KR20230032154A - 세포 밖 소포체 함유 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
세포 밖 소포체 함유 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중간엽 줄기세포에서 유래된 세포 밖 소포체를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 세포 밖 소포체는 수용액 이상계 분리법을 이용하여 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀으로서, 건성안 증상 개선, 각막 손상 회복 및 안구 표면 염증을 억제하는 효과가 우수하므로, 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 예방 및 치료 용도로서 바람직하게 적용이 가능하다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포에서 수용액 이상계 분리법을 이용하여 분리된 세포 밖 소포체 함유 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
안표면 염증 질환은 다양한 원인으로 눈물막의 불안정으로 정의되는 질환으로 안구표면의 염증을 동반한다. 이의 원인은 노화, 각결막염증, 약물 사용, 안과적 수술력, 콘택트 렌즈 착용력 및 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군(입, 눈 등 몸 전체 점막에 염증이나 건조가 발생하는 질환), 루프스, 공피증, 당뇨병, 비타민 A 결핍증 등의 질병의 동반 질환, 갑상선 질환, 여성호르몬 감소 등의 전신요인이 있다.
일반적으로 알려진 안표면 염증 질환의 증상은 눈의 자극감, 모래가 굴러가는 것 같은 이물감, 눈이 타는 듯한 작열감, 침침하다고 느끼는 눈의 불편감, 가려움, 눈부심, 갑작스러운 과다한 눈물 등 다양한 증상으로 발현되어 생활에 불편감을 준다. 특히, 안표면 염증 질환이 심해지면 안구표면(각막 및 결막)의 염증과 눈물층의 불안정성으로 안구 표면에 손상을 주어, 통증, 불규칙한 각막 표면, 흐리고 변동폭이 커진 시력 및 각막 궤양 등으로 영구적 시력저하가 발생할 수도 있다.
기존에 사용되는 치료 방식은 인공눈물 점안, 눈물점 폐쇄술, 스테로이드와 사이클로스포린 등의 비특이적 항염증제를 사용한다, 스테로이드 안약 점안은 장기적으로 사용 시 녹내장, 백내장 등의 합병증이 발생하며 사이클로스포린 안약은 치료효과가 스테로이드보다 적고 치료효과가 발생할 때까지 수개월이 시간이 필요하다, 안표면 염증 질환 환자는 유병율이 약 30%가 넘고 지속적으로 증가하고 있으나, 아직까지 스테로이드를 능가할 효과적이고 안전한 치료제는 없는 상황이다.
US2019-0015452 A1에서는 세포 유도된 미세입자 중간엽계 줄기세포로부터 원심분리를 통해 세포 밖 소포체를 분리하고, 이 분리된 세포 밖 소포체가 안표면 염증 질환에 효과가 있다고 개시하고 있으며, WO2017/160884 A1에서는 알칼리제에 의해 유기적으로 손상된 안구 질환이 줄기세포로부터 유래하는 세포 밖 소포체를 초원심분리하고, 이 분리된 세포 밖 소포체의 사용을 통해 개선될 수 있다고 개시하고 있다. 이들 특허에서는 세포 밖 소포체의 안표면 염증 질환 치료에 대한 가능성만을 언급하고 있을 뿐, 구체적으로 입증하고 있지 못하다.
한편, CN109431985A 특허는 중간엽 줄기세포로부터 유래한 세포 밖 소포체 2.5%와 0.2% 비타민 E, 0.2% 카보머 및 2% NaCl 분말을 혼합한 점안액을 제조하고, 이 점안액이 안구건조 치료의 안약에 사용될 수 있음을 언급하고 있다.
이 특허의 내용을 보면, 줄기세포로부터 세포 밖 소포체의 분리는 300g, 10min 1차 원심 분리, 상층을 취한 후 2000g, 10min 원심분리, 다시 상층을 취한 후 10000g, 30min 원심 분리, 마지막으로 상층을 취한 후 100000g, 70min 초원심 분리를 수행하고 있다. 이러한 (초)원심분리 방식은 가장 대표적인 분리 방법이나 높은 순도 및 효율로 세포 밖 소포체를 분리하기 힘들며, 실제 세포가 받는 중력가속도가 10만g까지 이르게 되어 세포에 손상을 줄 가능성이 커 실질적으로 안구 건조의 치료 효과에 신뢰도가 낮다.
본 발명의 발명자들은 중간엽 줄기세포 배양액 유래 세포 밖 소포체를 이용한 안표면 염증 질환과 관련된 치료제를 개발하고자 연구한 결과, 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리된 세포 밖 소포체를 수득하는 방법에 있어서, 분리 방법으로 수용액 이상계 조성물을 이용함으로써 세포 밖 소포체의 손상을 최소화하고 고순도로 분리할 수 있어, 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 치료 및 회복에 효과적으로 적용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 목적은 상기 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 세포 밖 소포체는 줄기세포를 배양하여 세포 밖 소포체를 생성하는 단계; 상기 세포 밖 소포체를 배양하는 단계; 및 수용액 이상계 분리법을 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 방법으로 생산된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포 밖 소포체는 엑소좀이고, 이때 상기 엑소좀은 CD9, CD63, CD81 막 단백질 표지자를 갖는 것일 수 있고, 상기 막 단백질 표지자 중 CD63/CD9의 비는 2.5 이상을 만족하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포 밖 소포체는 배양액 1 L 당 분리되는 엑소좀의 개수가 1x109 내지 1X1012이고, 단백질 양이 0.1 mg 내지 20 mg일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 자가 및 동종 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 유래한 세포주일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 또는 동물 조직은 골수, 지방조직, 제대조직, 제대혈, 골격근, 말초핼액 및 양수 중 어느 하나 이상에서 선택된 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 안표면 염증 질환은 건성안일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 안표면 염증 질환은 안표면 염증 질환은 무루증, 쇼그렌 증후군 등의 자가면역질환, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술, 알레르기성 결막염, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소, 공기 조절장치로 인한 건조한 방, 장기적인 약물사용에 의한 독성, 장기적인 콘택트 렌즈 사용, 눈물분비를 감소시키는 전신약제 및 전신질환, 안구화상 및 만성안구이식편대숙주반응으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 야기 또는 수반되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물 전체 중량 대비 세포 밖 소포체를 0.0001 내지 95 중량%로 함유하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 안구내, 유리체내 또는 피내 경로로 투여되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 액제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 줄기세포에서 유래된 엑소좀 및 소포를 포함하며, 이는 세포 노폐물을 포함하지 않으며 종래 줄기세포를 이용한 치료제에서 발생하는 다른 장기로의 유입과 증식, 체내 분포의 문제, 종양원성 및 면역독성의 문제가 발생하지 않는 이점이 있고, 건성안 증상 개선, 각막 손상 회복 및 안구 표면 염증을 억제하는 효과가 우수하므로, 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 예방 및 치료 용도로서 바람직하게 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 수용액 이상계(ATPS) 분리법으로 분리된 엑소좀의 입자 크기 분포도를 보여주는 그래프이다.
도 2는 배양액에서 본 발명의 수용액 이상계(ATPS) 방식 또는 기존의 초원심분리(Gradient) 방식으로 세포 밖 소포체를 분리한 뒤 추출한 엑소좀의 개수와 순도를 측정한 결과이다.
도 3은 전반사 현미경을 이용하여 본 발명의 ATPS 방식으로 분리된 세포 밖 소포체(엑소좀)가 발현하는 마커의 비율을 측정한 결과이다.
도 4는 대조군(control)을 마우스의 결막하에 주사한 day 0, day 7일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 5는 엑소좀(exosome)을 마우스의 결막하에 주사한 day 0, day 7일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 6은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
도 7은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물분비량을 phenol red thread를 통하여 비교한 그래프이다.
도 8은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 염색 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 11는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군의 day 0, day 14일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 12는 엑소좀을 마우스의 점안 투여로 14일 동안 처리한 후 day 0, day 14일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 13은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
도 14는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물분비량을 phenol red thread를 통하여 비교한 그래프이다.
도 15는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 염색 결과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP-9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP-9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 2는 배양액에서 본 발명의 수용액 이상계(ATPS) 방식 또는 기존의 초원심분리(Gradient) 방식으로 세포 밖 소포체를 분리한 뒤 추출한 엑소좀의 개수와 순도를 측정한 결과이다.
도 3은 전반사 현미경을 이용하여 본 발명의 ATPS 방식으로 분리된 세포 밖 소포체(엑소좀)가 발현하는 마커의 비율을 측정한 결과이다.
도 4는 대조군(control)을 마우스의 결막하에 주사한 day 0, day 7일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 5는 엑소좀(exosome)을 마우스의 결막하에 주사한 day 0, day 7일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 6은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
도 7은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물분비량을 phenol red thread를 통하여 비교한 그래프이다.
도 8은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 염색 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 마우스의 결막하에 주사한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 11는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군의 day 0, day 14일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 12는 엑소좀을 마우스의 점안 투여로 14일 동안 처리한 후 day 0, day 14일째 lissamine green 염색을 통하여 각막손상 정도를 나타낸 이미지이다.
도 13은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
도 14는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물분비량을 phenol red thread를 통하여 비교한 그래프이다.
도 15는 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 염색 결과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 각막 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP-9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 마우스의 점안 투여로 처리한 대조군 및 엑소좀(exosome) 투여군의 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP-9의 발현을 fold 값으로 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 '배양액'이란, 줄기세포를 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 또는 상기 배양액의 건조, 여과 및/또는 농축물을 의미한다. 상기 배양물은 줄기세포를 포함 또는 불포함 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '세포 밖 소포체(extracellular vesicles, EVs)'란 세포가 세포 외로 분비하거나, 세포 내에 존재하는 지질-이중층으로 구성된 막 구조를 갖는 소낭(membrane vesicle)으로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 상기 세포밖 소포체는 기원과 분비 기작, 크기 등을 기준으로 엑소좀(exosomes), 마이크로베시클(microvesicles), 엑토좀(ectosomes), 마이크로파티클(microparticles), 막 소포체(membrane vesicles), 나노베시클(nanovesicles), 외막 소포체(outer membrane vesicles) 등의 용어와 혼용되어 사용되고, 이들을 포괄하는 개념이다. 본 명세서에서 특별히 언급하지 않는 한 세포 밖 소포체는 엑소좀일 수 있다. 상기 세포 밖 소포체는 직경이 50 nm 내지 1000 nm이며, 다중소포체(multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 상기 세포 밖 소포체는 응고, 세포-세포간 커뮤니케이션 및 세포성 면역을 중재하는 기능적 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA를 수송하는 역할을 하는 것이 잘 알려져 있다. 상기 세포 밖 소포체의 마커 단백질로는 CD9, CD63, CD81 등이 알려져 있고, 그 외에는 EGFR과 같은 세포 표면의 수용체, 신호전달에 관련 분자, 세포 부착 관련 단백질, 중간엽 줄기세포 (MSC) 연관 항원, 열 충격 단백질(heat shock protein), 소포 형성과 관련된 Alix 등의 단백질이 알려져 있다.
본 발명에서 '엑소좀'은 줄기세포 내에 존재하거나, 이의 배양물로 분비된 생체 나노 입자를 의미한다.
본 명세서에서 용어, '유효성분으로 포함하는'이란 줄기세포 또는 이의 배양액 또는 이로부터 분리한 세포 밖 소포체의 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 개선, 예방 또는 치료 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 '안표면 염증 질환'이란, 눈, 특히, 안구 표면에서 발생되는 비정상적인 상태 또는 증상을 의미한다.
본 명세서에서 '각막 손상'은 이에 제한하는 것은 아니나 예를 들어, 병원균, 염증, 물리적 자극(예컨대, 콘택트렌즈, 자외선), 화학적 자극(예컨대, 약품), 신경 손상 또는 피로 누적 등에 의해 각막에 손상이 가해진 것을 의미하는 것으로서, 통증, 충혈, 각막 혼탁, 눈부심, 이물감 등의 증상을 동반할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '예방'은 본 발명의 조성물의 투여로 안표면 염증 질환 또는 각막 손상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '치료'는 (a) 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 발전의 억제; (b) 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 경감; 및 (c) 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 제거를 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명의 세포 밖 소포체는 배지 내에서 중간엽 줄기세포의 배양을 통해 생산될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포 밖 소포체는 중간엽 줄기세포를 배양하여 세포 밖 소포체를 생성하는 단계; 상기 세포 밖 소포체를 배양하는 단계; 및 수용액 이상계 분리법을 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 방법으로 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배지이다. 상기의 "중간엽 줄기세포"는 인간을 포함한 포유동물 유래의 줄기세포에서 분리한 세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 세포형태(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화가 가능한 세포이다. 상기의 "배양"은 중간엽 줄기세포의 성장 및 증식을 포함하는 의미이다.
본 발명의 "기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 중간엽 줄기세포 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈청은 동물 또는 사람의 혈액으로부터 원심분리하여 얻을 수 있는 상층액이다. 상기 혈청은 세포의 성장시 필요한 필수 영양소 이외에 성장에 필수적이나 명확히 규명되지 않은 각종 무기염, 폴리펩타이드성 성장인자, 및 폴리펩타이드성 호르몬 등의 각종 인자를 포함하는 미량원소가 포함되어 있다.
본 발명의 "혈청"은 우태아 혈청이나, 상업용 인간혈청, 상업용 인간태아 혈청 및 자가혈청의 이용이 가능하다.
본 발명의 세포 배양시 배지에 사용하는 혈청의 농도는 전체 배지 조성물의 30% 이내, 바람직하게는 25% 이내, 보다 바람직하게는 20% 이내이다.
본 발명의 배양 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 예를 들면, F-12, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302, 등이 있으며, 바람직하게는 F-12 영양혼합물(F-12 Nutrient Mixture), M199, MCDB 배양액 등을 사용할 수 있다. 상기 영양혼합물은 기본배지에 1:1 내지 10:1로 희석하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1:1 내지 5:1로 희석하여 사용할 수 있다. 그 외 Transferrin, Selenium, Glutamine 등도 혼합 사용될 수 있다.
구체적 양태로서, 본 발명의 세포 배양 배지는 중간엽 줄기세포의 성장에 영향을 주는 중간엽 줄기세포 성장인자를 추가로 또는 혈청대신 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포의 성장인자는 예를 들면, 인슐린(Insulin), 하이드로코르티존(Hydrocortisone), EGF(Epidermal Growth Factor), LIF(Leukemia Inhibitory Factor), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor), EPO(Erythropoietin), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like growth factor), PDGF(Platelet-derived growth factor), SCF(Stem cell factor), TGF (Transforming growth factor) 등이 있다. 세포의 일반 배양배지와 마지막 단계의 세포 밖 소포체 분리를 위한 분리 배양배지는 구분된다. 상기 세포 밖 소포체 분리 배양배지는 세포 밖 소포체가 제거된 혈청을 포함하거나 바람직하게는 혈청을 포함하지 않는다. 단 영양혼합물과 성장인자를 포함할 수 있다.
구체적 양태로서, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양물로부터 세포 밖 소포체의 생산은 하기 단계를 포함하는 방법으로 이루어질 수 있다.
먼저, 세포 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양한다. 하나의 예로서, 중간엽 줄기세포를 1 내지 10,000 세포수/cm2로, 바람직하게는 50 내지 6000 세포수/cm2 농도로 본 발명의 일반 배양배지가 포함된 세포배양용 디쉬/플라스크 등에서 배양한다. 일반적으로 30℃내지 38℃의 온도, 2% 내지 7% CO2 환경 하에서 수행된다. 일반적으로 계대 번호 8을, 바람직하게는 계대 번호 6을 넘지않으나, 줄기세포, 줄기세포주의 계대 및 계대 유지 날짜는 각각의 세포에 적합하다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 세포배양은 어떤 계대에서도 계대 간격이 150 시간을 넘지 않도록 한다.
다음으로, 일반 배양액에서 세포 밖 소포체 분리 배양 배지로 교체한다. 교체 시기는 제한이 없으나, 바람직하게는 계대 번호 6을 넘기지 않으며, 배양액 교체후 1 내지 4일 이내에 세포 밖 소포체 분리 배양액을 수거한다.
세포 밖 소포체 분리 배양액으로는 소포가 제거된 태아혈청이 사용되거나, 단계별로 태아혈청을 제거한 무혈청 배지를 사용한다. 영향혼합물, 성장인자가 포함될 수 있다.
무혈청 배지로서는 첨가제로서의 동물 혈청을 포함하지 않는 배지이며, 특별히 제한되지 않는다. 공지의 기본 배지에 동물 혈청을 제외하는 기타 첨가제를 함유한 조성을 허용, 이용할 수 있다. 기본 배지의 조성은 배양해야 할 세포의 종류에 따라 적의 선택할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 마지막 계대때, 세포 밖 소포체 분리 배양액으로 교체하였으며, 골수 중간엽 줄기세포 배양, 계대 번호 6 이상이 사용되지 않았으나, 특정 줄기세포 혹은 줄기세포주 등 다른 조합으로 배양이 가능하며, 따라서 본 발명에서는 특정 계대 번호에 그 제한을 두지 않는다. 또한 마지막 배양은 100 시간을 넘지 않는다. 수거된 세포 밖 소포체 분리를 위한 배양액은 원심분리 후 상층액이 세포 밖 소포체의 분리를 위해 냉동 보관된다. 원심분리는 죽은 세포 및 세포 부스러기 등을 제거하기 위한 단계로 본 발명에서는 500×g, 10분 후 2,000×g, 10분을 혹은 10,000×g, 10분을 사용하였으나, 원심분리와 시간의 조합은 적합하게 응용 사용 가능하다.
분리 공정은 수용액 이상계 분리법, 초원심 분리법, 항체친화 분리법, 고분자 침전법, 여과법, 또는 접선흐름여과법 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 KR 10-2020-0058631 A에서 언급된 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 방법을 사용하는 것일 수 있다. 수용액 이상계 분리방법은 서로 다른 입자가 서로 다른 두 상에 의해 다르게 분리되는 현상을 이용한 분리 방법으로, 불순물과 세포 밖 소포체 밖의 고분자들의 제거에 용이하다.
구체적으로, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물은 분산상을 이루는 제1수용액상; 및 상기 분산상과 상분리되며, 연속상을 이루는 제2수용액상을 포함하되, 상기 제1수용액상과 제2수용액상이 상분리되는 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하는 조성물을 이용하는 것이다.
[수학식 1]
2×10-7 J/m2 ≤ γ ≤ 50×10-5 J/m2
세포 밖 소포체를 함유하는 제1수용액상은 벌크(bulk) 형태를 가지며, 중력(gravitational force) 또는 부력(buoyancy)에 의해 제2수용액상 내에서 유동하는 상태로 존재한다. 상기 제1수용액상과 제2수용액상이 접촉하는 경계면에 세포 밖 소포체가 트랩(trap)되고, 입자 크기가 작은 단백질만 경계면을 탈출해서 제2수용액상으로 이동하여, 제1수용액상에 존재하는 세포밖 소포체를 고순도로 회수할 수 있다. 이러한 분리 방식은 계면장력의 조절에 의해 임계 입경을 제어할 수 있음에 따라 분리능이 불순물과 세포 밖 소포체와의 크기 차이가 10 nm 정도까지 분리가 가능하다. 일례로, 제1수용액상은 덱스트란을, 제2수용액상은 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 제조된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 수용액 이상계 분리법을 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 단계는, 세포 밖 소포체 분리를 위한 배양액의 상층액 100 부피부 대비 덱스트란을 포함하는 제1수용액상 1 내지 5 부피부 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 제2수용액상 3 내지 10 부피부를 혼합하여 용해시킨 다음, 원심분리하여 상분리된 제1수용액상으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계; 및 세포 밖 소포체를 회수하고 남은 제1수용액상에 상기 세포 밖 소포체 분리를 위한 배양액의 상층액 100 부피부 대비 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 제2수용액상 40 내지 60 부피부를 추가로 혼합하여 용해시킨 다음, 원심분리하여 상분리된 제1수용액상으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함하는 과정으로 제조될 수 있으며, 상기 과정을 두번 이상 반복하여 수행할 수 있다.
수용액 이상계를 이용한 분리 공정은 세포 밖 소포체를 충분히 회수할 수 있도록 수행하며, 2시간 이내, 바람직하기로 5분 내지 1시간, 더욱 바람직하기로 5분 내지 30분, 가장 바람직하기로 15분 이내 수행한다. 이러한 시간은 종래 최소 2시간 이상이 소요되는 초원심분리 공정과 비교하여 시간을 대폭 감축시키는 이점이 있다.
기존에 초원심분리를 이용한 방법의 경우, 세포 밖 소포체의 크기가 수백 nm로 작고 단백질과 밀도 차이가 크지 않아서 혈장에서 높은 순도 및 효율로 세포 밖 소포체의 분리 효율이 낮은 단점이 있고, 초원심분리기를 사용시 실제 세포가 받는 중력가속도가 10만×g까지 이르게 되어 소포체에 손상을 줄 가능성이 크다는 문제가 있다. 이는 상기 수용액 이상계를 이용한 분리 공정은 이러한 기존의 분리 방법의 문제를 해결할 수 있다.
분리된 세포 밖 소포체는 나노 입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis)장치 및 TIRF (total internal fluorescence)분석을 통해 엑소좀 크기, 개수, 막 단백질 표지자 분포 등이 분석될 수 있다.
이때 세포 밖 소포체의 품질은 배양액 1 L 당 분리되는 세포 밖 소포체의 개수, 세포 밖 소포체의 단백질 양, 단위 단백질당 세포 밖 소포체 개수로 확인될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 골수 줄기세포 최종 세포 밖 소포체인 엑소좀은 배양액 1 L 당 분리되는 엑소좀의 개수가 1×109 내지 1×1012이고, 단백질 양이 0.1 mg 내지 20 mg 일 수 있다. 줄기세포 종류와 배양 계대 번호 및 배양액의 종류에 따라 분리되는 세포 밖 소포체의 개수 및 단백질양이 변동될 수 있으며, 최종 분리된 세포 밖 소포체는, 동일 및 유사한 최종 크기분포, 순도, 동일 및 유사 생리활성을 지닌다면, 본 발명은 특정 분리 방법을 한정하지 않는다.
바람직하게는, 상기 세포 밖 소포체는 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm을 가지며, 막 단백질 표지자(즉, 세포 밖 소포체 특이 마커, 보다 구체적으로 엑소좀 특이 마커)를 갖는 것일 수 있다.
이때 상기 조성물에 존재하는 세포 밖 소포체는 입경 분포가 10 nm 이상 300 nm 이하인 세포 밖 소포체가 전체 대비 90 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 이상이다. 만약, 상기 입경이 10 nm 미만이거나, 300 nm 이상인 세포 밖 소포체가 10 중량% 이상인 경우, 고분자 단백질 혹은 apoptotic bodies (사멸체)와의 혼합 문제가 있어서 바람직하지 않다.
본 실시예에서 사용한 적합/적절한 세포 배양 방법과 수용액 이상계에 의한 분리는 고분자 단백질의 불순물을 최소화하며, 사멸체의 분순물 또한 최소화한다. 또한 사멸체 분순물을 최소화 및 제거하기 위해 본 발명의 실시예에서는 원하는 크기로 필터링 (250 μm 또는 450 μm)을 실시하며, 원하는 크기 범위의 나노 입자를 만든다.
일 구현예에서, 상기 세포 밖 소포체는 엑소좀이고, 이때 상기 엑소좀은 CD9, CD63, CD81 막 단백질 표지자를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "막 단백질 표지자"란, 세포 밖 소포체의 막에 풍부하게 존재하는 단백질을 의미한다. 상기 세포 밖 소포체, 그 중에서도 엑소좀의 막 단백질 표지자로는 CD9, CD63, CD81 등이 될 수 있으며, 상기 분리된 엑소좀은 CD9 또는 CD63 발현 엑소좀의 개수 대비 CD9 막 단백질 표지자를 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 가장 바람직하게는 15% 이하 발현한다. 또한 전제 상기 분리된 엑소좀은 CD9 또는 CD63 발현 엑소좀의 개수 대비 CD63 막 단백질 표지자를 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상 발현한다.
일 구현예에서, 상기 막 단백질 표지자 중 CD63/CD9의 비는 2.5 이상을 만족하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, CD9, CD63 및 CD81의 총 합 대비 CD9는 2~25%, CD63은 13~70%, CD81은 10~60%의 범위를 갖는다. 특히, CD63 및 CD9의 비율에 따라 효능 면에서 차이가 있으며, CD63/CD9의 비가 2.5 이상인 경우, 바람직하게는 3.5 이상인 경우, 더욱 바람직하게는 5.0 이상인 경우 안표면 염증 질환의 효과를 더욱 높일 수 있다. CD63/CD9의 비가 5.0 내지 6.0인 것이 가장 바람직한 것일 수 있다.
이와 더불어, 상기 조성물에 존재하는 세포 밖 소포체는 개수가 특정 개수 범위를 갖는 경우 안표면 염증 질환의 효과를 더욱 높일 수 있다. 단백질의 정량은 Bradford (브래드포드) 또는 Bicinchoninic acid (BCA) 등의 방법으로 정량 분석한다. 본 발명의 실시예 2에 참조하면, 상기 세포 밖 소포체는 Bradford 정량 기준 단백질 1 μg 당 5×107개 이상 5×108개 이하 순도의 세포 밖 소포체가 안구건조 질환의 동물실험에서 효능이 확인되었다.
일 구현예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 자가 및 동종 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 유래한 세포주일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 또는 동물 조직은 골수, 지방조직, 제대조직, 제대혈, 골격근, 말초핼액 및 양수 중 어느 하나 이상에서 선택된 조직으로부터 분리될 수 있다.
본 명세서에서 용어 '중간엽 줄기세포'란, 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부, 신경 등의 세포로 분화할 수 있는 다능성(multipotent)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 상기 중간엽 줄기세포는 유도만능 줄기세포로부터 분화되거나, 골수, 지방조직, 제대조직, 제대혈, 골격근, 말초혈액, 윤활막, 양수 등에서 분리될 수 있다.
일 구현예에서, 바람직하게는, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
'유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)'란, 체세포와 같은 이미 분화된 세포에 역분화(dedifferentiation)를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가, 전분화능(pluripotency)을 가지게 된 세포를 의미한다. 상기 역분화는 특정 유전자(예를 들어, Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등)를 도입하여 발현시키거나 상기 특정 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 주입하여 유도될 수 있다.
상기 전분화능은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm) 및 외배엽(ectoderm) 기원의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있는 능력을 의미한다.
본 발명의 유도만능 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능 줄기세포이다.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 안표면 염증 질환은 안구에서 발생하는 질환으로서, 바람직하게는 건성안인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 '건성안(안구 건조증 또는 눈마름 증후군)'이란, 안표면 염증 질환 중의 하나로서, 눈물막의 불안정, 눈물의 고삼투압, 안구 표면의 손상과 염증, 감각신경의 이상 등으로 눈물 층의 항상성이 상실되어 안구 표면의 건조, 손상 또는 염증 등의 증상을 동반하는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 안표면 염증 질환은 무루증, 쇼그렌 증후군 등의 자가면역질환, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술, 알레르기성 결막염, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소, 공기 조절장치로 인한 건조한 방, 장기적인 약물사용에 의한 독성, 장기적인 콘택트 렌즈 사용, 눈물분비를 감소시키는 전신약제 및 전신질환, 안구화상 및 만성안구이식편대숙주반응으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 야기 또는 수반되는 안표면 염증 질환 유사 상태인 것일 수 있다. 상기 안표면 염증 질환 유사 상태는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소 증상을 포함하는 것일 수 있고, 건성안 증상을 의미하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 쇼그렌 증후군에 의해 야기 또는 수반되는 건성안인 것일 수 있다.
본 발명에서 제시하는 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 분리된 세포 밖 소포체는 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 예방 또는 치료에 사용되며, 이때 안표면 염증 질환과 관련된 손상 및 질환 또는 각막 손상을 억제시키거나, 경감 및 회복에 사용될 수 있다.
구체적으로, 세포 밖 소포체는 안표면 염증 질환 또는 각막 손상의 호전 및 면역반응 조절로 질병 제어 효과를 발휘하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 안표면 염증 질환이 유발된 건성안 동물 모델에서 세포 밖 소포체 투여 후 각막 상피 결손 및 눈물양이 호전되는 효과가 나타났으며, 건성안 동물 모델의 눈물샘 조직에서 세포 밖 소포체 투여가 염증 병소(inflammatory foci)를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 눈물샘과 각막 조직에서 염증성 사이토카인 (IL-6, IL-1β, TNFα, IFN-γ, IL-17A, MMP9)의 발현을 확인한 결과, 세포 밖 소포체가 염증성 유전자 발현을 억제하는 것을 관찰하였다(실시예 4 및 5 참조).
본 발명의 세포 밖 소포체는 나노 약제 전달체로서 기능을 가지며, 특히, 안구 유리체내 유지 (retention) 및 망막 내 분포 (distribution), 약제 나노 전달체로서의 기능을 지니며 장기간 그 약의 효능 또한 유지될 것으로 기대, 탑재약제의 단회 투여 농도 및 투여 횟수를 줄일 수 있어, 투여시 발생할 수 있는 합병증을 줄일 수 있으며, 환자의 병원 방문 및 의료비 절감의 효과도 기대된다.
본 명세서에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포 또는 기관으로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "개체(subject)"는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명에 따른 세포 밖 소포체를 함유하는 조성물은 상기 조성물 전체 중량(총 100 중량%) 내에서, 0.0001 내지 95 중량%로 세포 밖 소포체를 함유시켜 약학적 제제로 제형화하여 이를 투여하거나 다른 약제와 동시에 투여할 수 있고, 다른 약제를 투여하는 전후의 적절한 시기에 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 전신 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 투여, 경피 투여, 안구 투여 또는 안구 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 안구 국소 투여는 예를 들어, 직접적으로 안구에 점안, 안구내 투약되거나, 안구주위, 안구뒤, 망막하(subretinal), 망막중심(central retinal), 중심와(fovea) 외부, 결막하 (subconjunctival), 유리체내(intravitreous), 전방내(intracameral), 또는 맥락막위(suprachoroidal) 등에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은 안구 삽입 장치를 통하여 투약될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 안구내, 유리체내 또는 피내 경로로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 상법에 의해 적당의 제제, 제형으로 만들 수 있다. 제제의 제형으로서는 산제, 과립제 등의 고형 제제일 수 있지만 우수한 예방 치료 효과를 얻는 관점에서는 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 액제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것이 바람직하다. 특히 안구 주사제 및 점안제로 할 경우에는 용액제인 것이 바람직하다. 상기 액제 제조 방법으로서는 예를 들면 미리 조제한 줄기세포 유래의 미립자나 줄기세포의 배양 액(예, 배양 상청)을 용제와 혼합하는 방법이나 추가로 현탁화제나 유화제를 혼합하는 방법을 적합하게 예시할 수 있다.
이상과 같이 본 발명의 의약 조성물의 제제에 있어서는 제제상의 필요에 따라 적당의 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 부형제, 결합제, 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 등장화제, 완충제, 안정화제, 무통화제, 방부제, 항산화제, 착색제, 활택제, 붕괴제, 습윤제, 흡착제, 감미제, 희석제 등의 임의 성분을 배합할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물이 세포를 포함할 경우에는 세포 제제에 허용될 수 있는 성분을 배합할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 제제 투여량으로서는 질환의 종류나 그 증상의 정도, 제형, 투여 대상의 체중 등에 의해 바뀔 수 있지만, 중간엽계 줄기세포 유래 미립자의 양으로서 예를 들면 1일당, 1 pg/kg 내지 100 mg/kg의 범위를 적합하게 예시할 수 있고 중에서도 100 pg/kg 내지 10 mg/kg의 범위를 더욱 적합하게 예시할 수 있다.
또한 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 투여는 점안제의 경우 1일 중1~복수회로 나누어 수행할 수 있다. 점안액 또한, 단회 투여, 복수 투여가 가능하며, 복수 투여의 경우, 예를 들면 7일에 1회 이상의 빈도로 2회 이상 계속 투여할 수 있고, 중에서도 3일에 1회 이상의 빈도로 2회 이상 투여하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 2일에 1회 이상의 빈도로 3회 이상 투여하는 것이 바람직하고 1일에 1회 이상의 빈도로 2회 이상 계속 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 제제가 안구 내 투여 및, 점안제일 경우 안구 내 투여제 및 점안제에 범용되어 있는 기술을 이용해 필요에 따라 제약학적으로 허용될 수 있는 첨가제를 이용하여 조제할 수 있다.
예를 들면 염화나트륨, 글리세린 등의 등장화제; 염산, 수산화나트륨 등의 pH조정제; 인산 나트륨, 초산나트륨 등의 완충화제; 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트, 스테아르산 폴리옥실 40, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 계면활성제; 구연산 나트륨, 에데트산 나트륨 등의 안정화제; 염화벤잘코늄, 파라벤 등의 방부제 등에서 필요에 따라 선택해 이용해 조제할 수 있다. 안구 유리체내 투여시 pH 는 통상 7.3의 멸균제제이며, 점안액의 pH는 안과 제제에 허용되는 범위 내에 있으면 좋지만 통상 pH4~8의 범위가 바람직하다.
본 발명의 조성물은 임의의 다양한 완충액 중에서 용해될 수 있다. 적합한 완충액은 예를 들면 인산염 완충된 염수(PBS), 일반 염수, 트리스(Tris) 완충액 및 인산 나트륨 (예를 들면 150 mM 인산 나트륨)을 포함한다. 불용성 폴리뉴클레오타이드는 약산 또는 약염기에 용해된 후 완충액을 이용하여 목적하는 부피까지 희석될 수 있다. 완충액의 pH는 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 이용하여 적절한 삼투성을 제공할 수 있다. 이런 첨가제는 당 분야의 숙련자의 권한에 포함된다. 상기 조성물이 생체 내에 사용되는 경우, 멸균된, 발열원이 없는 물을 사용할 수 있다. 이런 제제는 인간에게 투여하기에 적합한 조성물을 제조하기 위해 적합한 양의 수용액과 함께 효과량의 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 특히, 안구 유리체 및 점안제의 완충용액으로는 상업적 또는 그에 준하도록 제조된 안구용 Balanced Salt Solution (BSS)이 사용될 수 있다. pH는 6.8-7.4의 등장액으로 삼투압은 약 300 mOsm/kg, 조성물로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 마그네슘, 아세트산 나트륨, 구연산 나트륨, 수산화 나트륨 등을 포함한 용액이다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 제제 투여 대상이 되는 동물로서는 특히 제한되지 않지만 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 소, 말, 토끼, 양, 염소, 고양이, 개 등이 바람직하고 안에서도 인간이 더욱 바람직하다. 또한 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물이 세포 및/또는 그 배양액을 포함할 경우, 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 제제 투여 대상이 되는 동물의 종류와 일치하고 있는 것이, 질환에 대하는 것보다 안정적으로 우수한 예방 및/또는 치료 효과를 얻는 관점에서 바람직하다.
한편, 본 발명의 세포 밖 소포체를 포함하는 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물은 이와 및 기능성 식품적으로 허용되는 담체를 포함하는 기능성 식품 조성물 또는 동물 사료로도 적용이 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어 '기능성 식품 조성물'은 식품 제품, 식료품, 식이 보충제, 영양 보충제, 또는 식품 제품용 또는 식료품용 보충 조성물을 포함한다.
애완 동물 사료 조성물을 포함하는 동물 사료는, 트리트(예를 들어, 개 비스킷) 또는 다른 식품 보충제뿐만 아니라, 유리하게는 필요한 식사 요구량을 공급하는 식품, 일례로 보충제, 예를 들어 그레이비, 음료수, 요구르트, 분말, 현탁액, 츄, 트리트(예를 들어, 비스켓) 또는 임의의 다른 전달 형태이다.
본 발명의 식이 보충제는 임의의 적합한 형식으로 전달될 수 있다. 바람직한 양태에서, 액체, 젤, 젤캡, 캡슐, 분말, 고체 정제(코팅되거나 또는 코팅되지 않음), 차 등일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포로부터 세포 밖 소포체 분리
1-1. 줄기세포 배양
정상 건강인의 공여 혹은 환자 자신으로부터 공여받은 11㎖의 골수를 DMEM 배지로 1:2의 비율로 희석한 후, 미리 준비한 10㎖의 히스토파크(Histopaque; Sigma, density 1.077g/㎖) 층 위에 점적하고, 400×g에서 30분간 실온에서 원심분 리하였다. 단핵구 세포층을 분리하고, DMEM 배지를 첨가한 후 400×g에서 5분간 실온에서 원심분리하고, 얻어진 단핵구 세포를 DMEM 배지로 2회 세척한 후 MSCGM™ 배지에서 37℃와 5% C02를 유지하며 배양하였다. 배양 48시간 후, 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 새로운 배지로 교환하여 제거시키고, 플라스크 바닥에 붙은 세포를 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 갈아주며 배양하였다. 배양된 세포가 80%정도 자랐을 때 새 플라스크로 계대하여 배양하고, 배양한 세포는 일부는 계속 계대배양하고, 일부는 MSCGM™, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 5% DMSO이 함유된 동결보존액 혹은 Stem Cell Banker에 혼탁하여 -176℃액체질소에 보관하였다.
구체적으로, 중간엽 줄기세포(가톨릭 서울 성모병원 세포치료 사업단)를 구매(분양)하여, 본사 질소 탱크에 보관, 구매 후 1년 안에 사용하였다. 계대 번호 2의 세포를 구매하여, 20% FBS (fetal bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신/암포테기신B가 포함된 DMEM 배양배지에 배양하였다. 계대 번호 4까지 일반 배양 배지를 이용하여 배양 후, 엑소좀 및 소포 추출전에 분리 배양액으로 교체 후, 48시간 배양 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다.
회수한 세포배양 상층액은 500×g에서 10 분후 상층액을 회수, 2,000×g 에서 다시 10분간 원심분리하여 상층액을 분주하여 냉동 보관하였다. 구체적으로, 냉동 보관 세포 배양 상층액은 세포와 세포 부스러기가 제거된 배양액으로, 배양액 ml 당 1×10 내지 1×103의 세포가 분비한 엑소좀을 포함하며, 배양액 ml당 단백질 농도는 100 μg 내지 5000 μg 의 범주에 해당하는 것을 사용하였다.
1-2. 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 세포 밖 소포체의 분리
수용액 이상계를 만들기 위해 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란을 인산 완충 식염수(PBS, Phosphate buffered saline)에 녹여 각각 10.5 wt% 및 45 wt% 의 농도로 준비하였다.
상기 실시예 1-1에서 얻어진 배양액(세포와 세포 부스러기가 제거된 엑소좀을 포함하는 세포배양 상층액) 2 L를 덱스트란 수용액 20 ml 및 폴리에틸렌 수용액 50ml와 혼합하여 1시간 동안 용해시킨 후, 상 분리를 위하여 3,000g 10분 원심분리하였다. 최종 상분리된 수용액 이상계는 덱스트란 수용액/폴리에틸렌글리콜 수용액 간 계면장력이 5.36×10-6 J/m2이 되도록 하였다. 상분리된 시료의 덱스트란 수용액층으로부터 세포 밖 소포체를 피펫으로 추출(분리 및 회수)한 뒤 덱스트란 수용액층을 폴리에틸렌 수용액 1L와 다시 혼합하였다. 혼합된 용액의 상 분리를 위하여 3000g 10분 원심분리 하였다. 상분리된 수용액 이상계는 동일하게 덱스트란 수용액/폴리에틸렌글리콜 수용액 간 계면장력이 5.36×10-6 J/m2이 되도록 하였다. 상분리된 덱스트란층에서 세포 밖 소포체를 피펫으로 추출하였다. 단백질당 세포 밖 소포체 개수의 순도를 높이기 위해, 즉 배양액에 세포 밖 소포체 외에 존재하는 잔류 단백질을 완전히 제거하기 위해 두번 이상 이 과정을 반복하여 세포 밖 소포체를 분리 및 수득(회수)하였다.
이어, 회수된 세포 밖 소포체의 개수와 단백질 농도 등을 측정하여 특성을 분석하였다.
실시예 2: 분리된 세포 밖 소포체 특성 확인
시험예 1에서 분리된 세포 밖 소포체의 특성을 분석하기 위하여 입자 크기(입경)를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 시험예 1에서 분리된 세포 밖 소포체의 입자 크기 분포도를 보여주는 그래프이다. 이때 세포 밖 소포체는 엑소좀이고, 분리된 엑소좀의 입경분포는 1000 nm 이하이나, 50 nm 내지 300 nm 범위에서 96 중량% 이상 밀집 분포하는 것으로 확인되었다.
분리된 엑소좀의 특성 (1 L 미디어에서 추출된 엑소좀의 개수, 1 L 당 단백질 내 엑소좀의 함량 및 단백질 1 μg당 엑소좀의 개수)을 분석하기 위해 기존 분리방법인 density gradient μLtracentrifμgation (초원심분리)와 수용액 이상계 (ATPS)를 이용한 분리를 적용한 결과, 엑소좀의 개수 및 순도를 분석하여 도 2에 나타내었다. 이때, 엑소좀의 개수는 Nano tracking analysis를 사용하여 측정했으며 순도는 단위 단백질당 엑소좀의 개수로 측정하였다.
또한, 분리된 엑소좀의 막 단백질 표지자의 분포 및 함량을 측정한 결과, CD9, CD63 및 CD81이 주로 존재하되, 각각 14.3%, 75.79%, 2.5%씩 존재하였고, 상기 막 단백질 표지자 중 CD63 및 CD9의 비(ratio)는 5.3이었다(도 3).
실시예 3: 마우스 건성안 모델 준비 및 세포 밖 소포체의 투여
3-1. 마우스 건성안 모델의 확립
NOD/LtJ 건성안 마우스 모델을 사용했으며, 6주된 암컷과 수컷 마우스를 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, 미국)에서 구입하여 18주까지 키운 다음 실험에 사용하였다. 모든 마우스들은 가톨릭대학교 (서울, 한국)의 동물사육실의 무병원균 시설에서 멸균사료와 자유식(ad libitum) 물로 사육되었다. 건성안 모델이 형성되는 시점을 확인하기 위하여 13주부터 눈물양과 각막 결막 염색 시약인 리사민그린(Lissamine green)으로 각막염색을 하여 각막손상 정도를 확인하였다. 눈물양 감소와 각막염색의 증가가 되는 시점이 마우스의 건성안이 유도되는 시기로 18주령의 마우스를 실험에 사용하였다.
3-2. 마우스 건성안 모델에 세포 밖 소포체의 투여
건성안 모델이 확인되는 시점으로 마우스에 결막하 주사 투여(주사액제 투여) 또는 점안 투여(점안액제 투여)의 두 가지 방법으로 세포 밖 소포체를 처리하기 시작하였다.
세포 밖 소포체를 결막하에 주사로 투여한 대조군 그룹에는 control (10μL/per eye)을, 세포 밖 소포체 처리 그룹에는 세포 밖 소포체 (10μL/per eye)를 1회 투여한 후 7일째에 희생하였다. 즉, 마우스의 결막하에 주사 투여로 control (대조군) 혹은 세포 밖 소포체 (exosome)를 각 눈에 10μL, 한 마리당 20μL를 1일 1회 처리하여, 7일 동안 처리하였다.
세포 밖 소포체를 점안으로 투여한 대조군 그룹에서는 control (5μL/per eye)을, 세포 밖 소포체 처리 그룹에는 세포 밖 소포체 (5μL/per eye)를 투여처리하고 14일째에 희생하였다. 즉, 마우스의 눈에 점안 투여로 control (대조군) 혹은 세포 밖 소포체 (exosome)를 각 눈에 5μL, 한 마리당 10μL를 14일 동안 처리하였다.
이 때, 상기 투여되는 세포 밖 소포체 시료는 상기 실시예 1의 방법으로 수득된 줄기세포를 배양한 배지에서 수용액 이상계로 엑소좀을 추출하여 준비한 것이며, Control로 투여된 시료는 줄기세포를 배양하지 않은 배지에서 수용액 이상계를 이용하여 같은 방식으로 분리를 진행하여 준비한 것이다. 줄기 세포를 배양하지 않은 배지는 세포 밖 소포체가 없지만 다른 불순물이 있어 최종으로 추출한 Control 시료에는 극미량의 불순물이 함유되어 있다. Control 시료와 세포 밖 소포체 시료의 효능 비교를 통해 효능을 유발하는 인자가 불순물이 아닌 세포 밖 소포체 인지 여부를 확인할 수 있다.
눈물분비량 측정은 phenol red thread로 투여 시작 전과 희생 전에 실시하였다.
이하 실시예 및 도면에서 Control은 대조군이고, 엑소좀 (exosome)은 세포 밖 소포체가 투여된 투여군이다.
실시예 4. 세포 밖 소포체의 주사액제 투여에 따른 건성안에 대한 효과
4-1. 시험 방법
세포 밖 소포체의 주사액제 투여에 따른 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3의 마우스들에 대하여 1회 결막하에 주사로 세포 밖 소포체(exosome) 혹은 control을 투여한 후, 7일 뒤에 희생하였다. 안표면 염증 질환 동물모델에서 세포 밖 소포체(exosome)투여에 따른 임상 지표 변화를 확인하였다. Control 및 세포 밖 소포체(exosome)를 결막하에 주사로 투여하기 전 phenol red thread를 이용한 눈물분비량 확인, lissamine green 염색으로 각막 상피 결손의 정도를 확인하였다. 희생 후에는 마우스의 눈물샘 및 각막을 외과적으로 절제하여 헤마톡실린&에오신 염색(H&E Staining)을 이용한 염증병소 분석 및 Real-Time PCR을 통한 염증 인자 유전자 발현 분석을 수행하였다.
4-2. 각막 이미지 비교 분석
도 4는 대조군의 day 0, day 7일째 각막을 보여주는 이미지이고, 도 5는 세포 밖 소포체(exosome)를 안구에 1회 주사한 후 day 0, day 7일째 각막을 보여주는 이미지이다.
도 4 및 도 5를 보면, 대조군인 Injection control에 비해 본 발명에 따라 세포 밖 소포체(exosome)를 결막에 1회 투여 시 각막 상피의 결손이 감소되어 안표면 염증 질환이 호전된 결과를 확인할 수 있었다.
4-3. NEI Scoring 비교 분석
도 6은 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
Day 0일째 대조군 및 세포 밖 소포체 투여군의 점수는 큰 차이가 없었으나, day 7일째 수치를 보면, 세포 밖 소포체 투여군이 대조군 대비 유의미하게 점수가 감소되는 결과를 나타내었다.
4-4. 눈물분비량(tear secretion) 분석
도 7은 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 눈물분비를 비교한 그래프이다. Phenol red thread를 이용하여 투여 시작 전과 희생 전에 눈물분비량을 확인하였다.
Day 0의 대조군 및 세포 밖 소포체 투여군의 점수는 큰 차이가 없었으나, day 7 의수치를 보면, 세포 밖 소포체 투여군이 대조군 대비 유의미하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통하여 세포 밖 소포체를 투여함으로써 마우스의 안표면 염증 질환이 호전된 것을 확인할 수 있었다.
4-5. H&E Stain (lacrimal glands, 눈물샘) 분석
외과적으로 절제된 마우스의 눈물샘을 10% 포르말린(formalin)에 고정시키고 파라핀(paraffin)으로 포매(embedding)하였다. 파라핀 조직은 마이크로톰 (RM2255, Leica Biosystems, Nussloch, Germany)으로 미세 절단하여 4 μm의 각막 절편을 제조한 후, 헤마톡실린&에오신 염색(H&E Staining)을 수행하여 염증 병소 (inflammatory foci)의 개수 및 크기를 분석하였다.
도 8은 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 눈물샘 염색을 보여주는 이미지이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 염증 병소의 개수와 크기가 큰 것을 확인하여 눈물샘의 염증병소 지표 수치 (lacrimal foci score)가 크게 나온 반면에 세포 밖 소포체를 투여한 군에서는 눈물샘의 염증병소 지표 수치가 현저히 감소하였다.
4-6. Real-Time PCR을 통한 유전자 발현 분석
Real-Time PCR 분석법을 이용하여 외과적으로 절제된 마우스의 각막에서 염증 인자의 유전자 발현을 fold 값으로 관찰하여 도 9에 나타내었다. 세포 밖 소포체를 투여한 군에서는 대조군에 비하여 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현이 각막에서 확연하게 감소한 것을 볼 수 있었다.
도 10은 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 보여주는 그래프이다. 도 10 또한, 도 9와 같이, 세포 밖 소포체를 투여한 투여군의 경우 대조군 대비 염증 인자의 유전자 발현이 크게 줄어드는 결과를 보였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 세포 밖 소포체의 주사액 투여가 안표면 염증 질환의 개선과 관련하여 염증 인자의 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 세포 밖 소포체의 점안액제 투여에 따른 건성안에 대한 효과
세포 밖 소포체의 점안액제 투여에 따른 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 수행하였다.
5-1. 시험 방법
상기 실시예 3의 마우스들에 대하여 2주간 세포 밖 소포체 혹은 control을 점안으로 투여한 후, 7일 뒤에 희생하였다. 안표면 염증 질환 동물모델에서 세포 밖 소포체 투여에 따른 임상 지표 변화를 확인하였다. Control 및 세포 밖 소포체(exosome)을 점안으로 투여하기 전 phenol red thread를 이용한 눈물분비량 확인, lissamine green 염색으로 각막 상피 결손의 정도를 확인하였다. 희생 후에는 마우스의 눈물샘 및 각막을 외과적으로 절제하여 헤마톡실린&에오신 염색(H&E Staining)을 이용한 염증병소 분석 및 Real-Time PCR을 통한 염증 인자 유전자 발현 분석을 수행하였다.
5-2. 각막 이미지 비교 분석
도 11은 대조군의 day 0, day 14일째 각막을 보여주는 이미지이고, 도 12는 세포 밖 소포체(exosome)를 안구에 14일 동안 처리한 후 day 0, day 14일째 각막을 보여주는 이미지이다.
도 11및 도 12를 보면, 대조군인 Injection control에 비해 본 발명에 따라 세포 밖 소포체를 점안액으로 14일 동안 투여시 각막 상피의 결손이 감소되어 안표면 염증 질환이 호전된 결과를 확인할 수 있었다.
5-3. NEI Scoring 비교 분석
도 13은 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 각막염색점수(NEI scoring)를 비교한 그래프이다.
Day 0일째 대조군 및 세포 밖 소포체 투여군의 점수는 큰 차이가 없었으나, day 7일째 수치를 보면, 세포 밖 소포체 투여군이 대조군 대비 유의미하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다.
5-4. 눈물분비량(tear secretion) 분석
도 14는 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 눈물분비량을 비교한 그래프이다. Phenol red thread를 이용하여 투여 시작 전과 희생 전에 눈물분비량을 확인하였다.
Day 0의 대조군 및 세포 밖 소포체 투여군의 점수는 큰 차이가 없었으나, Day14의 수치를 보면, 세포 밖 소포체 투여군이 대조군 대비 증가하는 결과를 나타내었다. 이를 통하여 세포 밖 소포체를 투여함으로써 마우스의 안표면 염증 질환이 호전된 것을 확인할 수 있었다.
5-5. H&E Stain (lacrimal glands, 눈물샘) 분석
외과적으로 절제된 마우스의 눈물샘을 10% 포르말린(formalin)에 고정시키고 파라핀(paraffin)으로 포매(embedding)하였다. 파라핀 조직은 마이크로톰 (RM2255, Leica Biosystems, Nussloch, Germany)으로 미세 절단하여 4 μm의 각막 절편을 제조한 후, 헤마톡실린 & 에오신 염색을 수행하여 염증 병소 (inflammatory foci)의 개수 및 크기를 분석하였다.
도 15는 대조군 및 세포 밖 소포체(exosome) 투여군의 눈물샘 염색을 보여주는 이미지이다. 도 15에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 염증 병소의 개수와 크기가 큰 것을 확인하여 눈물샘의 염증병소 지표 수치 (lacrimal foci score)가 크게 나온 반면에 세포 박 소포체를 투여한 군에서는 눈물샘의 염증병소 지표 수치가 현저히 감소하였다.
5-6. Real-Time PCR을 통한 유전자 발현 분석
외과적으로 절제된 마우스의 각막에서 염증 인자의 유전자 발현을 fold 값으로 관찰하여 도 16에 나타내었다. 세포 밖 소포체를 투여한 군에서는 대조군에 비하여 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현이 각막에서 확연하게 감소한 것을 볼 수 있었다.
도 17은 눈물샘 내 IL-6, IL-1β, TNF-a, IFN-g, IL-17A, MMP9의 발현을 보여주는 그래프이다. 도 17 또한, 도 16과 같이, 세포 밖 소포체를 투여한 투여군의 경우 대조군 대비 염증 인자의 유전자 발현이 크게 줄어드는 결과를 보였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 세포 밖 소포체의 점안액 투여가 안표면 염증 질환의 개선과 관련하여 염증 인자의 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (15)
- 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포 밖 소포체는 중간엽 줄기세포를 배양하여 세포 밖 소포체를 생성하는 단계; 상기 세포 밖 소포체를 배양하는 단계; 및 수용액 이상계 분리법을 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 방법으로 생산된 것인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포 밖 소포체는 엑소좀이고, 상기 엑소좀은 CD9, CD63, CD81 막 단백질 표지자를 갖는 것인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 막 단백질 표지자 중 CD63/CD9의 비는 2.5 이상을 만족하는, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 세포 밖 소포체는 배양액 1 L 당 분리되는 엑소좀의 개수가 1×109 내지 1×1012이고, 단백질 양이 0.1 mg 내지 20 mg인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 자가 및 동종 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 유래한 세포주인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 인간 또는 동물 조직은 골수, 지방조직, 제대조직, 제대혈, 골격근, 말초핼액 및 양수 중 어느 하나 이상에서 선택된 조직으로부터 분리된 것인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 안표면 염증 질환은 건성안인 것인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 안표면 염증 질환은 무루증, 쇼그렌 증후군 등의 자가면역질환, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술, 알레르기성 결막염, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소, 공기 조절장치로 인한 건조한 방, 장기적인 약물사용에 의한 독성, 장기적인 콘택트 렌즈 사용, 눈물분비를 감소시키는 전신약제, 안구화상 및 만성안구이식편대숙주반응으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 야기 또는 수반되는 것인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 세포 밖 소포체를 전체 조성물 총 100 중량% 내에서, 0.0001 내지 95 중량%로 함유되는, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 안구내, 유리체내 또는 피내 경로로 투여되는, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 액제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인, 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 중간엽 줄기세포 유래 또는 이의 배양액으로부터 분리되고, 평균입경이 50 nm 내지 1000 nm 인 세포 밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 세포 밖 소포체는 엑소좀이고, 상기 엑소좀은 CD9, CD63, CD81 막 단백질 표지자를 갖는 것인, 각막 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 막 단백질 표지자 중 CD63/CD9의 비는 2.5 이상을 만족하는, 각막 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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