CN115768881A - 用于产生马立克氏病病毒疫苗的细胞系及其制造和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种能够支持马立克氏病病毒(MDV)，包括火鸡疱疹病毒(HVT)的病毒生长的禽细胞系，产生此类细胞系的方法，以及此类细胞系和所得疫苗的治疗用途。

Description

用于产生马立克氏病病毒疫苗的细胞系及其制造和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC 119(e)要求于2020年6月15日提交的美国临时申请第63/039021号的权益，该申请全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及能够一种支持马立克氏病病毒，包括火鸡疱疹病毒(Herpes virus ofturkeys，HVT)的病毒生长的禽细胞系，产生此类细胞系的方法，以及此类细胞系和所得疫苗的治疗用途。在某些实施例中，该细胞系是鸡胚成纤维细胞(Chicken embryofibroblast，CEF)细胞系。在其它实施例中，该细胞系已经经过基因修饰(例如通过CRISPR-Cas9基因编辑)，以包括一个或多个基因(例如HTR2A基因或SLAMF8基因)的敲除或敲弱(缺失或破坏)。
背景技术
马立克氏病病毒是家禽肿瘤性淋巴组织增生疾病的病原体。该病毒引起单核细胞浸润和淋巴瘤的发展，主要是在周围神经和内脏器官中。马立克氏病导致多种症状，包括周围神经病变；一个或多个器官(包括脾、肝、肾、肺和心脏)的肿瘤；呼吸困难；眼淋巴瘤病；和免疫抑制。在免疫幼稚禽群中，马立克氏病感染会流行起来，导致高达80％的死亡率。
马立克氏病是由高度传染性的α疱疹病毒引起的，称为禽α疱疹病毒-2(Gallidalpha-herpesvirus-2，GaHV-2)或简称为“马立克氏病病毒”(Marek's Disease Virus，MDV)。已经发现了三种MDV血清型：血清型1(MDV-1)、血清型2(MDV-2)和血清型3(火鸡疱疹病毒或HVT)。其中只有第一种是致病性的。
目前还没有已知的针对受MDV感染的禽类的药物或治疗方法。目前仅通过施用疫苗来控制该疾病。有效的疫苗可以防止后来感染MDV的禽类发展成肿瘤性疾病，尽管它们不能防止毒性MDV的感染或防止病毒从受感染的禽类散发。由于天然MDV中毒力不断增加，全世界的家禽工业现在对所有商用鸡群接种抗MDV疫苗。因此，MDV和MDV疫苗具有非常高的经济重要性。
自二十世纪七十年代以来，无毒MDV，即MDV-2和HVT已被用于禽群疫苗接种，并且与减毒血清型1疫苗组合可成功地控制该疾病。目前，这些疫苗病毒在含胚卵或来源于含胚卵的原代细胞中生长。使用含胚卵和原代细胞进行病毒生长耗费劳力并且昂贵。此外，尽管胚胎的来源来自无特定病原体(specific pathogen free，SPF)的禽群，但存在禽群被一些外来试剂污染，从而污染疫苗的情况。除了这种风险之外，还可能存在供应问题，因为来自SPF禽群的卵也用于制造某些人疫苗，例如流感疫苗。由于这些原因，需要开发新的成本有效的策略来生产HVT和MDV疫苗，从而减少对使用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)生产疫苗的依赖。
克服HVT疫苗生产对原代CEF的依赖性的一种方法是使用永生细胞系代替原代细胞。永生细胞在某些方面是优越的，因为它们可以根据需要储存和扩增，并且在细胞生长速率或病毒复制方面在批与批之间几乎没有变化。尽管永生细胞系目前用于生产其它疫苗，但是仅开发了极少数可支持HVT生长至任何显著水平而不延长病毒适应的自发永生禽细胞系。能够提供与原代细胞相当的病毒产量/效价的连续细胞系将显著节约成本，并消除了供应带有外来试剂的SPF禽群并被其污染的风险。因此，本领域仍然需要能够支持MDV生长的改良细胞系。
发明内容
在一个方面，本发明提供了能够支持马立克氏病病毒(MDV)高效价生长的基因修饰细胞系。在一个实施例中，基因修饰细胞系提供起始细胞系，起始细胞系包含永生禽细胞系。在一个实施例中，起始细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1，DF-1；LF-1；LMH；SL-29；DT-40；ESCDL-1；SC-1；SC-2；和ST-2。在一个实施例中，起始细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1；DF-1；LF-1；SC-1；SC-2；和ST-2。在一个实施例中，起始细胞系是JBJ-1。
在一个实施例中，由本发明的基因修饰细胞系产生的马立克氏病病毒(MDV)包含MDV血清型1(MDV-1，例如CV 1988)、MDV血清型2(MDV-2、SB-1)或MDV血清型-3(MDV-3，火鸡疱疹病毒/HVT)。在一个实施例中，MDV包含MDV-1。在一个实施例中，MDV包含MDV-2。在一个实施例中，MDV包含MDV-3。在一个实施例中，本发明的MDV不是重组的。在一个实施例中，本发明的MDV是重组MDV。
在一个实施例中，本发明提供了，由本发明的基因修饰细胞系产生的MDV是重组的，并且包含插入MDV基因组中一个或多个位置的一种或多种异源抗原。在一个实施例中，一种或多种异源抗原包含来自禽病原体的抗原。在一个实施例中，禽病原体包含致病性禽病毒。在一个实施例中，禽病原体选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒；传染性支气管炎病毒；传染性喉气管炎病毒；新城疫病毒；鸡贫血病毒和禽流感病毒。
在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含由本发明的基因修饰细胞系产生的MDV。
在一个实施例中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明的药物组合物，药物组合物包含由本发明的基因修饰细胞系产生的MDV。
在一个实施例中，本发明提供了包含一种疫苗，其包含本发明的药物组合物，药物组合物包含由本发明的基因修饰细胞系产生的MDV。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗禽类的方法，其包含施用治疗量的本发明的疫苗，疫苗包含由本发明的基因修饰细胞系产生的MDV。
在一个方面，本发明提供了一种用于产生能够支持马立克氏病病毒(MDV)高效价生长的基因修饰细胞系的方法，方法包含：提供起始细胞系，其中所述起始细胞系是永生禽细胞系，和通过改变起始细胞系的基因以降低表达，从而改变基因HTR2A和SLAMF8之一或两者的产物的功能活性来产生基因修饰细胞系，其中当受到相同MDV毒株感染时，与起始细胞系相比，基因修饰细胞系能够支持增加MDV病毒效价。
在一个实施例中，本发明提供了一种起始细胞系，其选自由以下组成的组：JBJ-1，DF-1；LF-1；LMH；SL-29；DT-40；ESCDL-1；SC-1；SC-2；和ST-2。在一个实施例中，起始细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1；DF-1；LF-1；SC-1；SC-2；和ST-2。在一个实施例中，起始细胞系是JBJ-1。
在一个或多个实施例中，本发明的方法提供了包含基因改变的细胞系，基因改变包含使用TALEN、ZFN、CRISPR-Cas9或替代性CRISPR-Cas酶改变基因组。在一个实施例中，基因改变包含使用CRISPR-Cas9改变基因组。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，细胞系的基因改变包含使用CRISPR-Cas9进行HTRA2A或SLAMF8基因的纯合改变。
在一个或多个实施例中，根据本发明，通过本发明的方法产生的MDV选自MDV-1(例如CV 1988)、MDV-2(SB-1)和MDV-3(火鸡疱疹病毒/HVT)。在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，当受到相同MDV毒株感染时，基因修饰细胞系支持比起始细胞系高至少10倍的MDV病毒效价。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，当受到相同MDV毒株感染时，基因修饰细胞系支持比未修饰细胞系高至少50倍的MDV病毒效价。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，基因修饰细胞系支持的MDV病毒效价在用相同MDV毒株在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上获得的病毒效价的2倍以内。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，基因修饰细胞系包含改变HTR2A基因的产物的功能活性的基因改变。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，基因修饰细胞系还包含改变一种或多种其它基因的产物的功能活性的基因改变，一种或多种其它基因选自由STAT4、COBBL2和CTSL组成的组。在一个实施例中，其它基因包含STAT4。
在一个或多个实施例中，根据本发明的方法，细胞系中的基因改变包含使用TALEN、ZFN、CRISPR-Cas9或替代性CRISPR-Cas酶改变基因组。在一个或多个实施例中，基因改变包含使用CRISPR-Cas9改变基因组。
在一个方面，本发明提供了一种能够支持MDV高效价生长的基因修饰细胞系，该基因修饰细胞系通过本发明的方法的一个或多个实施例产生。在一个实施例中，本发明提供了一种基因修饰细胞系，其中MDV包含编码插入MDV基因组中一个或多个位置的异源抗原的核酸。在一个实施例中，异源抗原由来源于家禽病原体的基因编码，家禽病原体选自由以下组成的组：新城疫病毒；传染性法氏囊病病毒；传染性支气管炎病毒；禽流感病毒；传染性喉气管炎病毒和鸡贫血病毒。
在一个方面，本发明提供了一种用于制备MDV疫苗的方法，方法包含通过本发明的方法的一个或多个实施例制备基因修饰细胞系，并使MDV在所述基因修饰细胞系中生长。
在一个实施例中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含通过本发明的方法的一个或多个实施例制备的MDV。
在一个实施例中，本发明提供了一种MDV疫苗，MDV疫苗通过本发明的方法的一个或多个实施例制备。
附图说明
图1示出了受到携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的HVT病毒(HVT-ND-GFP)感染的CEF和HTR2A修饰的JBJ-1细胞在感染后24小时、48小时和72小时的荧光图像。
图2示出了受到HVT-ND-GFP感染的CEF和SLAMF8修饰的JBJ-1细胞在感染后24小时、48小时和72小时的荧光图像。
图3示出了受到HVT-ND-GFP感染的CEF细胞、野生型JBJ-1细胞和修饰的JBJ-1细胞在感染后45小时的荧光图像。
图4示出了受到HVT-ND-GFP感染的CEF细胞、野生型JBJ-1细胞和修饰的JBJ-1细胞在感染后45小时的荧光图像。
序列说明
SEQ ID NO:1包含DNA引物SORF1 F1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2包含DNA引物SORF1 R1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3包含DNA引物SORF1 S1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4包含DNA SORF1 STD的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5包含DNA引物OVO(TF)F1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6包含DNA引物OVO(TF)R1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7包含DNA引物OVO(TF)S的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8包含DNA OVO(TF)STD的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9包含用于转染JBJ-1细胞的BLEC2 gRNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10包含用于转染JBJ-1细胞的HTR2A gRNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11包含用于转染JBJ-1细胞的SLAMF8 gRNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12包含cbPCR引物HTR2A F-out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13包含cbPCR引物HTR2A R-out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14包含cbPCR引物HTR2A F-In的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15包含SLAMF8引物SLAMF8 F-Out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16包含SLAMF8引物SLAMF8 R-out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17包含SLAMF8引物SLAMF8 F-in的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18包含BLEC2引物BLEC2 F-Out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19包含BLEC2引物BLEC2 R-out的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20包含BLEC2引物BLEC2 F-in的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21包含BLEC2引物BLEC2 R-in的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22包含针对STAT4的gRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23包含针对STAT4 F-out的cbPCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24包含针对STAT4 R-out的cbPCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25包含针对STAT4 R-in的cbPCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26包含针对CTSL2的gRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27包含针对CTSL2 F-out的cbPCR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28包含针对CTSL2 R-out的cbPCR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29包含针对CTSL2 F-in的cbPCR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30包含针对CTSL2的gRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31包含针对CTSL2 F-out的cbPCR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32包含针对CTSL2 R-out的cbPCR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33包含针对CTSL2 F-in的cbPCR的核苷酸序列。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)的含义与本领域普通技术人员通常理解的相同。还应当理解，术语，例如在常用词典中定义的那些术语，应当被解释其含义与它们在相关上下文中的含义一致，并且除非在本文中明确地如此定义，否则不应以理想化或过度形式化的意义来解释。定义：
在详细描述本发明之前，将定义在本发明的上下文中使用的几个术语。除了这些术语之外，根据需要在说明书的其它地方定义其它术语。除非本文另有明确定义，否则本说明书中使用的术语将具有其本领域公认的含义。
定义
应当注意，在本公开中，术语诸如“包含(comprises\comprised\comprising)”、“含有(contains\containing)”、“由……组成”、“组成”、“基本上由……组成”、“包括(includes\included)”等，根据标准美国和国际专利法实践来定义。
术语“约”在本文中用于表示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指备选方案和指“和/或”的定义。当不与权利要求中的封闭式措辞结合使用或另外具体指出时，词语“一”和“一个”表示“一个或多个”。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团连接的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指其结构与氨基酸的一般化学结构不同，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。
氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码表示。大分子结构如多肽结构可以用各种组织水平来描述。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域，例如酶结构域、胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域或胞质尾结构域。结构域是形成多肽的紧密单元的多肽部分。示例性结构域包括具有酶活性的结构域。结构域可以由较小组织的区段组成，例如β-片层和α-螺旋的伸展。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指通过独立的三级单元的非共价缔合形成的三维结构。各向异性项也称为能量项。
本文所用的术语“禽类”包括家禽，例如鸡形目的成员。更具体地，更具有经济和/或农业利益的一类禽类，例如鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鸵鸟、鸽子和鹌鹑等。
术语“保守氨基酸取代”表示对给定氨基酸残基的任何氨基酸取代，其中取代残基在化学上类似于给定残基的取代残基，从而不会导致多肽功能(例如酶活性)的显著降低。保守氨基酸取代在本领域是众所周知的，其实例描述于例如美国专利第6,790,639号、第6,774,107号、第6,194,167号或第5,350,576号。在一个优选的实施例中，保守氨基酸取代将是发生在以下六组之一中的任一种取代：
·小脂肪族，基本上非极性残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；
·大脂肪族，非极性残基：lie、Leu和Val；Met；
·极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp和Glu；
·极性带负电荷的残基的酰胺：Asn和Gin；His；
·极性带正电荷的残基：Arg和Lys；His；以及
·大芳香族残基：Trp和Tyr；Phe。
本文所用的保守氨基酸取代将是下列中的任一种，其作为天然残基(保守取代)对列出：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gin；His)；Asp(Glu)；Gin(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；lie(Leu；Val)；Leu(lie；Val)；Lys(Arg；Gin；Glu)；Met(Leu；lie)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；和Val(lie；Leu).
在用于测试如本文所述的调节病毒活性的化合物的测定的上下文中，短语“功能效应”包括间接或直接受此类病毒影响的参数的测定，例如表型或化学效应。“功能效应”可以包括体外、体内和离体活性，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式测量，例如蛋白质的光谱特征、形状、色谱或溶解度性质的变化，测量蛋白质的可诱导标记或转录激活；测量结合活性或结合测定，例如与抗体的结合；测量配体或底物结合活性的变化、测量病毒复制，测量细胞表面标记表达，测量蛋白质水平的变化，测量RNA稳定性，通过例如化学发光、荧光、比色反应、抗体结合和/或可诱导标记鉴定下游或报道基因表达。
术语“基因”是指包含DNA或RNA、cDNA、内含子和外显子DNA、人工DNA多核苷酸，或编码肽、多肽、蛋白质或RNA转录物分子的其它DNA的组分，以及可能侧接参与调节表达的编码序列的遗传元件，如启动子区、5'前导区、3'非翻译区，其可以作为天然基因或转基因存在。可以对基因或其片段进行确定包含该基因的核苷酸顺序的多核苷酸测序方法。
术语“火鸡疱疹病毒(HVT)”被定义为家养火鸡的非致病性病毒，并且被分类为马立克氏病病毒组中的第三种血清型，即抗原性遗传相关嗜淋巴性禽疱疹病毒。
术语“异源”，当用于指核酸的部分时，表示该核酸包含两个或更多个本质上彼此关系不相同的序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个来自无关基因的序列，这些序列被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白表示该蛋白包含两个或更多个本质上彼此关系不相同的亚序列(例如融合蛋白)。异源也可以指病毒序列(如基因或转基因，或其部分)被插入到其通常不存在于其中的病毒基因组中，或基因被引入到其通常不存在于其中的生物体中。
术语“宿主细胞”是指以任何方式被选择、修饰、转化、生长或使用或操纵的任何生物体的任何细胞，以通过该细胞产生物质，例如通过该细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。宿主细胞包括任何单个细胞或细胞培养物，它们可以是或已经是载体或外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质掺入的受体。它包括单细胞的后代。由于天然的、偶然的或有意的突变，后代可能不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因组或总DNA互补上)。
如本文所用，术语“宿主”、“受试者”、“患者”或“生物体”可包括动物，特别是禽类，尤其是家禽。对于兽医应用，禽类可以来自鸡形目，其包括鸡、鹌鹑和火鸡等。术语“活宿主”是指如上所述的宿主或其它活的生物体。该术语还可以指整个宿主或生物体，而不仅仅是从活宿主切除的部分(例如脑或其它器官)。这些术语还包括处于所有发育阶段的个体，包括胚胎和胎儿阶段。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“百分比同一性”是指两个或更多个序列或亚序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，在指定区域上约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，其使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和视觉检查进行测量(参见，例如NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。此类序列被称为“基本相同”。该定义还涉及或适用于特定序列的互补序列。该定义还可以包括具有缺失、添加和/或取代的序列。
对于序列比较，一个序列通常用作参考序列，与其它序列进行比较。当使用序列比较算法时，可以将参考序列和比较序列输入计算机，并且根据需要选择序列算法程序参数。然后根据选择的参数，生成相对于参考序列的比较序列的序列同一性百分比。适用于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(《核酸研究(Nuc Acids Res)》25:3389-3402,1977)和Altschul等人(《分子生物学杂志(J Mol Biol)》215:403-410,1990)。BLAST和BLAST 2.0是本领域公知的，并可用于测定任何核酸或蛋白质(例如本文所述的那些)的序列同一性百分比。
如本文所用，“免疫原性组合物”或“药物组合物”或“疫苗”意在涵盖包含适合施用于受试者(例如禽类受试者)的抗原的组合物。所述组合物通常意指在受试者中引发免疫应答。免疫应答可包括T细胞应答、B细胞应答或T细胞和B细胞应答两者。该组合物可以通过在细胞表面呈递与MHC分子结合的抗原而使受试患者致敏。此外，可生成抗原特异性T淋巴细胞或抗体以允许将来保护免疫宿主。“免疫原性组合物”可包含活的、减毒的或杀死的/灭活的疫苗，疫苗包含完整的微生物或由其衍生的免疫原性部分，其诱导细胞介导的(T细胞)免疫应答或抗体介导的(B细胞)免疫应答或两者，并且可保护动物免于与微生物感染相关的一种或多种症状，或可保护动物免于因微生物感染而死亡。通常，“免疫原性组合物”是无菌的，并且优选不含可能在受试者体内引起不希望的应答的污染物(例如免疫原性组合物中的化合物是药物级的)。免疫原性组合物可以设计为通过多种不同的给药途径给予有需要的受试者，包括卵内、口服、静脉内、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、气管内、肌内、皮下、吸入等。
如本文所用，术语“免疫原性”蛋白或肽包括具有免疫活性的多肽，即一旦给予宿主，其能够引起针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，蛋白片段具有与全长蛋白基本相同的免疫活性。因此，本发明的蛋白片段包含至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由至少一个表位或抗原决定簇组成，或由至少一个表位或抗原决定簇组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白或多肽包括蛋白的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包括一个或多个表位并因此引发上述免疫应答的蛋白质片段。
术语“免疫原性蛋白或肽”还包括对序列的缺失、添加和取代，只要多肽能产生如本文定义的免疫应答。术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替代，或核酸序列中核苷酸的替代，使得编码的氨基酸残基不改变或成为另一个生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的取代通常在性质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性－天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性－赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性－丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性－甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括用一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水性残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或者用结构上相关的对生物活性不具有主要影响的氨基酸对氨基酸进行类似的保守取代。因此，具有与参照分子基本相同的氨基酸序列但具有基本不影响蛋白质免疫原性的小氨基酸取代的蛋白质落于参照多肽的定义内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，条件是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
本文所用的“免疫有效量”是指足以引发免疫应答(细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答)的抗原或疫苗的量，如通过本领域技术人员已知的标准测定法所测量的。例如，就本发明而言，“免疫有效量”是最小保护剂量(效价)。抗原作为免疫原的有效性可以通过增殖试验，细胞溶解试验，如测定T细胞溶解其特异性靶细胞的能力的铬释放试验，或通过测定血清中特异性针对抗原的循环抗体的水平来测定B细胞活性的水平，或本领域技术人员已知和使用的其它试验来测定。此外，免疫应答的保护水平可以通过用已注射的抗原攻击免疫宿主来测量。例如，如果需要免疫应答的抗原是病毒或肿瘤细胞，则通过检测动物受到病毒或肿瘤细胞攻击后的存活百分比或死亡率百分比来测量由“免疫有效量”的抗原诱导的保护水平。
确定本发明疫苗的免疫有效量是本领域技术人员所熟知的，例如通过监测接种后或攻击感染后的免疫应答，例如通过再分离病原体，或通过监测靶标的疾病临床征象或血清学参数，并将这些与在模拟接种动物中观察到的应答进行比较。用于将根据本发明的疫苗施用于靶生物体的给药方案可以是单剂量或多剂量，其可以以与疫苗制剂相容的方式同时或依次给予，并且以免疫有效量给予。
术语病毒核酸和多肽序列的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”用于指使用病毒核酸和多肽序列的体外和体内测定鉴定的活化、抑制或调节分子。抑制剂是可结合病毒、部分或完全阻断病毒活性、降低、预防、延迟活化、失活、脱敏或下调病毒活性或表达的化合物。活化剂是指增加、打开、活化、促进、增强活化、敏化、激动或上调病毒活性的化合物。抑制剂、活化剂或调节剂还包括如本文所述的病毒的遗传修饰形式，如本文所述的病毒的遗传修饰形式，例如具有改变的活性的形式，以及天然存在的和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶、小化学分子等。抑制剂和活化剂的测定包括，例如，在体外、在细胞或细胞膜中表达本发明病毒，应用推定的调节剂化合物，然后测定对活性的功能作用，如本文所述。
可以将包含用可能的激活剂、抑制剂或调节剂处理的本发明病毒的测试样品或测定与缺乏抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品进行比较，以确定抑制程度。与测试样品或测定进行比较的对照样品被指定具有100％的相对蛋白质活性值。当测试样品相对于对照样品的活性值小于约80％，包括约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％和约0％时，实现病毒的抑制。
如本文所用，“马立克氏病病毒”或“MDV”是指马德病毒属的任何α疱疹病毒，其包括如本文所述的火鸡疱疹病毒(HVT)。在一个具体的实施例中，本发明涉及马立克氏病病毒、其遗传组分、基因和由此产生的蛋白质。如本文所用，这样的病毒可包括病毒的遗传组分，即其基因组和转录物，由基因组编码的蛋白质(包括结构蛋白质和非结构蛋白质)，和功能性或非功能性病毒颗粒。编码这种病毒的多核苷酸和多肽序列是本领域熟知的，并且本领域技术人员容易发现。
术语“突变体”和“突变”是指遗传物质中的任何可检测的改变，例如DNA，或此类改变的任何过程、机制或结果。这包括基因突变，其中基因的结构(例如DNA序列)被改变，由任何突变过程产生的任何基因或DNA，和由修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(例如蛋白质或酶)。术语“变体”也可用于表示修饰或改变的基因、DNA序列、酶、细胞等，即任何类型的突变体。
如本文所用，术语“核酸”是指从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。“核酸”还可任选地含有非天然存在的或改变的核苷酸碱基，其允许聚合酶正确通读并且不减少由该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为单个单链或在双链体中的核酸的有义链和反义链。术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、tRNA(转移RNA、无论带或不带相应酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)。术语“核酸区段”、“核苷酸序列区段”或更一般地，“区段”将被本领域技术人员理解为功能术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和表达或可适于表达蛋白质、多肽或肽的较小工程化核苷酸序列。本文使用的术语是《美国联邦法规(United StatesCode of Federal Regulations)》的标题37中的§1.822所要求的，并且在WIPO标准ST.25(1998)、附录2、表1和表3中的表中列出。
术语“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的生理上相容的成分，以施用于受试者。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、佐剂、防腐剂、稀释剂、水性或非水性媒介物和其它添加剂。另外，该术语是指免疫原性组合物或疫苗的要素，其通常由联邦、州政府或其它管理机构的管理机构批准，或在《美国药典(U.S.Pharmacopeia)》或其它公认的药典中列出，用于人类和非人类动物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。组合物可与常规粘合剂和载体如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin所著的《雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)》。制剂应适合给药方式。
如本文所用，“家禽”是指为其生产的蛋以及其肉和羽毛而饲养的家养或商用禽类。在一些实施例中，家禽可以包括来自鸡形目的禽类，其包括鸡、鹌鹑和火鸡，并且还可以包括鹅、鸭、天鹅、天竺鼠、鸽子等。
如本文所述，多核苷酸可以与病毒基因序列的全部或部分互补，包括启动子、内含子、编码序列、外显子、5'非翻译区和3'非翻译区。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“多价疫苗”、“联合或组合疫苗”和“多联疫苗”可互换使用，是指含有一种以上抗原的疫苗。多价疫苗可含有两种、三种、四种或更多种抗原。多价疫苗可包含重组病毒载体，活性或减毒或灭活的野生型病毒，或活性或减毒或灭活形式的重组病毒载体和野生型病毒的混合物。
本文所用的“启动子”是指定义RNA聚合酶开始基因转录的位置的DNA序列。启动子通常位于转录起始位点的上游。启动子还可以包含远端增强子或阻抑物元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个核苷酸的位置。启动子定义了转录的方向，并指示哪条DNA链将被转录。启动子可以来自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段，或响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，而组成型或差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、人CMV启动子；鼠CMV启动子；Pec启动子；β鸡肌动蛋白启动子；豚鼠CMV启动子、伪狂犬病病毒启动子；糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1启动子；马立克氏病病毒启动子；和SV40启动子。
如本文所用，术语“预防性治疗”是指完全或部分预防疾病或其症状，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。
术语“重组体”当用于参考时，例如对于细胞或核酸、蛋白质或载体，表明该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达在其它方面异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。在一些实施例中，重组序列还可以包括核酸、蛋白质或重组基因组，如病毒基因组。如本文所述，重组病毒载体可含有与异源启动子有效连接的转基因，以实现转基因的转录。
如本文所用，术语“治疗有效量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是指产生其施用的效果的剂量。这样的剂量或量还可以是指所施用的药剂的实施例的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病(即感染)的一种或多种症状，和/或将在一定程度上预防所治疗的宿主具有或处于发展风险中的疾病(即感染)的一种或多种症状。确切的剂量将取决于治疗目的，并且本领域技术人员将能够使用本领域已知的技术确定这样的剂量。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treating/treat)”被定义为用减少或改善疾病、病症或病状和/或其症状的药理学和/或生理学效应的药剂作用于疾病、病症或病状。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者或宿主的疾病的任何治疗(例如兽医感兴趣的动物)，并且包括：(a)降低被确定为易患该疾病但尚未被诊断为感染该疾病的受试者发生该疾病的风险，(b)阻止该疾病的发展，和(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”还意指包括递送抑制剂以提供药理学效果，即使在没有疾病或病症的情况下。例如，“治疗”包括递送为受试者提供增强或期望效果的疾病或病原体抑制剂(例如减少病原体负荷、减少疾病症状等)。
如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为用于动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的化合物(例如，如本文所述的抗病毒化合物)，其以足以产生所需效应的量计算，其与药学上可接受的稀释剂、载剂或媒剂组合。单位剂型的规格取决于所用的具体化合物、给药途径和频率、待实现的效果和与宿主中每种化合物相关的药效学。
本文可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包含至少一种诱导受试者免疫应答的本发明免疫原性组合物的药物组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护受试者免于疾病或可能的死亡，并且可以包括或可以不包括一种或多种增强活性组分的免疫活性的其它组分。本发明的组合物诱导保护性免疫应答，其包含在本发明的细胞系中产生的重组HVT病毒。在一些实施例中，本发明的组合物包含具有插入到HVT中的一种或多种异源抗原编码基因的重组HVT病毒。在一些实施例中，抗原编码基因是衍生自家禽病原体的抗原，家禽病原体例如是新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒和/或鸡贫血病毒。在一些实施例中，重组HVT与另一种引起家禽保护性免疫应答的重组马立克氏病病毒疫苗组合。本发明的疫苗或疫苗组合物可另外包含疫苗或疫苗组合物典型的其它组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗可包含一种或同时包含一种以上的上述要素。
本发明的疫苗还可以包含合适的药物载体。术语“药学上可接受的载体”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。根据给药方法，组合物可以与常规粘合剂和载体如甘油三酯一起配制。具体的制剂可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin所著的《雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)》。制剂应适合给药方式。合适的载体对于本领域技术人员是显而易见的，并且大部分取决于给药途径。本发明中可能存在的其它组分是佐剂、防腐剂、表面活性剂、化学稳定剂、悬浮剂或分散剂。通常，优化稳定剂、佐剂和防腐剂以确定在目标受试者中功效最佳的制剂。
“变体”肽在本文中是指由于在亲本肽序列中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列上与“亲本”疫苗肽氨基酸序列不同并且保留亲本疫苗肽的至少一种所需活性的肽。例如，变体可在用作本发明疫苗一部分的肽的一个或多个氨基酸序列中包含至少一个，例如约1至约10个，优选约2至约5个取代。通常，变体将具有与亲本氨基酸序列具有至少50％氨基酸序列同一性，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的氨基酸序列。关于序列的同一性或同源性在本文中定义为在对序列进行比对并在必要时引入缺口以获得最大序列同一性百分比后，候选序列中与亲本肽残基相同的氨基酸残基的百分比。肽序列中的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入都不应解释为影响序列同一性或同源性。变体保留了引发免疫应答的能力，并且优选具有优于亲本肽的活性。
变体肽可以是功能完全的或对于一种或多种活性缺乏功能。全功能变体通常仅含有保守变异或非关键残基或非关键区域中的变异。功能变体也可包含导致功能无变化或不显著变化的相似氨基酸的取代。可替代地，这样的取代可以在一定程度上正面或负面地影响功能。非功能性变体通常含有一个或多个非保守氨基酸取代、缺失、插入、倒位或截短，或关键残基或关键区域中的取代、插入、倒位或缺失。
此外，多肽通常含有20种“天然存在的”氨基酸以外的氨基酸。此外，许多氨基酸，包括末端氨基酸，可以通过天然过程修饰，如加工和其它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。已知的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的加成如精氨酰化以及泛素化。此类修饰是本领域技术人员熟知的，并且已经在科学文献中进行了详细描述。几种特别常见的修饰，例如糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP核糖基化描述于最基本的教科书中，如《蛋白质结构和分子性质(Proteins-Structure and Molecular Properties)》(第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman&Co.,NY,1993)。可获得许多关于该主题的详细介绍，例如Wold的《蛋白质的翻译后共价修饰(Posttranslational Covalent Modification ofproteins)》,1-12(Johnson,ed.,Academic Press,NY,1983)；Seifter等人,182《酶学方法(Meth.Enzymol.)》626-46(1990)；和Rattan等人663《纽约科学院年鉴(Ann.NYAcad.Sci.)》48-62(1992)。
“变体”核酸在本文中是指在序列上与“亲本”核酸不同的分子。多核苷酸序列差异可由突变改变如一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加引起。这些改变中的每一种可以单独或组合地在给定序列中发生一次或多次。变体核酸可以含有导致保守氨基酸取代的核苷酸差异或当翻译时导致氨基酸差异的核苷酸序列差异。变体核酸也可以是调节元件的改变。
正如多肽可以含有保守氨基酸取代一样，其多核苷酸可以含有编码保守密码子取代的核酸序列。如果在表达时产生如上所述的保守氨基酸取代，则认为密码子取代是保守的。导致无氨基酸取代的简并密码子取代也可用于本发明的多核苷酸。因此，例如，可通过简并密码子取代来突变编码本发明实施例中所用的选定多肽的多核苷酸，以接近待转化的表达宿主细胞所表现出的密码子使用频率，或以其它方式改善其表达。
如本文所用，“载体”是指能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，如生产细胞。如本文所述，载体具有表达控制序列，即指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列“可操作地连接”。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位成促进翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点连接完成的。如果不存在这样的位点，则根据常规实践，使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
根据本发明，本文所述的重组病毒载体可通过提供表达来自两种或更多种不同病毒病原体的基因的重组病毒载体来保护家禽抵抗此类病毒病原体。在一些实施例中，本发明的重组病毒载体可以在本文所述的免疫原性组合物中提供给家禽。可以使用来自适用于本文所述重组病毒载体的任何病毒病原体的基因。例如，在一些实施例中，重组病毒载体可以表达来自新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡贫血病毒(CAV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)等的基因。
通过本发明的重组病毒载体在家禽中表达的病毒抗原可由病毒基因如本文所述的病毒基因编码。本领域技术人员在这方面将理解，为了获得期望的活性和/或功能，可能不需要整合特定基因的全部。相反，可以使用这种基因的一部分。可能需要选择对任何给定的靶病毒特异的所需基因的特定部分。不管蛋白质的长度如何，所需病毒蛋白质或编码这种蛋白质的序列都可以使用本领域已知的适于本发明使用的方法容易地进行优化。本领域技术人员将理解，可以对一个或多个基因或由其编码的蛋白质进行修饰，以在引入受试者时增加病毒蛋白质的活性。对病毒基因或蛋白进行的修饰可以增加或降低宿主对特定病毒的应答。
在某些实施例中，本发明的重组马立克氏病病毒或重组病毒载体可以具有编码IBDV病毒蛋白或基因产物，如IBDV VP2蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码NDV病毒蛋白或基因产物，如NDV F或HN蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码禽流感病毒(AIV)病毒蛋白或基因产物，如AIV HA或N蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码传染性喉气管炎病毒(ILTV)病毒蛋白或基因产物的转基因，如ILTV gB或gC或gD或gE或gI和UL-32蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码传染性支气管炎病毒(IBV)病毒蛋白或基因产物，如IBVS1或S2蛋白或基因产物的转基因。本发明的转基因可以具有一个以上的基因，包括基因融合蛋白或基因产物，如NDV F-HN融合蛋白、嵌合体或基因产物。在一些实施例中，此类基因的完整编码序列可用于产生全长或全功能蛋白质或多肽。可替代地，病毒蛋白或多肽的部分或片段可足以提供对特定病毒或病毒的保护或抗性。除非本文另有说明，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。在本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围造成限制，除非另有说明。本发明中的任何语言都不应被解释为指示实践本公开所必需的任何未要求的要素。
在某些实施例中，方法包括提供起始细胞系，起始细胞系为永生禽细胞系。在某些实施例中，永生禽细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1；DF-1；LF-1；LMH；SL-29；DT-40；ESCDL-1；SC-1；SC-2；和ST-2。在具体实例中，永生禽细胞系是鸡成纤维细胞样细胞系。在具体实例中，永生禽细胞系是JBJ-1。
在某些实施例中，方法包含通过改变起始细胞系的一个或多个遗传元件的基因产生修饰细胞系。在特定的实施例中，基因改变可以在靶基因的编码部分内，而在其它实施例中，基因改变可以是针对基因组中落在靶基因的编码部分之外但以其它方式影响表达的部分(例如，对启动子、增强子等的基因改变)。
在某些实施例中，基因改变敲除(缺失)或敲弱(破坏)或增加(改变)靶基因的表达，从而降低表达、增加表达或改变基因产物的功能活性。具有这种基因改变的细胞在本文中称为“缺失突变体”、“破坏突变体”或“缺失/破坏突变体”，这些术语在全文中通常可互换使用。表达降低或增加/改变可由许多不同类型的本领域普通技术人员熟知的基因改变引起。例如，表达降低可以由基因的功能形式的转录降低和/或由蛋白质的功能形式的翻译降低引起。例如，表达降低可以由在靶基因的编码区内产生插入或缺失(“indel”)的改变引起，使得最终转录的蛋白质被截短(例如由于引入终止密码子)或被充分改变(例如由于蛋白质内外显子的消除或多个氨基酸残基的改变)，从而无功能或功能降低或增强/改变，例如抑制因子/阻抑因子元件的功能。在另一个实例中，表达降低可由使靶基因的启动子或增强子突变而使得该基因的转录降低或消除的改变引起。在另一实例中，特定靶基因的表达降低可由参与靶基因表达的另一基因(例如上游信号传导元件)的表达改变引起。
在本发明的细胞系中进行的基因改变可以以本领域普通技术人员已知的许多不同方式使基因修饰细胞系能够支持MDV病毒复制或效价增加。在某些实例中，基因改变影响与MDV进入细胞和/或MDV存活和/或细胞内复制相关的一个或多个基因，和/或与MDV感染期间细胞存活相关的一个或多个基因。在其它实例中，基因改变降低了涉及破坏或隔离病毒复制机制的一个或多个基因的表达。在另外的实例中，基因改变降低了涉及破坏病毒颗粒的一个或多个基因的表达。在其它实例中，基因改变增加了参与病毒复制的一个或多个基因的表达。在更进一步的实例中，基因改变降低了参与感染细胞凋亡的一个或多个基因的表达。在另外的实例中，基因改变涉及涉及多个方面的基因的组合，例如涉及凋亡的一个或多个基因的表达降低和涉及病毒颗粒破坏的一个或多个基因的表达降低。
如本文所述，通过使用CRISPR/Cas9系统进行基因改变，这是本领域技术人员熟知的。简而言之，CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)是在原核生物如细菌和古细菌的基因组中发现的DNA序列的家族。这些序列来源于先前感染原核生物的噬菌体的DNA片段。这些序列用于在随后的感染过程中检测和破坏来自相似噬菌体的DNA。因此，这些序列在原核生物的抗病毒(即抗噬菌体)防御系统中起关键作用。Cas9(或“CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9)”)是一种酶，其使用CRISPR序列作为识别和切割与CRISPR序列互补的DNA的特异性链。Cas9酶与CRISPR序列一起形成可用于编辑基因的称为CRISPR-Cas9的技术的基础。Cas9内切核酸酶是包括两个小crRNA分子和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的四组分系统。通过将两个RNA分子融合成“单向导RNA”，将Cas9内切核酸酶工程化到双组分系统中，当与Cas9组合时，“单向导RNA”可发现并切割由向导RNA指定的DNA靶标。通过操纵向导RNA的核苷酸序列，人工Cas9系统可被编程以靶向任何DNA序列用于切割。还显示Cas9能够被重新编程以通过改变其crRNA的序列靶向选择的位点。这些进展推动了用修饰的CRISPR-Cas9系统编辑基因组的工作。
用于基因改变的特异性基因靶可以通过本领域普通技术人员熟知的多种方式来鉴定，包括与MDV感染期间细胞基因表达的相关过程或生物信息学分析相关的细胞基因的文献综述。在某些实施例中，可以通过比较感染MDV的细胞系中的基因表达谱与未感染细胞中的基因表达谱来鉴定基因改变的特异性基因靶。这可以在单个基因或途径水平上进行，例如通过PCR、qPCR或实时PCR分析，或在更全面的水平上对大量基因进行，例如使用DNA微阵列或RNA-Seq。这样的分析将允许鉴定在感染细胞中上调或下调的特定基因或途径，从而鉴定用于基因改变的候选基因。例如，如果涉及抗原呈递的蛋白水解基因被鉴定为在感染期间上调，则该基因将是降低表达的候选基因。类似地，如果发现参与细胞凋亡的基因在感染期间高度上调，则该基因将是降低表达的候选基因。通过这样的分析，可以鉴定基因靶，然后可以减少或增加基因靶的表达以确定这样的改变是否对病毒复制或病毒效价具有积极影响。在基因改变以减少或增加基因表达或改变各种靶蛋白的功能活性后，可用MDV来感染细胞以确定基因改变是否对病毒复制或病毒效价具有积极影响。
在一个实例中，进行RNA-Seq分析以鉴定在JBJ-1细胞的MDV感染期间上调的205个潜在候选基因(与未感染的JBJ-1细胞相比)。在该分析中显示出最大表达变化的基因是SLAMF8、HTR2A、BLEC2、CTSL2、COBLL1、STAT4、SEPP1、VTG1、AHSG、BRCA1、F13A1、GCGR、IL10、CDH5、IFNK、TP53I11、CTGF和IRS1。在某些实施例中，修饰细胞系含有导致这些基因中的一个或多个(例如，这些基因中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)的表达降低的基因改变。在特定的实施例中，修饰细胞系含有导致SLAMF8、HTR2A、BLEC2、CTSL2、COBLL1和STAT4中的一个或多个的表达降低的基因改变。在具体实例中，修饰细胞系含有导致SLAMF8的表达和/或功能降低的基因改变。在其它实例中，修饰细胞系含有导致HTR2A的表达/功能降低的基因改变。在其它实例中，修饰细胞系含有导致HTR2A和CTSL2、COBLL1或STAT4表达降低的基因改变。在另外的实例中，修饰细胞系含有导致HTR2A、STAT4和CTSL2或COBLL1表达降低的基因改变。在其它实例中，修饰细胞系含有导致SLAMF8和CTSL2、COBLL1或STAT4表达降低的基因改变。在另外的实例中，修饰细胞系含有导致SLAMF8、STAT4和CTSL2或COBLL1表达降低的基因改变。
在典型的二倍体细胞中，细胞将具有每个基因的两个拷贝。基因改变可以影响产生纯合突变体的基因的两个拷贝，或仅影响产生杂合突变体的一个拷贝。在某些实施例中，修饰细胞是杂合缺失/破坏突变体。在其它实例中，修饰细胞是纯合缺失/破坏突变体。
在某些实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比起始细胞系增加至少约2倍。在其它实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比起始细胞系增加至少约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍或更多。在其它实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比起始细胞系增加至少约1log。在进一步的实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比起始细胞系增加1-3log。在更进一步的实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比起始细胞系增加1-2log。
在某些实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价在原代CEF细胞中获得的病毒复制和/或效价的1log以内，即不超过约1log以下。在其它实施例中，修饰细胞系中的MDV病毒复制和/或效价比在原代CEF细胞中获得的低不超过约20倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍。在某些实施例中，在主动感染期间，例如在用MDV感染细胞后约12、24、36、48、72、96或120小时确定MDV病毒复制和/或效价。
病毒复制和/或病毒效价可通过本领域已知的任何合适的方法测定。在某些实施例中，通过分析存在的病毒DNA的量与存在的细胞基因组DNA的量进行比较来确定病毒复制，例如通过qPCR。例如，可进行qPCR以比较存在于样品中的病毒DNA的量与存在于样品中的细胞卵转铁蛋白DNA的量。通过比较起始细胞系与修饰细胞系在感染期间病毒与细胞DNA的比率，可以确定修饰细胞系是否支持病毒复制/效价增加。
在其它实施例中，通过连续稀释病毒制备物并用这些连续稀释物一式两份感染新鲜容许细胞如CEF来测定病毒效价。通过使用与荧光分子如FITC偶联并对病毒具有特异性的抗体，可以对细胞被感染的病灶或区域的数目进行计数。在特定的稀释度下，取决于制剂中病毒的水平，存在很少的足够的病灶，通常在30和300之间，使得它们可以单独计数。通过对可计数的病灶进行求平均并校正稀释因子，可以确定特定制剂中感染性病毒单位的数目或病毒效价。
在其它实施例中，本申请涉及一种能够支持MDV高效价生长的基因修饰细胞系，基因修饰细胞系通过本文所述的方法产生。在进一步的实施例中，本申请涉及一种用于制备或生产MDV疫苗的方法，MDV疫苗通过用MDV接种或感染本文所述的遗传修饰细胞，使MDV在那些细胞中生长，并收集所得细胞或病毒颗粒而产生。在进一步的实施例中，本申请涉及一种使用这种方法制备的MDV疫苗。
提供以下实例以说明要求保护的实施例，但不进行限制。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将认识到在不脱离本公开的精神或所附权利要求的范围的情况下可以改变的各种参数。
实例
实例1：
用于增强细胞系中MDV复制/效价的基因靶标的鉴定
可在平底组织培养瓶、滚瓶和微载体上生长的成纤维细胞样连续鸡细胞系JBJ-1细胞先前已被鉴定为能够支持生长安全且有效的MDV，包括HVT。参见Geerlings等人，2008。然而，在没有适应的情况下产生HVT病毒的能力远低于原代CEF细胞。因此，本发明人寻求增强JBJ-1细胞通过基因编辑产生病毒的能力。参见，例如，van der Sanden等人，2016；Wu等人，2017。
为了鉴定用于靶向敲除的潜在候选基因，本发明人使用RNA-Seq在不同时间点检查受到MDV感染的和未受感染的JBJ-1细胞中的基因表达。简单地说，将JBJ-1细胞以约90％汇合接种并用HVT-FC126感染或不感染。在感染后4小时、8小时、24小时和36小时收集受感染和未感染细胞的重复样品。使用标准方法分离RNA。在制备用于测序的文库之前，对RNA实施质量控制以测定浓度和RIN(RNA完整性数)。使用合适的总RNA试剂盒制备每个样品的文库。对每个文库进行最终质量控制，然后将样品标准化、合并，并在合适的测序仪(即NextSeq500)上测序以产生每个样品约40至80百万个读段。针对不明确的碱基、低质量和衔接子污染，对读段进行修剪，然后相对于Ensembl鸡基因组(v.4.82)和HVT基因组(NC_002641)进行作图。使用从RNA-Seq分析获得的数据作为输入，使用Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)软件来鉴定在MDV感染期间被高度诱导或抑制的基因，以及那些基因的上游和下游调节物。从该分析中，鉴定了205个基因，它们是潜在的靶，如果改变，可能导致病毒生长增强。
使用的CRISPR/Cas9方法是本领域技术人员公知的。文库含有615个CRISPR单向导RNA(sgRNA)以靶向上述鉴定的205个基因中的每一个。对于每个基因，产生三个单独的sgRNA以确保该基因在CRISPR-Cas9研究期间被成功破坏。将Cas9转染到JBJ-1细胞系中，并选择稳定表达Cas9的JBJ-1细胞系(“Cas9-JBJ-1细胞”)。简言之，根据制造商的建议(GE–Dharmacon)用Edit-R慢病毒CAG-Blast-Cas9核酸酶颗粒转导JBJ-1细胞，然后通过在杀稻瘟菌素存在下生长来选择插入片段。使用抗体7A9(Novus)通过蛋白质印迹或IFA证实CAS9的表达，并命名为JBJ-1:pCAG CAS9。JBJ-1在含有高葡萄糖、10％FBS、0.02mg/ml庆大霉素、含有或不含1.2μg/ml杀稻瘟素的L-谷氨酰胺的DMEM中生长。
使用24孔组织培养板，将615个sgRNA中的每一个转染到Cas9-JBJ-1细胞中。简单地说，在转染前约18小时，将JBJ-1:mCMV CAS9以每孔3×105个细胞接种于24孔板中。然后通过在室温下孵育使tracrRNA和每种crRNA在缓冲液中双链化。根据制造商的说明将双链体加入到Dharmafect(Dharmacon)溶液中，加入到培养基中，然后加入到细胞中约70小时。约70小时后，将所有孔用HVT病毒感染约46小时，收获，并如下所述进行测定。
qPCR方法基于先前描述的引物和探针组(Islam等人,2004；Baigen等人,2005)。简言之，SORF1基因(HVT-083/HVT-093)用于病毒基因组的定量，卵转铁蛋白(OVO或TF)基因用于鸡基因组的定量。SORF1和TF的引物、探针和标准物列于表1中。标准曲线均使用来自各基因区域的IDT的合成gBlock。每个双链体反应一式三份进行，并且SORF1基因的拷贝数除以除以每个鸡细胞的病毒基因组拷贝的TF基因的拷贝数。在每个实验中，修饰的JBJ-1细胞的病毒拷贝数除以野生型JBJ-1细胞的病毒拷贝数，以确定病毒复制是否由于基因破坏而增加。
表1：qPCR引物、探针和gBlock序列
Figure BDA0003993173680000221
Figure BDA0003993173680000231
通过该筛选，鉴定了18种基因，列于表2中，其在CRISPR-Cas9基因破坏后提供增加的病毒复制。
表2：在CRISPR基质筛选中鉴定的基因
Figure BDA0003993173680000232
Figure BDA0003993173680000241
Figure BDA0003993173680000251
这18个基因都是用于基因缺失/破坏以产生能够支持MDV病毒复制/效价增加的永生细胞系的候选者。在这18个候选者中，选择在病毒复制中产生最大增加的3个基因破坏用于进一步分析。
实例2：
基因缺失/破坏突变体的产生
在第一个实例中显示对病毒复制影响最大的三个基因：使用核糖核蛋白(RNP)复合物在正常JBJ-1细胞中缺失/破坏SLAMF8、HTR2A和BLEC2基因以进一步评估它们对病毒复制/效价的影响。对于每个基因靶，产生sgRNA，如表3所示。
表3：
gRNA用于转染JBJ-1细胞(下划线部分是基因特异性靶向序列)
Figure BDA0003993173680000252
每个单向导RNA(sgRNA)与Cas9蛋白复合以形成RNP。然后使用商业转染试剂以24孔板形式将每种RNP复合物转染到JBJ-1细胞中并孵育72小时。将所有群体扩展到6孔板中，然后扩展到T25烧瓶中，以通过有限稀释冷冻样品、测试和克隆。通过将每个靶基因有限稀释到10个96孔板中进行克隆。生长3至4周后，将阳性孔转移到24孔板中用于进一步扩增和测试。通过竞争性结合PCR(cbPCR)测试每个孔在所选位点的纯合缺失/破坏的存在。扩增阳性克隆并用于进一步测试。
针对三个基因中的每一个产生竞争性结合PCR(cbPCR)(Harayama和Riezman2017)引物，并用于筛选每个克隆中感兴趣基因处缺失的存在。用于cbPCR研究的引物列于下表4至6中。
表4：HTR2A的cbPCR引物
Figure BDA0003993173680000261
表5：SLAMF8的cbPCR引物
Figure BDA0003993173680000262
表6：BLEC2的cbPCR引物
Figure BDA0003993173680000263
简言之，为每个靶基因设计三个引物：外部正向引物、外部反向引物和正向或反向的内部引物。使用三种引物进行PCR，然后通过凝胶电泳分析所得PCR产物以观察。在设计引物时，内部引物与gRNA的靶位点重叠，使得如果在该区域中存在破坏(由于CRISPR-Cas9复合物的切割)，则内部引物将不能结合，导致仅较大的PCR产物被扩增。相反，如果CRISPR-Cas9复合物在gRNA区不切割，则内部产物将在其靶位点结合，导致较小的PCR产物被扩增。因此，如果在凝胶上观察到较小的PCR产物(或者仅观察到较小的PCR产物，或者同时观察到小的和大的PCR产物)，在样品基因型中存在未破坏形式的靶基因。相反，如果在凝胶上仅观察到较大PCR产物的单一条带，则样品是缺失/破坏突变体的纯合群体。
通过cbPCR分析每个基因缺失/破坏的8个24孔板(192个克隆)。对于HTR2A缺失研究，在凝胶电泳研究中将12个克隆(A1、A5、B2、B19、B24、C1、C5、E1、F14、F15、F23和H12)鉴定为HTR2A的纯合缺失/破坏突变体。扩增后，重复分析，并证实其中11个克隆(A1、A5、B19、B24、C1、C5、E1、F14、F15、F23和H12)是HTR2A的纯合缺失/破坏突变体。
对于SLAMF8，对8个24孔板的初始分析没有鉴定任何纯合缺失/破坏突变体。因此，制备另外8个24孔板并筛选。5个克隆(G10、G13、G15、G24和I24)在凝胶电泳研究中鉴定为SLAMF8的纯合缺失/破坏突变体。
对于BLEC2，对8个24孔板的初始分析没有鉴定任何纯合缺失/破坏突变体。因此，制备并筛选另外8个24孔板，并且再次没有鉴定到BLEC2的纯合缺失/破坏突变体。假设纯合BLEC2破坏可能对细胞致死。
实例3：
HTR2A加另一候选基因的双突变体的产生
为了评估多个候选基因的同时缺失/破坏是否可进一步增加所得修饰细胞系中的病毒效价，产生具有HTR2A的缺失/破坏加上额外候选基因的双突变体。将实例2中产生的HTR2A的缺失/破坏突变体(JBJ-1HTR2A-突变体克隆F14)用作起始细胞系。靶向缺失/破坏的其它基因是STAT4、CTSL2、COBLL1和SLAMF8。产生这些额外基因的缺失/破坏突变体并使用表7至10中列出的gRNA和引物序列通过如实例2中所述的cbPCR进行分析。
表7：STAT4的gRNA和cbPCR引物序列
Figure BDA0003993173680000271
表8：CTSL2的gRNA和cbPCR引物序列
Figure BDA0003993173680000272
Figure BDA0003993173680000281
表9：COBLL1的gRNA和cbPCR引物序列
Figure BDA0003993173680000282
表10：SLAMF8的gRNA和cbPCR引物序列
Figure BDA0003993173680000283
通过cbPCR分析2个和4个24孔板(48至96个克隆)之间的每个双缺失/破坏。在该分析中鉴定了具有与STAT4、CTSL2(例如克隆34和48)和COBLL1(例如克隆35和47)组合的HTR2A的双缺失/破坏的克隆。没有鉴定出与SLAMF8组合的HTR2A的成功双缺失/破坏突变体，导致发明人假设这两种基因的纯合破坏可能对细胞致死。
实例4：
通过qPCR测试HTR2A缺失突变体的MDV病毒复制
为了评估缺失/破坏突变体支持MDV复制的能力，用MDV对突变体进行感染，并使用qPCR分析以确定每个样品中病毒DNA与鸡基因组DNA的比率，如实例1中所述。用HVT-FC126病毒在24孔板中对每种细胞类型以两种不同的MOI(0.008和0.02)进行感染。在向细胞中加入病毒后立即取样，然后将每次处理的剩余感染混合物等分在两个24孔板之间。在48小时收获一个板，在72小时收获一个板。该分析的结果列于表11中。
表11：JBJ-1细胞和选择HTR2A突变体中HVT复制随时间的qPCR值
Figure BDA0003993173680000291
HVT病毒在JBJ-1野生型细胞中经历很少或不经历扩增，如通过HVT/TF比率在各时间点上一致所证明。相反，对于所有HTRA2-突变体，HVT/TF比率随时间点增加，并且HTR2A-突变体通常产生比在JBJ-1野生型细胞中看到的高得多的比率。所测试的大多数HTR2A-突变体克隆表现类似，显著的例外是克隆C1和F14，其产生比其它克隆高得多的HVT/TF比率，以及克隆C5和F15，其表现类似于JBJ-1野生型细胞。
实例5：
用HVT-ND-GFP病毒感染HTR2A和SLAMF8突变体
为了进一步表征单基因缺失/破坏突变体细胞系支持MDV复制的能力，用HVT-ND-GFP病毒感染细胞，其为HVT病毒的一种修饰形式，具有来自新城疫病毒的基因和绿色荧光蛋白(GFP)的基因。这允许在特定时间点显现病毒生长，以及使细胞/病毒更易于滴定。原代CEF细胞用作对照。将所有细胞以1.00×106个细胞/cm2的密度接种在T25烧瓶中，并用MOI为0.008的HVT-ND-GFP病毒感染。在感染后24小时、48小时和72小时观察到GFP荧光。
所得图像示于图1(HTR2A-克隆)和图2(SLAMF8-克隆)。可以看出，在感染后48小时在CEF细胞中观察到最活跃的病毒复制。缺失/破坏突变体也支持大量病毒复制。
对于HTR2A-突变体，克隆F14在72小时显示出最多的复制，随后是克隆C1在72小时，而克隆A1支持较少的病毒复制。这与qPCR数据密切相关，其中克隆F14提供最高的SORF1/TF比率(对于0.008的MOI，在72小时为1083)，克隆C1提供第二高的SORF1/TF比率(对于0.008的MOI，在72小时为382)，而克隆A1提供低得多的比率(对于0.008的MOI，在72小时为23)。
对于SLAMF8-突变体，克隆G10显示出最大的病毒复制，紧随其后的是克隆G24小时，然后是克隆G15。其它克隆也支持病毒复制，但程度低于这些克隆。
实例6：
用不同HVT病毒感染JBJ-1和HTR2A突变体
为了确定缺失突变体中增加的病毒复制是否在多种类型的HVT病毒中是普遍的，用四种不同的HVT病毒感染CEF、JBJ-1野生型和JBJ-1HTR2A-突变体(克隆F14)细胞，然后测定病毒效价。将所有细胞以1.00×106个细胞/cm2的密度接种在T225烧瓶中，并用MOI为0.008的病毒感染。孵育约45小时后，以1ml/75cm2收获细胞，并使用基于USDA CVB测试方案SAM 407的标准SOP回冻用于滴定：用于滴定马立克氏血清型3(火鸡疱疹病毒菌株FC-126)的补充测定方法，冻干。该分析的结果列于表12中。
表12：CEF细胞、JBJ-1野生型和JBJ1 HTR2A-突变体细胞中四种不同HVT病毒的病毒产量
病毒 CEF细胞 JBJ-1细胞 JBJ-1HTR2A-F14
HVT-FC126 1.96E+06 5.85E+03 1.22E+06
HVT-ND 1.29E+06 2.54E+04 1.15E+06
HVT-IBD-ND 2.12E+06 1.81E+04 6.89E+05
HVT-IBD 7.75E+05 1.50E+04 8.07E+05
所有四种病毒在CEF细胞中比在JBJ-1细胞中生长得更好(高1至3log)。与JBJ-1野生型细胞相比，HTR2A-突变体细胞系提供大大增加的病毒效价(高1至2log)。事实上，HVT-IBD在HTR2A-细胞中比在CEF细胞中达到更高的效价。
实例7：
CEF细胞、JBJ-1细胞和受HVT-ND-GFP感染的缺失突变体细胞中荧光和病毒效价的 分析
为了进一步表征各种突变体细胞系中的病毒复制，用HVT-ND-GFP病毒感染细胞，然后观察荧光并测定病毒效价。原代CEF细胞和野生型JBJ-1细胞用作对照。将所有细胞以1.02×106个细胞/cm2的密度接种在T75烧瓶中，并用MOI为0.008的病毒感染。在感染后约25小时和45小时观察并记录GFP荧光。在感染后45小时，还以1ml/75cm2收获细胞，并如上所述使用标准SOP将其冷冻用于滴定。
在第一项研究中，分析了JBJ-1SLAMF8-突变体细胞(克隆G10)和JBJ-1HTR2A-突变体细胞(克隆F14)。对于HTR2A-细胞系，使用F14细胞系克隆的低传代(第9代)和高传代(第17代)培养物来测定多次传代对病毒复制的影响。荧光图像如图3所示，病毒效价分析的结果如表13所示。
表13：各种细胞系的病毒效价
细胞系 PFU/ml
CEF 8.29E+06
JBJ-1野生型 2.67E+05
JBJ-1HTR2A-克隆F14低通 2.09E+06
JBJ-1HTR2A-克隆F14高通 3.04E+06
HTR2A SLAMF8-克隆G10 1.66E+06
根据GFP荧光和病毒效价结果，HTR2A-和SLAMF8-突变体产生比野生型JBJ-1细胞高约1log的病毒效价，并且在低通或高通HTR2A-细胞之间没有差异。在所有情况下，JBJ-1缺失突变体中的病毒产量低于CEF细胞中的病毒产量，但在1log内，这在生物学上是重要的，因为JBJ-1细胞系被转化而不是原代禽细胞如CEF。
在第二项研究中，将SLAMF8-突变体(克隆G10)和HTR2A-突变体(克隆F14)细胞与几种双重突变体进行比较：HTR2A-/STAT4-(克隆14和74)，HTR2A-/CTSL2-(克隆34和48)和HTR2A-/COBLL1-(克隆2)。荧光图像如图4所示，病毒效价分析的结果如表14所示。
表14：感染HVT-ND-GFP的各种JBJ-1缺失突变体的病毒效价
细胞系 PFU/ml
CEF 5.41E+06
JBJ-1野生型 2.44E+05
HTR2A-克隆F14 1.61E+06
HTR2A-/STAT4-克隆16 1.87E+05
HTR2A-/STAT4-克隆72 2.05E+06
HTR2A-/COBBL1-克隆2 5.52E+05
HTR2A-/CTSL-克隆34 2.73E+05
HTR2A-/CTSL-克隆48 3.63E+05
SLAMF8-克隆G10 1.66E+06
与其它研究一致，根据GFP荧光和病毒效价数据，HTR2A-和SLAMF8-突变体产生比野生型JBJ-1细胞高约1log的病毒效价，并且具有仅稍低于在原代CEF细胞中获得的效价。在双缺失突变体中，HTR2A-/COBLL1-双突变体和HTR2A-/CTSL2-双突变体的表现比JBJ-1野生型细胞好，但可忽略不计。然而，HTR2A-/STAT4-克隆72与HTR2A-单突变体和SLAMF8-单突变体中的每一者表现一样好，或甚至略微更好。
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<170> PatentIn版本3.5
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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acggtcgggc cttctttaaa agcgcttgta tgtgtagggg cggccgtgaa gttgcccggc 120
gtgtcggcag acaccgcgtt gtatccgaac ccgggcttgt gaacgtcttc aaacacgttc 180
aggatagtct cgagcgtgga cagataaacg tacgtccaag caagcggcct tccattatag 240
aggcctacga tcacgtacag tcccgcgtct gtcggttggg cattcgccaa cctgaacgag 300
ggaacgtccg attcgaggaa agccagcttc ccctggacgg attcgtctac ggacgtttgg 360
aatgtacacc cgcggacgtc cacgcggcag ccgtcggtac gcgccgacgc caactgcatg 420
acgtccatat ttgccgcaaa acgacattcg gcatgctcgg gtaccatttg gcattccg 478
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taacttttga atttaaatcc agcaggtttt ccttctccaa ggaagaatcc caaagaagaa 300
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<220>
<223> STAT4 R-In cbPCR引物
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<213> 人工序列
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<223> COBLL1 F-In cbPCR引物
<400> 33
actgccaagt tttccctcct gc 22

Claims (31)

1.一种能够支持马立克氏病病毒(MDV)高效价生长的基因修饰细胞系。
2.根据权利要求1所述的基因修饰细胞系，其中所述细胞系包含永生禽细胞系。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因修饰细胞系，其中所述马立克氏病病毒选自由以下组成的组：马立克氏病病毒血清型1；马立克氏病病毒血清型2；和马立克氏病病毒血清型3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因修饰细胞系，其中所述马立克氏病病毒是重组病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因修饰细胞系，其中所述重组马立克氏病病毒包含插入MDV基因组中一个或多个位置的一种或多种异源抗原。
6.根据权利要求5所述的基因修饰细胞系，其中所述一种或多种异源抗原包含来自致病性禽病毒的抗原。
7.根据权利要求6所述的基因修饰细胞系，其中所述致病性禽病毒选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒；传染性支气管炎病毒；传染性喉气管炎病毒；新城疫病毒；鸡贫血病毒和禽流感病毒。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的重组马立克氏病病毒。
9.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求8所述的药物组合物。
10.一种疫苗，其包含根据权利要求8所述的药物组合物。
11.一种用于治疗禽类马立克氏病的方法，所述方法包含给予治疗量的根据权利要求9所述的疫苗。
12.一种用于产生能够支持马立克氏病病毒(MDV)高效价生长的基因修饰细胞系的方法，所述方法包含：
提供起始细胞系，其中所述起始细胞系是永生禽细胞系，和
通过改变所述起始细胞系的基因以降低表达，从而改变基因HTR2A和SLAMF8之一或两者的产物的功能活性来产生基因修饰细胞系，其中当受到相同MDV毒株感染时，与所述起始细胞系相比，所述基因修饰细胞系能够支持增加MDV病毒效价。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述起始细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1，DF-1；LF-1；LMH；SL-29；DT-40；ESCDL-1；SC-1；SC-2；和ST-2。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述起始细胞系选自由以下组成的组：JBJ-1；DF-1；LF-1；SC-1；SC-2；和ST-2。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述起始细胞系是JBJ-1。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述基因改变包含使用TALEN、ZFN、CRISPR-Cas9或替代性CRISPR-Cas酶改变基因组。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述基因改变包含使用CRISPR-Cas9改变所述基因组。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述基因改变包含使用CRISPR-Cas9进行HTRA2A或SLAMF8基因的纯合改变。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中当受到相同MDV毒株感染时，所述基因修饰细胞系支持比所述起始细胞系高至少10倍的MDV病毒效价。
20.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中当受到相同MDV毒株感染时，所述基因修饰细胞系支持比所述起始细胞系高至少50倍的MDV病毒效价。
21.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述基因修饰细胞系支持的MDV病毒效价在用相同MDV毒株在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上获得的病毒效价的2倍以内。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的方法，其中所述基因修饰细胞系包含改变所述HTR2A基因的所述产物的所述功能活性的基因改变。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述基因修饰细胞系还包含改变一种或多种其它基因的产物的功能活性的基因改变，所述一种或多种其它基因选自由STAT4、COBBL2和CTSL组成的组。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述其它基因包含STAT4。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述基因改变包含使用TALEN、ZFN、CRISPR-Cas9或替代性CRISPR-Cas酶改变所述基因组。
26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述基因改变包含使用CRISPR-Cas9改变所述基因组。
27.一种能够支持MDV高效价生长的基因修饰细胞系，所述基因修饰细胞系通过根据权利要求12至26中任一项所述的方法产生。
28.根据权利要求27所述的基因修饰细胞系，其中所述MDV包含编码插入MDV基因组中一个或多个位置的异源抗原的核酸。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的基因修饰细胞系，其中所述异源抗原来自选自由以下组成的组的家禽病原体：传染性法氏囊病病毒；传染性支气管炎病毒；新城疫病毒；传染性喉气管炎病毒；禽流感病毒；和鸡贫血病毒。
30.一种用于制备MDV疫苗的方法，所述方法包含：通过根据权利要求12至29中任一项所述的方法制备基因修饰细胞系，并使所述MDV在所述基因修饰细胞系中生长。
31.一种MDV疫苗，所述MDV疫苗通过根据权利要求30所述的方法制备。
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