CN113271955A - 用于细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统 - Google Patents

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D·H·阮
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Abstract

本文提供了用于强化细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统。还提供了用于此类系统的经修饰的病毒，以及通过施用此类系统治疗癌症的方法。

Description

用于细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统
相关申请
本申请要求2018年11月6日提交的发明人Antonio Fernandez Santidrian，申请人Calidi Biotherapeutics，Inc.，发明名称为“ENHANCED SYSTEMS FOR CELL-MEDIATEDONCOLYTIC VIRAL THERAPY”的美国临时申请号62/756,550以及2019年1月7日提交的发明人Antonio Fernandez Santidrian、Duong Hoang Nguyen、Dobrin Draganov，申请人Calidi Biothereutics，Inc，发明名称为“ENHANCED SYSTEMS FOR CELL-MEDIATEDONCOLYTIC VIRAL THERAPY”的美国临时申请号62/789,458的优先权。本申请也是同日提交的发明人Antonio Fernandez Santidrian、Duong Nguyen、Dobrin Draganov，申请人Calidi Biothereutics，Inc.，发明名称为“ENHANCED SYSTEMS FOR CELL-MEDIATEDONCOLYTIC VIRAL THERAPY”的相关美国申请号16/676,416。这些申请各自的主题和公开以引用的形式整体并入本文。
以引用的形式并入以电子形式提供的序列表
在此提交序列表的电子版本，其内容以引用的形式整体并入。电子文件创建于2019年11月6日，大小为793千字节，标题为2601SEQ001.txt。
技术领域
提供了用于改善溶瘤病毒疗法的细胞辅助病毒表达系统、系统的用途以及通过给需要此类治疗的对象施用系统来治疗癌症的方法。
背景技术
递送或施用的病毒感染肿瘤和在肿瘤内定殖和/或复制的能力可被循环中和抗体、固有和适应性免疫机制以及针对病毒和/或载体细胞的其它清除机制所阻碍。细胞已被用作递送溶瘤病毒用于癌症疗法的载体。需要改进的系统以强化溶瘤病毒的治疗效果。
发明概述
本文表明，通过将细胞和病毒孵育足以使病毒表达编码基因和/或复制的时间，可改善细胞，如干细胞用于递送溶瘤病毒的用途。孵育后，细胞可在降低的温度下储存以供后续使用。与裸病毒相比，以及与先前使用未与病毒孵育足够时间的细胞相比，延长的孵育增加了溶瘤病毒疗法的有效性。得到的细胞可储存，如低温保存或在降低的温度下储存，以供后续使用。所得的细胞提供更有效的溶瘤病毒的递送载体，可全身施用以及通过其它途径施用，包括瘤内、腹膜内和局部施用。
本文提供了强化溶瘤病毒疗法的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。所述系统包括：(1)允许病毒感染和复制的细胞，如载体细胞；(2)溶瘤病毒；和(3)至少一种由在细胞中表达的病毒编码的表达的免疫调节或治疗基因。CAVES是通过在病毒感染细胞和基因能够表达的条件下孵育细胞和病毒而产生的。示例性细胞强化具有一种或多种为此目的的特性的溶瘤病毒疗法，例如：(a)扩增病毒和病毒编码的蛋白的表达；(b)保护病毒不被体液免疫系统或其它血清成分灭活；和/或(c)促进病毒感染在肿瘤内的定殖和/或扩散。本文提供的系统可使用任何溶瘤病毒和允许病毒扩增和病毒编码的蛋白的表达的任何细胞生成。通常，细胞/载体细胞不是肿瘤细胞或失活的肿瘤细胞，而是如但不限于干细胞和成纤维细胞的细胞。
本文提供的系统可通过将允许病毒感染和复制的细胞和病毒(如溶瘤病毒)一起离体孵育预定的时间段来产生，该时间段足够病毒感染和至少一种病毒编码的免疫调节蛋白和/或至少一种病毒编码和重组表达的治疗蛋白的表达，以及任选地一种或多种细胞/重组细胞蛋白的表达。
为产生不使用细胞作为标准载体而将细胞作为强化溶瘤病毒疗法的系统的部分的CAVES，一般需要多于2-4小时，通常约5或6小时至72或更多小时，例如通常至少5或6小时，或约5或6小时或大于约5或6小时至至少7，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71或72或更多小时或约7，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71或72或更多小时，例如约6小时-18小时，或约12小时-48小时的孵化时间。然而，时间周期取决于系统中使用的特定溶瘤病毒和/或载体细胞及其组合。其为足以使细胞感染病毒，并表达病毒编码的免疫调节蛋白或编码的治疗蛋白的时间。例如，在水疱性口炎病毒(VSV)病毒复制周期中，表达病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组蛋白如治疗蛋白的时间一般相对短，约为2-3小时；对于痘苗病毒，表达病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组治疗蛋白的时间一般较长，约为6-12小时或更长。为制备痘苗病毒CAVES，病毒一般应与细胞孵育至少约6小时。
施用后，不管肿瘤是否允许病毒感染和/或扩增，细胞辅助病毒表达系统(CAVES)立即提供免疫调节和/或治疗蛋白的供给。促进病毒编码的免疫调节和/或治疗基因的表达导致许多优势。这些包括改善对异体环境的适应，因为病毒编码的免疫调节剂在暴露于癌症/肿瘤之前表达，因此它们在施用后立即起作用以阻断患者免疫系统对病毒和/或细胞的排斥。细胞辅助病毒表达系统(CAVES)可促进阻断补体的抑制作用的蛋白质的表达。
尽管自体细胞可用于生产细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，细胞辅助病毒表达系统(CAVES)提供了采用同种异体细胞的方法，使得它们可被制造和储存以用于以标准方案施用。本文提供的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)可标准化用于治疗患者群体，因为病毒扩增和一种或多种病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组表达的治疗基因的表达在体外在施用之前或在储存用于未来施用之前的预定量的时间内启动。因为感染细胞的病毒在施用时表达编码的蛋白质，本文提供的系统的治疗效果不受或较少受患者群体中肿瘤微环境的差异引起的变化的影响。本文提供的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)克服或减轻了与肿瘤中的非许可性癌症/肿瘤、敌对微环境和/或低营养环境相关的困难，其可能是病毒扩增和病毒编码的基因表达的障碍。病毒在肿瘤中的释放和扩散可在施用后立即发生，这是由于事先离体启动的病毒扩增和病毒编码的免疫调节和/或治疗基因的表达。
在本文提供的任何组合物和方法中，如本文提供的修饰用于生成CAVES和用于相关方法中的细胞和/或病毒。如本文所提供的修饰可提供改善的治疗益处，例如通过合并编码的治疗性产物，或可帮助克服免疫屏障和其它屏障如肿瘤血管关闭，以改善治疗功效。在一些实施方案中，细胞被修饰以用于条件永生化，即，它们可通过活化永生化而稳定地扩增以生成大的群体，然后在施用之前去活化以使得不受控制的细胞分裂不会在对象中继续。例如，细胞(“载体细胞”)可被修饰以表达野生型或鲸修饰(突变或例如作为融合蛋白)的c-myc、v-myc、E6/E7、hTERT、SV40大T抗原、loxP和/或tetR中的一种或多种，以使得CAVES的细胞组分适于条件永生化。如此修饰的载体细胞群的扩增可在制备CAVES之前和/或在给对象施用CAVES之前的第一时间活化，并且载体细胞群的扩增可在扩增之后和给对象施用CAVES之前的第二时间失活。
本文提供的系统可在低温保存条件下，例如在-80℃下稳定且无限期地保存，并且可在施用之前根据需要或期望解冻。例如，本文提供的系统在解冻用于施用之前可在保存温度如-20℃或-80℃下存储至少几个小时或在约几个小时(1、2、3、4或5小时)之间或数天，包括至少几年或在约几年(例如但不限于1、2、3年或更长)之间，例如至少或约1、2、3、4或5小时至至少或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30天或1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12个月或1、2、3、4、5或更多年。本文提供的系统还可稳定地存储在制冷条件下如4℃下和/或在冰上运输到施用的位置以进行治疗。例如，本文提供的系统可在施用用于治疗之前在4℃下或冰上保存至少约几小时或约几小时(例如但不限于1、2、3、4或5小时)至至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48或更多小时或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48或更多小时。
本文提供的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)含有在施用用于治疗对象之前预表达的病毒编码蛋白，如免疫调节剂和/或重组表达的治疗蛋白。这允许肿瘤微环境更快地对治疗作出响应。用于生成本文提供的系统的病毒量可小于直接施用病毒而无体外扩增时的量。因为在施用到肿瘤部位之前，病毒扩增和病毒编码的免疫调节剂和/或重组表达的治疗蛋白的表达已在体外以预定量的时间发生，可使用异体细胞来生成本文提供的系统，因为在肿瘤部位的病毒感染和释放可在宿主的免疫细胞启动针对细胞和/或病毒的应答之前发生。因为病毒扩增和病毒编码的免疫调节剂和/或重组表达的治疗蛋白的表达在施用到肿瘤部位之前已在体外以预定量的时间发生，将系统施用到宿主之后可立即原位制造能够在循环中存活更长时间的胞外包膜病毒颗粒(eeV)。
本文还提供了治疗方法，包括给需要此类治疗的对象施用本文提供的系统。所述系统可单独施用或与例如其它免疫肿瘤疗法组合施用，所述其它免疫肿瘤疗法包括但不限于检查点抑制剂、CAR-T细胞、共刺激因子、治疗性抗体、双抗体和抗体-药物偶联物。
发明详述
概要
A.定义
B.细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的组分选择
1.细胞
(i)用于改进的病毒扩增和/或免疫调节的经敏化/保护的细胞载体
(ii)经敏化以对病毒介导的杀伤具有抗性(用于延长的生存和改善的局部免疫抑制)
(iii)用于改善的病毒扩增和/或免疫调节的工程化细胞载体
(iv)表达用于血管正常化/肿瘤血管重编程的血管生成抑制剂的工程化细胞载体
(v)表达用于条件性细胞永生化的转基因的工程化细胞载体
2.病毒
C.CAVES的产生、配制、储存和运输
D.药物组成、组合和试剂盒
1.药物组合物
2.组合
3.试剂盒
E.与CAVES施用的组合(附加)疗法
F.用于治疗的CAVES的施用方式
a.照射或非照射CAVES的施用
b.施用途径
c.设备
d.施用剂量
疗程
G.治疗方法和与治疗相配合的监测
H.待治疗的癌症的示例性类型
I.实例
A.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，在本文的整个公开中提及的所有专利、专利申请、已公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其它已发表的材料全部以引用的形式整体并入本文。如果本文的术语存在多个定义，以本节中的定义为准。当提及URL或其它此类标示符或地址时，应理解此类标示符可改变并且互联网上的特定信息可出现或消失，但等价信息通过搜索互联网找到。其引用表明此类信息的可获得性和公共传播。
如本文所用，“病毒”是指在没有宿主细胞情况下不能生长或复制的任何一组感染性实体。病毒通常包含蛋白质外壳和RNA或DNA作为遗传物质；它们没有半透膜，只能在活细胞中生长繁殖。实例包括流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、塞内卡谷病毒和塞姆利基森林病毒。
如本文所用，“溶瘤病毒”是指在肿瘤对象的肿瘤细胞中选择性复制的病毒。这些病毒包括自然地优先在肿瘤细胞中复制和积累的病毒，如痘病毒，以及已工程化改造好这样做的病毒。某些溶瘤病毒在肿瘤细胞感染后能杀死肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可通过溶解肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的细胞死亡而导致肿瘤细胞死亡。示例性溶瘤病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、弹状病毒、乳头状瘤病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小RNA病毒、Sindbis病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒和柯萨奇病毒。
如本文所用，术语“治疗性病毒”是指被施用以治疗疾病或病症的病毒，所述疾病或病症例如肿瘤性疾病，例如癌症、肿瘤和/或转移或炎症或创伤或其诊断和/或两者。通常，本文中的治疗性病毒是表现出抗肿瘤活性和最小毒性的病毒。
本文所用术语“痘苗病毒”或“VACV”或“VV”表示属于痘病毒家族的大的、复杂的、有包膜的病毒。它具有长度约为190kbp的线性双链DNA基因组，其编码约200种蛋白质。痘苗病毒株包括但不限于西储(WR)、哥本哈根(Cop)、伯尔尼、巴黎、塔什干、天坛、李斯特、惠氏株、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、CVA382、大连I、LIPV、LC16M8、LC16M0、ACAM、WR 65-16、康诺特、JX-594(pexastimogene devacirepvec)、GL-ONC1、vvDDTK突变株、纽约市健康委员会(NYCBH)、EM-63和NYVAC痘苗病毒株、来源于它们的病毒株或修饰的形式。
如本文所用，涉及工程化病毒的“标记”或“选择标记”是指化合物，例如蛋白质，其在病毒内和/或表面的表达和/或存在允许选择具有所需工程化性质的病毒，例如表达重组表达的治疗基因或包括标记蛋白的其它蛋白的病毒。
如本文所用，病毒制剂研究所(LIVP)的李斯特毒株或LIVP病毒毒株是指减毒的李斯特毒株(ATCC目录号VR-1549)，是通过在Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia适应小牛皮肤而产生的(Al’tshtein et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699)。LIVP毒株可例如从Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia获得(参见，例如，Kutinova et al.(1995)Vaccine 13：487-493)；the Microorganism Collectionof FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al.(2010)Environ.Sci.Technol.44：5121-5126)；或可从Moscow Ivanovsky Institute of Virology获得(C0355 K0602；Agranovski etal.(2006)Atmospheric Environment 40：3924-3929)。它对于本领域技术人员也是公知的；因为它是苏联、整个亚洲和印度用于免疫接种的疫苗毒株。该毒株现在被研究人员使用并且是众所周知的(参见例如Altshteyn et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch.Virol.134：1-9；Kutinova et al.(1995)Vaccine 13：487-493；Shchelkunov et al.(1993)Virus Research 28：273-283；Sroller et al.(1998)Archives Virology 143：1311-1320；Zinoviev et al.，(1994)Gene 147：209-214；and Chkheidze et al.(1993)FEBS 336：340-342)。LIVP病毒株包括通过在细胞系中重复传代繁殖LIVP获得的任何病毒毒株或病毒制剂。
如本文所用，“修饰的病毒”是指与病毒的亲代株相比发生改变的病毒。典型的修饰的病毒在病毒基因组中具有一个或多个截短、突变、插入或缺失。修饰的病毒可具有修饰的一个或多个内源性病毒基因和/或修饰的一个或多个基因间区域。示例性修饰的病毒可具有插入到病毒基因组中的一个或多个异源核酸序列。修饰的病毒可含有基因表达盒形式的一或多个异源核酸序列以表达异源基因。
典型地，病毒的基因组是通过核苷酸的取代(置换)、插入(添加)或者缺失(截短)进行修饰。可使用本领域技术人员已知的任何方法进行修饰，包括本文提供的方法，例如基因工程和重组DNA方法。因此，修饰病毒是一种与亲本病毒的基因组相比，其基因组发生改变的病毒。示例性修饰病毒具有插入病毒基因组的一个或多个异源核酸序列。通常，异源核酸包含编码异源蛋白质的开放阅读框，其可在病毒启动子或异源非病毒启动子的控制下插入。例如，本文修饰的病毒可含有一个或多个用于表达异源基因的基因表达盒形式的异源核酸序列。
如本文所用，术语“载体细胞”与“细胞”、“细胞载体”、“载体媒介物”、“基于细胞的递送载体”和“基于细胞的载体”互换使用，其是指可或被病毒感染或以其它方式与病毒相关的任何细胞，例如通过病毒与表面蛋白之间的化学或物理相互作用，或通过细胞的细胞质或细胞核与病毒的感染。如本文所用，载体细胞是指可感染病毒的细胞，例如溶瘤病毒，并且病毒/溶瘤病毒可在其中复制。所得到的载体细胞含有溶瘤病毒或与溶瘤病毒相关。
如本文所用，术语“细胞辅助病毒表达系统”或“细胞辅助病毒增强系统”(CAVES)是指与病毒和至少一种病毒编码的蛋白质结合的载体细胞，所述病毒通常为溶瘤病毒，所述病毒编码的蛋白质例如免疫调节或治疗性基因产物，其通过结合而表达。术语“CAVES”在此可与术语“SNV”互换使用。通过在病毒感染细胞的条件下孵育病毒和细胞，载体细胞与病毒结合，从而由细胞表达病毒蛋白。借助病毒，载体细胞含有或在其表面存在至少一种由病毒编码的免疫调节蛋白或治疗基因产物。在示例性实施方案中，本文提供的CAVES是通过将载体细胞与病毒在体外或体外孵育一段时间以实现病毒编码的免疫调节或治疗蛋白的表达而产生的。该时间段取决于特定的病毒和细胞，而且是在大于约2小时至72小时或更大之间，通常在约3小时至约72小时之间，例如在大约或至少3、4、5或6小时至约或至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72h或更多个小时，并且通常在允许至少一种病毒编码的免疫调节或治疗基因表达的温度下，通常在约37℃或在37℃温度条件下。促进此类表达的特定时间和温度取决于系统中使用的溶瘤病毒的类型。CAVES是通过病毒编码产物的表达和病毒在细胞内的复制而产生的。对于本文的大多数实施方案，用于CAVES的细胞不是肿瘤细胞和/或免疫细胞。
如本文所用，“低温保存”是指在非常低的温度下冷却和储存细胞、组织或器官以保持其活力的过程。典型的低温保存是在-80℃至-200℃之间进行的。低温保存介质是本领域技术人员已知的。例如，此类保存介质通常含有用于繁殖细胞的相同配方，另外，如果细胞已在无血清培养基中繁殖，则推荐包括最多20％的胎牛血清，以及低温保存剂，例如DMSO(7％-10％)和/或甘油(约10％)。据说将所得到的组合物低温保存。
如本文所用，“低温保存组合物”是已在低温保存温度下保存至少24小时的组合物。
如本文所用，“感染复数(MOI)”是指在感染期间每个细胞添加的病毒粒子的数量(即，添加到100万个细胞的100万个病毒粒子的MOI为1)。
如本文所用，“致敏”或“敏化细胞”以改变细胞的性质是指通常在使用前用药剂处理以改变细胞的性质，例如通过诱导基因的表达来处理细胞。
如本文所用，病毒在载体细胞中的扩增是指病毒在细胞中复制以维持病毒或增加细胞中病毒的量。
如本文所用，“宿主细胞”或“靶细胞”可互换地使用，以表示可被病毒感染的细胞。
如本文所用，术语“组织”是指通常作用于在生物体内执行特定功能的类似细胞的组，集合或聚集体。
如本文所用，术语“免疫调节蛋白”或“免疫调节剂”是指由病毒表达的蛋白质，其可保护病毒免受靶细胞的先天和/或获得性免疫系统(例如肿瘤的细胞)的攻击。病毒免疫调节产物已进化到能够承受宿主免疫系统施加的选择性进化压力。这些产物可调节先天和适应性宿主免疫反应。由痘苗编码的示例性免疫调节产物例如包括但不限于VCP(C3L)、B5R、HA(A56R)、B18R/B19R、B8R、CmrC和CMRE。
如本文所用，术语“治疗基因产物”或“治疗多肽”是指由病毒(例如溶瘤病毒)编码的治疗基因表达的任何异源蛋白，其可改善疾病或病症的症状或改善疾病或病症。治疗基因产物包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡、可被活化以抑制细胞生长或促进细胞死亡、或活化另一药剂以抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。任选地，治疗剂可显示或表现出另外的性质，例如允许其用作成像剂的性质，如本文其它地方所述。示例性治疗基因产物包括，例如，免疫检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢剂、信号传导调节剂、抗癌抗体、血管生成抑制剂或其组合。
如本文所用，特定细胞载体(本文也称为细胞媒介物)与待用载体细胞和病毒治疗的癌症对象之间的“匹配”意指着细胞载体与宿主的免疫系统充分相容，以避开对象的免疫系统将病毒递送到对象中的肿瘤。载体细胞也可与病毒匹配，其中匹配的病毒可在细胞中复制。如果病毒在该细胞中扩增/复制并且该细胞将病毒递送至对象体内的肿瘤，则与病毒匹配的载体细胞是用于施用对象的匹配物。在美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请第16/536,073号中提供了鉴定与待治疗对象匹配的载体细胞和鉴定匹配的载体细胞/病毒组合的试验，其内容通过引用整体并入本文。
出于本文的目的，表述“抗体”(例如，针对在免疫细胞群体，例如T细胞、γδ(gd)T细胞、NK细胞和NKT细胞上表达的抗原的抗体，以消耗或抑制免疫应答)包括全长抗体及其包含抗体片段的部分。抗体片段，包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键连接的Fvs(dsFv)、Fd片段、Fd'片段、单链Fvs(scFv)、单链Fabs(scFab)、双抗体、抗独特型(anti-Id)抗体或上述任何一种的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
可使用本领域技术人员已知的标准方法制备抗体，例如单克隆抗体(参见，例如，Kohler et al.，Nature 256：495-497(1975)；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；和WO 02/46455)。例如，用标准方法对动物进行免疫，以产生分泌抗体的体细胞。然后从免疫动物身上取出这些细胞，融合成骨髓瘤细胞。能够产生抗体的体细胞，特别是B细胞，可用于与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可来源于已接触抗原的动物的淋巴结、脾脏和外周血。已从淋巴细胞肿瘤开发了用于产生杂交瘤的融合方法的特异性骨髓瘤细胞系(Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Shulman et al.，Nature，276：269-282(1978)；Volk et al.，J.Virol.，42：220-227(1982))。这些细胞系具有三个有用的特性。首先，它们由于酶缺乏而无法在支持杂交瘤生长的选择性培养基中生长，从而促进了融合杂交瘤从未融合的和类似的无限自繁殖的骨髓瘤细胞中选择融合的杂交瘤。二是具有产生抗体的能力，不具备产生内源性轻或重免疫球蛋白链的能力。第三个特性是它们能有效地与其它细胞融合。生产杂交瘤和单克隆抗体的其它方法对于本领域技术人员是公知的。常规的是产生针对任何多肽的抗体，例如免疫细胞群体上的抗原标记物或免疫检查点。
如本文所用，治疗剂是改善疾病或病症的症状或改善疾病或病症的药剂。治疗剂、治疗化合物或治疗方案包括常规药物和药物疗法，包括用于治疗或预防(即，降低获得特定疾病或病症的风险)的疫苗，这是本领域技术人员已知的并在本文别处描述的。用于治疗肿瘤疾病的治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分，可被活化以抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分，或活化另外的药剂以抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。在本文提供的方法中使用的治疗剂可以是例如抗癌剂。示例性治疗剂包括例如治疗微生物，例如治疗病毒和细菌、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢剂、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、放射疗法、化疗化合物或其组合。
如本文所用，肿瘤细胞或癌细胞是指由于生长和分裂不受调节或控制而异常分裂和繁殖的细胞，即易受不受控制的生长影响的细胞。肿瘤细胞可以是良性或恶性细胞。典型地，肿瘤细胞是一种恶性细胞，可扩散到身体的其它部位，这一过程被称为转移。
如本文所用，病毒制剂或病毒组合物是指通过在培养系统中体内或体外繁殖病毒株，例如痘苗病毒株、痘苗病毒克隆株或经修饰或重组病毒株而获得的病毒组合物。例如，痘苗病毒制剂是指通过在宿主细胞中繁殖病毒株而获得的病毒组合物，通常在使用本领域已知的标准方法从培养系统中纯化。病毒制剂通常由许多病毒颗粒或病毒粒子组成。如果需要，样品或制剂中的病毒颗粒的数量可使用空斑测定来确定，以计算每样品单位体积(pfu/ml)的空斑形成单位的数量，假设所形成的每个空斑代表一个感染病毒颗粒。与其它病毒颗粒相比，制剂中的每个病毒颗粒或病毒粒子可具有相同的基因组序列(即，制剂在序列上是同源的)，或者可具有不同的基因组序列(即，制剂在序列上是异源的)。本领域技术人员应理解，在没有克隆分离的情况下，病毒基因组中的异质性或多样性可在病毒繁殖时发生，例如通过病毒株的自然选择过程中发生的同源重组事件(Plotkin&Orenstein(eds)“Recombinant Vaccinia Virus Vaccines”in Vaccines，3rd edition(1999))。
如本文所用，空斑形成单位(pfu)或感染单位(IU)是指感染性或活病毒的数量。因此它反映了制剂中活性病毒的数量。可使用病毒空斑测定(空斑形成测定)或终点稀释测定来测定pfu，这是本领域技术人员已知的标准测定。
如本文所用，“靶向分子”或“靶向配体”是指任何引导定位到特定细胞、组织或器官的分子信号。靶向配体的实例包括但不限于结合细胞表面分子的蛋白质、多肽或其部分，所述分子包括但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质或其它此类部分。例如，靶向配体包括结合细胞表面受体或针对在靶细胞上选择性表达的抗原的抗体的蛋白质或其部分。靶向配体包括但不限于生长因子、细胞因子、粘附分子、神经肽、蛋白激素和单链抗体(scFv)。
如本文所用，用于施用的递送载体是指脂质基或其它聚合物基组合物，例如脂质体、胶束或反胶束，其与如本文提供的病毒的药剂结合，以递送到宿主对象中。
如本文所用，病毒在特定组织中的积聚是指病毒在给宿主施用病毒后的一段时间后在宿主生物体的特定组织中的分布或定殖，该时间足以使病毒感染宿主的器官或组织。本领域技术人员认识到，病毒感染的时间段取决于病毒、待感染的器官或组织、宿主的免疫能力和病毒的剂量而变化。通常，可在感染病毒后约少于1天、约1天至约2、3、4、5、6或7天、约1周至约2、3或4周、约1个月至约2、3、4、5、6个月或更长时间的时间点测定积聚。出于本文的目的，病毒优先聚集在免疫豁免组织中，如发炎组织或肿瘤组织，但从宿主中的其它组织和器官，如非肿瘤组织中清除，直至病毒的毒性是温和的或可耐受的，且至多不致命的程度。
如本文所用，“优先积聚”是指病毒在第一位置以高于在第二位置积聚的水平积聚(即，在第一位置的病毒颗粒浓度或滴度高于在第二位置的病毒颗粒浓度)。因此，相对于正常组织或器官，优先聚集在免疫豁免组织(免疫系统庇护的组织)如发炎组织和肿瘤组织中的病毒是指以比在正常组织或器官中聚集的病毒更高的水平(即浓度或病毒滴度)聚集在免疫豁免组织如肿瘤中的病毒。
如本文所用，活性是指本文提供的化合物或病毒的体外或体内活性。例如，体内活性是指在体内施用本文提供的化合物或病毒(或其组合物或其它混合物)后产生的生理反应。因此，活性包括此类化合物、组合物和混合物所产生的治疗效果和药物活性。可在工程化改造用于测试或使用此类活性的体外和/或体内系统中观察到活性。
如本文所用，“抗肿瘤活性”或“抗致瘤性”是指在对象体内或体外防止或抑制肿瘤形成或生长的病毒株。抗肿瘤活性可通过评估指示抗肿瘤活性的一个或多个参数来确定。
如本文所用，关于抗肿瘤活性或抗致瘤性的“更大的”或“改进的”活性是指病毒株能够在比参考或对照病毒更大的程度上或在比不使用病毒治疗更大的程度上防止或抑制对象体内或体外肿瘤的形成或生长。抗肿瘤活性是“更大的”还是“改进的”，可通过评估病毒以及必要时对照或参考病毒对指示抗肿瘤活性的参数的影响来确定。应当理解，当比较两种或多种不同病毒的活性时，在体外测定中使用的或在体内施用的病毒量(例如pfu)相同或相似，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内施用方式)相同或相似。
如本文所用，关于病毒的“毒性”(本文也称为毒力或致病性)是指施用病毒时对宿主的有害或毒性作用。对于溶瘤病毒，如痘苗病毒，病毒的毒性与其在非肿瘤器官或组织中的积聚有关，这可能影响宿主的生存或导致有害或毒性效应。可通过评估一个或多个指示毒性的参数来测量毒性。这些包括在非肿瘤组织中的积聚以及对服用药物的对象的生存能力或健康的影响，如对体重的影响。
如本文所用，“降低毒性”是指与未用病毒处理的宿主相比或与用另一参考或对照病毒施用的宿主相比，将病毒施用到宿主时的毒性或有害作用减弱或减轻。毒性是否降低或减轻，可通过评估病毒以及必要时对照或参考病毒对指示毒性的参数的影响来确定。应当理解，当比较两种或多种不同病毒的活性时，在体外测定中使用的或在体内施用的病毒量(例如pfu)相同或相似，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内施用方式)相同或相似。例如，当比较病毒和对照或参考病毒体内施用的效果时，对象是相同的物种、大小、性别，并且病毒在相同或相似的剂量方案下以相同或相似的量施用。特别地，毒性降低的病毒可意味着当将病毒施用到宿主，例如用于治疗疾病时，病毒不会在宿主中的非肿瘤器官和组织中积聚到导致对宿主的损害或伤害的程度，或者不会在比被治疗的疾病更大的程度或比对照或参考病毒更大的程度上影响宿主的生存。例如，毒性降低的病毒包括在治疗过程中不会导致对象死亡的病毒。
如本文所用，“对照”或“标准”指的是除了它没有用测试参数处理，与测试样品基本相同的样品，或者，如果它是血浆样品，它可来自不受感兴趣条件影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。例如，对照可以是具有已知性质或活性的样本(如病毒)。
如本文所用，剂量方案是指施用的药剂量，例如载体细胞或病毒或其它药剂，以及在施用周期过程中的施用频率。剂量方案取决于待治疗的疾病或条件，因此可变化。
如本文所用，施用频率是指在施用周期中施用药剂的次数。例如，频率可以是天、周或月。例如，频率可在一个施用周期内施用一次，两次、三次、四次、五次、六次或七次。频率可指施用周期内的连续天数。特定的频率取决于治疗的特定疾病或条件。
如本文所用，“施用周期”是指在连续施用中重复的病毒施用剂量方案的重复时间表。例如，示例性的施用周期是28天周期。
如本文所用，免疫豁免细胞和免疫豁免组织是指与免疫系统隔离的细胞和组织，例如实体瘤。免疫豁免细胞或组织能耐受抗原的引入而不引起炎症免疫反应。例如，给对象施用病毒会引起一种免疫反应，将病毒从对象身上清除。然而，免疫豁免位点被屏蔽或隔离，不受免疫反应的影响，从而使病毒得以存活和复制。免疫豁免组织包括增殖组织，如肿瘤组织和其它参与其它增殖性障碍的组织和细胞、伤口和其它参与炎症反应的组织。
如本文所用，肿瘤，也称为瘤，是当细胞以异常高的速率增殖时产生的异常组织块。肿瘤包括血液肿瘤和实体肿瘤。肿瘤可表现为部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调。肿瘤可以是良性的(非癌性的)，也可以是恶性的(癌性的)。
如本文所用，应用于肿瘤的恶性是指具有转移能力且失去生长控制和位置控制的原发肿瘤。
如本文所用，转移是指远离病态过程主要涉及的部位的异常或肿瘤细胞的生长。
如本文所用，恶性肿瘤可被广泛地分类为三种主要类型。癌是由上皮结构产生的恶性肿瘤，例如但不限于乳腺、前列腺、肺、结肠和胰腺。肉瘤是起源于结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤，如肌肉、软骨、脂肪或骨。白血病和淋巴瘤是影响造血结构(与血细胞形成有关的结构)的恶性肿瘤，包括免疫系统的组成部分。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤(例如神经纤维瘤)、生殖细胞肿瘤和母细胞肿瘤。
如本文所用，切除的肿瘤是指其中肿瘤的重要部分已被切除的肿瘤。切除可通过外科手术(即手术切除的肿瘤)来实现。切除可以是部分的，也可以是全部的。
如本文所用，疾病或病症是指生物体中由例如感染或遗传缺陷引起的病理状况，其特征是可识别的症状。这里描述的示例性疾病是肿瘤性疾病，例如癌症。
如本文所用，肿瘤性疾病是指涉及癌症的任何病症，包括肿瘤的发展、生长、转移和进展。
如本文所用，癌症是指由任何类型恶性肿瘤或血液系统恶性肿瘤引起或以任何类型恶性肿瘤或血液系统恶性肿瘤为特征的疾病的术语，包括转移癌、淋巴肿瘤和血癌。示例性癌症包括但不限于，急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、恶性上皮肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路或下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤、恶性上皮肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性髓增生性失调症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、表皮样癌、食管癌、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌/眼内黑色素瘤、眼癌/视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胆结石肿瘤、胃部癌/胃癌、胃肠类癌、胃肠间质肿瘤、巨细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、胶质瘤、毛细胞肿瘤、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌/肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、增生、增生性角膜神经肿瘤、原位癌、下咽肿瘤、肠神经节瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌/肾细胞癌、喉癌、平滑肌瘤肿瘤、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性类癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、马凡样体征肿瘤、髓样癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性皮肤癌、转移性颈鳞状癌、口癌、粘膜神经瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性失调症、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、颈部癌症、神经组织癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺胚细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞肿瘤、网状细胞肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、精原细胞瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、颈鳞状癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、局部皮肤病变、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌/子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
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巨球蛋白血症或Wilm氏瘤。通常在人类中诊断的示例性癌症包括但不限于膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、结肠/直肠癌、肾癌、肝癌、肺/支气管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。通常在犬、猫和其它宠物中诊断的癌症包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、脑肿瘤、黑色素瘤、腺鳞癌、类癌性肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小胶质瘤、神经母细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤(例如，粒细胞性肉瘤)、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头状瘤病、血管内皮瘤和囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。在啮齿类动物如雪貂中诊断的示例性癌症包括但不限于胰岛瘤、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。影响农业家畜的示例性肿瘤包括但不限于白血病、血管外皮细胞瘤和牛眼肿瘤(在牛中)；包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞癌(在猪中)；淋巴瘤和肺腺瘤病(在绵羊中)；肺肉瘤、淋巴瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、纤维肉瘤、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴样白血球组织增生(在禽类中)；视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤(淋巴母细胞淋巴瘤)、浆细胞样白血病和鳔肉瘤(在鱼中)、干酪性淋巴结炎(CLA)：由假结核棒杆菌引起的绵羊和山羊的慢性、传染性、感染性疾病，以及由肺腺瘤病引起的绵羊传染性肺肿瘤。
如本文所用，参与疾病或疾病过程的细胞是指其存在有助于、加剧、引起或以其它方式参与疾病或疾病过程的病因学的细胞。抑制或杀死这些细胞可改善疾病的症状或可改善疾病。此类细胞的实例是肿瘤细胞。杀伤或抑制肿瘤细胞的生长或增殖，对肿瘤有治疗作用。其它实例是免疫效应细胞，其参与导致多种疾病的病例的炎症反应。抑制或杀死免疫效应细胞可治疗具有炎症成分的疾病。
如本文所用，“杀伤或抑制细胞的生长或增殖”是指细胞死亡或被消除。抑制生长或增殖是指此类细胞的数量不增加，可减少。
如本文所用，“肿瘤细胞”是作为肿瘤一部分的任何细胞。通常，本文提供的载体细胞优先归属于肿瘤细胞，并且与正常细胞相比，本文提供的病毒优先感染对象中的肿瘤细胞。
如本文所用，“转移细胞”是具有转移潜力的细胞。转移细胞具有从对象中的第一肿瘤转移的能力，并且可在对象中的不同部位定殖组织以在该部位形成第二肿瘤。
如本文所用，“致瘤细胞”是当引入对象的合适部位时可形成肿瘤的细胞。细胞可以是非转移性的，也可以是转移性的。
如本文所用，“正常细胞”是指不是来源于肿瘤，而是来源于健康的非病变组织的细胞。
如本文所用，“转移”是指癌症从身体的一个部分扩散到另一个部分。例如，在转移过程中，恶性细胞可从恶性细胞产生的原发肿瘤部位扩散，并移入淋巴和血管，后者将细胞运送到生物体其它部位的正常组织，在那里细胞继续增殖。由转移扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”、“继发性肿瘤”或“转移瘤”。
如本文所用，抗癌剂或化合物(可与“抗肿瘤剂”互换使用)是指在抗癌治疗中使用的任何药剂或化合物。这些包括单独使用或与其它化合物组合使用时可减轻、减少、改善、预防、或使与肿瘤疾病、肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标记物处于缓解状态或维持缓解状态的任何药剂，并且可用于本文提供的方法、组合和组合物中。抗癌剂包括抗转移剂。示例性抗癌剂包括但不限于化疗化合物，例如但不限于毒素、烷基化剂、亚硝基脲、抗癌抗生素、抗代谢剂、抗有丝分裂剂和拓扑异构酶抑制剂、细胞因子、生长因子、激素、光敏剂、放射性核素、信号传导调节剂、免疫治疗剂、CAR-T细胞、检查点抑制剂、CRISPR疗法、抗癌抗体、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸(例如反义RNA和RNAi，例如siRNA和shRNA)、血管生成抑制剂、放射疗法或其组合。示例性化疗化合物包括但不限于Ara-C、顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、吉西他滨、喜树碱、伊立替康、环磷酰胺、6-巯嘌呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤。
除非另有说明，本文所用的抗癌或化疗剂包括抗癌或化疗剂的组合或多种。
如本文所用，对象包括任何生物体，包括预期对其进行诊断、筛选、监测或治疗的动物。动物包括灵长类和驯养的动物等哺乳动物。典型的灵长类动物是人类。患者是指对象，例如患有疾病的哺乳动物、灵长类动物、人或家畜对象，或其疾病状况有待确定或疾病状况风险有待确定。
如本文所用，患者是指表现出疾病或紊乱症状的人类对象。
如本文所使用的，对具有病症、紊乱或疾病的对象的治疗是指任何方式的治疗，其中病症、紊乱或疾病的症状得到改善或以其它方式有益地改变。治疗包括本文所述和提供的细胞辅助病毒表达系统的任何药物用途。
如本文所用，对具有肿瘤疾病(包括肿瘤或转移)的对象的治疗是指其中具有肿瘤疾病的症状得到改善或以其它方式有益改变的任何治疗方式。通常，对对象中的肿瘤或转移的治疗包括导致肿瘤生长减慢、肿瘤细胞溶解、肿瘤大小减小、防止新肿瘤生长或防止原发肿瘤转移的任何方式的治疗，包括抑制肿瘤的血管化、肿瘤细胞分裂、肿瘤细胞迁移或基底膜或细胞外基质的降解。
如本文所使用的，治疗效果是指通过对对象的治疗而产生的效果，其改变、典型地改善或改善疾病或病症的症状或治愈疾病或病症。治疗有效量是指在施用对象后产生治疗效果的组合物、分子或化合物的量。
如本文所用，例如通过施用特定药物组合物来改善或减轻特定病症的症状是指可归因于或与施用该组合物相关的任何减轻，无论是永久的或暂时的，持久的或短暂的。
如本文所用，效力是指在施用病毒或病毒组合物时，病毒将定殖于增殖或免疫转染的细胞，例如肿瘤细胞，并复制。在肿瘤细胞中的定殖和复制表明该治疗是或将是有效的治疗。
如本文所用，与不使用细胞载体/病毒治疗相比，使用细胞载体/病毒的有效治疗可提高存活率。例如，如果能稳定疾病、导致肿瘤消退、降低疾病的严重程度或减缓或减少肿瘤的转移，则病毒是一种有效的治疗。
如本文所用，用于治疗特定疾病的有效量或治疗有效量的病毒或化合物是改善或以某种方式减少与该疾病相关的症状的量。该量因个体而异，并取决于多个因素，包括但不限于年龄、体重、患者的整体身体状况和疾病的严重程度。治疗有效量可作为单剂量施用，或者可根据方案以多剂量施用，由此其是有效的。该量可治愈疾病，但通常是为改善疾病症状而施用。需要反复施用才能达到所需的症状改善。
如本文所用，用于治疗肿瘤疾病(包括肿瘤或转移)的有效量或治疗有效量的病毒或化合物是改善或以某种方式减少与肿瘤疾病相关的症状的量，包括但不限于减缓肿瘤生长、肿瘤细胞溶解、肿瘤大小减小、防止新肿瘤生长或防止原发肿瘤的转移。
如本文所用，预防疾病或病症意味着降低获得疾病或病症的概率或上升。
如本文所用，“组合物”是指两种或多种产物或化合物的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性、非水性或其任意组合。
本文所用制剂是指含有至少一种活性药物或治疗剂和一种或多种赋形剂的组合物。
如本文所用，共制剂是指含有两种或更多种活性或药物或治疗剂和一种或多种赋形剂的组合物。
如本文所用，组合是指两个或多个项目之间或之间的任何关联。组合物可以是两个或多个单独的项目，例如两种组合物或两种集合物，可以是它们的混合物，例如两个或多个项目的单一混合物，或它们的任何变体。组合的元素通常在功能上是关联的或相关的。示例性组合包括但不限于两种或多种药物组合物、含有两种或更多种活性成分的组合物，例如两种病毒，或病毒和抗癌剂，例如化疗化合物、两种或更多种病毒、病毒和治疗剂、病毒和显像剂、病毒和多种治疗剂和/或显像剂，或其任何组合物。此类组合可包装为试剂盒。
如本文所用，组合物是指两种或多种组分的混合物，例如在药学上可接受的载体中或与之混合的治疗剂。
如本文所用，直接施用是指不经稀释施用组合物。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，任选地包括使用组合和/或其它反应的说明书和用于此类用途的组分。
如本文所用，“制品”是制造和销售的产品。如在本申请中使用的，该术语旨在包括单独含有载体细胞和痘苗病毒或与第二种治疗或治疗能量源联合含有载体细胞和痘苗病毒的制品，所述第二种治疗或治疗能量源包含在相同或不同的包装制品中。
如本文所使用的，设备是指为特定任务制造或适配的东西。这里的示例性设备是覆盖或涂覆或能够接触表皮或皮肤表面的设备。此类设备的实例包括但不限于包扎、绷带、捆绑、衣服、缝合线、贴片、纱布或敷料。
除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数所指物。
如本文所用，范围和量可表示为“大约”或“近似”特定值或范围。“大约”或“近似”也包括确切的量。因此，“约5毫升”是指“约5毫升”，也可以是“5毫升”。通常，“大约”包括预期在实验误差范围内的量。
如本文所使用的，“大约相同”意指在本领域技术人员认为相同的量内或在可接受的误差范围内。例如，典型地，对于药物组合物，在至少1％、2％、3％、4％、5％或10％内被认为是大致相同的。这些量可根据对象对特定成分变化的容忍度而变化。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况发生或不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的实例和所述事件或情况不发生的实例。
如本文所用，“异体细胞”是指对于特定对象在遗传上不同的细胞，因为它们来源于遗传上不同的个体，通常是同一物种的。例如，异体干细胞是来自患者(或同卵双胞胎)以外的供体的干细胞。
如本文所用，“自体细胞”是从待用细胞处理的个体获得的细胞。例如，从待治疗对象(即患者)获得自体细胞。例如，自体干细胞是来自患者的干细胞。
如本文所用，关于细胞载体或载体细胞，术语“工程化”表示细胞的遗传修饰，使得它们表达能够改善或增强细胞性能的蛋白质。例如，可对细胞进行工程化改造以用于改进的病毒扩增和/或改进的免疫调节。
如本文所用，“免疫调节”是指其中免疫应答被修饰到期望水平的任何过程，例如通过诱导、增强或抑制免疫应答。
如本文所用，“免疫抑制”是指免疫应答的抑制或减少。
如本文所用，“免疫豁免”是指不引发免疫应答并可逃避免疫系统的细胞或组织。免疫豁免细胞和组织是指实体瘤和肿瘤微环境等借助肿瘤的免疫抑制特性与免疫系统隔离的细胞和组织。其结果是，溶瘤病毒在肿瘤微环境中优先聚集在肿瘤中，因为它们被免疫系统屏蔽了。然而，免疫豁免组织和细胞被屏蔽或隔离，不受免疫反应的影响，从而使病毒得以存活和复制。
如本文所用，“疾病或病症”是指生物体中由例如感染或遗传缺陷引起的病理状况，并以可识别的症状为特征。
如本文所用，关于病毒感染的“抗性”是指在暴露于病毒时未被病毒感染或被病毒感染到非常低程度的细胞。
如本文所用，关于病毒感染的“允许的”是指在暴露于病毒时容易被感染的细胞。
如本文所用，免疫相容性是指与对象/宿主的免疫系统充分相容的细胞或病毒，以避开对象的免疫系统足够的时间将病毒递送到对象中的肿瘤或癌细胞。
如本文所用，“共培养”是指其中生长两个或更多不同细胞群的细胞培养物。
本文所用的关于细胞的术语“负载”可指细胞与药剂的结合，药剂例如是病毒、小分子、治疗剂及其抗体或抗原结合片段，通过细胞与药剂之间在细胞表面或细胞内部的化学或物理相互作用。
如本文所用，脂肪源干细胞或ADSC是从供体的脂肪组织获得的间充质干细胞。
如本文所用，外周血单个核细胞或PBMC是任何具有圆形核的外周血细胞，例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。
如本文所用，“L14 VV”或“Cal14 VV”是TK插入的Turbo-FP635工程化的痘苗病毒LIVP株。
本文所用“ACAM2000”(具有相同基因组序列的ACAM1000和ACAM2000，以ATCC保藏号PTA-3321保藏；参见美国专利号第6,723,325、6,723,325、7,115,270和7,645,456号)是痘苗病毒的野生型胸苷激酶(TK)阳性Wyeth株。这是一种可从CDC获得的天花疫苗株。ACAM1000是病毒在MRC5细胞中繁殖时的名称；ACAM2000是病毒在Vero细胞中繁殖时的名称。在实施方案中，ACAM2000病毒具有SEQ ID NO：70所示的序列。
如本文所用，本文可互换使用的“CAL-01”或“CAL1”或“WT1”表示从ACAM2000或ACAM1000扩增或培养的病毒。在示例性实施方案中，CAL1病毒具有SEQ ID NO：71所示的序列。
本文所用“CAL-02”或“CAL2”在本文中可互换使用，表示编码外源基因(例如OX40L、4-IBBL、针对检查点抑制剂(例如CTLA-4)的单链抗体)的ACAM2000或CAL1病毒的重组形式。
本文所用的“CAL-03”或“CAL3”，在本文中可互换地使用，表示ACAM2000、CAL1或CAL2病毒的重组形式，其表达抗血管生成基因，例如抗VEGF的单链抗体，任选地与一个或多个其它外源基因结合，例如OX40L、4-IBBL、针对检查点抑制剂的单链抗体，例如CTLA-4。
如本文所用，本文可互换使用的“SNV-1”或“SNV1”是指通过将CAL-01病毒与细胞载体(例如干细胞)孵育而形成的CAVES(或SNV)。当1×107pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-1a(或SNV1a)。当1×106pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-1b(或SNV1b)。当1×105pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-1c(或SNV1c)。
如本文所用，本文可互换使用的“SNV-2”或“SNV2”是指通过将CAL-02病毒与细胞载体(例如干细胞)孵育而形成的CAVES(或SNV)。当1×107pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-2a(或SNV2a)。当1×106pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-2b(或SNV2b)。当1×105pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-2c(或SNV2c)。
如本文所用，本文可互换使用的“SNV-3”或“SNV3”是指通过将CAL-03病毒与细胞载体(例如干细胞)孵育而形成的CAVES或SNV。当1×107pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-3a(或SNV3a)。当1×106pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-3b(或SNV3b)。当1×105pfu的病毒与细胞载体孵育时，得到的SNV被命名为SNV-3c(或SNV3c)。
如本文所用，病毒空斑测定(VPA)是用于测定感染性病毒的数量或病毒滴度的测定，以每毫升或每个样品的空斑形成单位(pfu)给出。
如本文所用，“经预备的”或“受保护的”细胞载体或载体细胞是已预先处理和/或负载了药剂，例如细胞因子，例如干扰素(IFN)，或异体失活/排斥决定簇的拮抗剂，以保护细胞免受免疫应答的细胞。
如本文所用，治疗是指疾病或病症症状的改善。
如本文所用，预防是指预防治疗以降低获得疾病或病症的风险或降低其严重程度。
如本文所用，对象是指可通过本文的方法和用途治疗的任何哺乳动物。哺乳动物包括人类、其它灵长类动物，如黑猩猩、倭黑猩猩，以及大猩猩、犬、猫、牛、猪、山羊等农场动物和宠物。病人是指人类对象。
如本文所用，基因或遗传位点的“失活”是指由该基因或位点编码的一种或多种产物的表达被部分或完全抑制，例如被抑制10％或更多，通常被抑制50％或更多，例如大约或在50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。所述失活可例如通过部分或完全截短位点和/或通过插入外源基因(例如治疗基因)来实现。
如本文所用，除非另有说明，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写是符合它们的通常用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生化命名委员会(参见，(1972)Biochem.11：1726)。
为公开的清楚性，而不是作为限制，详细描述被分成以下小节。
B.细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的组分选择
细胞已被用作溶瘤病毒的载体用于治疗。已理解，在离体细胞中装载病毒，目的是在每个细胞中装载尽可能多的病毒(参见，例如，Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。通常使用至少200个或更多病毒/细胞的感染复数(MOI)来实现这一点。此外，已理解，病毒应该尽可能快地装载，以避免病毒复制的任何过早启动，这降低了细胞载体的生存能力，并且还增加了病毒抗原在细胞表面的不适时递呈，这导致宿主免疫系统消除(参见，例如，Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。本文表明，此类先前的理解是不正确的。本文表明，细胞的感染应在低MOI，通常小于10，例如0.1或更低至约1MOI/细胞下进行，并且病毒与细胞的孵育应进行足够长的时间，以开始病毒复制，并表达病毒基因，例如免疫调节基因产物和治疗性产物。通常，本文提供的含有病毒的细胞在施用时、或冷冻时或冷藏时所含的用于将来使用的病毒，应该含有少于约100个病毒颗粒/细胞，并且应该表达病毒编码的蛋白质。病毒的特定数量取决于所选择的细胞和病毒。例如，对于痘苗病毒和干细胞，如来自脂肪SVF的MSC或细胞，应孵育至少6小时，最多大约35、大约40或大约50小时。初始MOI应小于10PFU/细胞，如0.1至10，或0.01至10，或0.1至1病毒粒子/细胞。通常该细胞是干细胞或原代细胞，例如成纤维细胞，并且不是癌细胞，包括灭活的癌细胞和/或免疫细胞。
1.细胞
与正常细胞相比，溶瘤病毒(OV)具有优先在肿瘤细胞内聚集、复制和杀伤的能力。此类能力可以是病毒(如痘病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒)的固有特征，也可针对此类特性对病毒进行修饰或选择。病毒可在遗传上减毒或修饰，使得它们可绕过对象中的抗病毒免疫和其它防御(例如水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒)，使得它们优先聚集在肿瘤细胞或肿瘤微环境中，和/或使用例如肿瘤特异性细胞表面分子、转录因子和组织特异性microRNAs选择肿瘤细胞或将其工程化到病毒中(参见，例如，Cattaneo et al.，Nat.Rev.Microbiol.，6(7)：529-540(2008)；Dorer et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.，61(7-8)：554-571(2009)；Kelly et al.，Mol.Ther.，17(3)：409-416(2009)；and Naik et al.，Expert Opin.Biol.Ther.，9(9)：1163-1176(2009))。
溶瘤病毒的递送可通过直接瘤内注射来实现。虽然直接瘤内递送减小使正常细胞对病毒的暴露，但由于例如肿瘤部位(例如脑肿瘤)的不可接近性，或对于大面积分布的几个小结节形式的肿瘤或转移性疾病，通常存在限制。病毒可通过全身或局部递送，例如通过静脉施用，或腹膜内施用，和其它此类途径递送。全身递送不仅能将病毒递送到原发肿瘤部位，还能将病毒递送到播散转移灶。
然而，无论递送方式如何，使用溶瘤病毒治疗的成功都可能受到宿主免疫系统的影响，宿主免疫系统可诱导免疫应答并中和病毒(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。例如，静脉注射的病毒暴露于补体和各种免疫细胞以及抗体，其被隔离并随后在诸如肺、脾和肝等器官中清除(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。宿主的免疫系统已进化到可消灭病毒。例如，中和抗体(NAbs)结合病毒，阻断病毒与细胞表面受体的附着并抑制病毒感染，从而限制施用的治疗性病毒的治疗潜力(Jennings et al.(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。除了先天性免疫反应外，以前的接触导致的适应性免疫可能更为特异和有效，也限制了OV的治疗潜力。物理屏障，如肿瘤的细胞外基质和高间质液压力，可阻止病毒颗粒向肿瘤细胞的高效递送(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。
大多数人暴露于多种病毒，包括麻疹病毒、腺病毒、痘苗病毒和呼肠孤病毒，结果表现出预先存在的抗病毒免疫力，这会降低溶瘤病毒疗法的治疗潜力。例如，1970年代中期以前出生的大多数对象都接种了天花疫苗，从而产生了对包括痘苗病毒在内的正痘病毒的抗病毒免疫力。即使对象对特定的OV不具有预先存在的免疫力，初始剂量的病毒也会导致抗病毒免疫应答，从而限制重复剂量的有效性，而重复剂量是实现有效的抗肿瘤应答所必需的。规避此类情况的策略包括使用免疫抑制剂，如环磷酰胺，以及使用载体细胞(细胞载体)绕过免疫系统，将OV递送到肿瘤部位。
使用免疫抑制药物的瞬时免疫抑制，如环磷酰胺、他克莫司、霉酚酸酯和甲基强的松龙琥珀酸钠，已用于器官移植，但在增强系统施用的OV的肿瘤递送方面的成功有限(Guoet al.(2010)Gene Ther.17(12)：1465-1475)。免疫抑制药物的使用还可增加病毒的潜在毒性，此外，还可降低免疫系统启动的任何抗肿瘤应答，否则将有助于溶瘤(Thorne et al.(2010)Molecular Therapy 18(9)：1698-1705)。
载体细胞已被用于OV的递送。载体细胞可模仿病毒进化的方式在宿主体内传播。例如，人类免疫缺陷病毒与循环的树突状细胞(DC)和巨噬细胞结合，这些细胞可迁移到淋巴结并允许病毒到达其目标：CD4+T细胞。此外，通过在细胞间传播而复制的病毒可逃避中和抗体。临床试验表明，溶瘤呼肠孤病毒经静脉施用后结合循环细胞，保持其感染性，即使在中和抗体存在的情况下也能到达肿瘤细胞(Roy and Bell(2013)OncolyticVirotherapy 2：47-56)。使用基于细胞的载体的优点包括将OV特异性地递送到肿瘤细胞，增加其治疗潜力和防止脱靶毒性，以及保护OV免受预先存在的抗病毒免疫的能力。
载体细胞递送OV的有效性取决于几个因素，包括但不限于：(1)病毒的离体装载；(2)病毒在肿瘤部位的体内积聚；和(3)肿瘤部位的病毒扩增/产生(Guo et al.(2010)GeneTher.17(12)：1465-1475)。理想的载体细胞既能保护OV不被免疫系统中和，又能特异性地将其递送至肿瘤，并且其具有自身的抗肿瘤活性。载体细胞应该是施用安全，易于分离和/或制造，易受病毒感染，允许病毒复制，并在被破坏之前在肿瘤部位释放病毒。
对于本文提供的CAVES，载体细胞除了对OV的递送有效外，还必须能够促进病毒的离体扩增(复制)和至少一种病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组表达的治疗蛋白的表达。在本文提供的系统中，将诸如载体细胞的细胞与病毒孵育预定的时间量，该时间量允许病毒的离体复制(扩增)和至少一种病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组表达的治疗蛋白的表达。时间量可根据病毒的复制周期而变化，例如从超过2小时，例如3或更多小时，超过4小时，例如6-48小时至例如72或更多小时。例如，VSV是一种快速复制的病毒，如果在感染1-2小时后注射细胞，则可实现经由载体细胞的递送。对于复制速度较慢的病毒，如痘苗病毒，在优化感染和递送载体细胞的时机方面有更大的灵活性。
在本文提供的系统中使用的细胞可以是自体的或异体的。自体载体细胞(从待治疗的对象获得的细胞)的使用可最大限度地减少针对载体细胞的先天和免疫反应，但对对象来说可能是繁重的、昂贵的以及有限的可获得性。异体载体细胞，其可包括各种容易分离和/或市售的细胞/细胞系，为对象提供易得性和非侵袭性；然而，先天和/或适应性免疫应答的更大程度可能损害其治疗效果和临床适用性。
本文提供的系统通过在病毒的治疗作用上提供领先的开始克服或减轻宿主免疫应答，即通过在施用之前离体病毒复制和免疫调节和/或重组表达的治疗蛋白的表达，从而允许使用异体细胞来产生系统。本文提供的系统中使用的细胞也可匹配或优化，以使其对所治疗的特定对象的治疗效果在免疫上相容或以其它方式最佳。在美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请号第16/536,073号中描述了用于将细胞与病毒以及进一步与对象匹配的方法。如美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请号第16/536,073号及以下所述，本文提供的系统中使用的细胞也可被修饰以克服或减轻免疫宿主应答。修饰的细胞也可与病毒和/或待治疗的对象匹配。
在一些实施方案中，用于产生本文提供的CAVES系统的载体细胞不是肿瘤细胞。在其它实施方案中，载体细胞不是癌细胞。在另一些实施方案中，载体细胞不是癌细胞系，例如永生化癌细胞系。在实施方案中，载体细胞选自基质细胞、干细胞和成纤维细胞。
下面描述可用于产生本文提供的系统的示例性细胞，例如载体细胞。
干细胞、免疫细胞、癌细胞系
干细胞、免疫细胞和肿瘤/癌细胞可用作溶瘤病毒(OV)的递送载体，其中包括HSV-1、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒和腺病毒等。这些细胞具有肿瘤归巢特性，增强了OV的治疗效果。此类肿瘤选择性是由于这些细胞对肿瘤微环境的吸引力，肿瘤微环境的特征是缺氧、炎症和大量的趋化分子，如细胞因子和趋化因子。
干细胞
干细胞具有固有的肿瘤归巢能力，使其成为溶瘤病毒治疗的载体细胞。这要归因于肿瘤微环境(TME)，肿瘤微环境中富含多种生长因子、血管生成因子、细胞因子和趋化因子，支持肿瘤的无节制生长。TME的低氧性也促进了干细胞向肿瘤的迁移。干细胞被用作载体细胞是因为它们具有高度的免疫抑制性，并且表达抗原处理和递呈所需的较低水平的分子，延迟免疫系统对它们所携带的病毒的识别(Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。可用作OV载体细胞的干细胞实例包括内皮祖细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
已显示内皮祖细胞归巢到肿瘤新血管系统的位点，并且已用于在人神经胶质瘤的鼠模型中递送溶瘤麻疹病毒(Guo et al.(2008)Biochim Biophys Acta 1785(2)：217-231)。这些细胞在体内迅速分裂，但不是永生的，必须从临床样本中反复分离出新的细胞(Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。
神经干细胞(NSC)分化为神经系统的各种不同细胞，包括神经元和胶质细胞，是第一个被研究作为向脑肿瘤递送治疗剂的载体细胞的干细胞(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457)。由于低氧诱导因子(HIF)介导胶质瘤细胞中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和尿激酶纤溶酶原活化物(uPA)的表达，NSC显示出对胶质母细胞瘤肿瘤的强烈倾向性(Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。NSC已被用于向胶质瘤递送IL-4、IL-12、IL-23、胞嘧啶脱氨酶、抗血管生成蛋白血栓素和腺病毒等OV。NSC必须在手术过程中从胎儿脑组织或成人脑室周围分离，这不利于其作为载体细胞的应用。
成人骨髓已被用作干细胞的替代来源，因为骨髓干细胞很容易获得，并且可从患者自身获得用于自体移植，阻止了免疫排斥(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457)。骨髓间充质干细胞(MSC)是一种很有吸引力的载体细胞，因为MSC易于从患者体内分离和体外扩增，支持OV的复制和保护其不被免疫系统立即中和，它们可容易地被工程化并且由于炎性细胞因子的肿瘤相关表达，它们在体内固有地归巢肿瘤。MSC甚至可作为独立的抗癌药物。例如，研究已证明了表达IFN-β的MSC的肿瘤归巢能力和溶瘤效应(Nakashima et al.(2010)Cytokine Growth Factor Rev.21(2-3)：119-126)。
MSC在其细胞表面表达低水平的MHC I类分子，而不表达MHC II类分子，其允许异体移植。MSC还可抑制T细胞增殖和单核细胞向树突状细胞(DC)的分化，并且可抑制CD4+T辅助细胞产生的干扰素伽马和肿瘤坏死因子的表达(Kim et al.(2015)Viruses7：6200-6217)。MSC还能够通过分泌蛋白酶降解细胞外基质，这有助于克服溶瘤病毒递送的物理障碍(Ramirez et al.(2015)Oncolytic Virotherapy 4：149-155)。使用MSC的另一个优点是，它们可在病毒感染后被冷冻，并且在解冻后保持活跃的病毒复制和抗肿瘤活性，从而允许它们的储存(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。除骨髓外，MSC还可从脂肪组织、脐带血、外周血、肌肉、软骨和羊水中分离，其中脂肪组织是最有吸引力的来源，这是因为脂肪组织易于获取和丰富(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Nakashima et al.(2010)Cytokine Growth Factor Rev.21(2-3)：119-126)。
MSC已作为溶瘤腺病毒的载体用于治疗胰腺癌、脑癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和卵巢癌，并作为麻疹病毒的载体用于治疗卵巢癌和肝细胞癌(Kim et al.(2015)Viruses7：6200-6217)。例如，MSC已被用作溶瘤腺病毒ICOVIR-5的载体，用于治疗晚期转移性神经母细胞瘤的儿童(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Ramirez et al.(2015)Oncolytic Virotherapy 4：149-155)。
然而，使用MSC的一个缺点是其促进肿瘤生长的潜力，这已在乳腺癌、子宫内膜肿瘤和胶质瘤的模型中得到证实。为克服此类潜在的下降，可对MSC进行工程化改造，例如通过携带自杀基因(Kerrigan et al.(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457)，以确保其在OV递送时被破坏。
可用作载体细胞的干细胞(自体或异体)的实例包括：成体干细胞；胚胎干细胞；胎儿干细胞；神经干细胞；间充质干细胞；全能干细胞；多能干细胞；诱导的多能干细胞；专能干细胞；寡能干细胞；单能干细胞；脂肪基质干细胞；内皮干细胞(例如，内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞、周细胞)；成体外周血干细胞；成肌细胞；小的幼年干细胞；皮肤成纤维干细胞；组织/肿瘤相关的成纤维细胞；上皮干细胞；和胚胎上皮干细胞。
间充质细胞包括但不限于例如分离自/来源于以下的间充质干细胞：成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞、肌肉卫星细胞等。
脂肪基质血管成分来源的细胞群
在实施方案中，在本文提供的系统和方法中使用的载体细胞是从脂肪组织基质血管成分(SVF)新鲜分离的，和/或是SVF衍生的培养的脂肪衍生间充质基质/干细胞(AD-MSC)。本领域技术人员已知并在此提供的任何溶瘤病毒可与此类细胞组合以产生本文提供的CAVES系统和/或在本文提供的方法中使用它们。在一些实施方案中，溶瘤病毒是痘苗病毒(VACV)。在实施方案中，VACV是具有SEQ ID NO：70所示序列的ACAM2000，或者是具有SEQID NO：71所示序列的CAL1病毒。
通过流式细胞术、显微镜观察和体外共培养的VACV载体细胞在人血清或健康供者外周血单个核细胞存在下的病毒空斑测定，分析了这些载体细胞保护、递送和扩增病毒以及克服先天和适应性免疫屏障的能力。进行比较分析以建立统计学上显著的相关性，并评估干细胞对关键免疫细胞群活性的影响。研究发现SVF细胞对VACV具有抗血清失活的保护作用。细胞分选表明外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)是SVF细胞的主要群体，它们最有效地向肿瘤细胞递送溶瘤病毒。这证明了它们作为自体环境和异体环境中强化溶瘤病毒治疗的工具的临床应用。
培养的AD-MSC(来源于CD34+SA-ASC)作为载体，在自体和异体环境中，在人PBMCs存在的情况下，具有抗血清失活和扩增病毒的作用。这可能与它们固有的免疫抑制特性和逃避异体排斥反应有关。本文表明，这些细胞通过抑制源自先天(NK)免疫细胞和适应性(T)免疫细胞的抗病毒应答提供短暂的免疫抑制，从而增强病毒溶瘤和抗肿瘤免疫的产生。
本文提供了SA-ASC和周细胞作为本领域技术人员已知的溶瘤病毒的载体细胞，包括本文所述或提供的任何载体细胞。其中包括但不限于痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、汉坦病毒、粘液瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)和慢病毒。示例性病毒是痘苗病毒，例如ACAM1000和ACAM2000，其示例性是SEQ ID NO：70中所示的序列，或CAL1，其示例性是SEQID NO：71中所示的序列，或在除ITRs之外的基因组中的微小变异(85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性，并且可能由于在复制期间ITRs的重组而更降低的序列相同性)。通过培养这些细胞产生的SA-ASC(CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)、SA-ASC和/或周细胞和/或AD-MSC可一起孵育一段时间，该时间足以使溶瘤病毒在SA-ASC、周细胞或AD-MSC载体细胞的表面或内部表达至少一种免疫调节或重组治疗蛋白，以产生本文提供的CAVES系统。
从促进病毒感染和/或复制的脂肪SVF中分选细胞群可例如通过将SVF与溶瘤病毒如ACAM1000、ACAM2000或CAL1在适于此类感染的温度下孵育来进行，该温度例如室温(大约20℃)，或更高的32-42℃，例如35-40℃，典型地为37℃。以合适的MOI，通常是低的MOI，例如约0.001-10，例如0.01-1.0，或1.0或更低的MOI，以连续旋转，例如以20RPM，进行大约20分钟至大约5小时，通常大约30分钟至大约2小时，将病毒装载到细胞中。在实施方案中，孵育大约1小时。在SVF细胞或亚群或由其产生的MSC负载溶瘤病毒后，可用针对不同细胞群的细胞表面标记物(例如CD235a、CD45、CD34、CD31和CD146)的一组抗体标记细胞，并用合适的染色剂，例如碘化丙啶(PI)染色存活力。然后通过流式细胞术根据细胞表面标记的表达对SVF细胞进行分类。脂肪SVF中有7种不同的细胞群：红细胞(CD235a+)；外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)，其是培养中MSC的主要前体；周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)，其在培养中也是MSC前体；粒细胞(CD235a-/CD45中等/高，侧向散射(SSC)高)；淋巴细胞(CD235a-/CD45高，SSC低)；单核细胞(CD235a-/CD45高，SSC中)；和内皮祖细胞(CD235a-/CD45-/CD34+/CD146+/CD31+)。主要细胞群的组成(％)描述于实施例4。
为测量病毒感染，然后可将来自SVF的分选的单个细胞群体接种在合适的受体细胞单层上，例如A549肿瘤细胞单层，并孵育一段允许空斑形成的时间，例如1-5天，例如1-3天或3天或大约3天。细胞单层中形成的空斑数可通过固定并用合适的染色剂(如结晶紫)染色来测量，以确定来自每个分类群体的携带溶瘤病毒的细胞的数量。在脂肪SVF中，发现5种不同的细胞群：红细胞、SA-ASC、周细胞、粒细胞和淋巴细胞被发现携带溶瘤病毒，如痘苗病毒，如ACAM2000或CAL1。3种SVF组分(如ACAM2000或CAL1)中的主要细胞群被鉴定为SA-ASC(MSC前体)和周细胞。这些细胞群也能促进病毒的扩增。
因此，本文还提供了来源于SVF的红细胞、SA-ASC、周细胞、粒细胞和淋巴细胞，用于与溶瘤病毒一起使用的载体细胞。在实施方案中，溶瘤病毒是痘苗病毒(VACV)。在另外的实施方案中，VACV是具有SEQ ID NO：70所示序列的ACAM2000，或者是具有SEQ ID NO：71所示序列的CAL1病毒。在实施方案中，红细胞、SA-ASC、周细胞、粒细胞和淋巴细胞可一起孵育一段时间，该时间足以使溶瘤病毒在SA-ASC或周细胞载体细胞表面或内部表达至少一种免疫调节或重组治疗蛋白，从而产生本文提供的CAVES系统。
免疫细胞
免疫细胞对转移到癌症部位的肿瘤释放的“危险信号”作出反应，已被研究作为用于OVs的载体细胞。免疫细胞包括但不限于T细胞、靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞、靶向肿瘤特异性抗原的TCR转基因细胞；例如，NKT细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、髓系来源的抑制细胞、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞和细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。免疫细胞作为载体细胞是有吸引力的，因为它们进行系统循环并能识别肿瘤(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。使用免疫细胞作为OV的载体还以直接细胞毒性的形式或通过启动适应性抗肿瘤免疫应答提供额外的抗肿瘤活性(Jennings et al.(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。
例如，肿瘤抗原特异性T细胞显示出直接的抗癌效应功能，并且活化T细胞在OVs到肿瘤的递送中已被广泛研究。已表明，用OV负载过继转移的T细胞可帮助对抗肿瘤微环境的免疫抑制性质，因为病毒感染的促炎性质可阻止T细胞的沉默和失活(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。趋化因子如CCL3、CCL21和CXCL10(IP-10)的瘤内表达增强了过继T细胞的肿瘤特异性运输。T细胞也可基因工程来表达趋化因子受体，例如CXCR2，以帮助将它们导向肿瘤(Guo et al.(2008)Biochim Biophys Acta1785(2)：217-231)。研究表明，水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和逆转录病毒颗粒可附着在T细胞表面，并且可被动地或通过载体与肿瘤细胞之间的细胞突触传递给肿瘤细胞(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。尽管使用T细胞作为OV的载体具有优势，但提高T细胞群体对抗来自患者的高度肿瘤特异性抗原仍然非常昂贵且困难，这限制了它们的使用(Willmon et al.(2009)Molecular Therapy17(10)：1667-1676)。
淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)已与IL-2联合应用于卵巢癌的治疗。未成熟树突状细胞(iDC)、LAK细胞及其共培养物(LAKDC)被测试为呼肠孤病毒在卵巢癌治疗中的载体，并且表明，负载呼肠孤病毒的LAKDC能够保护呼肠孤病毒免受中和抗体的侵害，诱导促炎性细胞因子环境，并产生先天和适应性抗肿瘤免疫应答(Jennings et al.(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。DC细胞还被用作呼肠孤病毒的载体用于黑色素瘤的治疗(Jennings et al.(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。
CIK细胞是另一可作为OV载体的免疫细胞。肿瘤抗原特异性T细胞识别一种抗原，而CIK细胞识别NKG2D配体，这些配体通常在多种肿瘤细胞上上调，使其具有更多的通用性。CIK细胞也更容易从患者中分离并离体扩增，并能够产生高滴度的病毒，并且已被用于将麻疹和痘苗病毒递送给肿瘤(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56；Willmonet al.(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676；Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。然而，使用CIK细胞的一个缺点是，它们的产生需要在体内使用细胞因子扩增初级白细胞(Kim et al.(2015)Viruses 7：6200-6217)。
巨噬细胞是OV的另一类潜在载体细胞。由于肿瘤常分泌单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞集落刺激因子和VEGF，单核细胞自然迁移至肿瘤部位，定位于缺氧区，并分化为肿瘤相关巨噬细胞，其可增强肿瘤生长抑制(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。因此，巨噬细胞已被临床前研究用于溶瘤腺病毒和麻疹病毒的递送。除了讨论的其它类型的免疫细胞外，髓系来源的抑制细胞也被研究作为递送溶瘤VSV的载体细胞。
癌细胞
为安全起见，癌细胞通常在施用前用伽玛射线灭活，其也被用作OV的载体细胞。γ-辐射可防止致肿瘤性，但保持病毒产生。另一项安全措施涉及到OV的工程化以表达自杀基因，如胸苷激酶，以确保癌细胞不会无限期地留在对象体内(即被杀死而不再永生)。或者，可使用通常被受体免疫系统清除的异体癌细胞(Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。
癌细胞可大量获得，并且显示出比正常细胞更高的病毒感染性和扩增水平(Guoet al.(2010)Gene Ther.17(12)：1465-1475；Roy and Bell(2013)OncolyticVirotherapy 2：47-56)。此外，一些肿瘤细胞特异性地迁移到某些器官，如转移性疾病。例如，骨髓瘤细胞表达高水平的趋化因子受体CXCR4，导致骨髓转移，并且已用于溶瘤麻疹病毒的递送(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。多种转化细胞系已被证明能在免疫能力强和免疫缺陷的动物体内递送溶瘤的细小病毒、麻疹病毒和水疱性口炎病毒。例如，用VSV或腺病毒感染的癌细胞已被用于将病毒有效地递送到小鼠的肺部转移(Willmon et al.(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676；Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。然而，由于实体瘤细胞直径较大，在小鼠静脉注射后，其细胞在肺中积累。因此，造血/血液学来源的癌细胞可以是更好的替代，因为它们在体内分布更广，并且可将OV递送到肺外的解剖位置(Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。
可用作载体细胞的异基因人血液恶性肿瘤细胞系的实例包括：白血病细胞(例如，KASUMI-1、HL-60、THP-1、K-562、RS4；11、MOLT-4、CCRF-CEM、JVM-13、31E9、ARH-77、MoB、JM1、NALM-1、Propak-X.36)；T细胞白血病细胞(例如，HM-2、CEM-CM3、Jurkat/Jurkat克隆E6-1、J.CAM1.6、BCL2 Jurkat、BCL2 S87A Jurkat、BCL2 S70A Jurkat、Neo Jurkat、BCL2 AAAJurkat、J.RT3-T3.5、J45.01、J.Gamma1、J.Gamma1.wt、JK28、P116、P116.cl39、A3、JX17、D1.1、I9.2、I2.1)；粒单核细胞白血病细胞(例如MV-4-11)；淋巴瘤细胞(例如，HT、BC-3、CA46、Raji、Daudi、GA-10-Clone-4、HH、H9)；非霍奇金氏淋巴瘤细胞(例如，SU-DHL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-4、SU-DHL-5、SU-DHL-6、SU-DHL-8、SU-DHL-10、SU-DHL-16、NU-DUL-1、NCEB-1、EJ-1、BCP-1、TUR、U-937)；Burkitt淋巴瘤细胞(例如，Ramos/RA 1、Ramos.2G6.4C10、P3HR-1、Daudi、ST486、Raji、CA46、来自Burkitt淋巴瘤患者人γ疱疹病毒4/HHV-4面颊肿瘤、DG-75、GA-10、NAMALWA、HS-Sultan、Jiyoye、NC-37、20-B8、EB2、1G2、EB1、EB3、2B8、GA-10克隆20、HKB-11/肾-B细胞杂合体)；弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞(例如，Toledo，Pfeiffer)；套细胞淋巴瘤细胞(例如，JeKo-1、JMP-1、PF-1、JVM-2、REC-1、Z-138、Mino、MAVER-1)；AML细胞(例如，AML-193、BDCM、KG-1、KG-1a、Kasumi-6、HL-60/S4)；CML细胞(例如，K562、K562-r、K562-s、LAMA84-r、LAMA84-s、AR230-r、AR230-s)；ALL细胞(例如，N6/ADR、RS4；11、NALM6克隆G5、Loucy、SUP-B15、CCRF-SB)；红白血病细胞(例如，IDH2-突变体-TF-1等基因细胞系)；粒细胞白血病细胞(例如GDM-1)；恶性非霍奇金氏NK淋巴瘤细胞(例如，NK-92、NK-92MI)；骨髓瘤/浆细胞瘤细胞(例如，U266B1/U266、HAA1、SA13、RPMI8226、NCI-H929、MC/CAR)；多发性骨髓瘤细胞(例如，MM.1R、IM-9、MM.1s)；和巨噬细胞系(例如，MD，SC，WBC264-9C)。
商业异体细胞系包括：间充质干细胞，例如APCETH-201、APCETH-301(APCETH)、Cx601(TIGENIX)、TEMCELL、MSC-100-IV、Prochymal(MESOBLAST)；诱导多能干细胞(iPSC)，例如ToleraCyte(Fate Therapeutics)；成纤维细胞，例如CCD-16Lu、WI-38；肿瘤相关成纤维细胞，例如，Malme-3M、COLO 829、HT-144、Hs 895.T、hTERT PF179TCAF；内皮细胞，例如HUVEC，HUVEC/TERT2，TIME；胚胎上皮细胞，例如，HEK-293、HEK-293STF、293T/17、293T/17SF、HEK-293.2sus；胚胎干细胞，例如hESC BG01V；和上皮细胞，例如NuLi-1、ARPE-19、VK2/E6E7、Ect1/E6E7、RWPE-2、WPE-stem、End1/E6E7、WPMY-1、NL20、NL20-TA、WT 9-7、WPE1-NB26、WPE-int、RWPE2-W99、BEAS-2B。
自体或异体全肿瘤细胞疫苗包括分泌GM-CSF的全肿瘤细胞疫苗(GVAX)，例如GVAX前列腺(基于PC3/LNCaP)细胞；GVAX胰腺细胞；GVAX肺细胞；和GVAX肾细胞，购自CellGenesys/Biosante/Aduro Biotech。
同种异体人肿瘤细胞系包括，例如，NCI-60panel(BT549、HS 578T、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D、SF268、SF295、SF539、SNB-19、SNB-75、U251、Colo205、HCC 2998、HCT-116、HCT-15、HT29、KM12、SW620、786-O、A498、ACHN、CAKI、RXF 393、SN12C、TK-10、UO-31、CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR、A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、LOX IMVI、M14、MALME-3M、MDA-MB-435、SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、NCI-ADR-RES、DU145、PC-3)。其它异体人肿瘤细胞系包括，例如，纤维肉瘤细胞系(HT-1080)；肝癌细胞系(Hih-7)；前列腺癌细胞系(LAPC4、LAPC9、VCaP、LuCaP、MDA PCa 2a/2b、C4、C4-2、PTEN-CaP8、PTEN-P8)；乳腺癌细胞系(HCC1599、HCC1937、HCC1143、MDA-MB-468、HCC38、HCC70、HCC1806、HCC1187、DU4475、BT-549、Hs 578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-157、MDA-MB-453、HCC1599、HCC1937、HCC1143、MDA-MB-468、HCC38、HCC70、HCC1806、HCC1187、DU4475、BT-549、Hs 578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-157、MDA-MB-453、BT-20、HCC1395、MDA-MB-361、EMT6、T-47D、HCC1954)；头颈部癌细胞系(A-253、SCC-15、SCC-25、SCC-9、FaDu、Detroit 562)；肺癌细胞株(NCI-H2126、NCI-H1299、NCI-H1437、NCI-H1563、NCI-H1573、NCI-H1975、NCI-H661、Calu-3、NCI-H441)；胰腺癌细胞系(Capan-2、Panc10.05、CFPAC-1、HPAF-II、SW 1990、BxPC-3、AsPC-1、MIA PaCa-2、Hs 766T、Panc 05.04、PL45)；卵巢癌细胞系(PA-1、Caov-3、SW626、SK-OV-3)；骨癌细胞系(HOS、A-673、SK-PN-DW、U-2OS、Saos-2)；结肠癌细胞系(SNU-C1、SK-CO-1、SW1116、SW948、T84、LS123、LoVo、SW837、SNU-C1、SW48、RKO、COLO 205、SW1417、LS411N、NCI-H508、HT-29、Caco-2、DLD-1)；胃癌细胞系(KATOIII、NCI-N87、SNU-16、SNU-5、AGS、SNU-1)；妇科癌细胞系(SK-LMS-1、HT-3、ME-180、Caov-3、SW626、MES-SA、SK-UT-1、KLE、AN3-CA、HeLa)；肉瘤细胞系(SW684，HT-1080，SW982，RD，GCT，SW872，SJSA-1，MES-SA/MX2，MES-SA，SK-ES-1，SU-CCS-1，A-673，VA-ES-BJ，Hs822.T，RD-ES，HS 132.T，Hs 737.T，Hs 863.T，Hs 127.T，Hs 324.T，Hs 821.T，Hs 706.T，Hs707(B).Ep，LL 86/LeSa，Hs 57.T，Hs 925.T，GCT，KHOS-312H，KHOS/NP R-970-5，SK-LMS-1，HOS)；黑色素瘤细胞系(SK-MEL-1，A375，G-361，SK-MEL-3，SH-4，SK-MEL-24，RPMI-7951，CHL-1，Hs 695T，A2058，VMM18，A375.S2，Hs 294T，VMM39，A375-P，VMM917，VMM5A，VMM15，VMM425，VMM17，VMM1，A375-MA1，A375-MA2，SK-MEL-5，Hs 852.T，LM-MEL-57，A101D，LM-MEL-41，LM-MEL-42，MeWo，LM-MEL-53，MDA-MB-435S，C32，SK-MEL-28，SK-MEL-2，MP38，MP41，C32TG，NM2C5，LM-MEL-1a，A7/M2A7)；鳞状细胞癌细胞系(SiHa，NCI-H520，SCC-15，NCI-H226，HCC1806，SCC-25，FaDu，SW 954，NCI-H2170，SCC-4，SW 900，NCI-H2286，NCI-H2066，SCC-9，SCaBER，SW579，SK-MES-1，2A3，UPCI：SCC090，UPCI：SCC152，CAL 27，RPMI 2650，UPCI：SCC154，SW756，NCI-H1703，ME-180，SW962)；肝癌细胞系(Hep G2、Hep 3B2.1-7/Hep3B、C3A、Hep G2/2.2.1、SNU-449、SNU-398、SNU-475、SNU-387、SNU-182、SNU-423、PLC/PRF/5)；膀胱癌细胞系(5637、HT-1197、HT-1376、RT4、SW780、T-24、TCCSUP、UM-UC-3)；肾细胞癌细胞系(ACHN、786-O/786-0、769-P、A-498、Hs 891.T、Caki-2、Caki-1)；胚胎癌/睾丸畸胎瘤细胞系(NTERA-2cl.D1、NCCIT、Tera-2、Tera-1、Cates-1B)；胶质母细胞瘤细胞系(LN-229、U-87MG、T98G、LN-18、U-118MG、M059K、M059J、U-138MG、A-172)；星形细胞瘤细胞系(SW1088、CCF-STTG1、SW 1783、CHLA-03-AA)；脑癌细胞系(PFSK-1、Daoy)；甲状腺癌细胞系(TT、MDA-T68、MDA-T32、MDA-T120、MDA-T85、MDA-T41)和间皮瘤细胞系(NCI-H28、NCI-H226、NCI-H2452、NCI-H2052、MSTO-211H)。
匹配细胞
可测试用于本文提供的系统中的任何细胞，例如上面描述的那些细胞，其与病毒和/或施用病毒治疗的对象的匹配相容性，即细胞克服或改善针对细胞和/或相关病毒的先天和/或适应性免疫应答的能力。选择与对象匹配的细胞可进一步增加本文提供的系统的治疗功效。筛选最佳细胞-病毒组合(例如，细胞促进病毒扩增的能力)和与对象匹配的细胞的方法描述于美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请第16/536,073号。本文还提供了修饰的细胞载体，所述修饰的细胞载体以一种或多种方式敏化和/或工程化改造以用于改进的细胞递送(参见，例如下面的部分)。
具有改进的递送和/或匹配能力的修饰的细胞载体
本文还提供了细胞载体(载体细胞)，其性质被修饰以促进溶瘤病毒向对象的递送和/或提供与对象的改进的匹配。本文提供的任何细胞载体(例如，干细胞、免疫细胞、癌细胞)都可如此修饰。此类性质可包括但不限于，在细胞递送载体中改进的病毒扩增便利性、改进的逃避针对细胞载体和/或病毒的免疫应答的能力和/或改进的免疫抑制。在实施方案中，免疫调节能力(例如，逃避免疫应答、抑制免疫应答)可以是局部的和/或瞬时的，以促进病毒在肿瘤或其它癌细胞中的递送，积累和感染所需的程度存在。
在一些实施方案中，可使用如美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请号第16/536,073号中所述的匹配分析筛选本文提供的修饰的细胞载体，以确定其作为细胞载体用于将溶瘤病毒递送到特定对象和/或特定癌症/肿瘤类型的适用性。在实施例中，可通过美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请第16/536,073号中描述的匹配分析来筛选多个/组修饰的细胞载体，并按照它们的匹配能力排序。在一些示例中，细胞载体panel可包括未经修饰的细胞载体。
简而言之，如美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请第16/536,073号所述，将载体细胞与对象匹配的方法包括执行以下步骤中的一个或多个：
1.通过在包含所述细胞载体、所述溶瘤病毒和来自所述对象的细胞的共培养物中检测以下一种或多种来确定所述细胞载体是否克服所述对象的免疫屏障：
(a)与除了细胞载体不存在之外的其它等效条件相比，用于T细胞活化的一种或多种标志物的水平降低；
(b)与除了细胞载体不存在之外的其它等效条件相比，NK细胞活化的一种或多种标志物的水平降低；和
(c)与除了细胞载体不存在之外的其它等效条件相比，NKT细胞活化的一种或多种标志物的水平降低，其中如果满足(a)、(b)和(c)中的一个或多个，则细胞载体是对象的匹配。
2.(a)测量当病毒和细胞载体与来自对象的细胞一起孵育时获得的病毒扩增量；
(b)测量当病毒和细胞载体在等效条件下(除非来自对象的细胞不存在)孵育时所获得的病毒扩增量；和
(c)比较(a)和(b)中测量的量，其中如果(a)中测量的扩增量是(b)中测量的扩增量的至少20％，则所述细胞载体与所述对象匹配。
3.鉴定细胞载体和对象中一个或多个主要组织相容性复合物(MHC)和/或杀伤细胞抑制性受体(KIR)遗传位点上相同的等位基因，并且如果例如50％或更多的等位基因相同，则鉴定细胞载体与对象匹配。
本文提供的修饰的细胞载体可包含本节和本文其它地方所述的一个或多个修饰，如所描述的：
(i)用于改进病毒扩增和/或免疫调节的敏化/保护细胞载体
用于产生本文提供的CAVES系统和用于本文提供的方法的修饰的细胞载体(载体细胞)可包括以下实施方案中的一个或多个：在实施方案中，可通过用IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、GM-CSF、生长因子、RTK/mTOR激动剂、wnt蛋白配体和GSK3抑制剂/拮抗剂(例如，Tideglusib、Valporic acid)中的一个或多个预处理/负载细胞载体来敏化细胞载体以增强其病毒扩增能力。在其它实施方案中，细胞载体可敏化以阻断抗病毒状态的诱导，例如，通过用小分子或蛋白质抑制剂预处理/负载细胞载体，该小分子或蛋白质抑制剂干扰IFN I型/II型受体和/或干扰下游信号转导，该下游信号转导包括但不限于IFNAR1/IFNAR2信号转导、IFNGR1/IFNGR2信号转导、STAT1/2信号转导、Jak1信号转导(例如，托法替尼、鲁索替尼、巴拉替尼)、Jak2信号转导(例如，SAR302503、LY2784544、CYT387、NS-018、BMS-911543、AT9283)、IRF3信号转导、IRF7信号转导、IRF9信号转导、TYK2信号转导(例如BMS-986165)、TBK1信号转导(例如BX795、CYT387、AZ13102909)。
在一些实施方案中，细胞载体可用HDAC抑制剂预处理/负载，用于干扰/解除调节IFN信号传导/响应性；此类抑制剂可包括但不限于伏立诺司他、罗米肽、西达本胺、潘诺司他、贝利诺司他、伐泊酸、莫西替诺司他、阿贝诺司他、恩替诺司他、SB939、雷米诺司他、吉维诺司他、奎诺司他、HBI-8000、克维他林、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、萝卜硫素和/或曲古司他丁。在其它实施方案中，细胞载体可预处理/负载由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)介导的病毒传感(virus sensing)和/或抗病毒防御通路的拮抗剂；此类拮抗剂可包括但不限于K1、E3L、K3L蛋白(痘苗)、NS1/NS2蛋白(流感)、NS3-4A(丙型肝炎)、NP和Z蛋白(沙粒病毒)、VP35(埃博拉病毒)、US11、ICP34.5、ICP0(HSV)、M45(MCMV)和X蛋白(BDV：博尔纳病病毒)中的一种或多种。在实施方案中，细胞载体可被保护免受异体失活/排斥决定簇的影响，例如通过用病毒来源的MHC拮抗剂(例如A40R MHCI拮抗剂(痘苗)、Nef和TAT(HIV)、E3-19K(腺病毒)、ICP47(HSV-1/2)、CPXV012和CPXV203(牛痘)、ORF66(VZV)、EBNA1、BNLF2a、BGLF5、BILF1(EBV)、US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10、US11/gp33(hCMV)、Rh178/VIHCE(RhCMV)、U21(HHV-6/7)、LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1、kK5/MIR2(KSHV)、mK3(MHV-68)、UL41/vhs(a-疱疹病毒、HSV、BHV-1、PRV)、UL49.5(水痘病毒属、BHV-1、EHV-1/4、PRV)和m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40(mCMV)中的一种或多种预处理/负载细胞。
在实施方案中，修饰的细胞载体可用病毒来源的B2M拮抗剂(例如UL18(HCMV))预处理/负载。在其它实施方案中，细胞载体可用MIC-A和MIC-B的拮抗剂(NKG2D配体)预处理/负载，例如kK5(KHSV)。在一些实施方案中，细胞载体可预先处理/负载一种或多种病毒来源的免疫抑制因子，包括但不限于免疫FAS/TNF/颗粒酶B诱导的凋亡抑制剂(例如Ectromelia/痘苗病毒SP1-2/CrmA)、IL-1/NFkB/IRF3拮抗剂(例如痘苗病毒编码的N1)、IL-1和TLR拮抗剂(例如IL-18结合蛋白、A46R、A52R)、IL-1β拮抗剂(例如B15R/B16R)、TNFα阻断剂(例如痘苗病毒CmrC/CmrE)、IFNα/β阻断剂(例如痘苗病毒B18R/B19)和IFNγ阻断剂(例如痘苗病毒B8R)。在实施方案中，细胞载体可用TAP1/2和/或tapasin的小分子抑制剂预处理/负载。
在实施方案中，可通过例如用补体因子的小分子抑制剂(例如C1、C2、C3、C4、C5、MBL)预处理/负载细胞载体来保护经修饰的细胞载体免受补体的侵害；此类抑制剂可包括但不限于VCP(痘苗病毒补体调控蛋白)、B5R(痘苗病毒补体抑制剂)、scFv抗CD1q/CD1r/CD1s、抗C3、抗C5(例如Eculizumab)、compstatin家族的多肽C3抑制剂(例如Cp40)、人可溶性膜(s/m)蛋白(例如s/mCR1(CD35)、s/mCR2(CD21)、s/mCD55、s/mCD59)、人因子H和衍生物、具有补体抑制活性的眼镜蛇毒因子和衍生物中的一种或多种。
在上述实施方案中，不是用这些因子负载或处理细胞，而是可修饰病毒以表达这些产物，或者借助本文的方法，当与载体细胞孵育时，病毒在载体细胞中表达这些产物。
敏化细胞载体可通过本领域已知的方法产生。例如，在细胞存放、病毒感染或给受试物施用，例如约或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟或约或至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48或更多小时之前，通过孵育10分钟至48小时或更多小时，用致敏试剂(例如，蛋白质或小分子激动剂/拮抗剂)预处理细胞载体。为增强蛋白质/脂质不溶性小分子到细胞中的负载，可使用脂质体或替代的蛋白质转染试剂，例如Xfect(Takara)、Pierce Pro-Ject(ThermoFisher)、Pro-DeliverIN(OZBiosciences)、TurboFect(Fermentas)或替代试剂。
(ii)对病毒介导的杀伤具有抵抗力的敏化(延长生存期和改善局部免疫抑制)
在一些实施方案中，可用一种或多种使细胞载体抵抗病毒介导的杀伤的试剂预处理/负载经修饰的细胞载体。例如，在一些实施方案中，细胞载体可用I型和/或II型干扰素预处理。在其它实施方案中，细胞载体可用抗病毒状态的激动剂/诱导剂(例如，STING、PKR、RIG-I、MDA-5)预处理。为生成此类“受保护的”细胞载体，任何自体或异体细胞载体可在未感染病毒的情况下或感染病毒之前用干扰素I型(例如，IFNα/β)和/或II型(例如IFNγ)和/或STING、PKR、RIG-I、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM-2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)通路的激动剂处理30分钟至至多48或更多小时，例如约或至少30分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48或更多小时。
这些“受保护的”细胞载体可作为单独的组合物与不受保护并包含病毒的匹配/敏化/工程化细胞载体同时施用；受保护的细胞载体可提供延长的生存期和/或改善的局部免疫抑制。在一些实施方案中，受保护的细胞载体可在施用不受如此保护并包含病毒的匹配/敏化/工程化细胞载体之前或之后，例如大约或至少10、15、20、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时内或1、2、3、4或5天内施用。
(iii)用于改进病毒扩增和/或免疫调节的工程化细胞载体
在一些实施方案中，在本文提供的系统和方法中使用的修饰的细胞载体被工程化改造用于基因的瞬时或永久表达或抑制，以促进改进的病毒扩增和/或免疫调节。可在以下实施例中的一个或多个中工程化修饰细胞载体。可使用用于敏化、保护和/或工程化如本文所提供的细胞载体的实施例的一个或组合来修饰本文提供的细胞载体中的任何细胞载体。
在一些实施方案中，细胞载体可被工程化改造成对干扰素(IFN)诱导的抗病毒状态无反应。例如，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久(例如，切除基因位点)抑制IFNI型/II型受体和/或下游信号传导，例如抑制I型/II型干扰素受体的一种或多种表达；IFNα/β、IFNγ受体的表达；IFNAR1/IFNAR2受体表达；IFNGR1/IFNGR2受体表达；STAT1/2受体表达；Jak1/2受体表达；IRF3受体表达；IRF7受体表达；IRF9受体表达；TYK2激酶和TBK1激酶的表达。
在实施方案中，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久抑制胞质病毒DNA/RNA传感和抗病毒防御机制的元素，包括但不限于PKR、RIG-I、MDA-5、cGAS、STING、TBK1、IRF3、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)中的一种或多种。在其它实施方案中，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久表达病毒传感和抗病毒防御通路的拮抗剂，所述拮抗剂由例如STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)介导；这些可包括但不限于K1、E3L、K3L(痘苗)中的一种或多种；NS1/NS2(甲型流感)；NS3-4A(丙型肝炎)；NP，Z蛋白(沙粒病毒)；VP35(埃博拉病毒)；US11、ICP34.5、ICP0(HSV)；M45(MCMV)；和X蛋白(BDV：博尔纳病病毒)。
在一些实施方案中，可工程化改造经修饰的细胞载体以逃避T和NKT细胞的异体识别。例如，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久抑制MHC I类分子(HLA-A、B、C)的表达；MHC II类分子(HLA-DP、DQ、DR)；类MHC分子(CD1a/b/c/d)；或MHC I类、MHC II类、类MHC分子(如TAP1/2、Tapasin、Beta-2微球蛋白、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP)的转录或表达的调节因子。在其它实施例中，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久表达：病毒来源的B2M拮抗剂(例如，UL18(HCMV)；和/或病毒来源的MHC拮抗剂(例如，A40R MHCI(痘苗)；Nef、TAT(HIV)；E3-19K(腺病毒)；ICP47(HSV-1/2)；CPXV012、CPXV203(牛痘)；EBNA1、BNLF2a、BGLF5、BILF1(EBV)；ORF66(VZV)；US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10、US11/gp33(hCMV)；rh178/VIHCE(RhCMV)；U21(HHV-6/7)；LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1、kK5/MIR2(KHSV)；mK3(MHV-68)；UL41/vhs(a-疱疹病毒、HSV、BHV-1、PRV)；UL49.5(水痘病毒属、BHV-1、EHV-1/4、PRV)；和m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40(mCMV))中的一种或多种。
在实施方案中，细胞载体可被工程化改造成逃避NK细胞的异体识别。例如，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久抑制一种或多种的表达：膜结合的MICA/B(NKG2D配体)；膜结合PVR(DNAM-1配体)；膜结合Nectin-2(DNAM-1配体)。在其它实施例中，细胞载体可被工程化改造用于瞬时或永久表达：
MIC-A和MIC-B的拮抗剂(NKG2D配体)(例如，kK5(KHSV))；NKG2D受体拮抗剂(例如牛痘OMCP)；NCR靶向NKp30、NKp44、NKp46受体的拮抗剂(例如HA(痘苗和其它病毒中的血细胞凝集素))；NK抑制受体(KIR)的配体(例如，HLA-Bw4；HLA-C2)；和NK抑制受体的配体(NKG2a/CD94)(例如HLA-E及其衍生物单独或与21M HLA-B配体组合以产生HLA-E结合肽并稳定HLA-E表面表达)。
在某些实施方案中，细胞载体可被工程化改造成表达人或病毒来源的免疫抑制因子(例如，防止/抑制异体抗细胞载体或抗病毒免疫应答)。这可通过在细胞基因组和/或病毒基因组中编码它们来完成。人源因子包括但不限于，
IDO、精氨酸酶、TRAIL、iNOS、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、sMICA、sMICB、sHLA-G、HLA-E、PD-L1、FAS-L、B7-H4和靶向或耗尽NK和/或NKT细胞单链抗体(scFv)。病毒来源的因子包括但不限于Ectromelia/痘苗病毒SPI-2/CrmA(免疫Fas/TNF/颗粒酶B诱导的凋亡抑制剂)；痘苗病毒N1(IL-1/NFkB/IRF3拮抗剂)；HA(针对NKp30、NKp44、NKp46的NCR拮抗剂)；IL-18结合蛋白；A40R；A46R；A52R；B15R/B16R；TNFα阻断剂(如痘苗病毒CmrC/CmrE)；IFNα/β阻断剂(如痘苗病毒B18R/B19R)；IFNγ阻断剂(如痘苗病毒B8R)和其它IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D拮抗剂。
在一些实施方案中，细胞载体可经工程化改造以表达癌或干细胞衍生因子，从而促进病毒感染其它不受感染的细胞载体和/或肿瘤细胞。例如，细胞载体可经工程化改造以表达下述的一种或多种：癌相关抗原(例如，癌睾丸抗原(MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、NY-ESO-1、PRAME、CT83、SSX2、BAGE家族、CAGE家族)；癌胎儿抗原(AFP、CEA)；癌基因/肿瘤抑制物(myc、Rb、Ras、p53、端粒酶)；分化抗原(MELAN、酪氨酸酶、TRP-1/2、gp100、CA-125、MUC-1、ETA)；GM-CSF；IL-10；TGFβ；VEGF；FGF-2；PDGF；HGF；IL-6；生长因子；RTK/mTOR激动剂和wnt蛋白质配体。
在实施方案中，修饰的细胞载体可被工程化改造成表达干扰补体和/或中和抗体功能的因子，包括但不限于下述的一种或多种：补体因子的蛋白拮抗剂(C1、C2、C3、C4、C5、MBL)；痘苗病毒补体调控蛋白(VCP)；痘苗病毒补体抑制剂(B5R)；抗CD1q/CD1r/CD1s单链抗体；抗C3；抗C5(如Eculizumab)；compstatin家族的多肽C3抑制剂(例如Cp40)；人可溶性膜(s/m)蛋白(例如，s/mCR1(CD35)，s/mCR2(CD21)，s/mCD55，s/mCD59)；具有补体抑制活性的人H因子及其衍生物和眼镜蛇毒因子及其衍生物。
(iv)表达血管正常化/肿瘤血管重编程用血管生成抑制剂的工程化细胞载体
在一些实施方案中，细胞载体可被工程化改造成编码血管生成抑制剂(例如，用于肿瘤血管重编程/修复、稳定和/或使肿瘤血管系统正常化)。这些抑制剂的细节在下文“2.病毒”部分中描述，其中描述了作为本文提供的CAVES的组成部分的病毒的此类修饰。如下文所述，血管生成抑制剂可诱导血管正常化，通过恢复肿瘤细胞与其局部细胞环境相互作用所启动的信号级联中的平衡来修复肿瘤血管系统(肿瘤血管重编程)。这反过来又可导致肿瘤灌注的增强和肿瘤内缺氧的减少，这反过来又可导致原发肿瘤生长、腹水和转移的改善减少。
本文提供的CAVES组合物和相关的使用和治疗方法可包括编码抑制血管生成的分子的细胞载体，所述分子包括下调促血管生成因子和/或上调抗血管生成因子的分子。替代地或另外，本文提供的CAVES组合物可与血管生成抑制剂和/或与编码血管生成抑制剂的病毒组合施用。
(v)表达用于条件细胞永生化的转基因的工程化细胞载体
在一些实施方案中，本文提供的用于CAVES组合物和相关方法的细胞载体可经工程化改造以编码用于条件细胞永生化的转基因(参见，例如，Wall等人的综述，Wall etal.，Cell Gene Therapy Insights，2(3)：339-355(2016)和其中引用的参考文献，其内容在此通过引用整体并入本文)。条件永生化利用可诱导的转基因技术来产生细胞，当转基因是活性的，例如在操作者的控制下时，这些细胞可稳定、一致的方式扩展到临床数量，以获得目标细胞，但当需要时是不可活化的，从而使它们恢复到正常的、有丝分裂后的状态。这允许向需待治疗的对象安全地递送一致可复制的、稳定的、可塑化的细胞制剂(例如，CAVES)，同时减小或消除施用组成永生化细胞的癌症风险。以可塑化和成本有效但对对象施用安全的方式获得高数量的质量一致的细胞载体的能力是所期望的，例如，用于开发临床上用于细胞基组合物(例如本文提供的CAVES)的“现成的”异体细胞。
细胞的条件永生化可使用本领域技术人员已知的方法来进行，并且可改变，例如，其取决于获得细胞的类型和种类。例如，p53和pRB通路的应激活化是导致小鼠衰老的常见原因；在最佳培养基和氧气条件下生长小鼠细胞可抑制或沉默这些基因，从而减轻应激。另一方面，人体细胞除了沉默p53和pRB基因外，还需要通过端粒酶重建等途径维持端粒。可控制地(有条件地)活化/去活化用于细胞分裂的示例性基因包括例如癌基因和端粒酶。用于条件永生化的示例性技术包括但不限于以下内容：
E6/E7
人乳头瘤病毒16型(HPV16)的癌蛋白E6和E7通过灭活肿瘤抑制因子如p53和pRB来协同介导细胞永生化。因此，条件永生化可通过当期望扩增时这些肿瘤抑制物的条件灭活，然后在扩增要停止时活化它们(例如，在作为治疗施用之前；参见例如Storey et al.，Oncogene，11：653-661(1995))来实现。
Myc基因
c-myc基因及其病毒同源物v-myc对一系列细胞功能发挥调控作用。特别是，它驱动细胞周期进入和细胞分裂，这使它成为创造稳定永生化细胞系的诱人靶标。导致myc基因组成性表达的突变与致癌转化相关，从而导致癌症。因此，需要c-myc的受控表达，优选在操作者的控制下，用于有条件永生化。
条件永生化技术c-MycERTAM是编码含有c-myc和突变鼠雌激素受体(G525R)的N端截短激素结合域的嵌合蛋白的融合基因。突变体G525R不再与雌二醇和雌激素结合，而是在合成的类雌激素激动剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)存在下对活化有反应。因此，在4-OHT存在下培养细胞促进了c-myc活性和随后的细胞分裂，而在不存在4-OHT的情况下，细胞恢复到非活化状态，并能像正常细胞一样经历成熟/分化。
c-MycERTAM的合成不影响细胞的表型，并且此类条件永生化技术已用于从皮质神经上皮开发人类干细胞系，这些干细胞系已在缺血性中风、肢体缺血的临床前动物研究中进行了研究，并且目前正在作为中风残疾的治疗(1期和2期)的临床试验中进行研究，以及在临床肢体缺血的1期试验中进行研究。
在myc癌基因中，禽病毒的同源物v-myc也被证明能有效地使人神经干细胞(hNSCs)永生。禽髓细胞瘤病病毒基因组中编码的p110gag-myc蛋白在分化后自发下调。v-myc转导的hNSC的生长和分化依赖于生长因子的促有丝分裂。在新生小鼠体内植入24-48小时后，观察到禽v-myc的自发下调，表明它们有可能成为条件永生化的细胞载体。已建立的v-myc hNSC细胞系由于其嗜肿瘤特性，显示出作为选择性基因治疗载体的潜力。一个基因修饰表达胞嘧啶脱氨酶的hNSC系(HB1.F3.CD)的临床前研究，导致肿瘤部位由5-氟胞嘧啶转化为化疗药物5-氟尿嘧啶。目前正在进行1期临床试验，以研究此类抗癌策略的剂量和副作用(ID：13401NCI-2013-02346 13401)。
温度敏感性猴病毒SV40 T抗原
SV40是一种来自恒河猴的双链DNA病毒。SV40具有多种抗原，其中大肿瘤抗原(Tag)是SV40的主要抗原。Tag调节细胞信号通路，诱导细胞进入S期并发生DNA损伤反应，从而促进病毒DNA复制。Tag还与p53和pRB蛋白家族结合并灭活，这些蛋白家族是参与细胞周期进程和凋亡的强大肿瘤抑制因子，为病毒复制创造理想的环境。早期对啮齿动物细胞的研究表明，Tag使这些细胞永生化，从而使它们获得无限的增殖潜能。随后的Tag失活导致细胞周期G1期和G2期增殖潜能的快速和不可逆丧失，表明Tag持续需要维持增殖状态。这些特性使Tag成为开发可控细胞系的理想候选。
Tag的灭活是利用大Tag的温度敏感突变体(SV40 tsA58)实现的，该突变体最初于1975年分离出来，发现在许可温度(33.5℃)下表现为野生型，但在39℃的非许可温度下生物学上无活性。因此，通过在许可温度下扩大细胞，然后通过将细胞的温度升高到非许可的温度来促进分化，可实现条件永生化。ReNeuron Ltd.(UK)/伦敦大学学院正在进行使用SV40大肿瘤抗原条件永生化的人胎儿视网膜细胞系(hRPC)用于视网膜色素变性的治疗的临床前研究。
端粒酶
在人类体细胞中，随着细胞的每次分裂，端粒(染色体末端的短重复序列)的不断缩短被认为是有丝分裂的时钟。人的端粒含有位于染色体末端的多个TTTAGG串联重复序列。它们依赖于端粒酶来维持其长度，但由于人类体细胞不以足以维持端粒的水平表达端粒酶，因此它们在每次细胞分裂时缩短约50个碱基对。总而言之，与缺乏端粒酶活性有关的端粒丢失是负责限制衰老前分裂数目的有丝分裂时钟。
人端粒酶逆转录酶的催化亚基hTERT催化合成6个碱基的重复序列以延长端粒。由于原代人体细胞中端粒酶的基础水平不足以维持无限的寿命，外源性hTERT的转导可导致寿命延长。
虽然最初提出利用hTERT重建端粒酶活性足以使原代人体细胞永生化，但发现有时仅重建端粒酶是不够的；在这些情况下，调节通路如p16和pRB的二次失活是必需的。
虽然上述研究评估了组成性活化，但端粒酶与其它条件性转基因结合，证明在支持条件性永生方面是成功的(O’Hare et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，98(2)：646–651(2001))。例如，SV40的U19标签突变体在结合SV40复制起点方面是有缺陷的，并且当在编码U19标签的重组逆转录病毒中递送时，在使啮齿动物细胞永生化方面比野生型标签更有效。构建结合tsA58(温度敏感标签突变，见上文描述)和U19突变的载体，以产生能够体外分化的鼠少突胶质细胞前体细胞系(Almazan et al.，Brain Res.，579：234–245(1992))。发现U19tsA58标签能够从大鼠新生视神经产生条件性永生细胞系，其能够分化为少突胶质细胞(Barnett et al.，Eur.J.Neurosci.，5：1247–1260(1993))。U19tsA58标签也被用于研究来自嗅球和固有层的候选再生嗅鞘细胞的异质性(Franceschini et al.，Dev.Biol.，173(27)：327–343(1996))。O'Hare等人的研究表明hTERT或U19tsA58标签单独的异位表达不足以使新鲜分离的人体细胞永生化，但这些基因的组合导致了永生细胞系的有效产生，而不管它们被引入的顺序(O’Hare et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，98(2)：646–651(2001))。
Cre-loxP系统
噬菌体p1 Cre是一种在称为LOXP的特定位点促进重组的酶。当两个33bp的loxP序列被定向时，发生重组，因此中间序列被切割和移除。Cre-loxP可逆永生化技术在自体和异体细胞治疗中的应用前景广阔。活组织切片和原代培养物可通过带有loxP位点的重组癌基因永生化。然后用Cre转染将导致永生化基因的切除。去除癌基因后，细胞应与原代培养群体相同，但数量有所增加。
Cre-loxP系统已从大鼠肾上腺细胞应用到以hTERT和Tag为永生化基因的人肝细胞和肌原细胞(见上文讨论)。为消除任何可能没有删除转基因的细胞，重组的阴性对照包括单纯疱疹病毒1-胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因，以便在更昔洛韦(GCV)存在下，在Cre转染后杀死一小部分难治性永生化细胞。三苯氧胺依赖的Cre重组酶也被纳入，以实现癌基因的可控切除。
Tet-On和Tet-Off
有条件的永生化也是通过转录调控系统实现的。最广泛使用的是原核四环素抑制系统。他们利用一种tet阻遏物(tetR)蛋白，该蛋白在没有抗生素(四环素或强力霉素)的情况下，与一个叫做四环素操纵子(tetO)的序列结合。当抗生素存在时，它与阻遏物结合，从而抑制它与tetO的结合。
第一个可用于条件永生化的系统被称为“Tet-Off”，它是在HeLa细胞中开发的。在该系统中，tet阻遏物结合位点插入启动子和转录起始位点之间，使得阻遏物的结合空间阻断转录。然而，在添加少量四环素和强力霉素时，空间位阻被克服，它们阻止了tetR与tetO的结合，从而诱导报告基因的表达。
作为另一选择，“Tet-On”系统是通过将tetR与单纯疱疹病毒(HSV)病毒体蛋白16(VP16)的C-末端活化结构域融合而产生的，从而产生刺激与tetO序列融合的启动子的杂交反式活化子(tTA)。4个氨基酸的修饰导致反向四环素反式活化子(rtTA)，它仅在四环素或强力霉素存在时与tetO结合。在基于Tet的永生化系统中对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠肾细胞(293T)、小鼠胚胎干细胞和人内皮细胞进行了癌基因(c-Myc和Tag)和端粒酶(hTERT)的初步检测。此外，间充质基质细胞(MSC)已被四环素诱导系统永生化。四环素诱导表达hTERT的MSC细胞系保持多效性，永生化依赖于端粒伸长。通过结合强力霉素/四环素诱导(Tet-On)系统慢病毒转染Tag-hTERT产生条件永生化MSC系(Koch et al.，Genome Res.，2013；23：248–259(2013))。这些细胞被用来研究衰老相关DNA甲基化(SA-DNAm)的变化，并且可在培养中保持80天而没有任何衰老迹象。去除培养基中的多西环素会导致生长立即停止，并进一步表达衰老相关的半乳糖苷酶。当细胞暴露于抗生素时，端粒长度显着增加，但不受SA-DNAM的影响。
修饰细胞载体的方法
工程化细胞的许多方法，例如用于制造上述工程化细胞载体的方法，在本领域中是已知的。此类方法包括但不限于：
(a)CRISPR-CAS9靶向抑制(永久性基因/位点缺失)。细胞载体可用同时表达CAS9蛋白和目标基因特异性的指导RNA(gRNA)的DNA质粒转染。基因组中gRNA-Cas9介导的切割可利用供体DNA质粒修复，这导致靶向基因的特异性缺失和基因编码蛋白的永久和完全丢失。可使用PCR(DNA水平)、Northern blot/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定例如westernblot或流式细胞术来验证蛋白质表达的丢失。
(b)CRISPR-CAS9靶向表达(永久基因/位点插入)
该方法可用于将目的基因插入细胞载体基因组的特定位置。细胞载体可用同时表达CAS9蛋白和针对特定插入位置特异性的指导RNA(gRNA)的DNA质粒转染。基因组中gRNA-Cas9介导的切割可使用供体DNA质粒修复，该供体DNA质粒在DNA切割/双链断裂位置的两侧具有以细胞载体基因组的序列为侧翼的插入的目的基因，引起目的基因在特定基因组位置的同源重组介导的插入，而不是随机的插入。可使用PCR(DNA水平)、Northern blot/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定例如western blot或流式细胞术来验证成功的插入和蛋白质表达。
(c)RNA干扰(逆转录病毒/慢病毒/转座子介导的shRNA/microRNA转导)(永久基因抑制)靶向特定目的基因/蛋白质的shRNA/microRNA可被工程化改造并克隆到逆转录病毒/慢病毒/转座子载体中以稳定整合到细胞载体基因组中。可用载体转导细胞载体，并且可使用载体编码的选择标记来选择被转导的细胞。可使用例如Northern印迹和蛋白质测定来评估shRNA介导的目的基因的抑制。
(d)慢病毒/逆转录病毒介导的随机/多拷贝基因插入
特定目的基因/蛋白质可被工程化改造和/或克隆到逆转录病毒或慢病毒载体中，以稳定随机整合到细胞载体基因组中。可用病毒载体转导细胞载体，并且可使用载体编码的选择标记选择转导的细胞。将使用Northern Blot和任何蛋白质分析，例如western Blot和流式细胞术来评估shRNA介导的目的基因的抑制。
(e)转座子介导的随机/多拷贝基因插入
特定目的基因/蛋白质可被工程化改造和/或克隆到哺乳动物转座子载体系统，例如PiggyBac(SBI system Biosciences)或等同物中。细胞载体可与目的基因(cDNA)的转座子载体和转座酶载体共转染。转座酶可介导目的基因转移到TTAA染色体整合位点。可任选地使用载体编码选择标记选择转导细胞。插入和蛋白质表达可使用PCR(DNA水平)、Northern blot/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定如western blot、流式细胞术来验证。
(f)可通过例如RNA干扰来实现目的蛋白质表达的瞬时基因抑制。siRNA/microRNA可通过本领域已知的任何已建立的方法转染到细胞载体中，例如氯化钙转染；脂质体转染；X效应；电穿孔；超声操作和细胞挤压(例如引入siRNA)。
(g)例如，通过将目的基因克隆到适当的哺乳动物质粒表达载体中，所述质粒表达载体可用编码所需产物的质粒DNA转染到细胞载体中，以实现瞬时基因表达。或者，编码目的基因/蛋白的mRNA可直接转染到细胞载体中。转染可使用任何已建立的方法进行，例如：氯化钙转染；脂质体转染；X效应；电穿孔；超声操作和细胞挤压(例如引入siRNA)。
2.病毒
如上所述选择和/或修饰的载体细胞可用于任何鉴定为具有溶瘤性质的病毒治疗。可用于本文提供的方法、组合和组合物中的示例性溶瘤病毒如下：
病毒类型
溶瘤病毒具有肿瘤细胞特异性复制的特点，可导致肿瘤细胞溶解和肿瘤有效消退。溶瘤病毒通过在肿瘤细胞，包括转移性肿瘤细胞如循环肿瘤细胞中定殖或聚集，并在其中复制来影响治疗。所述方法、组合物和组合物可用于任何抗癌疫苗或病毒。例如，溶瘤病毒可以是任何天然存在或工程化重组病毒，例如但不限于痘苗病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、maraba病毒、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内卡谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、小RNA病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、逆转录病毒、慢病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒和辛德比斯病毒等。在许多情况下，肿瘤选择性是如痘苗病毒和其它溶瘤病毒的固有性质。通常，溶瘤病毒通过在肿瘤或肿瘤细胞中复制从而导致溶瘤，从而起到治疗作用。
在一些实施方案中，源自致病病毒的减毒株用于制造活疫苗。痘苗病毒的非限制性实例包括但不限于，李斯特(也称为Elstree)株、纽约市健康委员会(NYCBH)株、大连株、池田株、LC16M8株、西储(WR)株、哥本哈根(Cop)株、塔什干株、天坛株、惠氏株、Dryvax株、IHD-J、IHD-W、布莱顿株、安卡拉株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、大连I株、LIPV株、LC16M0株、LIVP株、WR 65-16株、EM63株、伯尔尼株、巴黎株、CVA382株、NYVAC株、ACAM2000株、ACAM1000株和康诺特株。这些病毒可以是溶瘤病毒的克隆株。编码发色团产生酶的核苷酸序列可插入或取代未经修饰的溶瘤病毒基因组中的非必需基因或区域，或插入或取代未经修饰的溶瘤病毒基因组中编码异源基因产物的核酸。
在一些实施方案中，与细胞一起使用的痘苗病毒和在本文的方法中使用的痘苗病毒是减毒的纽约市健康委员会(NYCBOH)株。在一些实施方案中，NYCBOH株痘苗病毒可以是ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX。
在一些实施方案中，痘苗病毒选自Dryvax、ACAM1000、ACAM2000、李斯特、EM63、LIVP、天坛、哥本哈根、西储或修饰的安卡拉痘苗(MVA)。在一些实施方案中，溶瘤病毒不缺乏存在于一个或多个这些菌株中的任何基因。
在一些实施方案中，病毒或疫苗是可复制病毒。在一些实施方案中，病毒或疫苗是复制缺陷的。在一些实施方案中，病毒或疫苗是非减毒的。在其它实施方案中，病毒或疫苗是减毒的。
其它未经修饰的溶瘤病毒包括本领域技术人员已知的任何病毒，包括选自命名为GLV-1h68、JX-594、JX954、ColoAd1、MV-CEA、MV-NIS、ONYX-015、B18R、H101、OncoVEX GMCSF、Reolysin、NTX-010、CCTG-102、Cavatak、Oncorine和TNFerade的病毒。
在本文提供的方法中使用的溶瘤病毒包括本领域技术人员公知的几种，并且包括例如水疱性口炎病毒，参见例如美国专利第7,731,974、7,153,510、6,653,103号和美国专利公开第2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818号和EP专利第1385466、1606411和1520175号；单纯疱疹病毒，参见，例如，美国专利第7,897,146、7731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968和美国专利公开第2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894和20040009604号；逆转录病毒，参见例如美国专利第6,689,871、6,635,472、6,639,139、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开第20110212530号；和腺相关病毒，参见例如美国专利第8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670号。
新城疫病毒
新城疫病毒(NDV)是一种禽副粘病毒，其具有负极性的单链RNA基因组，感染家禽，一般对人类无致病性，但可引起流感样症状(Tayeb et al.(2015)OncolyticVirotherapy4：49-62；Cheng et al.(2016)J.Virol.90：5343-5352)。由于其胞质复制、缺乏宿主基因组整合和重组以及高基因组稳定性，NDV和其它副粘病毒为其它溶瘤病毒，如逆转录病毒或某些DNA病毒提供了更安全和更有吸引力的替代(Matveeva et al.(2015)Molecular Therapy-Oncolytics 2，150017)。已证明NDV具有肿瘤选择性，在肿瘤细胞中的复制比正常细胞高10,000倍，由于直接的细胞病变效应和免疫应答的诱导而导致溶瘤(Tayeb et al.(2015；Lam et al.(2011)Journal of Biomedicine and Biotechnology，Article ID 718710)。尽管NDV的肿瘤选择性机制并不完全清楚，但肿瘤细胞中干扰素产生的缺陷和对干扰素信号的反应允许病毒复制和传播(Cheng et al.(2016)；Ginting etal.(2017)Oncolytic Virotherapy 6：21-30)。副粘病毒对癌细胞的高亲和力也可能是由于癌细胞表面的病毒受体过度表达，包括唾液酸(Cheng et al.(2016)；Matveeva et al.(2015)；Tayeb et al.(2015))。
非工程化NDV毒株根据其在鸡体内的致病性被分类为慢生型(无毒)、中生型(中间型)或速生型(强毒)，速生型和中生型毒株能够在多个人类癌细胞系中复制(和裂解)，但不包括生菌型毒株(Cheng et al.(2016)；Matveeva et al.(2015))。NDV毒株也分为裂解型或非裂解型，只有裂解型毒株能够产生存活和传染性后代(Ginting et al.(2017)；Matveeva et al.(2015))。另一方面，非溶瘤菌株的溶瘤作用主要源于其刺激导致抗肿瘤活性的免疫应答的能力(Ginting et al.(2017)Oncolytic Virotherapy 6：21-30)。肿瘤治疗中常用的中基因裂解菌株包括PV701(MK107)、MTH-68/H和73-T，常用的慢生型非裂解菌株包括HUJ、Ulster和Hitchner-B1(Tayeb et al.(2015)；Lam et al.(2011)；Freemanet al.(2006)Mol.Ther.13(1)：221-228)。
NDV作为溶瘤病毒的使用最早见于20世纪50年代早期，当时腺病毒和NDV直接注射到子宫癌中，导致部分坏死。观察到肿瘤再生长，这可能是由于产生针对病毒的中和抗体抑制了溶瘤活性(Lam et al.(2011)Journal of Biomedicine and Biotechnology，ArticleID 718710)。最近，NDV株PV701在1期试验中显示出抗结直肠癌的活性(Laurie et al.(2006)Clin.Cancer Res.12(8)：2555-2562)，而NDV株73-T显示出抗各种人类癌细胞系的体外溶瘤活性，包括纤维肉瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤和宫颈癌，以及在携带人神经母细胞瘤、纤维肉瘤异种移植物和若干癌异种移植物的小鼠中的体内治疗效果，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌异种移植物(Lam et al.(2011))。NDV株MTH-68/H导致肿瘤细胞系的显著消退，包括PC12、MCF7、HCT116、DU-145、HT-29、A431、HELA和PC3细胞，并且当通过吸入施用时在晚期癌症患者中显示出良好的应答(Lam et al.(2011))。非裂解菌株Ulster证明了对结肠癌的细胞毒性作用，而裂解菌株Italien则有效地杀死了人类黑色素瘤(Lam等人(2011年))。当给患者静脉注射时，慢生型NDV株HUJ显示出对复发的多形胶质瘤的溶瘤活性，而慢生型菌株LaSota延长了结直肠癌患者的生存期(Lam et al.(2011)；Freeman etal.(2006)Mol.Ther.13(1)：221-228))，并且能够感染和杀伤非小细胞肺癌(A549)、胶质母细胞瘤(U87MG和T98G)、乳腺腺癌(MCF7和MDA-MB-453)和肝细胞癌(Huh7)细胞系(Gintinget al.(2017)Oncolytic Virotherapy 6：21-30)。
基因工程的NDV毒株也已被评估用于溶瘤治疗。例如，将IFN拮抗剂流感NS1基因引入NDV株Hitchner-B1的基因组中，导致在多种人类肿瘤细胞系和B16黑色素瘤小鼠模型中增强的溶瘤作用(Tayeb et al.(2015))。通过将IL-2或GM-CSF基因导入病毒基因组，增强了NDV的抗肿瘤/免疫刺激效应(Lam et al.(2011))。
除了使用游离病毒外，研究还评估了NDV溶瘤物、NDV感染的细胞载体以及与其它非癌症药物的组合疗法在癌症治疗中的应用。在几项临床试验中，NDV溶瘤物显示出对恶性黑色素瘤的溶瘤活性(Lam et al.(2011))。NDV感染细胞载体的使用也已得到证实。用感染NDV的自体肿瘤细胞系对抗结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾脏癌、头颈部癌和胶质母细胞瘤(Lam et al.(2011))。来源于骨髓、脂肪和脐带的MSC感染NDV毒株MTH-68/H后，将病毒传递给共培养的A172和U87胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，导致胶质瘤细胞中剂量依赖性的细胞死亡，胶质瘤干细胞中低水平的凋亡和自我更新抑制，且凋亡水平高于直接感染裸病毒(Kazimirsky et al.(2016)Stem Cell Research&Therapy7：149)。采用瘤内NDV注射和全身CTLA-4抗体施用的组合治疗可导致预先建立的远端肿瘤的有效排斥(Matveeva et al.(2015))。
Maraba病毒
马拉巴病毒最早是从巴西的亚马逊白沙蝇中分离出来的，到目前为止在南美以外地区还没有检测到。Maraba病毒属于弹状病毒科囊泡病毒属，与典型的囊泡性口炎病毒(VSV)在遗传上有一定的同源性。(参见Pol et al.，Oncolytic Virother.，7：117-128(2018)和其中引用的参考文献，其内容通过引用整体并入本文)。
在20株弹状病毒中，Maraba病毒表现出最广泛的嗜瘤性。该病毒是在所有人类和小鼠细胞系中完成裂解周期的唯一候选病毒，这些细胞系来源于多种癌症类型(如乳腺癌、脑癌、结肠癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌)。Maraba病毒(与VSV一样)利用(但不是唯一的)广泛存在的低密度脂蛋白受体(LDLR)为其进入靶细胞提供了一个广泛的恶性细胞宿主感染的解释。与此相一致的是，LDLR的表达降低与卵巢癌患者腹水中某些细胞系对Maraba病毒进入和杀伤的敏感性降低相关。
为增强Maraba病毒在恶性细胞中的复制，对其基因组进行了基因工程改造。引入了两个单突变，分别转化为M和G蛋白序列中的L123W和Q242R取代。与野生型(wt)和其它突变株相比，MG1株在体外的复制速度更快，更大的突发大小，在肿瘤细胞中的杀伤能力更强。相反，MG1在正常原代细胞中强烈减弱，验证了其肿瘤选择性(Brun et al.，Mol.Ther.18(8)：1440-1449(2010))。
在体外，MG1溶瘤活性已被证实对抗多种人、犬和鼠来源的贴壁癌细胞系(例如，中枢神经系统癌、肉瘤、乳腺癌和结肠癌来源)。此外，发现MG1能够在卵巢癌细胞中感染、复制和诱导细胞死亡，而与分期无关(Tong et al.，Mol.Ther.Oncolytics，2()：15013)。在离体实验中，发现MG1菌株对前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌或肉瘤的切除组织具有有效感染和显著的细胞病变作用。在体内，MG1可安全地全身递送，不仅可治疗局部的，也可治疗播散性的癌性病变。MG1的溶瘤活性在多个同源小鼠肿瘤模型和使用人癌细胞系或植入免疫缺陷小鼠的患者源性肿瘤的异种移植物模型中得到证实(例如，在小鼠中：结肠癌(CT26，CT26lacZ)、白血病(L1210)、肺癌(TC1)、乳腺癌(EO771，EMT6，4T1)、前列腺癌(TRAMP-C2)、肉瘤(S180)、皮肤癌(B16F10，B16F10Ova，B16lacz)；在人中：乳腺癌(HCI-001，HCI-003)和卵巢癌(ES2，OVCAR4)。
Maraba囊泡病毒MG1株的活性不仅依赖于直接的细胞毒性，而且还依赖于对固有和适应性抗肿瘤免疫的诱导。因此，Maraba病毒既可作为一种选择性的肿瘤破坏溶瘤病毒，又可作为一种免疫刺激T细胞疫苗发挥作用。让健康细胞不受影响，Maraba平台直接攻击癌细胞，改变肿瘤微环境，使癌症易受靶向疫苗诱导的免疫反应的影响。这项技术是由Turnstone Biologics(渥太华，安大略省)开发的，该公司是一家临床阶段免疫肿瘤学公司，最近与AbbVie(北芝加哥，伊利诺伊州)签订了一项研究、期权和许可协议，以获得Turnstone最多三种下一代溶瘤病毒免疫疗法的独家许可权。
细小病毒
H-1细小病毒(H-1PV)是属于细小病毒科的一种小的、无包膜的单链DNA病毒，其自然宿主是大鼠(Angelova et al.(2017)Front.Oncol.7：93；Angelova et al.(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3：55)。H-1PV对人类无致病性，作为溶瘤病毒具有吸引力，这是因为其良好的安全性、人类中没有预先存在的H-1PV免疫以及缺乏宿主细胞基因组整合(Angelova et al.(2015))。H-1PV已显示出对实体肿瘤，包括临床前模式的乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、胰腺癌和结直肠癌，以及血液系统恶性肿瘤，包括淋巴瘤和白血病的广泛的肿瘤抑制潜力，Angelova et al.(2017)Front.Oncol.7：93；Angelova et al.(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3：55)。H-1PV通过肿瘤相关抗原的增加呈递、树突状细胞的成熟和促炎细胞因子的释放来刺激抗肿瘤应答(Moehler et al.(2014)Frontiers in Oncology 4：92)。H-1PV还显示出肿瘤选择性，这被认为是由于细胞复制和转录因子的可用性、与NS1细小病毒蛋白相互作用的细胞蛋白的过度表达，以及在肿瘤细胞(而不是正常细胞)中参与NS1功能调节的代谢途径的活化(Angelova et al.(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3：55)。由于H-1PV的无毒性质，其野生型毒株经常被使用，从而不需要通过基因工程使其减毒(Angelova et al.(2015))。
研究表明，溶瘤性H-1PV感染人脑胶质瘤细胞可导致细胞的高效杀伤，高级别胶质瘤干细胞模型也允许溶瘤性H-1PV感染。当在肿瘤细胞照射后不久应用病毒时，已观察到胶质瘤细胞的增强杀伤，表明该方案可用于不可切除的复发性胶质母细胞瘤(Angelova etal.(2017)Front.Oncol.7：93；Angelova et al.(2015)Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology 3：55)。在具有原位RG-2肿瘤的免疫活性大鼠以及植入人U87胶质瘤的免疫缺陷动物中，脑内或全身注射H-1PV导致胶质瘤消退而无毒副作用(Angelova et al.(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3：55)。Del H-1PV是一种适应度变异体，具有更高的传染性并在人转化细胞系中传播，在胰腺癌和宫颈癌异种移植模型中显示了体内溶瘤作用(Geiss et al.(2017)Viruses 9，301)。H-1PV还显示出对五种人骨肉瘤细胞系(CAL 72、H-OS、MG-63、SaOS-2、U-2OS)(Geiss et al.(2017)Viruses 9，301)和针对人黑色素瘤细胞的溶瘤活性(SK29-Mel-1、SK29-Mel-1.22)(Moehler et al.(2014)Frontiers in Oncology 4：92)。在另一项研究中，携带宫颈癌异种移植物的裸鼠在接受H-1PV治疗后显示出剂量依赖性肿瘤生长停滞和消退(Angelova et al.(2015)Frontiers inBioengineering and Biotechnology 3：55)。瘤内和静脉注射H-1PV也显示出免疫缺陷小鼠的人乳腺癌异种移植物的显著生长抑制(Angelova et al.(2015)Frontiers inBioengineering and Biotechnology 3：55)。在人胃癌或携带人Burkitt淋巴瘤的小鼠体内注射H-1PV导致肿瘤消退和生长抑制(Angelova et al.(2015)Frontiers inBioengineering and Biotechnology 3：55)。
2015年在复发性多形性胶质母细胞瘤患者中完成了溶瘤H-1PV(ParvOryx01)的第一个I/IIa期临床试验(临床试验NCT01301430)，并显示了良好的无进展生存期、临床安全性和瘤内或静脉注射患者耐受性(Angelova et al.(2017)；Geiss et al.(2017)Viruses9，301；Geletneky et al.(2017)Mol.Ther.25(12)：2620-2634)。该试验证明了H-1PV以剂量依赖的方式穿过血脑屏障并建立免疫原性抗肿瘤应答的能力，其特征是白细胞浸润，主要由CD8+和CD4+T淋巴细胞浸润，以及在局部治疗的肿瘤中检测到几种免疫细胞活化标记物，其包括穿孔素、颗粒酶B、IFNγ、IL-2、CD25和CD40L(Geletneky et al.(2017)Mol.Ther.25(12)：2620-2634)。
H-1PV还证明在体外有效杀伤高侵袭性胰腺导管腺癌(PDAC)细胞，包括那些对吉西他滨耐药的细胞，瘤内注射H-1PV在PDAC原位大鼠模型中导致肿瘤消退和延长动物生存期(Angelova et al.(2017)；Angelova et al.(2015))。在免疫缺陷裸鼠PDAC模型中观察到了类似的结果，包括选择性肿瘤靶向和无毒性(Angelova et al.(2015))。H-1PV与细胞抑制药物(顺铂、长春新碱)或靶向药物(舒尼替尼)的联合导致协同诱导人类黑色素瘤细胞凋亡(Moehler et al.(2014))。H-1PV与HDAC抑制剂丙戊酸联合使用导致对宫颈细胞和胰腺细胞产生协同细胞毒性(Angelova et al.(2017))，而吉西他滨在两步方案中与H-1PV联合使用时治疗效率显著提高(Angelova et al.(2015))。与其它病毒一样，H-1PV也可通过工程化来表达抗癌分子。例如，研究表明，表达凋亡素的细小病毒-H1衍生载体比野生型H-1PV具有更大的诱导凋亡的能力(Geiss et al.(2017))。
与其它溶瘤病毒一样，细小病毒的治疗潜力受到非特异性摄取的限制，这是由于识别它们的细胞表面受体的普遍表达，以及由于重复施用后中和抗体的发展。当H-1PV与细胞载体结合时，已证明了抗肿瘤作用，从而规避了这些潜在的问题。在一项研究中，使用自体MH3924A大鼠肝癌细胞靶向递送H-1PV并抑制由相同细胞形成的转移(Raykov et al.(2004)Int.J.Cancer 109：742-749)。肝癌细胞在感染H-1PV后24h被辐射灭活，仅使子代病毒产量减少2倍或更少。与直接的病毒注射相比，基于载体细胞的治疗导致更好的转移抑制和更少的中和抗体的产生，支持使用载体细胞系统地递送溶瘤细小病毒(Raykov et al.(2004))。
麻疹病毒
麻疹病毒(MV)是一种具有负义基因组的包膜单链RNA病毒，属于副粘病毒家族(Aref et al.(2016)Viruses 8：294；Hutzen et al.(2015)Oncolytic Virotherapy 4：109-118)。其非分段基因组是稳定的，突变和恢复到其致病形式的风险低，并且由于其在细胞质中的复制，在受感染细胞中不存在插入DNA突变的风险(Aref et al.(2016)；Hutzenet al.(2015))。MV于1954年首次从一名名叫Edmonston的患者中分离出来，并通过多次体外传代后的减毒作用，发展成一种安全性极佳的活疫苗，50年来保护了全世界超过10亿人(Aref et al.(2016)Viruses 8：294；Hutzen et al.(2015)Oncolytic Virotherapy 4：109-118)。该菌株的衍生物命名为MV-Edm，是溶瘤治疗研究中最常用的MV菌株。Schwarz/Moraten麻疹疫苗株比Edm衍生物弱毒和免疫原性更强，这使它们更安全和更具有免疫调节作用(Veinalde et al.(2017)Oncoimmunology 6(4)：e1285992)。野生型MV的溶瘤作用在20世纪70年代就有文献记载，有报告显示急性淋巴细胞白血病、Burkitt淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤患者的溶瘤作用有所改善(Aref et al.(2016))。
MV使用三种主要受体进入靶细胞：CD46、nectin-4和信号淋巴细胞活化分子(SLAM)(Aref et al.(2016)；Hutzen et al.(2015))。尽管在活化的B和T细胞、未成熟胸腺细胞、单核细胞和树突状细胞上表达的SLAM是野生型菌株的主要受体，但减毒和肿瘤选择性MV-Edm菌株主要靶向CD46受体，该受体是在许多肿瘤细胞中过表达的补体活化调节因子(Aref et al.(2016)；Hutzen et al.(2015)；Jacobson et al.(2017)Oncotarget8(38)：63096-63109；Msaouel et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。野生型和减毒株使用主要在呼吸道上皮中表达的Nectin-4(Aref et al.(2016)；Msaouel et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。与其它溶瘤病毒一样，肿瘤细胞的干扰素抗病毒应答中的缺陷也促进了MV的肿瘤选择性(Aref et al.(2016)；Jacobson et al.(2017)Oncotarget8(38)：63096-63109。MV已在临床试验中研究用于治疗下述几种癌症，包括多发性骨髓瘤(NCT02192775，NCT00450814)，头颈癌(NCT01846091)，间皮瘤(NCT01503177)和卵巢癌(NCT00408590，NCT02364713)。
已对MV进行基因工程，以表达免疫刺激和免疫调节基因，包括编码IL-13、INF-beta、GM-CSF和幽门螺旋杆菌中性粒细胞活化蛋白(NAP)的基因，例如(Aref et al.(2016)，Hutzen et al.(2015)；Msaouel et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。使用溶瘤MV与抗CTLA4和抗PD-L1抗体的组合疗法已显示在黑色素瘤小鼠模型中有效(Arefet al.(2016)；Hutzen et al.(2015))。由于广泛接种疫苗或既往自然感染，大多数患者对MV有先天免疫力，其阻碍了其治疗潜力。为规避这一点，MV已在载体细胞(如间充质基质细胞)中被递送到肿瘤，有效地规避了宿主中和抗体，并在急性淋巴细胞白血病、肝细胞癌和卵巢癌的临床前模型中被证明是有效的(Aref et al.(2016))。其它几种细胞载体已证明了MV的递送结果，其包括U-937单核细胞系、未成熟和成熟的原代树突状细胞、PMBCs、活化T细胞、原代CD14+细胞、多发性骨髓瘤MM1细胞系和血液外生长内皮细胞(Msaouel et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。一项临床试验(NCT02068794)研究了溶瘤MV感染的间充质干细胞用于治疗复发性卵巢癌患者。克服预先存在的免疫力的另一策略涉及MV治疗与环磷酰胺等免疫抑制剂联合使用(Hutzen et al.(2015))。
MV-CEA
经基因工程改造以表达肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)的MV-CEA导致CEA在癌细胞感染后释放到患者的血流中，允许检测CEA水平，从而跟踪体内病毒感染(Aref et al.(2016)；Hutzen et al.(2015))。MV-CEA的治疗潜力已在临床前得到证实，并已进入卵巢癌治疗的I期临床试验(NCT00408590)。
MV-NIS
MV-NIS是Edmonston疫苗谱系的另一可追踪溶瘤MV，工程化以表达碘化钠同向转运体(NIS)，与MV-CEA相比，其显示出优越的病毒增殖，这是由于NIS转基因定位在MV基因组的血细胞凝集素(H)基因下游，而不是像MV-CEA构建体那样定位在核衣壳(N)基因上游(Aref et al.(2016)；Galanis et al.(2015)Cancer Res.75(1)：22-30)。例如123I、124I、125I、131I和99mTc的放射性同位素经由NIS转运，其在MV-NIS感染的细胞上表达，从而允许使用例如PET、SPECT/CT和伽玛相机进行非侵入性成像(Msaouel et al.(2013)ExpertOpin.Biol.Ther.13(4))。NIS的表达还可通过促进Beta发射放射性同位素(如I-131)进入肿瘤细胞用于放射病毒治疗来提高溶瘤MV的效力，并且已在多发性骨髓瘤、多形性胶质母细胞瘤、头颈癌、间变性甲状腺癌和前列腺癌模型中显示了临床前的结果(Aref et al.(2016)；Hutzen et al.(2015)；Msaouel et al.(2013))。为研究MV-NIS在多发性骨髓瘤(NCT00450814、NCT02192775)、间皮瘤(NCT01503177)、头颈癌(NCT01846091)和卵巢癌中的应用，已使用病毒感染的MSC(NCT02068794)进行了几个I/II期临床试验。
呼肠孤病毒
呼吸道肠孤病毒，俗称呼肠孤病毒，是呼肠孤病毒科的无囊膜双链RNA病毒，对人无致病性。野生型呼肠孤病毒在整个环境中普遍存在，导致一般人群中70-100％的血清阳性(Gong et al.(2016)World J.Methodol.6(1)：25-42)。呼肠孤病毒有3种血清型，包括1型Lang、2型Jones、3型Abney和3型Dearing(T3D)。T3D是临床前和临床研究中最常用的自然发生溶瘤呼肠孤病毒血清型。
溶瘤呼肠孤病毒是肿瘤选择性的，因为活化的Ras信号传导是癌细胞的特征(Gonget al.(2016))；Zhao et al.(2016)Mol.Cancer Ther.15(5)：767-773)。Ras信号通路的活化通过抑制dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR)的磷酸化而中断细胞的抗病毒应答，该蛋白通常负责阻止病毒蛋白合成(Zhao et al.(2016))。Ras活化还增强病毒的解包被和解体，其增强病毒子代的产生和感染性，并通过增强的凋亡加速子代的释放(Zhao et al.(2016))。据估计，大约30％的人类肿瘤显示异常Ras信号(Zhao et al.(2016))。例如，大多数恶性胶质瘤具有活化的Ras信号通路，呼肠孤病毒在体外83％的恶性胶质瘤细胞中、在体内人类恶性胶质瘤模型中以及在100％的离体胶质瘤标本中显示出抗肿瘤活性(Gong et al.(2016)World J.Methodol.6(1)：25-42)。此外，胰腺腺癌显示出非常高的Ras突变发生率(大约90％)，并且呼肠孤病毒在体外测试的100％胰腺细胞系中显示出强大的细胞毒性，并在体内100％皮下肿瘤小鼠模型中诱导消退。(Gong et al.(2016))。
呼肠孤病毒在一系列恶性肿瘤临床前表现出广泛的抗癌活性，包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、神经肿瘤、血液肿瘤、前列腺癌、膀胱癌和头颈癌(Gong et al.(2016))。呼肠孤病毒治疗已与放疗、化疗、免疫治疗和手术联合进行了试验。呼肠孤病毒与放射治疗的结合已被证明在体外治疗头颈、结直肠和乳腺癌细胞系以及体内治疗结直肠癌和黑色素瘤模型方面是有益的(Gong et al.(2016))。呼肠孤病毒与吉西他滨的联合，以及呼肠孤病毒、紫杉醇和顺铂在小鼠肿瘤模型中被证明是成功的(Zhao etal.(2016))。B16黑色素瘤小鼠模型的临床前研究表明，溶瘤呼肠孤病毒和抗PD-1疗法的组合与单独使用呼肠孤病毒相比，显示出更好的抗癌功效(Gong et al.(2016)；Zhao et al.(2016)；Kemp et al.(2015)Viruses 8，4)。
呼肠孤病毒的临床试验很多。
Figure BDA0003148729980000371
-呼肠孤病毒溶瘤生物技术公司已证明单独对恶性肿瘤以及与其它疗法联合使用的抗癌活性。例如，用于治疗复发性恶性胶质瘤的
Figure BDA0003148729980000372
呼肠孤病毒I期临床研究(NCT00528684)发现该呼肠孤病毒耐受性良好，I/II期试验显示
Figure BDA0003148729980000373
呼肠孤病毒能够杀死患有卵巢上皮癌，原发性腹膜癌，和未对铂化疗作出反应的输卵管癌的患者中的肿瘤细胞而不损害正常细胞(NCT00602277)。一项
Figure BDA0003148729980000374
呼肠孤病毒的II期临床试验表明，它在治疗转移到肺的骨和软组织肉瘤患者中是安全有效的(NCT00503295)。
Figure BDA0003148729980000375
呼肠孤病毒联合FOLFIRI和贝伐单抗已用于转移性结直肠癌患者的临床试验中(NCT01274624)。在晚期胰腺癌患者中开展了
Figure BDA0003148729980000376
呼肠孤病毒联合化疗药吉西他滨的II期临床试验(NCT00998322)，在晚期/转移性乳腺癌患者中开展了
Figure BDA0003148729980000377
呼肠孤病毒联合多西他赛的治疗潜力研究(NCT01619813)，在晚期/转移性乳腺癌患者中开展了
Figure BDA0003148729980000378
呼肠孤病毒联合紫杉醇的II期临床试验(NCT01656538)。III期临床试验研究了
Figure BDA0003148729980000379
呼肠孤病毒与紫杉醇和卡铂组合治疗铂类难治头颈癌的疗效(NCT01166542)，而采用此类组合疗法的II期临床研究在非小细胞肺癌(NCT00861627)和转移性黑色素瘤(NCT00984464)患者中进行。正在进行一项治疗复发或难治性多发性骨髓瘤患者的
Figure BDA00031487299800003710
呼肠孤病毒联合卡菲佐米和地塞米松的I期临床试验(NCT02101944)。
由于在大多数人群中存在中和抗体，系统施用呼肠孤病毒的治疗潜力有限，这可通过与免疫抑制剂(如环孢素A或环磷酰胺)共同施用呼肠孤病毒来克服(Gong et al.(2016))。在静脉施用呼肠孤病毒之前施用GM-CSF导致小鼠B16黑色素瘤肿瘤显著减少并延长存活时间(Kemp et al.(2015)Viruses 8，4)。载体细胞也证明了在保护病毒不受预先存在的免疫力的影响方面的成功。例如，淋巴因子活化的杀伤细胞(LAKs)和DCs被用作卵巢癌模型中呼肠孤病毒的细胞载体，并保护病毒免受中和抗体的侵害(Zhao et al.(2016))。包括NK细胞在内的PMBCs不仅转运呼肠孤病毒，而且被呼肠孤病毒刺激后杀伤肿瘤靶标(Zhaoet al.(2016))。另一项研究表明，在没有人血清的情况下，DCs和T细胞都是体外呼肠孤病毒的有效载体，但只有DCs在中和血清的情况下将病毒传递给黑色素瘤细胞(Ilett et al.(2011)Clin.Cancer Res.17(9)：2767-2776)。DCs也能够在携带淋巴结B16tk黑色素瘤转移的小鼠中传递呼肠孤病毒，而纯呼肠孤病毒完全无效(Ilett et al.(2009)Gene Ther.16(5)：689-699)。
水疱性口炎病毒
水疱性口炎病毒(VSV)是弹状病毒科水泡病毒属的一员。其基因组包含具有负义极性的单链RNA，包含11,161个核苷酸，编码5个基因：核衣壳蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)(Bishnoi et al.(2018)Viruses 10(2)，90)。VSV通过昆虫媒介传播，疾病仅限于其自然宿主，包括马、牛和猪，在人类中有轻度和无症状感染(Bishnoi et al.(2018)Viruses 10(2)，90)。VSV是感染细胞中细胞凋亡的有效且快速的诱导剂，并且已显示使化疗抗性肿瘤细胞致敏。VSV感染肿瘤血管系统，导致肿瘤血流的丧失、血液凝固和新生血管的溶解。该病毒也能够在缺氧组织中复制和诱导细胞病变效应和细胞裂解。此外，WT VSV在多种组织培养细胞系中生长至高滴度，有利于大规模病毒生产，它具有小且易于操纵的基因组，并且它在细胞质中复制，没有宿主细胞转化的风险(Bishnoi et al.(2018)；Felt and Grdzelishvili(2017)Journal of General Virology98：2895-2911)。这些因素，加上它对人类不致病，而且人类对VSV一般没有预先存在的免疫力，使它成为病毒肿瘤治疗的一个很好的候选者。
尽管VSV可附着在普遍表达的细胞表面分子上，使其“泛向性”，但它对I型干扰素反应敏感，因此基于肿瘤的I型干扰素信号有缺陷或被抑制而显示出肿瘤选择性(Felt andGrdzelishvili(2017))。由于其对正常细胞的感染性，VSV可引起神经致病性，但可通过修饰其基质蛋白和/或糖蛋白来减弱。例如，可删除基质蛋白或删除基质蛋白第51位的蛋氨酸残基或用精氨酸取代(Bishnoi et al.(2018)；Felt and Grdzelishvili(2017)。另一方法是用淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白(rVSV-GP)取代VSV的糖蛋白(Bishnoiet al.(2018)；Felt and Grdzelishvili(2017)。VSV还可被基因修饰以包括自杀基因，如疱疹病毒胸苷激酶(TK)，或表达免疫刺激细胞因子，如IL-4、IL-12、IFNβ或共刺激因子，如粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子1(GM-CSF1)，以增强溶瘤活性(Bishnoi et al.(2018))。编码NIS和IFNβ的VSV-IFNβ-碘化钠同向转运体(VSV-IFNβ-NIS)，已在若干I期临床试验中进行了测试(参见例如ClinicalTrials.gov的试验NCT02923466、NCT03120624和NCT03017820)。
水疱性口炎病毒(VSV)在多种小鼠肿瘤模型中静脉施用时是一种有效的溶瘤治疗剂。在一项研究中，VSV-GP在免疫缺陷小鼠模型中成功地用于皮下移植的G62人脑胶质母细胞瘤细胞的瘤内治疗，以及原位U87人脑胶质瘤细胞的静脉治疗。瘤内注射VSV-GP也对颅内CT2A鼠胶质瘤细胞有效(Muik et al.(2014)Cancer Res.74(13)：3567-3578)。研究发现，VSV-GP不引发可检测的中和抗体应答，而且此类基因修饰的溶瘤病毒对人补体不敏感，在实验期间保持稳定(Muik et al.(2014))。在另一个实施例中，发现瘤内施用VSV-GP可有效地感染和杀死移植在小鼠模型中的人A375恶性黑色素瘤细胞，以及小鼠B16黑色素瘤细胞系(Kimpel et al.(2018)Viruses 10，108)。静脉注射溶瘤病毒并不成功，即使在肿瘤内施用组中，由于I型干扰素应答，肿瘤最终都生长了(Kimpel et al.(2018))。在另一项研究中，对A2780人卵巢癌细胞的皮下异种移植小鼠模型进行了瘤内注射VSV-GP治疗，虽然最初观察到肿瘤缓解没有神经毒性，但缓解是暂时的，然后肿瘤复发。发现这是由于I型干扰素应答，通过将VSV-GP与JAK1/2抑制剂鲁索利替尼结合，观察到抗病毒状态的逆转。(Dold etal.(2016)Molecular Therapy-Oncolytics 3，16021)。由于安全性的考虑，抑制I型干扰素应答对于野生型VSV的减毒变异株在体内常常是不可能的，这就需要一种替代的解决方案。
研究表明，体液免疫产生抗病毒抗体，限制了VSV的治疗潜力。已发现，与注射裸病毒粒相比，在载体细胞中重复施用VSV给携带转移性肿瘤的动物导致更高的治疗效果(Power et al.(2007)Molecular Therapy 15(1)：123-130)，证明了载体细胞逃避循环抗体的能力。同基因CT26小鼠结肠癌细胞易感染VSV，静脉施用后，在肺肿瘤内迅速积聚，但在正常肺组织内不积聚，直至释放病毒并在24h内溶解(Power et al.(2007)，将VSV递送到小鼠中感染肺肿瘤，说明可使用免疫不相容的细胞来实现VSV的细胞介导递送(Power et al.(2007))。L1210小鼠白血病细胞也将VSV递送至肺肿瘤以及位于小鼠后侧的皮下肿瘤(Power et al.(2007))。当这些VSV感染的白血病细胞施用给无肿瘤的小鼠时，正常组织中没有可检测到的病毒复制，这表明了肿瘤的选择性。
在另一项研究中，将缺乏基质蛋白的蛋氨酸51，因此不能阻断编码干扰素的mRNAs的核输出的VSVδ51负载到表达针对卵清蛋白抗原的SIINFEKL表位的转基因T细胞受体的OT-I CD8+T细胞上，该表位由B16ova肿瘤表达(Qiao et al.(2008)Gene Ther.15(8)：604-616)。此类溶瘤病毒/基于细胞的载体组合用于抗免疫活性C57B1/6小鼠肺中的B16ova肿瘤，与单独使用病毒或T细胞相比，治疗效果显著提高。VSV在OT-I细胞内没有可检测到的复制，但在感染的T细胞与B16ova细胞共培养后，病毒被释放并有效地感染、复制并杀死肿瘤细胞。VSV负载到T细胞上显示在体外增加T细胞活化，并增加T细胞向体内肿瘤的转运(Qiaoet al.(2008))。
腺病毒
腺病毒(Ad)是具有线性基因组的无包膜ds-DNA病毒，1953年由Wallace Rowe和同事首次发现，并且早在1956年就被测试用于宫颈癌的治疗(Choi et al.(2015)J.Control.Release 10(219)：181-191)。人类Ads普遍存在于环境中，根据交叉易感性可分为57个血清型(Ad1-Ad57)，根据毒力和组织嗜性可分为7个亚群(A-G)。腺病毒血清5型(Ad5)是溶瘤病毒治疗中最常用的腺病毒。人类感染是轻微的，并导致感冒样症状(Yokodaet al.(2018)Biomedicines 6，33)，全身施用导致嗜肝并可导致肝毒性(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837)，但Ads被认为用于治疗目的是安全的。Ads通过附着于柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)进入细胞，随后细胞表面的整合素与腺病毒五邻体碱基处的Arg-Gly-Asp三肽基序(RGD)相互作用(Jiang et al.(2015)Curr.Opin.Virol.13：33-39)。CAR在大多数正常细胞表面表达，但在不同类型的癌细胞中表达差异很大。另一方面，RGD相关整合素在癌细胞中高表达，但在正常细胞中表达水平低得多(Jiang et al.(2015))。因此，Ad通常通过RGD基序靶向癌细胞。
Ad作为溶瘤病毒具有吸引力，这是因为它们在转化细胞中的高转导效率、它们缺乏与宿主基因组整合/缺乏插入突变、它们的基因组稳定性、能够将大的治疗基因插入其基因组的能力以及它们通过遗传操作(例如用癌症组织选择性启动子替换病毒启动子)而具有肿瘤选择性的能力(Yokoda et al.(2018)Biomedicines 6，33；Choi et al.(2015)J.Control.Release 10(219)：181-191)。
具有肿瘤特异性启动子的溶瘤Ad的实例包括用于前列腺癌治疗的CV706，前列腺特异性抗原启动子控制腺病毒早期1A区(E1A)基因，以及OBP-301，其使用端粒酶逆转录酶(TERT)启动子调节E1A基因表达(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837)。另一诱导肿瘤选择性的方法是在Ad基因组的E1区引入突变，其中缺失的基因由肿瘤细胞中常见的遗传突变进行功能互补，例如视网膜母细胞瘤(Rb)途径的异常或p53突变(Yamamoto etal.(2017)Cancer Sci.108：831-837)。例如，溶瘤Ads ONYX-015和H101在E1B55K基因中有缺失，这使p53失活。这些突变体不能阻断正常的凋亡防御途径，从而通过有缺陷的p53肿瘤抑制途径感染肿瘤细胞而导致肿瘤选择性(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837；Uusi-Kerttula et al.(2015)Viruses 7：6009-6042)。E1AΔ24是一种溶瘤性Ad，其在E1A基因中含有一个24个碱基的突变，在Rb途径突变的癌细胞中破坏Rb结合结构域并促进病毒复制。ICOVIR-5是一种溶瘤Ad，其结合了E2F启动子的E1A转录调控、E1A的Δ24突变和插入腺病毒纤维的RGD-4C(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837；Uusi-Kerttula et al.(2015))。Delta-24-RGD或DNX-2401是一种溶瘤Ad，其中主链通过插入RGD基序修饰，在体内和体外证明了增强的溶瘤效果(Jiang et al.(2015))。
提高肿瘤选择性的另一策略是通过靶向细胞外基质(ECM)来克服实体瘤中的物理屏障。例如，VCN-01是一种溶瘤Ad，它在体内表达透明质酸酶，以增强病毒在肿瘤中的传播。Ads也被工程化改造成表达松弛素以破坏ECM(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837；Shaw and Suzuki(2015)Curr.Opin.Virol.21：9-15)。表达自杀基因如胞嘧啶脱氨酶(CD)和HSV-1胸苷激酶(TK)的Ad在体内具有增强的抗肿瘤功效，表达免疫刺激细胞因子如表达GM-CSF的ONCOS-102的Ad也具有增强的抗肿瘤功效(Yamamoto et al.(2017)Cancer Sci.108：831-837；Shaw和Suzuki(2015)Curr.Opin.Virol.21：9-15)。表达抗CTLA4抗体的基于Δ24的溶瘤Ad已在临床前研究中显示出结果(Jiang et al.(2015))。
H101腺病毒(
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腺病毒)于2005年在国内首次获得临床应用，用于联合化疗治疗晚期鼻咽癌。许多临床试验研究了溶瘤腺病毒用于多种癌症的治疗。例如，正在进行的和过去的临床试验包括涉及在转移性胰腺癌患者中编码IL-12的Ad5的研究(NCT03281382)；在胰腺腺癌、卵巢癌、胆管癌和结直肠癌患者中表达TMX-CD40L和41BBL的免疫刺激性Ad5(LOAd703)(NCT03225989)；LOAd703联合吉西他滨和NAB-紫杉醇治疗胰腺癌(NCT02705196)；编码人PH20透明质酸酶的溶瘤腺病毒(VCN-01)已与吉西他滨和
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联合用于晚期实体肿瘤患者，包括胰腺癌(NCT02045602；NCT02045589)；
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(OBP-301)，其是一种具有肿瘤选择性的溶瘤Ad，含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子，用于肝细胞癌患者(NCT02293850)；E1B基因缺失Ad5联合经动脉化疗栓塞(TACE)治疗肝癌(NCT01869088)；CG0070，其在膀胱癌患者中表达GM-CSF并包含癌特异性E2F-1启动子以驱动E1A的表达的溶瘤Ad(NCT02365818；NCT01438112)；在结肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌患者中的Ad11P/Ad3嵌合B组溶瘤病毒Enadenotucirev(Colo-Ad1)(NCT02053220)；和DNX-2401(Ad5E1AΔ24RGD)联合替莫唑胺(NCT01956734)或联合IFNγ(NCT02197169)治疗胶质母细胞瘤。由于T细胞迁移不足和实体肿瘤的免疫抑制环境等因素，CAR-T细胞作为治疗剂常常是微不足道的，特别是对实体肿瘤。研究发现，在小鼠神经母细胞瘤肿瘤模型中，使用CAR-T细胞与由趋化因子RANTES和细胞因子IL-15装载的溶瘤Ad病毒Ad5Δ24组合治疗，可增加CAR-T细胞向肿瘤部位的迁移和存活。腺病毒对肿瘤细胞具有强效的、剂量依赖性的细胞毒性效应，并在暴露于CAR-T细胞的肿瘤细胞中加速caspase通路，而不损伤CAR-T细胞(Nishio et al.，Cancer Res.，74(18)：5195-5205(2014))。此外，RANTES和IL-15的瘤内释放分别将CAR-T细胞吸引到肿瘤部位并促进其局部存活，从而与单独使用CAR-T治疗相比提高了荷瘤小鼠的总体存活(Nishio et al.，Cancer Res.，74(18)：5195-5205(2014))。
与其它溶瘤病毒一样，由于中和抗体的发展，Ad在系统施用时具有较低的治疗效力，并且由于它们的高血清阳性率，估计多达90％的一些人群具有Ad的先天免疫力(Uusi-Kerttula et al.(2015)Viruses 7：6009-6042)。此外，Ad的非特异性肝隔离会导致肝毒性(Choi et al.(2015))。聚合物，例如PEG、带正电荷的精氨酸接枝的生物还原性聚合物(ABP)、PAMAMG5和其它纳米材料可用于掩盖病毒衣壳蛋白，减轻抗病毒免疫应答和非特异性肝脏积聚，并增加肿瘤积聚(Choi et al.(2015))。其它逃避免疫系统的方法包括使用载体细胞来传递溶瘤ADS。例如，在基于原位胶质瘤干细胞(GSC)的异种移植鼠模型中，使用T细胞在体外和体内向胶质母细胞瘤细胞递送Delta24-RGD Ad(Balvers et al.(2014)Viruses 6：3080-3096)。系统施用病毒负载的T细胞导致瘤内病毒递送(Balvers et al.(2014))。研究用载体/载体细胞递送Ad的临床试验包括使用负载溶瘤Ad的神经干细胞治疗恶性胶质瘤(NCT03072134)；转移性乳腺癌患者感染表达Her2的Ad的自体树突状细胞(NCT00197522)；和成人转移性难治性实体瘤中感染ICOVIR5的自体间充质干细胞(MSC)(NCT01844661)。
脊髓灰质炎病毒
脊髓灰质炎病毒(PV)属于小RNA病毒科肠道病毒属，具有正义单链RNA基因组。由于PV对脊髓和运动神经元的嗜性，PV感染导致严重的神经综合征脊髓灰质炎(Brown andGromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PV在临床应用中是有用的，因为它们在存在积极的抗病毒干扰素应答的情况下保留了强大的复制能力和细胞毒性，允许几轮病毒复制以放大免疫刺激的病毒细胞毒性效应(Brown and Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PV也不整合到宿主细胞基因组中(Yla-Pelto et al.(2016)Viruses8，57)。
PV宿主细胞进入是由Ig超家族细胞粘附分子CD155介导的，也称为PV受体(PVR)和Necl5样分子，其在固体肿瘤如胶质母细胞瘤中广泛过表达(Brown and Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85)。CD155还在结直肠癌、肺腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中表达，并且在抗原呈递细胞(APCs)如巨噬细胞和树突状细胞中表达(Brown et al.(2014)Cancer120(21)：3277-3286)。
PV的内部核糖体进入位点(IRES)负责驱动PV RNA基因组的翻译起始，与PV的神经致病性有关。源自Sabin血清型的减毒活疫苗在IRES中携带关键的减毒点突变(Brown和Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85)。高减毒脊灰/鼻病毒重组PVSRIPO是一种1型(Sabin)减毒活疫苗，其同源PV IRES被人鼻病毒2型(HRV2)替代，与亲本PV相比，没有表现出神经毒力/神经致病性，但保留了癌细胞的细胞毒性和对GBM细胞的特异性。(Brown andGromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85；Brown and Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PVSRIPO通过引发抗肿瘤免疫应答而不是直接裂解大块肿瘤来导致肿瘤消退，并已用于治疗复发性胶质母细胞瘤(GBM)(NCT01491893)(Brown and Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85；Brown and Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。1b期临床试验研究了使用PVSRIPO治疗儿童复发性恶性胶质瘤(NCT03043391)，而2期临床试验研究了单独使用PVSRIPO以及联合化疗药物洛莫司汀治疗成人复发性恶性胶质瘤患者(NCT02986178)。
单纯疱疹病毒
单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科，具有一个大的线性双链DNA基因组，包含许多对病毒复制不必需的基因，是遗传操作的理想候选基因。其它优势包括其感染广泛细胞类型的能力、对抗病毒药物如阿昔洛韦和更昔洛韦的敏感性以及缺乏插入突变(Sokolowski et al.(2015)Oncolytic Virotherapy 4：207-219；Yin et al.(2017)Front.Oncol.7：136)。HSV有两种类型：HSVⅠ型(HSV-1)和HSVⅡ型(HSV-2)，大多数溶瘤型HSV来源于HSV-1。在人类中，HSV-1通过与细胞表面的核苷、糖蛋白和疱疹病毒进入介质(HVEM)结合而引起发热水泡疾病并感染上皮细胞、神经元和免疫细胞(Kohlhapp andKaufman(2016)Clin.Cancer Res.22(5)：1048-1054)。
迄今已产生了许多不同的溶瘤型HSV-1病毒。例如，HSV-1已被工程化改造成表达抗HER-2抗体曲妥珠单抗，靶向过表达HER-2的肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌、胃癌和胶质母细胞瘤。将曲妥珠单抗的编码基因插入到HSV-1gD糖蛋白基因的两个区域，产生两种溶瘤型HSV，R-LM113和R-LM249。R-LM113和R-LM249显示出对人类乳腺癌和卵巢癌以及HER2+胶质母细胞瘤小鼠模型的临床前活性。使用间充质基质细胞(MSC)作为载体细胞系统地施用R-LM249，在小鼠模型中对卵巢癌和乳腺癌的肺和脑转移发挥治疗作用(Campadelli-Fiumeet al.(2016)Viruses 8，63)。另一溶瘤型HSV-1，dlsptk HSV-1在编码胸苷激酶(TK)病毒同源物的独特长23(UL23)基因中含有缺失，而hrR3型HSV-1突变体则含有基因UL39编码的核糖核苷酸还原酶(RR)大亚基的LacZ插入突变，也称为ICP6。结果，dlsptk和hrR3 HSV-1突变体只能分别在过表达TK和RR的癌细胞中复制(Sokolowski et al.(2015)OncolyticVirotherapy 4：207-219)。
HF10是一种自发突变的溶瘤型HSV-1，缺乏编码UL43、UL49.5、UL55、UL56和潜伏期相关转录本的基因，过度表达UL53和UL54。HF10已显示出高肿瘤选择性、高病毒复制、强抗肿瘤活性和良好的安全性(Eissa et al.(2017)Front.Oncol.7：149)。研究HF10的临床试验包括：在难治性头颈部癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤患者中的I期研究(NCT01017185)和在不可切除的胰腺癌患者中HF10联合化疗(吉西他滨，NAB-紫杉醇，TS-1)的I期研究(NCT03252808)。HF10还与抗CTLA-4抗体ipilimumab联合，导致IIIb、IIIc或IV期不可切除或转移性黑色素瘤患者的治疗效果得到改善(NCT03153085)。一项II期临床研究调查了HF10与抗PD-1抗体Nivolumab联合应用于可切除的IIIb、IIIc和IV期黑色素瘤患者(NCT03259425)，并与ipilimumab联合应用于不可切除或转移性黑色素瘤患者(NCT02272855)。与单独治疗相比，紫杉醇和HF10组合治疗在腹膜结直肠癌模型中导致更高的生存率，而与单独治疗相比，HF10和厄洛替尼组合治疗导致体内外抗胰腺异种移植物的活性提高(Eissa et al.(2017)Front.Oncol.7：149)。
Talimogene laherparepvec(
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T-VEC)，以前称为OncoVEXGM-CSF，是一种FDA批准的用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤单纯疱疹病毒，由单纯疱疹病毒-1的JS1株产生，并经基因工程以表达粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)(Aref et al.(2016)Viruses 8：294)。在T-VEC中，GM-CSF的表达增强了抗肿瘤细胞毒免疫应答，而感染细胞蛋白34.5(ICP34.5)基因的两个拷贝的缺失抑制了正常组织中的复制，而ICP47基因的缺失增加了MHC I类分子的表达，允许在感染细胞上进行抗原提呈(Eissa et al.(2017))。T-VEC通过与癌细胞表面的nectin结合而表现出肿瘤选择性，并通过利用中断的致癌和抗病毒信号通路，特别是蛋白激酶R(PKR)和I型干扰素通路在肿瘤细胞中优先复制。在正常细胞中，PKR被病毒感染活化，然后使真核起始因子-2A蛋白(eIF-2A)磷酸化，使其失活，进而抑制细胞蛋白质合成，阻断细胞增殖，阻止病毒复制。野生型单纯疱疹病毒由于ICP34.5蛋白的表达而逃避抗病毒反应，该蛋白活化磷酸酶使eIF-2A去磷酸化，恢复感染细胞中蛋白质的合成。因此，ICP34.5的缺失阻止了T-VEC在正常细胞中的病毒复制。然而，癌细胞中的PKR-eIF-2A通路被破坏，允许连续的细胞生长和不受抑制的病毒复制(Kohlhapp and Kaufman(2016)Clin.CancerRes.22(5)：1048-1054；Yin et al.(2017)Front.Oncol.7：136)。GM-CSF的表达通过引起树突状细胞聚集、促进抗原提呈和启动T细胞应答来改善T-VEC的免疫原性(Kohlhapp andKaufman(2016)Clin.Cancer Res.22(5)：1048-1054)。
T-VEC在多种不同的癌细胞系中表现出优先复制，包括乳腺癌、结直肠腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和胶质母细胞瘤。临床试验包括，例如，T-VEC在胰腺癌(NCT03086642，NCT00402025)，复发性乳腺癌(NCT02658812)，儿童晚期非中枢神经系统肿瘤(NCT02756845)，非黑色素瘤皮肤癌(NCT03458117)，非肌层浸润性膀胱移行细胞癌(NCT03430687)，和恶性黑色素瘤(NCT03064763)，以及T-VEC在转移性三阴性乳腺癌和转移性结直肠癌伴肝转移患者中联合阿替唑珠单抗(NCT03256344)、在三阴性乳腺癌患者中联合紫杉醇(NCT02779855)、在难治性淋巴瘤或晚期/难治性非黑色素瘤皮肤癌患者中联合尼伏单抗(NCT02978625)、在晚期头颈部癌患者中联合顺铂和放疗(NCT01161498)、以及在肝肿瘤(NCT02509507)、头颈部癌(NCT02626000)、肉瘤(NCT03069378)和黑色素瘤(NCT02965716，NCT02263508)的患者中联合彭布利珠单抗。
除GM-CSF外，许多其它免疫刺激基因已被插入溶瘤型单纯疱疹病毒中，包括编码IL-12、IL-15、IL-18、TNFα、IFNα/β和fms样酪氨酸激酶3配体的基因，从而提高了治疗效果(Sokolowski et al.(2015)；Yin et al.(2017))。
另一溶瘤型HSV-1，R3616在编码ICP34.5的RL1(也称为γ134.5)基因的两个拷贝中都有缺失，以PKR通路中断的癌细胞为靶向。NV1020(或R7020)是一种HSV-1突变体，其包含UL55、UL56、ICP4、RL1和RL2基因的缺失，导致神经毒力和癌症选择性降低。NV1020已在头颈部鳞状细胞癌、表皮样癌和匍匐腺癌的小鼠模型中显示出结果(Sokolowski et al.(2015))。NV1020已被研究用于治疗转移到肝脏的结直肠癌(NCT00149396和NCT00012155)。
G207(或MGH-1)是另一个在UL39神经毒力基因中有RL1(γ134.5)缺失和LacZ失活插入的HSV-1突变株。使用G207的临床研究包括在进行性或复发性幕上脑肿瘤的儿童中单独或单次放射剂量给予G207的研究(NCT02457845)，在复发性脑癌(胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)患者中G207的安全性和有效性的研究(NCT00028158)，以及在恶性胶质瘤患者中G207施用后放射治疗的效果的研究(NCT00157703)。
G207用于产生G47Δ，其包含编码ICP47的基因的进一步缺失。其它HSV-1衍生的溶瘤病毒包括HSV1716，其包含RL1中的缺失，但具有完整的UL39基因并在活跃分裂的细胞中选择性复制，以及KM100突变体，其在UL48和RL2基因中具有插入，导致即刻早期病毒基因表达和癌细胞选择性的丧失(Sokolowski et al.(2015)；Yin et al.(2017)Front.Oncol.7：136)。
由于大多数人群对单纯疱疹病毒-1具有预先存在的免疫力，使用载体细胞来传递溶瘤型单纯疱疹病毒可提高其治疗潜力。例如，人腹膜间皮细胞被用作HF10的载体细胞，导致在体外以及在小鼠卵巢癌异种移植模型中有效杀伤卵巢癌细胞(Fujiwara et al.(2011)Cancer Gene Therapy 18：77-86)。
溶瘤病毒也是由单纯疱疹病毒2衍生而来。例如，FusOn-H2是一种HSV-2溶瘤病毒，其编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PK)结构域的ICP10基因N-末端区域缺失。该PK负责磷酸化GTPase活化蛋白Ras-FAP，该蛋白活化Ras/MEK/MAPK有丝分裂通路，并诱导和稳定HSV-2高效复制所需的c-Fos。正常细胞通常具有失活的Ras信号通路。因此，通过仅在具有活化的Ras信号通路的肿瘤细胞中复制，FusOn-H2表现出肿瘤选择性(Fu et al.(2006)Clin.Cancer Res.12(10)：3152-3157)。FusOn-H2已显示出对胰腺癌异种移植物的活性(Fuet al.(2006)Clin.Cancer Res.12(10)：3152-3157)、与环磷酰胺结合的Lewis肺癌异种移植物以及对同源鼠乳腺肿瘤和神经母细胞瘤的活性(Li et al.(2007)Cancer Res.67：7850-7855)。
痘病毒
痘苗病毒
痘苗病毒的实例包括但不限于，李斯特(也称为Elstree)株、纽约市健康委员会(NYCBH)株、大连株、池田株、LC16M8株、西储(WR)株、哥本哈根(Cop)株、塔什干株、天坛株、惠氏株、Dryvax株、IHD-J、IHD-W、布莱顿株、安卡拉株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、大连I株、LIPV株、LC16M0株、LIVP株、WR 65-16株、EM63株、伯尔尼株、巴黎株、CVA382株、NYVAC株、ACAM2000株、ACAM1000株和康诺特株痘苗病毒是一种溶瘤病毒，其具有多种特性，特别适用于创伤和癌症的基因治疗。例如，痘苗是一种胞质病毒，因此，它在生命周期中并不将其基因组插入宿主基因组。与许多其它需要宿主转录机制的病毒不同，痘苗病毒可利用编码在病毒基因组中的酶在宿主细胞胞浆中支持自身基因表达。痘苗病毒还具有广泛的宿主和细胞类型范围。特别地，痘苗病毒可在免疫接种细胞或免疫接种组织中积聚，包括肿瘤和/或转移瘤，也包括受伤的组织和细胞。然而，与其它溶瘤病毒不同的是，痘苗病毒通常可通过对象免疫系统的活动从被给予病毒的对象身上清除，因此比其它病毒如腺病毒毒性小。因此，虽然病毒通常可通过对象的免疫系统的活动从被给予病毒的对象中清除，但病毒仍然可在免疫豁免的细胞和组织(例如肿瘤)中积聚、存活和增殖，因为此类免疫豁免区域分离自宿主的免疫系统。
痘苗病毒也可很容易地通过插入异源基因进行修饰。这可导致病毒的衰减和/或允许治疗蛋白的递送。例如，痘苗病毒基因组对外源基因具有很大的携带能力，其中最多可插入25kb的外源DNA片段(约为痘苗基因组大小的12％)。已对几株痘苗毒株的基因组进行了完整的测序，鉴定了许多必需和非必需基因。由于不同株系之间的序列高度同源性，来自一株痘苗病毒株的基因组信息可用于工程化改造和产生其它株系的修饰病毒。最后，建立了通过基因工程生产修饰痘苗病毒菌株的技术(Moss(1993)Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90；Broder和Earl，(1999)Mol.Biotechnol.13：223-245；Timiryasova et al.(2001)Biotechniques 31：534-540)。
各种痘苗病毒已被证明具有抗肿瘤活性。例如，在一项研究中，将带有非转移性结肠腺癌细胞的裸鼠全身注射痘苗病毒WR株，该株痘苗病毒通过具有痘苗生长因子缺失和增强的绿色荧光蛋白插入胸苷激酶位点进行修饰。尽管在修饰的病毒中缺乏外源治疗基因，但观察到该病毒具有包括一个完全应答的抗肿瘤作用(McCart et al.(2001)CancerRes.1：8751-8757)。在另一项研究中，在黑色素瘤患者的III期临床试验中，将痘苗黑色素瘤溶瘤物(VMO)注射到黑色素瘤阳性淋巴结附近的部位。作为对照，对黑色素瘤患者施用New York City Board of Health株痘苗病毒(VV)。接受VMO治疗的黑色素瘤患者的存活率高于未接受治疗的患者，但与接受VV对照治疗的患者相似(Kim et al.(2001)SurgicalOncol.10：53-59)。
痘苗病毒的LIVP株也已用于肿瘤的诊断和治疗，以及用于受伤和发炎的组织和细胞的治疗(参见例如Zhang et al.(2007)Surgery 142：976-983；Lin et al.(2008)J.Clin.Endocrinol.Metab.93：4403-7；Kelly et al.(2008)Hum.Gene Ther.19：774-782；Yu et al.(2009)Mol.Cancer Ther.8：141-151；Yu et al.(2009)Mol.Cancer 8：45；美国专利第7,588,767号；美国专利第8,052,968号；和美国公开递2004/0234455号)。例如，当静脉施用时，LIVP菌株已被证实在体内多个位点积聚在内部肿瘤中，并已被证实可有效治疗各种组织来源的人类肿瘤，包括但不限于乳腺肿瘤、甲状腺肿瘤、胰腺肿瘤、胸膜间皮瘤的转移性肿瘤、鳞状细胞癌、肺癌和卵巢肿瘤。痘苗的LIVP株，包括其减毒形式，比痘苗病毒的WR株表现出更小的毒性，并导致经处理的荷瘤动物模型的增加和更长的存活率(参见，例如，美国公开第2011/0293527号)。Wyeth株痘苗病毒，如JX-594，也表现出较低的毒性，并已用于癌症的治疗。
痘苗是一种胞质病毒，因此，它在生命周期中不将其基因组插入宿主基因组。痘苗病毒具有长度约为180,000个碱基对的线性双链DNA基因组，其由单个连续多核苷酸链组成(Baroudy et al.(1982)Cell 28：315-324)。此类结构是由于存在10,000个碱基对反向末端重复(ITRs)。ITRs参与基因组复制。基因组复制涉及自启动，导致高分子量串联体(从感染细胞分离)的形成，随后该串联体切割和修复以产生病毒基因组(参见，例如，Traktman，P.，Chapter 27，Poxvirus DNA Replication，pp.775-798，in DNA Replication inEukaryotic Cells，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。所述基因组包含大约250个基因。通常，非分段、非感染性基因组的排列方式是，位于中心的基因对病毒复制至关重要(因此是保守的)，而靠近两个末端的基因影响更多的外围功能，如宿主范围和毒力。痘苗病毒通过使用开放阅读框架(ORF)来实现差异基因表达，开放阅读框架排列成一组，作为一般原则，其不重叠。
痘苗病毒具有宿主和细胞类型广泛、毒性低等特点，可用于肿瘤基因治疗和疫苗接种。例如，虽然大多数溶瘤病毒都是自然病原体，但痘苗病毒作为天花疫苗的广泛应用有着独特的历史，此类疫苗在人类中已建立了安全的记录。与牛痘施用有关的毒性发生在不到0.1％的病例中，并且可用免疫球蛋白施用有效地解决。此外，痘苗病毒具有较大的外源基因携带能力(约占痘苗基因组大小12％的外源DNA片段可插入到痘苗基因组中，并可达25kb)，不同毒株之间具有较高的序列相同性，可用于在其它毒株中工程化改造和生成修饰病毒。通过基因工程生产修饰痘苗菌株的技术已很好地建立起来(Moss(1993)Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90；Broder and Earl(1999)Mol.Biotechnol.13：223-245；Timiryasova et al.(2001)Biotechniques 31：534-540)。已显示痘苗病毒株特异性定殖实体肿瘤，同时不感染其它器官(参见，例如，Zhang et al.(2007)Cancer Res.67：10038-10046；Yu et al.(2004)Nat.Biotech.22：313-320；Heo et al.(2011)Mol.Ther.19：1170-1179；Liu et al.(2008)Mol.Ther.16：1637-1642；Park et al.(2008)Lancet Oncol.9：533-542)。
ACAM2000
在示例性实施方案中，用于本文提供的CAVES系统并用于相关方法中的痘苗病毒是ACAM2000病毒株痘苗，其是一种在美国许可的克隆分离的Dryvax疫苗。ACAM2000具有SEQID NO：70所示的序列。在传播之后，ACAM2000具有SEQ ID NO：71所示的序列(在此指定为“CAL1”或“WT1”)，该序列是SEQ ID NO：70的变体，其包括短6个碱基的左侧ITR，短197个碱基的右侧ITR，以及位于第32位的单个SNP(ITR序列的非编码区和部分)。一种示例性的CAVES系统，其包含痘苗病毒，包含ACAM2000或CAL1或其修饰株作为溶瘤病毒，以及干细胞，例如但不限于间充质干细胞、脂肪基质细胞、成纤维细胞和脂肪基质细胞的亚群，例如外膜上-脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)或周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)。
在实施方案中，修饰ACAM2000病毒或CAL1病毒以使其减毒，例如使其更安全地用于全身施用，例如F1L和/或B8R位点的减毒，和/或表达治疗基因和/或标记物，例如选择标记物。
柯萨奇病毒
柯萨奇病毒(CV)属于肠道病毒属、小RNA病毒科，具有不整合宿主细胞基因组的正向单链RNA基因组。CVs根据其在小鼠中的作用被分类为A组和B组，并可导致人类轻度上呼吸道感染(Bradley et al.(2014)Oncolytic Virotherapy 3：47-55)。用于溶瘤病毒治疗的柯萨奇病毒包括但不限于减毒柯萨奇病毒B3(CV-B3)、CV-B4、CV-A9和CV-A21(Yla-Peltoet al.(2016)Viruses 8，57)。CV-A21通过ICAM-1(或CD54)和DAF(或CD55)受体感染细胞，这些受体在肿瘤细胞(包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头颈部癌、胰腺癌和肺癌)以及多发性骨髓瘤和恶性胶质瘤中表达得更高。CV-A21在体外对恶性骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺、肺、头颈和乳腺癌细胞系，在体内对携带人黑色素瘤异种移植物的小鼠，以及对原发性乳腺癌肿瘤及其在小鼠中的转移显示出临床前抗癌活性(Yla-Pelto et al.(2016)；Bradley et al.(2014))。CV-A21的衍生物CV-A21-DAFv，也称为CAVATAKTM，是由野生型Kuykendall株通过连续传代在表达DAF的ICAM-1阴性的横纹肌肉瘤(RD)细胞上产生的，与亲本株相比具有更强的溶瘤特性。CAVATAKTM仅与DAF受体结合，这有助于其增强对癌细胞的趋化性(Yla-Pelto et al.(2016))。
CV-A21还与盐酸阿霉素联合进行了研究，与单独治疗人类乳腺癌、结直肠和胰腺癌细胞系相比，以及在人类乳腺癌的异种移植小鼠模型中显示出增强的溶瘤效率(Yla-Pelto et al.(2016))。由于相当一部分人群已开发出针对CV的中和抗体，CV-A21疗法已与免疫抑制剂如环磷酰胺(Bradley et al.(2014))结合，并且可用于通过载体细胞递送，如本文所述。
临床试验研究了在IIIc期或IV期恶性黑色素瘤患者中使用被命名为CAVATAKTM病毒(NCT01636882；NCT00438009；NCT01227551)，在非肌肉浸润性膀胱癌患者中使用CAVATAKTM单独或与低剂量丝裂霉素C联合使用(NCT02316171)。临床试验还研究了静脉施用CV-A21治疗实体肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌的效果(NCT00636558)。CavatakTM单独或与pembrolizumab组合治疗非小细胞肺癌(NCT02824965、NCT02043665)和膀胱癌(NCT02043665)患者也已进入临床试验，同样，CAVATAKTM病毒与ipilimumab组合治疗葡萄膜黑色素瘤和肝转移患者(NCT03408587)和晚期黑色素瘤患者(NCT02307149)也已进入临床试验；CAVATAKTM病毒与pembrolizumab联合应用于晚期黑色素瘤患者(NCT02565992)。
塞内卡谷病毒
塞内卡谷病毒(SVV)是小RNA病毒科塞内加尔病毒属的成员，具有正义单链RNA基因组，并且对神经内分泌癌包括神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、Wilms瘤、胶质母细胞瘤和小细胞肺癌具有选择性(Miles et al.(2017)J.Clin.Invest.127(8)：2957-2967；Qian et al.(2017)J.Virol.91(16)：e00823-17；Burke，M.J.(2016)OncolyticVirotherapy 5：81-89)。研究已鉴定炭疽毒素受体1(ANTXR1)是SVV的受体，与正常细胞相比，SVV经常在肿瘤细胞表面表达，但先前的研究也表明唾液酸可以是儿童胶质瘤模型中SVV受体的成分(Miles et al.(2017))。SVV分离物001(SVV-001)是一种强溶瘤病毒，经静脉施用后可靶向并穿透实体瘤，因其缺乏插入突变性、对癌细胞的选择性取向以及对人和动物无致病性而具有吸引力。此外，以前在人类中接触的情况很少，导致先前存在的免疫率较低(Burke，M.J.(2016)Oncolytic Virotherapy 5：81-89)。
SVV-001已显示出对小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和尤文肉瘤细胞株的体外活性，以及在儿童GBM、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤的原位异种移植小鼠模型中的体内活性(Burke(2016))。NTX-010是
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公司开发的溶瘤SVV-001，已被证明单独或与环磷酰胺组合治疗复发/难治性实体瘤的儿科患者是可行和可耐受的，但由于中和抗体的开发，其治疗效果受到限制(Burke et al.(2015)Pediatr.Blood Cancer 62(5)：743-750)。临床试验包括在具有神经内分泌特征的实体瘤患者中使用SV-001的研究(NCT00314925)，在复发或难治性神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、Wilms瘤、视网膜母细胞瘤、肾上腺皮质癌或类癌患者中使用NTX-010/SVV-001联合环磷酰胺的研究(NCT01048892)，以及在化疗后的小细胞肺癌患者中使用NTX-010/SVV-001的研究(NCT01017601)。
修饰病毒的方法
多种工程化病毒的方法，包括工程化细胞载体的方法，如上述的方法，是本领域已知的。通过基因工程生产修饰的痘苗菌株的技术已很好地建立起来(Moss，Curr.Opin.Genet.Dev.3(1993)，86-90；Broder and Earl，Mol.Biotechnol.13(1999)，223-245；Timiryasova et al.，Biotechniques 31(2001)，534-540)。工程化溶瘤病毒的方法包括但不限于：
(1)同源重组需要使用供体载体，其含有侧翼为两个DNA区的转基因，所述两个DNA区在我们想要插入转基因的位置与受体病毒DNA同源(Kaufman，H.L.，F.J.Kohlhapp，andA.Zloza，Oncolytic viruses：a new class of immunotherapy drugs.Nat Rev DrugDiscov，(2015)14(9)：642-62)。重组病毒可通过几种方法进行筛选，包括TK阳性/阴性、beta-半乳糖苷酶、显性选择标记如绿色荧光蛋白(GFP或eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或TurboFP635，或利用磷酸核糖转移酶(gpt)进行瞬时显性选择(TDS)。
源自P1噬菌体的CRE/lox系统是一种位点特异性重组酶技术，用于在细胞DNA的特定位点进行缺失、插入、易位和倒位(Kleinstiver，B.P.，et al.，High-fidelity CRISPR-Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.Nature 529(7587)：490-495(2016))。该工具在真核和原核生物中都起作用，并且已很好地建立了多种转基因动物模型(Ran，F.A.，et al.，Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 forenhanced genome editing specificity.Cell，2013.154(6)：p.1380-9)。该系统基于一个位点特异性Cre重组酶(～1kb)，其需要易于掺入任何靶DNA的34bp特异性loxP序列。Cre/lox重组系统的优点之一是，无论细胞环境如何，都不需要额外的辅因子或序列元件来进行高效重组(Schaefer，K.A.，et al.，Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editingin vivo.Nat Methods，2017.14(6)：p.547-548)。分析表明，loxP序列的m2、m3、m7、m11、lox5171等突变位点容易与自身重组，但与野生型位点的重组率明显较低。因此，这些序列可通过重组酶介导的盒交换(RMCE)以高效保真度和位点特异性的方式用于基因插入(Oberstein，A.，et al.，Site-specific transgenesis by Cre-mediated recombinationin Drosophila.Nat Methods，(2005)2(8)：583-5)。Nakano和同事证明了RMCE可用于生产腺病毒载体，方法是利用核Cre重组酶和不相容的loxP和loxP 2272系统(Kuhn，R.andR.M.Torres，Cre/loxP recombination system and gene targeting.Methods Mol Biol，2002.180：p.175-204)。
(2)CRISPR/Cas9已用于产生新的重组痘苗病毒。由于Cas 9蛋白酶在由信号指导RNA标记的DNA基因组中的限定位点切割的能力，CRISPR/Cas 9最近已成为编辑来自各种生物体的基因组的方法(Wyatt，L.S.，P.L.Earl，and B.Moss，Generation of RecombinantVaccinia Viruses.Curr Protoc Mol Biol，2017.117：p.16.17.1-16.17.18)。通过Cas9在靶DNA中引入双链断裂促进了所需基因的插入。Yuan和他的同事们表明，与同源重组方法相比，使用CRISPR/Cas9系统在产生新的重组病毒方面提高了效率(50倍以上)(Falkner，F.G.and B.Moss，Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.JVirol，1990.64(6)：p.3108-11)。为克服哺乳动物细胞中的非靶诱导突变，已引入了Cas9核酸酶中的几个突变：N497A、R661A、Q695A和Q926A(Cas9高保真)，导致更精确的切割(Mali，P.，K.M.Esvelt，and G.M.Church，Cas9 as a versatile tool for engineeringbiology.Nat Methods，2013.10(10)：p.957-63)或D10A突变的Cas9，其提供单链断裂(Yuan，M.，et al.，A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant VacciniaVirus Vectors.J Vis Exp，2016(116))。
工程化病毒
在实施方案中，本文提供的CAVES系统可使用工程化溶瘤病毒产生。溶瘤病毒可通过本领域已知的方法或本文提供的方法进行工程化。所述病毒可被工程化用于重组表达选择标记物，所述选择标记物包括但不限于EGFP、EmGFP、mNeonGreen、EBFP、TagBFP、EYFP、TPet、GFP、BFP或TurboFP635，和/或用于重组表达治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质包括但不限于细胞因子(GM-CSF、IL2、IL10、IL12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、TNF、MIP1a、FLt3L、IFN-b、IFN-g)、趋化因子(CCl5、CCl2、CCl19、CXCl11、RANTES)、共刺激因子(OX40L、41BBL、CD40L、B7.1/CD80、GITRL、LIGHT、CD70)、BITE、治疗性抗体、免疫检查点抑制剂、单链抗体(针对例如VEGF、例如VEGF-A、VEGF-B、PGF、VEGFR 2、PDGFR、Ang-1、Ang-2、ANGPTL 1、ANGPTL2，HGF)和免疫检查点抑制剂(例如针对PD-1、PD-L1、CTLA 4、TIM-3)、前药活化剂(lacZ、胞嘧啶脱氨酶)、人碘化钠同功酶-hNIS和水通道蛋白1-AQP 1。所述病毒可被工程化以在不同的病毒启动子(例如，Pel，pL)下表达上述重组蛋白中的1个，2个或更多个。所述病毒可被工程化以表达治疗性蛋白的组合，例如针对血管生成和免疫系统共刺激因子或检查点(例如，抗VEGFA和VEGFB以及PGF)的调节剂的治疗性蛋白的组合；抗VEGF和抗ANGPT 2；抗VEGF，抗ANGPT-2，抗CTL 4；抗VEGF和OX 40L；抗VEGF，抗ANGPT 2和抗PD-1。
工程化痘苗病毒
在实施方案中，工程化病毒是工程化痘苗病毒。在实施方案中，痘苗病毒是ACAM2000及其衍生物，例如通过繁殖病毒产生的衍生物。在实施方案中，痘苗病毒具有包含SEQ ID NO：70(ACAM2000)或SEQ ID NO：71(CAL1)所示的序列的基因组。对ACAM2000基因组DNA进行测序分析鉴定了241个不同的开放阅读框(ORF)，其编码病毒结构、酶、免疫调节剂蛋白和具有未鉴定功能的蛋白。在某些实施方案中，选择标记和/或治疗基因可插入到本领域技术人员公知的非必需基因位点中。在一些实施方案中，插入到ORF_157和ORF_158之间的基因间区，而不改变病毒的原始性质。其它位点如OFR_174和ORF_175的基因间区，或截短的ORFs(例如72、73、156、157、157、159、160、174、175)也可用于插入转基因而不改变原始病毒性质。这些病毒可通过诸如胸苷激酶(TK)、血细胞凝集素(HA)、干扰素alfa/beta阻断剂受体和其它免疫调节剂等基因的灭活而进一步减毒。在实施方案中，F1L位点或其部分可被选择物或可检测标记物和/或目的治疗基因替换或中断(即，消除F1L功能，其是内在线粒体凋亡的有效抑制剂)。在其它实施方案中，用目的选择标记和/或治疗基因替换抗干扰素gamma基因B8R或其部分。减毒病毒除了是携带外源基因(如治疗基因)的载体外，有时对全身施用更为安全。
在一些实施方案中，修饰痘苗或ACAM2000以增强EEV(胞外包膜病毒)的产生。在一个实施方案中，通过在A34R蛋白(K151E)的氨基酸151处用谷氨酸取代甘氨酸来实现增强的EEV产生。痘苗病毒从每个感染的细胞中产生四种不同类型的病毒体，分别为细胞内成熟病毒(IMV)、细胞内包膜病毒(IEV)、细胞相关包膜病毒(CEV)和细胞外包膜病毒(EEV)。EEV经过优化，可快速有效地通过实体瘤局部传播，并传播到区域或远处的肿瘤部位。K151E突变增加EEV的释放，同时保持释放病毒的传染性。
本文提供了在未经修饰的ACAM2000病毒中包含一个或多个前述修饰和/或本领域技术人员已知的其它修饰的修饰ACAM2000病毒。可引入本文所述和/或本领域技术人员已知的任何治疗基因和/或选择标记中的一个或多个以产生本文提供的工程化ACAM2000病毒。在实施方案中，未经修饰的ACAM2000病毒具有SEQ ID NO：70所示的序列。在其它实施方案中，未经修饰的ACAM2000病毒具有SEQ ID NO：71所示的序列。可使用任何修饰的ACAM2000病毒或未经修饰的ACAM2000病毒来产生本文提供的CAVES系统。
示例性免疫调节剂和治疗蛋白质
通过将溶瘤病毒与合适的载体细胞孵育足以表达至少一种病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组治疗蛋白的时间量来产生本文提供的CAVES系统。下面描述和提供示例性病毒免疫调节剂和治疗蛋白。
免疫调节剂
包括痘苗病毒(VACV)在内的病毒编码多种宿主免疫调节剂，其阻断肿瘤微环境中初始抗病毒应答，并保护感染细胞免受补体和自然杀伤(NK)细胞的中和。这些免疫调节剂可以是细胞内的(非分泌的)或细胞外的(分泌的)。例如，感染细胞分泌结合并破坏补体，干扰素(IFNα)，细胞因子和趋化因子的功能并干扰信号传导的蛋白质。分泌的(细胞外)免疫调节剂可阻止趋化因子与其白细胞上宿主受体的相互作用，干扰白细胞向感染和炎症区域的迁移。细胞外免疫调节剂也可抵消促炎性细胞因子诱导的抗病毒状态，例如通过破坏TNF-alpha诱导的病毒感染细胞的凋亡。细胞内免疫调节剂抑制细胞凋亡，调节干扰素的抗病毒作用，干扰先天免疫信号传导和宿主基因转录。例如，细胞内免疫调节剂抑制导致产生干扰素和促炎趋化因子和细胞因子的信号通路(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。不同的痘苗毒株编码不同的免疫调节剂；因此，每种病毒株与宿主细胞的相互作用不同。本文中的病毒可通过基因工程来表达细胞内和/或细胞外免疫调节剂，从而增加其毒力，或者，它们可通过缺失编码免疫调节蛋白的基因来减毒。
可由本文的病毒表达的细胞外痘病毒免疫调节剂包括趋化因子抑制剂/结合蛋白A41；TNF抑制剂/结合蛋白CrmB、CrmC、CrmD和CrmE；MHC样TNF-alpha抑制剂TPXV2；IL-18结合蛋白C12；VACV CC趋化因子抑制剂(vCCI)，其阻止白细胞募集；干扰素伽马结合蛋白(IFN-γ)，其阻断IFN-γ与其受体的结合；IL-1β-结合蛋白B15；Ⅰ型干扰素结合蛋白B18；II型干扰素结合蛋白B8；补体调控蛋白VCP(C21/B27)；和信号素7A mimic A39(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Sumner et al.(2016)Vaccine 34：4827-4834；Nichols et al.(2017)Viruses 9，215；Albarnaz et al.(2018)Viruses10，101)。
可由本文的病毒表达的细胞内痘病毒免疫调节剂包括血细胞凝集素(HA，A56)；胸苷激酶；B5(促进病毒传播)；N1(Bcl-2样凋亡抑制剂和NF-кB/IRF3活化抑制剂)；B14和A52(NF-кB的Bcl-2样抑制剂)；K7(NF-кB和IFN-beta的Bcl-2样抑制剂)；F1和M11(Bcl-2类抗凋亡药物)；E3(PKR活化抑制剂，dsRNA结合蛋白)；K3(抑制PKR介导的eIF2α磷酸化)；C4(NF-кB活化抑制剂)；C6(IRF3/7和JAK/STAT抑制剂)；VH1(去磷酸化STAT1并阻断IFN诱导基因的表达)；A35(MHC II类抗原提呈抑制剂)；B13(SPI-2/CrmA)和B22(SPI-1)，其抑制caspase活性；N2(IRF3抑制剂)；D9和D10(脱帽酶)；C16(DNA传感抑制剂和低氧反应启动子)；A49、K1和M2(NF-кB活化抑制剂)；蛋白质169(翻译抑制剂)；vGAAP(凋亡抑制因子)；A44(3β-羟基类固醇脱氢酶)；和A46(TLR信号传导、NF-кB、IRF3和MAPK抑制剂)(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Sumner et al.(2016)Vaccine 34：4827-4834；Nichols et al.(2017)Viruses9，215；Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
VCP(C3L)
痘苗病毒补体调控蛋白(VCP；由C3L，C21L编码)是痘苗病毒感染细胞分泌的主要蛋白，与未感染细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)相互作用。VCP也可独立于HSPGs在VACV感染细胞表面表达。VCP的表面表达依赖于它与另一病毒蛋白A56(也称为血细胞凝集素)的相互作用，该蛋白存在于痘苗病毒感染的细胞和细胞外包膜病毒(EEV)颗粒的表面。VCP通过加速C3和C5转化酶的衰变(这是不可逆的)以及作为因子I介导的C3b和C4b的切割和失活的辅因子来抑制经典和替代补体途径的活化(Girgis et al.(2008)J.Virol.82(8)：4205-4214；Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。缺失了编码VCP的C21L基因的缺失突变体在兔体内被减毒，并与CD4+和CD8+T细胞浸润增加、病毒滴度降低和针对VACV的抗体增加相关(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
研究表明，当VCP被工程化改造成含有允许其在细胞表面表达的跨膜结构域时，它能够保护细胞免受补体介导的裂解，证明VCP存在时裂解率降低了三倍。(Rosengard etal.(1999)Mol.Immunol.36(10)：685-697)。通过保护痘苗感染的细胞不被裂解，表面结合的VCP延长病毒产生并导致病毒滴度增加。细胞表面补体活化的减少也减少了促炎肽如C3a和C5a的产生，这减少了局部炎症和免疫系统活化(Girgis et al.(2008)J.Virol.82(8)：4205-4214)。
B5
B5(由B5R编码)是补体蛋白家族的成员，是存在于细胞外包膜病毒(EEV)外包膜中的I型整体膜糖蛋白，是EEV形成所需的，并促进病毒传播(Smith et al.(2013)Journal ofGeneral Virology 94：2367-2392)。
胸苷激酶(TK)
由早期VACV J2R基因编码的VACV胸腺嘧啶核苷激酶(TK)是一种毒力因子，当从病毒基因组中删除时，会导致痘苗病毒株减毒(Yakubitskiy et al.(2015)Acta Naturae7(4)：113-121)。
HA(A56)
自然杀伤(NK)细胞是通过抑制和活化信号转导受体调控的，在对痘苗病毒(VACV或VV)等邻位病毒家族成员的免疫防御中发挥重要作用。活化信号受体包括NKG2D和天然细胞毒性受体(NCRs)如NKp46、NKp44和NKP30。NCRs是NK细胞抗病毒和抗肿瘤活性的重要活化受体(Jarahian et al.(2011)PLoS Pathogens 7(8)：e1002195)。
血细胞凝集素(HA)(由A56R编码)，也称为A56，是介导病毒附着宿主细胞、抑制感染细胞融合、促进感染性蛋白水解活化的蛋白质(Yakubitskiy et al.(2015)ActaNaturae7(4)：113-121)。HA是VACV感染细胞表面的晚期产物，是活化受体NKp30和NKP46的病毒配体。HA/A56可阻断NKP30触发的活化，从而降低感染细胞在VACV表达后期对NK裂解的敏感性，此时HA表达明显。因此，HA是NCR的保守配体，并通过其在感染晚期对NKP30介导的活化的阻断作用导致免疫逃逸(Jarahian et al.(2011)PLoS Pathogens 7(8)：e1002195)。
VACV基因组中A56R的缺失导致小鼠的半数致死量与亲本株相比降低了40倍。因此，VACV中HA基因的失活导致显著的衰减(Yakubitskiy et al.(2015)Acta Naturae 7(4)：113-121)。
B18
VACV蛋白B18(由B18R编码)是一种可溶性的细胞外免疫调节蛋白，它与I型干扰素结合，在溶液中表现出“诱骗干扰素受体”的活性，当通过糖胺聚糖(GAG)与细胞表面结合时，可隔离未感染细胞产生的I型干扰素，特别是IFN-α。当B18结合到细胞表面，防止未感染细胞中IFN介导的抗病毒状态的诱导时，细胞仍然易受病毒感染和复制的影响(Smith etal.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392；Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
B8
B8(由B8R编码)是一种可溶性VACV诱饵II型干扰素受体，可在细胞外与干扰素结合。在小鼠感染研究中，与野生型VACV相比，与干扰素受体胞外结构域同源物B8的缺失导致VACV的衰减(Yakubitskiy et al.(2015)Acta Naturae 7(4)：113-121)。与细胞IFN-γR不同，B8在没有IFN-γ的情况下可二聚化(Smith et al.(2013)Journal of GeneralVirology 94：2367-2392)。
B15
VACV蛋白B15(由B15R编码)是由感染细胞分泌的可溶性IL-1R，它与IL-1β具有高亲和力结合，阻止其与其天然受体结合。研究表明，缺乏B15R基因的病毒表现出降低的毒力(Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。
A39/A39R
A39/A39R是一种分泌性免疫调节糖蛋白，其氨基酸序列与糖磷脂酰肌醇连接的细胞表面信号素相似。在小鼠皮内模型中，A39R在感染期间晚期表达，并且已显示具有促炎特性，并影响感染的结果(Gardner et al.(2001)J.Gen.Virol.82：2083-2093)。
CrmA/B13/SPI-2
细胞因子反应修饰剂A(CrmA)(也称为B13/B13R或丝氨酸蛋白酶抑制剂2(SPI-2))是一种在病毒感染过程早期表达并保留在宿主细胞内的正痘病毒蛋白。CrmA结合caspase-1并阻断IL-1β前体与IL-1β的切割。IL-1β是一种在控制痘病毒感染中起重要作用的促炎细胞因子。通过抑制多种半胱天冬酶(如半胱天冬酶1、半胱天冬酶8)的活化，CrmA/B13也抑制细胞凋亡。B13还抑制成熟IL-18的形成(Smith et al.(2013)Journal of GeneralVirology 94：2367-2392；Nichols et al.(2017)Viruses 9，215)。
SPI-1/B22R
痘苗病毒SPI-1(也称为B22或B22R)是一种与SPI-2/CrmA相似的细胞内免疫调节蛋白，其抑制半胱天冬酶活性。研究表明，缺失SPI-1/B22R基因的变异VACV在A549细胞中的病毒复制率较低。感染的细胞对TNF诱导的凋亡敏感，这表明SPI-1在毒力中起着重要作用(Nichols et al.(2017)Viruses 9，215)。
病毒TNF受体(vTNFR)
病毒TNF受体(vTNFR)是一种可溶性的、分泌性的诱饵受体，可与TNFα结合，阻止其与天然受体结合，减轻其抗病毒作用。vTNFRs包括细胞因子反应修饰剂B(CrmB)、CrmC、CrmD和CrmE(A53)，它们模拟细胞TNF受体TNFR1和TNFR2的胞外结构域，在配体亲和力和在正痘病毒中的表达上存在差异。研究表明vTNFR增强了重组VACV的毒力。例如，缺乏CrmE的VACV菌株USSR突变体被减毒，而表达CrmE的VACV WR重组菌株显示出增加的毒力(Nichols etal.(2017)Viruses 9，215；Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392；Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134)。
C12
C12(由C12L编码)是一种可溶性的正痘病毒蛋白，在溶液中与IL-18结合，阻止其与其天然受体IL-18R相互作用。C12通过抑制IL-12诱导的干扰素的产生增加VACV的毒力，干扰素的产生抑制NK细胞和VACV特异性CD8+T细胞应答(Smith et al.(2013)Journal ofGeneral Virology 94：2367-2392)。已显示C12L基因的缺失导致病毒衰减，IL-18和IFN-γ水平增加，并且在小鼠鼻内感染后增强NK细胞的细胞毒性和CTL应答(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
VACV CC趋化因子抑制剂(vCCI)
趋化因子是一种小的趋化细胞因子，能将白细胞聚集到感染和炎症部位。趋化因子与邻近内皮细胞表面的GAGs结合，产生浓度梯度，并通过结合其趋化因子受体来募集循环白细胞。VACV CC趋化因子抑制因子(vCCI)，又称VACV趋化因子结合蛋白(vCKBP)，其是病毒感染早期细胞分泌的一种趋化因子，可与CC趋化因子结合，阻止其与受体结合。这防止白细胞聚集到感染部位，减少炎症(Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。
A41
尽管大多数病毒CC趋化因子抑制剂在其受体结合位点结合趋化因子，防止其与白细胞相互作用和募集到炎症位点，A41(由A41L编码)是在其GAG结合位点而不是受体结合位点结合趋化因子的细胞外VACV免疫调节蛋白(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134)。A41在感染早期也由感染细胞分泌，但与趋化因子结合的亲和力低于vCCI，且不阻止趋化因子与各自的趋化因子受体结合。相反，A41破坏了内皮细胞表面的趋化因子浓度梯度，这对于白细胞的募集是重要的(Smith et al.(2013)Journal of GeneralVirology 94：2367-2392；Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
VH1
VACV VH1是细胞内免疫调节蛋白(磷酸酶)，其通过去磷酸化抑制转录因子STAT1(信号转导子和转录活化子1)和STAT2，抑制来自所有干扰素受体的信号传导并阻止抗病毒基因的表达(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。
K3
K3是一种VACV细胞内免疫调节蛋白，可抑制PKR介导的eIF2α磷酸化。在病毒感染细胞中，STAT1诱导dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)的表达，该蛋白激酶检测VACV转录过程中产生的dsRNA，磷酸化并抑制宿主蛋白翻译因子eIF2α(真核生物翻译起始因子2alpha)，阻止宿主和病毒蛋白在感染细胞中的合成，导致细胞凋亡。K3是eIF2a的N-末端88个氨基酸的病毒模拟物，其通过作为不可磷酸化的假底物结合PKR，并通过抑制PKR对eIF2a的磷酸化来防止PKR诱导的凋亡(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Smith et al.(2013)Journal of General Virology 94：2367-2392)。
N1
B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白具有促凋亡或抗凋亡作用，并调节促凋亡分子从线粒体中的释放。包括疱疹病毒、腺病毒和VACV在内的几种病毒表达抗凋亡的Bcl-2和Bcl-2样蛋白以逃避宿主细胞死亡。例如，N1(由N1L编码)是一种VACV毒力因子，起细胞内免疫调节剂的作用，并且在结构上与抗凋亡的Bcl-2蛋白相似。N1结合促凋亡蛋白的BH3基序，抑制VACV感染细胞的凋亡。已显示N1与宿主促凋亡的Bcl-2蛋白如Bid、Bad、Bak和Bax相互作用，并且已显示通过与IкB激酶(IKK)复合物和TANK结合激酶1(TBK1)结合来抑制先天免疫信号通路，抑制核因子(NF)-кB和IRF3的活化(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134)。
F1
F1(由F1L编码)是VACV细胞内免疫调节剂，是痘病毒Bcl-2样家族蛋白，抑制病毒感染细胞的凋亡。F1与促凋亡Bcl-2蛋白的BH3基序结合，并且与发现于胞浆中的N1不同，它定位于线粒体膜，与宿主促凋亡Bcl-2蛋白如Bak和Bax相互作用，后者在线粒体膜处启动凋亡(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134)。F1还通过结合NLRP-1来减少炎症反应，所述NLRP-1是caspase-1的上游活化剂(Smith et al.(2013)Journal ofGeneral Virology 94：2367-2392)，并且结合并抑制Caspase 9(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
抑制NF-кB通路的Bcl-2样蛋白
核因子(NF)是一种转录因子复合物，能刺激对感染的天然免疫和适应性免疫反应。促炎性细胞因子的受体如TNFα和IL-1以及Toll样受体(TLRs)识别病原体相关分子模式(PAMPs)，活化信号通路，从而导致NF-кB活化。VACV编码几种Bcl-2样蛋白，包括N1、A52、B14和K7，它们抑制NF-кB信号通路。而缺乏BH3结合沟的A52、B14和K7则不抑制凋亡。B14通过与IKKβ结合并阻止其磷酸化和IкBα的磷酸化来抑制NF-кB的活化并作用于IKK复合物。A52和K7通过抑制TLR诱导的信号转导和TLR-和IL-1β-介导的NF-кB活化(通过与TRAF6和IRAK2结合)来抑制B14上游的信号转导。K7(由K7L编码)还与人DEAD-盒RNA解旋酶3(DDX3)形成复合物，拮抗IFN-β启动子诱导并抑制促炎细胞因子的产生(Bahar et al.(2011)J.Struct.Biol.175(2-2)：127-134；Smith et al.(2013)Journal of General Virology94：2367-2392；Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
A46
A46(由A46R编码)是与含有Toll/IL-1R(TIR)结构域的衔接分子(例如MyD88，MAL，TRIF和TRAM)结合的胞内VACV免疫调节蛋白，所述衔接分子与TLR的细胞质尾缔合。这又抑制MAP激酶，NF-κB和IRF 3的活化，其抑制IFN-β的诱导(Smith et al.(2013)Journal ofGeneral Virology 94：2367-2392)。与对照病毒相比，VACV WR A46R缺失突变体的毒性减弱(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
抑制NF-кB活化的其它蛋白质
A49是一种胞内VACV蛋白，其通过防止其识别和降解来稳定磷酸化的IκBα(κB的抑制剂)，使得IκBα保持与细胞质中的NF-κB结合。细胞内VACV蛋白C4在IKK复合物处或下游抑制NF-кB的活化，但其机制尚不清楚。VACV蛋白E3(由E3L编码)通过依赖于PKR的独立机制和通过拮抗RNA聚合酶III-dsDNA传感途径抑制NF-кB活化。E3结合和隔离来自细胞模式识别受体(PRRs)的dsRNA阻止细胞识别病毒dsRNA。除E3外，VACV脱帽酶D9和D10通过脱帽病毒mRNAs，阻止PKR和dsRNA诱导的抗病毒途径的活化来阻止dsRNA的积累。VACV蛋白K1通过阻止IкBα的降解抑制NF-кB的活化。蛋白M2降低由肉豆蔻酸佛波酯乙酸酯诱导的细胞外信号调节激酶2(ERK2)的磷酸化，并防止p65核易位(Smith et al.(2013)Journal of GeneralVirology 94：2367-2392；Nichols et al.(2017)Viruses 9，215；Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
C6
C6(由C6L编码)是一种细胞内免疫调节蛋白，通过与活化上游激酶TBK1和IKKε所需的接头蛋白结合，增强IRK3和IRF7的毒力并抑制其活化。这导致抑制I型干扰素的产生。C6还抑制I型干扰素与其受体结合后JAK/STAT信号通路的活化，阻止干扰素刺激基因(ISGs)的转录。已显示缺失C6L可增强CD8+和CD4+T细胞应答(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
C16
C16是细胞内免疫调节蛋白，其通过与DNA-PK复合物(DNA传感器)亚基的蛋白质Ku70和Ku80结合，抑制导致IRF3依赖的天然免疫的DNA感应。C16还结合氧传感器的含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)，防止缺氧诱导的转录因子(HIF)-1α的羟基化。这防止了HIF-1α的泛素化和降解，并且稳定的HIF-1α诱导导致缺氧反应的基因的转录。已显示C16的缺失导致更快的肺募集和CD8+和CD4+T细胞的活化(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
N2
蛋白N2是一种具有Bcl-2折叠的细胞内免疫调节蛋白，通过未知的机制抑制IRF3的活化。从VACV株WR中缺失N2导致毒力降低和肺细胞浸润增加(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
蛋白169
蛋白169是一种细胞内免疫调节蛋白，其通过抑制Cap依赖和Cap非依赖翻译的起始来抑制免疫应答(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
蛋白A35
蛋白A35由A35R编码，是一种细胞内免疫调节蛋白，通过MHCⅡ类分子限制抗原向T细胞递呈。A35R缺失突变体减毒，并导致较低的VACV特异性抗体、IFN-γ的分泌减少和脾细胞的裂解减少(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
蛋白A44
蛋白A44是细胞内免疫调节剂，其为3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)并促进毒力。缺乏蛋白A44的VACV毒株WR突变体导致增强的炎症应答，增加的IFN-γ水平，CD8+和CD4+T细胞的快速募集，以及对VACV感染的细胞更强的溶细胞性T细胞应答(Albarnaz et al.(2018)Viruses 10，101)。
vGAAP
病毒高尔基体抗细胞凋亡蛋白(vGAAP)是主要定位于高尔基体并抑制细胞凋亡的疏水蛋白。VACV vGAAP抑制星形孢菌素，TNFα/环己酰亚胺(CHX)，Fas抗体，阿霉素，顺铂和C2神经酰胺诱导的内在和外在凋亡通路，以及Bax过表达诱导的凋亡。vGAAP形成离子通道，其导致Ca2+的漏出，降低其在高尔基体中的浓度，并且影响由Ca2+的释放介导的凋亡通路(Nichols et al.(2017)Viruses 9，215)。
治疗蛋白质
用于产生本文提供的CAVES的溶瘤病毒也可被工程化改造以表达重组治疗蛋白。下面描述示例性治疗蛋白；这些蛋白质也可单独施用，作为与本文提供的CAVES系统的组合疗法。
免疫检查点
免疫检查点参与免疫系统的调节和防止自身免疫，包括刺激和抑制途径。病毒感染刺激免疫和炎症通路和应答，而肿瘤已进化为逃避免疫系统，例如通过活化抑制性免疫检查点通路来抑制抗肿瘤免疫应答。通过添加编码诱导期望的免疫刺激抗肿瘤应答的分子的基因或抑制促进肿瘤免疫逃避的免疫检查点通路的基因来修饰本文中的病毒，可提高病毒的抗肿瘤活性。这可通过共刺激途径的激动，共抑制途径的拮抗，或两者兼而有之来实现。例如，本文中的病毒可被修饰以表达肿瘤用于免疫逃避的共刺激因子、或共刺激因子的激动剂、或免疫检查点通路的抑制剂，以改善抗肿瘤免疫应答。
免疫检查点抑制剂
免疫检查点抑制剂是免疫抑制拮抗剂，对维持自身耐受至关重要，但可被肿瘤过度表达作为逃避免疫系统检测的手段(Meyers et al.(2017)Front.Oncol.7：114)。程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；也称为CD279)及其同源配体程序性死亡配体1(PD-L1；也称为B7-H1和CD274)是众多抑制性“免疫检查点”的两个实例，它们通过下调免疫应答而起作用。例如，PD-1在T细胞上的上调及其与PD-L1的结合(PD-L1在抗原提呈细胞和肿瘤细胞上均有表达)干扰CD8+T细胞的信号通路，损害CD8+T细胞的增殖和效应功能，诱导T细胞耐受。抗PD-1抗体(例如，pembrolizumab、nivolumab、pidilizumab)和抗PD-L1抗体(例如，atezolizumab、BMS-936559、avelumab(MSB0010718C)和durvalumab)可由本文的病毒表达以增强抗肿瘤效果。
另一个抑制性免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4；也称为CD152)，其在T细胞上表达，与APC上的共刺激受体(如CD80或CD86)结合并抑制共刺激簇分化28(CD28)竞争，后者结合相同的受体，但亲和力较低。这阻断了来自CD28的刺激信号，而来自CTLA-4的抑制信号被传递，从而阻止T细胞活化(参见Phan et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：8372-8377)。CTLA-4的抑制增强了CD4+T辅助细胞介导的免疫应答，并导致Treg的免疫抑制效应被抑制。(Pardoll，D.M.(2012)Nat.Rev.Cancer 12(4)：252-264)。抗CTLA-4抗体如ipilimumab和tremilimumab可由本文的病毒编码以增强抗肿瘤作用。
淋巴细胞活化基因3(LAG3；又称CD223)是另一T细胞相关抑制分子，在MHCⅡ类连接后由T细胞和NK细胞表达，对T细胞功能有负向调节作用。抗LAG-3的单克隆抗体可用于抑制LAG-3。此外，LAG-3-Ig融合蛋白(IMP321，
Figure BDA0003148729980000541
)是LAG-3的可溶性形式，其上调共刺激因子并增加IL-12生成，增强肿瘤免疫应答，在临床试验中已显示可增加肿瘤反应性T细胞(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3，又称甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2))是T细胞的直接负性调节因子，表达于NK细胞和巨噬细胞上，通过诱导骨髓源性抑制细胞(MDSC)的扩增而促进免疫抑制。针对TIM-3的单克隆抗体，如MBG453，可增加T细胞增殖和细胞因子生成(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology11：39)。
T细胞活化V-结构域Ig抑制子(VISTA)，又称程序性死亡1同源物(PD-1H)，其抑制T细胞活化增殖和细胞因子产生。研究表明，阻断VISTA增加TIL活化，增强肿瘤特异性T细胞反应。针对VISTA(例如，JNJ-61610588)和抑制剂(例如，口服抑制剂CA-170)的单克隆抗体正在临床试验中进行研究(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
B7-H3(又称CD276)在APC、NK、B细胞和T细胞上表达，并抑制T细胞活化和增殖，以及细胞因子的产生。B7-H3在几种类型的癌症中过表达，包括黑色素瘤、NSCLC、前列腺、胰腺、卵巢和结直肠癌。抗B7-H3的人源化单克隆抗体Enoblituzumab(MGA271)和放射性碘标记的抗B7-H3抗体8H9已显示出抗肿瘤活性(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA，或CD272)是由大多数淋巴细胞表达的抑制性受体，当与其配体疱疹病毒进入介质(HVEM)结合时，其阻断B和T细胞活化、增殖和细胞因子产生(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR，也称为CD158)由NK和T细胞表达，降低淋巴细胞活化、细胞毒活性和细胞因子释放。针对KIRs的抗体包括利鲁单抗和IPH4102(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种色氨酸降解酶，参与免疫抑制，在多种肿瘤中过度表达，包括黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、卵巢癌、CMC和肉瘤。IDO抑制剂可用于免疫检查点治疗，并包括BMS-986205、吲哚昔莫特和epacadostat(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
此外，腺苷受体A2aR抑制T细胞反应，其缺失已被证明可增强对感染的炎症反应。A2aR可被阻断腺苷结合的抗体或腺苷类似物抑制(Pardoll，D.M.(2012)Nat.Rev.Cancer12(4)：252-264)。
可被本文病毒靶向用于癌症免疫治疗的其它抑制性免疫检查点分子包括，但不限于信号调节蛋白、程序性死亡配体2(PD-L2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)1和2、半乳糖凝集素-9、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、疱疹病毒进入介体(HVEM)、CTNNB1(β-连环素)、TIM1、TIM4、CD39、CD73、B7-H4(也称为VTCN1)、B7-H6、CD47、CD48、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD112、CD155、CD160、CD200、CD244(2B4)和癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1或CD66a)。
虽然免疫检查点抑制剂已证明在有应答的患者中抗癌治疗是成功的，但许多患者没有应答，可能是由于TME中缺乏活性的肿瘤特异性T细胞。由于溶瘤病毒治疗诱导抗肿瘤适应性免疫，溶瘤病毒治疗已与免疫检查点抑制剂联合应用。例如，T-VEC和CTLA-4抑制的组合已显示出治疗黑色素瘤的效果(Meyers et al.(2017)Front.Oncol.7：114)。
本文描述的病毒和本文提供的痘苗病毒可被工程化以表达免疫检查点的抑制剂。此类抑制的靶标包括但不限于CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM-3和LAG-3。免疫检查点抑制剂包括，例如抗体，如抗PD-1抗体(例如，pembrolizumab、nivolumab)、抗PD-L1抗体(例如，atezolizumab、avelumab和durvalumab)、抗CTLA-4抗体(例如，ipilimumab)、抗TIM-3抗体(例如，MBG453)和抗LAG-3抗体(例如，Relatlimab/BMS-986016)。
共刺激因子
当抑制通路削弱免疫系统时，共刺激因子则增强针对肿瘤细胞的免疫反应。因此，共刺激通路被肿瘤细胞抑制以促进肿瘤发生。本文所述和提供的病毒可经工程化改造以表达共刺激因子，例如CD27、CD70、CD28、CD30、CD40、CD40L(CD154)、CD122、CD137(4-1BB)、4-1BBL、OX40(CD134)、OX40L(CD252)、CD226、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、疱疹病毒进入介质(HVEM)、LIGHT(也称为TNFSF14)、B7-H2和可诱导的T细胞共刺激子(ICOS；也称为CD278)。例如，4-1BBL在小鼠肿瘤中的表达增强了免疫原性，并且瘤内注射具有增加OX40L表达的树突状细胞(DCs)可导致小鼠模型中的肿瘤排斥反应。研究还表明，将表达重组GITR的腺病毒注射到B16黑色素瘤细胞中，促进T细胞浸润，并缩小肿瘤体积。
针对4-1BB、OX40和GITR等分子的刺激性抗体也可由病毒编码以刺激免疫系统。例如，激动性抗-4-1BB单克隆抗体已被证明增强抗肿瘤CTL应答，激动性抗OX40抗体已被证明在可移植肿瘤模型中增加抗肿瘤活性。此外，已显示激动性抗GITR抗体增强抗肿瘤应答和免疫(Peggs et al.(2009)Clinical and Experimental Immunology 157：9-19)。
OX40(CD134)是TNF受体超家族的一员，与其配体OX40L一起参与T细胞的活化、增强、增殖和存活，并调节NK细胞的功能。激动性单克隆抗体可用于活化OX40，增加免疫系统的抗肿瘤活性。这些包括，例如，MOXR 0916、PF-04518600(PF-8600)、MEDI6383、MEDI0562、MEDI6469、INCAGN01949和CSK3174998(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
糖皮质激素诱导的TNFR家族相关蛋白(GITR)是一种共刺激的细胞表面受体，由T细胞和NK细胞表达，在T细胞活化后其表达增加。其配体GITRL由APCs和内皮细胞表达，在免疫系统上调、白细胞粘附和迁移中起作用。激动性GITR抗体包括TRX-518、BMS-986156、AMG228、MEDI1873、MK-4166、INCAGN01876和GWN323(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
诱导型T细胞共刺激因子(ICOS；又称CD278)，其主要由CD4+T细胞表达，是增殖和细胞因子产生的共刺激因子。ICOS的激动抗体包括JTX-2011、GSK3359609和MEDI-570(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11：39)。
4-1BB(CD137)是一种由T细胞、NK细胞和APCs表达的诱导性共刺激受体，与其配体4-1BBL结合引发免疫细胞增殖和活化。已显示抗-4-1BB激动剂增加免疫介导的抗肿瘤活性，包括乌托鲁单抗(PF-05082566)和乌鲁单抗(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
CD27是TNF受体家族的一员，它与配体CD70结合后，活化T细胞并将其分化为效应细胞和记忆细胞，促进B细胞的增殖。激动型CD-70抗体包括ARGX-110和BMS-936561(MDX-1203)，激动型CD27抗体包括varlilumab(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
CD40是TNF受体家族的另一个成员。CD40由APCs和B细胞表达，而其配体CD154(CD40L)由活化的T细胞表达。CD40和CD154相互作用刺激B细胞产生细胞因子，导致T细胞活化和肿瘤细胞死亡。针对CD40的单克隆抗体包括CP-870893(激动型)、APX005M(激动型)、ADC-1013(激动型)、lucatumumab(拮抗型)、Chi Lob 7/4(激动型)、dacetuzumab(部分激动型)、SEA-CD40(激动型)和RO7009789(激动型)(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
其它表达产物
除了免疫调节蛋白外，免疫检查点抑制剂和共刺激因子(及其激动剂)，本文中的病毒可被改造以表达其它分子以增强其抗肿瘤作用，例如，前列腺素E2/COX-2抑制剂，消耗养分的酶(例如，精氨酸酶，精氨酸脱亚胺酶，天冬酰胺酶)，细胞因子(例如，GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、TNF-α、TGF-β)、趋化因子(例如，CCL2、CCL5、CCL19、CXCL11、RANTES)、BiTE(例如，blinatumomab(MT-103)、solitomab(MT110)、MT-111、BAY2010112(AMG112)、catumaxomab)、肿瘤新抗原和肿瘤相关抗原(例如，甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、肿瘤睾丸抗原(CTAs)、纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)、E6/E7、SV40、MART-1、PRAME、CT83、SSX2、BAGE家族、CAGE家族、上皮肿瘤抗原(ETA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、酪氨酸酶、CD19、GP100、端粒酶、周期蛋白B1、存活蛋白、间皮素、EPHA2、HER2)、血管生成抑制剂、例如用于肿瘤血管重编程的药物(例如贝伐单抗、吉非替尼、沙利度胺(Immunoprin)、来那度胺、索拉非尼
Figure BDA0003148729980000561
舒尼替尼、阿西替尼
Figure BDA0003148729980000562
坦西罗莫司
Figure BDA0003148729980000563
帕佐帕尼、卡博赞替尼、依维莫司、拉木鲁单抗
Figure BDA0003148729980000564
雷戈拉非尼、范德他尼、他尼比鲁单抗、奥拉图单抗
Figure BDA0003148729980000565
奈斯伐单抗、AMG780、MEDI3617、万古霉素单抗、利乐妥单抗(AMG102)、菲卡妥单抗、TAK-701、奥那曲单抗(MetMab)、埃米贝妥单抗、阿曲贝西普、伊马替尼)和其它治疗性抗体(如阿来妥单抗
Figure BDA0003148729980000566
曲妥珠单抗
Figure BDA0003148729980000567
西妥昔单抗
Figure BDA0003148729980000568
帕尼图单抗
Figure BDA0003148729980000569
阿曲单抗
Figure BDA00031487299800005610
利妥昔单抗
Figure BDA00031487299800005611
吉妥珠单抗
Figure BDA00031487299800005612
本妥昔单抗
Figure BDA00031487299800005613
达拉图姆单抗
Figure BDA00031487299800005614
地诺妥昔单抗
Figure BDA00031487299800005615
艾洛珠单抗(EmplicitiTM)、耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM)、奥比妥珠单抗
Figure BDA00031487299800005616
和帕妥珠单抗
Figure BDA00031487299800005617
)。病毒可被修饰以表达报告基因和成像分子，例如但不限于荧光蛋白、发光蛋白、NIS和水通道蛋白1。
前列腺素E2阻断
环氧化酶(COX-2)介导的前列腺素E2(PGE2)的产生可导致MDSC肿瘤浸润、免疫抑制表型的维持和CTL活性的抑制。阻断COX-2/PGE2通路可增强肿瘤免疫应答。例如，表达前列腺素失活酶羟前列腺素脱氢酶15-(NAD)(HPGD)的溶瘤痘苗病毒以无毒的方式导致肿瘤中MDSC的数量减少。HPGD的表达可增强T细胞的吸引力，并使耐药肿瘤对不同的免疫疗法(包括抗PD-1抗体)敏感。另一项研究显示，使用阿司匹林阻断COX-2活性可使肿瘤对抗PD-1治疗敏感。PGE2耗尽抗体，例如塞来昔布
Figure BDA00031487299800005618
和PGE2受体EP2和EP4的激动剂也可用于PGE2抑制/阻断以增强癌症免疫治疗(Hou et al.(2016)Cancer Cell 30：108-119；Miaoet al.(2017)Oncotarget 8(52)：89802-89810)。
营养消耗酶
癌症的特点是生长不可控，肿瘤细胞具有特异性营养缺陷型和比正常细胞更高的营养需求。因此，营养消耗酶可用于抗癌治疗。例如，肿瘤细胞缺乏天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺，导致caspase依赖型凋亡或自噬性细胞死亡。
天冬酰胺酶
天冬酰胺参与细胞呼吸和蛋白质合成，也作为神经内分泌组织中的神经递质。研究还表明，天冬酰胺可抑制癌细胞中的凋亡。天冬酰胺酶是一种将天冬酰胺转化为天冬氨酸的酶。L-天冬酰胺酶耗尽L-天冬酰胺可诱导细胞凋亡，使其在某些癌症的治疗中发挥作用。例如，天冬酰胺酶被用于儿科急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗，其耗尽细胞外的天冬酰胺，使ALL细胞不能合成。治疗性天冬酰胺酶可来源于大肠杆菌或除虫菊欧杆菌，也以聚乙二醇化的制剂存在。然而，细菌源性天冬酰胺酶常常由于产生抗天冬酰胺酶抗体而导致不良免疫反应，其范围可从局部皮疹到危及生命的过敏反应。这些不良反应严重阻碍了成人的治疗。聚乙二醇化的天冬酰胺酶具有更长的血清半衰期，允许给予更低和更少的剂量，并导致比细菌天冬酰胺酶制剂更少的不良反应(Fung and Chan(2017)Journal ofHematology&Oncology 10：144；Koprivnikar et al.(2017)OncoTargets and Therapy10：1412-1422)。
L-天冬酰胺酶可装载到红细胞(RBC)中用于治疗，该制剂已在几个早期临床试验中进行了测试。此类酶仍然包裹在红细胞中，阻止抗体的结合，从而减慢从体内清除的速度，降低不良反应的风险。研究表明，接受红细胞包裹的天冬酰胺酶的患者比注射大肠杆菌天冬酰胺酶的患者表现出更少的过敏反应(Koprivnikar et al.(2017)OncoTargets andTherapy 10：1412-1422)。
细菌L-天冬酰胺酶也被证明能将L-谷氨酰胺分解成L-谷氨酸盐，导致谷氨酰胺耗竭。癌细胞对谷氨酰胺的需求很高，谷氨酰胺可用于核苷酸和谷胱甘肽的合成，也可用于其它氨基酸的合成，或者用于产生ATP以获得能量。谷氨酰胺耗竭导致癌细胞中myc介导的凋亡(Fung and Chan(2017)Journal of Hematology&Oncology 10：144)。
精氨酸耗竭
精氨酸是一氧化氮(NO)等癌症相关因子的前体，在纳摩尔浓度下可致瘤。精氨酸消耗剂包括聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI)和聚乙二醇化精氨酸酶I。ADI将精氨酸转化为瓜氨酸。它不是由人体细胞产生的，而是来源于微生物，使它成为一种能导致不良免疫反应的外源蛋白。聚乙二醇化，例如生成ADI-PEG20，已被证明降低免疫原性并增加半衰期。临床前研究发现ADI-PEG20在不同癌症类型中有效抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡和自噬。此外，使用ADI-PEG20治疗黑色素瘤、肝细胞癌和间皮瘤的临床研究表明，患者对其耐受性良好(Fung and Chan(2017)Journal of Hematology&Oncology 10：144)。
将精氨酸转化为鸟氨酸的聚乙二醇化人精氨酸酶I(PEG-ARG I)正在进行临床研究，以用于治疗癌症。应用PEG-ARG I的临床前研究表明，它在肝细胞癌中抑制肿瘤细胞生长并诱导凋亡；诱导急性髓系白血病(AML)细胞坏死细胞死亡；诱导ALL细胞凋亡；抑制小鼠皮下种植黑色素瘤；诱导前列腺癌细胞自噬；诱导胰腺癌细胞凋亡及抑制胰腺癌皮下移植瘤生长的实验研究；并在体内抑制间皮瘤细胞的生长和诱导间皮瘤细胞凋亡。一项调查聚乙二醇化精氨酸酶I用于肝细胞癌治疗的临床试验显示，该药耐受性良好，在患者血清中未检测到中和抗体(Fung and Chan(2017)Journal of Hematology&Oncology 10：144)。
细胞因子和趋化因子
在一些实施方案中，本文中的病毒可经工程化改造以表达刺激免疫系统的细胞因子，包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TGF-β。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，通过细胞毒细胞增强肿瘤细胞识别。在一些实施方案中，病毒可经工程化改造以表达趋化因子，例如RANTES、CCL2、CCL5、CCL19和CXCL11。趋化因子参与免疫细胞向炎症部位的迁移，以及免疫细胞的成熟和适应性免疫反应的产生。
GM-CSF
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已被用于癌症的治疗，例如用于癌症疫苗，如Sipuleucel-T(用于前列腺癌)。表达GM-CSF的溶瘤病毒，如talimogenelaherparepvec(T-VEC，
Figure BDA0003148729980000581
)和JX-594也显示出在治疗癌症方面的效果。单剂GM-CSF直接注射到转移性病灶后，在黑色素瘤中表现出抗肿瘤活性。GM-CSF促进单核细胞向DC的分化，在病毒诱导的肿瘤溶解后促进DC表面的抗原呈递，并导致NK细胞的募集和肿瘤特异性细胞毒性T细胞的诱导(Meyers et al.(2017)Front.Oncol.7：114；Lee，S.andMargolin，K.(2011)Cancers 3：3856-3893)。
白细胞介素(IL)
白细胞介素-2(IL-2)是第一个被批准用于肿瘤治疗的细胞因子，通过多种机制活化免疫系统，包括活化和促进CTL的生长，生成淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)，促进Treg细胞的生长和增殖，刺激TILs，促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖和分化。重组IL-2(rIL-2)被FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌(RCC)和转移性黑色素瘤(Sheikhi et al.(2016)IranJ.Immunol.13(3)：148-166)。
IL-10是一种细胞因子，可抑制促炎性细胞因子如IFNγ、TNFα、IL-1β和IL-6，抑制MHC分子和共刺激因子的表达，从而抑制T细胞的功能。研究表明，IL-10诱导CD8的活化和增殖，从而产生抗肿瘤作用。在黑色素瘤患者中使用聚乙二醇化的重组人IL-10AM0010与pembrolizumab(抗PD-1抗体)联合进行的研究(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11：39)。
由抗原呈递细胞分泌的IL-12促进NK和T细胞分泌IFN-γ，抑制肿瘤血管生成，导致NK、CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化和增殖，增强CD4+Th0细胞向Th1细胞的分化，并促进针对肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Sheikhi et al.(2016)IranJ.Immunol.13(3)：148-166)。已显示IL-12在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肉瘤的小鼠模型中表现出抗肿瘤作用(Lee，S.and Margolin，K.(2011)Cancers 3：3856-3893)。
IL-15通过活化NK和CD8+T细胞增强抗肿瘤免疫，通过活化记忆T细胞诱导长期抗肿瘤免疫。(Sheikhi et al.(2016)Iran J.Immunol.13(3)：148-166)。
由活化的CD4+T细胞产生的IL-21促进CD4+、CD8+T细胞的增殖，增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒作用。IL-21已在黑色素瘤的小鼠模型中证明了抗肿瘤作用(Lee，S.andMargolin，K.(2011)Cancers 3：3856-3893)。
干扰素(IFN)
I型干扰素(IFN)包括IFN-α和IFN-β，几乎由所有类型的细胞分泌，对肿瘤具有抗增殖和促凋亡作用，是一种强效的免疫调节剂。I型IFN诱导肿瘤细胞表面MHC I类分子的表达，介导DC成熟，活化细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)、NK和巨噬细胞，可对肿瘤新生血管产生抗血管生成作用，并可对肿瘤细胞发挥细胞抑制和凋亡作用(Lee，S.and Margolin，K.(2011)Cancers 3：3856-3893)。
IFN-α
Figure BDA0003148729980000582
被批准用于毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、AIDS相关卡波西肉瘤、滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的治疗，也用于慢性粒细胞白血病(CML)、肾细胞癌、神经内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、非滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤、硬纤维瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。
IFN-γ是一种II型干扰素，由NK细胞、NKT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、APCs和B细胞分泌。IFN-γ活化巨噬细胞，诱导APC上MHCⅠ类和Ⅱ类分子的表达，促进CD4+T细胞的Th1分化，活化JAK/STAT信号通路。此外，干扰素具有抗血管生成的特性，已被证明对某些恶性细胞具有细胞毒性，并且可调节由其它细胞因子如IL-2和IL-12介导的抗肿瘤活性(Lee，S.and Margolin，K.(2011)Cancers 3：3856-3893)。
TNF-α
TNF-α由活化的巨噬细胞、T细胞和NK细胞产生，通过与肿瘤细胞表面受体结合诱导凋亡、阻断T-Reg细胞和活化巨噬细胞和NK细胞、破坏肿瘤血管系统和阻止血管生成、吸引和刺激中性粒细胞和单核细胞、促进肿瘤相关巨噬细胞进入M1抗肿瘤阶段、嗜酸性粒细胞样细胞下调IL-13表达和抑制肿瘤诱导的单核细胞向免疫抑制表型分化而表现出抗肿瘤活性。使用系统施用TNF-α的临床试验受到剂量限制毒性的限制，但肿瘤内施用TNF-a的研究在治疗卡波西肉瘤和肝转移瘤方面取得了成功，例如(Josephs et al.(2018)J.Transl.Med.16：242)。
TGF-β
TGF-β是一种细胞因子，其可促进炎性T细胞(如T辅助者17(Th17)、Th9和常驻记忆T细胞(Trm))的分化，并促进CD4+和CD8+T细胞的存活(Dahmani and Delisle(2018)Cancers10，194)。
双特异T cell engagers
Figure BDA0003148729980000591
双特异T cell engager
Figure BDA0003148729980000592
构建体是一类用于肿瘤免疫治疗的人工双特异性单克隆抗体，由两个单链可变片段(scFv)连接而成，使一个scFv结合细胞毒性T细胞表面的CD3，另一个结合特定的肿瘤相关抗原。
Figure BDA0003148729980000593
因此将T细胞靶向肿瘤细胞，独立于MHC I类或共刺激因子刺激T细胞活化、细胞因子产生和肿瘤细胞细胞毒性。临床试验中的
Figure BDA0003148729980000594
包括正在研究用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的博纳吐单抗(MT-103)，并针对CD19；solitomab(MT110)正在研究用于治疗胃肠道和肺癌，并针对EpCAM抗原；靶向癌胚抗原(CEA)治疗胃肠道腺癌正在研究的MT-111；和BAY2010112(AMG112)，其靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，正在被研究用于前列腺癌的治疗。卡妥索单抗
Figure BDA0003148729980000595
是一种双特异性大鼠-小鼠杂交单克隆抗体，靶向CD3和EpCAM，用于治疗恶性腹水。其它正在开发的
Figure BDA0003148729980000596
包括靶向EGFR、EphA2、Her2、ADAM17/TACE、前列腺干细胞抗原(PSCA)和黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)的那些(Huehls et al.(2015)Immunol.Cell Biol.93(3)：290-296)。
肿瘤相关抗原和肿瘤新抗原
肿瘤相关抗原(TAA)在肿瘤细胞中高表达，但在正常组织中也有表达，可作为肿瘤疫苗靶向的抗原。因此，以TAAs为靶标的治疗会导致治疗效率低、中枢和外周免疫耐受和自身免疫。另一方面，肿瘤特异性新抗原来源于肿瘤细胞中的随机体细胞突变，在非癌细胞中没有发现。因此，靶向肿瘤新抗原的癌症疫苗具有提高特异性、有效性和安全性的潜力，并且已在临床前和早期临床研究中证明了治疗几种类型癌症的结果，包括黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、肉瘤、乳腺癌和肺癌(Guo et al.(2018)Front.Immunol.9：1499；Bendjama和Quemeneur(2017)Human Vaccines&Immunotherapeutics 13(9)：1997-2003)。
基于新抗原的疫苗包括基于肽的、基于核酸(mRNA/DNA)的、基于人细胞的(例如，体外/体外脉冲树突状细胞)和基于活载体的(病毒或细菌)疫苗。活载体提供了一种吸引人的递送系统，它能更有效地靶向抗原提呈细胞，并且比树突状细胞疫苗更容易和更便宜地制备。例如，Advaxis(普林斯顿，新泽西)已开发出用于新抗原疫苗递送的减毒形式的单核细胞增生李斯特菌。腺病毒(如Exovax；NousCom，巴塞尔，瑞士)、a病毒、痘病毒和慢病毒(如
Figure BDA0003148729980000597
ImmuneDesign，西雅图，华盛顿州)也被用于递送新抗原疫苗。痘病毒，如修饰的安卡拉病毒(MVA)具有一个大的基因组，易于遗传操作，能够插入大量的蛋白质抗原。例如，基于MVA的疫苗包括TG4001(Tipapkinogene sovacivec)，其靶向来自人乳头状瘤病毒的E6和E7抗原，被用于治疗高度宫颈上皮内赘生物变。其它基于MVA的肿瘤新抗原疫苗包括在治疗非小细胞肺癌方面获得成功的TG4010(Mesmulogene ancovacivec)和表达前列腺特异性抗原(PSA)的Prostvac
Figure BDA0003148729980000601
(Rilimogene galvacirepvec)，除了刺激细胞因子(LFA-3、ICAM-1和B7.1)之外，已显示出治疗前列腺癌方面的效果(Bendjama and Quemeneur(2017)HumanVaccines&Immunotherapeutics 13(9)：1997-2003)。
本文描述和提供的病毒可编码肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(新抗原)，包括但不限于，例如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、癌睾丸抗原(CTA)、纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)、E6/E7、SV40、MART-1、PRAME、CT83、SSX2、BAGE家族、CAGE家族、上皮肿瘤抗原(ETA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、黑色素瘤相关抗原(MAGEs)、TACE/ADAM17、酪氨酸酶、CD19、GP100、端粒酶、周期蛋白B1、存活蛋白、间皮素、EPHA2、B细胞成熟抗原(BMCA)和HER2。
血管生成抑制剂/肿瘤血管重编程/血管正常化
在一些实施方案中，本文提供的病毒可编码血管生成抑制剂(例如，用于肿瘤血管重编程)。血管生成是众所周知的癌症进展的贡献者，并且血管生成抑制剂，特别是当与其它抗癌疗法联合使用时，可用于在癌症治疗期间防止新血管的形成，从而阻断对肿瘤的营养物质和/或氧的供应。作为血管生成活化剂的蛋白质，并且可被血管生成抑制剂靶向，包括血管内皮生长因子(VEGF；例如(VEGFA、VEGFB)、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、FGF2)、血管生成素、转化生长因子(TGF)-α，TGF-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血小板衍生内皮生长因子、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-8(IL-8)、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素(例如ANGPT-1、ANGPT-2)、胎盘衍生生长因子(PDGF)和PDGF受体(PDGFRa)和表皮生长因子(EGF)(Rajabi，M.and Mousa，S.A.(2017)Biomedicines5，34；Kong et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18，1786)。
研究表明，除了阻断血管形成之外，使用血管生成抑制剂的癌症免疫治疗可通过其对稳定和/或使肿瘤血管系统正常化的作用而增强(此类剂量有时可低于阻断血管形成的剂量)(参见，例如，Huang et al.，Cancer Res.，73(10)：2943-2948(2013)；Matuszewskaet al.，Clin.Cancer Res.，25(5)：1624-1638(2019)；Lanitis et al，Curr.Opin.Immunol.，33：55-63(2015)；and Bykov et al.，Clin.Cancer Res.，25(2)：1446-1448(2019)，其全部内容通过引用整体并入本文)。为满足氧和营养需求，肿瘤通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)来应对低氧、癌基因和肿瘤抑制基因的丢失来启动血管生成。由此产生的血管以结构异常为特征，如不规则分支、基底膜完整性丧失、血管周围细胞不足或缺失，从而导致肿瘤核心的癌症治疗的低效率递送。此外，肿瘤中有限的血管灌注选择了肿瘤微环境中的低氧和酸性，这会限制治疗药物的有效性并加剧转移。(参见，例如Matuszewska et al.，Clin.Cancer Res.，25(5)：1624-1638(2019)以及其中引用的参考文献)。此外，血管内衬的内皮细胞可抑制T细胞活性，以其为目标进行破坏，并通过解除粘附分子的调节阻止其进入肿瘤(Lanitis et al，Curr.Opin.Immunol.，33：55-63(2015)。
近年来的研究表明OV(溶瘤病毒)治疗的疗效可通过下调/抑制血管生成和/或上调抗血管生成来提高。虽然将OV治疗作为单一药物施用可有效地减少肿瘤生长，但施用病毒会引起血管关闭。以前，关闭被认为是一个潜在的好处，通过促进隔离病毒，最大限度地直接溶瘤。然而，OV治疗通常以多剂量施用以获得最佳疗效；当血管破裂被诱导时，它可损害后续剂量的OV的摄取。此外，免疫细胞向肿瘤部位的递送也会受到损害。(参见，例如，Matuszewska et al.，Clin.Cancer Res.，25(5)：1624-1638(2019)以及其中引用的参考文献)。Matuszewska et al.(Clin.Cancer Res.，25(5)：1624-1638(2019)发现，在卵巢癌的体内小鼠模型中，与3TSR蛋白(抗血管生成蛋白)共同施用溶瘤病毒(NDV；新城疫病毒)导致肿瘤灌注增强，血管结构正常化并减少肿瘤内的缺氧，这反过来导致与单独治疗相比更好地减少原发肿瘤生长、腹水和转移。
本文提供的CAVES组合物和相关的使用和治疗方法可包括编码抑制血管生成的分子的病毒，包括下调促血管生成因子和/或上调抗血管生成因子的分子。替代地或另外，本文提供的CAVES组合物可与血管生成抑制剂组合施用。肿瘤血管生成抑制剂通过恢复肿瘤细胞与局部细胞环境相互作用所启动的信号级联的平衡，诱导血管正常化，修复肿瘤血管系统(肿瘤血管重编程)。
直接抑制血管生成的药物包括血管抑素、内皮抑素、抑制蛋白、血管能抑素和肿瘤抑素。间接血管生成抑制剂以肿瘤细胞或肿瘤相关基质细胞为靶标，通过阻断促血管生成蛋白的表达或活性而起作用。例如，吉非替尼是一种用于治疗结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。贝伐单抗
Figure BDA0003148729980000611
是一种抗VEGF的重组人源化单克隆抗体，可阻断肿瘤来源的VEGF-A，阻止新生血管的形成，从而抑制肿瘤的生长。其它血管生成抑制剂包括沙利度胺(Immunoprin)、伊马替尼、来那度胺、索拉非尼
Figure BDA0003148729980000612
舒尼替尼、阿西替尼
Figure BDA0003148729980000613
坦西罗莫司
Figure BDA0003148729980000614
帕佐帕尼、卡博赞替尼、依维莫司、拉木鲁单抗
Figure BDA0003148729980000615
雷戈拉非尼、万地他尼、他尼比鲁单抗、奥拉图单抗
Figure BDA0003148729980000616
奈斯伐单抗、AMG780、MEDI3617、瓦努珠单抗、利洛图单抗(AMG102)、菲拉妥珠单抗、TAK-701、奥纳妥珠单抗(MetMab)、埃米贝妥单抗和阿柏西普(Eylea，
Figure BDA0003148729980000617
)(Rajabi，M.and Mousa，S.A.(2017)Biomedicines 5，34；Kong et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18，1786)。
VEGF是肿瘤组织中一种强有力的血管生成活化剂，在肿瘤血管生成中起重要作用。例如，研究表明：VEGF受体(VEGFR)在白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌和乳腺癌中均有表达；VEGF mRNA水平升高与NSCLC 5年生存率降低相关；VEGF-A在乳腺癌中的表达促进乳腺癌细胞增殖、存活和转移；胃癌组织中VEGF-A和VEGF-C的过表达与预后不良有关，而VEGF-A和VEGF-C的沉默可显著抑制肿瘤的增殖和生长。贝伐单抗
Figure BDA0003148729980000618
是一种重组人源化免疫球蛋白G(IgG)抗体，可抑制VEGF-A和VEGFR-2复合物的形成，于2004年被FDA批准用于联合化疗治疗转移性结直肠癌，并用于治疗多种其它癌症，包括转移性非鳞状非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌和胶质母细胞瘤。阿柏西普
Figure BDA0003148729980000619
是一种抑制VEGF-A、VEGF-B和P1GF活性的Fc融合蛋白，于2012年被FDA批准用于治疗对奥沙利铂耐药或在奥沙利铂治疗后有所进展的转移性结直肠癌。雷莫芦单抗
Figure BDA00031487299800006110
是一种抑制VEGFR-2与VEGF配体相互作用的全人源单克隆抗体，2014年获FDA批准用于晚期胃或胃食管交界腺癌和转移性NSCLC的治疗。Tanibirumab是结合VEGFR-2的全人单克隆抗体，阻断其与配体如VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D的相互作用(Kong et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18，1786)。
除促进肿瘤血管生成外，VEGF具有免疫抑制作用，可抑制T细胞的功能，增加Treg和MDSC的募集，阻止DC的分化、成熟和活化。发现VEGFA增强PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3等抑制性检查点的表达，其被抗VEGFR2的抗体逆转。因此，靶向VEGF/VEGFR可增强抗肿瘤免疫能力。例如，靶向VEGF/VEGFR可促进T细胞在TME中的浸润。发现贝伐单抗治疗可增加转移性结直肠癌患者的B和T细胞间室，并改善转移性非小细胞肺癌患者的细胞毒性T淋巴细胞反应。贝伐单抗也被发现增加DC的数量并促进其活化。阿昔替尼是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的小分子抑制剂，可减少MDSC的数量和抑制能力，并诱导MDSC向抗原提呈表型分化。索拉非尼是一种靶向VEGFR2、VEGFR3和PDGFR等的多激酶抑制剂，被发现可恢复DC的分化。舒尼替尼是一种阻断VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、血小板源性生长因子受体、干细胞因子受体和Flt3的酪氨酸激酶抑制剂，可降低小鼠体内IL-10、Foxp3、PD-1、CTLA-4和BRAF的表达，增加CD4+、CD8+TIL的比例，减少Treg的数量，提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。舒尼替尼也能减少多种肿瘤模型中MDSC的数量。因此，舒尼替尼可用来修饰TME，改变细胞因子和共刺激因子的表达谱，从而导致良好的T细胞活化和Th1响应。舒尼替尼与溶瘤呼肠孤病毒联合在临床前小鼠肾细胞癌模型中显示显著降低肿瘤负担并延长寿命，而舒尼替尼与溶瘤VSV联合被发现消除小鼠前列腺、乳腺和肾脏恶性肿瘤(Meyers et al.(2017)Front.Oncol.7：114；Yanget al.(2018)Front.Immunol.9：978)。这些结果表明，包括血管生成抑制剂和溶瘤病毒在内的组合治疗可提高抗癌治疗的疗效。
PDGF/PDGFR信号转导与血管生成、肿瘤生长和患者生存期降低相关，例如在结直肠癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤中观察到PDGFR和/或PDGF过表达。靶向PDGFR的小分子包括伊马替尼、舒尼替尼、雷戈拉非尼和帕佐帕尼，它们抑制PDGFR和其它激酶的活化，如VEGFR和FGFR。这些分子已被批准用于治疗转移性结直肠癌、转移性肾细胞癌和胃肠道间质瘤。靶向PDGF和PDGFR的抗体包括olaratumab(LartruvoTM)，其靶向PDGFRα并已被FDA批准用于治疗软组织肉瘤(Kong et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18，1786)。
肝细胞生长因子(HGF)是一种运动和形态发生因子，它与c-MET相互作用，导致胚胎发育、上皮分支形态发生、创伤愈合和肿瘤发生等多种生物学反应。因此，HGF/c-MET信号是肿瘤治疗的靶标。利妥木单抗是一种完全人源性单克隆抗体，与HGF结合，阻断其与c-MET的相互作用，从而产生肿瘤生长抑制、肿瘤消退、细胞凋亡和细胞增殖消失等抗肿瘤作用。其它抗HGF的人源化单克隆抗体包括非拉妥组单抗和TAK-701(L2G7)，而抗c-MET的人源化单克隆抗体包括奥那妥组单抗(MetMab)和依玛妥珠单抗(LY-2875358)(Kong et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18，1786)。
其它治疗性抗体
单克隆抗体可用于靶向癌细胞表达的抗原，用于癌症治疗。在某些实施方案中，除上述血管生成抑制剂、BiTE和免疫检查点抑制剂/刺激物外，本文中的病毒可被工程化以表达其它治疗性抗癌抗体，包括例如人源化或嵌合单克隆抗体，例如但不限于阿仑单抗(
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抗CD52)、曲妥珠单抗(
Figure BDA0003148729980000622
抗Her2)、西妥昔单抗(
Figure BDA0003148729980000623
抗EGFR)、帕尼妥单抗(
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抗EGFR)、奥法妥单抗(
Figure BDA0003148729980000625
抗CD20)、利妥昔单抗(
Figure BDA0003148729980000626
抗CD20)、吉妥珠单抗(
Figure BDA0003148729980000627
抗CD33)、本妥昔单抗(
Figure BDA0003148729980000628
抗CD30)、托西莫单抗(抗CD20)、达雷木单抗(
Figure BDA0003148729980000629
抗CD38)；地努吐昔单抗(
Figure BDA00031487299800006210
抗GD2)；埃罗妥珠单抗(EmplicitiTM；抗SLAMF7)；耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM；抗EGFR)；阿托珠单抗(
Figure BDA00031487299800006211
抗CD20)；和帕妥珠单抗(
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抗HER2)。
单克隆抗体已成功地用于治疗几种类型的癌症，无论是单独治疗还是组合治疗。例如，利妥昔单抗也被称为IDEC-C2BB，是美国FDA批准的第一个单克隆抗体，用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。曲妥珠单抗是FDA批准的用于治疗HER2+乳腺癌的单克隆抗体。此外，西妥昔单抗用于结直肠癌、转移性NSCLC和头颈癌的治疗；帕尼木单抗用于治疗转移性结直肠癌；阿仑珠单抗用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤；奥法木单抗用于CLL的治疗；吉妥珠单抗奥佐加米星用于急性髓系白血病的治疗；本妥昔单抗用于复发或难治性霍奇金氏淋巴瘤、全身间变性大细胞淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的治疗；托妥莫单抗与碘标记的托妥莫单抗(Bexxar)联合用于化疗和利妥昔单抗难治性非霍奇金氏淋巴瘤的治疗；达拉图单抗用于多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的治疗；地努妥昔单抗用于小儿神经母细胞瘤的治疗；依洛妥珠单抗用于多发性骨髓瘤的治疗；耐昔妥珠单抗治疗转移性鳞状上皮性非小细胞肺癌；奥比努珠单抗用于慢性淋巴细胞白血病和滤泡性淋巴瘤的治疗；而帕妥珠单抗用于治疗HER2+乳腺癌。
其它抗体包括D1(A12)，其靶向TACE外结构域，在头颈部鳞状细胞癌中被显示抑制癌细胞的增殖和运动；Fsn0503h，其是一种抗组织蛋白酶S的抗体，已显示可抑制体内血管生成和转移；以及ATN-658，一种针对尿激酶纤溶酶原活化物受体(uPAR)的抗体，已显示其抑制侵袭、转移和肿瘤增殖并诱导凋亡(Neves and Kwok(2015)BBA Clinical 3：280-288)。
报告基因
在某些实施方案中，病毒可被改造以表达报告基因，包括成像分子/试剂，例如荧光蛋白(例如GFP、YFP、RFP、TurboFP635)；发光蛋白(例如，荧光素酶)；和核磁共振、超声波或断层成像剂，包括放射性核素。本文中的病毒也可被工程化来表达人钠碘化物同向转运体(hNIS)或水通道蛋白1(AQP1)，这有助于通过深层组织非侵入性成像技术(如PET、SPECT/CT、伽玛相机或MRI)检测病毒。
NIS
Na+/I-同向转运体(NIS)是一种跨膜糖蛋白，介导碘阴离子转运到细胞中，例如在甲状腺和其它组织中，如唾液腺、胃、肾脏、胎盘、哺乳期乳腺和小肠。例如123I、124I、125I、131I和99mTc的放射性同位素通过NIS运输，当NIS被病毒编码时，在受感染细胞的表面上表达，从而允许使用例如PET、SPECT/CT和伽玛相机进行非侵入性成像(Msaouel et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。
NIS作为报告基因是有用的，因为它积累放射性标记的底物，浓缩和放大信号，可用于监测其它基因的输送，并且在肿瘤中表达后，可用于通过诊断闪烁成像监测肿瘤大小。例如，表达人NIS(hNIS)的腺病毒已经鼻递送到大鼠的肺中，并且在施用后长达17天内可检测到124I-PET信号。使用表达NIS的慢病毒载体利用99mTcO4 -或124I-的单光子发射计算机断层扫描(PET)成像来检测移植的大鼠心脏衍生的干细胞(Portulano et al.(2014)Endocr.Rev.35(1)：106-149)。
表达NIS的病毒可用于联合溶瘤和放射治疗，临床前已显示可增强溶瘤疗效。例如，将在CMV启动子下表达NIS的腺病毒载体注射到荷肝癌大鼠的门静脉，经131I-治疗后，观察到肿瘤生长的有效抑制和生存期的延长。向患有胰腺癌的小鼠施用在MUC1启动子下表达NIS的腺病毒载体导致131I-治疗后肿瘤显著消退(Portulano et al.(2014)Endocr.Rev.35(1)：106-149)。编码人NIS基因的痘苗病毒(VV-NIS)已被研究用于子宫内膜癌、胰腺癌、恶性胸膜间皮瘤、结直肠癌、间变性甲状腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗和监测。VV-NIS还被用作报告基因，用于通过124I-microPET成像在小鼠模型中识别乳腺癌的阳性手术切缘(Ravera et al.(2017)Annu Rev Physiol.79：261-289)。
在多发性骨髓瘤、多形性胶质母细胞瘤、头颈部癌、间变性甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肝细胞癌、骨肉瘤、子宫内膜癌和前列腺癌模型中，表达NIS(MV-NIS)的溶瘤麻疹病毒(MV)用于I-131的放射病毒治疗也显示了临床前的效果。几个I/II期临床试验研究了MV-NIS在多发性骨髓瘤(NCT00450814、NCT02192775)、间皮瘤(NCT01503177)、头颈部癌(NCT01846091)和使用病毒感染的MSC在卵巢癌(NCT02068794)中的应用。
水通道蛋白1(AQP1)
水通道蛋白是细胞内介导水跨质膜运输的整体膜蛋白。人水通道蛋白1(AQP1)是一种遗传编码的磁共振弥散加权成像的报告剂，由于其无毒、无金属和敏感等优点而具有优势。因为是自体报告基因，不存在免疫原性的风险。研究表明，AQP1使肿瘤异种移植物中的基因表达成像成为可能(Mukherjee et al.(2016)Nature Communications 7：13891)。
C.CAVES的产生、制剂、储存和运输
本文提供的CAVES系统可通过将本文提供的任何载体细胞(包括修饰的载体细胞)与本文提供的任何溶瘤病毒(包括修饰的病毒，例如那些经工程化改造以表达重组治疗蛋白的病毒)在适合于装载细胞、感染和病毒复制的时间和温度下孵育而产生，使得至少一种病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组治疗蛋白被表达。在实施方案中，孵育时间可比表达病毒编码的免疫调节和/或重组治疗蛋白所需的时间更长，例如，比产生子代病毒颗粒(包括EEV颗粒)所需的时间更长。培养温度可以是例如室温或32-42℃，例如35-40℃。在实施方案中，培养温度为37℃。病毒加载到细胞上的MOI可为0.001至200、300、400或1000或更多。在实施例中，MOI约为0.001-10，例如0.01-1.0，或1.0的MOI。
CAVES的产生一般需要2小时以上的孵育时间，通常在约3小时至72小时或更多小时之间，例如通常至少或在约3，4，5或6小时之间或在大于约4小时之间至至少或在约7，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72或更多小时之间，例如约6小时至18小时，或约12小时至48小时。促进此类表达的时间和温度可取决于系统中使用的溶瘤病毒和/或细胞的类型，例如载体细胞或其组合。例如，在VSV病毒复制周期中，表达病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组蛋白(例如治疗蛋白)所花费的时间通常相对较短，约为2-3小时，而在痘苗病毒的情况下，表达病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组治疗蛋白所花费的时间通常较长，约为6-12小时或更长。在溶瘤病毒是痘苗的实施方案中，孵育时间可以是至少或在约7，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72或更多小时之间，例如约6小时至18小时，或约12小时至48小时或约30-36小时。在一些实施方案中，痘苗病毒是具有SEQ ID NO：70所示序列的ACAM2000。在其它实施方案中，痘苗病毒是具有SEQ ID NO：71所示序列的CAL1。在其中溶瘤病毒是痘苗病毒的一些实施方案中，例如具有SEQ ID NO：70所示序列的ACAM2000或具有SEQ ID NO：71所示序列的CAL1，载体细胞是干细胞或源自SVF的细胞，例如MSC、SA-ASC或周细胞。
本文提供的系统可稳定且无限期地冷冻或低温保存(例如，-20至-80℃)并且可在施用之前根据需要解冻。例如，这里提供的系统可在-80℃下储存至少或大约几小时之间，例如1、2、3、4或5个小时，至少几年或几年之间，例如1、2、3年或3年以上，例如至少或大约1，2，3，4或5小时至至少或约6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30天或1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12个月或1、2、3、4、5或5年以上，直至解冻用于施用。这里提供的系统还可在例如0-5℃，例如4℃的制冷条件下稳定地存储和/或在冰上递送施用部位以进行治疗。例如，本文提供的系统可在4℃或冰上保存至少或在大约几小时，例如1、2、3、4或5小时之间，至至少或大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48或更多小时，然后施用用于治疗。
D.药物组合物、组合和试剂盒
本文提供含有本文提供的CAVES系统的药物组合物、组合和试剂盒。药物组合物可包括含有本文提供的任何载体细胞和任何溶瘤病毒的CAVES和药物载体。药物组合物可在室温至约37℃、制冷温度例如0-5℃、例如4℃，或冷冻或低温保存条件例如-20至-80℃下。在实施方案中，药物组合物在-80℃。组合可包括例如载体细胞、溶瘤病毒；以及至少一种由溶瘤病毒编码的免疫调节和/或重组治疗蛋白。组合可包括本文提供的任何载体细胞、溶瘤病毒、病毒编码的免疫调节蛋白和/或重组治疗蛋白和可检测化合物；CAVES和另外的治疗化合物；CAVES和病毒表达调节化合物，或其任何组合。试剂盒可包括本文提供的一种或多种药物组合物或组合，以及一种或多种组分，例如使用说明书、用于向对象施用药物组合物或组合的装置、用于向对象施用治疗或诊断化合物的装置或用于检测对象体内病毒的装置。
包含在药物组合物、组合或试剂盒中的载体细胞可包括本文提供的任何载体细胞。包含在药物组合物、组合或试剂盒中的溶瘤病毒可包括本文提供的任何病毒。
1.药物组合物
本文提供的是含有CAVES的药物组合物，所述CAVES包括本文提供的任何载体细胞、本文提供的溶瘤病毒和至少一种表达的病毒编码的免疫调节和/或重组治疗蛋白，以及合适的药物载体。药学上可接受的载体包括固体、半固体或液体材料，其作为病毒的载体或介质。本文提供的药物组合物可以各种形式配制，例如固体、半固体、水性、液体、粉末或冻干形式。在本文提供的CAVES系统中包含任何载体细胞(包括已接触抗原的、敏化的、工程化细胞)或溶瘤病毒的示例性药物组合物包括但不限于无菌可注射溶液、无菌包装粉末、滴眼剂、片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软膏剂、软和硬明胶胶囊和栓剂。
合适的药物载体的实例是本领域已知的，包括但不限于水、缓冲液、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、明胶、甘油、碳水化合物例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、直链淀粉或淀粉、山梨醇、甘露醇、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素和粉末等。本文提供的药物组合物可包含其它添加剂，例如，抗氧化剂、防腐剂、镇痛剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、稀释剂、赋形剂、填充剂、助滑剂、增溶剂、稳定剂、张力剂、媒介物、粘度剂、调味剂、甜味剂、乳剂如油/水乳剂、乳化剂和悬浮剂如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、膨润土、卡波姆、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯聚醇9、油醇、聚维酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂醇、黄蓍胶、黄原胶和它们的衍生物，溶剂和各种成分，例如但不限于结晶纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等。此类载体和/或添加剂可通过常规方法配制，并且可以合适的剂量给予对象。稳定剂如脂类、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可保护组合物在体内不被降解。在药物组合物中使用的其它合适的制剂可在例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy(2005，Twenty-first edition，Gennaro&Gennaro，eds.，Lippencott Williamsand Wilkins)中找到。
包括本文提供的用于注射或粘膜递送的CAVES系统的药物制剂通常包括在用于注射或粘膜施用的合适缓冲液中提供的病毒水溶液或在用于注射或粘膜施用的合适缓冲液中重建的病毒冻干形式。此类制剂可任选地包含一种或多种如本文所述或本领域已知的药学上可接受的载体和/或添加剂。用于口服施用的液体组合物通常包括水溶液、适当调味的糖浆、含水或油混悬液、与食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油以及酏剂和类似药物溶媒。
本文提供的药物组合物可通过采用本领域已知的方法配制为提供本文所述的CAVES系统的快速、持续或延迟释放。为制备固体组合物如片剂，本文提供的CAVES系统与药物载体混合以形成固体组合物。任选地，片剂或丸剂被包衣或以其它方式复合以提供具有在对象中延长作用的优点的剂型。例如，片剂或药丸包含一个内剂量和一个外剂量组分，后者以包封的形式覆盖在前者之上。例如，这两种成分可被肠溶层隔开，肠溶层用于抵抗胃内的崩解，并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料用于此类肠溶层或包衣，包括例如多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素等材料的混合物。
用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的、水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。这些液体或固体组合物可任选地包含本文所述或本领域已知的合适的药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。这些组合物例如通过口服或鼻呼吸途径施用以产生局部或全身作用。通过使用惰性气体使药学上可接受的溶剂中的组合物雾化。雾化溶液例如直接从雾化装置、从附接的面罩帐篷或从间歇正压呼吸机吸入。例如，从以适当方式递送制剂的装置(例如，使用吸入器)经口或经鼻施用溶液，悬浮液或粉末组合物。
本文提供的药物组合物可配制为经透皮递送装置(“贴剂”)透皮递送。此类透皮贴剂用于提供本文提供的病毒的连续或不连续输注。用于递送药剂的透皮贴剂的构建和使用根据本领域已知的方法进行(参见例如美国专利第5,023,252号)。此类贴片被构建用于连续、脉冲或按需递送本文提供的载体细胞和/或病毒。
可用于病毒递送的胶体分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的体系，包括水包油乳剂(混合)、胶束、脂质体和脂复合物。示例性胶体系统是脂质体。可使用器官特异性或细胞特异性脂质体，以实现仅向所需组织的递送。脂质体的靶向可由本领域技术人员通过应用公知的方法进行。此类靶向包括被动靶向(利用脂质体分布到含有窦状毛细血管的器官中网状内皮系统(RES)的细胞的自然倾向)或主动靶向(例如，通过本领域技术人员已知的方法将脂质体偶联到特异性配体，例如抗体、受体、糖、糖脂和蛋白质)。单克隆抗体可通过特定的细胞表面配体将脂质体靶向到特定的组织，例如肿瘤组织。
2.组合
本文提供了载体细胞、溶瘤病毒；以及至少一种表达的病毒编码的免疫调节剂和/或重组治疗蛋白。组合可包括第三或第四试剂，例如第二病毒或其它治疗或诊断试剂。组合可包含含有本文提供的CAVES系统的药物组合物。组合还可包括用于根据本文提供的方法进行治疗或诊断的任何试剂，例如抗病毒或化疗剂。组合还可含有一种化合物，用于调节病毒编码的内源或异源基因的基因表达。
本文提供的组合可包含CAVES系统和治疗化合物。用于本文提供的组合物的治疗化合物可以是例如抗癌或化疗化合物。示例性治疗化合物包括例如细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、酶/Pro E药物对、抗代谢剂、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化疗化合物、抗转移化合物或其任何组合。
本文提供的CAVES系统可与抗癌化合物如铂配位配合物组合。示例性铂配合物包括，例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3 295和254-S。示例性化疗剂还包括但不限于，甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博莱霉素、阿霉素、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、葡甲胺GLA、戊柔比星、卡莫司汀、聚苯丙生、MM1270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、洛美曲索/LY264618、Glamolec、CI-994、TNP-470、美新/拓泊替康、PKC412、戊司泊达/PSC833、米托蒽醌、Metaret/苏拉明、BB-94/巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、IS1641、ODN 698、TA2516/马立司他、BB2516/马立司他、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、沙培林/OK-432、戊柔比星/AD 32、锶-89/Metastron、Temodal/替莫唑胺、Yewtaxan/紫杉醇、Taxol/紫杉醇、Paxex/紫杉醇、Cyclopa/口服紫杉醇、Xeloda/卡培他滨、Furtulon/doxifluridine、口服紫杉烷类、SPU-077/顺铂、HMR 1275/flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(Tegafur/Uracil)、Ergamiol/levamisole、Campto/levamisole、Enilural/776C85/5FU增强子、Camptosar/伊立替康、Tomudex/雷替曲塞、Leustatin/克拉屈滨、Caelyx/脂质体阿霉素、Myocet/脂质体阿霉素、Doxil/脂质体阿霉素、Evacet/脂质体阿霉素、Fludara/氟达拉滨、Pharmrubicin/表阿霉素、DepoCyt、ZD 1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺、LU 103793/多拉斯汀、Gemzar/吉西他滨、ZD 0473/安诺米得、YM 116、碘粒、CDK 4和CDK 2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/右异环磷酰胺、Ifex/Mesnex/异环磷酰胺、Vumon/替尼泊苷、铂尔定/卡铂、Platinol/顺铂、VePesid/Eposin/Etopophos/依托泊苷、ZD 9331、泰索帝/多西他赛、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂如美法仑和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖胞苷、更生霉素、盐酸柔红霉素、磷酸雌莫司汀钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素alfa-2b；醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、氮芥盐酸盐(氮芥盐、巯基嘌呤、美司钠、米托坦(o,p'-DDD)、米托蒽醌盐酸盐、奥曲肽、普卡霉素、丙卡巴肼盐酸盐、链佐星、枸橼酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、噻替派、硫酸长春花碱、安吖啶、阿扎胞苷、促红细胞生成素、六甲基三聚氰胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基GAG；甲基乙二醛双胍腙；MGBG)、戊甾胺(2'脱氧甲氧磷霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛)。用于本文提供的药物组合物和组合中的另外的示例性治疗化合物可在本文别处找到(参见例如，参见，E部分，关于示例性细胞因子，生长因子，光敏剂，放射性核素，毒素，siRNA分子，酶/前药对，抗代谢物，信号传导调节剂，抗癌抗生素，抗癌抗体，血管生成抑制剂，和化疗化合物)。
在一些实例中，组合可包括另外的治疗化合物，例如作为病毒编码和表达的酶的底物的化合物，或本文提供的或本领域已知的与病毒协同作用的其它治疗化合物。例如，病毒可表达一种酶，将前体药物转化为活性化疗药物，用于杀死癌细胞。因此，本文提供的组合可包含治疗性化合物，例如前药。示例性病毒/治疗性化合物组合可包括编码具有前药更昔洛韦的单纯疱疹病毒胸苷激酶的病毒。所提供的用于组合的其它示例性酶/前体药物对包括但不限于水痘带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核糖核酸、beta内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧肽酶G2/4-[(2-氯乙基)(2-甲酰氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、细胞色素P450/对乙酰氨基酚、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨酸酶/双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯氨基甲酮28、β-半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚，β-葡萄糖醛酸酶/表柔比星葡萄糖醛酸、胸苷磷酸化酶/5'-脱氧-5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷、β-内酰胺酶和芳樟醇酶/芳樟醇。用于组合使用的其它示例性前药也可在本文其它地方找到(参见例如E节)。本文提供的各种已知组合中的任何一种或本领域中已知的组合都可包括在本文提供的组合中。
在一些实例中，该组合可包括可杀死或抑制病毒生长或毒性的化合物。此类化合物可用于减轻病毒感染引起的一种或多种不良副作用(参见，例如，美国专利公开号US2009-016228-A1)。本文提供的组合可包含用于治疗感染的抗生素、抗真菌、抗寄生虫或抗病毒化合物。在一些实施例中，抗病毒化合物是抑制病毒生长或毒性的化疗剂。
可包含在本文提供的与载体细胞和病毒的组合中的示例性抗生素包括但不限于头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、氨基糖苷、万古霉素和抗假单胞内酰胺。可包含在本文提供的与载体细胞和病毒的组合中的示例性抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、氨苯砜、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、克霉唑、制霉菌素及其组合。可包含在本文提供的与载体细胞和病毒的组合中的示例性抗病毒剂包括但不限于，西多福韦、西多福韦烷氧基烷基酯(CDV)、环CDV和(S)-9-(3-羟基-2-膦酰甲氧基丙基)腺嘌呤、5-(二甲氧基甲基)-2'-脱氧尿苷、靛青素β-氨基硫脲、N-甲氨基脲、布里伏定、7-脱氮烷酸甲素、ST-246、格列卫、2'-β-氟-2',3'-二脱氧腺苷、茚地那韦、奈非那韦、利托那韦、奈韦拉平、AZT、ddI、ddC及其组合。通常，与抗病毒剂的组合含有已知对该组合的病毒有效的抗病毒剂。例如，组合可包含痘苗病毒与抗病毒化合物，如西多福韦、西多福韦的烷氧基烷基酯、更昔洛韦、阿昔洛韦、ST-246、格列卫及其衍生物。
在一些实例中，所述组合可包括可检测化合物。可检测化合物可包括例如配体、底物或其它化合物，其可与病毒或载体细胞编码和表达的蛋白质或RNA相互作用和/或特异性结合，并可提供可检测信号，例如可通过断层扫描、光谱、磁共振或其它已知技术检测的信号。在一些实例中，蛋白质或RNA是外源蛋白质或RNA。在一些实施例中，病毒或载体细胞表达的蛋白质或RNA修饰可检测化合物，其中修饰化合物发出可检测信号。示例性可检测化合物可以是或可包含成像剂，例如磁共振、超声或断层成像剂，包括放射性核素。可检测化合物可包括本文别处提供的或本领域已知的多种化合物中的任何一种。可由病毒或载体细胞表达的示例性蛋白质和用于检测的可检测化合物组合包括但不限于荧光素酶和荧光素、β-半乳糖苷酶和(4,7,10-三(乙酸)-l-(2-β-吡喃半乳糖乙氧基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)钆(Egad)，以及本领域已知的其它组合。
在一些实例中，所述组合可包括基因表达调节化合物，所述基因表达调节化合物调节由病毒或载体细胞编码的一个或多个基因的表达。调节基因表达的化合物是本领域已知的，包括但不限于转录活化剂、诱导剂、转录抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和RNA结合化合物如siRNA或核酶。本领域已知的多种基因表达调节化合物中的任何一种都可包括在本文提供的组合中。通常，在本文提供的组合中与病毒包括的基因表达调节化合物将是能够结合、抑制或与一种或多种化合物反应的化合物，所述化合物在基因表达方面具有活性，例如病毒或组合的载体细胞的转录因子或RNA。示例性的病毒或载体细胞/表达调节剂组合可以是编码嵌合转录因子复合物的病毒或载体细胞，所述嵌合转录因子复合物具有融合到酵母GAL4 DNA结合结构域、单纯疱疹病毒蛋白VP16的活化结构域的突变人孕酮受体，并且还含有在腺病毒主晚期E1B TATA盒上游含有一系列GAL4识别序列的合成启动子，其中所述化合物可以是RU486(参见例如Yu et al.(2002)Mol Genet Genomics 268：169-178)。本领域已知的多种其它病毒或载体细胞/表达调节剂组合也可包括在本文提供的组合中。
在一些实例中，组合可包含纳米颗粒。可工程化改造纳米颗粒，使得它们携带本文提供的一种或多种治疗剂。此外，纳米颗粒可被工程化改造成携带将纳米颗粒靶向肿瘤细胞的分子。在一个非限制性实施例中，纳米颗粒可涂覆有放射性核素，并且任选地，涂覆有与肿瘤相关抗原免疫反应的抗体。
在一些实例中，所述组合可包含一种或多种另外的用于诊断或治疗的治疗和/或诊断病毒或其它治疗和/或诊断微生物(例如，治疗和/或诊断细菌)。示例性治疗性和/或诊断性病毒是本领域已知的，包括但不限于治疗性和/或诊断性痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒和呼肠孤病毒。以上在此描述了示例性溶瘤病毒。
3.试剂盒
本文提供的CAVES、药物组合物或组合可包装为试剂盒。试剂盒可任选地包括一个或多个部件，例如使用说明书、装置和附加试剂，以及用于实施所述方法的部件，例如管、容器和注射器。示例性试剂盒可包括本文提供的CAVES系统，并且任选地包括使用说明、用于检测对象中的载体细胞和/或病毒的装置、用于向对象施用CAVES的装置、或用于向对象施用附加药剂或化合物的装置。
在一个实例中，试剂盒可包含说明书。说明书通常包括描述CAVES系统和任选地包括在试剂盒中的其它组分的有形表达，以及用于施用载体细胞和病毒的施用方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当施用方法的方法。说明书还可包括用于在治疗时间的持续时间内监视对象的指导。
在另一个实例中，试剂盒可包含用于检测对象中的载体细胞和/或病毒的装置。用于检测对象中的载体细胞和/或病毒的装置可包括用于检测光的弱光成像装置，所述光例如从荧光素酶发射或从荧光蛋白(例如绿色或红色荧光蛋白)荧光化的光、磁共振测量装置(例如MRI或NMR装置)、断层扫描仪(例如PET、CT、CAT、SPECT或其它相关扫描仪)、超声装置、或可用于检测对象中的载体细胞和/或病毒表达的蛋白的其它装置。通常，试剂盒的装置将能够检测由试剂盒的载体细胞和/或病毒表达的一种或多种蛋白质。包含载体细胞、病毒和检测装置的多种试剂盒中的任何一种都可包括在本文提供的试剂盒中，例如，表达荧光素酶的载体细胞或病毒和弱光成像器或表达荧光蛋白(例如绿色或红色荧光蛋白)的载体细胞或病毒和弱光成像器。
本文提供的试剂盒还可包括用于向对象施用CAVES系统的装置。本领域已知的用于施用药物、药物组合物和疫苗的各种装置中的任何一种都可包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。例如，通过静脉注射系统递送的CAVES系统可包括在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。通常，用于施用试剂盒的CAVES的装置将与试剂盒的载体细胞和病毒兼容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可包括在具有未被高压注射损坏的CAVES的试剂盒中，但典型地不包括在具有被高压注射损坏的CAVES的试剂盒中。
本文提供的试剂盒还可包括用于给对象施用附加试剂或化合物的装置。本领域已知的用于给对象施用药物的各种装置中的任何一种都可包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，施用试剂盒的化合物的装置将与所需的化合物施用方法兼容。例如，将系统或皮下递送的化合物可包含在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。
本文提供的试剂盒还可包括用于向对象施加能量(例如电磁能)的任何装置。此类装置包括但不限于激光器、发光二极管、荧光灯、二向色灯和灯箱。试剂盒还可包括对对象进行内部能量暴露的装置，例如内窥镜或光纤导管。
E.与CAVES一起施用的组合(附加)疗法
使用本文提供的组合、组合物或试剂盒的病毒治疗可单独使用或与其它疗法或治疗进一步组合使用，所述组合、组合物或试剂盒包含如本文提供的用于向需要病毒治疗的对象递送溶瘤病毒表达/复制系统的CAVES。B节中描述的用于修饰溶瘤病毒的任何治疗性蛋白质，例如治疗性抗体和免疫检查点抑制剂，也可作为单独的治疗附加或替代地施用。本文提供的组合或组合物还可与其它治疗或药理剂或治疗(例如程序)一起、在其之前、间歇地或在其之后共同配制或共同施用。例如，此类试剂包括但不限于其它生物制剂、抗癌剂、小分子化合物、分散剂、麻醉剂、检查点抑制剂、血管收缩剂、外科手术、放射线、化疗剂、生物制剂、多肽、抗体、肽、小分子、基因治疗载体、病毒和DNA及其组合。此类药剂还可包括一种或多种药剂以改善、减少或防止副作用。在某些情况下，组合疗法可与一种或多种癌症治疗联合使用，所述癌症治疗去除原发肿瘤或在治疗前对对象进行免疫抑制。例如，除了本文提供的组合治疗之外，还可使用附加的化疗或放射治疗。此类附加疗法可能会削弱对象的免疫系统。在其它实例中，手术切除和/或免疫系统削弱治疗可能不是必需的。可在其中组合的示例性其它方法包括施用在不削弱免疫系统的情况下降低肿瘤或肿瘤细胞增殖速率的化合物(例如，通过施用肿瘤抑制化合物或通过施用肿瘤细胞特异性化合物)或施用血管生成抑制化合物。
一种或多种第二药剂或一种或多种治疗方法的制剂可一次施用，或者可分成多个较小剂量以间隔时间施用。选择的药剂/治疗制剂可在治疗时间的过程中以一个或多个剂量施用，例如在几个小时、几天、几周或几个月。在某些情况下，持续施用是有用的。据了解，精确的施用剂量和疗程取决于适应症和患者的耐受性。通常，本领域技术人员已知用于本文中的第二药剂/治疗的施用方式。
例如，本文提供的组合疗法可与以下一种或多种进一步组合使用，包括但不限于免疫共刺激激动剂(例如，B7家族(CD28，ICOS)；TNFR家族(4-1BB，OX40，GITR，CD40，CD30，CD27)；LIGHT，LTα)；BiTE；CAR-T细胞，适应性T细胞疗法，例如NK-92细胞系，和靶向肿瘤特异性抗原的TCR转基因T细胞；共刺激因子，治疗性抗体，包括单链抗体，阿瓦斯汀，阿柏西普，万尼珠单抗，双抗体，抗体-药物偶联物，检查点抑制剂(靶标包括PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO 1和2、CTNNB1(β-catenin)、SIRPα、VISTA、LIGHT、HVEM、LAG3、TIM3、TIGIT、Galectin-9、KIR、GITR、TIM1、TIM4、CEACAM1、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD112、CD137(4-1BB)、CD155、CD160、CD200、CD226、CD244(2B4)、CD272(BTLA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、ICOS、A2aR、A2bR、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4和OX40/OX-40L、MDR1、Arginase1、iNOs、IL-10、TGF-β、pGE2、STAT3、VEGF、KSP、HER2、Ras、EZH2、NIPP1、PP1、TAK1和PLK1a)；和化疗化合物和抗体。
除了本文提供的病毒治疗之外施用的示例性化疗化合物和抗体可包括细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢剂、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素和免疫治疗剂。
可在本文的组合施用之后、同时或之前施用的示例性抗癌药物和用于治疗癌症患者的药物包括但不限于阿西维辛京(Acivicins)；阿维星(Avicin)；阿柔比星(Aclarubicins)；阿考达唑(Acodazoles)；阿克罗宁(Acronines)；阿多来新(Adozelesins)；阿地白介素(Aldesleukins)；阿伦单抗(Alemtuzumabs)；阿曲替诺(Alitretinoins(9-顺式维甲酸))；别嘌呤醇(Allopurinols)；六甲蜜胺(Altretamines)；Alvocidibs；安巴松(Ambazones)；氨霉素类(Ambomycins)；甲胺蒽醌类(Ametantrones)；氨磷汀类(Amifostines)；氨基黄酮酰亚胺(Aminoglutethimides)；安吖啶类(Amsacrines)；阿那曲唑类(Anastrozoles)；Anoxirones；安他滨类(Ancitabines)；蒽霉素类(Anthramycins)；阿帕奇醌(Apaziquones)；精美司那(Argimesnas)；三氧化二砷(ArsenicTrioxides)；天冬酰胺酶(Asparaginases)；阿斯珀林(Asperlins)；阿特胞嘧啶类(Atrimustines)；氮胞苷(Azacitidines)；Azetepas；偶氮霉素(Azotomycins)；班诺蒽醌类(Banoxantrones)；巴他布林(Batabulins)；巴马司他(Batimastats)；注射用卡介苗(BCGLive)；苯那西宾类(Benaxibines)；苯达莫司汀类(Bendamustines)；苯甲苯胺类(Benzodepas)；贝沙罗腾(Bexarotenes)；贝伐单抗(Bevacizumab)；比卡鲁酰胺(Bicalutamides)；比他舍平(Bietaserpines)；比立克达(Biricodars)；比生群(Bisantrenes)；Bisantrenes；二甲磺酸双胺酯(Bisnafide Dimesylates)；双菌素(Bizelesins)；博莱霉素(Bleomycins)；硼替佐米(Bortezomibs)；布喹那(Brequinars)；溴匹立明(Bropirimines)；布朵替坦(Budotitanes)；白消安(Busulfans)；放线菌素(Cactinomycins)；卡鲁睾酮(Calusterones)；卡纳替尼(Canertinibs)；卡培他滨(Capecitabines)；胎甲酰胺(Caracemides)；Carbetimers；卡铂(Carboplatins)；卡波醌(Carboquones)；卡莫氟(Carmofurs)；卡莫司汀与Polifeprosans(Carmustines withPolifeprosans)；卡莫司汀(Carmustines)；卡柔比星(Carubicins)；卡折来新(Carzelesins)；头孢芬醇(Cedefingols)；塞来昔布(Celecoxibs)；西马多丁(Cemadotins)；苯丁酸氮芥(Chlorambucils)；塞奥罗奈(Cioteronels)；西罗里霉素(Cirolemycins)；顺铂(Cisplatins)；克拉屈滨(Cladribines)；克兰氟脲(Clanfenurs)；氯法拉滨(Clofarabines)；Crisnatols；环磷酰胺(Cyclophosphamides)；阿糖胞苷脂质体(Cytarabine liposomals)；阿糖胞苷(Cytarabines)；达卡巴嗪(Dacarbazines)；放线菌素(Dactinomycins)；阿法达贝泊(Darbepoetin Alfas)；柔红霉素脂质体(Daunorubicinliposomals)；柔毛霉素/柔红霉素(Daunorubicins/Daunomycins)；柔红霉素(Daunorubicins)；地西他滨(Decitabines)；地尼白介素(Denileukin Diftitoxes)；右尼古地平(Dexniguldipines)；地扎胍宁(Dexonnaplatins)；右雷佐生(Dexrazoxanes)；地扎胍宁(Dezaguanines)；地吖醌(Diaziquones)；右尼古地平(Dexniguldipines)；地诺孕素(Dienogests)；地那林(Dinalins)；地舍莫来(Disermolides)；多西他赛(Docetaxels)；Dofequidars；去氧氟尿苷(Doxifluridines)；阿霉素脂质体(Doxorubicin liposomals)；盐酸阿霉素(Doxorubicin HCL)；盐酸阿霉素脂质体注射液(Doxorubicin HCL liposomeinjection)；阿霉素(Doxorubicins)；屈洛昔芬(Droloxifenes)；屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone Propionates)；达佐霉素(Duazomycins)；Ecomustines；依达曲沙(Edatrexates)；埃多卡林(edotecarins)；依氟鸟氨酸(Eflornithines)；依克立达(Elacridars)；依利奈法德(Elinafides)；Elliott's B Solutions；依沙芦星(Elsamitrucins)；乙嘧替氟(Emitefurs)；恩洛铂(Enloplatins)；恩普氨酯(Enpromates)；恩扎妥林(Enzastaurins)；依匹哌啶(Epipropidines)；表阿霉素(Epirubicins)；阿法依泊汀(Epoetin Alfas)；依他前列素(eptaloprosts)；阿法依泊汀(Epoetin alfas)；厄布洛唑(Erbulozoles)；依索比星(Esorubicins)；雌莫司汀类(Estramustines)；依他硝唑类(Etanidazole)；依托格鲁(Etoglucids)；磷酸依托泊苷(Etoposide phosphates)；依托泊苷VP-16s(Etoposide 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Alfas)；干扰素Betas；干扰素Gammas；干扰素(Interferons)；白细胞介素2s(Interleukin-2s)和其它白细胞介素(包括重组白细胞介素)；茚托利辛(Intoplicines)；碘苄胍[131-I](Iobenguanes[131-I])；异丙铂类(Iproplatins)；伊立替康(Irinotecans)；伊索拉定(Irsogladines)；伊沙匹隆类(Ixabepilones)；酮曲沙(Ketotrexates)；L-阿拉诺新(L-Alanosines)；兰瑞肽(Lanreotides)；拉帕替尼(Lapatinibs)；来多蒽琼(Ledoxantrones)；来曲唑(Letrozoles)；亚叶酸钙(Leucovorins)；亮丙瑞林(Leuprolides、Leuprorelins、Leuprorelides)；来沙骨化醇(Lexacalcitols)；利阿唑(Liarozoles)；乐铂(Lobaplatins)；洛美曲索(Lometrexols)；洛莫司汀/CCNUSs(Lomustines/CCNUs)；洛莫斯汀(Lomustines)；洛那法尼(Lonafarnibs)；氯索蒽醌类(Losoxantrones)；勒托替康(Lurtotecans)；马磷酰胺(Mafosfamides)；甘露舒凡(Mannosulfans)；马立马司他(Marimastats)；马索罗酚(Masoprocols)；美登素(Maytansines)；氮芥(Mechlorethamines)；氮芥/氮芥子气(Mechlorethamines/Nitrogenmustards)；醋酸甲地孕酮(Megestrol acetates)；甲地孕酮(Megestrols)；美仑孕酮(Melengestrols)；美法仑(Melphalans)；MelphalanslL-PAMs；美诺立尔(Menogarils)；美雄烷(Mepitiostanes)；巯嘌呤(Mercaptopurines)；6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)；美司钠(Mesnas)；美替辛德(Metesinds)；氨甲蝶呤(Methotrexates)；甲氧沙林(Methoxsalens)；美托咪酯(Metomidates)；氯苯氨啶(Metoprines)；美妥替哌(Meturedepas)；米铂(Miboplatins)；米泼昔芬(Miproxifenes)；迷索硝唑(Misonidazoles)；米丁度胺(Mitindomides)；米托卡星(Mitocarcins)；丝裂红素(Mitocromins)；米托拉酮(Mitoflaxones)；米托洁林(Mitogillins)；米托胍腙(Mitoguazones)；米托马星(Mitomalcins)；丝裂霉素C(Mitomycin Cs)；丝裂霉素(Mitomycins)；米托萘胺(Mitonafides)；米托喹酮(Mitoquidones)；米托司培(Mitospers)；米托坦(Mitotanes)；米托葸醌(Mitoxantrones)；米托唑胺(Mitozolomides)；米伏布林(Mivobulins)；咪唑立宾(Mizoribines)；莫法罗汀(Mofarotenes)；莫哌达醇(Mopidamols)；木利替尼(Mubritinibs)；麦可酚酸(Mycophenolic Acids)；苯丙酸诺龙(Nandrolone Phenpropionates)；奈达铂(Nedaplatins)；奈扎拉宾(Nelzarabines)；奈莫柔比星(Nemorubicins)；二胺硝吖啶(Nitracrines)；诺考达唑(Nocodazoles)；诺非妥莫单抗(Nofetumomabs)；诺加霉素(Nogalamycins)；诺拉曲特(Nolatrexeds)；诺托生琼(Nortopixantrones)；奥曲肽(Octreotides)；奥普瑞白介素(Oprelvekins)；奥马铂(Ormaplatins)；奥他紫杉醇(Ortataxels)；奥特拉西(Oteracils)；奥沙利铂(Oxaliplatins)；奥昔舒仑(Oxisurans)；氧芬胂(Oxophenarsines)；紫杉醇(Paclitaxels)；帕米膦酸盐(Pamidronates)；Patubilones；培加酶(Pegademases)；培门冬酶(Pegaspargases)；培非格司亭(Pegfilgrastims)；培得星(Peldesines)；佩里霉素(Peliomycins)；吡利曲索(Pelitrexols)；培美曲塞(Pemetrexeds)；奈莫司汀(Pentamustines)；喷司他丁(Pentostatins)；培洛霉素(Peplomycins)；培磷酰胺(Perfosfamides)；哌立福辛(Perifosines)；吡铂(Picoplatins)；吡萘非特(Pinafides)；哌泊溴烷(Pipobromans)；哌泊舒凡(Piposulfans)；吡非尼酮(Pirfenidones)；吡罗蒽醌(Piroxantrones)；匹杉琼(Pixantrones)；普来曲塞(Plevitrexeds)；普卡霉素(Plicamycid Mithramycins)；普卡霉素(Plicamycins)；普洛美坦(Plomestanes)；普洛美坦(Plomestanes)；卟吩姆钠(Porfimersodiums)；卟吩姆钠(Porfimers)；甲基丝裂霉素(Porfiromycins)；泼尼莫司汀(Prednimustines)；甲基苄肼(Procarbazines)；普罗帕脒(Propamidines)；丙螺氯铵(Prospidiums)；嘌嘧替派(Pumitepas)；嘌呤霉素(Puromycins)；吡唑呋喃菌素(Pyrazofurins)；喹吖因(Quinacrines)；雷莫司汀(Ranimustines)；拉布立酶(Rasburicases)；利波腺苷(Riboprines)；利曲舒凡(Ritrosulfans)；利妥昔单抗(Rituximabs)；洛太米特(Rogletimides)；罗喹美克(Roquinimexs)；链黑菌素(Rufocromomycins)；Sabarubicins；沙芬戈(Safingols)；沙格司亭(Sargramostims)；沙铂(Satraplatins)；司铂(Sebriplatins)；司莫司汀(Semustines)；辛曲秦(Simtrazenes)；西索菲兰(Sizofirans)；索布佐生(Sobuzoxanes)；索拉非尼(Sorafenibs)；Sparfosates；膦门冬酸(Sparfosic Acids)；司帕索霉素(Sparsomycins)；锗螺胺(Spirogermaniums)；螺莫司汀(Spiromustines)；螺铂(Spiroplatins)；螺铂(Spiroplatins)；角鲨胺(Squalamines)；链黑霉素(Streptonigrins)；链可变菌素(Streptovarycins)；链脲霉素(Streptozocins)；磺磷酰胺(Sufosfamides)；磺氯苯脲(Sulofenurs)；苹果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine(6-TG))；Tacedinalines；Talcs；他利霉素(Talisomycins)；他莫司汀(Tallimustines)；他莫昔芬(Tamoxifens)；Tariquidars；牛磺莫司汀(Tauromustines)；替可加兰(Tecogalans)；替加氟(Tegafurs)；替洛蒽醌(Teloxantrones)；替莫卟吩(Temoporfins)；替莫唑胺(Temozolomides)；鬼臼噻吩甙/VM-26s(Teniposides/VM-26s)；替尼泊苷(Teniposides)；替罗昔隆(Teroxirones)；睾内酯(Testolactones)；硫咪嘌呤(Thiamiprines)；硫鸟嘌呤(Thioguanines)；塞替派(Thiotepas)；硫米嘌呤(Tiamiprines)；噻唑呋林(Tiazofurins)；噻氯咪索(Tilomisoles)；泰洛龙(Tilorones)；汀考达(Timcodars)；噻莫西酸(Timonacics)；替拉扎明(Tirapazamines)；托吡蒽醌(Topixantrones)；拓扑替康(Topotecans)；托瑞米芬(Toremifenes)；托西莫单抗(Tositumomabs)；曲贝替定(曲贝替定743)(Trabectedins(Ecteinascidin 743))；曲妥珠单抗(Trastuzumabs)；曲托龙(Trestolones)；维甲酸/ATRA(Tretinoins/ATRA)；曲西瑞宾(Triciribines)；曲洛司坦(Trilostanes)；三甲曲沙(Trimetrexates)；四硝酸三铂(Triplatin Tetranitrates)；曲普瑞林(Triptorelins)；曲洛磷胺(Trofosfamides)；妥布氯唑(Tubulozoles)；乌苯美司(Ubenimexs)；乌拉莫司汀(Uracil Mustards)；乌瑞替派(Uredepas)；戊柔比星(Valrubicins)；伐司朴达(Valspodars)；伐普肽(Vapreotides)；维替泊芬(Verteporfins)；长春碱(Vinblastines)；长春新碱(Vincristines)；长春地辛(Vindesines)；长春匹定(Vinepidines)；长春氟宁(Vinflunines)；环氧长春新碱(Vinformides)；长春甘酯(Vinglycinates)；长春西醇(Vinleucinols)；长春罗辛(Vinleurosines)；长春瑞滨(Vinorelbines)；长春罗定(Vinrosidines)；长春曲醇(Vintriptols)；长春利定(Vinzolidines)；伏氯唑(Vorozoles)；链霉黄素(胍哌甲基四环素)(Xanthomycin As)(Guamecyclines)；折尼铂(Zeniplatins)；亚苄维C[2-H](Zilascorbs[2-H])；净司他丁(Zinostatins)；唑来磷酸(Zoledronate)；佐柔比星(Zorubicins)；和Zosuquidars，例如：阿地白介素(Aldesleukins)(例如
Figure BDA0003148729980000731
)；阿仑单抗(Alemtuzumabs)(例如
Figure BDA0003148729980000732
)；阿利维甲酸(Alitretinoins)(例如
Figure BDA0003148729980000733
)；别嘌呤醇(Allopurinols)(例如
Figure BDA0003148729980000734
)；六甲蜜胺(Altretamines)(例如
Figure BDA0003148729980000735
)；氨磷汀(Amifostines)(例如
Figure BDA0003148729980000736
)；阿那曲唑(Anastrozoles)(例如
Figure BDA0003148729980000737
)；三氧化二砷(ArsenicTrioxides)(例如
Figure BDA0003148729980000738
)；天冬酰胺酶(Asparaginases)(例如
Figure BDA0003148729980000739
)；注射用卡介苗(BCG Live)(例如
Figure BDA00031487299800007310
BCG)；贝沙罗腾(Bexarotenes)(例如
Figure BDA00031487299800007311
)；贝伐单抗(Bevacizumab)
Figure BDA00031487299800007312
博莱霉素(Bleomycins)(例如
Figure BDA00031487299800007313
)；静脉注射用白消安(Busulfans intravenous)(例如
Figure BDA00031487299800007314
)；口服白消安(Busulfan orals)(例如
Figure BDA00031487299800007315
)；卡鲁睾酮(Calusterones)(例如
Figure BDA00031487299800007316
)；卡培他滨(Capecitabines)(例如
Figure BDA00031487299800007317
)；卡铂(Carboplatins)(例如
Figure BDA00031487299800007318
)；卡莫司汀(Carmustines)(例如
Figure BDA00031487299800007319
)；Carmustines with Polifeprosans(例如
Figure BDA00031487299800007320
Wafer)；塞来昔布(Celecoxibs)(例如
Figure BDA00031487299800007321
)；苯丁酸氮芥(Chlorambucils)(例如
Figure BDA00031487299800007322
)；顺铂(Cisplatins)(例如
Figure BDA00031487299800007323
)；克拉屈滨(Cladribines)(例如
Figure BDA00031487299800007324
)；环磷酰胺(Cyclophosphamides)(例如
Figure BDA00031487299800007325
Figure BDA00031487299800007326
)；阿糖胞苷(Cytarabines)(例如
Figure BDA00031487299800007327
)；阿糖胞苷脂质体(Cytarabine liposomals)(例如
Figure BDA00031487299800007328
)；达卡巴嗪(Dacarbazines)(例如DTIC-Dome)：Dactinomycins(例如
Figure BDA00031487299800007329
)；Darbepoetin Alfas(例如
Figure BDA00031487299800007330
)；柔红霉素脂质体(Daunorubicin liposomals)(例如
Figure BDA00031487299800007331
)；柔毛霉素/柔红霉素(Daunorubicins/Daunomycins)(例如
Figure BDA00031487299800007332
)；地尼白介素(DenileukinDiftitoxes)(例如
Figure BDA00031487299800007333
)；右雷佐生(Dexrazoxanes)(例如
Figure BDA00031487299800007334
)；多西他赛(Docetaxels)(例如
Figure BDA00031487299800007335
)；阿霉素(Doxorubicins)(例如
Figure BDA00031487299800007336
Figure BDA00031487299800007337
)；阿霉素脂质体(Doxorubicin liposomals)，包括盐酸阿霉素(DoxorubicinHCL)注射液(例如
Figure BDA00031487299800007338
)；屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone Propionates)(例如
Figure BDA00031487299800007339
和
Figure BDA00031487299800007340
Injection)；Elliott's B Solutions(例如Elliott's B
Figure BDA00031487299800007341
)；表阿霉素(Epirubicins)(例如
Figure BDA00031487299800007342
)；阿法依泊汀(Epoetin Alfas)(例如
Figure BDA00031487299800007343
)；雌莫司汀类(Estramustines)(例如
Figure BDA00031487299800007344
)；磷酸依托泊苷(Etoposide phosphates)(例如
Figure BDA00031487299800007345
)；依托泊苷VP-16s(EtoposideVP-16s)(例如
Figure BDA00031487299800007346
)；依西美坦(Exemestanes)(例如
Figure BDA00031487299800007347
)；非格司亭(Filgrastims)(例如
Figure BDA00031487299800007348
)；氟尿苷(Floxuridines)(例如
Figure BDA00031487299800007349
)；氟达拉滨(Fludarabines)(例如
Figure BDA00031487299800007350
)；Fluorouracils incl.5-FUs(例如
Figure BDA00031487299800007351
)；氟维司琼(Fulvestrants)(例如
Figure BDA0003148729980000741
)；吉西他滨(Gemcitabines)(例如
Figure BDA0003148729980000742
)；吉妥单抗/奥佐米星(Gemtuzumabs/Ozogamicins)(例如
Figure BDA0003148729980000743
)；乙酸戈舍瑞林(Goserelin acetates)(例如
Figure BDA0003148729980000744
)；羟基脲类(Hydroxyureas)(例如
Figure BDA0003148729980000745
)；替伊莫单抗(Ibritumomabs/Tiuxetans)(例如
Figure BDA0003148729980000746
)；伊达比星(Idarubicins)(例如
Figure BDA0003148729980000747
)；异环磷酰胺(Ifosfamides)(例如
Figure BDA0003148729980000748
)；甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylates)(例如
Figure BDA0003148729980000749
)；干扰素alfa-2as(Interferon alfa-2as)(例如
Figure BDA00031487299800007410
)；干扰素alfa-2bs(Interferon alfa-2bs)(例如INTRON
Figure BDA00031487299800007411
)；伊立替康(Irinotecans)(例如
Figure BDA00031487299800007412
)；来曲唑(Letrozoles)(例如
Figure BDA00031487299800007413
)；亚叶酸钙(Leucovorins)(例如
Figure BDA00031487299800007414
)；左咪唑(Levamisoles)(例如
Figure BDA00031487299800007415
)；洛莫司汀/CCNUSs(Lomustines/CCNUs)(例如
Figure BDA00031487299800007416
)；氮芥/氮芥子气(Mechlorethamines/Nitrogen mustards)(例如
Figure BDA00031487299800007417
)；醋酸甲地孕酮(Megestrol acetates)(例如
Figure BDA00031487299800007418
)；Melphalans/L-PAMs(例如
Figure BDA00031487299800007419
)；巯嘌呤(Mercaptopurines)，包括6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)(6-MPs；例如
Figure BDA00031487299800007420
)；美司钠(Mesnas)(例如
Figure BDA00031487299800007421
)；氨甲蝶呤(Methotrexates)；甲氧沙林(Methoxsalens)(例如
Figure BDA00031487299800007422
)；丝裂霉素C(Mitomycin Cs)(例如
Figure BDA00031487299800007423
)；米托坦(Mitotanes)(例如
Figure BDA00031487299800007424
)；米托葸醌(Mitoxantrones)(例如
Figure BDA00031487299800007425
)；苯丙酸诺龙(Nandrolone Phenpropionates)(例如
Figure BDA00031487299800007426
)；诺非妥莫单抗(Nofetumomabs)(例如
Figure BDA00031487299800007427
)；奥普瑞白介素(Oprelvekins)(例如
Figure BDA00031487299800007428
)；奥沙利铂(Oxaliplatins)(例如
Figure BDA00031487299800007429
)；紫杉醇(Paclitaxels)(例如
Figure BDA00031487299800007430
)；帕米膦酸盐(Pamidronates)(例如
Figure BDA00031487299800007431
)；培加酶(Pegademases)(例如
Figure BDA00031487299800007432
)；培门冬酶(Pegaspargases)(例如
Figure BDA00031487299800007433
)；培非格司亭(Pegfilgrastims)(例如
Figure BDA00031487299800007434
)；喷司他丁(Pentostatins)(例如
Figure BDA00031487299800007435
)；哌泊溴烷(Pipobromans)(例如
Figure BDA00031487299800007436
)；普卡霉素(Plicamycid/Mithramycins)(例如
Figure BDA00031487299800007437
)；卟吩姆钠(Porfimer sodiums)(例如
Figure BDA00031487299800007438
)；甲基苄肼(Procarbazines)(例如
Figure BDA00031487299800007439
)；喹吖因(Quinacrines)(例如
Figure BDA00031487299800007440
)；拉布立酶(Rasburicases)(例如
Figure BDA00031487299800007441
)；利妥昔单抗(Rituximabs)(例如
Figure BDA00031487299800007442
)；沙格司亭(Sargramostims)(例如
Figure BDA00031487299800007443
)；链脲霉素(Streptozocins)(例如
Figure BDA00031487299800007444
)；苹果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)；Talcs(例如
Figure BDA00031487299800007445
)；他莫昔芬(Tamoxifens)(例如
Figure BDA00031487299800007446
)；替莫唑胺(Temozolomides)(例如
Figure BDA00031487299800007447
)；鬼臼噻吩甙/VM-26s(Teniposides/VM-26s)(例如
Figure BDA00031487299800007448
)；睾内酯(Testolactones)(例如
Figure BDA00031487299800007449
)；硫鸟嘌呤(Thioguanines)，包括6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine(6-TG))；噻替派(Thiotepas)(例如
Figure BDA00031487299800007450
)；拓扑替康(Topotecans)(例如
Figure BDA00031487299800007451
)；托瑞米芬(Toremifenes)(例如
Figure BDA00031487299800007452
)；托西莫单抗(Tositumomabs)(例如
Figure BDA00031487299800007453
)；曲妥珠单抗(Trastuzumabs)(例如
Figure BDA00031487299800007454
)；维甲酸/ATRA(Tretinoins/ATRA)(例如
Figure BDA00031487299800007455
)；乌拉莫司汀(Uracil Mustards)；戊柔比星(Valrubicins)(例如
Figure BDA00031487299800007456
)；长春碱(Vinblastines)(例如
Figure BDA00031487299800007457
)；长春新碱(Vincristines)(例如
Figure BDA00031487299800007458
)；长春瑞滨(Vinorelbines)(例如
Figure BDA00031487299800007459
)；和唑来磷酸(Zoledronate)(例如
Figure BDA00031487299800007460
)。
可在本文治疗的施用之后、同时或之前施用的示例性检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4剂、抗PF-1剂和其它，其示例性如下：
Figure BDA00031487299800007461
Figure BDA0003148729980000751
与本文提供的用于病毒治疗的组合一起施用的附加治疗可包括一种或多种免疫抑制药物，例如糖皮质激素(例如，强的松、地塞米松、氢化可的松)；钙调神经磷酸酶抑制剂(如环孢素、他克莫司)；mTOR抑制剂(如西罗莫司、依维莫司)；甲氨蝶呤；来那度胺；硫唑嘌呤；巯嘌呤；氟尿嘧啶；环磷酰胺；TNF阻断抗体(如英夫利昔单抗/雷米卡德、依那西普/恩布雷、阿达木单抗/胡米拉)和氟达拉滨。
F.用于治疗的CAVES的施用方式
本文提供的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)可施用给对象，包括具有肿瘤或具有肿瘤细胞的对象以进行治疗。施用的CAVES可以是本文提供的CAVES或使用本文提供的方法生成的任何其它CAVES。在一些实施例中，在CAVES中使用的载体细胞/细胞载体是自体细胞(即，来源于患者)或异基因细胞(即，不来源于患者)，其是干细胞、免疫细胞或癌细胞。载体细胞可敏化，例如，增强病毒扩增能力，阻断抗病毒状态的诱导，保护对抗异体失活/排斥决定簇，以及对抗补体，或者载体细胞可被工程化，例如，对干扰素诱导的抗病毒状态无反应，逃避T细胞、NK细胞和NKT细胞的异体识别，表达人或病毒来源的免疫抑制因子，表达癌或干细胞衍生因子，使不允许的肿瘤细胞对溶瘤病毒感染致敏，以及表达干扰补体和中和抗体功能的因子。在一些实施例中，所施用的病毒是一种含有如下特性的病毒，所述特性例如弱致病性、低毒、在肿瘤中优先积聚、活化针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力和表达外源蛋白的能力，所述外源蛋白包括免疫调节蛋白和免疫治疗蛋白，例如针对检查点抑制剂的抗体、共刺激因子的激动剂及其组合。
a.照射或非照射CAVES的施用
在溶瘤病毒感染之前或之后，可对CAVES中使用的载体细胞进行照射。为将转化细胞用作溶瘤病毒治疗的细胞载体，必须防止未感染的细胞在施用后建立新的转移生长。这可通过在病毒感染之前或之后、施用之前照射载体细胞来实现，这可消融致瘤性，但保留代谢活性，并且不影响病毒的产生/扩增和释放。例如，载体细胞可在病毒感染前照射至24小时，或在病毒感染后照射至24小时。
辐射量可由本领域技术人员根据各种因素中的任何一种来选择，这些因素包括CAVES中的载体细胞和病毒的性质。辐射量可足以灭活载体细胞，防止肿瘤发生，而不影响病毒感染、扩增和释放。例如，辐射量可以是大约5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、100Gy、120Gy、150Gy、200Gy、250Gy、500Gy或更高。
b.施用途径
CAVES可局部地或系统地递送或给对象施用。例如，施用模式包括但不限于全身、肠外、静脉、腹膜内、皮下、肌肉内、经皮、皮内、动脉内(例如肝动脉输注)、膀胱内灌注、胸膜内、关节内、局部、瘤内、局部、内窥镜、多次穿刺(例如与天花疫苗一起使用)、通过吸入、经皮、皮下、鼻内、气管内、口服、腔内(例如通过导管施用到膀胱、通过栓剂或灌肠施用到肠道)、阴道、直肠、颅内、前列腺内、玻璃体腔、耳、眼或局部施用。
本领域技术人员可选择与对象和CAVES兼容的任何施用模式，并且这也可能导致CAVES到达和进入靶细胞类型或组织，例如肿瘤和/或转移瘤。本领域技术人员可根据多种因素中的任何一种来选择施用途径，这些因素包括疾病的性质、靶细胞或组织的性质(例如肿瘤的种类)以及要施用的特定CAVES。对目标部位的施用可例如通过作为胶体分散系统的弹道递送来执行，或者通过注射到动脉中来执行全身施用。
c.设备
本领域已知的用于施用药物、药物组合物和疫苗的各种装置中的任何一种都可用于施用CAVES。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。例如，可使用Qaudra-FuseTM多管注射针(Rex Medical，Conshohocken，PA)。
通常，用于施用CAVES的设备将与CAVES兼容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可与不被高压注射损坏的CAVES一起使用，但典型地不与被高压注射损坏的CAVES一起使用。本文还提供了用于给对象施用附加试剂或化合物的装置。可使用本领域已知的用于给对象施用药物的各种装置中的任何一种。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，施用该化合物的装置将与所需的施用该化合物的方法相容。例如，全身或皮下注射的化合物可用皮下注射针和注射器施用。
d.施用剂量
剂量方案可以是多种方法和量中的任何一种，并且可由本领域技术人员根据已知的临床因素来确定。如医学领域中已知的，任何一个患者的剂量可取决于许多因素，包括对象的种类、大小、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、要施用的特定CAVES、施用的持续时间和途径、疾病的种类和阶段(例如肿瘤大小)以及同时施用的其它治疗或化合物(例如化疗药物)。除了上述因素之外，这些水平还可能受到病毒的感染性和扩增潜力以及CAVES的性质的影响，如本领域技术人员可确定的。
在本发明的方法中，CAVES的适当的最小剂量水平和剂量方案可以是足以使CAVES将病毒递送到靶位点和使病毒在肿瘤或转移中存活、生长和复制的水平。通常，用任何合适的溶瘤病毒(包括基于本文提供的共培养筛选和分析方法选择的溶瘤病毒)离体感染100,000至10亿个未经修饰的、敏化的、保护的或基因工程化的异体或自体载体细胞，以0.01或更高的感染复数(MOI)，以产生CAVES。例如，载体细胞以至少或约0.01至至少或约10.0之间的MOI感染，或以至少或约0.01、0.02、0.03、0.04或0.05至至少或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0或5.0之间的MOI，例如至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.9、1.0或更多的MOI感染。然后将感染的载体细胞温育至少或约6小时至至少或约72小时或更长时间，以产生CAVES。例如，产生CAVES的孵育时间可在至少或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18小时之间至至少或约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72或更多小时之间。在一些实施方案中，MOI为0.1，并且产生CAVES的孵育时间为至少或约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时或更多小时。例如，MOI为0.1，产生CAVES的孵育时间在约38至约42小时之间，例如约38、39、40、41或42小时。在示例性实施例中，MOI为0.1，产生CAVES的孵育时间为约28小时，在一些实施例中，MOI为0.5，产生CAVES的孵育时间在约18至约24小时之间，例如约18、19、20、21、22、23或24小时。在任何前述实施方案中，细胞载体可以是干细胞，例如MSC细胞或培养的AD-MSC(源自CD34+SA-ASC)，或SVF细胞或其亚群，例如外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235A-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)或周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)。在进一步的实施方案中，病毒是痘苗病毒(VACV)，例如ACAM1000或ACAM2000；在实施方案中，VACV是具有SEQ ID NO：70所示序列的ACAM2000，或者是具有SEQID NO：71所示序列的CAL1病毒。
对于本文提供的组合物和方法，选择产生至少为或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多pfu/细胞的细胞载体/CAVES。例如，选择产生至少或至少约10、至少或至少约100、至少或至少约1,000或更高的pfu/细胞的细胞载体/CAVES。通常，在一个施用周期内，病毒的施用量至少为或约为或1×105pfu一次。将病毒施用到65kg人的示例性最小水平可包括至少约1×105空斑形成单位(pfu)、至少约5×105pfu、至少约1×106pfu、至少约5×106pfu、至少约1×107pfu、至少约1×108pfu、至少约1×109pfu、或至少约1×1010pfu。例如，在一个施用周期内，病毒的施用量至少为1×105pfu、1×106pfu、1×107pfu、1×108pfu、1×109pfu、1×1010pfu、1×1011pfu、1×1012pfu、1×1013pfu或1×1014pfu一次。
e.方案
在药物治疗方案中，CAVES的量可作为一次施用或在施用周期内多次施用。因此，本文提供的方法可包括对对象单次施用CAVES或对对象多次施用CAVES。在一些实施例中，单次施用足以在肿瘤中递送和建立病毒，其中病毒可增殖并可在对象中引起或增强抗肿瘤应答；这些方法不需要额外给予CAVES以引起或增强对象的抗肿瘤应答，其可导致例如抑制肿瘤生长、抑制转移生长或形成、缩小肿瘤大小、消除肿瘤或转移、抑制或预防肿瘤疾病的复发或新的肿瘤形成，或其它癌症治疗效果。
在其它示例中，可在不同的场合施用CAVES，在时间上通常间隔至少一天。例如，所述CAVES可施用两次、三次、四次、五次或六次或更多次，施用间隔一天或更长时间，两天或更长时间，一周或更长时间，或一个月或更长时间。单独施用可增加将病毒递送至肿瘤或转移的可能性，其中先前的施用在将病毒递送至肿瘤或转移中是无效的。单独施用可增加肿瘤或转移瘤上可发生病毒增殖的位置或可增加肿瘤中积聚的病毒滴度，这可增加抗原或其它化合物从肿瘤释放的规模，以引发或增强宿主的抗肿瘤免疫应答，并且还可任选地增加基于病毒的肿瘤溶解或肿瘤细胞死亡的水平。单独给予CAVES可进一步延长对象对病毒抗原的免疫应答，这可延长宿主对病毒已在其中积累的肿瘤或转移瘤的免疫应答，并可增加宿主形成抗肿瘤免疫应答的可能性。
当进行单独施用时，每次施用可以是相对于其它施用剂量相同或不同的剂量的量。在一个示例中，所有施用剂量的量相同。在其它实施例中，第一剂量的量可以是比一个或多个后续剂量的量更大的剂量的量，例如，比后续剂量的量大至少10×、大至少100×、或大至少1000×。在其中第一剂量的量大于一个或多个后续剂量的量的单独施用方法的一个实例中，所有后续剂量的量可以是相同的，或者相对于第一施用的更小的量。
单独的施用可包括任意数量的两个或更多的施用，包括两个、三个、四个、五个或六个施用。本领域技术人员可根据本领域已知的用于监视治疗方法的方法和本文提供的其它监视方法，容易地确定要执行的施用次数或执行一个或多个附加施用的期望。因此，本文提供的方法包括向对象提供一个或多个CAVES施用的方法，其中施用的数量可通过监视对象来确定，并且基于监视的结果来确定是否提供一个或多个附加施用。决定是否提供一个或多个附加施用可基于多种监测结果，包括但不限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的指示、新转移瘤的出现或转移抑制、对象的抗病毒抗体滴度、对象的抗肿瘤抗体滴度、对象的整体健康、对象的体重、仅在肿瘤和/或转移瘤中存在病毒以及在正常组织或器官中存在病毒。
施用之间的时间段可以是各种时间段中的任何一个。施用之间的时间周期取决于多种因素中任何一个，其包括监测步骤，如关于施用次数、对象启动免疫应答的时间周期、对象从正常组织清除病毒的时间周期、或病毒在肿瘤中增殖或转移的时间周期所描述的。在一个示例中，时间周期可以是对象进行免疫应答的时间周期的函数；例如，时间周期可大于对象挂载免疫应答的时间周期，如约一周以上、约十天以上、约两周以上、或约一个月以上；在另一个示例中，所述时间段可小于对象启动免疫应答的时间段，例如小于约一周、小于约十天、小于约两周或小于约一个月。在另一个示例中，时间周期取决于对象从正常组织清除病毒的时间周期；例如，时间周期可大于对象从正常组织中清除病毒的时间周期，如超过约一天、超过约两天、超过约三天、超过约五天、或超过约一周。在另一个实例中，时间周期取决于肿瘤中病毒增殖或转移的时间周期；例如，所述时间段可大于在施用表达可检测标记物的病毒后在肿瘤或转移中出现可检测信号的时间量，例如约3天、约5天、约一周、约10天、约两周或约一个月。
例如，一个剂量的CAVES在一个施用周期内施用两次、三次、四次、五次、六次或七次。可在周期的第一天、周期的第一天和第二天、周期的前三个连续天中的每一天、周期的前四个连续天中的每一天、周期的前五个连续天中的每一天、周期的前六个连续天中的每一天或周期的前七个连续天中的每一天施用CAVES量。一般施用周期为7天、14天、21天或28天。根据患者的反应性或预后，施用周期在几个月或几年中重复。
通常，CAVES的合适的最大剂量水平或施用方式是对宿主没有毒性的水平、不会引起3倍或3倍以上脾肿大的水平、不会在大约1天后或大约3天后或大约7天后在正常组织或器官中导致病毒集落或斑块的水平。
G.治疗方法和与治疗相配合的监测
本文提供了通过施用如本文所提供的细胞辅助的病毒表达系统或CAVES以促进病毒的递送来治疗具有增殖性或炎症性疾病或病症的对象的治疗方法。特别是，此类情况与免疫活化的细胞或组织有关。与免疫豁免的细胞或组织相关的疾病或病症包括例如增殖性疾病或病症，包括癌细胞、肿瘤、肿瘤、转移瘤、癌症干细胞和其它免疫豁免的细胞或组织(例如伤口和受伤或发炎的组织)的治疗(例如抑制)。在此类方法的具体实施例中，本文提供的CAVES通过静脉施用进行全身递送。在其它实施例中，本文提供的CAVES通过瘤内注射施用。在实施例中，对象患有癌症。本文提供的任何CAVES可用于向需要的对象提供病毒治疗，包括包含致敏细胞载体、受保护细胞载体、工程化细胞载体和匹配细胞载体的CAVES，所述细胞载体可包括另外通过美国临时专利申请第62/680,570号和美国申请号第16/536,073号中描述的匹配分析筛选的敏化/工程化细胞载体。
本文提供的CAVES可通过单次注射、多次注射或连续地施用。例如，可通过包括使用静脉泵、注射器泵、静脉滴注或慢速注射的慢速输注来施用CAVES。例如，CAVES的连续施用可在分钟至小时的过程中发生，例如在1分钟至1小时之间或大约在1分钟至1小时之间，例如在20至60分钟之间。
适于本文所述的治疗和检测方法的癌症还包括转移的癌症。本领域技术人员应理解，转移是细胞从原发肿瘤扩散到非毗连部位，通常通过血流或淋巴管，这导致继发肿瘤生长的建立。预期用于治疗的癌症的实例包括，但不限于实体瘤和血液系统恶性肿瘤，例如黑色素瘤，包括脉络膜和皮肤黑色素瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、牙龈癌、舌癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、直肠癌、绒毛膜癌、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)癌、结缔组织癌、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统的癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、纤维瘤；粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、肝癌、间皮瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质瘤、骨巨细胞瘤、口腔赘生物、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、浆细胞性淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、肉瘤、神经瘤、胰岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤、胃腺癌、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成和任何其它转移的或有转移风险的肿瘤或赘生物。
本文提供的方法的对象可以是任何对象，例如动物或植物对象，包括哺乳动物或鸟类物种。例如，动物对象可以是人类或非人类动物，包括但不限于驯养和农场动物，例如猪、牛、山羊、绵羊、马、猫或犬。在特定的实例中，动物对象是人类对象。在特定的实例中，人类对象是儿童患者。
本文提供的方法可进一步包括监测对象、监测肿瘤和/或监测给予对象的CAVES/病毒的一个或多个步骤。多种监测步骤中的任何一种可包括在本文提供的方法中，包括但不限于监测肿瘤大小、监测抗(肿瘤抗原)抗体滴度、监测转移瘤的存在和/或大小、监测对象的淋巴结、监测对象的体重或包括血液或尿液标记物的其它健康指标、监测抗(病毒抗原)抗体滴度、监测可检测基因产物的病毒表达，以及直接监测对象的肿瘤、组织或器官中的病毒滴度。
监测的目的可以是评估对象的健康状态或对象的治疗治疗的进展，或者可以是确定是否需要进一步施用相同或不同的CAVES/病毒，或者确定何时或是否向对象施用化合物，其中所述化合物可起到增加治疗方法的功效的作用，或者所述化合物可起到降低施用给对象的病毒的致病性的作用。
肿瘤和/或转移大小可通过本领域已知的多种方法中的任何一种来监测，包括外部评估方法或断层摄影或磁成像方法，例如本文所述的检测方法。此外，本文提供的方法，例如，监测基因表达(例如，病毒基因表达)，可用于监测肿瘤和/或转移大小。
在几个时间点上监测肿瘤大小可提供关于本文提供的治疗方法的疗效的信息。此外，监测肿瘤或转移的大小的增大或减小也可提供关于对象中附加肿瘤和/或转移的存在(即，检测和/或诊断)的信息。在几个时间点上监测肿瘤大小可提供关于对象中肿瘤疾病的发展的信息，包括对象中肿瘤疾病的治疗的疗效，例如本文提供的治疗。
本文提供的方法还可包括监测对象中的抗体滴度，包括响应于给予CAVES而产生的抗体。例如，在本文提供的方法中施用的CAVES/病毒可引发对内源性病毒抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的CAVES/病毒还可引发对由CAVES/病毒表达的外源基因的免疫应答。在本文提供的方法中施用的CAVES/病毒也可引发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对病毒抗原、病毒表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度可用于监测病毒的毒性、监测治疗方法的效力、或监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体水平的方法。
在一个实例中，监测抗体滴度可用于监测病毒的毒性。针对病毒的抗体滴度可在给对象施用CAVES/病毒后的时间段内变化，其中在某些特定时间点，低的抗(病毒抗原)抗体滴度可指示较高的毒性，而在其它时间点，高的抗(病毒抗原)抗体滴度可指示较高的毒性。在本文提供的方法中使用的病毒可以是免疫原性的，并且因此可在给对象施用CAVES/病毒后很快引发免疫应答。
通常，对象的免疫系统能够迅速对其产生强烈免疫反应的病毒可以是当对象的免疫系统能够将病毒从所有正常器官或组织中清除时具有低毒的病毒。因此，在一些实施例中，在给对象施用CAVES/病毒后不久针对病毒抗原的高抗体滴度可指示病毒的低毒。相反，不具有高度免疫原性的病毒可感染宿主生物而不引起强烈的免疫反应，从而导致病毒对宿主具有较高的毒性。因此，在一些实施例中，在给对象施用CAVES/病毒后不久针对病毒抗原的高抗体滴度可指示病毒的低毒。
在其它实例中，监测抗体滴度可用于监测治疗方法的疗效。在本文提供的方法中，抗体滴度，例如抗(肿瘤抗原)抗体滴度，可指示治疗方法，例如治疗肿瘤疾病的治疗方法的疗效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答。因此，通过监测抗(肿瘤抗原)抗体滴度，可监测治疗方法在引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答方面的效力。
本文提供的治疗方法还可包括给对象施用可积聚在肿瘤中并可引起或增强抗病毒或抗细胞载体/抗CAVES免疫应答的CAVES。因此，可监测宿主针对肿瘤或转移中积累的病毒或CAVES进行免疫应答的能力，这可指示对象也进行了抗肿瘤免疫应答，或者可指示对象很可能进行抗肿瘤免疫应答，或者可指示对象能够进行抗肿瘤免疫应答。
本文提供的方法还可包括监测对象的健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括肿瘤疾病治疗方法。监测对象的健康可用于确定治疗方法的疗效，如本领域已知的。本文提供的方法还可包括如本文提供的向对象施用CAVES的步骤。监测对象的健康可用于确定给对象施用时CAVES中的病毒的致病性。如本领域已知的，可监测用于监测疾病如肿瘤疾病、传染病或免疫相关疾病的各种健康诊断方法中的任何一种。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、颜色、温度或其它可观察的状态可指示对象的健康状况。此外，来自对象的样本中一种或多种成分的存在或不存在或水平可指示对象的健康状况。典型的样品可包括血液和尿液样品，其中一种或多种组分的存在或不存在或水平可通过执行例如血液板或尿液板诊断测试来确定。指示对象健康的示例性成分包括但不限于白细胞计数、红细胞压积或反应蛋白浓度。
H.待治疗的癌症类型
本文提供的系统(CAVES)和方法可用于治疗任何类型的癌症或转移，包括实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤。可通过本文公开的方法治疗的肿瘤包括，但不限于膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肥大细胞瘤、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
在一些实施方案中，肿瘤选自转移性黑色素瘤；食管胃腺癌；胆管癌(任何阶段)；胰腺癌(任何阶段)；胆囊癌(任何阶段)；高级别粘液性阑尾癌(任何阶段)；高级别胃肠道神经内分泌癌(任意阶段)；间皮瘤(任何阶段)；软组织肉瘤；前列腺癌；肾细胞癌；肺小细胞癌；肺非小细胞癌；头颈部鳞状细胞癌；结直肠癌；卵巢癌；肝细胞癌；和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。
I.实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并非旨在限制主题的范围。
实施例1
痘苗病毒具有肿瘤选择性，可作为骨架表达携带治疗性基因的重组病毒
本实施例证明CAL1病毒是通过扩增ACAM2000获得的痘苗病毒，是肿瘤选择性的，并且可用于工程化表达治疗基因的重组病毒。
材料和方法
(1)病毒和细胞培养
根据先前描述的使用CV-1细胞的方法(Monath et al.，Int.J.of Infect.Dis.8(2004))，从ACAM2000扩增CAL1。CAL2，其在基因间位点插入了TurboFP635，如下面实施例8所述从CAL1进行基因工程化。PC3、DU145、E006AA和HPrEC细胞购自ATCC(Manassas，VA)。将PC3细胞维持在补充10％胎牛血清(FBS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Thermo Fisher Scientifice，Waltham，MA)中。将DU145细胞维持在补充有2mM L-谷氨酰胺和10％FBS的低糖Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM)中。将E006AA细胞维持在补充有10％FBS的DMEM中。通过加入前列腺上皮细胞生长试剂盒，将HPrEC细胞维持在补充有6mM L-谷氨酰胺、0.4％提取物P、1.0μM肾上腺素、0.5ng/ml rh TGF-a、100ng/ml氢化可的松、5μg/ml rh胰岛素和5μg/ml载脂蛋白转铁蛋白的前列腺上皮细胞基础培养基中。将CV-1细胞维持在补充有1％抗生素溶液(Life Technologies，Carlsbad，CA)，2mM L-谷氨酰胺和10％热灭活FBS的高糖DMEM中。使细胞在37℃、5％CO2和加湿气氛的培养箱中生长。
(2)病毒扩增试验
将细胞以90-100％的汇合度在含2％FBS的0.5mL适当培养基中接种在24孔培养皿中。接种后4-5小时，用MOIs 0.01和0.1的CAL1一式两份同时感染细胞。在感染后24小时，通过用1毫升注射器的橡胶头刮取每个细胞系的两孔和感染细胞样品的MOI，转移到1.5毫升试管中，并在-20℃下保存直到通过空斑测定进行分析。在48、72和96小时对皿重复同样的步骤。在进行斑块分析之前，样品被冷冻-解冻三次。
(3)空斑试验
在检测前一天将CV-1细胞以2×105个细胞/孔的速度接种于24孔板中。样品在补充有2％胎牛血清(FCS)(DMEM2)的Dulbecco改良Eagle's培养基中按1：10连续稀释，每种稀释液200微升或仅DMEM2以双份等分入孔中。培养1-2小时后，向每个孔中加入1毫升羧甲基纤维素覆盖培养基，在37℃和5％CO2条件下孵育平板48±6小时。用结晶紫染色细胞1-4小时。染色完成后，吸出染色液；用1毫升水洗涤孔2次持续1分钟并风干。如果需要，通过肉眼或通过显微镜评价对斑块进行定量。
(4)异种人前列腺肿瘤模型系统的CAL 1
取4-6周龄无胸腺裸鼠右侧皮下接种2.5×106个PC3细胞。当肿瘤达到约150mm3的平均体积(100-200mm3)时，根据肿瘤尺寸将小鼠随机分组，并分层为1×106或1×107PFU的CAL1或仅PBS的治疗组(n＝10/组)。治疗在肿瘤内进行，在14天内每周测量肿瘤大小两次。在第15天，处死动物，收集组织样品(例如血液、肿瘤、肾脏、肝、肺、肠、前列腺、睾丸、膀胱、脾脏、脑和心脏)，并在液氮中低温保存之前将样品与蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM MiniProtease Inhibitor Cocktail(Catalog#11836153001Roche)，Millipore Sigma，Burlington，MA)混合。
(5)生物分布分析
冻存保存的样品在37℃水浴中解冻，剧烈涡旋使组织样品破碎。在以下分析中使用来自每个治疗剂量(1×106或1×107PFU的CAL1)的5只动物和3只模拟治疗的动物(阴性对照)的样品。所有样品通过如上所述的空斑测定进行分析。还根据Qiagen(Germantown，MD)的DNeasy血液和组织试剂盒方案制备用于qPCR的样品。使用DNA定量试剂盒，荧光测定法测定样品DNA浓度(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。制备的样品用于下面的qPCR分析。
(6)实时半定量PCR
用
Figure BDA0003148729980000821
仪(Roche，Penzberg，Germany)进行实时半定量PCR(qPCR)分析制备的PC3肿瘤异种移植物样本。Roche诊断SYBR Green kit的手册适用于与PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)一起使用。用含有VACV的A56R基因的参考质粒在不同设置下进行PCR反应，确定最佳设置，该参考质粒具有已知的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。除定量外，在每次运行结束时进行熔解曲线分析，以区分模板扩增、基质效应或非特异性反应。从组织样本中提取等量的DNA用于反应。所有实验反应一式两份。
将含有ACAM2000单拷贝A56R ORF的pUC57质粒用作阳性对照，以产生qPCR测定的标准曲线。用A56R引物扩增cDNA片段：
5'-CATCATCTGGAATTGTCACTACTAAA-3'(SEQ ID NO：91)和
5'-ACGGCCGACAATATAATTAATTAATGC-3'(SEQ ID NO：92)
根据操作手册(Roche，Penzberg，Germany)所述，使用
Figure BDA0003148729980000822
数据分析软件3.45版进行定量。
(7)指导RNA
使用在线软件(dna20.com/ecommerce/cas9/input)分析指导RNA(gRNA)靶序列(5'-CGAGGAAAAGCTGTAGTTAT-3'；SEQ ID NO：95；gRNA1的靶序列如SEQ ID NO：1)(靶基因间位点：在ORF-157和ORF-158之间)。在对嘌呤霉素具有抗生素抗性的慢病毒载体(VectorBuilder，Shenandoah，TX)中，在U6启动子的控制下构建gRNA。
(8)供体载体
供体载体的构建在实施例8中描述。根据ACAM2000基因组序列(GeneBank：AY313847)，选择ORF_157和ORF_158基因间位点的右侧(555bp)和左侧(642bp)的同源区(HR)。在每个HR的两端添加多个克隆位点，以允许插入目的治疗基因。TurboFP635的两侧是痘苗病毒早-晚期启动子(pEL)和痘苗病毒终止信号。合成三个构建的片段(HR-left、TurboFP635和HR-right)(GeneWiz，San Diego，CA)并使用
Figure BDA0003148729980000831
克隆试剂盒(TakaraBio USA，Mountain View，CA)克隆到pUC18载体中。供体质粒经Sanger测序(Retrogen，SanDiego，CA)确认。
(9)Cas9HFc载体
通过Vector Builder(Shenandoah，TX)(Kleinstiver et al.，Nature 529：490-495(2016))合成含有无核定位的Cas9HF1序列的质粒。
(10)转染与病毒感染
在转染前一天将2×106个CV-1细胞接种在6孔板中。使用6μL的TurboFectin 8.0转染试剂(Origene Technologies，Rockville，MD)和250μL的opti-DMEM(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)分别用1μg编码Cas9HFc和gRNA的质粒转染60-70％汇合度的细胞。转染后24小时，在添加2％FBS的高糖DMEM中，以0.02的MOI用CAL1 VACV感染细胞。病毒感染后2小时，用PBS洗涤细胞。将1.5mL DMEM加入孔中，将平板在37℃与CO2孵育30分钟，然后用2μg上述供体载体转染。细胞在37℃、5％CO2和加湿气氛中孵育24小时。收集感染/转染细胞的混合物，在-80℃下保存，直到病毒纯化和筛选。
(11)病毒纯化
将感染/转染细胞的混合物解冻，然后以最大强度超声处理30秒，在冰上/冰上三次，从细胞中释放病毒。用每板2μL释放的病毒感染6孔板中的4个汇合的CV-1细胞层。感染后2天，在2X荧光显微镜下检出4-6个阳性(红色)斑块，并转移到含有200微升无血清DMEM的冷冻小瓶中。纯化过程重复2-4次，得到纯克隆。
(12)PCR
如下面实施例8所述，确认转基因的插入。为证实转基因(TurboFP635)在基因间位点的插入，工程化改造引物对以扩增整个基因间区，其中：
反向5'-GACGAAGAAGCAAGAGATTGTGT-3'(SEQ ID NO：41)；和
正向5'-ACCGTTTCCATACCGCCA-3'(SEQ ID NO：42)引物位于HR的左右两侧。
纯化克隆的PCR产物通过Sanger测序(Retrogen，San Diego，CA)进行分析。
结果
(1)CAL1序列
用CV-1细胞扩增原克隆疫苗ACAM2000；得到的衍生物被命名为CAL1。下一代测序(NGS)用于确定CAL1和亲本ACAM2000疫苗之间是否存在遗传差异。结果表明，与已发表的ACAM2000序列(SEQ ID NO：70)相比，GBAY313847，CAL1(SEQ ID NO：71)i)在CAL1基因组32位的反向末端重复序列(ITR)的非编码区具有单核苷酸多态性(SNP)，ii)在左侧ITR中缩短了6bps，iii)在右侧ITR中缩短了197bps。
(2)CAL1的肿瘤选择性
使用前列腺癌来源的人肿瘤细胞系PC3、DU145和E006AA以及非肿瘤人原代前列腺上皮细胞系HPREC来测量CAL1病毒的扩增，作为比较。将用于制造CAL1的非洲绿猴肾细胞株CV-1作为阳性对照。简而言之，在0.01和0.1的MOI下用CAL1感染细胞。在24、48、72和96小时用空斑法检测细胞系中活病毒颗粒的扩增。96小时后，在肿瘤细胞(例如PC3、DU145和E006AA)和非肿瘤细胞(例如HPrEC)之间比较和分析感染细胞中的病毒扩增。分析表明，与非肿瘤细胞系相比，所有人类肿瘤细胞系在MOI和所有测试时间都显示出更高的病毒扩增。人肿瘤细胞系E006AA显示CAL1的病毒扩增率最高。PC3和DU145肿瘤细胞表现出相似的病毒扩增水平，PC3细胞中的扩增略高于DU145(不到2倍)。非肿瘤HPrEC细胞显示CAL1的扩增量最少：约比DU145细胞少5-10倍，约比E006AA细胞少50倍。这些结果表明，与来自同一组织的原代(非肿瘤)细胞相比，肿瘤来源的细胞系中CAL1的优先扩增。
(3)瘤内施用CAL 1诱导肿瘤消退
利用异种人前列腺肿瘤模型系统分析了CAL1的抗癌治疗潜力。简单地说，前列腺肿瘤是通过将2×106侵袭转移的人前列腺癌PC3细胞皮下注射到4-6周龄无胸腺裸鼠右侧皮下而产生的。当肿瘤体积测量为平均约150mm3(注射PC3细胞后15天；治疗第0天)时，将小鼠瘤内注射1×106或1×107PFU的CAL1，或作为对照，PBS(n＝10/治疗)。注射后，在实验期间(直到治疗后第15天)每周测量两次肿瘤体积。结果表明，单次瘤内注射CAL1诱导了对人PC3肿瘤生长的显著抑制：在第15天，对照肿瘤大小测量到约1450mm3，相对于用1×106PFU的CAL1的肿瘤大小约800mm3，和用1×107PFU的CAL1的肿瘤大小约550mm3。尽管动物的免疫功能受损，但治疗效果与治疗相关死亡率或安全性受损无关。
(4)CAL1瘤内注射不引起全身性病毒血症
分析CAL1的生物分布和病毒扩增潜力，确定其肿瘤选择性，评估其对正常组织是否有负面影响。治疗后15天处死上述裸鼠。每只动物采集12个组织样本(血液、肿瘤、脑、心、肾脏、肝、肺、肠、膀胱、前列腺、睾丸)并在液氮中低温保存。用空斑试验和实时半定量PCR(qPCR)检测样本。用1×106或1×107PFU的CAL1处理的动物(每剂量n＝5)分析病毒DNA或感染性颗粒的存在，并用未处理的动物作为阴性对照(n＝3)。分析显示，与正常组织相比，所有感染的动物经CAL1处理后的PC3肿瘤中有大量的病毒。具体而言，空斑测定显示活的病毒颗粒，而qPCR分析显示在治疗的PC3肿瘤中有高水平的病毒DNA。肿瘤组织中的病毒量显著高于任何其它测试的组织或器官(治疗的PC3肿瘤中104-105pfu/mg病毒，相对于正常组织中的0-300pfu/mg病毒；相对于正常组织样本中的背景水平，每个PC3肿瘤样本的病毒DNA拷贝数为106-108个)，表明瘤内施用后CAL1具有可接受的安全性。
(5)CAL1基因工程病毒株增加的治疗潜力
利用具有高保真胞质Cas9蛋白的CRISPR/Cas9系统(Kleinstiver，B.P.，et al.，High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-targeteffects.Nature 529(7587)：490-495(2016)；见实施例8)工程化改造重组病毒，其中在ORF_157和ORF_158之间的基因间区域发现的92bp片段被TurboFP635取代。PCR和Sanger测序证实了TurboFP635在重组病毒中的插入，并命名为CAL2。此外，来自CV-1转染细胞的克隆的显微镜分析显示TurboFP635成功地插入到工程化的CAL2重组VACV中。
通过以0.01或0.1的MOI同步感染细胞，在感染后24、48、72和96小时收集样品，冷冻/解冻样品，感染CV-1细胞1-2小时，并定量CV-1细胞上的斑块，比较前列腺癌来源的人肿瘤细胞系PC3、DU145和E006AA和非肿瘤人原代前列腺上皮细胞系HPrEC中CAL1和CAL2的病毒扩增。将用于制备CAL2的CV-1细胞作为阳性对照。人肿瘤细胞系对CAL1和CAL2都表现出非常高的病毒扩增，每个细胞的空斑形成单位水平大于10。在所测试的所有三种人类肿瘤细胞系中，基于用于感染的MOI没有观察到病毒扩增的显著差异。与所检测的人肿瘤细胞系相比，HPrEC显示CAL1和CAL2的病毒扩增最小。结果表明，在ORF_157和ORF_158之间的基因间位点引入外源基因(例如示例性的TurboFP635)不损害CAL1病毒的天然肿瘤选择性；与来源于同一来源组织的非肿瘤原代细胞相比，CAL1和CAL2在肿瘤细胞中表现出类似的优先扩增。结果表明，CAL 1可作为改造携带治疗性基因的重组病毒的骨架。
实施例2
人血清和犬血清对痘苗病毒的灭活作用
在体内给人和动物施用溶瘤病毒，例如痘苗病毒(VACV或VV)后，补体系统和在具有预先存在的免疫力的患者的情况下，中和抗体灭活施用的病毒，并产生对病毒治疗的免疫屏障。如下文所示，此类屏障存在于人类和犬类血清中，尽管屏障的大小因物种而异。
A.用于测定痘苗病毒灭活的病毒空斑试验(VPA)
用病毒空斑试验(VPA)测定了痘苗病毒在血清存在下的灭活情况。VPA用于测量样本中病毒滴度或病毒浓度。例如，VPA可用于定量不同条件下的病毒颗粒扩增，例如，比较病毒暴露于血清后的活病毒恢复与未与血清孵育的对照条件。
含有病毒的样品在-80℃下保存，并进行三次冷冻(-80℃)/解冻(+37℃)循环，然后在冰水上超声处理3次，间隔1分钟。超声处理的样品在痘苗病毒感染培养基(补充有2％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM)中连续稀释。空斑试验在24孔板中进行，在两个孔中进行。简而言之，将200,000个CV-1猴肾细胞接种在每孔1毫升D10培养基中过夜。抽吸上清液，将含病毒样品的10倍连续稀释液以200μL/孔施加到CV-1单层上。平板在37℃(培养箱)下培养1h，每隔20分钟手动摇动一次。将1mL CMC培养基平缓地层压在细胞顶部，并将平板温育48h。CMC覆盖培养基是通过高压灭菌15g羧甲基纤维素钠盐(Sigma-Aldrich，C4888)并在RT下搅拌过夜再悬浮于1升补充有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和5％FBS，并在4℃下短期储存而制备的DMEM中。通过用结晶紫溶液(1.3％结晶紫(Sigma-Aldrich，C6158)、5％乙醇(纯乙醇，分子生物学级，VWR，71006-012)、30％甲醛(37％v/v甲醛，Fisher，cat#F79-9)和双蒸馏水)在室温下覆盖孔，固定细胞后计数斑块，然后在自来水中洗涤板并干燥过夜。病毒滴度以每个样本的空斑形成单位(PFU)计算。
B.人血清灭活痘苗病毒为基础的癌症疫苗
为评价补体和中和抗体在人体内对VACV的灭活作用，将来自健康的、未接种疫苗的供体(h1)的人血清和来自健康的、接种疫苗的供体(h2)的人血清与临床相关剂量的空斑纯化的VACV野生型胸腺嘧啶核苷激酶(TK)阳性惠氏株ACAM2000孵育。来自h1的血清只含有补体，而来自h2的血清含有补体和中和抗体，这是因为供体以前曾用痘苗病毒接种过天花疫苗。
简而言之，将1×103个空斑形成单位(pfu)的VACV与100μL含90％供体h1或h2人血清的DMEM培养基在37℃孵育1小时。这一浓度对应于临床相关的病毒剂量为5×107pfu，当静脉注射到体重75公斤、血液5升的成人体内时。单独使用DMEM培养基(不含血清)作为对照。为评估补体在血清介导的病毒灭活中的具体作用，还将VACV与来自供体h1和h2的热灭活血清孵育，其中补体变性/无功能。
在与血清孵育1小时后，通过进行如上所述的空斑测定并比较与未与血清孵育病毒的对照相比，在CV-1细胞单层中与血清孵育病毒时获得的PFU的量，记录与对照(未与血清孵育的病毒)相比回收的活病毒的百分比。进行连续稀释，以使空斑测定中任何给定稀释液中存在少于3％的人血清。结果如下表X1所示：
表X1.人血清对VACV的灭活作用
条件 相对于未经血清处理的病毒的回收PFU％
对照(DMEM，无血清) 100
病毒+h1血清 4
病毒+热灭活h1血清 69
病毒+h2血清 0
病毒+热灭活h2血清 11
结果表明，来自非接种(h1)和接种(h2)供体的人血清灭活VACV株ACAM2000。这表明人血清对治疗效果具有显著的屏障作用，特别是当溶瘤病毒静脉施用时(I.V.)或肿瘤内(I.T.)。免疫供体h2的血清除补体外还含有中和抗体，比不含中和抗体的h1的血清更能灭活VACV。
热灭活h1和h2血清使补体蛋白变性并破坏补体活性，与未热灭活的h1和h2血清相比，病毒灭活程度显著降低。这证实了补体系统在血清诱导的病毒灭活中起作用。对不含中和抗体的h1血清进行热灭活后，活的VACV回收百分率高于非热灭活的h1血清中的VACV回收百分率。与此相反，热灭活来自接种过疫苗的供体h2的含补体和中和抗体的血清，只导致回收的活VACV略有增加。因此，除了补体之外，中和抗体和/或其它血清成分的存在也在血清诱导的VACV灭活中起作用。
这些结果表明VACV在体内施用后被人血清灭活，表明需要保护VACV的系统以提供或增强溶瘤病毒的递送和治疗的效力。
C.犬血清灭活痘苗病毒为基础的癌症疫苗
与在人类身上看到的效果相似，病毒疫苗注射到犬类体内会遇到最初的免疫屏障，从而降低传递和治疗的效力。为研究血清对犬VACV灭活的影响，将编码荧光蛋白TurboFP635的基因工程VACV LIVP株L14或CAL14与来自三种不同犬的血清样品孵育。
将1×103pfu的CAL14与100μL含90％三种不同供体(c1、c2和c3)犬血清的DMEM在37℃孵育1小时。这一浓度相当于静脉注射2×107pfu的VACV到一只体重25公斤、血液2升的犬体内。用来自供体h1和h2的人血清孵育的病毒(上文讨论)作为阳性对照，单独用DMEM培养基孵育的病毒(无血清)作为阴性对照。为分析补体在血清介导的病毒灭活中的作用，还将CAL14与犬和人供体的热灭活血清孵育。孵育1小时后，与对照(无血清孵育的病毒)相比，使用如上所述的空斑测定法记录活病毒回收的百分比。结果如下表X2所示：
表X2.犬血清对VACV的灭活作用
样品 相对于未经血清处理的病毒的回收PFU％
对照(DMEM，无血清) 100
病毒+h1血清 4
病毒+热灭活h1血清 69
病毒+h2血清 0
病毒+热灭活h2血清 11
病毒+c1血清 15
病毒+热灭活c1血清 55
病毒+c2血清 20
病毒+热灭活c2血清 39
病毒+c3血清 38
病毒+热灭活c3血清 42
与非血清对照(DMEM+CAL14病毒)相比，在所有人和犬血清样品中，血清孵育后活病毒恢复率降低。这些结果表明人和犬血清灭活了CAL14痘苗病毒。所有血清样品的热灭活降低了病毒灭活的程度，表明补体系统在血清介导的病毒灭活中起作用，如犬类和人类的实例。犬血清在体内病毒施用(I.V.或I.T.)后首先灭活VACV，这表明需要保护VACV的系统，以提高犬患者和人类患者的递送和治疗效力。
实施例3
人和犬间充质干细胞对人和犬血清诱导的痘苗病毒灭活的保护作用
在体内施用的溶瘤病毒最初被血清灭活是溶瘤病毒治疗的障碍。通过增加病毒的注射剂量和/或通过用补体抑制剂对患者进行系统治疗，此类失活部分地可部分地补偿或解决。然而，这些方法可能导致不良的副作用和毒性。
溶瘤病毒可通过将其输送到载体细胞如间充质干细胞(MSC)中来抵抗补体和其它存在于血液或肿瘤微环境中的灭活剂。人基质血管分数(SVF)来源于全脂抽吸物，含有外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC)和其它群体，在培养过程中可扩增和生成脂肪来源的间充质基质细胞和/或干细胞(AD-MSC)，可用作痘苗和其它病毒的载体细胞来源。用新鲜SVF和AD-MSC作为细胞载体保护VACV免受血清诱导的灭活，在人和犬体内进行了评估。
A.SVF的制备
从全脂抽吸物中提取的SVF减轻了对细胞进行大量处理的需要，并使步骤数最小化，从而降低了污染的风险。SVF含有来自脂肪组织的单个核细胞，通过一个简单的分离程序获得，其中脂肪被脂抽吸并进行酶消化。人SVF包含几种不同的细胞群，包括CD34+SA-ASC，它可附着在细胞培养塑料上并增殖(产生AD-MSC，下文讨论)。鉴于SVF制剂中MSC SA-ASC(AD-MSC前体)的丰度，SVF可用于提供溶瘤病毒如痘苗病毒的细胞载体。
为分离和制备脂肪细胞和脂肪基质血管成分，使用以下方法。局部麻醉，含有0.5％利多卡因与1：400,000肾上腺素和8.4％HCO3，滴定至pH值7.4(通常在60cc的总体积中5cc的HCO3)。对要去除脂肪的对象给予局部麻醉。然后，对象使用细胞采集、封闭系统采集和处理系统进行抽脂手术，该系统以商标Time
Figure BDA0003148729980000871
出售自Cell Surgical
Figure BDA0003148729980000872
(CSN；Beverly Hills，Ca.)。这个系统包括一个脂肪处理单元(一个用于抽脂的密闭注射器)和一个2.5-3毫米的套管。抽脂后，用杆菌肽软膏和
Figure BDA0003148729980000873
绷带包扎伤口，并用压缩绷带包扎。
根据以下方案在封闭系统中制备含有脂肪源干细胞(ADSCs)的基质血管成分(SVF)：
a.用于收获和处理脂肪干细胞的封闭系统，如CSN Time
Figure BDA0003148729980000874
将收获的脂肪提取到60cc的TP-101注射器(一次性使用无菌气密脂肪处理注射器)中
b.以2800rpm离心3分钟
c.通过TP-109密闭系统去除游离脂肪酸和碎片(局部/血液)
d.将25cc冷凝脂肪转移到TP-102注射器(SVF处理注射器)
e.加入预先加热(38℃)25cc罗氏
Figure BDA0003148729980000875
Time Machine加速器(GMP级胶原酶)，含有12.5Wunsch单位的酶(1Wunsch单位＝1000胶原降解单位(CDU))
f.在38℃下孵育30-45分钟
g.200g离心4分钟
h.除去底部3-10cc以外的上清液
i.加入50cc D5LR(乳酸林格氏液和5％葡萄糖)作为洗涤液，除去胶原酶残留物，在200g下离心4分钟
j.再重复2次，共洗涤3次
k.除去所有上清液，留下3-10cc的颗粒收集-这是基质血管成分
l.通过100微米过滤器将SVF转移到标记的20cc注射器上
m.收集SVF样本并鉴定细胞数量、存活能力，并确认无团块或碎片。
n.将细胞再悬浮于10mLDhanLR中，并将等分试样以1：6稀释于补充有血小板提取物的转运培养基中。
B.AD-MSC的制备
培养物中未经分选的SVF细胞可用于产生MSC。CD34+SA-ASC迅速附着于细胞培养物，一旦活化，迅速增殖，生成AD-MSC。将SVF细胞置于含有2mM谷氨酰胺和5％刺激物(血小板提取物)的组织培养塑料中，在37℃、5％CO2和增湿气氛中培养，获得AD-MSC。SA-ASC和其它MSC前体附着在组织培养处理的塑料上，第二天，所有未附着的细胞被移除。
抽吸培养液，用完整的培养液洗涤贴附在组织培养塑料上的MSC一次。然后加入新鲜完整的培养基，如上所述，并将MSC在37℃，5％CO2和加湿气氛中进一步培养1-2周。2-3天后，贴附的细胞获得间充质表型，现在称为AD-MSC，细胞开始指数增殖。1-2周后，产生第0代培养物。而这些脂肪又来源于20-100毫升的脂肪(脂肪组织)，这些脂肪是从小型脂肪抽吸中获得的。产生的细胞总数取决于患者，并且基于最初投入培养物中的SVF细胞的量而变化，但当以2-10毫升SVF制剂开始时，典型地在1×106-1×108个细胞范围内，所述SVF制剂又源自从微型脂肪抽吸获得的20-100毫升脂肪组织。细胞可进一步生长，达到1×1010-1×1014个细胞。
C.人SVF作为载体细胞保护病毒对抗人血清失活并促进向肿瘤细胞的递送
检测新鲜人SVF细胞(SVF)对人血清灭活VACV的保护作用，以及将保护的VACV传递给肿瘤细胞的能力。将CAL14痘苗病毒添加到来自两个不同健康供体(#1和#2)的新鲜分离的SVF细胞中，感染复数(MOI)为1，同时考虑SVF制剂中存在的所有细胞。细胞和病毒在37℃下孵育1小时，以20RPM连续旋转。然后将SVF/病毒混合物与补充有2mM谷氨酰胺和20％人血清的DMEM在37℃水浴中自体培养30分钟，然后用PBS洗涤细胞4次以除去任何游离病毒。将游离病毒(未负载到细胞上)以相同浓度与人血清孵育30分钟作为对照。未与血清孵育的游离病毒作为阳性对照。
在与人血清孵育后，将40,000pfu游离CAL14病毒或40,000pfu负载到40,000SVF细胞上的CAL14病毒(MOI 1)加入24孔板中的A549人肺癌细胞单层，MOI为0.1，在37℃、5％CO2的加湿气氛中孵育24小时。处理后24h，在KEYENCE All-in-one BZ-X700系列荧光显微镜上用荧光显微镜检测病毒编码TurboFP635蛋白在A549细胞中的表达，用红色滤光片检测TurboFP635蛋白表达(TRITC通道)；表达水平被用作病毒在肿瘤细胞中扩增量的直接测量。
24小时后A549癌细胞中病毒感染和扩增的相对水平：SVF的保护作用
对照 人血清#BH057 人血清#BH058
游离病毒 100.00％ 8.71％ 18.03％
SVF-BH057/VV 62.70％ 60.86％ n/a
SVF-BH058/VV 57.96％ n/a 46.42％
结果表明，游离病毒被两个供体的人血清灭活，在肿瘤细胞中不能扩增，检测到的荧光减少为证据。另一方面，负载到SVF细胞上的痘苗病毒被保护免受血清失活并有效地输送到肿瘤细胞中，在肿瘤细胞中通过观察由CAL14病毒编码的TurboFP635荧光蛋白的表达来检测病毒复制。未与血清孵育的游离病毒(阳性对照)在肿瘤细胞中显示出强有力的病毒扩增，证实在游离病毒+血清样品中观察到的荧光降低是由于病毒被血清灭活，而不是因为游离病毒未被传送到肿瘤细胞或未能在肿瘤细胞中复制。
因此，从吸脂术中获得的SVF含有大量的间充质干细胞前体，可携带病毒，保护病毒不被人血清中和/灭活，并将其高效地传递给靶肿瘤细胞。
D.人AD-MSC细胞对人血清灭活痘苗病毒的保护作用及对肿瘤细胞的递送作用
体外培养的人AD-MSC细胞对人血清灭活VACV的保护作用和将病毒传给肿瘤细胞的能力进行了评价。将CAL14 VV与来自健康人供体的AD-MSC细胞在MOI为1的条件下混合，并在37℃下孵育1小时，以20RPM连续旋转。然后将AD-MSC/病毒混合物与来自健康供体的20％血清在异体环境中孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞4次以除去任何游离病毒。游离病毒以相同浓度与人血清孵育30分钟作为对照，未与血清孵育的游离病毒作为阳性对照。
在人血清孵育后，将不同处理(游离病毒或MSC/VV)加入24孔板的A549肿瘤细胞单层中。将40,000pfu游离CAL14病毒或40,000pfu负载到40,000AD-MSC细胞上的CAL14病毒(MOI 1)加入24孔板中的A549人肺癌细胞单层中，MOI为0.1，在37℃、5％CO2加湿气氛中孵育24小时。处理后24h，在KEYENCE All-in-one BZ-X700系列荧光显微镜上用荧光显微镜检测病毒编码TurboFP635蛋白在A549细胞中的表达，用红色滤光片检测TurboFP635蛋白表达(TRITC通道)；表达水平被用作病毒在肿瘤细胞中扩增量的直接测量。
A549癌细胞24h后病毒感染和扩增的相对水平：AD-MSC的保护作用
Figure BDA0003148729980000891
结果表明，游离病毒被两种供体的人血清灭活，在肿瘤细胞中不能扩增，检测到的荧光显着降低。比较而言，负载在AD-MSC细胞上的痘苗病毒可防止血清失活并有效地传递到肿瘤细胞中，在肿瘤细胞中通过观察由CAL14病毒编码的TurboFP635荧光蛋白的表达来检测病毒复制。未与血清孵育的游离病毒(阳性对照)在肿瘤细胞中显示出强有力的病毒扩增，证实在游离病毒+血清样品中观察到的荧光降低是由于病毒被血清灭活，而不是因为游离病毒未被传送到肿瘤细胞或未能在肿瘤细胞中复制。
因此，培养的AD-MSC可携带病毒，保护其不被人血清中和/灭活，并将其高效地传递给靶肿瘤细胞。
E.犬AD-MSC对犬血清灭活痘苗病毒的保护作用
与人类一样，血清对痘苗病毒成功传递到犬肿瘤的负面影响可通过增加注射剂量或通过对动物进行系统的补体抑制剂治疗来减少，这可能导致不希望的和有毒的副作用。从而评价了培养的犬MSC携带和保护痘苗病毒对抗血清灭活的能力。
将CAL14痘苗病毒以1的MOI添加到来自两种不同犬供体(MSC3和MSC4)的脂肪来源的MSC(AD-MSC)中，混合物在37℃下孵育1小时，以20RPM连续旋转。然后在1,000个细胞中装载1,000pfu痘苗病毒的MSC与90％犬血清在添加DMEM的培养基中在37℃、5％CO2的加湿气氛中孵育1小时，最终体积为100μL(每1,000个细胞)。这一浓度相当于2×107pfu的痘苗病毒剂量，用2升血液注射到一只25公斤重的犬体内。作为比较，在相同条件下，将1,000pfu的游离CAL14病毒(未保护)与90％的犬血清孵育。作为对照，病毒负载的MSC和游离病毒分别与无血清DMEM在相同条件下孵育1小时。在1小时潜伏期后，通过在CV-1细胞单层中的空斑测定，在pfu中定量相对于非血清游离病毒对照的回收痘苗病毒的百分比，如上所述。在斑块分析中进行连续稀释，使任何给定稀释度的犬血清少于3％。每个活的感染细胞产生1个空斑，每个活的游离痘苗病毒颗粒形成1个空斑。结果如下表X3所示：
表X3.骨髓间充质干细胞对犬血清活化VACV的保护作用
Figure BDA0003148729980000892
Figure BDA0003148729980000901
结果表明，在无血清(以无血清DMEM为对照)的情况下，游离病毒和载MSC病毒均未灭活。然而，在犬血清存在下，游离的、未保护的病毒被显著灭活，而在与血清孵育之前将病毒负载到MSC上提供了对病毒的保护。这些结果表明，脂肪来源的犬MSC可隐藏和保护痘苗病毒对抗犬血清诱导的灭活。
F.犬AD-MSC可增强痘苗病毒对肿瘤细胞的转移
在证明培养的犬MSC能隐藏和保护痘苗病毒对抗血清诱导的灭活后，评价了MSC将保护病毒传递给肿瘤细胞的能力。将CAL14痘苗病毒负载到来自三种不同犬(MSC1、MSC2和MSC3)的犬脂肪来源的MSC(AD-MSC)上，MOI为1，并如上所述与90％犬血清孵育1小时。游离痘苗病毒(未保护)与犬血清在相同条件下孵育。在与血清孵育后，以0.5的MOI将病毒负载的细胞或游离病毒加入到A549肿瘤细胞单层中。含A549孔中的最终血清浓度为2％。作为对照，每种痘苗病毒处理在无血清DMEM中孵育。在与肿瘤细胞孵育72小时后，如上所述，通过CV-1细胞单层中的空斑测定来定量由肿瘤细胞扩增的痘苗病毒的量。结果如下表XX所示：
表XX治疗后72小时从肿瘤细胞中回收的病毒百分比
Figure BDA0003148729980000902
结果表明，预暴露于犬血清的游离痘苗病毒(未被MSC保护)处理的肿瘤细胞相对于未预暴露于血清的游离痘苗病毒表现出较低的病毒扩增率。这些结果证实了犬血清对病毒的初步灭活作用。另一方面，用负载痘苗病毒的3种犬MSC中的任何一种处理并预先暴露于犬血清的肿瘤细胞显示出有效的痘苗病毒扩增，其结果与未灭活的游离病毒(用DMEM和无血清孵育的对照)相当。这些结果表明，培养的犬MSC可用来保护痘苗病毒对抗血清失活，并高效地将其传递给肿瘤细胞。
实施例4
与ACAM2000递送和扩增相关的SVF细胞群
为表征SVF为基础的痘苗病毒递送系统，检测了SVF中携带病毒并将病毒递送到肿瘤细胞的特定细胞群。
A.携带ACAM2000的SFV细胞群
三种不同的人非癌供体(RMSD042、BHSD060和RMSD043)的SVF与ACAM2000在37℃、MOI为1的条件下以20RPM连续孵育1小时。用ACAM2000负载SVF细胞后，用针对CD235a、CD45、CD34、CD31和CD146中每一种的一组抗体标记细胞，并用碘化丙啶(PI)染色观察活性。然后使用FACSAriaTMFusion流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)根据细胞表面标记CD235a、CD45、CD34、CD31和CD146的表达，并遵循国际脂肪治疗和科学联合会(IFATS)和国际细胞治疗学会(ISCT)的建议(Bourin et al.(2013)Cytotherapy 15：641-648)通过流式细胞术对SVF细胞进行分类。只对活细胞(碘化丙啶(PI)阴性)进行分选。鉴定和分类出7个不同的细胞群：红细胞(CD235a+)；外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235A-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)，是培养中MSC的主要前体；周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)，在培养中也是MSC前体；粒细胞(CD235a-/CD45中等/高，侧向散射(SSC)高)；淋巴细胞(CD235a-/CD45高，SSC低)；单核细胞(CD235a-/CD45高，SSC中)；和内皮祖细胞(CD235a-/CD45-/CD34+/CD146+/CD31+)。三个SVF样品中主要细胞群的组成(％)如表X4所示。三个SVF样本中的主要单个核细胞群，以及每个单个核细胞群的百分比，如表X5所示。
表X4.三种供体SVF中主要细胞群的组成
Figure BDA0003148729980000911
表X5.三种供者SVF中主要单个核细胞群的组成
Figure BDA0003148729980000912
然后将来自SVF的分选的单个细胞群体接种在A549肿瘤细胞单层的顶部，并与羧甲基纤维素(CMC)层孵育3天，这允许量化分选的感染细胞形成的斑块。孵育3天后，在用结晶紫固定和染色后测量A549单层中形成的空斑数，以确定来自每个分类群体的携带ACAM2000的细胞数。如下表X6所示，通过流式细胞术对5个不同的细胞群体进行分类，发现它们携带ACAM2000。携带ACAM2000的3个SVF组分的主要细胞群被鉴定为SA-ASC(MSC前体)和周细胞。
表X6.来自携带ACAM2000的每个SVF细胞群的细胞百分比
Figure BDA0003148729980000913
B.允许ACAM2000扩增的SVF细胞群
如以上实施例3所述，SVF可保护痘苗病毒免受血清诱导灭活。进一步的研究发现SA-ASCs(MSC)和周细胞是SVF细胞群中携带痘苗病毒的主要单个核细胞。接下来，确定了能够高效扩增痘苗病毒的SVF细胞群。
来自新鲜SVF制剂的主要单核细胞群如上所述分类。然后将SA-ASCs(MSC前体)、周细胞、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞个体活体分类群体接种于涂有CTSTMCELLstartTM底物(ThermoFisher Scientific)的48孔板中，培养于补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM中，在37℃，5％CO2的加湿气氛中。分选的细胞立即用TurboFP635标记的痘苗病毒(CAL14)在细胞培养中以MOI为1感染5天。荧光显微镜检测荧光蛋白表达作为病毒扩增的指标。
从第2天开始，TurboFP635积聚仅在源自SA-ASC分选的细胞的AD-MSC细胞中发现，所述细胞附着于细胞培养塑料并在培养中增殖。感染后5d，AD-MSC有明显的荧光聚集。这些数据表明，由SVF产生并培养几天的AD-MSC允许痘苗病毒扩增，增加了可递送到肿瘤部位的治疗性病毒颗粒的数量，从而增强了治疗效果。
实施例5
人和犬骨髓间充质干细胞对痘苗病毒的扩增及病毒编码蛋白的表达
如以上实施例所示，使用新鲜SVF和培养的脂肪来源的MSC(AD-MSC)来隐藏、保护痘苗病毒并将其递送到肿瘤细胞提供了比单独使用痘苗病毒进行治疗的改进。如本文还提供和证明的(参见，例如，实施例7)，如果病毒在递送到肿瘤部位之前被载体MSC扩增，则可进一步提高溶瘤病毒的治疗功效。
如上所述，培养物中的非分选SVF细胞可产生MSC培养物。CD34+SA-ASCs迅速附着于细胞培养塑料上，一旦被活化，迅速增殖，增加痘苗病毒载体细胞的数量。在实施例3中显示，培养的人和犬MSC能够保护痘苗病毒对抗血清失活，并将病毒传递给肿瘤细胞。如以上实施例4所述，CD34+SA-ASC被鉴定为从SVF分离的主要细胞群，其携带痘苗病毒，并且一旦在其获得MSC间充质表型的培养中，扩增痘苗病毒。
其次，人和犬扩增的MSC(AD-MSC)除了保护病毒免受血清失活和将病毒转移到肿瘤细胞外，也能扩增病毒。为评价AD-MSC对痘苗病毒的扩增水平，使用了基因工程的CAL14VV。
A.人脂肪源间充质干细胞(AD-MSC)的病毒扩增及病毒蛋白表达
首先，通过检测感染细胞中的荧光来确定人AD-MSC是否允许病毒编码的荧光蛋白TurboFP635的表达和积累。为此，将来自三个不同供体(#1、#2和#3)的人脂肪来源的AD-MSC与两种不同浓度的CAL14痘苗病毒在MOI为0.1或MOI为1的情况下，在补充有2％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的DMEM中，在37℃，5％CO2的加湿气氛中混合3小时。3h后去除含有游离病毒的细胞培养基，以新鲜DMEM代替，其补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺48h。感染后48小时，分析荧光信号。取未感染CAL14病毒的3个供者的MSC作为对照。
荧光显微镜观察结果表明，三种供者的MSC均能表达荧光蛋白，这也表明病毒扩增活跃。三种MSC的荧光蛋白表达量不同。来自供体#2的MSC在0.1和1的MOI值下均显示出最高的荧光水平，而来自供体#3的MSC显示出最低的荧光水平，来自供体#1的MSC显示出中等水平的荧光。因此，来自某些供体的MSC显示出比其它供体更高的痘苗病毒扩增和/或病毒蛋白表达能力。未处理的MSC样品中未观察到荧光。
然后如上所述，通过空斑测定定量MSC扩增并释放到培养基(上清液)中的痘苗病毒的量，以及细胞扩增但未释放的病毒颗粒的数量。结果(表X7)显示来自所有3个供体的MSC扩增并释放痘苗病毒，如病毒在细胞和上清液中的存在所示。来自三个供者的MSC扩增和释放不同程度的病毒：来自MSC供者#2的细胞在24和48小时显示最高水平的荧光，48小时分泌最高水平的病毒(表X7)。总体而言，来自MSC供体#2的细胞在48小时显示出最高的病毒扩增总水平，而来自MSC供体#1的细胞显示出最低的病毒扩增总水平。这些结果表明来自不同供体的MSC显示出不同水平的痘苗病毒扩增和/或病毒编码蛋白表达。低水平和高水平的病毒扩增和病毒蛋白表达可能是有利的；低水平病毒扩增和病毒蛋白表达的MSC经静脉(I.V.)可在循环中存活更长时间行政施用；而具有较高病毒扩增和病毒蛋白表达水平的MSC可将较高剂量的痘苗病毒传递给肿瘤细胞。
表X7.人脂肪源间充质干细胞(AD-MSC)对痘苗病毒的扩增和释放
Figure BDA0003148729980000931
*ex、10x和10^x在本文提供的表格和说明中均指10x
B.犬脂肪间充质干细胞的病毒扩增及病毒蛋白表达
如实施例3所示，犬培养的MSC能够保护痘苗病毒免受血清灭活并将其传递给肿瘤细胞，与未保护的病毒相比提高了治疗效果。接下来的研究表明，犬类培养的MSC在运送到肿瘤部位之前能够进行有效的病毒扩增，这进一步提高了它们的治疗效用。
用CAL14 VV检测感染犬MSC中TurboFP635蛋白的表达和积聚情况，并分析其荧光信号，以评价病毒编码的TurboFP635蛋白在感染犬MSC中的表达和积聚情况。取3个不同供体(#1、#2和#3)的犬MSC，在MOI为0.1或1的条件下，在37℃、5％CO2的加湿气氛中，用两种不同浓度的CAL14痘苗病毒在添加2％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的DMEM中负载3h。3小时后，除去含有游离病毒的细胞培养基，用补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺的新鲜DMEM替换48小时。感染后48小时，分析荧光信号。取3只未感染病毒的犬供体的MSC作为对照。三种犬的MSC均显示荧光蛋白的表达，表明病毒扩增活跃。与人MSC的结果相似，病毒编码的荧光蛋白在三种犬MSC样本之间的表达存在差异，表明一些犬MSC扩增痘苗病毒的程度大于其它犬MSC。在MOI值均为0.1和1时，供体#3的MSC表现出最高的荧光水平，供体#1的MSC表现出最低的荧光水平。来自供体#2的MSC显示出中等水平的荧光，在MOI为1时更大。未处理的MSC对照未显示任何荧光。
接下来，如上所述，通过空斑测定评估犬MSC扩增并释放到培养基(上清液)中的痘苗病毒的量，以及扩增但未释放的病毒颗粒的数量。结果如表X8所示。发现三种犬的MSC均在感染后48h扩增并释放病毒，但程度不同。来自犬供体#3的MSC在48小时分泌的病毒量最高，并且在24和48小时显示出最高水平的荧光。来自犬2号供体的MSC在48小时时显示出最高的病毒扩增水平。来自犬供体#1的MSC显示出最低水平的病毒扩增和荧光蛋白表达。这些结果表明，每一个MSC系显示不同水平的病毒扩增和病毒编码的蛋白表达和分泌。高水平和低水平的病毒扩增和病毒蛋白表达/分泌都是有利的；携带较低病毒扩增和蛋白表达水平的痘苗病毒的MSC(MSC1)经静脉注射(I.V.)可在循环中存活更长时间，而病毒分泌水平较高的MSC(MSC2、MSC3)经瘤内注射(I.T.)可更快地传递痘苗病毒。
表X8.犬脂肪源MSC对痘苗病毒的扩增和释放
Figure BDA0003148729980000932
实施例6
负载痘苗病毒细胞的贮存
治疗的标准化要求产生大量的带有痘苗病毒的MSC。由于治疗剂(即活生物治疗剂/生物制剂)的性质，储存和分发的要求是严格的。携带病毒的MSC应进行等分，并在长期保存后保持治疗效果的条件下保存。在国内分销时，生物制剂/治疗剂必须在维持其效力和稳定性的温度下保存2-3天，而在国际分销时，这一时间通常为7-10天。溶瘤病毒负载细胞提供长期储存，因此，一个方便和现成的“现成”治疗。
A.接种痘苗病毒的MSC在4℃或液氮保存后蛋白质表达水平的评估
分别在4℃(如运输)和液氮(-196℃；代表低温保存以长期保存)条件下对负载两种痘苗病毒CAL2-eGFP(表达eGFP的CAL1重组株)和L3-TurboFP635(表达TurboFP635的Lister重组株)的脂肪来源MSC的影响进行了评价。将WT1-eGFP(即CAL2-eGFP)和L3-TurboFP635以1：1的比例和MOI为1的混合物负载犬脂肪来源的MSC(MSC4)，在37℃下以20RPM连续旋转2小时。然后用PBS洗涤细胞两次以除去游离病毒。将携带病毒的MSC样品分成3部分：a)感染后立即接种在6孔板中的100,000个活细胞(“新鲜细胞”)作为对照；b)将100,000个活细胞在4℃下保存2天，然后接种在6孔板中；c)将100,000个活细胞以500万个细胞/ml细胞低温保存培养基(
Figure BDA0003148729980000942
CS10，BioLife Solutions)的浓度冷冻下来并在液氮中保存2天，然后在DMEM中解冻并接种在6孔板中。在将细胞接种到平板中之前，对于a)、b)和c)细胞的存活率百分比分别为96％、80％和82％。细胞在37℃培养48h。来自所有三种条件的MSC在不到1小时的时间内附着于塑料上，显示出高度的细胞活力。在三个部分中的任何一个，细胞附着时没有检测到荧光信号，表明在储存过程中没有病毒扩增。接种后48小时，分析荧光信号，所有荧光通道曝光1秒(绿色表示表达eGFP的CAL2病毒，红色表示表达TurboFP635的L3病毒)。
荧光显微镜观察结果表明，CAL2和L3病毒分别编码的荧光蛋白eGFP和TurboFP635在新鲜MSC和液氮保存的MSC中的表达水平相似，表明细胞可低温保存以长期保存，而不影响其扩增病毒的能力。与4℃保存的MSC相比，病毒蛋白的表达程度较低，表明病毒扩增水平降低。
B.接种痘苗病毒的MSC在4℃或液氮保存后病毒扩增的评估
如上所述，在24和48小时后，通过空斑测定定量上述三个样品(a、b和c)中的每一个中的活病毒颗粒的量。以下表X9中总结的结果表明，与新鲜细胞相比，在液氮中存储不影响载体MSC4细胞的本征扩增电位。病毒携带细胞在4℃下保存2天仍可使痘苗病毒扩增，但与新鲜细胞和低温保存细胞相比，扩增程度有所降低。因此，携带病毒的细胞可被低温保存，从而产生一种方便的“现成的”治疗方法。
表X9.保存条件对犬骨髓间充质干细胞病毒扩增的影响
Figure BDA0003148729980000941
C.接种痘苗病毒的MSC在液氮中贮存后向肿瘤细胞的传递
接下来，确定负载了CAL2-eGFP和L3-TurboFP635并保存在液氮中的犬MSC4细胞在解冻后是否保持其治疗潜力。细胞装载病毒并在液氮中冷冻2天，如上所述。冷冻小瓶37℃解冻后立即用补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的DMEM清洗样品。将100,000个存活细胞加入含有1×106个MTH52c犬乳腺癌细胞的6孔板中，在37℃，5％CO2，加湿气氛中孵育48小时。作为对照，新鲜(非冷冻)犬脂肪来源的MSC4细胞新鲜装载，如上所述。然后用PBS洗涤细胞两次以除去游离病毒，并在与冷冻细胞相同的条件下将100,000个存活的非冷冻细胞加入到犬肿瘤细胞中。48小时后在绿色通道和红色通道上分析荧光信号，分别检测CAL2-eGFP和L3-TurboFP635。
结果表明，在液氮中冷冻的载病毒的MSC与新鲜的未冷冻的载病毒的MSC一样，向犬肿瘤单层输送了相似量的痘苗病毒，表明载病毒的载体细胞在液氮中长期保存是可行的。因此，活体生物治疗可低温保存，从而实现标准化和分发，并便于在更多的癌症患者中使用。
实施例7
荷痘苗病毒骨髓间充质干细胞体外培养克服肿瘤细胞免疫屏障提高疗效
如上所示，载体细胞，如MSC可保护痘苗病毒免受血清诱导的灭活。在自体和异体环境中，感染的载体细胞被体液和细胞介导的免疫识别和清除。因此，在临床情况下，在病毒能够扩增或表达其编码蛋白之前，细胞载体可被免疫系统清除，从而降低递送剂量和治疗效果。这个实例演示了这个问题的解决方案。细胞载体可与病毒离体孵育一段时间，这段时间有助于病毒扩增和伴随的一种或多种病毒免疫调节蛋白的表达，这提供了对体液和细胞介导的免疫的额外保护。示例性痘苗病毒病毒免疫调节蛋白列于下表×10中：
表×10.Wyeth和LIVP VV毒株免疫调节蛋白的表达
Figure BDA0003148729980000951
A.延长孵育时间对病毒负载MSC活力和功能的影响
将编码荧光蛋白TurboFP635的基因工程CAL1菌株病毒株痘苗CAL2-Opt1与人脂肪来源的MSC(AD-MSC)在补充有2mM谷氨酰胺的DMEM中于37℃悬浮液中以20RPM连续孵育1、2、6和24小时，MOI为1。然后如下所述，在感染后1、2、6和24小时收集AD-MSC并低温保存以产生治疗批次。感染后1小时和2小时收集的治疗批次分别命名为MSC/VV-1和MSC/VV-2。治疗后6和24小时收集的治疗批次有足够的时间使病毒在MSC中表达免疫调节剂(即，在细胞载体中离体而不是在肿瘤递送位点)；这些片段在本文中称为“CAVES”(细胞辅助病毒表达系统)，分别被指定为CAVES-6和CAVES-24。
为产生MSC/VV-1处理批次，用VV孵育1小时的细胞用PBS洗涤两次，在
Figure BDA0003148729980000952
CS10低温保存器中低温保存，并作为小瓶在液氮中保存1周。为产生MSC/VV-2处理批次，将与VV孵育2小时的细胞用PBS洗涤两次，在
Figure BDA0003148729980000953
CS10低温保存器中低温保存，并作为小瓶在液氮中保存1周。将AD-MSC与VV连续旋转孵育2h后，在37℃、5％CO2条件下于补充有2mM谷氨酰胺和5％血小板提取物的DMEM中培养，获得CAVES-6和CAVES-24处理批次。接种后4小时或22小时，将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤两次，在
Figure BDA0003148729980000954
CS10低温保存器中低温保存，并作为小瓶在液氮中保存1周。
冷冻小瓶37℃解冻后立即用补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的DMEM洗涤。通过台盼蓝分析细胞活力，并确定所有处理批次的细胞活力大于90％。然后使用荧光显微镜来评估TurboFP635的表达，该表达在CAVES-24处理批次解冻后立即检测到，表明病毒编码的蛋白已合成并存在于细胞中。这可增强溶瘤病毒的治疗功效，因为不仅任何病毒编码的免疫调节剂已表达，从而保护细胞和病毒对抗患者的免疫系统并有利于病毒在肿瘤中的初始传播，而且由病毒编码的任何治疗蛋白在肿瘤细胞感染时已存在，并且可提供比在肿瘤部位发生(启动)病毒扩增和蛋白质合成立即或快得多的治疗效果。这些结果表明，在低温保存和解冻后，CAVES能够保持其合成病毒编码蛋白的能力。
B.补体抑制对MSC/VV和CAVES治疗批次治疗效果的影响
为评估MSC/VV和/或CAVES是否抵抗补体抑制，将50,000个MSC/VV-1、MSC/VV-2、CAVES-6或CAVES-24的细胞(相当于50,000pfu游离痘苗病毒(VV)，其用于在MOI为1的条件下产生MSC/VV和CAVES-24)孵育在100μL的补充有2mM谷氨酰胺和10％热灭活胎牛血清(D10)、90％热灭活胎牛血清(D90)或90％人血清(H90)的DMEM溶液中。作为对照，在相同条件下孵育50,000个游离的CAL1-Opt1游离病毒。在1小时孵化期后，通过使用CV-1细胞单层和羧甲基纤维素(CMC)介质层的标准空斑测定，定量用90％人血清孵化后回收的痘苗PFU(空斑形成病毒)或cPFU(感染细胞空斑形成单位)的百分比，相对于用90％热灭活胎牛血清或10％热灭活胎牛血清孵化后回收的百分比；每个感染的活细胞产生1个空斑(细胞空斑形成单位，cPFU)，每个活的游离痘苗病毒颗粒形成1个空斑。细胞单层用结晶紫固定染色后计数斑块。
与对照孵育条件(90％热灭活胎牛血清)相比，用90％人血清孵育后回收的PFU或cPFU百分比
游离VV 14.0
MSC/VV 1小时 19.7
MSC/VV 2小时 34.5
CAVES-6 39.5
CAVES-24 100.8
结果表明，与游离病毒或与MSC孵育1-2小时的病毒相比，在人血清存在的情况下，CAVES对病毒的补体灭活提供了更大的保护作用。用CAVES-24与人血清孵育后的斑块回收率与用90％热灭活胎牛血清孵育后的回收率相同，表明CAVES-24对补体灭活提供完全保护。
C.CAVES增强肿瘤细胞溶瘤病毒的治疗作用
在证明了CAVES-6和CAVES-24能保护痘苗病毒对抗血清诱导的灭活后，在培养条件下，在20％人血清的持续存在下，评价了CAVES-6和CAVES-24将保护病毒传递给前列腺肿瘤细胞(PC3)的能力。
MSC/VV和CAVES处理在PBS中解冻和洗涤一次。将5,000个MSC/VV-1、MSC/VV-2、CAVES-6或CAVES-24细胞加入到含有500,000个PC3人前列腺癌细胞的24孔板中(MOI0.01)，并与补充了10％FBS的DMEM孵育，含或不含20％人血清。作为对照，在相同条件下将5,000个游离的CAL2-Opt1病毒加入PC3细胞中。
处理后24h，用荧光显微镜检测病毒编码的TurboFP635蛋白在PC3细胞中的表达，作为病毒在PC3细胞中表达的指示剂。结果表明，在无血清的情况下，用游离病毒处理的PC3细胞扩增出病毒编码的TurboFP635蛋白(0.60强度/像素)。在20％的人血清存在下，游离病毒被灭活，如病毒编码蛋白在肿瘤细胞中的荧光活性急剧下降(0.18强度/像素，抑制率70％)所示。另一方面，将病毒负载到MSC上，孵育1、2、6或24小时后，在20％人血清存在下，病毒的治疗效果保持不变。MSC/VV和CAVES治疗的效果在20％人血清存在时，与同等条件相比，除不存在人血清外，没有降低。
24小时后前列腺癌细胞中病毒感染和扩增的相对水平
对照(s.d.) 血清(s.d.)
游离VV 0.60(0.02) 0.18(0.01)
MSC/VV 1小时 0.90(0.02) 1.63(0.19)
MSC/VV 2小时 2.21(0.04) 3.56(0.22)
CAVES-6 1.34(0.18) 2.21(0.12)
CAVES-24 7.28(0.65) 10.17(0.54)
除了MSC/VV和CAVES对人血清介导的病毒灭活的保护作用外，还发现MSC/VV和CAVES在PC3细胞中显示出比游离病毒更高水平的TurboFP635表达，这表明溶瘤病毒有效地转移到肿瘤细胞中，并且病毒的扩增(最初在MSC中，随后在PC3细胞中)处于领先。在相同条件下，CAVES-24显示出显著更高水平的TurboFP635表达，表明用CAVES-24治疗可导致溶瘤病毒在短时间内有效地转移到肿瘤细胞，并且提供了比单独游离病毒、MSC/VV-1或MSC/VV-2治疗效果的显著改善。在含有20％人血清的条件下，CAVES-24与游离病毒相比，体外治疗的相对疗效大于5000％。
人血清对前列腺癌细胞的相对治疗作用
相对效价百分比
游离VV 100％
MSC/VV 1小时 885％
MSC/VV 2小时 1935％
CAVES-6 1201％
CAVES-24 5524％
D.MSC/VV和CAVES在外周血单个核细胞(PBMC)存在下递送和扩增溶瘤病毒
体外测定MSC/VV和CAVES在外周血单个核细胞(PBMC)存在下传递和扩增溶瘤病毒的能力。简而言之，将上述MSC/VV和CAVES处理批次在PBS中解冻和洗涤一次。将20,000个MSC/VV-1、MSC/VV-2、CAVES-6或CAVES-24细胞加入含有来自两个不同健康供体的250,000人PBMC的96孔板中，在异体环境中，并与补充有10％FBS、HEPES、2mM谷氨酰胺和丙酮酸的RPMI孵育。
接种后2、24和48h，用荧光显微镜检测病毒编码的TurboFP635蛋白的表达，作为病毒在MSC细胞中扩增的指标。结果表明，在没有PBMC的情况下，MSC/VV-2需要24小时才能达到类似于CAVES-24在解冻和播种2小时内达到的荧光水平。这些结果再次证明CAVES-24是比MSC/VV更有效的治疗方法。当供体1的PBMC存在时，MSC/VV-2荧光信号的扩增被抑制，而当供体2的PBMC存在时则不被抑制，表明供体1的PBMC存在时MSC/VV-2的异基因排斥反应。然而，当供体1或供体2的PBMC存在时，CAVES-24荧光信号的放大没有被抑制(接种后24小时测量)。这些数据表明，在同种异体PBMC存在的情况下，CAVES允许扩增。
PBMC存在下MSC的VV相对扩增量
Figure BDA0003148729980000971
Figure BDA0003148729980000981
数据表明，CAVES保护溶瘤病毒抵抗体液和细胞介导的免疫，并通过促进病毒在肿瘤内的最初传播，进一步放大和增强溶瘤病毒治疗。
E.孵育和/或冷冻后施用前的病毒颗粒/细胞和基因组拷贝
用3次冷冻(-80℃)/解冻(+37℃)循环破坏细胞(MSC或CAVES)，然后在冰水上超声处理3次，间隔1min，每隔1min，用空斑测定法分析每个细胞的病毒颗粒数。还测量了病毒基因组/细胞的数量(见下文)，因为超声可损伤病毒颗粒并影响准确性。
使用MOI＝1的CAL1病毒和脂肪来源的MSC制备的冷冻MSC/CAL1(2h)、CAVES(24h)或CAVES(48h)中的CAL1病毒颗粒的量如下：
Figure BDA0003148729980000982
使用MOI＝0.1的CAL2病毒和脂肪来源的MSC制备的冷冻CAVES(孵育24h后)中的CAL2病毒颗粒(CAL2-OX40L或CAL2-41BBL)的量如下：
Figure BDA0003148729980000983
上面提到的PFU/细胞值反映了在被感染的细胞或CAVES被破坏和超声处理后具有感染能力的病毒颗粒的数量。这些结果表明，在较短的孵育时间内，与MSC和病毒相关的病毒颗粒相比，CAVES中含有20-50倍的具有感染能力的病毒颗粒。
处理批次的特性(MSC/VV和CAVES)
为进一步表征MSC和痘苗病毒产生的处理批次，分析每次处理每细胞(MSC)的病毒基因组DNA拷贝量。新的接种痘苗病毒的MSC(MSC/VV)和CAVES的冻存体产生。还产生含有未经修饰的扩增/繁殖的ACAM2000(CAL-01)或含有重组CAL-02.M1和CAL-02.M2的处理。
表X11.用于产生MSC/VV的痘苗病毒
或CAVES处理
病毒名称 重组治疗
CAL-01 无
CAL-02.m1 MOX40L
Cal-02.m2 M4-1BBL
含CAL-01的MSC/VV和CAVES的制备
将病毒株痘苗CAL-01与人脂肪来源的MSC(AD-MSC)在补充有5％FBS、1％生长因子和2mM谷氨酰胺的DMEM中37℃孵育2小时(MOI为1或10)、24小时(MOI为1)或42小时(MOI为0.1)。如下所述，在感染后2、24或42小时收集AD-MSC并低温保存以产生处理批次。感染后2小时收集的处理批次按上述MSC/VV-2指定(MOI为1或10)。在24或42小时收集的处理批次分别被指定为CAVES-24和CAVES-42。为产生MSC/VV-2或CAVES-24或CAVES-42处理批次，将与VV孵育2、24或42小时的细胞用PBS洗涤两次，在
Figure BDA0003148729980000991
CS10低温保存器中低温保存，并作为小瓶保存在液氮中。
含CAL-02的MSC/VV和CAVES的制备
将病毒株痘苗CAL-02.m1或CAL-02.m2与人脂肪来源的MSC(AD-MSC)在补充有5％FBS、1％生长因子和2mM谷氨酰胺的DMEM中孵育24小时(MOI 1)或42小时(MOI0.1)。然后，如上所述，在感染后24或42小时收集AD-MSC并低温保存以产生治疗批次。在24或42小时收集的处理批次分别被指定为Caves-02.m1-24和Caves-02.m2-24或Caves-02.m1-42和Caves-02.m2-42。
为产生CAVES-02.m1-24和CAVES-02.m2-24或CAVES-02.m1-42和CAVES-02.m2-42处理批次，将与VV孵育24或42小时的细胞用PBS洗涤两次，在
Figure BDA0003148729980000992
CS10低温保存器中低温保存，并作为小瓶保存在液氮中。
治疗批次上每个细胞的病毒基因组DNA拷贝的定量
冷冻小瓶在37℃解冻，内容物立即用PBS洗涤。通过台盼蓝分析细胞活力，并确定所有处理批次的细胞活力大于70％。用定量实时PCR法测定每个细胞的病毒基因组含量
用Quick-gDNATM Blood MidiPrep(Zymo Research，CA)提取DNA。使用PowerUpTM
Figure BDA0003148729980000993
Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific，CA)和以下用于病毒的引物：A56R-F(CAT CAT CTG GAA TTG TCA CTA CTA AA；SEQ ID NO：91)、A56R-R(ACG GCC GACAAT ATT AAT GC；SEQ ID NO：92)和以下用于人细胞(MSC)的引物：GAPDH1-F(GGG AAG GTGAAG GTC GGAGT；SEQ ID NO：93)、GAPDH1-R(TCC ACT TTA CCA GAG TTA AAA GCAG；SEQ IDNO：94)。使用QuantStudio 6Flex实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)和QuantStudio实时PCR软件V1.3记录并分析数据。
每个细胞的病毒DNA基因组拷贝如表X12所示。所提供的数据考虑到每个人体细胞有2个GAPDH1拷贝。
表X12.处理批次上每个细胞的病毒基因组DNA拷贝的定量
Figure BDA0003148729980000994
Figure BDA0003148729980000995
每个细胞的病毒DNA的基因组拷贝提供了病毒数量的直接指示，这些病毒有可能在细胞内完成一个复制周期，并且一旦病毒颗粒形成，就可在注射时开始释放。数据显示，CAVES处理包含至少1000拷贝的病毒DNA，而MSC/CAL1不到约5或更少拷贝。这表明细胞内的病毒扩增周期比MSC/CAL1-2H更先进。在MOI为0.1到1的情况下，CAVES中病毒DNA的基因组拷贝数在几个1000到大约10000个之间。
实施例8
具有增强治疗潜力的工程化重组溶瘤病毒
为增加溶瘤病毒的治疗潜力，根据本文的组合物和方法进行递送，构建了编码治疗基因的重组病毒。病毒编码的治疗蛋白可发挥额外的治疗作用。如果重组病毒如实施例7所述用于产生CAVES，则在施用对象之前表达的编码治疗蛋白可在施用需要此类治疗的对象时直接生效。
痘苗病毒已被用作在肿瘤细胞中表达治疗基因的平台。治疗基因通常以破坏一个或多个病毒基因表达的方式插入病毒基因组中，从而减弱病毒并提高肿瘤选择性。此类减毒病毒常常失去在肿瘤细胞中高效复制的能力。在自然减毒的病毒中，进一步减毒可降低其治疗潜力。
本实施例描述了ACAM2000痘苗病毒中的一个新的定位位点，在该位点可插入治疗基因，而不改变所得重组病毒中的功能性病毒开放阅读框(ORF)。选择ORF_157和ORF_158(271bp；SEQ ID NO：3)之间的一个小的中间片段(92bp)被目的基因替换。如下所述，使用CRISPR/Cas9HFC(high fidelity Cas9)系统将目的基因导入到ORF_157和ORF_158之间的该基因间区。
1.细胞培养
将非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1细胞在Dulbecco改良Eagle's高糖培养基中培养，其补充有1％抗生素溶液(Life Technologies)，2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和10％热灭活胎牛血清(Mediatech)。细胞在37℃、5％CO2和加湿气氛的培养箱中生长。
2.用于靶向ORF_157和ORF_158之间基因间位点的指导RNA
使用在线软件(dna20.com/ecommerce/cas9/input)选择CRISPR/Cas9(SEQ IDNO：1)的指导RNA(gRNA)序列。指导RNA是在慢病毒载体(lentivector)中的U6启动子控制下构建的。对嘌呤霉素的抗生素耐药性包含在慢载体骨架中(载体购自VectorBuilder，Inc.，Shenandoah，TX；SEQ ID NO：2)。
3.构建产生重组VACV供体载体
根据ACAM2000痘苗病毒基因组序列(GenBank登录号：AY313847；SEQ ID NO：70)选择ORF_157和ORF_158之间的基因间位点左右的同源区(HR)。ORF_157和ORF_158之间的基因间位点是271bp的序列(SEQ ID NO：3)，而两个HR是基因间位点右侧555bp的序列(SEQ IDNO：4)和左侧642bp的序列(SEQ ID NO：5)。在基因间位点内有一个92bp的序列(SEQ ID NO：6)，该序列被目的治疗基因取代。
TurboFP635表达盒供体载体(载体1)
为构建表达TurboFP635的VACV的供体载体，合成了以下DNA片段(Genewiz，Inc.，San Diego，CA)：
(a)(上游)MCS1(多克隆位点1、MfeI、PstI)HR(左)(SEQ ID NO：7)(下游)；
(b)(上游)MCS2(多克隆位点2，SacI，NcoI，BmtI)loxP DNA编码远红色荧光蛋白TurboFP635，侧翼为VACV早期/晚期启动子上游(pEL)和痘苗转录终止信号loxP MCS 3(多克隆位点3，BamHI，SphI，EcoRV，SwaI，NotI，SacI)(下游)(SEQ ID NO：8)；和
(c)HR(右)(SEQ ID NO：4)。
使用融合克隆试剂盒(Takara Bio USA，Inc.，Mountain View，CA)将片段按顺序(a)→(b)→(c)(上游→下游)克隆到pUC18载体(SEQ ID NO：72)中，得到载体pIg-loxP-TurboFP635(SEQ ID NO：9)。所得供体质粒的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，SanDiego，CA)确认
用于产生表达抗VEGF scAb的重组VACV的供体载体(载体3)
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗VEGF单链抗体的DNA(scAb(VEGF)；SEQ ID NO：10)连接到编码IgK信号肽(SEQ ID NO：11)的DNA和编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA(SEQ ID NO：29)的DNA来构建的，该IgK信号肽(SEQ ID NO：11)促进抗体的细胞分泌，该FLAG标签(SEQ ID NO：29)促进检测。对IgK-scAb(VEGF)-FLAG序列进行密码子优化以在痘苗病毒中表达(例如，idtdna.com/CodonOpt)，并将其置于痘苗晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pL→IgK→scAb(VEGF)→FLAG序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：12)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
用于产生表达人碘化钠同向转运体(hNIS)和TurboFP635的重组VACV的供体载体(载体4)
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并在痘苗早期启动子(pE)(SEQ ID NO：15)的控制下插入编码人碘化钠同向转运体(hNIS)(SEQ ID NO：14)的DNA来构建的。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pE→hNIS序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz公司合成(SEQ ID NO：13)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，SanDiego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
用于产生表达检查点抑制剂和选择基因的重组VACV的供体载体(TurboFP635)
(1)抗人CTLA-4和TurboFP635单链抗体(载体5)
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗人CTLA-4单链抗体(h-scAb(CTLA-4))的DNA(SEQ ID NO：16或17)连接到编码IgK信号肽(SEQ ID NO：18)的DNA和编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA(SEQ ID NO：29)的DNA(SEQ ID NO：29)的DNA来构建的，所述IgK信号肽(SEQ ID NO：18)促进抗体的细胞分泌，所述FLAG标签(SEQ IDNO：29)促进检测。对IgK-H-Scab(CTLA-4)序列进行密码子优化以在痘苗病毒(idtdna.com/codonopt)中表达，并置于痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→h-scAb(CTLA-4))→FLAG序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：30，使用SEQ ID NO：17的序列用于h-scAb(CTLA-4))。该载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可用作选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶切除。
(2)抗鼠CTLA-4和TurboFP635单链抗体(载体6)
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗鼠CTLA-4单链抗体(m-scAb(CTLA-4)；SEQ ID NO：21)的DNA与编码IgK信号肽(SEQ ID NO：18)的DNA(其促进抗体的细胞分泌)和编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA(其促进检测)连接而构建的。对IgK-M-Scab(CTLA-4)序列进行密码子优化以在痘苗病毒(idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)的控制下。所得的含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→m-scAb(CTLA-4))→FLAG序列(上游→下游)的载体由Genewiz，Inc.(SEQ ID NO：31)合成。该载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，SanDiego，CA)确认。TurboFP 635盒可用作选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶切除。
(3)OX40L(鼠-载体7、犬-载体8和人-载体9)和TurboFP635
供体载体通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并在痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)的控制下插入编码鼠OX40L(SEQ ID NO：22)、犬OX40L(SEQ ID NO：23)或人OX40L(SEQ ID NO：24)的DNA来构建。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→OX40L(鼠、犬或人)序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：32、33和34，分别用于鼠(载体7)、犬(载体8)和人(载体9)OX40L)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
(4)4-1BBL(鼠-载体10、犬-载体11和人-载体12)和TurboFP635
供体载体通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并在痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)的控制下插入编码鼠4-1BBL(SEQ ID NO：25)、犬4-1BBL(SEQ ID NO：26)或人4-1BBL(SEQ ID NO：27)的DNA来构建。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→4-1BBL(鼠、犬或人)序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz公司合成(SEQ ID NO：35、36和37，分别用于鼠(载体10)、犬(载体11)和人(载体12)4-1BBL)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
编码两个治疗基因和一个选择基因(TurboFP635)的供体载体
(1)4-1BBL和OX40L(鼠-载体13、犬-载体14、人-载体15)
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入在痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)控制下编码鼠4-1BBL(SEQ ID NO：26)或人4-1BBL(SEQ ID NO：27)的DNA和在痘苗早/晚启动子(pEL)(SEQ ID NO：74)控制下编码鼠OX40L(SEQ ID NO：22)、犬OX40L(SEQ ID NO：23)或人OX40L(SEQ ID NO：24)的DNA来构建的。获得的编码鼠、犬或人4-1BBL和OX40L的载体(loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→4-1BBL→pEL→OX40L)分别命名为载体13、14和15。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
(2)抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF))和OX40L(鼠载体16，人载体17)
编码两种治疗基因的供体载体：(a)与编码IgK信号肽的DNA连接并在痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)控制下的抗VEGF的单链抗体(scAb(VEGF))；和(b)在痘苗病毒早/晚启动子(PEL；SEQ ID NO：74)启动子控制下的鼠或人OX40L。
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入：(1)编码抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF)；SEQ ID NO：10)的DNA与编码IgK信号肽(SEQ ID NO：11)的DNA连接，所述IgK信号肽有利于抗体的细胞分泌，所述DNA与编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA连接，所述FLAG标签有利于检测；和(2)编码鼠OX40L(SEQ ID NO：22)或人OX40L(SEQ ID NO：24)的DNA。对IgK-scAb(VEGF)-FLAG序列进行密码子优化以在痘苗病毒中表达(例如，idtdna.com/codonopt)，并将其置于痘苗晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下。将鼠或人OX40L基因置于痘苗早/晚启动子(pEL；SEQ ID NO：74)的控制下。将获得的编码scAb(VEGF)和鼠或人OX40L的载体分别命名为载体16和17。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
(3)抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF))和4-1BBL(鼠-载体18，人-载体19)
编码两种治疗基因的供体载体：(a)与编码IgK信号肽的DNA连接并在痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)控制下的抗VEGF的单链抗体(scAb(VEGF))；和(b)在痘苗病毒早期/晚期(PEL；SEQ ID NO：74)启动子控制下构建鼠4-1BBL或人4-1BBL。
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入：(1)编码抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF)；SEQ ID NO：10)的DNA与编码IgK信号肽(SEQ ID NO：11)的DNA连接，所述IgK信号肽有利于抗体的细胞分泌，所述DNA与编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA连接，所述FLAG标签有利于检测；和(2)编码鼠4-1BBL(SEQ ID NO：25)或人4-1BBL(SEQ ID NO：27)的DNA。对IgK-scAb(VEGF)-flag序列进行密码子优化以在痘苗病毒(idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)的控制下。将鼠4-1BBL或人4-1BBL基因置于痘苗早/晚启动子(pEL；SEQ ID NO：74)的控制下。将获得的编码scAb(VEGF)和鼠源或人源4-1BBL的载体分别命名为载体18和载体19。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
(4)抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF))和hNIS(Vector 20)
编码两种治疗基因的供体载体(载体20)：(A)与编码IgK信号肽的DNA连接并在痘苗病毒晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)控制下的抗VEGF的单链抗体(scAb(VEGF))；和(b)构建了痘苗病毒早/晚启动子(pEL；SEQ ID NO：74)控制下的人NIS(hNIS)。
供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入：(1)编码抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF)；SEQ ID NO：10)的DNA与编码IgK信号肽(SEQ ID NO：11)的DNA连接，所述IgK信号肽有利于抗体的细胞分泌，所述DNA与编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA连接，所述FLAG标签有利于检测；和(2)编码人hNIS的DNA(SEQ ID NO：14)。对IgK-scAb(VEGF)-FLAG序列进行密码子优化以在痘苗病毒(idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下。将人hNIS基因置于痘苗病毒早/晚启动子(PEL；SEQ ID NO：74)的控制下。由Genewiz公司(SEQ ID NO：38)合成包含loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pL→IgK→scAb(VEGF)→FLAG→pEL→hNIS序列(上游→下游)的所得载体(载体20)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
(5)抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF))和AQP1单链抗体(Vector 21)
编码两种治疗基因的供体载体(载体21)：(A)与编码IgK信号肽的DNA连接并在痘苗病毒晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)控制下的抗VEGF的单链抗体(scAb(VEGF))；和(b)在痘苗病毒早/晚启动子(PEL；SEQ ID NO：74)控制下构建人水通道蛋白1(AQP1)。人AQP1首先从开放阅读框(ORF)cDNA扩增(Origene Technologies，Rockville，MD)(SEQ ID NO：28)。
供体载体(载体21)通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入：(1)编码抗VEGF单链抗体(scAb(VEGF)；SEQ ID NO：10)的DNA与编码IgK信号肽(SEQ ID NO：11)的DNA连接，所述IgK信号肽(SEQ ID NO：11)促进抗体的细胞分泌，所述DNA编码FLAG标签(SEQ IDNO：29)促进检测，从而构建；和(2)编码人AQP1的DNA(SEQ ID NO：28)。对IgK-scAb(VEGF)-FLAG序列进行密码子优化以在痘苗病毒(idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗病毒晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)的控制下。将人AQP1基因置于痘苗病毒早/晚启动子(pEL；SEQ ID NO：74)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pL→IgK→scAb(VEGF)→FLAG→pEL→AQP1(人)序列(上游→下游)的所得载体(载体21)由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：39)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。
4.克隆Cas9HFc
Cas9HF1质粒得自Addgene(Cambridge，MA)；质粒#72247)。在CMV启动子(SEQ IDNO：40)的控制下，将Cas9HF胞质编码基因(Cas9HFc)克隆到pST1374(添加基因质粒ID#13426)中，或在CMV启动子(SEQ ID NO：40)的控制下，在VectorBuilder，Inc.，(Shenandoah，TX)构建的质粒中合成Cas9HF胞质编码基因(Cas9HFc)。
5.编码治疗基因重组溶瘤病毒
转染与病毒感染
在转染前一天将2×106个CV-1细胞接种在6孔板中，以实现60-70％的汇合。使用6μL的TurboFectin 8.0转染试剂(Origene Technologies，Rockville，MD)和250μL的opti-DMEM(Thermo Fisher Scientifice，Waltham，MA)分别用1μg编码Cas9HFc和指导RNA(gRNA)的质粒转染60％-70％的汇合细胞。转染后24小时，在补充有2％FBS的DMEM高糖中以MOI为0.02的受体痘苗病毒(ACAM2000)感染细胞。病毒感染后2小时，细胞用PBS洗涤一次。加入1.5ml DMEM生长培养基，将细胞置于37℃的CO2培养箱中30分钟，然后用2μg选自上述的供体质粒转染。细胞在37℃、5％CO2和加湿气氛中孵育24小时。收集感染细胞和上清液的混合物，保存于-80℃，用于病毒纯化和筛选。
病毒纯化
将被感染的细胞解冻，然后在冰上以最大强度超声处理30秒，3×开/关，从细胞中释放病毒。在6孔板中用释放的病毒感染四层汇合的CV-1细胞，每板释放病毒2μL。感染后2天，在2X荧光显微镜下鉴定4-5个绿色斑块(阳性，反映eGFP表达)和对照阴性斑块(不表达eGFP)，收集于含200微升无血清DMEM的冷冻小瓶中，通过2-4轮斑块纯化，直至获得纯克隆。通过PCR和Sanger测序证实在重组病毒的适当位点(ORF_157和ORF_158之间)插入了所需的治疗基因，其细节如下所述。
PCR和Sanger测序
为证实转基因在受体病毒基因间位点的插入，工程化改造了一对引物来扩增基因间区：
反向引物：5'GACGAAGAAGCAAGAGATTGTGT3'(SEQ ID NO：41)
正向引物：5'ACCGTTTCCATTACCGCCA3'(SEQ ID NO：42)。
两个引物的靶序列(互补)分别位于痘苗病毒的HR-left和HR-right上。来自Cre/Lox重组之前的原始病毒的扩增子可以是位于HR-left和HR-right上的引物。来自原始非重组病毒的PCR扩增子长度为230bp，而新的重组病毒扩增子的大小与插入的转基因的大小相等，加上从骨架处额外增加的140bp。所有纯化克隆的PCR产物的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。
实施例9
CAVES增加重组溶瘤病毒的治疗潜力
如实施例7所示，通过保护痘苗病毒抵抗体液和细胞介导的免疫，并通过在给予治疗之前提供病毒编码蛋白(例如免疫调节蛋白)的表达，使得治疗效果是即时的，而不是由于在体内启动病毒复制/病毒基因表达而受到延迟，CAVES增强了痘苗病毒的治疗效果。因此，在施用时，可使用编码治疗蛋白并在施用前在CAVES中表达治疗蛋白的重组病毒，利用CAVES直接递送治疗蛋白。病毒编码的治疗蛋白可在施用时直接发挥初始治疗作用，并且不依赖于肿瘤感染或肿瘤中的病毒扩增。此外，可独立于肿瘤微环境的性质发挥最初的治疗效果。如果病毒编码的治疗蛋白的初始表达发生在体内，表达的程度通常取决于肿瘤微环境的性质，例如，蛋白质合成机制对肿瘤微环境中营养物质的获取。因为CAVES已含有表达的病毒编码的治疗蛋白(由于细胞载体与溶瘤病毒孵育例如6小时或更多小时)，治疗蛋白在施用时可以与肿瘤微环境中的蛋白质合成无关的方式有效。例如，CAVES-24或CAVES-48(细胞载体和溶瘤病毒分别一起孵育24小时或48小时)的治疗效果可比载病毒2小时的MSC更有效，其中病毒编码的治疗蛋白的合成尚未开始或非常有限。
该实施例证明，使用编码治疗蛋白的工程化溶瘤病毒(如实施例8所述制备)，离体产生CAVES-48(即，细胞载体和溶瘤病毒一起孵育48h)，提供了所需的病毒编码的治疗蛋白的病毒扩增和表达。CAVES-48然后可被低温保存，冷藏以便运输到治疗地点(1-2天)或立即施用。
重组病毒
如实施例8所述制备含有以下治疗基因的重组病毒：人OX40L(hOX40L)、小鼠OX40L(mOX40L)、人4-1BBL(h4-1BBL)、小鼠4-1BBL(m4-1BBL)和抗人CTLA-4的单链抗体(scAb-hCTLA-4)。CAL-01的ORF_157和ORF_158之间的92bp缺口被TurboFP635替换为上述一个治疗基因上游的报告基因。基于CAL-01的新重组病毒在本实施例中以前缀“CAL-02”表示。
病毒名称 重组免疫治疗
CAL-02.h1 HOX40L
CAL-02.m1 MOX40L
Cal-02.h2 H4-1BBL
Cal-02.m2 M4-1BBL
CAL-02.h3 sc-hCTLA4
将人脂肪来源的MSC和0.1的MOI的上述重组病毒中的一种加载于补充有2％胎牛血清(FBS)、1％抗生素(等份氨苄西林和链霉素)和2mM谷氨酰胺的1ml DMEM中，在37℃的CO2培养箱中以20RPM连续旋转2小时。然后将细胞加入一个装有10毫升新鲜生长培养基(5％
Figure BDA0003148729980001051
合并人血小板裂解液、1％抗生素和2毫米谷氨酰胺)的10厘米圆形培养皿中。病毒和细胞的混合物在37℃的CO2培养箱中进一步孵育2天。用1x PBS洗涤细胞，并用1.5ml TrypLE酶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)分离6分钟。然后收集所有细胞并以500g离心5分钟。如实施例6和7所述，用1x PBS再次洗涤细胞并低温保存。
为证实治疗性蛋白在细胞表面的表达，使用表X13中列出的荧光标记抗体或同种型对照对与不同重组病毒孵育48小时的AD-MSC进行染色。将sc-hCTLA4与FLAG标签融合，使用FLAG标签抗体检测sc-hCTLA4。
表X13
Figure BDA0003148729980001052
标记CAVES-48后，通过流式细胞术分析完整细胞中治疗蛋白的细胞表面表达。阳性细胞的百分比(CAVES-48)列于下表X14。
表X14
Figure BDA0003148729980001053
Figure BDA0003148729980001061
结果表明，在产生的CAVES中，治疗蛋白存在于细胞膜中。OX40L和4-1BBL为细胞膜配体；因此，这些蛋白质应该在细胞膜中找到高水平的。然而，sc-hCTLA4是以分泌形式表达的，因此不会在细胞膜中保持高水平。因此，使用FLAG标记抗体进行胞浆检测，以分析含有治疗性sc-hCTLA4蛋白的细胞的百分比。与CAL-02.h3病毒孵育48h后，sc-hCTLA4阳性信号转导率增加到87.7％。
结果表明，CAVES-48的产生允许病毒编码的治疗基因的表达，这些基因在施用时可立即产生效果，该效果与肿瘤微环境、初始抗病毒屏障或肿瘤细胞对病毒扩增和病毒编码蛋白合成的允许性无关。
实施例10
CAVES提高溶瘤病毒对肿瘤的治疗效果
(1)前列腺癌
比较裸CAL1病毒和MSC/CAL1与CAVES-24h和CAVES-40h在异种(人)前列腺肿瘤模型系统中的抗癌治疗效果。如实施例6和7中所述，生成装载VV(2H)或CAVES的MSC冷冻库存，并在-80℃或液氮中保存。
与裸CAL1病毒或与MSC孵育短时间(与MSC孵育2小时)相比，CAVES(与MSC孵育24小时或40小时)显示出增加的治疗效果
在异种动物模型中，将2×106个侵袭转移的人前列腺癌PC3细胞皮下注射到4-6周裸鼠右侧皮下，以分析1×106个Cave(24h或48h孵育)与MSC/CAL1(2h孵育)和裸CAL1(cryopreserved lot)各自的治疗效果。当肿瘤的平均体积达到150mm3时(接种肿瘤细胞后2周)，瘤内注射以下处理之一：1×106pfu裸CAL1病毒(n＝6)；或1×107pfu裸CAL1病毒(n＝5)；或1×106MSC负载CAL1(MOI＝10)2h(n＝7)；或CAVES-24h(用CAL1 MoI＝1；n＝7制备)；或CAVES-40h(用CAL1 MoI＝0.1；n＝6)或PBS(n＝6)制备。在实验期间每周测量两次肿瘤体积。对于单次瘤内注射，数据显示含MSC的治疗比单纯病毒治疗更有效；与MSC/CAL1 2h或裸病毒相比，CAVES是最有效的处理方法。CAVES-40h是最有效的治疗方法，即使使用了100倍少的病毒来制造治疗方法。
Figure BDA0003148729980001062
基于病毒使用量的CAVES治疗效果
为进一步分析作为制备CAVES时基于添加到细胞中的CAL1病毒量的低温保存CAVES的治疗功效，制备了以下三种CAVES：
SNV-1a：1×107pfu CAL1病毒与脂肪源干细胞孵育(MOI 0.1，38-42小时)
SNV-1b：1×106pfu CAL1病毒与脂肪源性干细胞孵育(MOI 0.1，38-42小时)
SNV-1c：1×105pfu CAL1病毒与脂肪源性干细胞孵育(MOI 0.1，38-42小时)
在37摄氏度的CO2培养箱中进行培养。在收获时，所有的细胞都被感染，活力大于60％。用CryoStor10(或CryoStor5)以每毫升1000万个细胞的浓度低温保存CAVES。使用空斑测定法对低温保存的CAVES进行PFU/细胞测试，并选择最小值约为3-10PFU/细胞，每个细胞2000-5000个DNA拷贝。
将2×106侵袭转移的人前列腺癌PC3细胞皮下植入4-6周裸鼠右肋皮下，产生前列腺肿瘤。当肿瘤达到150mm3的平均体积时(接种肿瘤细胞后2周)，将小鼠瘤内注射(第0天)以下处理之一(所有处理的n＝8)：
无处理(对照-PBS)
1×106pfu裸CAL1病毒；
1×107pfu裸CAL1病毒；
1×106SNV-1a；
1×106SNV-1b；
1×106SNV-1c
肿瘤体积在实验期间每周测量两次(直到第15天)。对于单次瘤内注射，数据显示在第15天，对照显示肿瘤体积增加约20倍。与此相比，1×106pfu裸CAL1病毒治疗在第15天导致肿瘤体积增加12倍，而1×107pfu裸CAL1病毒治疗在第15天导致肿瘤体积增加7.5倍。CAVES在减缓肿瘤进展方面显示出更大的功效，用SNV-1a的治疗在第15天显示肿瘤体积增加约6.5倍，SNV-1b在第15天显示肿瘤体积增加约5倍，SNV-1c在第15天仅显示肿瘤体积增加约3.5-4倍。因此，结果进一步证明，使用较低pfu(1×105PFU，即SNV-1c)制成的CAVES与使用较高pfu(1×107PFU，即SNV-1a和1×106PFU，即SNV-1b)制成的CAVES相比，具有增加的治疗潜力。下表显示，与对照或裸病毒治疗相比，用CAVES治疗后肿瘤体积明显减小：
Figure BDA0003148729980001071
在肿瘤植入13天后开始CAVES治疗，并在开始CAVES治疗14天后测量肿瘤体积时，也观察到类似的结果。结果如下表所示：
Figure BDA0003148729980001081
CAVES(SNV-1c)治疗前列腺癌诱导肿瘤消退
除了减缓肿瘤进展外，SNV-1c的治疗被发现可诱导肿瘤消退。侵袭转移的PC3细胞来源于一位62岁男性高加索人的IV级前列腺腺癌的骨转移。
Figure BDA0003148729980001083
将2×106侵袭转移的人前列腺癌PC3细胞皮下注射到4-6周无胸腺裸鼠右肋产生前列腺肿瘤。当肿瘤达到150mm3的平均体积时(接种肿瘤细胞2周后)，将小鼠瘤内注射(第0天)以下处理之一(每个处理组n＝5)：不处理(对照PBS)或1×106SNV-1C。
肿瘤体积在实验期间每周测量两次(直到第15天)。对于单次瘤内注射，数据显示在第15天，对照显示平均肿瘤体积约为1150mm3。与此相比，用SNV-1c的治疗在第15天导致平均肿瘤体积约为500mm3。此外，在治疗后第30天，SNV-1c治疗的动物中的肿瘤已缩小到约250mm3。结果表明，除了减缓肿瘤生长外，CAVES还可通过缩小肿瘤来治疗肿瘤。
肿瘤内注射SNV-1c不引起全身性病毒血症
分析SNV-1c的生物分布和病毒扩增潜能，确定其对肿瘤的选择性，评估其对正常组织是否有负面影响。治疗后15天处死上述裸鼠。每只动物采集11个组织样本(血液、肿瘤、脑、心、肾脏、肝、肺、膀胱、前列腺、睾丸、脾脏)并在液氮中低温保存。用空斑试验和实时半定量PCR(qPCR)检测病毒DNA或感染性颗粒的存在。分析表明，几乎所有病毒都定位于肿瘤，在非肿瘤组织中没有检测到病毒。
SNV-1c治疗抑制前列腺癌体内免疫模型中肿瘤进展并募集适应性免疫细胞群
在两个免疫活性的前列腺癌小鼠模型：TRAMPC2(慢生长肿瘤)和RM1(快生长肿瘤)中测试SNV-1c的治疗效果。TRAMP-C2和细胞系于1996年从PB-Tag C57BL/6(TRAMP)小鼠前列腺的异质性32周原发肿瘤(ATCC-CRL-2731)中获得。RM1是一种Ras+myc诱导的前列腺癌，由泌尿生殖窦小鼠前列腺重建发展而来
Figure BDA0003148729980001084
将2×106个TRAMPC2或RM1前列腺癌细胞皮下注射到4-6周无胸腺裸鼠右肋，产生前列腺肿瘤。对TRAMPC2，于CAVES治疗前20d在右侧皮下植入肿瘤细胞。对于RM1，在CAVES治疗前5天在右侧侧面皮下植入肿瘤细胞。采用瘤内注射SNV-1C1×106，每2天1次，共3次。对照组动物不接受治疗(PBS)(n＝5只/治疗组)。
数据表明，在开始瘤内注射到TRAMPC2肿瘤后的第27天，对照动物显示出约500mm3的平均肿瘤体积。相比较而言，用SNV-1c治疗在第27天显示很少到没有可检测到的肿瘤。结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001082
Figure BDA0003148729980001091
对于快速生长的RM1肿瘤，数据显示在瘤内注射后的第7天，对照动物显示出约2500mm3的平均肿瘤体积。与此相比，用SNV-1c治疗的肿瘤体积约为1000mm3。结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001092
此外，在RM1肿瘤中，发现用SNV-1c的治疗增加了适应性T细胞群的募集，从而进一步提高了治疗效果。用SNV-1c治疗可使CD8+细胞毒性T细胞群持续增加，CD4+细胞群也有一定程度的增加，以细胞/g肿瘤和活细胞百分比来衡量。NK细胞数量未见增加。改善的CD8+T细胞群频率与改善的总CD8/Treg比率(对于SNV-1c处理的样品约为6，而对照样品约为2)和改善的CD4 Teff/Treg比率(对于SNV-1c处理的样品约为1.5，而对照样品约为0.6)相关。
(2)其它癌症模型
对SNV-1c的治疗效果进行了测试，并发现在许多其它癌症模型中是有效的。
鼠结肠癌模型(CT26)
将2×106个CT26细胞皮下注射到4-6周裸鼠右肋，产生结肠肿瘤。CT26是一株N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯(NNMU)诱导的未分化结肠癌细胞株。克隆产生细胞系CT26.WT(ATCC CRL-2638)。在肿瘤细胞注射后7天，每两天向小鼠瘤内注射1×106株SNV-1c、1×107株裸CAL1病毒，或不处理(瘤内注射PBS)，共3次(每个治疗组n＝8)。
数据表明，在开始瘤内注射到CT26肿瘤后的第15天，对照动物显示肿瘤的平均体积在1250-1500mm3之间。通过比较，裸病毒的治疗在第15天导致肿瘤的平均体积约为1000mm3。用SNV-1c治疗导致肿瘤进展明显减慢，在第15天平均肿瘤体积约为200mm3。
此外，发现SNV-1c减缓了通过将CT26肿瘤细胞引入小鼠左侧形成的远距离、未经治疗的肿瘤的肿瘤进展(瘤内注射SNV-1c进入右侧的肿瘤)。在用瘤内注射SNV-1c进行治疗时，在第15天，不仅右侧侧翼的平均肿瘤体积约为200mm3(如上所述，相对于1250-1500mm3的对照值)，未注射左侧侧翼的平均肿瘤体积相对于1250-1500mm3的对照值也仅为约500mm3。结果表明，使用示例性CAVESNV-1c的治疗对直接(近端)治疗的和远端肿瘤都是有效的。结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001101
Figure BDA0003148729980001102
在肿瘤植入13天后开始CAVES治疗，并在开始CAVES治疗20天后测量肿瘤体积时，也观察到类似的结果。结果如下表所示：
Figure BDA0003148729980001103
Figure BDA0003148729980001111
鼠黑色素瘤模型
将2×106个B16-F10细胞(黑色素瘤小鼠肿瘤模型
Figure BDA0003148729980001112
CRL-6475TM)皮下注射到4-6周无胸腺裸鼠的左右两侧，产生黑色素瘤肿瘤。注射肿瘤细胞后8天，每2天向小鼠瘤内注射1×106株SNV-1c或1×107株裸CAL1病毒，每治疗组8株。
数据表明，在瘤内注射到B16肿瘤后的第11天，裸病毒处理的动物显示右侧肿瘤的平均体积约为1400mm3。用SNV-1c治疗导致肿瘤进展显著减慢，在第11天平均肿瘤体积约为600mm3。结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001113
发现SNV-1c减缓了通过将B16-F10黑色素瘤细胞引入小鼠左侧形成的远处、未经治疗的肿瘤的肿瘤进展(瘤内注射SNV-1c进入右侧的肿瘤)。在用单次瘤内注射SNV-1c治疗时，在第11天，不仅右侧侧翼的平均肿瘤体积约为600mm3，未注射左侧侧翼的平均肿瘤体积也仅为约700mm3，相对于对照(裸病毒治疗)值约为1600mm3。结果表明，SNV-1c对直接(近端)治疗的肿瘤和远端肿瘤均有效，且与裸病毒治疗相比更有效。
当使用编码抗VEGF单链抗体的CAL2重组病毒制备CAVES(SNV-2c，通过将脂肪源干细胞与1×105pfu的CAL2病毒而不是CAL1病毒孵育而成)时，发现SNV-2c的CAVES比SNV-1c更增强治疗效果，表现为更强的肿瘤进展抑制。结果如下表所示：
Figure BDA0003148729980001121
乳腺癌模型
在鼠乳腺癌模型(EMT-6)和人三阴性乳腺癌模型(MDA-MB-231)中检测SNV-1c的治疗效果。EMT6是从移植性小鼠乳腺癌中建立的，该乳腺癌发生在BALB/CCRGL小鼠的增生性乳腺肺泡结节植入后。获得的肿瘤株(命名为KHJJ)在BALB/CKA小鼠中繁殖并在第25次动物传代后适应组织培养，将该细胞株命名为EMT。EMT6是1971年在Stanford大学分离EMT克隆分离物(
Figure BDA0003148729980001122
CRL-2755TM)。MDA-MB-231细胞系为高侵袭性、侵袭性、低分化的三阴性乳腺癌细胞系，缺乏雌激素受体和孕激素受体表达，以及HER2扩增；它是从一位51岁高加索女性转移性乳腺腺癌的胸腔积液中建立的。
在4-6周裸鼠左右两侧皮下注射2×106个EMT-6乳腺癌细胞，于CAVEs治疗前4天产生肿瘤。每隔2天皮下注射SNV-1c 1×106次，仅右侧皮下注射3次。对于MDA-MB-231三阴性乳腺癌，在CAVEs治疗前27天分别在左右两侧皮下植入细胞。然后将SNV-1c 1×106只在右侧肿瘤内注射一次。对照组为瘤内注射1×107裸CAL1病毒或PBS(每个治疗组n＝8)。
EMT-6乳腺癌模型的数据表明，在肿瘤内注射后第14天，对照(PBS处理的)动物显示右侧肿瘤的平均体积约为950mm3。用SNV-1c治疗导致肿瘤进展显著减慢，在第14天平均肿瘤体积约为350mm3。第18天的结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001123
Figure BDA0003148729980001131
此外，还发现SNV-1c减缓了通过将乳腺肿瘤细胞引入小鼠左侧形成的远处、未经治疗的肿瘤的肿瘤进展(瘤内注射SNV-1c进入右侧的肿瘤)。在用单次瘤内注射SNV-1c治疗时，在第14天，不仅右侧侧翼的平均肿瘤体积约为350mm3，未注射左侧侧翼的平均肿瘤体积也仅为约450mm3，相对于对照(裸病毒治疗)值约为950mm3。结果表明，SNV-1c对直接(近端)治疗的肿瘤和远端肿瘤均有效，且与裸病毒治疗相比更有效。
类似地，对于三阴性乳腺癌模型(MDA-MB-231)，对于单次瘤内注射，乳腺癌模型的数据表明，在瘤内注射到肿瘤中后的第14天，裸病毒处理的动物显示出大约950mm3的平均右侧肿瘤体积。用SNV-1c治疗导致肿瘤进展显著减慢，在第14天平均肿瘤体积约为350mm3。第46天的结果详见下表：
Figure BDA0003148729980001132
研究发现，SNV-1c减缓了通过将乳腺肿瘤细胞引入小鼠左侧形成的远处、未治疗的肿瘤的进展(瘤内注射SNV-1c进入右侧的肿瘤)。在用单次瘤内注射SNV-1c治疗时，在第14天，不仅右侧侧翼的平均肿瘤体积约为350mm3，未注射左侧侧翼的平均肿瘤体积也仅为约150mm3，相对于对照(裸病毒治疗)值约为375mm3。结果表明SNV-1c在三阴性乳腺癌模型中对直接(近端)治疗和远端肿瘤均有效。
结果表明，溶瘤病毒与干细胞(如MSC)孵育足够的时间以使免疫调节蛋白表达，显著提高溶瘤病毒的治疗效果。与单独的病毒相比，此类改进是显著的，并且病毒与细胞孵育的时间明显短(2-4小时，或病毒编码的免疫调节蛋白尚未表达的时间)。
在同基因肿瘤模型中，局部施用CAVEs诱导局部和远处肿瘤免疫浸润，并有效地抑制局部治疗和远端未治疗肿瘤的乳腺癌肿瘤进展(远端效应)。
为分析局部施用后CAVES是否同时诱导局部治疗效应和非系统治疗效应，研究了治疗对双侧肿瘤小鼠模型的治疗效果。在BALB/c小鼠两侧接种EMT6乳腺癌肿瘤细胞，当肿瘤达到50mm3时，随机分组，共接受3次治疗，共300万个CAVES，隔天直接施用于右侧肿瘤。左侧肿瘤未经治疗。通过以MOI为0.1的CAL1病毒感染干细胞产生CAVES，并在感染后28h收获CAVES。下表中提供的数据(右侧肿瘤进行了局部治疗；左侧肿瘤未经治疗)表明，用CAVES的治疗诱导了显著的局部和全身治疗效果(远端效应)，如在第20天，相对于右侧和左侧肿瘤的对照动物，肿瘤进展减慢所示。
Figure BDA0003148729980001141
Figure BDA0003148729980001142
然后分析治疗(右)和远处未治疗(左)肿瘤的免疫浸润。治疗后5天，切除5只对照动物和5只治疗动物的肿瘤，酶消化分离TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)。TIL进一步进行表面免疫分型和随后的细胞内Foxp3染色。应用多参数流式细胞术分析了对照和治疗肿瘤的免疫细胞浸润情况，并探讨了未治疗远处肿瘤的远端效应的机制基础。将CD45+CD11b-Low/medTIL的肿瘤浸润群体经双重鉴别和剔除死细胞后进一步细分为CD3-NKp46+NK细胞、CD3+NKp46+NKT细胞和CD3+NKP46-T细胞。将T细胞进一步分离为单个阳性CD4+或CD8+T细胞，并根据CD25和Foxp3的表达分析CD4+T细胞室，分别定量CD25+FOXP3-CD4+Teff和CD25+Foxp3+Treg。
如下表所示，流式细胞术分析显示，与治疗相关的CD4和CD8总浸润T细胞的比例增加，而CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例减少。T细胞室的改变进一步与CD25+FOXP3-CD4+Teff与Treg和CD8 T细胞与Treg的比值的改善相关。肿瘤微环境的这些变化与有利于溶瘤的条件一致，导致适应性抗肿瘤免疫的增强。此外，在治疗(右)和远处未治疗(左)的肿瘤中，免疫浸润的部分或比率也观察到类似的有利变化，为观察到的强大的远端效应提供了机制基础。
Figure BDA0003148729980001151
实施例11
具有提高治疗潜力的工程化重组溶瘤病毒的替代方法
实施例8描述了使用CRISPR/Cas9HFC(高保真Cas9)系统产生编码治疗基因的重组痘苗病毒(VACV)。或者，Cre-Lox方法可用于产生重组病毒。
构建包含两个不相容Lox序列loxM3(SEQ ID NO：49)和loxM7(SEQ ID NO：51)的受体VACV。用CRISPR/CytoSolic Cas9HF方法将不亲和的Lox序列导入CAL1基因组ORF157和ORF158之间的基因间位点。由于Lox序列的引入是在基因间位点上，因此得到的受体VACV以及编码目的治疗基因的最终产物重组病毒具有完整的ORF，并保留其原始的治疗潜力。
通过胞液重组介导的盒交换法(RMCE)将所需的治疗基因插入受体VACV中，这需要使用：(i)包含感兴趣的治疗基因和存在于受体VACV中的相同的两个不相容Lox序列的供体质粒/载体；和(ii)用于表达胞质CRE(CRE重组酶)的载体。通过在受体VACV中引入选择基因来实现所需重组病毒的选择(基于重组病毒中选择基因的存在来选择所得到的重组病毒)。
构建供体载体产生受体和重组VACV
根据ACAM2000痘苗病毒基因组序列(GenBank登录号：AY313847；SEQ ID NO：70)选择ORF_157和ORF_158之间的基因间位点左右的同源区(HR)。ORF_157和ORF_158之间的基因间位点是271bp的序列(SEQ ID NO：3)，而两个HR是基因间位点右侧555bp的序列(SEQ IDNO：4)和左侧642bp的序列(SEQ ID NO：5)。在基因间位点内有一个92bp的序列(SEQ ID NO：6)，该序列被目的治疗基因取代。利用在线软件(dna20.com/ecommerce/cas9/input)选择两个指导RNA，gRNA1(SEQ ID NO：1)和gRNA2(SEQ ID NO：43)与92bp基因间区的靶DNA特异性结合。将指导RNA引入到单独的载体中(分别用于gRNA1和gRNA2的SEQ ID NO：2和48)。每个指导RNA在慢病毒载体(lentivector)中的U6启动子控制下构建。对嘌呤霉素的抗生素耐药性包含在每个慢载体骨架中(载体得自VectorBuilder，Inc.，Shenandoah，TX)。
用于第一代受体VACV的供体载体(载体22)
为构建第一代受体VACV的供体载体，合成了以下DNA片段(Genewiz，Inc.，SanDiego，CA)：
(a)(上游)HR(左)loxM3(SEQ ID NO：49)(下游)；
(b)编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的DNA，其上游侧接VACV早/晚启动子(pEL)，下游侧接痘苗转录终止信号(SEQ ID NO：50)；而且
(c)(上游)loxM7(SEQ ID NO：51)HR(右)(下游)。
使用融合克隆试剂盒(Takara Bio USA，Inc.，Mountain View，CA)将片段按顺序(a)→(b)→(c)(上游→下游)克隆到pUC18载体(SEQ ID NO：72)中。在每个HR的两端添加多个克隆位点，以允许将来插入一个治疗基因。紧接loxM3序列之后添加限制性内切酶位点SpeI、XmaI、SmaI、NheI和BmtI，紧接loxM7序列之前添加限制性内切酶位点SphI、MscI、NotI、AgeI、SwaI和AflII。所得载体(载体22；loxM3→pEL→eGFP→loxM7)的序列如(SEQ IDNO：44)所示。
编码TurboFP635荧光蛋白的受体VACV的供体载体(载体2)
由VectorBuilder，Inc.(Shenandoah，TX)将编码VACV早/晚启动子(pEL)控制下的TurboFP635荧光蛋白的DNA引入pUC18质粒(SEQ ID NO：72)中，所述DNA的侧翼为loxM3(上游)和loxM7(下游)序列。得到的载体(载体2)pUC-loxM3-pEL-TurboFP635-loxM7的序列如(SEQ ID NO：45)所示。
编码胞浆CRE重组酶的载体
由VectorBuilder，Inc.(Shenandoah，TX)将编码来自噬菌体P1的经哺乳动物密码子优化并在CMV启动子控制下的胞浆Cre重组酶(Cre)的DNA插入慢病毒载体(载体23；SEQID NO：46)中。为制备编码胞质Cre重组酶的受体VACV，通过将在痘苗病毒早/晚启动子(pEL)控制下编码eGFP的DNA和在痘苗病毒早/晚启动子(pEL)控制下编码来自噬菌体P1的哺乳动物密码子优化的胞质Cre重组酶的DNA插入pUC18质粒(SEQ ID NO：72)中构建供体载体。在eGFP表达盒的上游插入loxM3序列，在Cre重组酶表达盒的下游插入loxM7序列。由VectorBuilder，Inc.(载体24；SEQ ID NO：47)合成在pUC18中含有loxM3→pEL→eGFP→pEL→CRE→loxM7(上游→下游)插入物的所得载体(载体24)。
(1)第一代受体痘苗病毒(R1-VACV)
获得第一代受体痘苗病毒2×106个CV-1细胞转染前1天接种于6孔板中。使用6μLTurbofectin 8.0转染试剂(Origene Technologies，Rockville，MD)用1μg Cas9HFc(胞质高保真Cas9)质粒和1μg指导RNA1转染60-80％汇合的CV-1细胞。Cas9HF1质粒得自Addgene(Cambridge，MA)；质粒#72247)。在CMV启动子(SEQ ID NO：40)的控制下，将Cas9HF胞质编码基因(Cas9HFc)克隆到pST1374(添加基因质粒ID#13426)中，或者在CMV启动子(SEQ ID NO：40)的控制下，在VectorBuilder，Inc.，(Shenandoah，TX)构建的质粒中合成Cas9HF胞质编码基因(Cas9HFc)。为最大限度地减少脱靶效应，使用了经过一些修饰的高保真Cas9蛋白(Mali，et al.(2013)Nat Methods 10(10)：957-963)。由于VACV的整个生命周期发生在细胞质中，高保真Cas9蛋白的核定位信号(NLS)被去除，导致在CMV启动子的控制下产生胞质高保真Cas9(Cas9HFc)。转染Cas9HFc和gRNA后第1天，在补充有2％FBS的DMEM高糖中以0.02的MOI感染WTI(CAL1)病毒。病毒感染后2小时，用PBS洗涤细胞一次，然后用2μg供体载体(载体22)转染细胞。细胞在37摄氏度、5％CO2和加湿气氛中孵育24小时。收集感染细胞和上清液的混合物并保存在-80摄氏度用于病毒纯化。
为纯化病毒，将感染的细胞解冻，然后在冰上以最大强度超声处理30秒，3x开/关，从细胞中释放病毒。在6孔板中用释放的病毒感染四层汇合的CV-1细胞，每板释放病毒2μL。感染后2天，在2X荧光显微镜下鉴定4-5个绿色斑块(阳性，反映eGFP表达)和对照阴性斑块(不表达eGFP)，收集于含200微升无血清DMEM的冷冻小瓶中，通过2-4轮斑块纯化，直至获得纯克隆。通过PCR和Sanger测序证实通过替换ORF_157和ORF_158之间的基因间区域的92个碱基对而将loxM3→pEL→eGFP→loxM7序列插入受体VACV(WT1或CAL1)中，其细节如下所述。
(2)治疗基因重组病毒的产生
使用编码红色荧光蛋白的供体质粒TurboFP635(载体2，上文所述)测试使用Cre/LOX系统产生表达一个或多个感兴趣基因的重组痘苗病毒的概念。用1μg编码Cre重组酶的质粒(载体23)转染60-80％汇合的CV-1细胞。24小时后，用受体病毒R1-VACV(如上所述)以0.02的MOI感染细胞。感染后2小时，用PBS洗涤细胞，并用2μg载体2转染细胞。在胞质CRE重组酶蛋白存在下，R1-VACV与载体2对应的loxM3和loxM7序列之间发生RMCE。病毒感染后24小时收集重组混合物，保存在-80摄氏度用于病毒纯化。
为纯化病毒，将感染的细胞解冻，然后在冰上以最大强度超声处理30秒，开/关3倍，从细胞中释放病毒。在6孔板中用释放的病毒感染四层汇合的CV-1细胞，每板释放病毒2μL。感染后2天，在48hpi的荧光显微镜下鉴定并选择红色斑块(阳性，反映TurboFP635的表达)(绿色斑块表示未转化且仍表达eGFP蛋白的病毒)。在一个冻融循环后，将裂解物加入到6孔板中的CV-1单层中进行第二轮空斑纯化。空斑纯化重复2-4轮，直到获得纯克隆。新的重组VACV(R1-VACV2)可作为另一受体病毒，即表达TurboFP635荧光蛋白而不是EGFP的受体病毒。用CRME法生产重组痘苗病毒的效率与CRISPR/Cas9法相当或高于CRISPR/Cas9法。
通过PCR和Sanger测序证实通过替换ORF_157和ORF_158之间的基因间区的92个碱基对而将loxM3→pEL→TurboFP635→loxM7(上游至下游)序列插入受体VACV(WT1或CAL1)中，其细节如下所述。通过用上述选自载体5-21中的一种载体替换载体2，该方法用于获得表达多种治疗蛋白的重组痘苗病毒。下面的表X15和X16总结了用于产生本文提供的病毒和CAVES的示例性载体：
表X15
Figure BDA0003148729980001171
Figure BDA0003148729980001181
表X16
Figure BDA0003148729980001182
PCR和Sanger测序
为证实转基因在受体病毒基因间位点的插入，工程化改造了一对引物来扩增基因间区：
反向引物：5'GACGAAGAAGCAAGAGATTGTGT3'(SEQ ID NO：41)
正向引物：5'ACCGTTTCCATTACCGCCA 3'(SEQ ID NO：42)。
两个引物的靶序列(互补)分别位于痘苗病毒的HR-left和HR-right上。来自Cre/lox重组之前的原始病毒的扩增子将是位于HR-left和hr-right上的引物。来自原始非重组病毒的PCR扩增子长度为230bp，而新的重组病毒扩增子的大小与插入的转基因的大小相等，加上从主干处额外增加的140bp。所有纯化克隆的PCR产物的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。
实施例12
通过抗凋亡基因的缺失和标记和/或治疗基因的插入对CAL-01/CAL-02病毒的减毒作用
CAL-01和CAL-02痘苗病毒主干可通过敲除病毒F1L基因而减毒。VACV蛋白F1L是一种在感染后早期表达的26kDa蛋白，在VACV株中广泛保守。F1L是内在线粒体凋亡的有效抑制剂。标记基因(例如，TurboFP635或eGFP)和/或治疗基因可导入F1L位点。使用实施例8中描述的CRISPR/Cas9HFC系统产生编码标记和/或治疗基因的重组痘苗病毒(VACV)。
编码F1L的基因位于CAL-01的ORF_050(ACAM2000；GenBank：登录号：AY313847.1；SEQ ID NO：70)。为消除F1L功能，移除F1L中的645bp片段(SEQ ID NO：52)并用loxM7-pEL-eGFP-loxM7-MCS(SphI，EcoRI，NotI，AgeI，SwaI，AflII)(SEQ ID NO：53)替换。
1.靶向F1L(ORF_50)指导RNA
使用在线软件(dna20.com/ecommerce/cas9/input)选择用于靶向ORF_50中F1L的指导RNA(gRNA)序列(SEQ ID Nos：54和55)。在慢病毒载体中的U6启动子控制下构建指导RNA，得到lenti-质粒(SEQ ID NO：56)(从VectorBuilder，Inc.获得的载体)。
2.eGFP取代F1L供体载体构建
基于ACAM2000痘苗病毒基因组序列(GenBank登录号：AY313847；SEQ ID NO：70)选择ORF_050的左侧(SEQ ID NO：57)和右侧(SEQ ID NO：58)的同源区(HRs)。为构建用于表达eGFP代替F1L的VACV的供体载体，合成了以下DNA片段(Genewiz，Inc.，San Diego，CA)：
(a)529bp同源左区(SEQ ID NO：57)；
(b)在VACV早期/晚期启动子(pEL)控制下的选择性标记基因(eGFP)，侧翼为loxM7，其可根据需要被Cre/LOX重组酶切除，(loxM7-pEL-eGFP-loxM7-MCS，SEQ ID NO：53)；和
(c)619bp同源右区(SEQ ID NO：58)。
将片段按顺序(a)→(b)→(c)(上游→下游)克隆到pUC57(氨苄西林)载体(SEQ IDNO：73)中。
3.构建eGFP和抗VEGF置换F1L供体载体
为构建表达eGFP和抗VEGF抗体以代替F1L的VACV的供体载体，合成了以下DNA片段(Genewiz，Inc.，San Diego，CA)：
(a)529bp同源左区(SEQ ID NO：57)；
(b)(上游)在VACV早期/晚期启动子(pEL)控制下的选择性标记基因(eGFP)和在VACV晚期启动子(pL)控制下的抗VEGF(scAb(VEGF))的单链抗体(下游)(loxM7-pEL-eGFP-loxM7-pL-scAb(VEGF)，SEQ ID NO：69)；和
(c)619bp同源右区(SEQ ID NO：58)。
将片段按顺序(a)→(b)→(c)(上游→下游)克隆到pUC57(氨苄西林)载体(SEQ IDNO：73)中。
含有ACAM2000位点修饰组合的重组病毒
CAL-02病毒(含有插入在ORF_157和ORF_158之间的治疗基因的重组病毒)被进一步修饰以在F1L位点包含重组插入的基因，并以前缀“CAL-03”表示。
Figure BDA0003148729980001201
实施例13
通过抗干扰素Gamma基因(B8R)的缺失和标记和/或治疗基因的插入来减毒CAL-01/CAL-02病毒
VACV株WR基因B8R编码一种与干扰素结合的分泌蛋白(B8)。蛋白B8与小鼠、人IFNγ受体(IFN-Rs)和粘液瘤病毒蛋白M-T7相似，是干扰素的可溶性拮抗剂。不同于细胞干扰素-Rs，B8与人、牛、大鼠和兔IFNγ的亲和力较高，与小鼠IFNγ的亲和力较低。在本例中，删除了B8R基因，并引入了标记基因(TurboFP635)来代替它。编码B8的基因位于CAL-01的ORF_201处(ACAM2000；GenBank：Accession NO：AY313847.1；SEQ ID NO：70)。删除B8R中785bp片段(SEQ ID NO：59)并用loxP-pEL-TurboFP635-loxP-MCS(EcoRI、NotI、AgeI、SwaI、AflII)(SEQ ID NO：60)替换。TurboFP635表达盒可根据需要使用Cre/LOX系统切除。
1.靶向B8R(ORF_201)指导RNA
使用在线软件(dna20.com/ecommerce/cas9/input)选择靶向ORF_201中B8R的指导RNA(gRNA)序列(SEQ ID Nos：61和62)。在慢病毒载体中的U6启动子控制下构建指导RNA，得到lenti-质粒(SEQ ID NO：63)(从VectorBuilder，Inc.获得的载体)。
2.构建以TurboFP635取代B8R供体载体
为构建表达TurboFP635代替B8R的VACV的供体载体，合成了以下DNA片段(Genewiz，Inc.，San Diego，CA)：
(a)624bp同源左区(SEQ ID NO：64)；
(b)选择性标记(TurboFP635)，在VACV早期/晚期启动子(pEL)的控制下，侧翼为loxP，其可根据需要被loxP/CRE重组酶(loxP-pEL-TurboFP635-loxP-MCS，SEQ ID NO：60)切除；并且
(c)624bp同源右区(SEQ ID NO：65)。
将片段按顺序(a)→(b)→(c)(上游→下游)克隆到pUC57(氨苄西林)载体(SEQ IDNO：73)中。
实施例14
抑制血管生成的工程化重组溶瘤病毒
血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)和血管生成素(AngPT)在血管发育和新生血管VEGF是一个与血小板源性生长因子家族相似的高度保守的受体结合胱氨酸结基序的生长因子亚家族。VEGF是参与血管生成和血管生成的信号蛋白。血管内皮生长因子A(VEGF-A)原名血管通透性因子(VPF)，是细胞产生的一种刺激血管形成的信号蛋白。
内皮细胞表达三种不同的VEGFR，属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族。它们分别被命名为VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。它们的表达几乎仅限于内皮细胞，但VEGFR-1也可在单核细胞上发现。所有VEGFR均具有7个免疫球蛋白样胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞内分裂酪氨酸激酶结构域。与Flt-1受体相比，VEGFR-2对VEGF的亲和力较低，但信号活性较高。内皮细胞的促有丝分裂活性主要由VEGFR-2介导，导致其增殖。
本实施例描述了编码抗血管生成或血管正常化基因的重组病毒的构建，例如针对VEGF的单链抗体。实体瘤的特征通常是血管系统异常，产生低氧微环境，具有免疫抑制作用，并损害抗肿瘤T细胞的活性。虽然溶瘤病毒(OV)可引发肿瘤内的血管关闭，但在摄取后，后续剂量的OV的摄取和/或免疫细胞向肿瘤的转运可因此类关闭而受损。
肿瘤通过分泌VEGF等因子来对抗缺氧诱导的氧和营养缺乏，从而启动一种形式的血管生成；然而，由此产生的血管受到结构异常的困扰，这些结构异常阻碍了治疗药物(如癌症疗法)向肿瘤核心的传递。使用抑制促血管生成因子(如VEGF)或上调抗血管生成因子的分子“血管正常化”可恢复这些信号的适当平衡并修复肿瘤血管系统，从而提高治疗的疗效。因此，本文提供的Caves/SNV组合物中使用的重组病毒可被修饰以重组表达抗血管生成因子或上调抗血管生成因子的因子。
抗血管生成因子的插入位点是ACAM2000痘苗病毒中先前描述的定位位点(在ORF157和158之间；参见实施例8)，其中可插入治疗基因而不改变所得重组病毒中的功能性病毒开放阅读框(ORF)。选择ORF_157和ORF_158(271bp；SEQ ID NO：3)之间的一个小的中间片段(92bp)被目的基因替换。如下所述，使用CRISPR/Cas9HFC(high fidelity Cas9)系统将感兴趣的基因导入到ORF_157和ORF_158之间的该基因间区。构建了以下针对VEGF、VEGFR和/或AngPT的抑制血管生成的重组溶瘤病毒。
用于产生表达血管生成抑制剂和选择基因的重组VACV的供体载体(TurboFP635)
(1)TurboFP635和抗VEGFR-2单链抗体
构建了表达抗VEGFR-2受体单链抗体的供体载体(针对痘苗病毒密码子优化)，以及在单独启动子控制下的标记基因TurboFP635。供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗VEGFR-2的单链抗体的重链的DNA(scAb(VEGFR-2)HC；SEQ ID NO：77)和编码抗VEGFR-2的单链抗体的轻链的DNA(scAb(VEGFR-2)LC；SEQ ID NO：79)，通过连接序列(SEQ ID NO：78)连接而构建的。将scAb(VEGFR-2)重组序列连接到编码IgK信号序列(SEQ ID NO：76)，其促进抗体的细胞分泌，编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)，其促进检测，以及终止子序列(SEQ ID NO：80)的DNA上。对IgK-scAb(VEGFR-2)HC-Linker-scAb(VEGFR-2)LC-FLAG-终止子序列进行密码子优化，以在痘苗病毒(例如，idtdna.com/codonopt)中表达，并置于痘苗早期/晚期启动子(PEL；SEQ ID NO：74)或可选地，晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→scAb(VEGFR-2)HC→Linker→scAb(VEGFR-2)LC→FLAG→终止子序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz公司合成(SEQID NO：81)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。IgK-scAb(VEGFR-2)HC-Linker-scAb(VEGFR-2)LC-FLAG-终止子序列可选地在痘苗病毒晚期启动子(pL；SEQ ID NO：20)的控制下构建，和/或不含FLAG标签。
(2)TurboFP635和含有融合到人IgG1的Fc部分的人VEGFR 1和2的细胞外结构域部分的重组融合蛋白
胞外结构域序列来自两种不同的VEGFR，VEGFR-1(又称Flt-1)和VEGFR-2(又称KDR或Flk-1)。每个VEGFR在其胞外区由7个免疫球蛋白(Ig)结构域组成，其中Ig结构域2和Ig结构域3贡献了VEGF的大部分结合能。该构建体靶向结合血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)和胎盘生长因子(PGF)(一种在胎盘中发现的与血管内皮生长因子同源的生长因子)。VEGFR-1作为VEGF-A、VEFG-B和PGF的细胞表面受体；VEGFR-2作为VEGF-A和血管内皮生长因子C和D(分别为VEGF-C和VEGF-D)的细胞表面受体。
构建了表达痘苗病毒密码子优化的融合蛋白的供体载体，该融合蛋白含有融合到人IgG1的Fc部分的VEGFR-1和VEGFR-2胞外结构域的部分(“融合蛋白”)，以及在单独启动子控制下的标记基因TurboFP635。供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码融合蛋白的DNA(SEQ ID NO：82)，该融合蛋白与编码IgK信号序列(SEQ ID NO：76)的DNA连接，该IgK信号序列(SEQ ID NO：76)，该IgK信号序列(SEQ ID NO：76)，该IgK信号序列(SEQ ID NO：29)，该IgK信号序列(SEQ ID NO：29)，该FLAG标签(SEQ ID NO：29)，该FLAG标签(SEQ ID NO：29)，该FLAG标签(SEQ ID NO：29)，该FLAG标签(SEQ ID NO：80)编码终止子序列(SEQ ID NO：80)。对IgK-融合蛋白-FLAG-终止子序列进行密码子优化以在痘苗病毒中表达(例如，idtdna.com/codonopt)，并将其置于痘苗早期/晚期启动子(PEL；SEQ ID NO：74)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→融合蛋白→FLAG→终止子序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz公司合成(SEQ ID NO：83)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。IgK-scAb(VEGF-A融合蛋白)-FLAG-终止子序列可选地在痘苗病毒后期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下构建，和/或在没有FLAG标签的情况下构建。
(3)抗ANGPT2单链抗体TurboFP635
ANGPT2编码血管生成素1(ANGPT1)和内皮酪氨酸激酶(TIE-2、TEK)的拮抗剂。ANGPT2破坏ANGPT1的血管重构能力，可诱导内皮细胞凋亡。
构建了一个表达抗痘苗病毒ANGPT2(密码子优化)单链抗体的供体载体，该载体与标记基因TurboFP635在单独的启动子控制下一起表达。供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗ANGPT2的单链抗体的重链的DNA(scAb(ANGPT2)HC；SEQ IDNO：84)和编码抗ANGPT2的单链抗体的轻链的DNA(scAb(ANGPT2)LC；SEQ ID NO：85)并通过接头序列(SEQ ID NO：78)连接而构建的。将scAb(ANGPT2)重组序列连接到编码IgK信号序列(SEQ ID NO：76)，其促进抗体的细胞分泌，编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)，其促进检测，以及终止子序列(SEQ ID NO：80)的DNA上。对IgK-scAb(ANGPT2)HC-Linker-scAb(ANGPT2)LC-FLAG-终止子序列进行密码子优化以在痘苗病毒(例如，idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗早期/晚期启动子(PEL；SEQ ID NO：74)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→scAb(ANGPT2)HC→Linker→scAb(ANGPT2)LC→FLAG→终止子序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：86)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。IgK-scAb(ANGPT2)HC-接头-Scab(ANGPT2)LC-FLAG-终止子序列可选地在痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下构建，和/或不含FLAG标签。
(4)TurboFP635与抗VEGF-A单链抗体
构建了表达VEGF-A(痘苗病毒密码子优化)单链抗体及标记基因TurboFP635的供体载体。供体载体是通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入编码抗VEGF-A的单链抗体的重链的DNA(scAb(VEGF-A)HC；SEQ ID NO：87)和编码抗VEGF-A的单链抗体的轻链的DNA(scAb(VEGF-A)LC；SEQ ID NO：88)，通过连接序列(SEQ ID NO：78)连接而构建的。将scAb(VEGF-A)重组序列连接到编码IgK信号序列(SEQ ID NO：76)，其促进抗体的细胞分泌，编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)，其促进检测，以及终止子序列(SEQ ID NO：80)的DNA上。对IgK-scAb(VEGF-A)HC-Linker-scAb(VEGF-A)LC-FLAG-终止子序列进行密码子优化以在痘苗病毒(例如，idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗早期/晚期启动子(PEL；SEQ IDNO：74)的控制下。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→scAb(VEGF-A)HC→Linker→scAb(VEGF-A)LC→FLAG→终止子序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz，Inc.合成(SEQ ID NO：89)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。IgK-scAb(VEGF-A)HC-Linker-scAb(VEGF-A)LC-FLAG-终止子序列可选地在痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下构建，和/或不含FLAG标签。
编码两个单链抗体和一个选择基因(TurboFP635)的供体载体
(1)抗VEGF-A的单链抗体和抗ANGPT2的单链抗体呈相反方向
构建了用于表达两种血管生成抑制剂的供体载体：抗VEGF-A的单链抗体和抗ANGPT-2(针对痘苗病毒优化的密码子)的单链抗体，各自由pEL(SEQ ID NO：74)或pL(SEQID NO：20)启动子独立控制，以及由单独启动子控制的标记基因TurboFP635。一种示例性供体载体，其编码：(a)抗VEGF-A的单链抗体(scAb(VEGF-A))，所述单链抗体与编码IgK信号序列、FLAG标签和终止子序列的DNA连接，并且在痘苗病毒早/晚启动子(PEL；SEQ ID NO：74)的控制下；和(b)以与(a)相反的方向连接到编码IgK信号序列、FLAG标签和终止子序列的DNA并在痘苗病毒早/晚启动子(PEL；SEQ ID NO：74)控制下的抗ANGPT2的单链抗体(scAb(ANGPT2))。
通过使用SphI限制性内切酶线性化载体1并插入：(1)编码抗VEGF-A单链抗体重链的DNA(scAb(VEGF-A)HC；SEQ ID NO：87)和编码抗VEGF-A的单链抗体轻链的DNA(scAb(VEGF-A)LC；SEQ ID NO：88)，由接头序列(SEQ ID NO：78)连接，并进一步连接到编码促进抗体的细胞分泌的IgK信号序列(SEQ ID NO：76)的DNA、编码促进检测的FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA和终止子序列(SEQ ID NO：80)；和(2)编码抗ANGPT2(scAb(ANGPT2)HC的单链抗体的重链的DNA；SEQ ID NO：84)和编码抗ANGPT2的单链抗体的轻链的DNA(scAb(ANGPT2)LC；SEQ IDNO：85)，由接头序列(SEQ ID NO：78)连接，并进一步连接到编码IgK信号序列(SEQ ID NO：76)的DNA(其促进抗体的细胞分泌)、编码FLAG标签(SEQ ID NO：29)的DNA(其促进检测)和终止子序列(SEQ ID NO：80)，IgK-scAb(VEGF-A)HC-Linker-scAb(VEGF-A)LC-Flag-终止子序列经密码子优化以在痘苗病毒(例如，idtdna.com/codonopt)中表达，并置于痘苗早期/晚期启动子(pEL；对IgK-scAb(ANGPT2)HC-Linker-scAb(ANGPT2)LC-Flag-终止子序列进行密码子优化以在痘苗病毒(例如，idtdna.com/codonopt)中表达，并将其置于痘苗早期/晚期启动子(PEL；将IgK-scAb(VEGF-A)HC-Linker-scAb(VEGF-A)LC-Flag-终止子序列和IgK-scAb(ANGPT2)HC-Linker-scAb(ANGPT2)LC-FLAG-终止子序列以相反的方向插入。含有loxP→pEL→TurboFP635→loxP→pEL→IgK→scAb(VEGF-A)HC→Linker→scAb(VEGF-A)LC→FLAG→终止子←终止子←FLAG←scAb(ANGPT2)LC←Linker←scAb(ANGPT2)HC←IgK←pEL序列(上游→下游)的所得载体由Genewiz公司合成(SEQ ID NO：90)。载体的序列通过Sanger测序(Retrogen，Inc.，San Diego，CA)确认。TurboFP635盒可作为选择基因，并可根据需要使用loxP/CRE重组酶进行切除。IgK-scAb(VEGF-A)HC-Linker-scAb(VEGF-A)LC-Flag-终止子序列和IgK-scAb(ANGPT2)HC-Linker-scAb(ANGPT2)LC-FLAG-终止子序列可选地在痘苗病毒晚期启动子(PL；SEQ ID NO：20)的控制下构建，和/或在没有FLAG标签的情况下构建。
实施例15
CAVES增强检查点抑制剂的治疗效果
本实施例证明，本文提供的CAVES组合物在作为组合疗法施用时可增加其它治疗剂如检查点抑制剂的治疗功效。
小鼠结肠癌模型(CT26)
将2×106个CT26细胞皮下注射到4～6周裸鼠右肋，产生结肠肿瘤。注射肿瘤细胞8天后，小鼠按以下方法处理：
(1)瘤内注射1×106SNV-1c(第0天)；
(2)通过全身施用抗PD1(每只动物200微克，腹腔注射，克隆RMP1-14，Bio X细胞)处理；
(3)瘤内注射1×106SNV-1c(第0天)，第2天全身注射抗PD1；或
(4)对照小鼠，瘤内注射PBS(每个治疗组n＝8)。
对于单次瘤内注射，数据显示在瘤内注射到CT26肿瘤后的第17天，对照动物显示出约2000mm3的平均肿瘤体积。相比之下，用抗PD1治疗在第17天导致平均肿瘤体积约为1450mm3。用SNV-1c治疗可使肿瘤进展稍有减缓，第17天的平均肿瘤体积约为1200mm3。用抗PD1和SNV-1c治疗的小鼠显示出协同获益，在第17天的平均肿瘤体积约为900mm3。
在另一个实验中，将2×106个CT26结肠癌小鼠细胞皮下注射到免疫活性BALB/c小鼠的右肋。接种肿瘤后10(10)天，用单剂量1×106CAVES或CAVES联合抗小鼠PD1(每只动物200微克，克隆RMP1-14，Bio X细胞)治疗小鼠3次，每2天。在MOI为0.1的情况下用CAL1病毒感染干细胞，在感染后28h收获，产生CAVES。腹腔注射抗PD1后2天。下表中的数据显示，当与CAVES治疗联合使用时，抗PD1治疗效果增强。
Figure BDA0003148729980001241
前列腺癌模型
将2×106个RM1前列腺癌细胞皮下注射到4-6周无胸腺裸鼠右肋，产生前列腺肿瘤。在注射肿瘤细胞20天后，将小鼠进行如下处理：
(1)瘤内注射1×106SNV-1c(第0天)；
(2)通过全身施用抗PD1(每只动物200微克，腹腔注射，克隆RMP1-14，Bio X细胞)处理；
(3)瘤内注射1×106SNV-1c(第0天)，第2天全身注射抗PD1；
(4)瘤内注射1×106SNV-3c：1×105pfu CAL3病毒(见实施例12)，与脂肪源干细胞孵育(MOI＝0.2持续28小时)
(5)瘤内注射1×106SNV-3c(第0天)，第2天全身注射抗PD1；或
(6)对照小鼠，瘤内注射PBS(每个治疗组n＝8)。
对于单次瘤内注射，数据显示在瘤内注射到CT26肿瘤后的第10天，对照动物显示肿瘤体积平均增加45-50倍。单用抗-PD1治疗的动物肿瘤体积的平均倍数增加与对照组相似。用SNV-1c治疗可显著减缓肿瘤进展，肿瘤体积平均增加约16倍。通过比较，同时用抗PD1和SNV-1c治疗的小鼠显示肿瘤体积的平均倍数增加约24-25倍。
含有表达抗血管生成因子的病毒的SNV-3c组合物被发现更有效地增强抗PD1的治疗效果。SNV-3c治疗可显著减缓肿瘤进展，第10天肿瘤体积平均增加12倍左右。用抗PD1和SNV-3c治疗的小鼠显示肿瘤进展更慢，在第10天肿瘤体积平均增加约7倍。
因此，本文提供的组合物可用于与其它抗癌治疗和药剂(如检查点抑制剂)的组合疗法，以增强其功效。
由于修改对本领域技术人员是显而易见的，因此本发明仅受所附权利要求的范围限制。
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<400> 1
uauugauguc gaaaaggagc 20
<210> 2
<211> 7705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector encoding gRNA1 (SEQ ID NO:1)
<400> 2
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt 1920
actagtgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 1980
agagagataa ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 2040
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 2100
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 2160
aaaggacgaa acaccgcgag gaaaagctgt agttatgttt tagagctaga aatagcaagt 2220
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttgt 2280
tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg tttttagcgc gtgcgccaat 2340
tctgcagaca aatggctcta gaggtaccga attccaactt tgtatagaaa agttggggtt 2400
gcgccttttc caaggcagcc ctgggtttgc gcagggacgc ggctgctctg ggcgtggttc 2460
cgggaaacgc agcggcgccg accctgggtc tcgcacattc ttcacgtccg ttcgcagcgt 2520
cacccggatc ttcgccgcta cccttgtggg ccccccggcg acgcttcctg ctccgcccct 2580
aagtcgggaa ggttccttgc ggttcgcggc gtgccggacg tgacaaacgg aagccgcacg 2640
tctcactagt accctcgcag acggacagcg ccagggagca atggcagcgc gccgaccgcg 2700
atgggctgtg gccaatagcg gctgctcagc agggcgcgcc gagagcagcg gccgggaagg 2760
ggcggtgcgg gaggcggggt gtggggcggt agtgtgggcc ctgttcctgc ccgcgcggtg 2820
ttccgcattc tgcaagcctc cggagcgcac gtcggcagtc ggctccctcg ttgaccgaat 2880
caccgacctc tctccccagg caagtttgta caaaaaagca ggctgccacc atgaccgagt 2940
acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg 3000
ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg 3060
agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg 3120
tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag 3180
cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg 3240
ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt 3300
tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg 3360
tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg 3420
cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg 3480
tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga acccagcttt 3540
cttgtacaaa gtggtggtac ccgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 3600
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 3660
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 3720
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 3780
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 3840
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 3900
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 3960
gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 4020
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 4080
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 4140
ggccgcctcc ccgcatcggc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 4200
cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 4260
ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 4320
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 4380
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 4440
gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt 4500
gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac 4560
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 4620
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc 4680
taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct 4740
gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga 4800
agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag ggacgtaccc aattcgccct atagtgagtc 4860
gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 4920
tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 4980
ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc 5040
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 5100
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 5160
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 5220
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 5280
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 5340
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 5400
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 5460
ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 5520
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 5580
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 5640
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 5700
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 5760
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 5820
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 5880
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 5940
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 6000
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 6060
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 6120
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 6180
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 6240
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 6300
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 6360
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 6420
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 6480
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 6540
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 6600
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 6660
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 6720
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 6780
cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 6840
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 6900
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 6960
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 7020
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaaga gagaaaggcg 7080
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 7140
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 7200
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 7260
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 7320
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 7380
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 7440
cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7500
aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7560
gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 7620
cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg 7680
gaacaaaagc tggagctgca agctt 7705
<210> 3
<211> 271
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intergenic locus between ORF_157 and ORF_158
<400> 3
agatttccga agttcagctt ttaggactgt gattcttttt ctttcgaatt cacagctgga 60
tgtacaaccg tttccattac cgccatctct aagtttcttt tctagatcgg caacatttca 120
tccccatgcc ttttacattc ctcgagtcta ctgtcgtcga aatatcgttc cagctccttt 180
tcgacatcaa taactttagc acgttgtctc tcaagctctc ttttgtagtt atctgattcc 240
ctggcacgtt taagatcttc atgcaattga g 271
<210> 4
<211> 555
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous region to the right of the intergenic locus between
ORF_157 and ORF_158
<400> 4
aagatcttca tgcaattgag tcagctctta acacaatctc ttgcttcttc gtcatagtac 60
ttacaatcac tatgggatcc attgttacca cgtctacact cggcgagctc gcgtttaaga 120
gattcaattt cccgtttgta ttggtccatg tttccattgc taccaccatt agatttacag 180
gctgctagtt gtcgttcgag atcagaaata cgggttttct tggaattgat ttcgtcgatg 240
tacttggcat cgaaacactt attaagttct ttttccaatt ctacgatttt atttctttcg 300
cgagtcaatt ccctcctgta gtaactatct gttttgtcag attcacgctc tctacgtaga 360
ctttcttgca agttactaat ttgttcccta gcacgtccga gtttagtttt atatgccgaa 420
tagagttctg attcatcctt tgagcagatc tctagagatc gttcaagatc cctgattcta 480
gtctttagcc tatttacctc ctcggaagat gctccgttac cgttgcgttt acactcgtta 540
agctgtctat caaga 555
<210> 5
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous region to the left of the intergenic locus between
ORF_157 and ORF_158
<400> 5
gatactgaag tctgatattc agaaagctgg gggatgttct ggttcgacat ccaccgatgg 60
tgtcacatca ctaatcggtt cggtaacgtc tgtggatgga ggtgctactt ctacagaacc 120
tgtagcctca gttgtcaacg gagatacatt tttaatgcga ggaaatgtat aatttggtaa 180
tggtttctca tgtggatctg aagaagaggt aagatatcta ctagaaagat accgatcacg 240
ttctagttct cttttgtaga acttaacttt ttctttctca gcatctagtt gatattccaa 300
cctcttcacg ttactacgtt cagatttcaa ttcacgttcg catgggttac ctccgcagtt 360
tttacgagcg atttcacgtt cagccttcat gcgtctttcc ctctctctat cgagtttatc 420
agagcagtct ttctgaaggc gatcgaactc cataaatttc tccaacgctt tgattgtttc 480
catagatttc cgaagttcag cttttaggac tgtgattctt tttctttcga attcacagct 540
ggatgtacaa ccgtttccat taccgccatc tctaagtttc ttttctagat cggcaacatt 600
tcatccccat gccttttaca ttcctcgagt ctactgtcgt cg 642
<210> 6
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence within the intergenic locus between ORF_157 and ORF_158
that is replaced by the therapeutic gene of interest
<400> 6
aaatatcgtt ccagctcctt ttcgacatca ataactttag cacgttgtct ctcaagctct 60
cttttgtagt tatctgattc cctggcacgt tt 92
<210> 7
<211> 740
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment containing the multiple cloning site 1 and the left
homologous region
<400> 7
caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca aagcttcaat tgctgcagga 60
tactgaagtc tgatattcag aaagctgggg gatgttctgg ttcgacatcc accgatggtg 120
tcacatcact aatcggttcg gtaacgtctg tggatggagg tgctacttct acagaacctg 180
tagcctcagt tgtcaacgga gatacatttt taatgcgagg aaatgtataa tttggtaatg 240
gtttctcatg tggatctgaa gaagaggtaa gatatctact agaaagatac cgatcacgtt 300
ctagttctct tttgtagaac ttaacttttt ctttctcagc atctagttga tattccaacc 360
tcttcacgtt actacgttca gatttcaatt cacgttcgca tgggttacct ccgcagtttt 420
tacgagcgat ttcacgttca gccttcatgc gtctttccct ctctctatcg agtttatcag 480
agcagtcttt ctgaaggcga tcgaactcca taaatttctc caacgctttg attgtttcca 540
tagatttccg aagttcagct tttaggactg tgattctttt tctttcgaat tcacagctgg 600
atgtacaacc gtttccatta ccgccatctc taagtttctt ttctagatcg gcaacatttc 660
atccccatgc cttttacatt cctcgagtct actgtcgtcg gagctcccat gggctagcat 720
aacttcgtat agcatacatt 740
<210> 8
<211> 961
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment containing the multiple cloning site 2, loxP, red
fluorescent protein TurboFP635 flanked by the Vaccinia virus
early/late promoter (pEL; SEQ ID NO:19) and multiple cloning site
3
<400> 8
gagctcccat gggctagcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atactagtcc 60
cggggctagc aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata agctcgaagt 120
cgaccaccat ggtgggtgag gatagcgtgc tgatcaccga gaacatgcac atgaaactgt 180
acatggaggg caccgtgaac gaccaccact tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc 240
cctacgaggg cacccagacc atgaagatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg 300
ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aacctttatc aaccacaccc 360
agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagaggatca 420
ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc cagaacggct 480
gcctcatcta caacgtcaag atcaacgggg tgaacttccc atccaacggc cctgtgatgc 540
agaagaaaac actcggctgg gaggccagca ccgagatgct gtaccccgct gacagcggcc 600
tgagaggcca tagccagatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggctacctg cactgctccc 660
tcaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc ggcttctact 720
tcgtggacag gagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac gtcgagcagc 780
acgagatggc tgtggccagg tactgcgacc tgcctagcaa actggggcac agctgattaa 840
ttaattttta tcgatctaat tcaacaatgt ctggaaccgg tcttaagata acttcgtata 900
gcatacatta tacgaagtta tggatccgca tgcgatatca tttaaatgcg gccgcgagct 960
c 961
<210> 9
<211> 4659
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 1 (pIg-loxP-TurboFP635)
<400> 9
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120
cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180
tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaaagcttc 240
aattgctgca ggatactgaa gtctgatatt cagaaagctg ggggatgttc tggttcgaca 300
tccaccgatg gtgtcacatc actaatcggt tcggtaacgt ctgtggatgg aggtgctact 360
tctacagaac ctgtagcctc agttgtcaac ggagatacat ttttaatgcg aggaaatgta 420
taatttggta atggtttctc atgtggatct gaagaagagg taagatatct actagaaaga 480
taccgatcac gttctagttc tcttttgtag aacttaactt tttctttctc agcatctagt 540
tgatattcca acctcttcac gttactacgt tcagatttca attcacgttc gcatgggtta 600
cctccgcagt ttttacgagc gatttcacgt tcagccttca tgcgtctttc cctctctcta 660
tcgagtttat cagagcagtc tttctgaagg cgatcgaact ccataaattt ctccaacgct 720
ttgattgttt ccatagattt ccgaagttca gcttttagga ctgtgattct ttttctttcg 780
aattcacagc tggatgtaca accgtttcca ttaccgccat ctctaagttt cttttctaga 840
tcggcaacat ttcatcccca tgccttttac attcctcgag tctactgtcg tcggagctcc 900
catgggctag cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatactag tcccggggct 960
agcaaaaatt gaaattttat tttttttttt tggaatataa ataagctcga agtcgaccac 1020
catggtgggt gaggatagcg tgctgatcac cgagaacatg cacatgaaac tgtacatgga 1080
gggcaccgtg aacgaccacc acttcaagtg cacatccgag ggcgaaggca agccctacga 1140
gggcacccag accatgaaga tcaaggtggt cgagggcggc cctctcccct tcgccttcga 1200
catcctggct accagcttca tgtacggcag caaaaccttt atcaaccaca cccagggcat 1260
ccccgacttc tttaagcagt ccttccctga gggcttcaca tgggagagga tcaccacata 1320
cgaagacggg ggcgtgctga ccgctaccca ggacaccagc ctccagaacg gctgcctcat 1380
ctacaacgtc aagatcaacg gggtgaactt cccatccaac ggccctgtga tgcagaagaa 1440
aacactcggc tgggaggcca gcaccgagat gctgtacccc gctgacagcg gcctgagagg 1500
ccatagccag atggccctga agctcgtggg cgggggctac ctgcactgct ccctcaagac 1560
cacatacaga tccaagaaac ccgctaagaa cctcaagatg cccggcttct acttcgtgga 1620
caggagactg gaaagaatca aggaggccga caaagagacc tacgtcgagc agcacgagat 1680
ggctgtggcc aggtactgcg acctgcctag caaactgggg cacagctgat taattaattt 1740
ttatcgatct aattcaacaa tgtctggaac cggtcttaag ataacttcgt atagcataca 1800
ttatacgaag ttatggatcc gcatgcgata tcatttaaat gcggccgcga gctcaagatc 1860
ttcatgcaat tgagtcagct cttaacacaa tctcttgctt cttcgtcata gtacttacaa 1920
tcactatggg atccattgtt accacgtcta cactcggcga gctcgcgttt aagagattca 1980
atttcccgtt tgtattggtc catgtttcca ttgctaccac cattagattt acaggctgct 2040
agttgtcgtt cgagatcaga aatacgggtt ttcttggaat tgatttcgtc gatgtacttg 2100
gcatcgaaac acttattaag ttctttttcc aattctacga ttttatttct ttcgcgagtc 2160
aattccctcc tgtagtaact atctgttttg tcagattcac gctctctacg tagactttct 2220
tgcaagttac taatttgttc cctagcacgt ccgagtttag ttttatatgc cgaatagagt 2280
tctgattcat cctttgagca gatctctaga gatcgttcaa gatccctgat tctagtcttt 2340
agcctattta cctcctcgga agatgctccg ttaccgttgc gtttacactc gttaagctgt 2400
ctatcaagac acgtgggcgc ccctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 2460
ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 2520
gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 2580
cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 2640
atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 2700
catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 2760
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 2820
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 2880
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 2940
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 3000
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 3060
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 3120
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 3180
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 3240
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 3300
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 3360
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 3420
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 3480
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 3540
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 3600
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 3660
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 3720
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 3780
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 3840
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 3900
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 3960
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 4020
gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 4080
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 4140
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 4200
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 4260
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 4320
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 4380
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 4440
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 4500
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 4560
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 4620
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaaga 4659
<210> 10
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single chain antibody against VEGF (scAb(VEGF))
<400> 10
gaggtgcagt tggttgagtc gggaggtggt ttggttcaac ctggaggtag tcttcgatta 60
tcttgcgcag ccagtggttt cactataagt gattattgga ttcattgggt tcgtcaagcc 120
cccggtaagg gattagaatg ggttgcagga ataacaccag ccggtggata tacgtattac 180
gccgactccg ttaagggacg ttttacgatt tcagccgaca cgtctaaaaa cactgcgtac 240
cttcagatga attctcttag agctgaagat acggcagtgt actactgtgc tcgttttgtg 300
tttttcttgc cttacgcaat ggattactgg ggacagggaa ctctagttac ggtttcatcg 360
ggaggaggtg gttctggtgg aggtggatcc ggaggaggtg gttcggatat tcaaatgacc 420
cagtcgccaa gttccttatc agcatctgtg ggagacagag tgacaatcac ttgtagagct 480
tcgcaagatg tatccacggc tgtagcttgg tatcaacaaa agccaggtaa agctccaaaa 540
ctattaatat actcagcatc atttctatat tctggtgtac cttcccgatt ctcgggttcg 600
ggttctggaa ccgatttcac cttgaccatc agttcgttac aaccggagga tttcgccaca 660
tattactgcc aacaaggata tggtaatcca ttcacttttg gacaaggaac gaaggtagaa 720
atcaagcga 729
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgK signal peptide
<400> 11
atggagactg atacccttct tttatgggtc ctacttttat gggtgccggg ttcaacggga 60
gat 63
<210> 12
<211> 1811
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 3 (loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pL-IgK-scAb(VEGF)-FLAG)
<400> 12
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatactagt cccggggcta gcaaaaattg 60
aaattttatt tttttttttt ggaatataaa taagctcgaa gtcgaccacc atggtgggtg 120
aggatagcgt gctgatcacc gagaacatgc acatgaaact gtacatggag ggcaccgtga 180
acgaccacca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag ggcacccaga 240
ccatgaagat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac atcctggcta 300
ccagcttcat gtacggcagc aaaaccttta tcaaccacac ccagggcatc cccgacttct 360
ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagaggat caccacatac gaagacgggg 420
gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccagaacgg ctgcctcatc tacaacgtca 480
agatcaacgg ggtgaacttc ccatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa acactcggct 540
gggaggccag caccgagatg ctgtaccccg ctgacagcgg cctgagaggc catagccaga 600
tggccctgaa gctcgtgggc gggggctacc tgcactgctc cctcaagacc acatacagat 660
ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcttcta cttcgtggac aggagactgg 720
aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca gcacgagatg gctgtggcca 780
ggtactgcga cctgcctagc aaactggggc acagctgatt aattaatttt tatcgatcta 840
attcaacaat gtctggaacc ggtcttaaga taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 900
tatggatccg tttttttttt tttttttttt ggcatataaa taagccgacc accatggaga 960
ctgataccct tcttttatgg gtcctacttt tatgggtgcc gggttcaacg ggagatgagg 1020
tgcagttggt tgagtcggga ggtggtttgg ttcaacctgg aggtagtctt cgattatctt 1080
gcgcagccag tggtttcact ataagtgatt attggattca ttgggttcgt caagcccccg 1140
gtaagggatt agaatgggtt gcaggaataa caccagccgg tggatatacg tattacgccg 1200
actccgttaa gggacgtttt acgatttcag ccgacacgtc taaaaacact gcgtaccttc 1260
agatgaattc tcttagagct gaagatacgg cagtgtacta ctgtgctcgt tttgtgtttt 1320
tcttgcctta cgcaatggat tactggggac agggaactct agttacggtt tcatcgggag 1380
gaggtggttc tggtggaggt ggatccggag gaggtggttc ggatattcaa atgacccagt 1440
cgccaagttc cttatcagca tctgtgggag acagagtgac aatcacttgt agagcttcgc 1500
aagatgtatc cacggctgta gcttggtatc aacaaaagcc aggtaaagct ccaaaactat 1560
taatatactc agcatcattt ctatattctg gtgtaccttc ccgattctcg ggttcgggtt 1620
ctggaaccga tttcaccttg accatcagtt cgttacaacc ggaggatttc gccacatatt 1680
actgccaaca aggatatggt aatccattca cttttggaca aggaacgaag gtagaaatca 1740
agcgagacta caaagacgac gacgacaaat aattaattaa tttttatcga tctaattcaa 1800
caatgtctgg a 1811
<210> 13
<211> 6679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 4 (loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pE-hNIS)
<400> 13
ttattaagtt ctttttccaa ttctacgatt ttatttcttt cgcgagtcaa ttccctcctg 60
tagtaactat ctgttttgtc agattcacgc tctctacgta gactttcttg caagttacta 120
atttgttccc tagcacgtcc gagtttagtt ttatatgccg aatagagttc tgattcatcc 180
tttgagcaga tctctagaga tcgttcaaga tccctgattc tagtctttag cctatttacc 240
tcctcggaag atgctccgtt accgttgcgt ttacactcgt taagctgtct atcaagacac 300
gtgggcgccc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 360
atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 420
gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 480
agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 540
cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 600
ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 660
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 720
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 780
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 840
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 900
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 960
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1020
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1080
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1140
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1200
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1260
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1320
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1380
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1440
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 1500
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 1560
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 1620
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 1680
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 1740
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 1800
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 1860
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 1920
tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 1980
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2040
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2100
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2160
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2220
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2280
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2340
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2400
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2460
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2520
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2580
ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 2640
gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 2700
gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 2760
ctatgaccat gattacgcca aagcttcaat tgctgcagga tactgaagtc tgatattcag 2820
aaagctgggg gatgttctgg ttcgacatcc accgatggtg tcacatcact aatcggttcg 2880
gtaacgtctg tggatggagg tgctacttct acagaacctg tagcctcagt tgtcaacgga 2940
gatacatttt taatgcgagg aaatgtataa tttggtaatg gtttctcatg tggatctgaa 3000
gaagaggtaa gatatctact agaaagatac cgatcacgtt ctagttctct tttgtagaac 3060
ttaacttttt ctttctcagc atctagttga tattccaacc tcttcacgtt actacgttca 3120
gatttcaatt cacgttcgca tgggttacct ccgcagtttt tacgagcgat ttcacgttca 3180
gccttcatgc gtctttccct ctctctatcg agtttatcag agcagtcttt ctgaaggcga 3240
tcgaactcca taaatttctc caacgctttg attgtttcca tagatttccg aagttcagct 3300
tttaggactg tgattctttt tctttcgaat tcacagctgg atgtacaacc gtttccatta 3360
ccgccatctc taagtttctt ttctagatcg gcaacatttc atccccatgc cttttacatt 3420
cctcgagtct actgtcgtcg gagctcccat gggctagcat aacttcgtat agcatacatt 3480
atacgaagtt atactagtcc cggggctagc aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg 3540
aatataaata agctcgaagt cgaccaccat ggtgggtgag gatagcgtgc tgatcaccga 3600
gaacatgcac atgaaactgt acatggaggg caccgtgaac gaccaccact tcaagtgcac 3660
atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgaagatca aggtggtcga 3720
gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa 3780
aacctttatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg 3840
cttcacatgg gagaggatca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga 3900
caccagcctc cagaacggct gcctcatcta caacgtcaag atcaacgggg tgaacttccc 3960
atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggccagca ccgagatgct 4020
gtaccccgct gacagcggcc tgagaggcca tagccagatg gccctgaagc tcgtgggcgg 4080
gggctacctg cactgctccc tcaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct 4140
caagatgccc ggcttctact tcgtggacag gagactggaa agaatcaagg aggccgacaa 4200
agagacctac gtcgagcagc acgagatggc tgtggccagg tactgcgacc tgcctagcaa 4260
actggggcac agctgattaa ttaattttta tcgatctaat tcaacaatgt ctggaaccgg 4320
tcttaagata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggatccgca tgcgatatca 4380
tttaaatgcg gccaaaaatt gaaaaactag cgtctttttt tgctcgaagt cgaccaccat 4440
ggaggccgtg gagaccgggg aacggcccac cttcggagcc tgggactacg gggtctttgc 4500
cctcatgctc ctggtgtcca ctggcatcgg gctgtgggtc gggctggctc ggggcgggca 4560
gcgcagcgct gaggacttct tcaccggggg ccggcgcctg gcggccctgc ccgtgggcct 4620
gtcgctgtct gccagcttca tgtcggccgt gcaggtgctg ggcgtgccgt cggaggccta 4680
tcgctatggc ctcaagttcc tctggatgtg cctgggccag cttctgaact cggtcctcac 4740
cgccctgctc ttcatgcccg tcttctaccg cctgggcctc accagcacct acgagtacct 4800
ggagatgcgc ttcagccgcg cagtgcggct ctgcgggact ttgcagtaca ttgtagccac 4860
gatgctgtac accggcatcg taatctacgc accggccctc atcctgaacc aagtgaccgg 4920
gctggacatc tgggcgtcgc tcctgtccac cggaattatc tgcaccttct acacggctgt 4980
gggcggcatg aaggctgtgg tctggactga tgtgttccag gtcgtggtga tgctaagtgg 5040
cttctgggtt gtcctggcac gcggtgtcat gcttgtgggc gggccccgcc aggtgctcac 5100
gctggcccag aaccactccc ggatcaacct catggacttt aaccctgacc cgaggagccg 5160
ctatacattc tggacttttg tggtgggtgg cacgttggtg tggctctcca tgtatggcgt 5220
gaaccaggcg caggtgcagc gctacgtggc ttgccgcaca gagaagcagg ccaagctggc 5280
cctgctcatc aaccaggtcg gcctgttcct gatcgtgtcc agcgctgcct gctgtggcat 5340
cgtcatgttt gtgttctaca ctgactgcga ccctctcctc ctggggcgca tctctgcccc 5400
agaccagtac atgcctctgc tggtgctgga catcttcgaa gatctgcctg gagtccccgg 5460
gcttttcctg gcctgtgctt acagtggcac cctcagcaca gcatccacca gcatcaatgc 5520
tatggctgca gtcactgtag aagacctcat caaacctcgg ctgcggagcc tggcacccag 5580
gaaactcgtg attatctcca aggggctctc actcatctac ggatcggcct gtctcaccgt 5640
ggcagccctg tcctcactgc tcggaggagg tgtccttcag ggctccttca ccgtcatggg 5700
agtcatcagc ggccccctgc tgggagcctt catcttggga atgttcctgc cggcctgcaa 5760
cacaccgggc gtcctcgcgg gactaggcgc gggcttggcg ctgtcgctgt gggtggcctt 5820
gggcgccacg ctgtacccac ccagcgagca gaccatgagg gtcctgccat cgtcggctgc 5880
ccgctgcgtg gctctctcag tcaacgcctc tggcctcctg gacccggctc tcctccctgc 5940
taacgactcc agcagggccc ccagctcagg aatggacgcc agccgacccg ccttagctga 6000
cagcttctat gccatctcct atctctatta cggtgccctg ggcacgctga ccactgtgct 6060
gtgcggagcc ctcatcagct gcctgacagg ccccaccaag cgcagcaccc tggccccggg 6120
attgttgtgg tgggacctcg cacggcagac agcatcagtg gcccccaagg aagaagtggc 6180
catcctggat gacaacttgg tcaagggtcc tgaagaactc cccactggaa acaagaagcc 6240
ccctggcttc ctgcccacca atgaggatcg tctgtttttc ttggggcaga aggagctgga 6300
gggggctggc tcttggaccc cctgtgttgg acatgatggt ggtcgagacc agcaggagac 6360
aaacctctga ttaattaatt tttatcgatc taattcaaca atgtctggag gccgcgagct 6420
caagatcttc atgcaattga gtcagctctt aacacaatct cttgcttctt cgtcatagta 6480
cttacaatca ctatgggatc cattgttacc acgtctacac tcggcgagct cgcgtttaag 6540
agattcaatt tcccgtttgt attggtccat gtttccattg ctaccaccat tagatttaca 6600
ggctgctagt tgtcgttcga gatcagaaat acgggttttc ttggaattga tttcgtcgat 6660
gtacttggca tcgaaacac 6679
<210> 14
<211> 1932
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human sodium iodide symporter (hNIS)
<400> 14
atggaggccg tggagaccgg ggaacggccc accttcggag cctgggacta cggggtcttt 60
gccctcatgc tcctggtgtc cactggcatc gggctgtggg tcgggctggc tcggggcggg 120
cagcgcagcg ctgaggactt cttcaccggg ggccggcgcc tggcggccct gcccgtgggc 180
ctgtcgctgt ctgccagctt catgtcggcc gtgcaggtgc tgggcgtgcc gtcggaggcc 240
tatcgctatg gcctcaagtt cctctggatg tgcctgggcc agcttctgaa ctcggtcctc 300
accgccctgc tcttcatgcc cgtcttctac cgcctgggcc tcaccagcac ctacgagtac 360
ctggagatgc gcttcagccg cgcagtgcgg ctctgcggga ctttgcagta cattgtagcc 420
acgatgctgt acaccggcat cgtaatctac gcaccggccc tcatcctgaa ccaagtgacc 480
gggctggaca tctgggcgtc gctcctgtcc accggaatta tctgcacctt ctacacggct 540
gtgggcggca tgaaggctgt ggtctggact gatgtgttcc aggtcgtggt gatgctaagt 600
ggcttctggg ttgtcctggc acgcggtgtc atgcttgtgg gcgggccccg ccaggtgctc 660
acgctggccc agaaccactc ccggatcaac ctcatggact ttaaccctga cccgaggagc 720
cgctatacat tctggacttt tgtggtgggt ggcacgttgg tgtggctctc catgtatggc 780
gtgaaccagg cgcaggtgca gcgctacgtg gcttgccgca cagagaagca ggccaagctg 840
gccctgctca tcaaccaggt cggcctgttc ctgatcgtgt ccagcgctgc ctgctgtggc 900
atcgtcatgt ttgtgttcta cactgactgc gaccctctcc tcctggggcg catctctgcc 960
ccagaccagt acatgcctct gctggtgctg gacatcttcg aagatctgcc tggagtcccc 1020
gggcttttcc tggcctgtgc ttacagtggc accctcagca cagcatccac cagcatcaat 1080
gctatggctg cagtcactgt agaagacctc atcaaacctc ggctgcggag cctggcaccc 1140
aggaaactcg tgattatctc caaggggctc tcactcatct acggatcggc ctgtctcacc 1200
gtggcagccc tgtcctcact gctcggagga ggtgtccttc agggctcctt caccgtcatg 1260
ggagtcatca gcggccccct gctgggagcc ttcatcttgg gaatgttcct gccggcctgc 1320
aacacaccgg gcgtcctcgc gggactaggc gcgggcttgg cgctgtcgct gtgggtggcc 1380
ttgggcgcca cgctgtaccc acccagcgag cagaccatga gggtcctgcc atcgtcggct 1440
gcccgctgcg tggctctctc agtcaacgcc tctggcctcc tggacccggc tctcctccct 1500
gctaacgact ccagcagggc ccccagctca ggaatggacg ccagccgacc cgccttagct 1560
gacagcttct atgccatctc ctatctctat tacggtgccc tgggcacgct gaccactgtg 1620
ctgtgcggag ccctcatcag ctgcctgaca ggccccacca agcgcagcac cctggccccg 1680
ggattgttgt ggtgggacct cgcacggcag acagcatcag tggcccccaa ggaagaagtg 1740
gccatcctgg atgacaactt ggtcaagggt cctgaagaac tccccactgg aaacaagaag 1800
ccccctggct tcctgcccac caatgaggat cgtctgtttt tcttggggca gaaggagctg 1860
gagggggctg gctcttggac cccctgtgtt ggacatgatg gtggtcgaga ccagcaggag 1920
acaaacctct ga 1932
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vaccinia virus early promoter (pE)
<400> 15
aaaaattgaa aaactagcgt ctttttttgc tcgaagtcga ccacc 45
<210> 16
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary single chain antibody against human CTLA-4
(h-scAb(CTLA-4))
<400> 16
atagtgttga cccagagtcc aggtactctt agtttaagtc caggagagcg agccactttg 60
tcatgccgag cttcacagtc agtaggttcg tcttacttgg cctggtacca acaaaaaccg 120
ggacaggctc cgagattact tatttacggt gctttttccc gtgcgacggg tataccagac 180
agattctccg gatccggttc cggtactgac tttaccttga caatcagtcg tttagagcca 240
gaagatttcg ccgtctacta ctgccaacag tacggatcct ccccttggac tttcggtcaa 300
ggaactaaag tagaaataaa gagaggtgga ggaggtagtg gaggtggagg atcgggagga 360
ggaggttcac aagtccaact tgtcgaatca ggaggtggag tggtgcagcc aggacgttca 420
ctacgtttgt cttgcgcggc gtccggattt acattttcct cctatacgat gcactgggta 480
cgtcaagctc ctggtaaggg tcttgagtgg gtcaccttta tctcctacga tggaaacaat 540
aagtattacg cggactcagt aaaaggtcga tttactattt cacgagataa ttctaaaaac 600
acgctttatt tgcaaatgaa ctccttacgt gcagaggata ctgcgattta ttattgtgcg 660
cgaacaggat ggctaggtcc ttttgattat tggggacagg gtactcttgt tacagtttca 720
tcagataaaa ctcatacttg cccaccgtgc ccagccccgg agttgctagg tggaccctcc 780
gtattcttgt tccctcctaa accgaaggac acgcttatga tttctagaac tcccgaagtt 840
acgtgtgttg tggtagatgt ttcccatgag gatcccgagg tgaaatttaa ctggtacgtc 900
gacggagttg aggtgcataa cgcgaagacg aaacccagag aagagcagta caactcgacg 960
taccgtgttg tatccgtatt aacagtacta catcaggact ggttgaacgg aaaagaatac 1020
aaatgcaagg tttcaaataa ggctcttcca gccccaatag agaaaacaat ctctaaagca 1080
aaaggacaac cacgtgagcc ccaggtatat accttaccgc caagtagaga ggagatgacc 1140
aaaaatcaag tctccttgac ttgcttggtc aagggatttt acccgtcgga catcgccgtt 1200
gaatgggaat ccaacggtca gcctgaaaac aactacaaaa caactccacc agttttggat 1260
tccgacggat cttttttcct atacagtaag ctaaccgtag acaaatcgcg atggcaacag 1320
ggtaacgtgt tttcttgttc ggtcatgcac gaggctttgc acaaccatta cactcaaaag 1380
tctctatcgc ttagtccagg taag 1404
<210> 17
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary single chain antibody against human CTLA-4
(h-scAb(CTLA-4))
<400> 17
atggagactg atacccttct tttatgggtc ctacttttat gggtgccggg ttcaacggga 60
gatggcgttg tccagcctgg aagatcactt agattatcat gcgccgcttc cggttttact 120
ttttcttcgt acggaatgca ctgggtacgt caagccccag gtaagggttt ggaatgggtc 180
gcagtgatat ggtatgatgg atctaataag tattatgccg attccgtgaa gggacgattt 240
accatctcgc gagacaattc taagaacact ctatacttgc aaatgaacag tcttcgtgct 300
gaagacactg ctgtttatta ttgcgcccga gatcccagag gagcaaccct atactattat 360
tactacagat gggatgtgtg gggacagggt acgacggtca ccgtctcttc cgcgagtacc 420
aaaggaccct ctgtattccc tcttgctcca tgttcccgtt caacttcgga atctacggcg 480
gcacttggat gccttgttaa ggattacttt cccgagcctg tcactgtgtc ctggaactcc 540
ggagctttaa cctcgggagt tcatggagga ggtggttctg gtggaggtgg atccggagga 600
ggtggttcgc cgtcatccct atcggccagt gttggagata gagtcacaat tacctgccga 660
gcatctcaaa gtatcaactc ataccttgac tggtatcagc agaagccagg taaggcaccc 720
aagttgttaa tatacgcggc ttcttctttg cagtcgggag taccctcccg attctcgggt 780
tcaggttcgg gaactgactt cactttaacc atctcttcat tacaacccga agacttcgct 840
acatattact gtcagcaata ttattctaca cctttcactt tcggaccggg aacgaaagtc 900
gagattaagc gtaccgtcgc ggctccctcg gtgttcattt tccctccatc tgacgagcag 960
cttaaatcgg gtacagcctc ggtggtgtgc ctattaaaca acttttatcc aagagaggcg 1020
aaggtggact acaaagacga cgacgacaaa taa 1053
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgK signal peptide
<400> 18
atggaaacgg acactttatt gttgtgggtg ctattgttgt gggtccctgg ttcaacgggt 60
gac 63
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vaccinia virus early/late promoter (pEL) + Kozak sequence
<400> 19
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata agctcgaagt cgaccacc 58
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vaccinia virus late promoter (pL)
<400> 20
tttttttttt tttttttttt ggcatataaa taagccgacc acc 43
<210> 21
<211> 1497
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single chain antibody against murine CTLA-4 (m-scAb(CTLA-4))
<400> 21
attcgtcgtg ctgatatagt aatgactcag actacacttt ctctacctgt atcgttaggt 60
gaccaagcca gtatatcttg tcgttcttct cagtccatcg tgcatagtaa tggtaacacc 120
tacttagagt ggtacctaca aaagccgggt cagtcaccaa agttattaat ctacaaggtt 180
tcaaaccgat tctctggagt tcctgacaga tttagtggtt ccggatccgg taccgacttc 240
accctaaaga tttcaagagt ggaggcagaa gacttgggag tgtattactg tttccaggga 300
tctcacgtcc cgtacacatt tggaggtgga accaaattag agatcaagag agccgacgcg 360
gcgcctactg tgagtggtag tggaggagga ggttcgggtg gtggtggttc cggaggaggt 420
ggttcagaag ccaagttgca agaatcggga cctgttttag taaagccggg tgcttctgta 480
aagatgtctt gtaaggcgag tggttatacg tttactgatt actacatgaa ttgggtcaaa 540
caatcacacg gaaagagtct tgaatggatc ggtgtgatta atccatacaa tggtgatacg 600
tcttacaacc agaaatttaa gggaaaagct acactaacag tagacaagtc atctagtaca 660
gcctacatgg agcttaactc tttgacctcg gaagactctg ccgtctacta ctgcgcgcgt 720
tactatggat cctggtttgc ttattgggga cagggaactc taattactgt atctactgcg 780
aaaaccaccc cgccatccgt gtatccatta gccccgagat cgtcgcgtgg ttgtaaaccg 840
tgtatctgca ctgttccaga ggtttcctcg gtgttcatat tccctcccaa gccgaaggac 900
gttcttacta ttacccttac gccaaaggtc acttgtgtcg ttgttgatat ctccaaagac 960
gatcctgagg tacagttttc ttggttcgtc gacgatgttg aagtacacac ggcgcaaaca 1020
caacctcgtg aagagcaatt caattccact tttagatcag tgtccgaatt acccatcatg 1080
caccaggact ggttaaacgg taaagaattc aaatgtagag tgaactccgc tgcgtttcca 1140
gctccgatcg aaaagaccat ctccaagact aaaggtcgac ccaaggcgcc ccaagtctac 1200
acgataccac cccccaaaga gcagatggcc aaggacaagg tgagtttaac gtgtatgata 1260
acggacttct tccctgaaga tataactgta gagtggcagt ggaatggtca gccggcggaa 1320
aactataaaa acactcagcc tattatggac accgacggtt catatttcgt gtattccaaa 1380
cttaacgtgc agaaatctaa ctgggaagcg ggtaatacct ttacgtgctc ggtcctacat 1440
gaaggacttc ataatcatca tacagaaaaa tctttatctc attcacccgg taaatga 1497
<210> 22
<211> 597
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> Murine OX40L
<400> 22
atggaaggtg aaggtgtcca acccctagat gagaacctag agaatggatc aagacctcgt 60
ttcaaatgga agaaaacact aagattggtg gtatccggta taaaaggagc gggaatgcta 120
ttgtgtttta tctacgtgtg tctacaatta tcatcctcac cggctaaaga ccccccaata 180
caacgactac gaggtgcagt gactcgttgt gaagacggtc agttatttat ttcatcttac 240
aaaaacgaat atcaaacaat ggaagttcag aacaactctg tcgttataaa gtgtgatggt 300
ctttacatta tttacttgaa aggttcattc tttcaagagg tgaaaataga cttgcatttc 360
cgagaagacc acaatccgat ctcgataccg atgcttaatg atggtagacg aattgttttt 420
acagtcgtag cgtcattagc cttcaaagac aaagtatacc taaccgtgaa tgcaccggat 480
accttatgtg agcacctaca aataaacgat ggtgaattaa ttgtagtaca attaacccct 540
ggttattgtg cgcctgaggg ttcctaccat tcaacagtga atcaggttcc cttgtga 597
<210> 23
<211> 552
<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> Canine OX40L
<400> 23
atggaagggg tccaacccct ggaccagaat gtgggaaaca caccagggcg aagattccag 60
aagaacaagg tattgctggt ggcagccata attcaggggc tgggtctgct cctgtgtttc 120
acctacatct gcctgcactt ctatgcttct caggtgccgc ctcagtatcc tccaattcaa 180
agtatcagag tacaatttac caggtgtgag aatgagaaag gttgcatcat cacatcccca 240
agcaaggatg aaactatgaa ggtgcaagac aactcaatca tcattaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ttacttctct gaggagctca gcctcagcct ttattaccga 360
aagggtcggg gacccctctt ctctctgagc aaggtcacat ctgttgactc cattggagtg 420
gcctatctgg ctttcaagga caaagtctac tttaatgtga ccactcacag tacctcctac 480
aaagacatcc aggtgaatgg tggggaattg attctcattc atcaaaatcc tggtggcttc 540
tgtgcctact ga 552
<210> 24
<211> 552
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human OX40L
<400> 24
atggaacgag tgcagccgtt agaggaaaac gtgggtaatg cagcgagacc gcgatttgaa 60
cgaaataagc tattattggt tgccagtgtc atccaaggtt tgggtcttct attgtgcttc 120
acatacattt gtttgcattt tagtgccctt caagtctcgc acagataccc gagaatacag 180
tcaataaaag ttcagttcac ggagtataag aaagaaaagg gttttatctt gaccagtcag 240
aaggaggacg agataatgaa agtccaaaac aattccgtca ttattaactg cgacggattc 300
tatcttatct ctctaaaagg ttacttctct caagaggtga acatctcact acactaccag 360
aaagacgaag agcctctttt ccagctaaaa aaagtgcgtt ccgtgaactc tctaatggtt 420
gcatcattaa cttacaaaga taaagtttac ttgaacgtca caacagataa cacatcccta 480
gacgattttc acgtcaacgg tggtgagctt attcttatcc accagaaccc cggagagttt 540
tgcgttctat ga 552
<210> 25
<211> 930
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> Murine 4-1BBL
<400> 25
atggatcaac atactttgga cgtagaggat actgccgacg cacgtcatcc cgccggtacc 60
tcctgccctt cggacgccgc gttacttaga gatactggtt tacttgcaga cgcggcgcta 120
ctatcagaca ccgtccgtcc caccaacgca gcgctaccga ccgatgcggc ctatcctgct 180
gtgaacgtaa gagaccgaga ggcggcgtgg ccgccagctt taaacttttg ctcccgacat 240
cccaaattgt atggtctagt tgcacttgtt ttgttgttat tgatcgctgc ttgcgtcccc 300
atatttacta gaaccgaacc tcgacccgcc ctaactataa ctacatcccc aaacctagga 360
acccgtgaga ataacgcaga ccaggtaacc ccagtatccc acatcggttg tccaaacact 420
actcagcagg gttccccagt atttgctaaa ttactagcca agaatcaagc atccttgtgt 480
aacaccacct taaactggca tagtcaagac ggtgccggta gttcgtacct ttcgcagggt 540
ttacgatacg aggaagacaa aaaagagcta gttgttgact caccgggttt atattatgta 600
ttcctagagc taaagttgtc ccctacgttc actaatactg gtcataaggt acagggttgg 660
gtatcacttg tgttgcaagc taagccccaa gtggacgact tcgacaactt agctttaact 720
gtcgagttgt tcccgtgctc aatggaaaac aaattggtcg acagaagttg gtctcaattg 780
ttattactaa aagccggtca ccgtctaagt gtgggactac gtgcatattt acacggagca 840
caagacgcat acagagattg ggaattgagt tacccaaaca ccacgtcctt tggtttattt 900
ttggtgaaac cggataatcc ctgggaatga 930
<210> 26
<211> 897
<212> DNA
<213> Canine lupus familiaris
<220>
<223> Canine 4-1BBL
<400> 26
atgcgccccc gcagcgacgc cgccccggac cccgaggccc cgcggccgcc cgcgcccccc 60
ggccgcgcct gcagcccgct gccctgggcg ctgagcgccg cgatgctgct gctcgtcggc 120
acctgcgccg cctgcgcgct ccgcgcctgg gtggtccccg ggccccggcc ccccgcgctc 180
cccgcgctcc ccgcgcccct gccggacgcc ggcgcccgcc tccccgactc cccgcaggcc 240
gtgttcgcgc agctggtggc ccgagatgta cagctgaagg aaggacccct gcgctggtac 300
agtgacccgg gcctggcaga gccccagcac ccctcccctg ggctgcaccc tggctccaca 360
gcccagctca aggaacctcc ctctcttctt cctccctcag tacagctgaa ggaaggaccc 420
ctgcgctggt acagtgaccc gggcctggca ggtgtattcc tggggccggg cctgagttat 480
gaccagcaca ctcgggagct gatggtggtg gaacccgggc tctactatgt tttcttgcac 540
ctgaagctgc agcgggtaat gtccagcacg ggctccggct ctgtctctgc tgccctgcac 600
ctgcagccac ttggcaccga ggctgcagcc ctggacctga ccttggacct gcctccacca 660
tcctcggagg cccgtgactc agcagctggt ttccggggca gcctgctgca cctggacgca 720
ggccagcgcc tccgtgttca cttgcgagct gaggcagggg cccaccctgc ctggcagctg 780
gcacaaggtg ccacgatctt gggcctcttc agagtggcca ccaaagtccc cactggactc 840
ccctcgtcat ggcccatgga cacggggcct gggtccccgc ccctggatgg agaatga 897
<210> 27
<211> 765
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human 4-1BBL
<400> 27
atggagtacg ccagtgatgc ctcgcttgac ccggaagccc cttggccgcc cgcgcctaga 60
gcccgagcct gtcgtgtctt accatgggct ttagtcgccg gtttgcttct actactattg 120
ttagccgccg cgtgtgcggt attcctagcc tgtccctggg ccgtatcagg tgcgagagca 180
tcacccggat ccgcagcgag tccacgactt cgagaaggtc ccgaattatc gccagacgat 240
cccgcaggac tacttgattt gcgacaggga atgtttgcac aattagtagc acaaaatgtc 300
ttacttatcg acggtccact ttcatggtat tcagatcccg gactagccgg agtctcctta 360
actggaggtc ttagttacaa ggaggacacg aaggagttag tagtcgctaa ggcgggtgtc 420
tattatgtat tcttccagtt ggaactaaga cgagttgttg ccggtgaggg atcgggatcg 480
gtatcactag ccttgcactt gcagccattg agatcggcag ccggtgctgc agccttagcc 540
ctaacagtcg acttaccacc tgctagttct gaggccagaa actccgcttt cggatttcaa 600
ggacgtttat tgcatctttc agcgggacaa agattgggtg tgcatctaca tacggaggct 660
cgtgcaagac atgcgtggca gctaacacag ggtgctaccg tattgggatt gttccgtgtt 720
acgccggaaa ttcccgcagg acttccttcg ccccgaagtg aataa 765
<210> 28
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human AQP1, amplified from an open reading frame cDNA
<400> 28
atggccagcg agttcaagaa gaagctcttc tggagggcag tggtggccga gttcctggcc 60
acgaccctct ttgtcttcat cagcatcggt tctgccctgg gcttcaaata cccggtgggg 120
aacaaccaga cggcggtcca ggacaacgtg aaggtgtcgc tggccttcgg gctgagcatc 180
gccacgctgg cgcagagtgt gggccacatc agcggcgccc acctcaaccc ggctgtcaca 240
ctggggctgc tgctcagctg ccagatcagc atcttccgtg ccctcatgta catcatcgcc 300
cagtgcgtgg gggccatcgt cgccaccgcc atcctctcag gcatcacctc ctccctgact 360
gggaactcgc ttggccgcaa tgacctggct gatggtgtga actcgggcca gggcctgggc 420
atcgagatca tcgggaccct ccagctggtg ctatgcgtgc tggctactac cgaccggagg 480
cgccgtgacc ttggtggctc agcccccctt gccatcggcc tctctgtagc ccttggacac 540
ctcctggcta ttgactacac tggctgtggg attaaccctg ctcggtcctt tggctccgcg 600
gtgatcacac acaacttcag caaccactgg attttctggg tggggccatt catcggggga 660
gccctggctg tactcatcta cgacttcatc ctggccccac gcagcagtga cctcacagac 720
cgcgtgaagg tgtggaccag cggccaggtg gaggagtatg acctggatgc cgacgacatc 780
aactccaggg tggagatgaa gcccaaatag 810
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment encoding a FLAG tag
<400> 29
gactacaaag acgacgacga caaa 24
<210> 30
<211> 6246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 5 (loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pEL-IgK-hscAb(CTLA-4)-FLAG;
h-scAb(CTLA-4) of SEQ ID NO:17
<220>
<221> misc_feature
<222> (972)..(972)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (974)..(974)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
ggccgcgagc tcaagatctt catgcaattg agtcagctct taacacaatc tcttgcttct 60
tcgtcatagt acttacaatc actatgggat ccattgttac cacgtctaca ctcggcgagc 120
tcgcgtttaa gagattcaat ttcccgtttg tattggtcca tgtttccatt gctaccacca 180
ttagatttac aggctgctag ttgtcgttcg agatcagaaa tacgggtttt cttggaattg 240
atttcgtcga tgtacttggc atcgaaacac ttattaagtt ctttttccaa ttctacgatt 300
ttatttcttt cgcgagtcaa ttccctcctg tagtaactat ctgttttgtc agattcacgc 360
tctctacgta gactttcttg caagttacta atttgttccc tagcacgtcc gagtttagtt 420
ttatatgccg aatagagttc tgattcatcc tttgagcaga tctctagaga tcgttcaaga 480
tccctgattc tagtctttag cctatttacc tcctcggaag atgctccgtt accgttgcgt 540
ttacactcgt taagctgtct atcaagacac gtgggcgccc ctgatgcggt attttctcct 600
tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 660
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 720
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 780
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 840
atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 900
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 960
gctcatgaga cndntacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 1020
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 1080
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 1140
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 1200
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 1260
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 1320
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 1380
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 1440
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 1500
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 1560
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 1620
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 1680
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 1740
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 1800
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 1860
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 1920
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1980
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 2040
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2100
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2160
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2220
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2280
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2340
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 2400
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 2460
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 2520
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 2580
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 2640
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 2700
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gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 5100
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 5160
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 5220
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 5280
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 5340
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 5400
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 5460
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 5520
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 5580
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 5640
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 5700
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 5760
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 5820
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 5880
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 5940
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6000
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6060
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agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6180
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6240
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 6300
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 6360
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 6420
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 6480
cagtgagcga ggaagcggaa ga 6502
<210> 40
<211> 9174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector encoding the Cas9HF cytosolic gene
<400> 40
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
accatgggac ctaagaaaaa gaggaaggtg gcggccgcta atacgactca ctatagggag 960
agccgccacc atggataaaa agtattctat tggtttagac atcggcacta attccgttgg 1020
atgggctgtc ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa 1080
cacagaccgt cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga 1140
aacggcagag gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa 1200
ccgaatatgt tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt 1260
ctttcaccgt ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc 1320
catctttgga aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca 1380
cctcagaaaa aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc 1440
tcttgcccat atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga 1500
caactcggat gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga 1560
agagaaccct ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc 1620
taaatcccga cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt 1680
gttcggtaac cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga 1740
cttagctgaa gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa 1800
tctactggca caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag 1860
cgatgcaatc ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt 1920
atccgcttca atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc 1980
cctagtccgt cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa 2040
cgggtacgca ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa 2100
acccatatta gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga 2160
tctactgcga aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt ccacatcaaa tccacttagg 2220
cgaattgcat gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg 2280
tgaaaagatt gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg 2340
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ttttgaggaa gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccgc 2460
ctttgacaag aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta 2520
tttcacagtg tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc 2580
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caaagtgaca gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc 2700
tgtcgagatc tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct 2760
cctaaagata attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga 2820
agatatagtg ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa 2880
aacatacgct cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac 2940
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aactattctc gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tggccctgat 3060
ccatgatgac tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg 3120
ggactcattg cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat 3180
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tcgagagcgg atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa ctgggcagcc agatcttaaa 3360
ggagcatcct gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa ctttacctct attacctaca 3420
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cgtcgatcac attgtacccc aatccttttt gaaggacgat tcaatcgaca ataaagtgct 3540
tacacgctcg gataagaacc gagggaaaag tgacaatgtt ccaagcgagg aagtcgtaaa 3600
gaaaatgaag aactattggc ggcagctcct aaatgcgaaa ctgataacgc aaagaaagtt 3660
cgataactta actaaagctg agaggggtgg cttgtctgaa cttgacaagg ccggatttat 3720
taaacgtcag ctcgtggaaa cccgcgccat cacaaagcat gttgcccaga tactagattc 3780
ccgaatgaat acgaaatacg acgagaacga taagctgatt cgggaagtca aagtaatcac 3840
tttaaagtca aaattggtgt cggacttcag aaaggatttt caattctata aagttaggga 3900
gataaataac taccaccatg cgcacgacgc ttatcttaat gccgtcgtag ggaccgcact 3960
cattaagaaa tacccgaagc tagaaagtga gtttgtgtat ggtgattaca aagtttatga 4020
cgtccgtaag atgatcgcga aaagcgaaca ggagataggc aaggctacag ccaaatactt 4080
cttttattct aacattatga atttctttaa gacggaaatc actctggcaa acggagagat 4140
acgcaaacga cctttaattg aaaccaatgg ggagacaggt gaaatcgtat gggataaggg 4200
ccgggacttc gcgacggtga gaaaagtttt gtccatgccc caagtcaaca tagtaaagaa 4260
aactgaggtg cagaccggag ggttttcaaa ggaatcgatt cttccaaaaa ggaatagtga 4320
taagctcatc gctcgtaaaa aggactggga cccgaaaaag tacggtggct tcgatagccc 4380
tacagttgcc tattctgtcc tagtagtggc aaaagttgag aagggaaaat ccaagaaact 4440
gaagtcagtc aaagaattat tggggataac gattatggag cgctcgtctt ttgaaaagaa 4500
ccccatcgac ttccttgagg cgaaaggtta caaggaagta aaaaaggatc tcataattaa 4560
actaccaaag tatagtctgt ttgagttaga aaatggccga aaacggatgt tggctagcgc 4620
cggagagctt caaaagggga acgaactcgc actaccgtct aaatacgtga atttcctgta 4680
tttagcgtcc cattacgaga agttgaaagg ttcacctgaa gataacgaac agaagcaact 4740
ttttgttgag cagcacaaac attatctcga cgaaatcata gagcaaattt cggaattcag 4800
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cagggataaa cccatacgtg agcaggcgga aaatattatc catttgttta ctcttaccaa 4920
cctcggcgct ccagccgcat tcaagtattt tgacacaacg atagatcgca aacgatacac 4980
ttctaccaag gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa tccatcacgg gattatatga 5040
aactcggata gatttgtcac agcttggggg tgactaatct agaaccggtc atcatcacca 5100
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tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 5220
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 5280
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 5340
ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta 5400
tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 5460
gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 5520
cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 5580
atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 5640
tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 5700
tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 5760
tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 5820
atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc 5880
tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 5940
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 6000
accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 6060
tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc 6120
tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 6180
ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga tctgatcagc acgtgttgac aattaatcat 6240
cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc atggccaagc 6300
ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc aacagcatcc 6360
ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc cgcatcttca 6420
ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg gtgctgggca 6480
ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga aatgagaaca 6540
ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg catcctggga 6600
tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt cgtgaattgc 6660
tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaag cacttcgtgg ccgaggagca ggactgacac 6720
gtgctacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt 6780
ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc 6840
caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 6900
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 6960
gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca 7020
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 7080
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 7140
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 7200
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 7260
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 7320
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 7380
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 7440
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 7500
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 7560
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 7620
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 7680
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 7740
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 7800
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 7860
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 7920
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 7980
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 8040
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 8100
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 8160
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 8220
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 8280
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 8340
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 8400
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 8460
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 8520
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 8580
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 8640
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 8700
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 8760
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 8820
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 8880
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 8940
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 9000
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 9060
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 9120
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 9174
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer designed to amplify the intergenic region
<400> 41
gacgaagaag caagagattg tgt 23
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer designed to amplify the intergenic region
<400> 42
accgtttcca ttaccgcca 19
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA2 targeting DNA within the 92 bp intergenic area (SEQ ID
NO:6)
<400> 43
uuuguaguua ucugauuccc 20
<210> 44
<211> 4583
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 22 (loxM3-pEL-eGFP-loxM7)
<400> 44
agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 60
tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 120
aacagctatg accatgatta cgccaaagct tcaattgctg caggatactg aagtctgata 180
ttcagaaagc tgggggatgt tctggttcga catccaccga tggtgtcaca tcactaatcg 240
gttcggtaac gtctgtggat ggaggtgcta cttctacaga acctgtagcc tcagttgtca 300
acggagatac atttttaatg cgaggaaatg tataatttgg taatggtttc tcatgtggat 360
ctgaagaaga ggtaagatat ctactagaaa gataccgatc acgttctagt tctcttttgt 420
agaacttaac tttttctttc tcagcatcta gttgatattc caacctcttc acgttactac 480
gttcagattt caattcacgt tcgcatgggt tacctccgca gtttttacga gcgatttcac 540
gttcagcctt catgcgtctt tccctctctc tatcgagttt atcagagcag tctttctgaa 600
ggcgatcgaa ctccataaat ttctccaacg ctttgattgt ttccatagat ttccgaagtt 660
cagcttttag gactgtgatt ctttttcttt cgaattcaca gctggatgta caaccgtttc 720
cattaccgcc atctctaagt ttcttttcta gatcggcaac atttcatccc catgcctttt 780
acattcctcg agtctactgt cgtcgataac ttcgtatatg gtattatata cgaagttata 840
agcttcaatt gctgcagact agtcccgggg ctagcaaaaa ttgaaatttt attttttttt 900
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accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 1020
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 1080
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 1140
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 1200
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 1260
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 1320
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ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 1560
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 1620
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taattaatta atttttatcg atctaattca 1680
acaatgtctg gaggatccgc atgctggcca gaattcgcgg ccgcaccggt atttaaatct 1740
taagataact tcgtatattc tatcttatac gaagttataa gatcttcatg caattgagtc 1800
agctcttaac acaatctctt gcttcttcgt catagtactt acaatcacta tgggatccat 1860
tgttaccacg tctacactcg gcgagctcgc gtttaagaga ttcaatttcc cgtttgtatt 1920
ggtccatgtt tccattgcta ccaccattag atttacaggc tgctagttgt cgttcgagat 1980
cagaaatacg ggttttcttg gaattgattt cgtcgatgta cttggcatcg aaacacttat 2040
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aactatctgt tttgtcagat tcacgctctc tacgtagact ttcttgcaag ttactaattt 2160
gttccctagc acgtccgagt ttagttttat atgccgaata gagttctgat tcatcctttg 2220
agcagatctc tagagatcgt tcaagatccc tgattctagt ctttagccta tttacctcct 2280
cggaagatgc tccgttaccg ttgcgtttac actcgttaag ctgtctatca agacacgtgg 2340
gcgcccctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 2400
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 2460
acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 2520
gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 2580
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 2640
tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 2700
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 2760
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 2820
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 2880
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 2940
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 3000
ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 3060
cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 3120
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 3180
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 3240
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 3300
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ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 3420
gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 3480
ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 3540
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cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 3660
tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 3720
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 3780
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ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt 3960
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 4020
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 4080
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 4140
tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 4200
gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 4260
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 4320
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tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 4500
attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 4560
tcagtgagcg aggaagcgga aga 4583
<210> 45
<211> 3679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 2 (loxM3-pEL-TurboFP635-loxM7)
<400> 45
cgaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 60
ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 120
ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 180
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 240
gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 300
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 360
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tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 480
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 540
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 600
gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 660
ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 720
cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 780
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cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 1260
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cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 1500
atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 1560
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 1620
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aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 1800
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cggggctagc aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata agctcgaagt 2820
cgaccaccat ggtgggtgag gatagcgtgc tgatcaccga gaacatgcac atgaaactgt 2880
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cctacgaggg cacccagacc atgaagatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg 3000
ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aacctttatc aaccacaccc 3060
agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagaggatca 3120
ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc cagaacggct 3180
gcctcatcta caacgtcaag atcaacgggg tgaacttccc atccaacggc cctgtgatgc 3240
agaagaaaac actcggctgg gaggccagca ccgagatgct gtaccccgct gacagcggcc 3300
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tcaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc ggcttctact 3420
tcgtggacag gagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac gtcgagcagc 3480
acgagatggc tgtggccagg tactgcgacc tgcctagcaa actggggcac agctgattaa 3540
ttaattttta tcgatctaat tcaacaatgt ctggaggatc cgcatgctgg ccagaattcg 3600
cggccgcacc ggtatttaaa tcttaagata acttcgtata ttctatctta tacgaagtta 3660
tgctttacga gggttacag 3679
<210> 46
<211> 8961
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 23 (Lentiviral vector encoding Cre recombinase under controlof the
CMV promoter)
<400> 46
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
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actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
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ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
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cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 2160
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 2220
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 2280
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 2340
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 2400
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 2460
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 2520
agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc tgccaccatg 2580
ggcccaaaga agaagagaaa ggtttcgaat ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca 2640
ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat 2700
cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg 2760
gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat 2820
tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc 2880
cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt 2940
tcactggtta tgcggcggat ccgaaaagaa aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag 3000
gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat 3060
cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt ctggggattg cttataacac cctgttacgt 3120
atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg 3180
ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt 3240
agcctggggg taactaaact ggtcgagcga tggatttccg tctctggtgt agctgatgat 3300
ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc 3360
agccagctat caactcgcgc cctggaaggg atttttgaag caactcatcg attgatttac 3420
ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc 3480
ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt 3540
ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac tatatccgta acctggatag tgaaacaggg 3600
gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat tagacccagc tttcttgtac aaagtggtga 3660
taatcgaatt ccgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 3720
cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat 3780
gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct 3840
ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct 3900
gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc 3960
gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg 4020
acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc 4080
tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac 4140
gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg 4200
cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc 4260
ccgcatcggg aattcccgcg gttcgaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg 4320
cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc 4380
tggcctcgca cacattccac atccaccggt aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc 4440
cccttcgcgc caccttctac tcctccccta gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc 4500
gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac 4560
agcaccgctg agcaatggaa gcgggtaggc ctttggggca gcggccaata gcagctttgc 4620
tccttcgctt tctgggctca gaggctggga aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc 4680
gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg tcctccggag gcccggcatt ctgcacgctt 4740
caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc tcttcctcat ctccgggcct ttcgacctca 4800
cgtggccacc atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 4860
cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 4920
cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 4980
cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 5040
cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 5100
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cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 5340
cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 5400
cggtgcctga ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 5460
ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc 5520
tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 5580
aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 5640
gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 5700
ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa 5760
agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 5820
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 5880
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 5940
tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 6000
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gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat 6120
tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 6180
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 6240
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt 6300
agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 6360
agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 6420
tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 6480
cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 6540
tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 6600
caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 6660
ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 6720
aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 6780
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 6840
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 6900
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 6960
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 7020
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 7080
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 7140
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 7200
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 7260
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 7320
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 7380
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 7440
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 7500
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 7560
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc 7620
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 7680
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 7740
cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 7800
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 7860
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 7920
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taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 8100
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 8160
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 8220
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 8280
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ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 8580
ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 8640
ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc 8700
tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 8760
cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 8820
tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 8880
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac 8940
aaaagctgga gctgcaagct t 8961
<210> 47
<211> 4770
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 24 (loxM3-pEL-eGFP-pEL-CRE-loxM7)
<400> 47
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
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attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
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tgaaatttta tttttttttt ttggaatata aataagctcg aagtcgacca ccatgtccaa 1380
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ggccgttaaa acgattcaac agcaccttgg tcaattgaat atgttacata gacgttcggg 1680
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tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3840
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<210> 48
<211> 7705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector encoding gRNA2 (SEQ ID NO:43)
<400> 48
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
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gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
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actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
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tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
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ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
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ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
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tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
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agagagataa ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 2040
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taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttgt 2280
tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg tttttagcgc gtgcgccaat 2340
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ttccgcattc tgcaagcctc cggagcgcac gtcggcagtc ggctccctcg ttgaccgaat 2880
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tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg 3420
cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg 3480
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tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 3720
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 3780
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 3840
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 3900
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gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 4020
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 4080
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 4140
ggccgcctcc ccgcatcggc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 4200
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ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 4320
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 4380
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 4440
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tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc 4680
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gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga 4800
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tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 4980
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gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 5400
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acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 5580
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tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 6300
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 6360
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gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 6900
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 6960
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 7020
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaaga gagaaaggcg 7080
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 7140
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 7200
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 7260
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 7320
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 7380
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 7440
cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7500
aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7560
gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 7620
cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg 7680
gaacaaaagc tggagctgca agctt 7705
<210> 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxM3
<400> 49
ataacttcgt atatggtatt atatacgaag ttat 34
<210> 50
<211> 817
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding enhanced green fluorescent protein (eGFP) flanked by
Vaccinia virus early/late promoter upstream (pEL; SEQ ID NO:19)
and Vaccinia virus transcription termination signals downstream
<400> 50
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata agctcgaagt cgaccaccat 60
ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg 120
cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg 180
caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct 240
cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 300
gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt 360
caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 420
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gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg 540
catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 600
ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 660
cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 720
gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaatt 780
aattaatttt tatcgatcta attcaacaat gtctgga 817
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxM7
<400> 51
ataacttcgt atattctatc ttatacgaag ttat 34
<210> 52
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment in F1L
<400> 52
tttgagagtt ttatatgtag caaacatgat agctgtgatg ccaataagct ttagatattc 60
acgcgtgcta gtgttaggga tggtattatc tggtggtgaa atgtccgtta tataatctac 120
aaaacaatca tcgcatatag tatgcgatag tagagtaaac atttttatag tttttactgg 180
attcatacat cgtctaccca atttggttat aaatgaaatt gtcgccaatc ttacacccaa 240
ccccttgtta tccattagta tagtattaac ttcgttattt atgtcataaa ctgtaaatga 300
ttttgtagat gccatatcat acatgatatt catgtcccta ttataatcat tactaacttt 360
atcacaatat atgttgataa tatctatata tgatctagtc tttgtgggca actgtctata 420
caagtcgtct aaacgttgtt tactcatata gtatcgaaca gccatcatta catggtcccg 480
ttccgttgat agataatcga gtatgttagt ggacttgtca aatctatata ccatattttc 540
tggaagtgga tatacatagt cgtgatcaac attattgcta gcctcatctt ctatatcatg 600
tactatacca ttatctatat catctacata atctacgata ttatt 645
<210> 53
<211> 943
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxM7-pEL-eGFP-loxM7-MCS
<400> 53
ataacttcgt atattctatc ttatacgaag ttataagctt aaaaattgaa attttatttt 60
ttttttttgg aatataaata agctcgaagt cgaccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc 120
tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt 180
tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca 240
tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg 300
gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 360
ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 420
agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg 480
gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca 540
gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga 600
tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 660
ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 720
tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 780
ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaatt aattaatttt tatcgatcta 840
attcaacaat gtctggagga tccataactt cgtatattct atcttatacg aagttatgca 900
tgctggccag aattcgcggc cgcaccggta tttaaatctt aag 943
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary DNA sequence for gRNA targeting F1L
<400> 54
tattcacgcg tgctagtgtt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary DNA sequence for gRNA targeting F1L
<400> 55
gttccgttga tagataatcg 20
<210> 56
<211> 8431
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector encoding a gRNA for targeting F1L
<400> 56
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg tattcacgcg tgctagtgtt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgtctagag 360
gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 420
ccattgacgt caatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 480
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 540
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg cccagtacat gaccttatgg 600
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg 660
agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat 720
ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg 780
ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca 840
gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg 900
ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg 960
ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 1020
caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagctgag caagaggtaa 1080
gggtttaagg gatggttggt tggtggggta ttaatgttta attacctgga gcacctgcct 1140
gaaatcactt tttttcaggt tggaccggtg ccaccatgga ctataaggac cacgacggag 1200
actacaagga tcatgatatt gattacaaag acgatgacga taagatggcc ccaaagaaga 1260
agcggaaggt cggtatccac ggagtcccag cagccgacaa gaagtacagc atcggcctgg 1320
acatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgcccagca 1380
agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac ctgatcggag 1440
ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga accgccagaa 1500
gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc agcaacgaga 1560
tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg 1620
ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg 1680
agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggccg 1740
acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc cacttcctga 1800
tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc 1860
agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg gacgccaagg 1920
ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc gcccagctgc 1980
ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc cctgagcctg ggcctgaccc 2040
ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg agcaaggaca 2100
cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctgt 2160
ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg agagtgaaca 2220
ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac gagcaccacc 2280
aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag tacaaagaga 2340
ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga gccagccagg 2400
aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc gaggaactgc 2460
tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac aacggcagca 2520
tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag gaagattttt 2580
acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc cgcatcccct 2640
actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc agaaagagcg 2700
aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct tccgcccaga 2760
gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag gtgctgccca 2820
agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa gtgaaatacg 2880
tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag gccatcgtgg 2940
acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag gactacttca 3000
agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg ttcaacgcct 3060
ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc ctggacaatg 3120
aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt gaggacagag 3180
agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa gtgatgaagc 3240
agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg atcaacggca 3300
tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac ggcttcgcca 3360
acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag gacatccaga 3420
aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat ctggccggca 3480
gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag ctcgtgaaag 3540
tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag aaccagacca 3600
cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag ggcatcaaag 3660
agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg cagaacgaga 3720
agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag gaactggaca 3780
tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt ctgaaggacg 3840
actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa ccggggcaag agcgacaacg 3900
tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg ctgaacgcca 3960
agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc ggcctgagcg 4020
aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag atcacaaagc 4080
acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat gacaagctga 4140
tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc cggaaggatt 4200
tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac gcctacctga 4260
acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc gagttcgtgt 4320
acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag caggaaatcg 4380
gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc aagaccgaga 4440
ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac ggcgaaaccg 4500
gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg ctgagcatgc 4560
cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc aaagagtcta 4620
tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg gaccctaaga 4680
agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg gccaaagtgg 4740
aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc accatcatgg 4800
aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc tacaaagaag 4860
tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg gaaaacggcc 4920
ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg gccctgccct 4980
ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag ggctcccccg 5040
aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg gacgagatca 5100
tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat ctggacaaag 5160
tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc gagaatatca 5220
tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac tttgacacca 5280
ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct ggacgccacc ctgatccacc 5340
agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga ggcgacaaaa 5400
ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa aaagtaagaa ttcctagagc 5460
tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 5520
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 5580
aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 5640
cagcaagggg gaggattggg aagagaatag caggcatgct ggggagcggc cgcaggaacc 5700
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 5760
accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 5820
cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 5880
acaccgcata cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 5940
ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccttagc gcccgctcct 6000
ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 6060
cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 6120
gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 6180
acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 6240
tctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggt ctattggtta 6300
aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca 6360
attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 6420
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 6480
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 6540
aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 6600
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6660
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6720
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6780
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6840
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 6900
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 6960
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 7020
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 7080
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 7140
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 7200
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 7260
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 7320
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 7380
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 7440
gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 7500
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 7560
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7620
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7680
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7740
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 7800
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 7860
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7920
aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7980
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 8040
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 8100
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 8160
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 8220
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 8280
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 8340
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 8400
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 8431
<210> 57
<211> 529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous left region
<400> 57
atggcgacta aattagatta tgaggatgct gttttttact ttgtggatga tgataaaata 60
tgtagtcgcg actccatcat cgatctaata gatgaatata ttacgtggag aaatcatgtt 120
atagtgttta acaaagatat taccagttgt ggaagactgt acaaggaatt gatgaagttc 180
gatgatgtcg ctatacggta ctatggtatt gataaaatta atgagattgt cgaagctatg 240
agcgaaggag accactacat caattttaca aaagtccatg atcaggaaag tctattcgct 300
accataggaa tatgtgctaa aatcactgaa cattggggat acaaaaagat ttcagaatct 360
agattccaat cattgggaaa cattacagat ctgatgaccg acgataatat aaacatcttg 420
atactttttc tagaaaaaaa attgaattga tgatataggg gtcttcataa cgcataatta 480
ttacgttagc attctatatc cgtgttaaaa aaaattatcc tatcatgta 529
<210> 58
<211> 619
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous right region
<400> 58
ttaacacata aacatcgaca acatactatt gtttattatc taagtcctgt tgatccaaac 60
ccttgatctc ctctatttgt actatctaga gattgtactt cttccagttc tggataatat 120
atacgttgat agattagctg agctattcta tctccagtat ttacattaaa cgtacatttt 180
ccattattaa taagaatgac tcctatgttt cccctataat cttcgtctat tacaccacct 240
cctatatcaa tgccttttag tgacagacca gacctaggag ctattctacc atagcaaatc 300
ttaggcatgg acatactaat atctgtctta attaactgtc tttctcctgg agggatagta 360
taatcgtaag cgctatacaa atcatatccg gcagcacccg gcgattgcct agtaggagat 420
ttagctctgt tagtttcctt aacaaatcta actggtgagt taatattcat gttgaacata 480
aaactaatat tttatttcaa aattatttac catcccatat attccatgaa taagtgtgat 540
gattgtacac ttctatagta tctatatacg attcacgata aaatcctcct atcaatagca 600
gtttattatc cactatgat 619
<210> 59
<211> 785
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B8R fragment
<400> 59
ctcgcagttt tgttcattaa tagtatacat gctaaaataa ctagttataa gtttgaatcc 60
gtcaattttg attccaaaat tgaatggact ggggatggtc tatacaatat atcccttaaa 120
aattatggca tcaagacgtg gcaaacaatg tatacaaatg taccagaagg aacatacgac 180
atatccgcat ttccaaagaa tgatttcgta tctttctggg ttaaatttga acaaggcgat 240
tataaagtgg aagagtattg tacgggacta tgcgtcgaag taaaaattgg accaccgact 300
gtaacattaa ctgaatacga cgaccatatc aatttgtaca tcgagcatcc gtatgctact 360
agaggtagca aaaagattcc tatttacaaa cgcggtgaca tgtgtgatat ctacttgttg 420
tatacggcta acttcacatt cggagattct aaagaaccag taccatatga tatcgatgac 480
tacgattgca cgtctacagg ttgcagcata gactttgtca caacagaaaa agtgtgcgtg 540
acagcacagg gagccacaga agggtttctc gaaaaaatta ctccatggag ttcggaagta 600
tgtctgacac ctaaaaagag tgtatataca tgcgcaatta gatccaaaga agatgttccc 660
aatttcaagg acaaaatggc cagagttatc aagagaaaat ttaataaaca gtctcaatct 720
tatttaacta aatttctcgg tagcacatca aatgatgtta ccacttttct tagcatgctt 780
aactt 785
<210> 60
<211> 931
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP-pEL-TurboFP635-loxP-MCS
<400> 60
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataagctt aaaaattgaa attttatttt 60
ttttttttgg aatataaata agctcgaagt cgaccaccat ggtgggtgag gatagcgtgc 120
tgatcaccga gaacatgcac atgaaactgt acatggaggg caccgtgaac gaccaccact 180
tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgaagatca 240
aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt 300
acggcagcaa aacctttatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct 360
tccctgaggg cttcacatgg gagaggatca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg 420
ctacccagga caccagcctc cagaacggct gcctcatcta caacgtcaag atcaacgggg 480
tgaacttccc atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggccagca 540
ccgagatgct gtaccccgct gacagcggcc tgagaggcca tagccagatg gccctgaagc 600
tcgtgggcgg gggctacctg cactgctccc tcaagaccac atacagatcc aagaaacccg 660
ctaagaacct caagatgccc ggcttctact tcgtggacag gagactggaa agaatcaagg 720
aggccgacaa agagacctac gtcgagcagc acgagatggc tgtggccagg tactgcgacc 780
tgcctagcaa actggggcac agctgattaa ttaattttta tcgatctaat tcaacaatgt 840
ctggaggatc cgcatgcata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta ttggccagaa 900
ttcgcggccg caccggtatt taaatcttaa g 931
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary DNA sequence for gRNA targeting B8R
<400> 61
ccgactgtaa cattaactga 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary DNA sequence for gRNA targeting B8R
<400> 62
tcttatttaa ctaaatttct 20
<210> 63
<211> 8431
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector encoding a gRNA for targeting B8R
<400> 63
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg tcagttaatg ttacagtcgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgtctagag 360
gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 420
ccattgacgt caatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 480
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 540
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg cccagtacat gaccttatgg 600
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg 660
agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat 720
ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg 780
ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca 840
gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg 900
ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg 960
ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 1020
caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagctgag caagaggtaa 1080
gggtttaagg gatggttggt tggtggggta ttaatgttta attacctgga gcacctgcct 1140
gaaatcactt tttttcaggt tggaccggtg ccaccatgga ctataaggac cacgacggag 1200
actacaagga tcatgatatt gattacaaag acgatgacga taagatggcc ccaaagaaga 1260
agcggaaggt cggtatccac ggagtcccag cagccgacaa gaagtacagc atcggcctgg 1320
acatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgcccagca 1380
agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac ctgatcggag 1440
ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga accgccagaa 1500
gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc agcaacgaga 1560
tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg 1620
ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg 1680
agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggccg 1740
acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc cacttcctga 1800
tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc 1860
agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg gacgccaagg 1920
ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc gcccagctgc 1980
ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc cctgagcctg ggcctgaccc 2040
ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg agcaaggaca 2100
cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctgt 2160
ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg agagtgaaca 2220
ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac gagcaccacc 2280
aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag tacaaagaga 2340
ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga gccagccagg 2400
aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc gaggaactgc 2460
tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac aacggcagca 2520
tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag gaagattttt 2580
acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc cgcatcccct 2640
actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc agaaagagcg 2700
aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct tccgcccaga 2760
gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag gtgctgccca 2820
agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa gtgaaatacg 2880
tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag gccatcgtgg 2940
acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag gactacttca 3000
agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg ttcaacgcct 3060
ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc ctggacaatg 3120
aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt gaggacagag 3180
agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa gtgatgaagc 3240
agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg atcaacggca 3300
tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac ggcttcgcca 3360
acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag gacatccaga 3420
aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat ctggccggca 3480
gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag ctcgtgaaag 3540
tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag aaccagacca 3600
cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag ggcatcaaag 3660
agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg cagaacgaga 3720
agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag gaactggaca 3780
tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt ctgaaggacg 3840
actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa ccggggcaag agcgacaacg 3900
tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg ctgaacgcca 3960
agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc ggcctgagcg 4020
aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag atcacaaagc 4080
acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat gacaagctga 4140
tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc cggaaggatt 4200
tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac gcctacctga 4260
acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc gagttcgtgt 4320
acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag caggaaatcg 4380
gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc aagaccgaga 4440
ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac ggcgaaaccg 4500
gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg ctgagcatgc 4560
cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc aaagagtcta 4620
tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg gaccctaaga 4680
agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg gccaaagtgg 4740
aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc accatcatgg 4800
aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc tacaaagaag 4860
tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg gaaaacggcc 4920
ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg gccctgccct 4980
ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag ggctcccccg 5040
aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg gacgagatca 5100
tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat ctggacaaag 5160
tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc gagaatatca 5220
tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac tttgacacca 5280
ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct ggacgccacc ctgatccacc 5340
agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga ggcgacaaaa 5400
ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa aaagtaagaa ttcctagagc 5460
tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 5520
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 5580
aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 5640
cagcaagggg gaggattggg aagagaatag caggcatgct ggggagcggc cgcaggaacc 5700
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 5760
accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 5820
cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 5880
acaccgcata cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 5940
ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccttagc gcccgctcct 6000
ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 6060
cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 6120
gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 6180
acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 6240
tctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggt ctattggtta 6300
aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca 6360
attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 6420
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 6480
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 6540
aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 6600
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6660
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6720
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6780
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6840
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 6900
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 6960
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 7020
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 7080
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 7140
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 7200
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 7260
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 7320
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 7380
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 7440
gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 7500
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 7560
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7620
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7680
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7740
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 7800
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 7860
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7920
aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7980
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 8040
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 8100
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 8160
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 8220
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 8280
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 8340
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 8400
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 8431
<210> 64
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous left region
<400> 64
atgtataaaa aactaataac gtttttattt gtaataggtg cagtagcatc ctattcgaat 60
aatgagtaca ctccgtttaa taaactgagt gtaaaactct atatagatgg agtagataat 120
atagaaaatt catatactga tgataataat gaattggtgt taaattttaa agagtacaca 180
atttctatta ttacagagtc atgcgacgtc ggatttgatt ccatagatat agatgttata 240
aacgactata aaattattga tatgtatacc attgactcgt ctactattca acgcagaggt 300
cacacgtgta gaatatctac caaattatca tgccattatg ataagtaccc ttatattcac 360
aaatatgatg gtgatgagcg acaatattct attactgcag agggaaaatg ctataaagga 420
ataaaatatg aaataagtat gatcaacgat gatactctat tgagaaaaca tactcttaaa 480
attggatcta cttatatatt tgatcgtcat ggacatagta atacatatta ttcaaaatat 540
gatttttaaa aatttaaaat atattatcac ttcagtgaca gtagtcaaat aacaaacaac 600
accatgagat atattataat ttta 624
<210> 65
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous right region
<400> 65
gactaaatat tcataactaa tttttattaa tgatacaaaa acgaaataaa actgcatatt 60
atacactggt taacgccctt ataggctcta accattttca agatgaggtc cctgattata 120
gtccttctgt tcccctctat catctactcc atgtctatta gacgatgtga gaagactgaa 180
gaggaaacat ggggattgaa aatagggttg tgtataattg ccaaagattt ttatcccgaa 240
agaactgatt gcagtgttca tctcccaact gcaagtgaag gattgataac tgaaggcaat 300
ggattcaggg atatacgaaa caccgataaa ttataaaaaa agcaatgtgt ccgctgtttc 360
cgttaataat actattttcg taactggcgg attattcata aataactcta atagcacgat 420
cgtggttaac aatatggaaa aacttgacat ttataaagac aaacaatggt cgattataga 480
aatgcctatg gctagggtat atcacggcat cgactcgaca tttggaatgt tatattttgc 540
cggaggtcta tccgttaccg aacaatatgg taatttagag aaaaacaacg agatatcttg 600
ttacaatcct agaacgaata agtg 624
<210> 66
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous left region
<400> 66
gttgaggata catggggatc tgatggtaat ccaattacaa aaactacatc cgattatcaa 60
gattctgatg tatcacaaga agttagaaag tatttttgtg ttaaaacaat gaactaatat 120
ttatttttgt acattaataa atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt aggtttaaga 180
agttgtcggt gccggccgct ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa 240
catttctgca ttacaaagaa gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat 300
acgataaaca ttgttattta gatactaaca ttaaaatgtc tacagataat gcggtttatc 360
agtgtcgtaa attacgagcc agattgccta gaccggatac tagacatctg agagtattgt 420
ttagtatttt ttataaagat tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaataat aaatggttag 480
atattaataa tgataaagat atagatatta gtaaattaac aaattttaaa caactaaaca 540
gtacgacgga tgctgaagcg tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt gaaacagtat 600
gtaaaagtac tcaatctgta ctatgtgtta aaaaattcta caagtgacaa c 651
<210> 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxM3-pEL-TagBFP-loxM3-MCS
<400> 67
ataacttcgt atatggtatt atatacgaag ttatactagt cccggggcta gcaaaaattg 60
aaattttatt tttttttttt ggaatataaa taagctcgaa gtcgaccacc atgagcgagc 120
tgattaagga gaacatgcac atgaagctgt acatggaggg caccgtggac aaccatcact 180
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acggcagcaa gaccttcatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttc aagcagtcct 360
tccctgaggg cttcacatgg gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg 420
ctacccagga caccagcctc caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg 480
tgaacttcac atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggccttca 540
ccgagacgct gtaccccgct gacggcggcc tggaaggcag aaacgacatg gccctgaagc 600
tcgtgggcgg gagccatctg atcgcaaaca tcaagaccac atatagatcc aagaaacccg 660
ctaagaacct caagatgcct ggcgtctact atgtggacta cagactggaa agaatcaagg 720
aggccaacaa cgagacctac gtcgagcagc acgaggtggc agtggccaga tactgcgacc 780
tccctagcaa actggggcac aagcttaatt gattaattaa tttttatcga tctaattcaa 840
caatgtctgg aaccggtctt aagataactt cgtatatggt attatatacg aagttatgga 900
tccgcatgcg atatcattta aatgcggccg cgagctc 937
<210> 68
<211> 562
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homologous right region
<400> 68
aattaataat aagtcgttaa cgtacgccgc catggacgcc gcgtttgtta ttactccaat 60
gggtgtgttg actataacag atacattgta tgatgatctc gatatctcaa tcatggactt 120
tataggacca tacattatag gtaacataaa aactgtccaa atagatgtac gggatataaa 180
atattccgac atgcaaaaat gctactttag ctataagggt aaaatagttc ctcaggattc 240
taatgatttg gctagattca acatttatag catttgtgcc gcatacagat caaaaaatac 300
catcatcata gcatgcgact atgatatcat gttagatata gaagataaac atcagccatt 360
ttatctattc ccatctattg atgtttttaa cgctacaatc atagaagcgt ataacctgta 420
tacagctgga gattatcatc taatcatcaa tccttcagat aatctgaaaa tgaaattgtc 480
gtttaattct tcattctgca tatcagacgg caatggatgg attataattg atgggaaatg 540
caatagtaat tttttatcat aa 562
<210> 69
<211> 1955
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxM7-pEL-eGFP-loxM7-pL-scAb(VEGF)
<400> 69
ataacttcgt atattctatc ttatacgaag ttataagctt aaaaattgaa attttatttt 60
ttttttttgg aatataaata agctcgaagt cgaccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc 120
tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt 180
tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca 240
tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg 300
gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 360
ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 420
agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg 480
gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca 540
gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga 600
tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 660
ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 720
tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 780
ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaatt aattaatttt tatcgatcta 840
attcaacaat gtctggagga tccataactt cgtatattct atcttatacg aagttatgca 900
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ttttatgggt gccgggttca acgggagatg aggtgcagtt ggttgagtcg ggaggtggtt 1140
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acaatataga ttttatcgat tcatctaatt taaacccttc cttaaacgtg aatgatctat 127200
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gcacgactac tttgttaata ataatctcgt cgatgtaaac gtcgtaaggt ttatcgtgga 194100
aaatatggac acgcggctgt aaatcacata tctaacaatg gccgtctatg tatgtacggt 194160
ctgatattat cgagatttaa taattgcggg tatcactgtt atgaaaccat actaatagat 194220
gtatttgata tactaagcaa gtacatggat aatatagata tgatcgataa tgagaataaa 194280
actctactat attacgcggt cgatgtcaat aatatacaat ttgcaaagcg gttattggaa 194340
tatggagcga gtgttacaac atcacgctcg ataatcaata cggccatcca gaaaagtagt 194400
tacagaagag aaaacaaaac gaagctagtt gatttattac ttagctacca tcccactcta 194460
gagactatga ttgacgcatt taatagagat atacgctatc tatatcctga accattattc 194520
gcctgtatca gatacgcctt aatcatagat gatgattttc cttctaaagt aaagtatgat 194580
atcgccggtc gtcataagga actaaagcgc tatagagtag acattaatag aatgaagaat 194640
gcctacatat caggcgtctc catgtttgat atattattta aacgaagcaa acgccacaga 194700
ttgagatacg caaagaatcc gacatcaaat ggtacaaaaa agaactaacg tccatcatta 194760
cagaaactgt aaagaacaat gagaggatcg actccatagt ggacaacatt aatacagacg 194820
ataacttgat ttcgaaatta cccatggaga tactttatta ctccattaaa taatttatca 194880
tggagcgata atgtcctgtt tcatttgttt ccatgacata ttacaaaatc gattccgtcc 194940
aagatgataa aaacatttac cggcatcata aacacggagt ttattttata tgtctcgcat 195000
aaacattact aaaaaaatat attgttcggt tttctttcac atctttaatt atgaaaaagt 195060
aaatcattat gagatggacg agattgtacg catcgttcgc gacagtatgt ggtacatacc 195120
taacgtattt atggacgacg gtaagaatga aggtcacgtt tctgtcaaca atgtttgtca 195180
tatgtatttt acgttctttg atgtggatac atcgtctcat ctgtttaagc tagttattaa 195240
acactgcgat ctgaataaac gaggtaactc tccattacat tgctatacga tgaatacacg 195300
atttaatcca tctgtattaa agatattgtt acaccacggc atgcgtaact ttgatagcaa 195360
ggatgaccac tatcaatcga taacaagatc tttgatatac taacggacac cattgatgac 195420
tttagtaaat catccgatct attgctgtgt tatcttagat ataaattcaa tgggagctta 195480
aactattacg ttctgtacaa aggatccgac cctaattgcg ccgacgagga tgaactcact 195540
tctcttcatt actactgtaa acacatatcc acgttctaca aaagcaatta ttacaagtca 195600
agtcacacta agatgcgagc cgagaagcga ttcatctacg cgataataga ttatggagca 195660
aacattaacg ccgttacaca cttaccttca acagtatacc aaacatagtc ctcgtgtggt 195720
gtatgctctt ttatctcgag gatacgtaat aatcttgatt gtacacccat catggaacga 195780
ttgtgcaaca ggtcatattc tcataatgtt actcaattgg cacgaacaaa aggaagaagg 195840
acaacatcta ctttatctat tcataaaaca taatcaagga tacactctca atatactacg 195900
gtatctacta gataggttcg acattcagaa agacgaatat tataataccg cctttcaaaa 195960
ttgtaacaac aatgttgcct catacatcgg atacgacatc aaccttccga ctaaagacgg 196020
tattcgactt ggtgtttgaa aacagaaaca tcatatacaa ggcggatgtt gtgaatgaca 196080
tcatccacca cagactgaaa gtacctatga ttaaatcgtt gttctacaag atgtcagaat 196140
tctctcccta cgacgattac tacgtaaaaa agatactagc ctactgccta ttaagggacg 196200
agtcattcgc ggaactacat agtaaattct gtttaaacga ggactataaa agtgtattta 196260
tgaaaaatat atcattcgat aagatagatt ccatcatcgt gacataagtc gccttaaaga 196320
gattcgaatc tccgacaccg acctgtatac ggtatcacag ctatcttaaa gccatacatt 196380
cagacagtca catttcattt cccatgtacg acgatctcat agaacagtgc catctatcga 196440
tggagcgtaa aagtaaactc gtcgacaaag cactcaataa attagagtct accatcgatg 196500
gccaatctag actatcgtat ttgcctccgg aaattatgcg caatatcatc taaacagtat 196560
gttgtacgga aagaaccatt acaaatatta tccatgatag aaagaaaata tctatatgat 196620
tggagaagta ggaaacagga acaagacaac gattactaca ttattaaatt atgaagtccg 196680
tattatactc gtatatattg tttctctcat gtataataat aaacggaaga gatatagcac 196740
cgcatgcacc atccgatgga aagtgtaaag acaacgaata caaacgccat aatttgtgtc 196800
cgggaacata cgcttccaga ttatgcgata gcaagactaa cacacaatgt acgccgtgtg 196860
gttcgggtac cttcacatct cgcaataatc atttacccgc ttgtctaagt tgtaacggaa 196920
gatgcgatcg tgtaacacta ctcacaatag aatctgtgaa tgctctcccg gatattattg 196980
tcttctcaaa ggatcatccg gatgcaaggc atgtgtttcc caaacaaaat gtggaatagg 197040
atacggagta tccggagacg tcatctgttc tccgtgtggt ctcggaacat attctcacac 197100
cgtctcttcc gcagataaat gcgaacccgt acccagaaat acgtttaact atatcgatgt 197160
ggaaattaac ctgtatccag ttaacgacac atcgtgtact cggacgacca ctaccggtct 197220
cagcgaatcc atctcaacgt cggaactaac tattactatg aatcataaag actgcgatcc 197280
cgtctttcgt gatggatact tctctgtcct taataaggta gcaacttcag gtttctttac 197340
aggagaaagg tgtgcactct gaatttcgag attaaatgca ataacaaaga ttcttcctcc 197400
aaacagttaa cgaaagcaaa gaatgatact atcatgccgc attcggagac tgtctatcta 197460
gcgtcgacat ctatatacta tatagtaata ccaatactca agactacgaa actgatacaa 197520
tctcttatca tgtgggtaat gttctcgatg tcgatagcca tatgcccggt agttgcgata 197580
tacataaact gatcactaat tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat 197640
aaatacaata attaatttct cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcacggtaa 197700
ggaagtagaa tcataaagaa cagtaatcaa tcaatagcaa tcatgaaaca atatatcgtc 197760
ctggcatgca tgtgcctgcc agtcttcagc aatcctcctc ctcgtgtacg gaagaagaaa 197820
acaaacatca tatgggaatc gatgttatta tcaaagtcac aaagcaagac caaacaccga 197880
ccaatgataa gatttgccaa tccgtaacgg aaattacaga gtccgagtca gatccagatc 197940
ccgaggtgga atcagaagat gattccacat cagtcgagga tgtagatcct cctaccactt 198000
attactccat catcggtgga ggtctgagaa tgaactttgg attcaccaaa tgtcctcaga 198060
ttaaatccat ctcagaatcc gctgatggaa acacagtgaa tgctagattg tccagcgtgt 198120
ccccaggaca aggtaaggac tctcccgcga tcactcatga agaagctctt gctatgatca 198180
aagactgtga ggtgtctatc gacatcagat gtagcgaaga agagaaagac agcgacatca 198240
agacccatcc agtactcggg tctaacatct ctcataagaa agtgagttac gaagatatca 198300
tcggttcaac gatcgtcgat acaaaatgcg tcaagaatct agagtttagc gttcgtatcg 198360
gagacatgtg caaggaatca tctgaacttg aggtcaagga tggattcaag tatgtcgacg 198420
gatcggcatc tgaaggtgca accgatgata cttcactcat cgattcaaca aaactcaaag 198480
cgtgtgtctg aatcgataac tctattcatc tgaaattgga tgagtagggt taatcgaacg 198540
attcaggcac accacgaatt aaaaaagtgt accggacact atattccggt ttgcaaaaca 198600
aaaatgttct taactacatt cacaaaaagt tacctctcgc gacttcttct ttttctgtct 198660
caatagtgtg atacgattat gacactattc ctattcctat tcctatttcc tttcagggta 198720
tcacaaaaat attaaacctc tttctgatgg tctcataaaa aaagttttac aaaaatattt 198780
ttattctctt tctctctttg atggtctcat aaaaaaagtt ttacaaaaat atttttattc 198840
tctttctctc tttgatggtc tcataaaaaa agttttacaa aaatattttt attctctttc 198900
tctctttgat ggtctcataa aaaaagtttt acaaaaatat ttttattctc tttctctctt 198960
tgatggtctc ataaaaaaag ttttacaaaa atatttttat tctctttctc tctttgatgg 199020
tctcataaaa aaagttt 199037
<210> 72
<211> 2686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC18 cloning vector
<400> 72
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420
actctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct 480
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540
aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600
gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660
agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aaagctcacg ctgtaggtat 1080
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 1320
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686
<210> 73
<211> 2710
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC57 cloning vector
<400> 73
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700
ccctttcgtc 2710
<210> 74
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEL promoter
<400> 74
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata agctcgaagt 50
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP
<400> 75
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 76
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgK sequence
<400> 76
atggaaaccg acacacttct attatgggtc ctacttttgt gggttccagg ttcaacagga 60
gac 63
<210> 77
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain of scAb(VEGFR-2)
<400> 77
gaggttcaac ttgtacaatc gggaggagga ctagtgaagc ctggaggttc ccttagacta 60
agttgcgcag ctagtggttt tacattctcg tcctactcaa tgaactgggt ccgtcaggcg 120
cccggtaagg gacttgagtg ggtatccagt atctcatcgt cttcttcgta tatttattat 180
gctgattcag taaagggtcg ttttacgata tcgagagata acgccaagaa ttctttatac 240
cttcagatga attcgttgcg agctgaagac accgcggttt attattgtgc gcgtgttact 300
gatgcgtttg atatatgggg acaaggaaca atggtaactg tttcatctgc ctctacaaaa 360
ggtccttcag tactacctct tgcgcctagt tctaaatcca cttccggagg tacagcggct 420
ttaggttgcc tagtaaagga ctactttcca gagcctgtaa ctgtttcgtg gaattccgga 480
gccctaacgt ccggagtgca tactttcccc gcggttttgc aatcatctgg tctatattct 540
ctttcttccg tagtcaccgt cccgtcctcg tcactaggta cccaaacata catttgtaac 600
gttaaccata aaccgtctaa cactaaggtt gataaaagag tggaacccaa gtcgtgcgac 660
aagacccata cgtgcccccc ctgcccggcc cctgaactat tgggtggacc cagtgttttc 720
ctattcccac ctaagccgaa agatactttg atgatctcaa gaactcccga agttacatgc 780
gttgtcgttg acgtctcgca cgaggaccca gaagttaaat ttaattggta cgtagatggt 840
gtggaggtcc ataatgcaaa aactaaaccc agagaggaac agtataacag tacatatcga 900
gtcgtgtcag tcttgacagt tttacatcaa gattggttaa atggaaagga atataagtgt 960
aaggtgagta acaaagcgtt accggcgccg attgaaaaga ccatttcgaa agccaaggga 1020
caaccaagag aaccgcaggt gtacacccta ccgccgtccc gagaagaaat gacaaagaac 1080
caagtcagtc taacttgttt ggttaaagga ttttatccaa gtgatatagc ggttgaatgg 1140
gagagtaatg gtcaaccgga aaacaattat aagacgactc cccccgtact agactcggac 1200
ggttctttct ttttgtattc aaaattgacc gttgacaaga gtcgatggca gcagggtaat 1260
gtgttctctt gttccgttat gcatgaggca cttcataatc actacacgca gaagagtctt 1320
tcattaagtc cgggtaag 1338
<210> 78
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 78
ggaggaggtg gttctggtgg aggtggatcc ggaggaggtg gttcg 45
<210> 79
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain of scAb(VEGFR-2)
<400> 79
gacatccaga tgactcagtc ccctagttcc gtgtcagcgt ccattggaga tagagtaacg 60
attacatgca gagcatcgca aggtattgat aactggttag gttggtatca acaaaagccg 120
ggaaaggctc ctaagctatt gatatatgat gcatcaaatc tagatacggg agtgccatca 180
cgtttctcag gatccggatc tggtacatat ttcactctaa caataagttc attgcaagcg 240
gaggactttg ccgtatactt ttgtcagcaa gcgaaggcct ttccacctac atttggtggt 300
ggtacaaaag tagacattaa gcgaacggtg gcggccccta gtgtgttcat ctttccaccc 360
tctgacgaac aattgaaatc aggaactgca tctgtagtct gcttattgaa taatttttac 420
ccaagagaag ccaaggtcca atggaaggtt gacaacgccc tacaatcggg taactcccaa 480
gagtcagtga ccgagcaaga ttccaaggat agtacctatt ctctttcgtc taccctaacc 540
ctttctaaag ccgactatga aaaacataaa gtttacgcat gcgaagtcac acaccaagga 600
ctatcctccc cggtcactaa gtccttcaac cgaggagaat gc 642
<210> 80
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Terminator
<400> 80
ttaattaatt tttatcgatc taattcaaca atgtctgga 39
<210> 81
<211> 6906
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pEL-IgK-scAb(VEGFR-2)-FLAG-terminator
vector sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (972)..(972)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (974)..(974)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 81
ggccgcgagc tcaagatctt catgcaattg agtcagctct taacacaatc tcttgcttct 60
tcgtcatagt acttacaatc actatgggat ccattgttac cacgtctaca ctcggcgagc 120
tcgcgtttaa gagattcaat ttcccgtttg tattggtcca tgtttccatt gctaccacca 180
ttagatttac aggctgctag ttgtcgttcg agatcagaaa tacgggtttt cttggaattg 240
atttcgtcga tgtacttggc atcgaaacac ttattaagtt ctttttccaa ttctacgatt 300
ttatttcttt cgcgagtcaa ttccctcctg tagtaactat ctgttttgtc agattcacgc 360
tctctacgta gactttcttg caagttacta atttgttccc tagcacgtcc gagtttagtt 420
ttatatgccg aatagagttc tgattcatcc tttgagcaga tctctagaga tcgttcaaga 480
tccctgattc tagtctttag cctatttacc tcctcggaag atgctccgtt accgttgcgt 540
ttacactcgt taagctgtct atcaagacac gtgggcgccc ctgatgcggt attttctcct 600
tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 660
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 720
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 780
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 840
atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 900
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 960
gctcatgaga cndntacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 1020
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 1080
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 1140
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 1200
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 1260
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 1320
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 1380
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 1440
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 1500
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 1560
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 1620
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 1680
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 1740
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 1800
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 1860
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 1920
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1980
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 2040
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2100
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2160
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2220
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2280
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2340
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 2400
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 2460
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 2520
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 2580
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 2640
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 2700
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 2760
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 2820
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 2880
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 2940
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 3000
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaaagc 3060
ttcaattgct gcaggatact gaagtctgat attcagaaag ctgggggatg ttctggttcg 3120
acatccaccg atggtgtcac atcactaatc ggttcggtaa cgtctgtgga tggaggtgct 3180
acttctacag aacctgtagc ctcagttgtc aacggagata catttttaat gcgaggaaat 3240
gtataatttg gtaatggttt ctcatgtgga tctgaagaag aggtaagata tctactagaa 3300
agataccgat cacgttctag ttctcttttg tagaacttaa ctttttcttt ctcagcatct 3360
agttgatatt ccaacctctt cacgttacta cgttcagatt tcaattcacg ttcgcatggg 3420
ttacctccgc agtttttacg agcgatttca cgttcagcct tcatgcgtct ttccctctct 3480
ctatcgagtt tatcagagca gtctttctga aggcgatcga actccataaa tttctccaac 3540
gctttgattg tttccataga tttccgaagt tcagctttta ggactgtgat tctttttctt 3600
tcgaattcac agctggatgt acaaccgttt ccattaccgc catctctaag tttcttttct 3660
agatcggcaa catttcatcc ccatgccttt tacattcctc gagtctactg tcgtcggagc 3720
tcccatgggc tagcataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac tagtcccggg 3780
gctagcaaaa attgaaattt tatttttttt ttttggaata taaataagct cgaagtcgac 3840
caccatggtg ggtgaggata gcgtgctgat caccgagaac atgcacatga aactgtacat 3900
ggagggcacc gtgaacgacc accacttcaa gtgcacatcc gagggcgaag gcaagcccta 3960
cgagggcacc cagaccatga agatcaaggt ggtcgagggc ggccctctcc ccttcgcctt 4020
cgacatcctg gctaccagct tcatgtacgg cagcaaaacc tttatcaacc acacccaggg 4080
catccccgac ttctttaagc agtccttccc tgagggcttc acatgggaga ggatcaccac 4140
atacgaagac gggggcgtgc tgaccgctac ccaggacacc agcctccaga acggctgcct 4200
catctacaac gtcaagatca acggggtgaa cttcccatcc aacggccctg tgatgcagaa 4260
gaaaacactc ggctgggagg ccagcaccga gatgctgtac cccgctgaca gcggcctgag 4320
aggccatagc cagatggccc tgaagctcgt gggcgggggc tacctgcact gctccctcaa 4380
gaccacatac agatccaaga aacccgctaa gaacctcaag atgcccggct tctacttcgt 4440
ggacaggaga ctggaaagaa tcaaggaggc cgacaaagag acctacgtcg agcagcacga 4500
gatggctgtg gccaggtact gcgacctgcc tagcaaactg gggcacagct gattaattaa 4560
tttttatcga tctaattcaa caatgtctgg aaccggtctt aagataactt cgtatagcat 4620
acattatacg aagttatgga tccgcatgca aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga 4680
atataaataa gctcgaagtc gaccaccatg gaaaccgaca cacttctatt atgggtccta 4740
cttttgtggg ttccaggttc aacaggagac gaggttcaac ttgtacaatc gggaggagga 4800
ctagtgaagc ctggaggttc ccttagacta agttgcgcag ctagtggttt tacattctcg 4860
tcctactcaa tgaactgggt ccgtcaggcg cccggtaagg gacttgagtg ggtatccagt 4920
atctcatcgt cttcttcgta tatttattat gctgattcag taaagggtcg ttttacgata 4980
tcgagagata acgccaagaa ttctttatac cttcagatga attcgttgcg agctgaagac 5040
accgcggttt attattgtgc gcgtgttact gatgcgtttg atatatgggg acaaggaaca 5100
atggtaactg tttcatctgc ctctacaaaa ggtccttcag tactacctct tgcgcctagt 5160
tctaaatcca cttccggagg tacagcggct ttaggttgcc tagtaaagga ctactttcca 5220
gagcctgtaa ctgtttcgtg gaattccgga gccctaacgt ccggagtgca tactttcccc 5280
gcggttttgc aatcatctgg tctatattct ctttcttccg tagtcaccgt cccgtcctcg 5340
tcactaggta cccaaacata catttgtaac gttaaccata aaccgtctaa cactaaggtt 5400
gataaaagag tggaacccaa gtcgtgcgac aagacccata cgtgcccccc ctgcccggcc 5460
cctgaactat tgggtggacc cagtgttttc ctattcccac ctaagccgaa agatactttg 5520
atgatctcaa gaactcccga agttacatgc gttgtcgttg acgtctcgca cgaggaccca 5580
gaagttaaat ttaattggta cgtagatggt gtggaggtcc ataatgcaaa aactaaaccc 5640
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gattggttaa atggaaagga atataagtgt aaggtgagta acaaagcgtt accggcgccg 5760
attgaaaaga ccatttcgaa agccaaggga caaccaagag aaccgcaggt gtacacccta 5820
ccgccgtccc gagaagaaat gacaaagaac caagtcagtc taacttgttt ggttaaagga 5880
ttttatccaa gtgatatagc ggttgaatgg gagagtaatg gtcaaccgga aaacaattat 5940
aagacgactc cccccgtact agactcggac ggttctttct ttttgtattc aaaattgacc 6000
gttgacaaga gtcgatggca gcagggtaat gtgttctctt gttccgttat gcatgaggca 6060
cttcataatc actacacgca gaagagtctt tcattaagtc cgggtaaggg aggaggtggt 6120
tctggtggag gtggatccgg aggaggtggt tcggacatcc agatgactca gtcccctagt 6180
tccgtgtcag cgtccattgg agatagagta acgattacat gcagagcatc gcaaggtatt 6240
gataactggt taggttggta tcaacaaaag ccgggaaagg ctcctaagct attgatatat 6300
gatgcatcaa atctagatac gggagtgcca tcacgtttct caggatccgg atctggtaca 6360
tatttcactc taacaataag ttcattgcaa gcggaggact ttgccgtata cttttgtcag 6420
caagcgaagg cctttccacc tacatttggt ggtggtacaa aagtagacat taagcgaacg 6480
gtggcggccc ctagtgtgtt catctttcca ccctctgacg aacaattgaa atcaggaact 6540
gcatctgtag tctgcttatt gaataatttt tacccaagag aagccaaggt ccaatggaag 6600
gttgacaacg ccctacaatc gggtaactcc caagagtcag tgaccgagca agattccaag 6660
gatagtacct attctctttc gtctacccta accctttcta aagccgacta tgaaaaacat 6720
aaagtttacg catgcgaagt cacacaccaa ggactatcct ccccggtcac taagtccttc 6780
aaccgaggag aatgcgacta caaagacgac gacgacaaat aattaattaa tttttatcga 6840
tctaattcaa caatgtctgg attaattaat ttttatcgat ctaattcaac aatgtctgga 6900
gcatgc 6906
<210> 82
<211> 1293
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAb(VEGF-A fusion protein)
<400> 82
agcgacactg gacgaccgtt cgttgagatg tattcggaga taccggagat aatccacatg 60
actgaaggtc gagagttggt cattccgtgc cgtgtgacta gtccgaatat tactgttacg 120
cttaagaagt tccctcttga tactttaatc ccagacggta agcgaatcat ttgggactcc 180
cgaaagggtt tcataatatc caatgctaca tacaaagaaa taggactatt gacgtgtgag 240
gccaccgtca acggtcacct atacaagacc aattacttga cccatcgaca gacgaatacg 300
attattgatg tcgtactttc accttcacat ggtattgagt tatccgtagg agagaaacta 360
gtcttaaatt gtactgctcg aacggaattg aacgttggta tagatttcaa ctgggagtac 420
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tcggaaatga aaaaatttct aagtaccctt acaatcgatg gtgtcacacg atctgatcaa 540
ggactataca catgtgccgc ctcgagtgga ttaatgacca agaagaattc cacttttgta 600
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ggaggtccca gtgtcttttt attccccccc aagccgaagg atacgcttat gatttcgcgt 720
acaccagaag tcacgtgtgt agttgtggat gtgtcacacg aggacccgga agtaaagttt 780
aactggtatg tcgacggtgt cgaggttcat aacgcaaaga ctaaaccacg agaagagcag 840
tataactcga catatcgtgt cgttagtgtt ttgacggtac tacaccaaga ctggttaaac 900
ggtaaagagt acaagtgtaa ggttagtaac aaggcattgc cagctcccat tgagaagact 960
atcagtaaag ctaagggtca accccgtgag ccacaggtat acactcttcc cccttcccga 1020
gacgagctta ccaagaacca agtaagtctt acttgtttag tcaaaggatt ttacccgtct 1080
gatatcgctg tggagtggga aagtaatgga cagcccgaaa ataattataa gaccacaccc 1140
cctgtactag attccgatgg ttcattcttt ttgtacagta agttgactgt tgataagagt 1200
cgttggcaac aaggtaatgt ctttagttgc agtgtgatgc acgaggcatt acacaaccac 1260
tacactcaga agtcgttatc actatcgcca ggc 1293
<210> 83
<211> 6174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pEL-IgK-scAb(VEGF-A fusion
protein)-FLAG-terminator vector sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (972)..(972)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (974)..(974)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 83
ggccgcgagc tcaagatctt catgcaattg agtcagctct taacacaatc tcttgcttct 60
tcgtcatagt acttacaatc actatgggat ccattgttac cacgtctaca ctcggcgagc 120
tcgcgtttaa gagattcaat ttcccgtttg tattggtcca tgtttccatt gctaccacca 180
ttagatttac aggctgctag ttgtcgttcg agatcagaaa tacgggtttt cttggaattg 240
atttcgtcga tgtacttggc atcgaaacac ttattaagtt ctttttccaa ttctacgatt 300
ttatttcttt cgcgagtcaa ttccctcctg tagtaactat ctgttttgtc agattcacgc 360
tctctacgta gactttcttg caagttacta atttgttccc tagcacgtcc gagtttagtt 420
ttatatgccg aatagagttc tgattcatcc tttgagcaga tctctagaga tcgttcaaga 480
tccctgattc tagtctttag cctatttacc tcctcggaag atgctccgtt accgttgcgt 540
ttacactcgt taagctgtct atcaagacac gtgggcgccc ctgatgcggt attttctcct 600
tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 660
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 720
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 780
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 840
atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 900
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 960
gctcatgaga cndntacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 1020
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 1080
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cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 1260
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 1320
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 1380
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 1440
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 1500
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 1560
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 1620
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 1680
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 1740
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 1800
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 1860
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 1920
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1980
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 2040
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2100
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2160
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2220
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2280
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2340
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 2400
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 2460
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 2520
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 2580
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 2640
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 2700
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 2760
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 2820
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 2880
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 2940
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 3000
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gtataatttg gtaatggttt ctcatgtgga tctgaagaag aggtaagata tctactagaa 3300
agataccgat cacgttctag ttctcttttg tagaacttaa ctttttcttt ctcagcatct 3360
agttgatatt ccaacctctt cacgttacta cgttcagatt tcaattcacg ttcgcatggg 3420
ttacctccgc agtttttacg agcgatttca cgttcagcct tcatgcgtct ttccctctct 3480
ctatcgagtt tatcagagca gtctttctga aggcgatcga actccataaa tttctccaac 3540
gctttgattg tttccataga tttccgaagt tcagctttta ggactgtgat tctttttctt 3600
tcgaattcac agctggatgt acaaccgttt ccattaccgc catctctaag tttcttttct 3660
agatcggcaa catttcatcc ccatgccttt tacattcctc gagtctactg tcgtcggagc 3720
tcccatgggc tagcataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac tagtcccggg 3780
gctagcaaaa attgaaattt tatttttttt ttttggaata taaataagct cgaagtcgac 3840
caccatggtg ggtgaggata gcgtgctgat caccgagaac atgcacatga aactgtacat 3900
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catccccgac ttctttaagc agtccttccc tgagggcttc acatgggaga ggatcaccac 4140
atacgaagac gggggcgtgc tgaccgctac ccaggacacc agcctccaga acggctgcct 4200
catctacaac gtcaagatca acggggtgaa cttcccatcc aacggccctg tgatgcagaa 4260
gaaaacactc ggctgggagg ccagcaccga gatgctgtac cccgctgaca gcggcctgag 4320
aggccatagc cagatggccc tgaagctcgt gggcgggggc tacctgcact gctccctcaa 4380
gaccacatac agatccaaga aacccgctaa gaacctcaag atgcccggct tctacttcgt 4440
ggacaggaga ctggaaagaa tcaaggaggc cgacaaagag acctacgtcg agcagcacga 4500
gatggctgtg gccaggtact gcgacctgcc tagcaaactg gggcacagct gattaattaa 4560
tttttatcga tctaattcaa caatgtctgg aaccggtctt aagataactt cgtatagcat 4620
acattatacg aagttatgga tccgcatgca aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga 4680
atataaataa gctcgaagtc gaccaccatg gaaaccgaca cacttctatt atgggtccta 4740
cttttgtggg ttccaggttc aacaggagac agcgacactg gacgaccgtt cgttgagatg 4800
tattcggaga taccggagat aatccacatg actgaaggtc gagagttggt cattccgtgc 4860
cgtgtgacta gtccgaatat tactgttacg cttaagaagt tccctcttga tactttaatc 4920
ccagacggta agcgaatcat ttgggactcc cgaaagggtt tcataatatc caatgctaca 4980
tacaaagaaa taggactatt gacgtgtgag gccaccgtca acggtcacct atacaagacc 5040
aattacttga cccatcgaca gacgaatacg attattgatg tcgtactttc accttcacat 5100
ggtattgagt tatccgtagg agagaaacta gtcttaaatt gtactgctcg aacggaattg 5160
aacgttggta tagatttcaa ctgggagtac ccgagttcaa aacatcagca caaaaagtta 5220
gtcaaccgtg acttaaaaac ccagagtgga tcggaaatga aaaaatttct aagtaccctt 5280
acaatcgatg gtgtcacacg atctgatcaa ggactataca catgtgccgc ctcgagtgga 5340
ttaatgacca agaagaattc cacttttgta cgtgttcacg agaaggacaa gacgcacacc 5400
tgtccgccat gtcccgcacc tgaactattg ggaggtccca gtgtcttttt attccccccc 5460
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gtgtcacacg aggacccgga agtaaagttt aactggtatg tcgacggtgt cgaggttcat 5580
aacgcaaaga ctaaaccacg agaagagcag tataactcga catatcgtgt cgttagtgtt 5640
ttgacggtac tacaccaaga ctggttaaac ggtaaagagt acaagtgtaa ggttagtaac 5700
aaggcattgc cagctcccat tgagaagact atcagtaaag ctaagggtca accccgtgag 5760
ccacaggtat acactcttcc cccttcccga gacgagctta ccaagaacca agtaagtctt 5820
acttgtttag tcaaaggatt ttacccgtct gatatcgctg tggagtggga aagtaatgga 5880
cagcccgaaa ataattataa gaccacaccc cctgtactag attccgatgg ttcattcttt 5940
ttgtacagta agttgactgt tgataagagt cgttggcaac aaggtaatgt ctttagttgc 6000
agtgtgatgc acgaggcatt acacaaccac tacactcaga agtcgttatc actatcgcca 6060
ggcgactaca aagacgacga cgacaaataa ttaattaatt tttatcgatc taattcaaca 6120
atgtctggat taattaattt ttatcgatct aattcaacaa tgtctggagc atgc 6174
<210> 84
<211> 1389
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain of scAb(ANGPT2)
<400> 84
caggttcagc tagtacaaag tggtgcggag gtgaagaaac caggagcaag tgttaaggtc 60
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ccgggaaag 1389
<210> 85
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain of scAb(ANGPT2)
<400> 85
cagccgggac ttactcagcc gccttccgtg tccgtcgcgc caggtcagac cgctagaatt 60
acgtgtggag gaaacaacat aggttctaag tcggttcact ggtatcagca gaagccagga 120
caagctcctg tacttgttgt ttatgacgac tctgatcgac catctggtat tccagaacgt 180
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gatgaagccg attactactg ccaggtatgg gactcctcat ccgaccacta cgtgtttggt 300
actggtacta aagtcacggt tctaagttca gcctctacga aaggaccctc ggtcttccca 360
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<210> 86
<211> 6954
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP-pEL-TurboFP635-loxP-pEL-IgK-scAb(ANGPT2)-FLAG-terminator
vector sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (972)..(972)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (974)..(974)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 86
ggccgcgagc tcaagatctt catgcaattg agtcagctct taacacaatc tcttgcttct 60
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<210> 87
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Heavy chain of scAb(VEGF-A)
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<212> DNA
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<223> n is a, c, g, or t
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<222> (974)..(974)
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ggccgcgagc tcaagatctt catgcaattg agtcagctct taacacaatc tcttgcttct 60
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gtagacagca gtatcatccg atcgtaatcg cgaaagttcc atataggcgg tggagataga 8820
agtgtctctc gtcatagtga ctcttccttg gaatttctgg gcatagtttg ttccaccaga 8880
gttcgggtta atccaaccca tccattccaa accctgaccc ggggcctgac gcacccagtg 8940
catgtagtaa ccagtgaacg tatatccgga agctttacaa ctgaccttaa cacttgctcc 9000
tggtttcttc acctccgcac cactttgtac tagctgaacc tggtctcctg ttgaacctgg 9060
aacccacaaa agtaggaccc ataatagaag tgtgtcggtt tccatggtgg tcgacttcga 9120
gcttatttat attccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt tttaattcaa caatgtctgg 9180
agcatgc 9187
<210> 91
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A56R Forward Primer
<400> 91
catcatctgg aattgtcact actaaa 26
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A56R Reverse Primer
<400> 92
acggccgaca atataattaa tgc 23
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH1 Forward Primer
<400> 93
gggaaggtga aggtcggagt 20
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH1 Reverse Primer
<400> 94
tccactttac cagagttaaa agcag 25
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Guide RNA (gRNA1, SEQ ID NO:1) target sequence
<400> 95
cgaggaaaag ctgtagttat 20

Claims (398)

1.一种细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，包含载体细胞，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述溶瘤病毒不是腺病毒；
所述载体细胞是病毒可在其中复制的细胞；
所述载体细胞不是肿瘤细胞或免疫细胞；并且
所述载体细胞表达至少一种由所述病毒编码并通过所述病毒与所述载体细胞的关联而表达的免疫调节蛋白或重组治疗蛋白。
2.一种细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，包含载体细胞，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述溶瘤病毒不是麻疹病毒；
所述载体细胞是病毒可在其中复制的干细胞；并且
所述载体细胞表达至少一种由所述病毒编码并通过所述病毒与所述载体细胞的关联而表达的免疫调节蛋白或重组治疗蛋白。
3.一种细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，包含载体细胞，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述载体细胞是病毒可在其中复制的细胞；
所述载体细胞表达至少一种由所述病毒编码并通过所述病毒与所述载体细胞的关联而表达的免疫调节蛋白或重组治疗蛋白；
所述载体细胞经处理或经修饰或经处理并经修饰以增强用于施用于人类对象的细胞的免疫抑制特性和/或免疫豁免特性；并且
任选地，所述细胞经处理或经修饰以增强所述细胞中所述病毒的扩增。
4.一种细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，包含载体细胞，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述溶瘤病毒不是腺病毒；
所述载体细胞是干细胞；
所述载体细胞表达至少一种由所述病毒编码并通过所述病毒与所述载体细胞的关联而表达的免疫调节蛋白或重组治疗蛋白；并且
在用所述溶瘤病毒感染所述载体细胞后，将溶瘤病毒孵育6或更多小时。
5.权利要求4的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为痘苗病毒。
6.权利要求4或权利要求5的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中通过以0.001-10的感染复数(MOI)感染所述细胞产生含有病毒的载体细胞。
7.权利要求1-6中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其低温保存。
8.权利要求1-6中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其冷藏了至少24小时。
9.权利要求1-6中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中组合物的温度为-20℃至-80℃或约-20℃至约-80℃。
10.权利要求1-7中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其在5℃至-200℃的温度下储存了至少24小时，其中所述载体细胞含有少于约100或50或10个病毒颗粒，其中病毒颗粒的数目是通过超声处理所述细胞并测量空斑形成单位而评估的数目。
11.权利要求7、9和10中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其在约-80℃至-200℃之间或-80℃至-200℃之间的温度下储存了至少24小时。
12.权利要求1-11中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒是TK+痘苗病毒。
13.权利要求1-11中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒是减毒的。
14.一种细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其包含载体细胞，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述载体细胞是病毒可在其中复制的细胞；
所述载体细胞表达至少一种由所述病毒编码并通过所述病毒与所述载体细胞的关联而表达的免疫调节蛋白或重组治疗蛋白；并且
所述CAVES低温保存或在含有低温保护剂的组合物中。
15.权利要求14的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒不是腺病毒。
16.权利要求14或权利要求5的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述组合物的温度为-200℃至-20℃或为约-200℃至-20℃。
17.权利要求7或权利要求14的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中CAVES在包含DMSO和甘油中的一种或两种用于低温保存的组合物中。
18.权利要求1-14中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中通过用所述病毒以仅至多10个病毒颗粒/细胞的感染复数(MOI)感染所述细胞产生具有溶瘤病毒的载体细胞。
19.权利要求18的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述MOI为0.001-10。
20.权利要求19的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述MOI为至少0.1或至少0.3或至少0.5。
21.权利要求1-19中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞含有约900或约1000个拷贝，至多约10,0000或约11,000个拷贝的所述溶瘤病毒基因组。
22.权利要求1-19中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，所述CAVES含有少于100个病毒基因组/细胞。
23.权利要求1-22中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，所述CAVES在5℃至-200℃之间的温度下储存了至少24小时，其中所述载体细胞含有约900或约1000个拷贝，至多约10,0000或约11,000个拷贝的所述溶瘤病毒基因组。
24.权利要求1-23中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞含有少于约100或50或10个病毒颗粒，其中病毒颗粒的数目是通过超声处理所述细胞并测量空斑形成单位而评估的数目。
25.权利要求1-24中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞含有1至小于200个病毒颗粒/细胞，其中病毒颗粒的数目是通过超声处理所述细胞并测量空斑形成单位而评估的数目。
26.权利要求1-24中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞含有1至小于200个病毒颗粒/细胞。
27.权利要求1、2和7-26中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中：
所述细胞经处理或经修饰或经处理并经修饰以增强用于施用于人类对象的细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性；和/或
所述细胞经处理或经修饰以增强所述细胞中病毒的扩增。
28.权利要求1-27中的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中：
所述细胞经处理或经修饰或经处理并经修饰以增强用于施用于人类对象的细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性；并且
所述细胞经处理或经修饰以增强所述细胞中病毒的扩增。
29.权利要求1-28中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞允许溶瘤病毒扩增，并且在肿瘤中积累和/或在足以将病毒递送至对象中的肿瘤的时间不被所述对象的免疫系统识别。
30.权利要求3-29中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞选自干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞，所述干细胞是经处理或经修饰的。
31.权利要求1-29中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞为胚胎上皮细胞或成纤维细胞。
32.权利要求3-29中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞为免疫细胞。
33.权利要求32的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述免疫细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞、靶向肿瘤特异性抗原的T细胞受体(TCR)转基因细胞和靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞。
34.权利要求3-29中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞是来自血液恶性肿瘤细胞系的经修饰或经处理的细胞。
35.权利要求34的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞系选自人白血病细胞系、T细胞白血病细胞系、髓单核细胞白血病细胞系、淋巴瘤细胞系、非霍奇金氏淋巴瘤细胞系、伯基特淋巴瘤细胞系、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系、急性髓性白血病(AML)细胞系、慢性髓性白血病(CML)细胞系、急性成淋巴细胞白血病(ALL)细胞系、红白血病细胞系、髓单核母细胞白血病细胞系、恶性非霍奇金氏NK淋巴瘤细胞系、骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系、多发性骨髓瘤细胞系和巨噬细胞细胞系。
36.权利要求1-32中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞为干细胞。
37.权利要求36的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述干细胞选自成体干细胞；胚胎干细胞；胎儿干细胞；神经干细胞；间充质干细胞；全能干细胞；多能干细胞；诱导的多能干细胞；专能干细胞；寡能干细胞；单能干细胞；脂肪基质干细胞；内皮干细胞(例如，内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞、周细胞)；成体外周血干细胞；成肌细胞；小的幼年干细胞；皮肤成纤维干细胞；组织/肿瘤相关的成纤维细胞；上皮干细胞；和胚胎上皮干细胞。
38.权利要求36的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述干细胞选自间充质细胞。
39.权利要求38的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述间充质细胞分离自/来源于：成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞、肌肉卫星细胞和其它此类细胞。
40.权利要求1-36中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞选自内皮祖细胞、神经干细胞、成体骨髓细胞和间充质干细胞。
41.权利要求1-36中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞为间充质干细胞，其分离自或来源于成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞和肌肉卫星细胞。
42.权利要求41的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述间充质干细胞分离自脂肪基质细胞。
43.权利要求1-36中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞包含脂肪基质细胞。
44.权利要求1-36中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞为分离自脐带血、外周血、肌肉、软骨或羊水或它们的混合物的MSC。
45.权利要求1-44中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞来源于脂肪基质细胞的基质血管成分(SVF)。
46.权利要求1-45中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞是通过培养外膜上脂肪基质细胞以产生AD-MSC而来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的干细胞。
47.权利要求38的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述间充质细胞来源于脂肪基质细胞。
48.权利要求1-47中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞是选自外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)的脂肪基质细胞。
49.权利要求1-48中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞是来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的脂肪培养的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)。
50.权利要求1-49中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中在施用于对象之前或在储存之前，将所述载体细胞和溶瘤病毒进行体外共培养足以使由所述病毒编码的免疫调节蛋白或治疗蛋白表达和/或足以使所述病毒经历至少一个复制周期的时间。
51.权利要求50的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中将所述载体细胞和病毒共培养足以使溶瘤病毒免疫调节蛋白表达并且足以使所述病毒经历至少一个复制周期的时间。
52.权利要求1-51中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞对于待治疗的对象是自体的。
53.权利要求1-51中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞对于待治疗的对象是异体的。
54.权利要求1-53中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒选自痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内加谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、逆转录病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒、马拉巴病毒和辛德毕斯病毒。
55.权利要求1和3-54中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为麻疹病毒。
56.权利要求54的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为逆转录病毒。
57.权利要求54的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为痘病毒，其为痘苗病毒。
58.权利要求57的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述痘苗病毒是TK+的。
59.权利要求54的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒是减毒的。
60.权利要求54的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒是选自Dryvax株、ACAM1000株、ACAM2000株、李斯特株、EM63株、LIVP株、天坛株、哥本哈根株、西储株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、纽约市健康委员会株、大连株、池田株、LC16M8株、塔什干株、惠氏株、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、大连I株和康诺特株的痘病毒。
61.权利要求60的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为ACAM1000或ACAM2000。
62.权利要求1-57中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中通过将所述载体细胞与所述病毒在感染后在表达由所述病毒编码的至少一种免疫调节蛋白或治疗蛋白的条件下或在所述载体细胞能够生长或所述病毒能够复制的条件下孵育超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59小时来实现所述病毒编码的免疫调节蛋白和/或治疗蛋白的表达。
63.权利要求62的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中通过在感染后将所述载体细胞与所述病毒一起孵育6小时或超过6小时来实现所述病毒编码的免疫调节蛋白和/或治疗蛋白的表达。
64.权利要求63的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为痘苗病毒。
65.权利要求1-62中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中在感染后将具有所述病毒的所述载体细胞孵育足够所述蛋白质的表达和所述病毒的复制的时间。
66.权利要求62或权利要求60的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中在孵育后，将含有所述病毒的载体细胞在-5℃至-200℃下储存至少24小时。
67.权利要求1-66中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述CAVES或含有所述CAVES的组合物在-5℃至-200℃下储存至少24小时。
68.权利要求1-66中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述CAVES或含有所述CAVES的组合物在-80℃至-200℃下储存至少24小时。
69.权利要求1-68中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒表达展现于所述载体细胞表面的免疫调节蛋白。
70.权利要求61中的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中免疫调节性病毒蛋白选自VCP(C3L)、B5R、HA(A56R)、B18R/B19R和B8R。
71.权利要求1-69中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中：
所述载体细胞是干细胞，其为来自脂肪基质细胞的间充质细胞；
所述病毒是痘苗病毒；并且
通过在表达至少一种由所述病毒编码的免疫调节蛋白或治疗蛋白的条件下或在所述载体细胞能够生长或所述病毒能够复制的条件下将所述细胞与所述病毒一起孵育6或更多小时来产生包含所述病毒的所述载体细胞。
72.权利要求71的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述孵育进行6小时至至多第二天、至多24小时、至多26小时、至多3小时、至多3天、至多4天或至多5天，或6小时-1周的任何量的时间。
73.权利要求62-71中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述条件包括在约25℃-40℃的温度下在细胞培养基中孵育。
74.权利要求1-73中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为选自权利要求280-310中任一项所示的那些的痘苗病毒。
75.权利要求1-73中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒是痘苗病毒，其选自包含以下的痘苗病毒：
a)SEQ ID NO：71中所示的核酸序列或与其具有至少95％的序列相同性的序列；
b)至少一个治疗基因或可检测的标记基因，其插入相应痘苗病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域；
c)相应的未经修饰的痘苗病毒的部分或完全缺失的F1L遗传基因座，由此所述F1L基因不表达；
d)相应的未经修饰的痘苗病毒的部分或完全缺失的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达；
e)下列修饰的一种或多种：
(i)至少一种治疗基因或标记基因，其插入相应的未经修饰的痘苗病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域；
(ii)相应的未经修饰的痘苗病毒的部分或完全缺失的F1L遗传基因座，由此所述F1L基因不表达；和/或
(ii)相应的未经修饰的病毒的部分或完全缺失的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达。
76.权利要求75a)-e)中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述相应的未经修饰的痘苗病毒包含SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71中所示的核酸序列。
77.权利要求75b)、e)和权利要求76中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述修饰包含至少一种治疗基因，其插入相应的未经修饰的痘苗病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域。
78.权利要求77的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、共刺激因子、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂。
79.权利要求78的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗基因是共刺激因子，其为Ox40L或CD40L。
80.权利要求75b)和e)和权利要求76-78中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述修饰包含至少一种标记基因，其插入相应的未经修饰的痘苗病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域。
81.权利要求80的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
82.权利要求75d)-f)中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中：
所述修饰是相应的未经修饰的病毒的部分或完全缺失的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达；并且
经修饰的病毒包含至少一种插入所述部分或完全缺失的B8R遗传基因座的区域的治疗基因和/或标记基因。
83.权利要求75c)、e)和f)中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中：
所述修饰是相应的未经修饰的病毒的部分或完全缺失的F1L遗传基因座，由此所述F1L基因不表达；并且
经修饰的病毒包含至少一种插入所述部分或完全缺失的F1L遗传基因座的区域的治疗基因和/或标记基因。
84.权利要求82或权利要求83的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其编码至少一种治疗基因。
85.权利要求84的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、共刺激因子、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂。
86.权利要求82-85中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其包含至少一种标记基因。
87.权利要求86的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
88.权利要求75b)和f)和权利要求76-87中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中至少一种治疗基因是抗癌抗体。
89.权利要求88的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述抗癌抗体为抗VEGF抗体或抗CTLA-4抗体。
90.权利要求88或权利要求89的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述抗癌抗体为单链抗体。
91.权利要求88-90中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其进一步包含编码IgK信号肽的核酸以促进所述抗体的分泌。
92.权利要求88-91中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其进一步包含编码FLAG标签的核酸以促进所述抗体的检测。
93.权利要求75b)和e)和权利要求76-87中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒包含编码治疗性产物的基因和/或可检测标记基因，选自碘化钠同向转运体(NIS)、OX40L和4-IBBL。
94.权利要求74和76-93中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述未经修饰的痘苗病毒为ACAM2000或ACAM1000。
95.权利要求94的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述未经修饰的痘苗病毒为ACAM2000。
96.权利要求3-75中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞来自待施用所述组合物的对象的肿瘤。
97.权利要求96的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其编码治疗性产物。
98.权利要求97的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为细胞因子、趋化因子、共刺激因子、前药活化剂和治疗性抗体中的一种或多种。
99.权利要求98的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为GM-CSF、IL2、IL10、IL12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、TNF、MIP1a、FLt3L、IFN-b、IFN-g、CC15、CCl2、CCl19、CXCl11、OX40L、41BBL、CD40L、B7.1/CD80、GITRL、LIGHT、CD70、BITEs、单链抗体、lacZ、胞嘧啶脱氨酶和人碘化钠转运体的一种或多种，所述单链抗体针对VEGFA、VEGFB、PGF、VEGFR2、PDGFR、Ang-1、Ang-2、ANGPT1、ANGPT2、HGF。
100.权利要求98的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为免疫检查点抑制剂。
101.权利要求100的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述免疫检查点抑制剂为针对PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、BTLA、VISTA、PD-L1或LAG-3的抗体。
102.权利要求1-96中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述溶瘤病毒编码抑制或减少血管生成的治疗性产物。
103.权利要求97的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所编码的治疗性产物选自抗VEGF或抗VEGFR单链抗体、任选直接或间接与人IgG1的Fc部分连接的VEGFR或其胞外结构域、抗血管生成素-2(ANGPT)单链抗体以及它们的组合。
104.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求1-103中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
105.权利要求104的药物组合物，其低温保存。
106.权利要求104或权利要求105的药物组合物，其配制为用于直接施用而不稀释。
107.权利要求104-106中任一项的药物组合物，其配制为单一剂量。
108.权利要求104-107中任一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适于肠胃外施用。
109.权利要求104-108中任一项的药物组合物，其配制为用于瘤内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、粘膜或直肠施用。
110.权利要求104-109中任一项的药物组合物，其配制为用于全身施用。
111.权利要求1-103中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒表达展现于所述载体细胞表面中的免疫调节蛋白。
112.权利要求111的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒为痘苗病毒。
113.权利要求111或权利要求112中的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中免疫调节性病毒蛋白选自VCP(C3L)、B5R、HA(A56R)、B18R/B19R和B8R。
114.权利要求1-110中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述溶瘤病毒选自溶瘤痘苗病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内加谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、慢病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒、马拉巴病毒和辛德毕斯病毒。
115.权利要求1-114中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒编码治疗性产物。
116.权利要求115的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为多肽或核酸。
117.权利要求116的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为多肽。
118.权利要求116的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为核酸，其为双链RNA。
119.权利要求116的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述细胞为T细胞。
120.权利要求116的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为抗癌剂。
121.权利要求115-120中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为抗体或其抗原结合片段。
122.权利要求121的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物为抗CTLA4、抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
123.权利要求115-121中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述治疗性产物是免疫检查点抑制剂或调控免疫通路的产物。
124.权利要求1-123中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其在低温保存组合物中。
125.权利要求124的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述低温保存组合物包含甘油、DMSO或其它低温保存剂中的一种或多种。
126.一种药物组合物，其包含一或多个权利要求1-103和111-125中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
127.权利要求126的药物组合物，其配制为用于肠胃外施用。
128.权利要求126的药物组合物，其配制为用于局部或全身施用。
129.权利要求126-128中任一项的药物组合物，其配制为用于口服、静脉内、肿瘤内、直肠、皮下或粘膜施用。
130.一种用于治疗对象中的癌症的方法，所述癌症包括实体瘤或恶性血液病，所述方法包括施用权利要求1-125中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或施用权利要求126-129中任一项的药物组合物。
131.一种用于治疗对象中的癌症的方法，所述癌症包括实体瘤或恶性血液病，所述方法包括：
a)以10或更低的感染复数(MOI)用溶瘤病毒感染细胞；
b)在细胞能够生长和/或复制的条件下，将所述细胞与所述溶瘤病毒一起孵育或共培养足以使所述病毒表达所述病毒的基因组中编码的治疗性或免疫调节性蛋白的时间，以产生细胞辅助病毒表达系统(CAVES)；并且
c)将所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)施用于所述对象以治疗所述实体瘤或恶性血液病。
132.权利要求131的方法，其中所述MOI是0.001-10、或0.1-10、或0.1、或小于0.3、或小于0.1、或小于0.5。
133.权利要求130-132中任一项的方法，其中将所述载体细胞和病毒孵育或共培养至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35、36、40或更多小时。
134.权利要求130-133中任一项的方法，其中将所述细胞和病毒孵育或共培养至少6小时。
135.权利要求130-134中任一项的方法，其中将所述细胞和病毒孵育或共培养至少或至多1、2、3、4、5、6或7天。
136.权利要求130-135中任一项的方法，其中在孵育或共培养所述细胞和病毒之后，储存所得细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
137.权利要求136的方法，其中储存在-5℃至-200℃的温度下，或在冰箱中，或在液氮或液态CO2中进行。
138.权利要求136或137的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)低温保存。
139.权利要求136-138中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)储存至少24小时。
140.权利要求136-139中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)储存至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年或更长。
141.权利要求131-140中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)在孵育或共培养(步骤b)之后且在施用(步骤c)之前储存。
142.权利要求130-141中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)在约-5℃至-200℃的温度下冷藏或冷冻或储存。
143.权利要求142的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)储存于约-80℃至-200℃的温度或储存于液氮或液态CO2中。
144.权利要求130-143中任一项的方法，其中所述载体细胞不是免疫细胞和/或不是肿瘤细胞。
145.权利要求130-143中任一项的方法，其中所述载体细胞是免疫细胞、或肿瘤细胞、或肿瘤细胞系、或干细胞。
146.权利要求130-145中任一项的方法，其中所述载体细胞是干细胞。
147.权利要求130-146中任一项的方法，其中：
处理或修饰或处理并修饰所述载体细胞以增强用于施用于人类对象的所述细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性；和/或
处理和/或修饰所述载体细胞以增强所述病毒在所述细胞中的扩增。
148.权利要求130-147中任一项的方法，其中所述载体细胞选自经处理或修饰的载体细胞，其选自干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞。
149.权利要求130-147中任一项的方法，其中所述载体细胞是胚胎上皮细胞或成纤维细胞。
150.权利要求130-147中任一项的方法，其中所述载体细胞是免疫细胞。
151.权利要求130-147中任一项的方法，其中所述载体细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞、靶向肿瘤特异性抗原的T细胞受体(TCR)转基因细胞和靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞。
152.权利要求130-147中任一项的方法，其中所述载体细胞是来自血液恶性肿瘤细胞系的经修饰或经处理的细胞，其中所述细胞经修饰或经处理或经修饰并经处理，或修饰或处理或修饰并处理所述细胞，以增强用于施用于人类对象的所述细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性，和/或增强所述细胞中的病毒扩增。
153.权利要求130-152中任一项的方法，其中所述载体细胞是选自人白血病细胞系、T细胞白血病细胞系、髓单核细胞白血病细胞系、淋巴瘤细胞系、非霍奇金氏淋巴瘤细胞系、伯基特淋巴瘤细胞系、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系、急性髓性白血病(AML)细胞系、慢性髓性白血病(CML)细胞系、急性成淋巴细胞白血病(ALL)细胞系、红白血病细胞系、髓单核母细胞白血病细胞系、恶性非霍奇金氏NK淋巴瘤细胞系、骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系、多发性骨髓瘤细胞系和巨噬细胞细胞系的细胞系。
154.权利要求130-152中任一项的方法，其中所述载体细胞是干细胞。
155.权利要求130-154中任一项的方法，其中所述载体细胞是选自以下的干细胞：成体干细胞；胚胎干细胞；胎儿干细胞；神经干细胞；间充质干细胞；全能干细胞；多能干细胞；诱导的多能干细胞；专能干细胞；寡能干细胞；单能干细胞；脂肪基质干细胞；内皮干细胞(例如，内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞、周细胞)；成体外周血干细胞；成肌细胞；小的幼年干细胞；皮肤成纤维干细胞；组织/肿瘤相关的成纤维细胞；上皮干细胞；和胚胎上皮干细胞。
156.权利要求155的方法，其中所述干细胞选自间充质细胞。
157.权利要求156的方法，其中所述间充质细胞分离自/来源于：成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞、肌肉卫星细胞和其它此类细胞。
158.权利要求130-157中任一项的方法，其中所述载体细胞选自内皮祖细胞、神经干细胞、成体骨髓细胞和间充质干细胞。
159.权利要求130-158中任一项的方法，其中所述细胞是间充质干细胞，其分离自或来源于成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞和肌肉卫星细胞。
160.权利要求159的方法，其中所述间充质干细胞分离自脂肪基质细胞。
161.权利要求130-160中任一项的方法，其中所述载体细胞包含脂肪基质细胞。
162.权利要求130-161中任一项的方法，其中所述细胞为分离自脐带血、外周血、肌肉、软骨或羊水或它们的混合物的MSC。
163.权利要求130-162中任一项的方法，其中所述载体细胞来源于脂肪基质细胞的基质血管成分(SVF)。
164.权利要求130-163中任一项的方法，其中所述细胞是通过培养外膜上脂肪基质细胞以产生AD-MSC而来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的干细胞。
165.权利要求164中所述的方法，其中所述间充质细胞来源于脂肪基质细胞。
166.权利要求130-164中任一项的方法，其中所述载体细胞是选自外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)的脂肪基质细胞。
167.权利要求130-166中任一项的方法，其中所述载体细胞是来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的脂肪培养的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)。
168.权利要求130-167中任一项的方法，其中所述细胞对于待治疗的对象是异体的。
169.权利要求130-167中任一项的方法，其中所述细胞对于待治疗的对象是自体的。
170.权利要求130-169中任一项的方法，其中病毒选自痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内卡谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、细小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、逆转录病毒、甲病毒、马拉巴病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒和辛德毕斯病毒。
171.权利要求170的方法，其中所述病毒是麻疹病毒。
172.权利要求170的方法，其中所述病毒是逆转录病毒，其为慢病毒。
173.权利要求170的方法，其中所述病毒是痘病毒，其为痘苗病毒。
174.权利要求170的方法，其中所述病毒是选自Dryvax株、ACAM1000株、ACAM2000株、李斯特株、EM63株、LIVP株、天坛株、哥本哈根株、西储株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、纽约市健康委员会株、大连株、池田株、LC16M8株、塔什干株、惠氏株、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、大连I株和康诺特株的痘病毒。
175.权利要求174的方法，其中所述病毒是ACAM1000或ACAM2000。
176.权利要求130-175中任一项的方法，其中：
所述病毒是痘苗病毒；并且
所述载体细胞是来自脂肪基质细胞的干细胞。
177.权利要求130-176中任一项的方法，其中所述CAVES表达由所述病毒编码的免疫调节蛋白。
178.权利要求130-177中任一项的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
179.权利要求130-177中任一项的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。
180.权利要求130-179中任一项的方法，其中所述对象患有癌症，所述癌症包括选自肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤和肾癌的实体瘤或血液恶性肿瘤。
181.权利要求180的方法，其中所述实体瘤或恶性血液病选自膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
182.权利要求130-181中任一项的方法，其中所述溶瘤病毒编码异源基因产物。
183.权利要求182中所述的方法，其中所述异源基因产物是抗癌治疗剂。
184.权利要求183中所述的方法，其中所述产物是抗体或其抗原结合部分。
185.权利要求130-184中任一项的方法，其中所述对象是人。
186.权利要求130-184中任一项的方法，其中所述对象是非人动物。
187.权利要求130-184中任一项的方法，其中所述对象是农场或动物园动物。
188.权利要求130-184中任一项的方法，其中所述对象是犬或猫。
189.权利要求187中所述的方法，其中所述对象是奶牛、马、山羊、骡、斑马、长颈鹿、大猩猩、倭黑猩猩、驴、猪、美洲驼、黑猩猩或羊驼。
190.权利要求130-185中任一项的方法，其中所述对象是人类儿童。
191.权利要求130-190中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)通过瘤内、静脉内、腹膜内、囊内、心室内、关节内或眼内注射施用。
192.权利要求130-190中任一项的方法，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)通过肌内或皮下施用来施用。
193.权利要求130-192中任一项的方法，包括施用另一抗癌治疗或疗法。
194.权利要求193的方法，其中所述另一种癌症治疗或疗法是免疫疗法。
195.权利要求194的方法，其中所述免疫疗法包括施用检查点抑制剂或抑制检查点或免疫抑制通路的治疗。
196.权利要求130-195中任一项的方法，包括施用活化所述对象内的T细胞应答的治疗，其中所述治疗包括施用针对负性共刺激因子的阻断抗体，或包括针对活化共刺激因子的激动剂抗体。
197.权利要求196的方法，其中所述治疗包括施用针对负性共刺激因子的阻断抗体。
198.权利要求196或权利要求197的方法，其中所述阻断抗体针对选自CTLA-1、CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、PD-L1和LAG-3的负性共刺激因子。
199.权利要求196-198中任一项的方法，其中所述治疗包括施用PD-1通路的抑制剂。
200.权利要求199的方法，其中所述PD-1通路的抑制剂选自针对PD-1的抗体和可溶性PD-1配体。
201.权利要求199的方法，其中所述PD-1通路的抑制剂是选自AMP-244、MEDI-4736、MPDL328 OA和MIH1的抗体。
202.权利要求196-198中任一项的方法，其中所述治疗包括施用抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
203.权利要求196-198中任一项的方法，其中所述治疗包括施用针对选自PD-L1和CTLA-4的负性共刺激因子的阻断抗体。
204.权利要求130-203中任一项的方法，包括施用针对共刺激因子的激动剂抗体的治疗。
205.权利要求204的方法，其中所述共刺激因子选自CD28、OX40、CD40、GITR、CD137、CD27和HVEM。
206.权利要求1-125中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或权利要求126-129中任一项的药物组合物，其用于治疗包括实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症。
207.权利要求1-125中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或权利要求126-129中任一项的药物组合物用于治疗对象中的癌症的用途，所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
208.权利要求206或权利要求207的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)通过以下步骤产生：
a)以10或更低的感染复数(MOI)用溶瘤病毒感染细胞；并且
b)在细胞能够生长和/或复制的条件下，将所述细胞与所述溶瘤病毒一起孵育或共培养足以使所述病毒表达在所述病毒的基因组中编码的治疗性蛋白或免疫调节性蛋白的时间，以产生所述CAVES。
209.权利要求208的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述MOI为0.001-10、0.1-10、0.1-1、0.1-＜1、0.1-0.5或0.1。
210.权利要求206-209中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中通过孵育或共培养至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35、36、40小时或更多小时来产生所述载体细胞和病毒。
211.权利要求206-210中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中将所述细胞和病毒孵育或共培养至少6小时。
212.权利要求206-211中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中将所述细胞和病毒孵育或共培养至少或至多1、2、3、4、5、6或7天。
213.权利要求206-212中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中储存所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)以供使用。
214.权利要求213的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中储存在-5℃至-200℃的温度下、或在冰箱中、或在液氮或液态CO2中进行。
215.权利要求213或权利要求214的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中将所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)低温保存。
216.权利要求213-215中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)储存至少24小时。
217.权利要求213-216中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)储存至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年或更长时间。
218.权利要求213-217中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中在将所述载体细胞与所述溶瘤病毒一起孵育之后储存得到的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
219.权利要求206-218中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中将所述细胞在约-5℃至-200℃的温度下储存或冷藏或冷冻。
220.权利要求219的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞储存在约-80℃至-200℃的温度下或储存在液氮或液态CO2中。
221.权利要求206-220中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞不是免疫细胞和/或不是肿瘤细胞。
222.权利要求206-220中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是免疫细胞或肿瘤细胞或肿瘤细胞系或干细胞。
223.权利要求206-222中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是干细胞。
224.权利要求206-223中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中：
处理或修饰或处理并修饰所述载体细胞以增强用于施用于人类对象的细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性；和/或
处理和/或修饰载体细胞以增强病毒在细胞中的扩增。
225.权利要求206-224中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞选自经处理或经修饰的细胞，其选自干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞。
226.权利要求206-224中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞为胚胎上皮细胞或成纤维细胞。
227.权利要求206-224中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞为免疫细胞。
228.权利要求206-224中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、靶向肿瘤特异性抗原的T细胞受体(TCR)转基因细胞和靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞。
229.权利要求206-224中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是来自血液恶性肿瘤细胞系的经修饰或处理的细胞，所述血液恶性肿瘤细胞系经处理或经修饰或经处理并经修饰，或处理或修饰或处理并修饰所述血液恶性肿瘤细胞系，以增强用于施用于人类对象的所述细胞的免疫抑制特性或免疫豁免特性和/或增强所述细胞中所述病毒的扩增。
230.权利要求206-229中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是选自人白血病细胞系、T细胞白血病细胞系、髓单核细胞白血病细胞系、淋巴瘤细胞系、非霍奇金氏淋巴瘤细胞系、伯基特淋巴瘤细胞系、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系、急性髓性白血病(AML)细胞系、慢性髓性白血病(CML)细胞系、急性成淋巴细胞白血病(ALL)细胞系、红白血病细胞系、髓单核母细胞白血病细胞系、恶性非霍奇金氏NK淋巴瘤细胞系、骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系、多发性骨髓瘤细胞系和巨噬细胞细胞系的细胞系。
231.权利要求206-229中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞为干细胞。
232.权利要求206-231中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是选自以下的干细胞：成体干细胞；胚胎干细胞；胎儿干细胞；神经干细胞；间充质干细胞；全能干细胞；多能干细胞；诱导的多能干细胞；专能干细胞；寡能干细胞；单能干细胞；脂肪基质干细胞；内皮干细胞(例如，内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞、周细胞)；成体外周血干细胞；成肌细胞；小的幼年干细胞；皮肤成纤维干细胞；组织/肿瘤相关的成纤维细胞；上皮干细胞；和胚胎上皮干细胞。
233.权利要求232的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述干细胞选自间充质细胞。
234.权利要求233的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述间充质细胞分离自/来源于：成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞、肌肉卫星细胞和其它此类细胞。
235.权利要求206-234中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞选自内皮祖细胞、神经干细胞、成体骨髓细胞和间充质干细胞。
236.权利要求206-235中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞是间充质干细胞，其分离自或来源于成体骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或羊水间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞和肌肉卫星细胞。
237.权利要求236的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述间充质干细胞分离自脂肪基质细胞。
238.权利要求206-237中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞包含脂肪基质细胞。
239.权利要求206-238中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞为分离自脐带血、外周血、肌肉、软骨或羊水或它们的混合物的MSC。
240.权利要求206-239中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞来源于脂肪基质细胞的基质血管成分(SVF)。
241.权利要求206-240中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞是通过培养外膜上脂肪基质细胞以产生AD-MSC而来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的干细胞。
242.权利要求241的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述间充质细胞来源于脂肪基质细胞。
243.权利要求206-240中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞是选自外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)的脂肪基质细胞。
244.权利要求206-243中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述载体细胞为来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的脂肪培养的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)。
245.权利要求206-244中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞对于所述待治疗的对象是异体的。
246.权利要求206-244中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞对于所述待治疗的对象是自体的。
247.权利要求206-246中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中病毒选自痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内卡谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、细小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、逆转录病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒和辛德毕斯病毒。
248.权利要求247的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述病毒为麻疹病毒。
249.权利要求247的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述病毒是逆转录病毒，其为慢病毒。
250.权利要求247的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述病毒是痘病毒，其为痘苗病毒。
251.权利要求247的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述病毒是选自Dryvax株、ACAM1000株、ACAM2000株、李斯特株、EM63株、LIVP株、天坛株、哥本哈根株、西储株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、纽约市健康委员会株、大连株、池田株、LC16M8株、塔什干株、惠氏株、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、大连I株和康诺特株的痘病毒。
252.权利要求251的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述病毒是ACAM1000或ACAM2000。
253.权利要求252的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述病毒的基因组包含SEQ ID NO：70或71中所示的核苷酸序列。
254.权利要求206-252中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中：
所述病毒是痘苗病毒；并且
所述载体细胞是来自脂肪基质细胞的干细胞。
255.权利要求254的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中将所述载体细胞和病毒孵育至少6小时，其中在所述病毒感染所述细胞并表达所编码的蛋白质的条件下进行所述孵育。
256.权利要求255的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述孵育不超过10、12、14、16或20小时。
257.权利要求206-254中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述CAVES表达由所述病毒编码的免疫调节蛋白。
258.权利要求206-257中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述癌症包括实体瘤。
259.权利要求206-258中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述癌症为血液恶性肿瘤。
260.权利要求206-259中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象患有癌症，所述癌症包括选自肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤和肾癌的实体瘤或血液恶性肿瘤。
261.权利要求259的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述实体瘤或恶性血液病选自膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
262.权利要求206-261中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述溶瘤病毒编码异源基因产物。
263.权利要求262的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述异源基因产物为抗癌治疗剂。
264.权利要求262或权利要求187的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述产物为抗体或其抗原结合部分。
265.权利要求193-264中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象为人。
266.权利要求206-264中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象为非人动物。
267.权利要求206-264中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象为农场或动物园动物。
268.权利要求206-264中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象为犬或猫。
269.权利要求187的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象是奶牛、马、山羊、骡、斑马、长颈鹿、大猩猩、倭黑猩猩、驴、猪、美洲驼、黑猩猩或羊驼。
270.权利要求206-265中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述待治疗的对象是人类儿童。
271.权利要求206-270中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述CAVES通过瘤内、静脉内、腹膜内、囊内、心室内、关节内或眼内注射施用。
272.权利要求206-270中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)用于肌内或皮下施用。
273.权利要求206-272中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其与另一不同的抗癌治疗或疗法组合。
274.权利要求209的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述其它癌症治疗或疗法为免疫疗法。
275.权利要求274的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述免疫疗法包括检查点抑制剂或抑制检查点或免疫抑制通路的治疗。
276.权利要求206-275中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，包括活化所述对象内的T细胞应答的治疗，其中所述治疗包括针对负性共刺激因子的阻断抗体，或包括针对活化共刺激因子的激动剂抗体。
277.权利要求276的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述治疗包括针对负性共刺激因子的阻断抗体。
278.权利要求276或权利要求213的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述阻断抗体针对选自CTLA-1、CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、PD-L1、和LAG-3的负性共刺激因子。
279.权利要求276-278中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述治疗包括PD-1通路的抑制剂。
280.权利要求279的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述PD-1通路的抑制剂选自针对PD-1的抗体和可溶性PD-1配体。
281.权利要求279的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述PD-1通路的抑制剂是选自AMP-244、MEDI-4736、MPDL328 OA和MIH1的抗体。
282.权利要求276-278中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述治疗包括抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
283.权利要求276-278中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述治疗包括针对选自PD-L1和CTLA-4的负性共刺激因子的阻断抗体。
284.权利要求206-283中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，包括针对共刺激因子的激动剂抗体、CAR-T和/或TIL的治疗。
285.权利要求284的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述共刺激因子选自CD28、OX40、GITR、CD40、CD137、CD27和HVEM。
286.一种痘苗病毒，包含具有SEQ ID NO：71中所示的核苷酸序列的基因组。
287.一种经修饰的ACAM2000病毒，包含至少一种插入相应的未经修饰的ACAM2000病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域的治疗基因或标记基因。
288.一种经修饰的ACAM2000病毒，包含相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失或破坏的F1L遗传基因座，由此所述F1L基因不表达。
289.一种经修饰的ACAM2000病毒，包含相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失或破坏的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达。
290.一种经修饰的ACAM2000病毒，包含一个或多个以下修饰：
(a)至少一种治疗基因或标记基因，插入相应的未经修饰的ACAM2000病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域；
(b)相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失的F1L遗传基因座，由此所述F1L基因不表达；和/或
(c)相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达。
291.一种经修饰的ACAM2000病毒，包含在相应的未经修饰的ACAM2000病毒中的一个或多个以下修饰：
至少一种插入开放阅读框174(ORF_174)和开放阅读框175(ORF_175)之间的基因间区域中的治疗基因或标记基因；和/或
在一个或多个以下遗传基因座的至少一个截短的开放阅读框(ORF)：ORF72、ORF73、ORF156、ORF157、ORF158、ORF159、ORF160、ORF174和ORF175。
292.权利要求291的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述修饰包括至少一种插入相应的未经修饰的ACAM2000病毒的开放阅读框174(ORF_174)和开放阅读框175(ORF_175)之间的基因间区域中的治疗基因或标记基因。
293.权利要求292的经修饰的ACAM2000病毒，其中：
所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂；并且
所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
294.权利要求291的修饰的ACAM2000病毒，在一个或多个以下遗传基因座包含至少一个截短的开放阅读框(ORF)：ORF72、ORF73、ORF156、ORF157、ORF158、ORF159、ORF160、ORF174和ORF175，并且进一步包含插入一个或多个以下遗传基因座的截短区的至少一个治疗基因和/或标记基因：ORF72、ORF73、ORF156、ORF157、ORF158、ORF159、ORF160、ORF174和ORF175。
295.权利要求294的经修饰的ACAM2000病毒，其中：
所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂；并且
所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
296.权利要求287-295中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述相应的未经修饰的ACAM2000病毒包含SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71中所示的核酸序列。
297.权利要求287、290或296的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述修饰包含至少一种插入相应的未经修饰的ACAM2000病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间的基因间区域的治疗基因。
298.权利要求297的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂。
299.权利要求287、290、291、296或297中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述修饰包含至少一种插入相应的未经修饰的ACAM2000病毒的开放阅读框157(ORF_157)和开放阅读框158(ORF_158)之间基因间区域的标记基因。
300.权利要求299的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
301.权利要求289、290或296中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中：
所述修饰是相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失的B8R遗传基因座，由此所述B8R基因不表达；和
所述经修饰的病毒包含至少一种插入部分或完全缺失的B8R遗传基因座的区域的治疗基因和/或标记基因。
302.权利要求288、290或296中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中：
所述修饰是相应的未经修饰的ACAM2000病毒的部分或完全缺失的F1L遗传基因座，因此所述F1L基因不表达；和
所述经修饰的病毒包含至少一种插入部分或完全缺失的F1L遗传基因座的区域的治疗基因和/或标记基因。
303.权利要求301或权利要求302的经修饰的ACAM2000病毒，包含至少一种治疗基因。
304.权利要求303的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述治疗基因选自免疫检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂。
305.权利要求301-304中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，包含至少一种标记基因。
306.权利要求305的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述标记基因选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、TurboFP635和磷酸核糖基转移酶(gpt)。
307.权利要求287和290-306中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中至少一种治疗基因是抗癌抗体。
308.权利要求307的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述抗癌抗体为抗VEGF抗体或抗CTLA-4抗体。
309.权利要求307或权利要求308的经修饰的ACAM2000病毒，其中所述抗癌抗体为单链抗体。
310.权利要求307-309中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，进一步包含编码IgK信号肽的核酸以促进抗体的分泌。
311.权利要求307-309中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，进一步包含编码FLAG标签的核酸以促进抗体的检测。
312.权利要求287和290-311中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，其中至少一种可检测标记基因和/或编码治疗性产物的基因为碘化钠同向转运体(NIS)、OX40L或4-IBBL。
313.权利要求1的ACAM2000病毒或权利要求387-312中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，进一步包含至少一种选自胸苷激酶(TK)、血细胞凝集素(HA)、干扰素α/β阻断剂受体或免疫调节剂的灭活基因。
314.权利要求1的ACAM2000病毒或权利要求287-313中任一项的经修饰的ACAM2000病毒，进一步被修饰以增强EEV(胞外包膜病毒)产生。
315.权利要求314的ACAM2000病毒或经修饰的ACAM2000病毒，其中所述用于增强的EEV产生的进一步修饰为编码A34R蛋白质的基因中的突变。
316.权利要求315的ACAM2000病毒或经修饰的ACAM2000病毒，其中所述突变编码包含突变K151E的A34R蛋白。
317.一种用于治疗对象中的实体瘤或恶性血液病的方法，包括向所述对象施用溶瘤病毒和包含脂肪基质细胞的组合物，其中所述脂肪基质细胞选自外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)。
318.用于治疗对象中的实体瘤或恶性血液病的方法，包括向所述对象施用溶瘤病毒和组合物，所述组合物包含来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)的培养的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)。
319.权利要求317或权利要求318的方法，其中在施用于所述对象之前将所述细胞和溶瘤病毒在体外共培养。
320.权利要求319的方法，其中将所述细胞共培养足以表达溶瘤病毒免疫调节蛋白或使所述病毒经历至少一个复制周期的时间。
321.权利要求318的方法，其中所述脂肪-间充质干细胞(AD-MSC)通过所述培养外膜上脂肪基质细胞以产生AD-MSC而来源于外膜上脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)。
322.权利要求319或权利要求320的方法，其中所述细胞和病毒共培养至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35、36、40或更多小时。
323.权利要求317-322中任一项的方法，其中所述溶瘤病毒选自痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、巨细胞病毒(CMV)和慢病毒。
324.权利要求323的方法，其中所述溶瘤病毒是痘苗病毒。
325.权利要求324的方法，其中所述痘苗病毒选自Dryvax株、ACAM1000株、ACAM2000株、李斯特株、EM63株、LIVP株、天坛株、哥本哈根株、西储株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、纽约市健康委员会株、大连株、池田株、LC16M8株、塔什干株、惠氏株、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、大连I株和康诺特株。
326.权利要求317-325中任一项的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
327.权利要求317-326中任一项的方法，其中所述对象患有选自肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤和肾癌的癌症。
328.权利要求326的方法，其中所述实体瘤或恶性血液病选自膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
329.权利要求317-328中任一项的方法，其中所述溶瘤病毒编码异源基因产物。
330.权利要求329的方法，其中所述异源基因产物是抗癌治疗剂。
331.权利要求330的方法，其中所述产物是抗体。
332.权利要求317-331中任一项的方法，其中所述对象是人。
333.权利要求332的方法，其中所述对象是儿童患者。
334.权利要求317-333中任一项的方法，其中所述细胞对于所述对象是自体的。
335.权利要求317-333中任一项的方法，其中所述细胞对于所述对象是异体的。
336.权利要求317-335中任一项的方法，其中所述病毒通过瘤内、静脉内、腹膜内、囊内、心室内、关节内或眼内注射施用。
337.权利要求317-336中任一项的方法，其中所述细胞通过瘤内、静脉内、腹膜内、囊内、心室内、关节内或眼内注射施用。
338.权利要求317-337中任一项的方法，包括施用另一抗癌治疗或疗法。
339.权利要求338的方法，其中所述其它癌症治疗或疗法是免疫疗法。
340.权利要求339的方法，其中所述免疫疗法包括施用检查点抑制剂或抑制检查点或免疫抑制通路的治疗。
341.权利要求317-338中任一项的方法，包括施用活化所述对象内的T细胞应答的治疗，其中所述治疗包括施用针对负性共刺激因子的阻断抗体，或包括针对活化共刺激因子的激动剂抗体。
342.权利要求341的方法，其中所述治疗包括施用针对负性共刺激因子的阻断抗体。
343.权利要求341或342的方法，其中所述阻断抗体针对选自CTLA-1、CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、PD-L1和LAG-3的负性共刺激因子。
344.权利要求341-343中任一项的方法，其中所述治疗包括施用PD-1通路的抑制剂。
345.权利要求344的方法，其中所述PD-1通路的抑制剂选自针对PD-1的抗体和可溶性PD-1配体。
346.权利要求344的方法，其中所述PD-1通路的抑制剂是选自AMP-244、MEDI-4736、MPDL328 OA和MIH1的抗体。
347.权利要求341-343中任一项的方法，其中所述治疗包括施用抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
348.权利要求341-343中任一项的方法，其中所述治疗包括施用针对选自PD-L1和CTLA-4的负性共刺激因子的阻断抗体。
349.权利要求317-348任一项的方法，包括施用针对共刺激因子的激动剂抗体的治疗。
350.权利要求349的方法，其中所述共刺激因子选自CD28、OX40、GITR、CD137、CD27和HVEM。
351.一种组合物或组合，包含：
(a)溶瘤病毒；和
(b)外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)或周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)，其中组合物是所述细胞和病毒的混合物，并且组合是两种单独的组合物，其中一种组合物包含所述病毒，并且另一种组合物包含所述细胞。
352.权利要求351的组合物或组合，其中所述溶瘤病毒选自痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、巨细胞病毒(CMV)和慢病毒。
353.权利要求352的组合物或组合，其中所述溶瘤病毒为痘苗病毒。
354.权利要求353的组合物或组合，其中所述痘苗病毒选自Dryvax株、ACAM1000株、ACAM2000株、李斯特株、EM63株、LIVP株、天坛株、哥本哈根株、西储株、修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)株、纽约市健康委员会株、大连株、池田株、LC16M8株、塔什干株、惠氏株、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、大连I株和康诺特株。
355.权利要求351-354中任一项的组合物或组合，用于治疗实体瘤或血液恶性肿瘤。
356.权利要求355的组合物或组合，其中所述实体瘤或恶性血液病选自膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肥大细胞瘤、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
357.用于治疗对象中的实体瘤或恶性血液病的组合疗法，其中所述疗法包括：
(a)干细胞，其中：
所述干细胞包含溶瘤病毒；和
所述干细胞是选自外膜上脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)和周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)的脂肪基质细胞；和
(b)活化所述对象内T细胞应答的治疗，其中所述治疗包括针对负性共刺激因子的阻断抗体，或包括针对活化性共刺激因子的激动剂抗体。
358.权利要求357的组合，其中在(b)中，所述治疗包括针对负性共刺激因子的阻断抗体。
359.权利要求358的用于所述用途的组合，其中所述阻断抗体针对选自CTLA-1、CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的负性共刺激因子。
360.权利要求357-359中任一项的组合，其中在(b)中，所述治疗包含PD-1通路的抑制剂。
361.权利要求360的用于所述用途的组合，其中所述PD-1通路的抑制剂选自针对PD-1的抗体和可溶性PD-1配体。
362.权利要求360的用于所述用途的组合，其中所述PD-1通路的抑制剂选自AMP-244、MEDI-4736、MPDL328 OA和MIH1的抗体。
363.权利要求357-359中任一项的用于所述用途的组合，其中在(b)中，所述治疗包括抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
364.权利要求357或权利要求358的组合，其中在(b)中，所述治疗包括针对选自PD-L1和CTLA-4的负性共刺激因子的阻断抗体。
365.权利要求357-364中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中在(b)中，所述治疗包含针对共刺激因子的激动剂抗体。
366.权利要求365的组合，其中所述共刺激分子选自CD28、OX40、GITR、CD137、CD27和HVEM。
367.权利要求357-366中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中(a)在(b)之后使用。
368.权利要求357-366中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中(a)在(b)之前使用。
369.权利要求357-368中任一项的用于所述用途的组合疗法，其还包括诱导肿瘤内细胞凋亡的治疗，其中所述治疗选自放射疗法、化学疗法、免疫疗法、光线疗法或它们的组合。
370.权利要求369中的用于所述用途的组合疗法，其中所述诱导凋亡的治疗包括放射疗法。
371.权利要求357-370中任一项的用于所述用途的组合疗法，进一步包括用于肿瘤微环境的修饰的治疗，其中所述治疗包括细胞因子阻断剂。
372.权利要求357-371中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中所述裂解病毒选自痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、汉坦病毒、粘液瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)和慢病毒。
373.权利要求357-371中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中所述溶瘤病毒为痘苗病毒。
374.权利要求357-373中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中所述干细胞与选自以下的药剂组合施用：TLR激动剂；静脉内免疫球蛋白(IVIG)；单核细胞条件培养基；来自嗜中性粒细胞胞外陷阱-暴露的外周血单个核细胞的上清液；从革兰氏阳性细菌分离的肽聚糖；从分枝杆菌分离的脂阿拉伯甘露聚糖；从酵母细胞壁分离的酵母聚糖；聚腺苷酸-聚尿苷酸；聚(IC)；脂多糖；单磷酰脂质A；鞭毛蛋白；Gardiquimod；咪喹莫特；R848；含有CpG基序的寡核苷；和23S核糖体RNA；或
所述干细胞已与单核细胞共培养，所述单核细胞已用IVIG、T细胞、已暴露于T细胞刺激物的T细胞或自然杀伤细胞预处理。
375.权利要求357-374中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中所述用途是用于治疗膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、恶性上皮肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、Wilm氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、骨巨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、可传播的性器瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞性肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤形成、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肥大细胞瘤、肝细胞癌、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(在鱼中)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
376.权利要求357-375中任一项的用于所述用途的组合疗法，其中所述用途是用于治疗成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、胰腺癌或黑色素瘤。
377.权利要求357-376中任一项的用于所述用途的组合，其中所述干细胞是自体的。
378.权利要求357-376中任一项的用于所述用途的组合，其中所述干细胞是异体的。
379.权利要求1-103和111-125中任一项的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中所述载体细胞经处理或修饰以条件永生化。
380.权利要求379的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其中修饰所述载体细胞以表达c-myc、v-myc、E6/E7、hTERT、野生型或经修饰的SV40大肿瘤抗原、loxP和/或tetR中的一种或多种。
381.一种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求379或权利要求380的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
382.权利要求381的药物组合物，其低温保存。
383.权利要求381或权利要求382的药物组合物，其配制为用于直接施用而不稀释。
384.权利要求381-383中任一项的药物组合物，其配制为单一剂量。
385.权利要求381-384中任一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适于胃肠外施用。
386.权利要求379或权利要求380的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)，其用于治疗癌症，所述癌症包括实体瘤或恶性血液病。
387.权利要求379或权利要求380的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或权利要求381-385中任一项的药物组合物用于治疗对象中的癌症的用途，所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
388.权利要求386或权利要求387的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)通过以下步骤产生：
a)以10或更低的感染复数(MOI)用溶瘤病毒感染细胞；并且
b)在细胞能够生长和/或复制的条件下，将所述细胞与所述溶瘤病毒一起孵育或共培养足以使所述病毒表达在所述病毒的基因组中编码的治疗性或免疫调节性蛋白的时间，以产生所述CAVES。
389.权利要求388的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中所述MOI为0.001-10、0.1-10、0.1-1、0.1-＜1、0.1-0.5或0.1。
390.权利要求386-389中任一项的用于所述用途的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)或所述细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的用途，其中将所述细胞和所述病毒孵育或共培养至少6小时。
391.权利要求130-205中任一项的方法，其中：
所述载体细胞经处理或修饰以条件永生化；
在制备所述CAVES之前和/或在将所述CAVES施用于所述对象之前的第一时间活化所述经修饰的载体细胞群体的扩增；并且
在所述第一时间之后且在将所述CAVES施用于所述对象之前的第二时间使所述载体细胞群体的扩增失活。
392.一种产生细胞辅助病毒表达系统(CAVES)的方法，包括：
在病毒表达编码的蛋白质的条件下，以0.001-10的MOI孵育载体细胞和溶瘤病毒6小时或更多小时至多小于48小时，以用病毒感染所述细胞，由此载体细胞通过所述病毒与所述载体细胞的关联表达由所述病毒编码的至少一种免疫调节蛋白或重组治疗蛋白，以产生细胞辅助病毒表达系统(CAVES)；
回收所述细胞辅助病毒表达系统细胞；并且
将它们在低温保存介质中在降低的温度下储存以产生储存的细胞辅助病毒表达系统(CAVES)。
393.权利要求392的方法，其中所述MOI是0.001-10、0.1-10、0.1-1、0.1-＜1、0.1-0.5或0.1。
394.权利要求392或权利要求393的方法，其中孵育时间为至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35、36、40或更多小时。
395.权利要求394的方法，其中所述孵育时间为至少6小时。
396.权利要求392-395中任一项的方法，其中所述载体细胞经处理或修饰以条件永生化。
397.权利要求396的方法，其中修饰所述载体细胞以表达c-myc、v-myc、E6/E7、hTERT、野生型或经修饰的SV40大肿瘤抗原、loxP和/或tetR中的一种或多种。
398.权利要求392-397中任一项的方法，其中处理或修饰所述病毒以使其编码或包含免疫检查点抑制剂、共刺激因子、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗体和血管生成抑制剂中的一种或多种。
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