KR20220047210A - 중간엽줄기세포 유래 세크레톰의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

중간엽줄기세포 유래 세크레톰의 제조 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220047210A
KR20220047210A KR1020217036569A KR20217036569A KR20220047210A KR 20220047210 A KR20220047210 A KR 20220047210A KR 1020217036569 A KR1020217036569 A KR 1020217036569A KR 20217036569 A KR20217036569 A KR 20217036569A KR 20220047210 A KR20220047210 A KR 20220047210A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
msc
msc secretome
secretome
composition
serpin
Prior art date
Application number
KR1020217036569A
Other languages
English (en)
Inventor
스펜서 앨포드
Original Assignee
컴반지오, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 컴반지오, 인크. filed Critical 컴반지오, 인크.
Publication of KR20220047210A publication Critical patent/KR20220047210A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2053—IL-8
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

본 출원은 중간엽 줄기세포 세크레톰을 제조하고, 사용하는 방법 및 공정, 뿐만 아니라 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰으로 안구 병태 및/또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

중간엽줄기세포 유래 시크리톰의 제조 및 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 2월 7일에 제출된 미국 특허출원 16/785,463; 2020년 2월 7일에 제출된 미국 특허출원 16/785,470; 2019년 4월 9일에 제출된 미국 가출원 62/831,371; 및 2019년 10월 31일에 제출된 미국 가출원 62/929,035에 대한 우선권을 주장하고, 이들의 개시 내용은 전문이 모든 목적으로 본원에 참고문헌으로 통합된다.
재생의학 (regenerative medicine)은 인간의 세포, 조직, 장기를 교체하거나 재생하여 정상적인 기능을 회복 또는 확립시키는 의학 분야이다. 예를 들어, 줄기세포 요법은 다양한 질환 및 장애를 치료하거나, 예방하거나, 치유하는데 활용될 수 있다.
줄기세포는 무한히 분열할 수 있는 능력이 있고, 특정 특이적 조건 하에서 많은 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포이다. 전능성 줄기세포는 배아를 구성하는 모든 세포와 조직을 생성할 수 있는 잠재력이 있는 줄기세포이다. 다능성 (pluripotent) 줄기세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포를 생성하는 줄기세포이다. 다능성 (multipotent) 줄기세포는 둘 이상의 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포인 반면, 단능성 줄기세포는 하나의 세포 유형으로만 분화하는 줄기세포이다. 이러한 줄기세포 중 하나의 유형은 중간엽 줄기세포이다. 예를 들어, 미국 특허출원 US 20190046576 참조.
그러나, 살아있는 줄기세포 기반의 요법을 임상적으로 적절한 규모로 생산하고, 보관하는 것은 어렵다. (Trainor et al., Nature Biotechnology 32(1) (2014) 참조). 더욱이, 이러한 요법의 치료 효능 및 재생 능력은 종종 가변적이며, 세포는 이식 이전 또는 이식 동안 죽을 수 있다 (Newell, Seminars in Immunopathology 33(2): 91 (2011) 참조). 이식된 줄기세포는 또한 숙주 면역계 공격 및/또는 거부에 취약하며, 종종 효능을 평가하고/거나 "투약"를 조절하는 것이 어렵다. 따라서, 현재 세포 기반의 재생의학 요법과 관련된 비용, 보관 및 제조 품질 관리 한계를 극복할 수 있는 추가적인 재생 요법이 당업계에 필요하다. 구체적으로는, 안구 병태의 맥락에서 어렵다.
눈에 대한 모세포 및 무딘 손상은 망막 부종, 외상성 백내장, 렌즈에 대한 띠 부착의 파열, 각도 후전, 홍채 투석 및 동공 괄약근 파열을 포함하여 안구 내용물에 대한 일련의 기계적 파열을 유발할 수 있다. 이러한 손상의 치료는 홍채의 기계적 복구 (가능한 경우), 플라스틱 렌즈 임플란트로 수정체의 교체 및 망막 박리의 복구로 제한되어 왔다. 망막 또는 전방 체임버의 세포성 구조를 복구하는 치료법은 없었다. 더욱이, 외상성 시신경병증 및 시신경 이탈은 이라크 자유작전 기간에 안과 전문의 치료가 필요하였던 6가지 주요 안구 손상 유형에 있다 (Cho and Savitsky, "Ocular Trauma Chapter 7", in Combat Casualty Care: Lessons learned from Oef and Oif, by Brian Eastbridge and Eric Savitsky, pp. 299-342, Ft. Detrick, Md.: Borden Institute (US) Government Printing Office, 2012, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨). 외상성 두부 손상의 60%는 신경안과적 이상을 야기하고 (Van Stavern, et al., J. Neuro-Ophthamol. 21(2): 112-117, 2001, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨), 이들 중 절반은 눈 신경 또는 시각 경로가 관여한다. 뉴런에 대한 외상성 손상은 축삭 손상 및 영구적인 결함을 유발하는 비-가역적 뉴런 소실을 가져온다. 다수의 잠재적인 신경보호 요법이 동물에서 확인되었던 한편, 이들의 단일 제제는 일반적으로 인간 임상 테스트에서 요법으로 개발하는 데 실패하였다 (Turner, et al., J. Neurosurg. 118(5): 1072-1085, 2013, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨). 여러 세포성 표적에 영향을 미치는 조합 요법이 신경 손상을 예방하는데 필요할 수 있다.
각막은 눈의 최외부 조직으로서 보호 역할을 하지만, 중증 손상 및 질환에 매우 취약하다. 혈관이 없기 때문에 투명할 수 있지만 치유 능력도 제한된다. 비가역적인 실명을 유발할 잠재력으로 인해 각막 손상은 즉각적 개입과 적극적 치료를 요구한다. 구체적으로, 개선된 안구 표면 치유 요법의 결정적인 필요성은 화학적 화상의 경우 및 여러 각막 질환, 예컨대 급성 만성 이식편대숙주병 (GvHD), 스티븐스-존슨 증후군, 안점막 천포창 및 연구적인 각막 상피 결함을 유발하는 기타 병태에서 분명하고, 이는 종합적으로 연간 100,000건 이상의 발병을 포함한다. (Dietrich-Ntoukas et al. Cornea. 2012, 31(3): 299-310; Stevenson W, et al., Clin. Ophthalmol. 2013, 7: 2153-2158; White KD, et al., J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2018, 6(1): 38-69; Tauber J. (2002) Autoimmune Diseases Affecting the Ocular Surface. In: Ocular Surface Disease Medical and Surgical Management. Springer, New York, NY.; Wirostko B, et al., Ocul. Surf. 2015 7월, 13(3): 204-21; 및 Haring, RS. et al., JAMA Ophthalmol. 2016 10월 1일, 134(10): 1119-1124).
더욱이, 국소 안과용 약물 개발은 종종 더 깊은 안구 조직에 도달하는 5% 미만의 국소 투여 용량과 함께 눈물 회전율 및 희석, 코눈물 배출 및 반사 깜박임을 포함하여 많은 해부학적 제약으로 인해 방해를 받는다 (Gaudana et al., 2009). 각막 상처의 경우, 초기 손상은 각막 상피에 균열을 일으키고, 이로써 국소적으로 적용된 MSC-S가 상피층을 관통할 수 있게 한다.
따라서, 눈을 표적으로 하여 외상 (예를 들어, 화상, 급성 염증, 연령 및/또는 산화적 스트레스)에 대한 이차적 염증으로 인해 퇴화될 수 있는 도달하기 어려운 감각 조직으로 치료 페이로드를 전달할 수 있는 안구 요법에 대한 당업계의 절실한 요구가 있다. 본 발명은 이러한 치료에 사용되는 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 제조하는 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
Akpek, E. K. and J. D. Gottsch. 2003. "Immune Defense at the Ocular Surface." Eye (London, England) 17 (8): 949-56. https://doi.org/10.1038/sj.eye.6700617. Baradaran-Rafii, Alireza, Medi Eslani, Zeeshan Haq, Ebrahim Shirzadeh, Michael J. Huvard, and Ali R. Djalilian. 2017. "Current and Upcoming Therapies for Ocular Surface Chemical Injuries." The Ocular Surface 15 (1): 48-64. https://doi.org/10.1016/j.jtos.2016.09.002. Chen, Yanfeng, Wenzhao Yang, Xiaobo Zhang, Shu Yang, Gao Peng, Ting Wu, Yueping Zhou, et al. 2016. "MK2 Inhibitor Reduces Alkali Burn-Induced Inflammation in Rat Cornea." Scientific Reports 6 (June): 28145. https://doi.org/10.1038/srep28145. Choi, Jin A., Jun-Sub Choi, and Choun-Ki Joo. 2011. "Effects of Amniotic Membrane Suspension in the Rat Alkali Burn Model." Molecular Vision 17 (February): 404-12. Epstein, R. J., R. D. Stulting, R. L. Hendricks, and D. M. Harris. 1987. "Corneal Neovascularization. Pathogenesis and Inhibition." Cornea 6 (4): 250-57. https://doi.org/10.1097/00003226-198706040-00004. Fernandes-Cunha, Gabriella Maria, Kyung-Sun Na, Ilham Putra, Hyun Jong Lee, Sarah Hull, Yu-Chia Cheng, Ignacio Jesus Blanco, Medi Eslani, Ali R Djalilian, and David Myung. 2019. "Corneal Wound Healing Effects of Mesenchymal Stem Cell Secretome Delivered within a Viscoelastic Gel Carrier." Stem Cells Translational Medicine 8 (5): 478-89. Ferreira, Joana R, Graciosa Q Teixeira, Susana G Santos, Mario A Barbosa, Graca Almeida-Porada, and Raquel M Gonηalves. 2018. "Mesenchymal Stromal Cell Secretome: Influencing Therapeutic Potential by Cellular Pre-Conditioning." Frontiers in Immunology 9. Gaudana R, Jwala J, Boddu SH, Mitra AK. 2009. "Recent perspectives in ocular drug delivery." Pharm. Res. 26(5): 1197-216 Harkin, Damien G, Leanne Foyn, Laura J Bray, Allison J Sutherland, Fiona J Li, and Brendan G Cronin. 2015. "Concise Reviews: Can Mesenchymal Stromal Cells Differentiate into Corneal Cells? A Systematic Review of Published Data." Stem Cells 33 (3): 785-91. Katzman, Lee R, and Bennie H Jeng. 2014. "Management Strategies for Persistent Epithelial Defects of the Cornea." Saudi Journal of Ophthalmology??: Official Journal of the Saudi Ophthalmological Society 28 (3): 168-72. https://doi.org/10.1016/j.sjopt.2014.06.011. Kim, Dae Won, Sung Ho Lee, Min Jea Shin, Kibom Kim, Sae Kwang Ku, Jong Kyu Youn, Su Bin Cho, et al. 2015. "PEP-1-FK506BP Inhibits Alkali Burn-Induced Corneal Inflammation on the Rat Model of Corneal Alkali Injury." BMB Reports 48 (11): 618-23. https://doi.org/10.5483/bmbrep.2015.48.11.041. Li M, Luan F, Zhao Y, Hao H, Liu J, Dong L, Fu X, Han W. "Mesenchymal stem cell- conditioned medium accelerates wound healing with fewer scars." Int. Wound J. 2017, 14: 64-73. Maddula, Surekha, Don K. Davis, Soumya Maddula, Michael K. Burrow, and Balamurali K. Ambati. 2011. "Horizons in Therapy for Corneal Angiogenesis." Ophthalmology 118 (3): 591-99. https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2011.01.041. McGwin, Gerald, and Cynthia Owsley. 2005. "Incidence of Emergency Department-Treated Eye Injury in the United States." Archives of Ophthalmology 123 (5): 662-66. Samaeekia, Ravand, Behnam Rabiee, Ilham Putra, Xiang Shen, Young Jae Park, Peiman Hematti, Medi Eslani, and Ali R Djalilian. 2018. "Effect of Human Corneal Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes on Corneal Epithelial Wound Healing." Investigative Ophthalmology & Visual Science 59 (12): 5194-5200. Schrage, Norbert Franz, Sirpa Kompa, Wolfram Haller, and Stephanie Langefeld. 2002. "Use of an Amphoteric Lavage Solution for Emergency Treatment of Eye Burns. First Animal Type Experimental Clinical Considerations." Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries 28 (8): 782-86. https://doi.org/10.1016/s0305-4179(02)00194-8. Serrano, Felipe, Lawrence B Stack, R Jason Thurman, Lara Phillips, and Wesley H Self. 2013. "Traumatic Eye Injuries: Management Principles for the Prehospital Setting." JEMS: A Journal of Emergency Medical Services 38 (12): 56. Singh, Parul, Manoj Tyagi, Yogesh Kumar, K K Gupta, and P D Sharma. 2013. "Ocular Chemical Injuries and Their Management." Oman Journal of Ophthalmology 6 (2): 83-86. https://doi.org/10.4103/0974-620X.116624. Vezina, Mark. 2012. "Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals." In Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals, 1-21. Springer. Vizoso, Francisco J, Noemi Eiro, Sandra Cid, Jose Schneider, and Roman Perez-Fernandez. 2017. "Mesenchymal Stem Cell Secretome: Toward Cell-Free Therapeutic Strategies in Regenerative Medicine." International Journal of Molecular Sciences 18 (9): 1852. Zanotti, L., R. Angioni, B. Cali, C. Soldani, C. Ploia, F. Moalli, M. Gargesha, et al. 2016. "Mouse Mesenchymal Stem Cells Inhibit High Endothelial Cell Activation and Lymphocyte Homing to Lymph Nodes by Releasing TIMP-1." Leukemia 30 (5): 1143-54. https://doi.org/10.1038/leu.2016.33. Ziaei, Mohammed, Carol Greene, and Colin R Green. 2018. "Wound Healing in the Eye: Therapeutic Prospects." Advanced Drug Delivery Reviews 126: 162-76.
본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물로서,
(i) 약 250 μM 미만의 IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성;
(ii) HGF, FGF-7, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및/또는 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(iii) sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), 세르핀 A1, IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및/또는 HO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iv) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및/또는 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함하는, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및/또는 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "더 높은 수준", 선택적으로 1 ng/mL 내지 8 ng/mL로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및/또는 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "중간 수준", 선택적으로 400 pg/mL 내지 3000 pg/mL로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및/또는 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 VEGF의 "낮은" 수준, 선택적으로 0 pg/mL 내지 200 pg/mL을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮다.
일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, 여기서 VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준, 선택적으로 1000 pg/mL 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 pH 7.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2가 양이온을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, 조성물은 접착제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 제조하는 방법으로서,
(i) 제 1 배양 배지에서 중간엽 줄기세포 (MSC)를 배양하는 단계;
(ii) 단계 (i)로부터의 제 1 배양 배지를 MSC로부터 제거하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서의 MSC를 세척하는 단계;
(iv) 제 2 배양 배지를 첨가하여 약 1일 내지 5일 동안 배양하는 단계;
(v) 단계 (iv)로부터의 제 2 배양 배지를 조건화　배지로서 수확하는 단계; 및
(vi) 본원에 설명된 바와 같이 단계 (v)에서의 조건화　배지를 MSC 세크레톰 조성물로 가공하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 세크레톰 조성물이다.
본원에 기재된 바와 같이 (vi) 단계 (v)에서의 조건화 배지를 MSC 세크레톰 조성물로 가공하는 단계는
(a) 단계 (v)로부터의 수확된 조건화 배지를 여과하여 세포 미립자를 제거하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 여과된 조건화 배지를 농축시키는 단계; 및
(c) 제형화 완충액으로 완충액 교환하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템으로 완충액 교환하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터, 0.22 μm 필터, 0.8 μm 필터 및 0.65 μm 필터, 낮은 단백질 결합 PVDF 막 및/또는 PES (폴리에테르설폰)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터, 접면 유동 여과 시스템 또는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 3 내지 10 kDa MW 컷오프를 채용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 안구 질환의 치료 방법으로서, 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 표적 영역에 투여된다.
또한, 본 발명은 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능 장애를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 환자에서 안구 상처 치유를 유도하고/거나, 촉진하는 방법으로서, 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 환자에서 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고/거나, 흉터 형성을 감소 및/또는 억제하고/거나, 시력을 증진 및/또는 보존하고/거나, 상처 봉합 속도를 증가시키는 (상처 봉합 시간을 감소시킴) 방법으로서, 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시력 보존을 증진시키기 위하여 필요로 하는 환자에서 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고, 흉터 형성을 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물은 국소 투여를 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물은 결막하 주사를 위해 제형화된다.
또한, 본 발명은 MSC 세크레톰을 특성화하는 방법으로서,
(i) MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 특성화 검정은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
(ii) (i)에서의 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MSC 세크레톰의 생체효능 및 안정성을 결정하는 방법으로서,
(i) MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
(ii) (i)에서의 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다수의 MSC 세크레톰 로트 사이에 MSC 세크레톰 로트 일관성을 결정하는 방법으로서,
(i) MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
(ii) (i)에서의 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 물리적 성분 특성화로부터의 결과는 본원에 기재된 바와 같이 항-혈관형성 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 안전성 분석으로부터의 결과는 혈액 적격성을 나타내고, 발열원 및/또는 내독소가 적거나 없는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 안정성 검정으로부터의 결과는 4℃, 20℃ 및/또는 25℃ (또는 실온)에서 적어도 7일 동안 안정성을 나타내는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 증식 검정으로부터의 결과는 증식을 유도하는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 이동 검정으로부터의 결과는 이동을 유도하는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 혈관신생 검정으로부터의 결과는 혈관신생을 억제하거나, 촉진하지 않는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 분화/흉터 형성 검정으로부터의 결과는 분화 및/또는 흉터 형성을 억제하는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 염증 검정으로부터의 결과는 염증을 억제하는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은
(iii) (ii)에서의 결과를 기초로 하여 MSC 세크레톰 로트를 확인하는 단계
를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 MSC 세크레톰을 특성화하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 제공하고, 패널은 적어도 2가지 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정 및/또는 염증 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 MSC 세크레톰 로트 사이에 일관성을 결정하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 제공하고, 패널은 하나 이상의 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정 및/또는 염증 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 물리적 성분 특성화는 본원에 기재된 바와 같이 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서 안전성 분석으로부터의 결과는 혈액 적격성을 나타내고, 발열원 및/또는 내독소가 적거나 없는 MSC 세크레톰을 제공한다.
일부 구현예에서, 안정성 검정은 4℃, 20℃ 및/또는 25℃ (또는 실온)에서 적어도 7일 동안 안정성을 나타내는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 증식 검정은 증식을 유도하는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 이동 검정은 이동을 유도하는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 혈관신생 검정은 혈관신생을 억제하거나, 촉진하지 않는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 분화/흉터 형성 검정은 분화 및/또는 흉터 형성을 억제하는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 염증 검정은 염증을 억제하는 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정은 모두 수행된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 테스트 및/또는 검정법의 패널은 본원에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰을 확인한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 테스트 및/또는 검정법 패널은 적어도 하나의 이동 검정을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동 검정은 시험관내 상처 봉합 검정이다. 일부 구현예에서, 시험관내 상처 봉합 검정은 "스크래치 검정" ("스크래치 상처 검정"으로도 지침됨), 원형 찰과상 방법, 원형 찰과상 검정 및 원형 상처 봉합 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 및/또는 항-반흔 MSC 세크레톰이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 및 항-반흔 MSC 세크레톰이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰이다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 1 μg 내지 20 μg, 선택적으로 2 μg 내지 8 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.0375%, 선택적으로 0.008% 내지 0.015% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 6 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2.28 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11.45 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 12.2 mg 만니톨;
(v) 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 1 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 7.4인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.012% w/w MSC 세크레톰;
(ii) 4.5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 22.4% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 24% w/w 만니톨;
(v) 47.1% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 2.0% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 7.4인, 제형물을 제공한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물로서,
(i) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(ii) PEDF (세르핀 F1), 세르핀 A1, IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iii) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함하는, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 높은 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 중간 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및 세르핀 E1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하고, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2, 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 낮은 수준의 VEGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGF를 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, 여기서 VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 1,000 pg/mL 미만의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 접착제를 추가로 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집물 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬, 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 HGF, 펜트락신-3 (TSG-14), VEGF, TIMP-1, 세르핀 E1 및 < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
(ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
(iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
(v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰을 포함한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은
(i) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(ii) PEDF (세르핀 F1), 세르핀 A1, IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iii) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함하는, 방법을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 높은 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 중간 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및 세르핀 E1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하고, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2 및 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 낮은 수준의 VEGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGF를 포함한다.
일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, 여기서 VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 1,000 pg/mL 미만의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 접착제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집물 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 HGF, 펜트락신-3 (TSG-14), VEGF, TIMP-1, 세르핀 E1 및 < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
(ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
(iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
(v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰을 포함한다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 1 μg 내지 20 μg, 선택적으로 2 μg 내지 8 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.0375%, 선택적으로 0.008% 내지 0.015% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 6 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2.28 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11.45 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 12.2 mg 만니톨;
(v) 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 1 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 7.4인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.012% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4.5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 22.4% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 24% w/w 만니톨;
(v) 47.1% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 2.0% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 7.4인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물의 일부 구현예에서, 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
안구 병태에 대한 치료 방법의 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용되는 MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는다.
MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물의 일부 구현예에서, 조성물 및/또는 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는다.
도 1: MSC 세크레톰 제조, 가공 및 사용의 구현예의 모식도를 나타낸다.
도 2: MSC-S가 상처 치유인자를 포함하는 것을 나타낸다. 인간 XL 사이토카인 어레이 (R&D 시스템스사)를 사용하여 MSC-S에 존재하는 여러 단백질 인자를 확인하였다. 점선 박스: 기준 지점.
도 3a 내지 도 3c: MSC-S는 낮은 응집 성향을 나타낸다. (A) pH 7.4의 포스페이트 완충액에서 제형화된 MSC-S를 SEC로 분석하였다. 초기 해동 이후, MSC-S를 4℃, 20℃ 또는 37℃에서 7일 동안 유지하고 SEC로 분석하였다. 고차 응집물의 약간의 증가만이 관찰되고, 더 높은 보관 온도와 상관관계가 있다. 시료는 다이오드 어레이 검출기와 TSKgel 슈퍼SW 2000, 4.6 × 300 mm 컬럼이 장착된 애질런트 1100 HPLC 시스템에서 0.25 mg/mL의 유속 및 1× PBS의 이동상을 사용하여 분석하였다. 모니터링된 파장은 214 nm이었다. 28 μg MSC-S가 로딩되었다. (B) pH 7.4에서 제형화된 MSC-S는 열 응집 성향에 의해 (C) pH 6.4보다 더 안정하다. 시료를 평가하고, 266 nm 및 473 nm에서 신호를 모니터링하였다 (큰 응집물의 경우). 8.8 μL의 1 mg/mL MSC-S를 유니 큐벳 내로 4회 반복하여 로딩하였다. 온도 스캔은 분당 0.6℃의 스캔 속도로 20℃ 내지 90℃에서 수행하였다.
도 4a 및 도 4b: MSC-S가 인간 일차 각막 상피세포의 이동을 촉진하는 것을 나타낸다. (A) MSC-S 또는 0.1% 성장 보충제와 함께 24시간 배양 이후 트랜스웰 막의 바닥면을 촬영한다. (B) MSC-S는 이동을 유의하게 촉진시킨다. 이동된 세포는 처리 당 3개의 사본에 대해 사본 당 3개의 영역에서 나열되었다. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다(graphpad.com의 월드와이드웹 참조). 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: ****p < 0.0001.
도 5a 및 도 5b: MSC-S가 인간 일차 각막 상피세포의 이동을 촉진하는 것을 나타낸다. (A) MSC-S 또는 0.1% 성장 보충제와 함께 24시간 배양 이후 트랜스웰 막의 바닥면을 촬영한다. (B) MSC-S는 이동을 유의하게 촉진시킨다. 이동된 세포는 처리 당 3개의 사본에 대해 사본 당 3개의 영역에서 나열되었다. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다(graphpad.com의 월드와이드웹 참조). 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: ****p < 0.0001.
도 6a 및 도 6b: MSC-S가 단백질 발현에 의한 항-혈관형성 프로파일을 갖는 것을 나타낸다. (A) 인간 혈관형성 어레이를 사용하여 MSC-S에서 프로-혈관형성 및 항-혈관형성 인자를 평가하였다. (B) 항-혈관형성 인자 (검은색)는 높은 수준으로 존재하고, 프로-혈관형성 인자 (흰색)는 낮은 수준으로 존재한다. 평균 픽셀 강도는 이미지 J (NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 결정되었다.
도 7a 및 도 7b: MSC-S는 관형성 검정에서 항-혈관형성 성질을 나타낸다. HUVEC 세포 (100 μL 중 10K개)를 MSC-S (300 μg/mL)의 부재 또는 존재 하에 저혈청 성장 보충물 (라이프테크놀로지사)을 더한 100 μL의 내피세포 기본 배지에 10K개 세포로 매트리겔 상에 접종하였다. 세포를 6시간 동안 배양하여 내피 관형성을 허용한 다음, 영상 획득 및 처리를 수행하였다. 각 조건에 대해 5회 반복하여 수행하였다. (A) 영상 패널은 MSC-S가 관형성을 약화시키는 것을 나타낸다. (B) MSC-S는 혈관형성 계량, 총 루프, 총 튜브 길이 및 총 분지점을 감소시킨다. 위마시스 (Wimasis) 2016을 사용하여 처리된 영상. 윔튜브: 관형성 검정 영상 분석 해법. 배포본 4.0. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0, www.graphpad.com을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다. 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: **p < 0.001 및 ***p　<　0.0005.
도 8: MSC-S는 항-반흔 성질을 나타낸다. 인간 진피 섬유모세포는 MSC-S 존재 하에 TGF
Figure pct00001
-1을 사용하여 근섬유모세포로 분화되었다. 24시간 후, 단리된 총 RNA에 대해 qPCR을 수행하였다. MSC-S는 흉터 형성 바이오마커 TGF
Figure pct00002
2 및 SMA의 발현을 감소시킨다. 데이터는 9회 반복의 평균 ± SD를 나타낸다. 원웨이 분산 분석 (ANOVA)에 이어진 사후 듀넷 테스트를 사용하여 비교를 수행하였다: *p < 0.05, ***p < 0.0001.
도 9: MSC-S 치료가 각막 알칼리 화상이 유도한 상처 봉합을 유의하게 개선하는 것을 나타낸다. 알칼리 화상 동물 모델: 갈색 노르웨이 래트 (150 g, 10주령)를 케타민/자일라진의 피하 주사 이전에 케토프로펜의 피하 투여에 의해 깊이 마취시켰다. 다음으로 오른쪽 눈을 치료할 목적으로 국소 프로파라케인 한 방울을 적용하였다. 다음으로 알칼리 화상을 깊게 마취된 마우스의 오른쪽 눈에 1 N NaOH에 적신 직경 5 mm의 원형 여과지를 각막 중앙에 30초 동안 두고, 이어서 100 mL의 계량으된 염 용액 (BSS)으로 세척하여 생성하였다. 수술후 통증 관리는 총 3회 투여 동안 24시간마다 케토프로펜의 피하 주사에 의해 달성하였다. 다음으로 동물을 무작위로 2가지 처리군으로 할당하였다: 비히클 (n = 4) 및 MSC-S (n = 4 내지 5). 눈을 플루오레세인 (BSS 중 희석된 20 μL의 1.0% 플루오레세인 포스페이트)으로 염색하고, 초기 상처 및 알칼리 화상의 유도 이후 매일 사진을 촬영하여 상피 결함 영역을 측정하였다. 초기 플루오레세인 염색 직후, 국소 치료를 시작하였다: 비히클 (BSS, 5 μL) 및 MSC-S (5 mg/mL, 5 μL), 7일 동안 매일 3회 (TID). 각막 마찰 상처의 면적은 컴퓨터 보조 영상 분석기 (Image J 1.38x; 국립보건원, Bethesda, MD)를 사용하여 사진으로부터 정량화하였다. 치유의 정도는 즉각적인 손상과 각 24시간 후 남은 상처 면적 사이의 차이 비율에 의해 결정하였다. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0, www.graphpad.com을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다. 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: *p < 0.05, **p　<　0.01 및 ***p < 0.001.
도 10: MSC-S는 5℃ 및 25℃ (상온)에서 보관될 때 7일 동안 프로-이동 생체활성을 유지하는 것을 나타낸다 [연구 CM19_TWS01]. 세포 기반의 이동 안정성 이중검정은 트랜스웰 이동 원리 및 일차 각막 섬유모세포를 이용한다. 간략하게, 세포를 다공성 막이 있는 상부 체임버의 기본 (영양분 결핍) 배지에 접종한다. 다음으로 체임버를 MSC-S를 포함하는 기본 배지에 배치한다. 24시간 후 막 바닥 표면 위의 이동된 세포를 염색하고, 영상화하여 정량화한다.
도11a 및 도 11b: MSC-S가 인간 일차 각막 상피세포의 이동을 촉진하는 것을 나타낸다. MSC-S 또는 0.1% 성장 보충제 (GS, A) 또는 MSC-S (300 μg/mL, B)와 함께 24시간 배양 이후 트랜스웰 막의 바닥면을 촬영한다. 이동된 세포는 처리 당 3개 사본에 대해 사본 당 3개의 영역에서 나열되었다. 변성: 90℃에서 10분 동안 가열하여 변성됨. 제시된 데이터는 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 사용한 평균 ± SE, ****p < 0.0001이다.
도12a 및 도 12b: MSC-S는 인간 일차 각막 상피세포의 충만한 단일층에서 상처 간격의 봉합을 개선하는 것을 나타낸다. (A) 비히클 대조군 (상단 패널) 또는 MSC-S (45 μg/mL, 하단 패널)로 처리되고, T = 0, 24 및 24시간에서 영상화된 인간 일차 각막 상피세포 단일층에서 상처 간격의 대표적인 영상을 촬영한다. 세포 단일층은 녹색으로 도시되고, 점선 (적색)은 상처 간격에 해당한다. (B) 세포를 45 μg/mL MSC-S로 48시간 동안 처리할 때, 상처 간격 봉합이 유의하게 개선되는 것을 나타낸다. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다. 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: *p < 0.001.
도　13: MSC-S가 인간 일차 각막 섬유모세포의 이동을 촉진하는 것을 나타낸다. MSC-S 또는 비히클 대조군과 함께 20시간 배양 이후 트랜스웰 막의 바닥면을 촬영한다.
도　14a 및 도 14b: MSC-S는 항-혈관형성 단백질 프로파일을 나타낸다. (A) 인간 혈관형성 어레이를 사용하여 MSC-S에서 프로-혈관형성 및 항-혈관형성 단백질 인자를 확인하였다. A에서 촬영된 번호매김 (1 내지 14)은 패널 B에서 표지된 밀도 막대 그래프에 해당한다. 항-혈관형성 인자 (검은색)는 높은 수준으로 존재하고, 프로-혈관형성 인자 (흰색)는 낮은 수준으로 존재한다. 평균 픽셀 강도는 영상 처리 소프트웨어, 이미지 J (NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 결정되었다.
도　15a 및 도 15b: MSC-S는 관형성 검정에서 항-혈관형성 성질을 나타낸다. MSC-S (40 μg/mL)의 부재 또는 존재 하에 저혈청 성장 보충물 (라이프 테크놀로지사)을 더한 100 μL의 내피세포 기본 배지 중 12,000개 세포의 매트리겔. 세포를 6시간 동안 배양하여 내피 관형성을 허용한 다음, 영상 획득 및 처리를 수행하였다. 각 조건에 대해 5회 반복하여 수행하였다. (A) 영상 패널은 MSC-S가 VEGF 양성 대조군과 비교하여 관형성을 약화시키는 것을 나타낸다. (B) MSC-S는 혈관형성 계량, 총 튜브 길이, 총 루프 및 총 분지점을 감소시킨다. 위마시스 (Wimasis) 2016을 사용하여 처리된 영상. 윔튜브: 관형성 검정 영상 분석 해법. 배포본 4.0. 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0을 사용하여 2개-미단의 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 수행하였다. 제시된 데이터는 평균 ± SE이다: **p < 0.05.
도 16: MSC-S가 TGFβ-1-유도된 각막 근섬유모세포 분화를 손상시키는 것을 나타낸다. 비히클 완충액 또는 MSC-S (10 μg/mL)의 존재 하에 TGFβ-1로 처리하여 근섬유모세포로 분화하도록 유도된 인간 일차 각막이 도시되어 있다. 24시간 후, 세포를 고정하여 핵 염료 (DAPI; 청색 채널)로 평활근 액틴 (녹색 채널)에 대해 염색하였다. 모든 치료군의 경우, 동일한 영상화 및 카메라 설정이 적용되었다.
도 17a 및 도 17b: MSC-S 처리가 상처 봉합을 가속하는 것을 나타낸다. 갈색 노르웨이 래트 (대략 150 g, 12주령)의 오른쪽 눈에 각막 알칼리 화상을 입히고, 동물을 5 μL의 비히클 (HPMC, n = 7) 또는 MSC-S (0.6 μg/mL, n= 7; 6 μg/mL, n = 7, 60 μg/mL, n = 8)로 매일 3회, 또는 6 μg/mL MSC-S (n = 8)로 매일 6회 처리하였다. 4일째 데이터는 패널 (a)에 표시된 상처 봉합 백분율 및 패널 (b)에 표시된 대표적인 플루오레세인 염색으로 나타낸다. 동물 식별 번호는 왼쪽 상단 모서리에 흰색으로 표시된다. 상처 봉합의 정도는 플루오레세인 염색을 통한 즉각적인 손상과 남은 상처 면적 사이의 차이 비율에 의해 결정하였다.
도 18a 및 도 18b: MSC-S 처리가 각막 혼탁 및 혈관신생을 유의하게 개선하는 것을 나타낸다. 5 μL의 비히클 (HPMC, n = 6) 또는 MSC-S (0.6 μg/mL, n = 6; 6 μg/mL, n = 6; 60 μg/mL, n = 6)로 매일 3회, 또는 6 μg/mL MSC-S (n = 7)로 매일 6회 10일 동안 처리된 각막 화상의 각막 혼탁 (A) 및 혈관신생 (B) 데이터를 나타낸다. 0 내지 4 척도의 각막 혼탁도. 0 = 완전히 투명함; 1 = 약간 흐릿함, 홍채와 동공이 쉽게 보임. 2 = 약간 혼탁, 홍채와 동공은 여전히 감지가능함; 3 = 혼탁, 동공이 거의 검출되지 않음; 그리고 4 = 동공이 보이지 않고 완전히 혼탁. 0 내지 4 척도의 신생혈관. 0 = 신생혈관 없음; 1 = 변연부에 있는 신생혈관; 2 = 변연부에 걸쳐 있는 신생혈관; 3 = 각막의 다른 곳에 투명한 영역이 남아 있는 각막 중심에 도달하는 신생혈관; 4 = 각막 중심을 포함하여 각막의 4개 사분면 모두에 있는 신생혈관. 데이터는 표준 오차가 있는 평균으로서 표현된다. 매개변수의 비교는 원웨이 분산 분석에 이어진 사후 본페로니 테스트를 사용하여 수행하였다. *P 값 < 0.05는 유의한 것으로 고려되었다 (미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드사의 윈도우용 그래프래드프리즘 버전 8.0.0).
도 19a 및 도 19b: 6 μg/mL의 MSC-S가 각막 손상을 개선하는데 비히클보다 현저하게 더 우수하다. 각막 알칼리 손상 유도된 래트에서 비히클 (a) 및 6 μg/mL MSC-S (b)를 10일 동안 매일 3회 국소 적용 (5 μL)하는 동안 각막 손상의 변화. 눈의 디지털 영상을 7일과 14일째 획득하여 눈의 임상적 외양을 기록하였다. 동물 식별 번호는 각 래트의 오른쪽 상단 모서리에 표시된다.
도 20: EV의 크기 분포를 나타낸다. 음영 영역은 세제 처리 이후 남은 입자로, 입자의 > 85%가 세제에 불안정한 지질 기반의 소포이다.
도 21: 일차 각막 각질형성세포 및 MSC 세크레톰을 사용한 증식 검정을 나타낸다. MSC 세크레톰은 각막 각질형성세포의 증식을 촉진한다. 일차 각막 각질형성세포를 5,000개 세포/cm2 로 접종하고, 밤새 배양하였다. 다음으로 세포를 1시간 동안 혈청 결핍시킨 다음 다양한 농도의 MSC 세크레톰으로 처리하였다. 증식은 처리 이후 최대 3일 동안 매일 CCK-8 검정 (세포 계수 키트; Dojindo Molecular Technologies)를 사용하여 모니터링하였다.
도 22: MSC 세크레톰 안정성 - 조성물을 나타낸다. MSC 세크레톰의 신선한 배치를 제조하고, 약물 원료 (제형화 완충액 중)의 안정성을 평가하였다. 분취량을 7일 또는 14일 프로그램의 일부로서 -20℃, 4℃ 또는 실온 (RT)에 보관하였다. 연구의 종료 시, 시료는 ELISA에 의해 검정하여 세르핀 E1, 세르핀 F1 및 TIMP-1을 측정하였다. MSC 세크레톰 인자는 액체 제형물에서 적어도 14일 동안 분해되지 않는다. 다수 요인의 안정성은 제형물이 광범위한 단백질 안정화를 지원함을 시사한다.
도 23: 시험관내 상처 봉합 검정을 나타낸다. 상단 패널: MSC 세크레톰은 원형 상처 부위에서 일차 각막 각질형성세포의 이동을 자극시킨다. 각막 각질형성세포의 충만한 단일층에서 원형 상처가 생성되었고, 상처 간격의 봉합을 매일 모니터링하였다. 무혈청 배지 중 100 및 50 μg/mL MSC 세크레톰은 48시간 이내에 상처를 봉합시킨다. 도시된 영상은 젠티안 바이올렛으로 염색되고, 상처 입은 2일 이후에 촬영된 상처 면적이다. 하단 패널: MSC 세크레톰은 원형 상처 부위에서 각막 상피세포의 이동을 자극시킨다. 각막 상피세포의 충만한 단일층에서 원형 상처가 생성되었고, 상처 간격의 봉합을 매일 모니터링하였다. 무혈청 배지 중 100 및 50 μg/mL MSC 세크레톰의 용량이 72시간 이내에 상처를 봉합시킨다. 도시된 영상은 젠티안 바이올렛으로 염색되고, 상처 입은 2일 이후에 촬영된 상처 면적이다.
도 24: MSC 세크레톰 안정성 - 생체활성을 나타낸다. MSC 세크레톰의 신선한 배치를 제조하고, 약물 원료 (제형화 완충액 중)의 안정성을 평가하였다. 분취량을 7일 또는 14일 프로그램의 일부로서 -20℃, 4℃ 또는 실온에 보관하였다. 연구의 종료 시, 시료는 각막 상피세포를 사용하여 원형 상처 검정으로 평가하였다. 상처 봉합을 3일 동안 매일 모니터링하였다. 참조 표준으로서, 생산 당시 급속 냉동된 약물 원료를 사용하였다. WC%는 상처 봉합 백분율을 지정하였다. MSC 세크레톰은 -20℃에서 보관되고, 4℃ 및 실온 (RT)에서 냉장될 때, 적어도 14일 동안 시험관내 상처 치유 생체활성을 유지한다. 안정성은 각막 상피세포와 섬유모세포 둘 다에서 관찰된다.
도 25: 3D 조직 모델을 나타낸다. 상처 입은 24시간 후, 상처 조직은 대조군 TEER의 10% (미처리에 비교함)를 나타내는 반면, 상처를 입은 후 MSC 세크레톰로 처리된 조직은 대조군 TEER의 55% (미처리에 비교함)를 나타낸다. 연구의 목표는 에피코니알 (EpiCorneal) 조직 모델 (매트텍사)을 사용하여 질소 머스타드 (NM)에 대한 국소 노출로 인한 각막 상피 손상에 이어진 테스트 항목 (MSC 세크레톰)의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하는 것이었다. MSC 세크레톰을 6 μg/mL (위약 용액에 희석됨)로 국소 적용하였다. 에피코니알 조직은 표준 배양 조건으로 5 mL 배지에서 24시간 동안 배양되었다.
I. 서론
본 발명은 이러한 치료에 사용되는 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물, 용도 및 관련 방법은 하기에 더 자세하게 설명된다.
A. 정의
청구범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에 기재된 바와 같이 정의된다. 모체 가특허출원에 사용된 용어와 서로 모순되는 경우, 본 명세서에 사용된 용어가 우선한다.
본원에 사용된 "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 물질을 말하고, 따라서 자연 상태에서 "사람의 손에 의해" 변경된다.
본원에 사용된 "강화된"은 원치 않는 물질을 제거하거나, 혼합물로부터 원하는 물질을 선택 및 분리함으로써 선택적으로 하나 이상의 물질을 농축시키거나, 이의 양을 증가시키는 것을 의미한다 (예로, 집단 내 세포 모두가 마커를 발현하지는 않는 이종유래 세포 집단으로부터 특이적 세포 마커가 있는 세포를 분리함).
본원에 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 특정한 마커 또는 마커의 조합에 대해 실질적으로 균질한 세포 집단을 의미한다. 실질적으로 균질함은 특정한 마커 또는 마커의 조합에 대해 적어도 90%, 바람직하게 95% 균질함을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "다능성 줄기세포"는 진정한 줄기세포이지만, 제한된 수의 유형으로만 분화할 수 있다. 예를 들어, 골수는 혈액의 모든 세포를 생성하지만 다른 세포 유형으로 분화할 수 없는 다능성 줄기세포를 포함한다.
본원에 기재된 특정 조성물, 성장 조건, 배양 배지 등을 언급할 때, 용어 "동물이 없는"은 소 혈청, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 비타민 등과 같은 비-인간 동물 유래의 물질이 특정 조성 또는 공정의 제조, 성장, 배양, 증식, 보관 또는 제형화에 사용되지 않는 것을 의미한다. "비-인간 동물 유래의 물질이 없음"은 물질이 비-인간 동물의 신체 또는 물질과 접촉하거나 접촉한 적이 없어 이종-오염되지 않은 것을 의미한다. 일반적으로, 재조합으로 생산된 인간 단백질과 같은 임상 등급 물질은 이러한 조성물 및/또는 공정의 제조, 성장, 배양, 증식, 보관 및/또는 제형화에 사용된다.
세포 조성물과 관련하여 용어 "증식된 (expanded)"은 세포 집단이 이전의 방법을 사용하여 획득된 것보다 유의하게 더 높은 농도의 세포를 구성하는 것을 의미한다. 예를 들어, AMP 세포의 증식된 조성물에서 양막 조직 그램 당 세포 수준은 이전의 방법을 사용하여 이러한 세포의 약 20배 증가와 비교하여, 5회 계대 이후 일차 배양물의 세포 수보다 적어도 50배 및 최대 150배 더 높다. 또 다른 예에서, AMP 세포의 증식된 조성물에서 양막 조직 그램 당 세포 수준은 3회 계대 이후 일차 배양물의 세포 수보다 적어도 30배 및 최대 100배 더 높다. 따라서 "증식된" 집단은 이전의 방법과 비교하여 양막 조직 그램 당 세포 수가 적어도 2배 및 최대 10배 개선된다. 용어 "증식된"은 사람이 세포 수를 늘리기 위해 개입한 상황만 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "조건화 배지 (conditioned medium)"는 특이적 세포 또는 세포 집단이 배양된 다음 제거된 배지이다. 세포가 배지에서 배양될 때, 이들은 다른 세포의 행동에 지원을 제공하거나, 영향을 줄 수 있는 세포성 인자를 분비할 수 있다. 이러한 인자는 호르몬, 사이토카인, 세포외 기질 (ECM), 단백질, 소포, 항체, 케모카인, 수용체, 저해제 및 과립을 포함하나, 이에 한정되지 않다. 세포성 인자를 포함하는 배지는 조건화 배지이다. 조건화 배지를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 US 6,372,494에 기술되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본원에 사용된 조건화 배지는 또한 조건화 배지 또는 예를 들어 MSC 세포로부터 회수 및/또는 정제되는 단백질과 같은 성분을 말한다.
본원에 사용된 용어 "중간엽 줄기세포 조성물" 또는 "MSC 조성물"은 MSC로부터 유래하고, 일부 경우에 추가의 처리를 거친 조건화 배지를 의미한다. 일부 구현예에서, "MSC 세크레톰"은 MSC로부터 유래한 미정제 조건화 배지를 말할 수 있다. 일부 구현예에서, "MSC 세크레톰"은 본원에 기재된 바와 같이 추가의 가공을 거친 이후 미정제 조건화 배지로부터 획득된 조성물을 말할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "현탁액"은 분산된 성분, 예로 사이토카인을 포함하는 액체를 의미한다. 분산된 성분은 액체에 완전히 용해되거나, 부분적으로 용해되거나, 현탁되거나, 달리 분산될 수 있다. 적합한 액체는 물, 염 및/또는 당 용액과 같은 삼투 용액, 세포 배양 배지, 및 기타 수용성 또는 비-수용성 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것, 뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시 프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산, 예로 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α 탄소와 동일한 기본 화학적 구조를 갖는 화합물, 예를 들어 호모 세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R기 (예로, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학적 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 말한다. 아미노산은 본원에서 공통적으로 공지된 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회가 권장하는 1개 문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 공통적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"아미노산 치환"은 선결정된 아미노산 서열 (출발 폴리펩티드의 아미노산 서열)에서 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기를 제 2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다. "아미노산 삽입"은 적어도 하나의 추가적인 아미노산을 선결정된 아미노산 서열 내에 혼입하는 것을 의미한다. 삽입이 보통 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어지지만, 현재의 더 큰 "펩티드 삽입"은 예로 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 최대 약 10개, 15개 또는 20개 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상기 개시된 바와 같이 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. "아미노산 결실"은 선결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기의 제거를 말한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 말하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
"핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 말한다. 달리 상세하게 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예로, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 의미상 포괄한다. 상세하게, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., Biol. Chem. 260: 2605-2608, 1985; 및 Cassol et al, 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98, 1994). 아르기닌과 류신의 경우, 두 번째 염기에서의 변형도 보존적일 수 있다. 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 인코딩된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 안정성을 위해 또는 다른 이유로 하나 이상의 변형된 염기 또는 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특별한 염기를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 이루어질 수 있고, 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세크레톰 조성물"은 세포에서 분비되는 하나 이상의 물질을 포함하는 조성물을 말한다. 특정 구현예에서, 세크레톰 조성물은 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 엑소좀 및/또는 하나 이상의 미세소포를 포함할 수 있다. 세크레톰 조성물은 정제되거나, 정제되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 세크레톰 조성물은 세포로부터 분비되지 않는 하나 이상의 물질(예로, 배양 배지, 첨가물, 영양분 등)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세크레톰 조성물은 세포로부터 분비되지 않는 미량의 하나 이상의 물질(예로, 배양 배지, 첨가물, 영양분 등)을 포함하거나, 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는" 등은 인간 또는 비-인간 포유동물 (예로, 설치류, 고양이, 개, 말, 소, 양 및 영장류 등)의 임의의 치료를 포괄하고, 질환 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 병태의 발생을 예방하는 것을 포함한다. 또한, 이것은 질환, 병태 및/또는 임의의 관련 증상을 억제 (발생의 정지), 완화 또는 개선 (퇴행 유발) 또는 치유 (발생 또는 진행을 영구적으로 중단)하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 포유동물, 구체적으로 인간의 질환 또는 병태의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질환 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 병태의 발생을 예방하는 것; (b) 질환 또는 병태의 억제, 예로 이의 발병을 정지시키는 것; (c) 질환 또는 병태의 완화 및/또는 개선, 예로 질환 또는 병태의 퇴행을 유발시키는 것; 또는 (d) 질환 또는 병태의 치유, 예로 이의 발생 또는 진행을 중단시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 대상체 집단은 원하지 않은 병태 또는 질환으로 고생하는 대상체, 뿐만 아니라 병태 또는 질환의 발병 위험이 있는 대상체를 포함한다. 일부 구현예에서, "치료" (또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정한 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 억제, 발병 지연시키고/거나, 이들의 중증도 감소 및/또는 발병 빈도를 감소시키는 요법의 임의의 투여를 말한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태로 고생하는 것으로서 진단된 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 민감성 인자를 갖는 것으로 알려된 대상체에 대한 것일 수 있다.
본원에 사용된 "상처"는 기계적 (예로, 타박상, 관통), 열적, 화학적, 전기적, 방사선, 진탕 및 절개 손상과 같은 외상성 손상; 외과 수술 및 결과적 절개 탈장, 누공 등과 같은 선별적 손상; 급성 창상, 만성 창상, 감염된 창상 및 무균 창상, 뿐만 아니라 질환 상태와 관련된 창상 (예로, 안구 타박상)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상처는 역동적이고, 치유 과정은 상처 입을 시 시작되어 안정한 상처 봉합에 도달하면서 초기 상처 봉합으로 진행되는 일련의 통합되고 상호연관된 세포성 공정을 요구하는 연속 과정이다. 이러한 세포성 공정은 사이토카인, 림포카인, 성장인자 및 호르몬을 포함하나, 이에 한정되지 않는 체액성 물질에 의해 매개되거나, 조절된다. 본 발명에 따르면, "상처 치유"는 일정 형태의 개입에 의해, 조직 복구의 자연 세포성 공정 및 체액성 물질을 개선하여 치유가 더 신속하고/거나, 생성된 치유된 영역이 흉터가 더 적고/거나, 상처 입은 영역이 손상되지 않은 조직에 가까운 조직 강도를 갖고/거나, 상처 입은 조직이 일정 정도 기능적 회복을 달성하는 것을 말한다.
본원에 사용된 용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상 또는 적어도 하나를 의미한다.
본원에 사용된 조성물의 "치료적 유효" 또는 "유효" 용량 또는 양은 주어진 의학적 병태에 긍정적인 영향을 미치기에 충분한 양이다. 즉각적이지 않은 경우, 치료적 유효 또는 유효 용량 또는 양은 일정 기간 동안 환자의 건강 및 복지에 주목할만한 또는 측정가능한 효과를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 "약제학적 조성물"은 전달 성분과 조합한 본원에 기재된 유효량의 조성물을 말한다. 약제학적 조성물은 선택적으로 약제학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있으며, 이는 대상체에게 조성물 및/또는 이의 개별 성분의 투여를 용이하게 할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 상당한 자극을 유발시키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
용어 "부형제"는 화합물의 투여를 추가로 용이하게 하도록 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다.
본원에 사용된 용어 "혼합하다 (mix)" 및 "혼합하는" 등은 구성요소의 기계적 공정 또는 기계적 처리를 설명한다. 예를 들어, 혼합은 제공된 소수성 매트릭스의 강한 압축 및 혼합을 유도하는 압축 및 폴딩 또는 비슷한 가공 단계의 반복된 주기를 수행하는 의미일 수 있다.
성체 줄기세포는 골수, 지방 및 치수 조직을 포함한 다양한 성체 조직으로부터 채취할 수 있다. 모든 성체 줄기세포는 자가 재생할 수 있고, 다능성으로 간주되지만, 치료적 기능은 기원에 따라 달라진다. 결과적으로, 각 유형의 성체 줄기세포는 특정 질환에 적합하게 만드는 독특한 특징을 갖는다. 중간엽 줄기세포 (MSC)는 전형적으로 중배엽으로부터 유래하고 조골세포 (예로, 뼈 세포), 연골세포 (예로, 연골 세포), 근세포 (예로, 근육 세포) 및 지방세포 (예로, 골수 지방 조직을 발생시키는 지방 세포)를 포함한, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 세포로부터 단리된 (이로부터 유래한) 다능성, 비-조혈 (비-혈액) 줄기세포이다. 본원에 사용된 "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 세포를 말한다. 줄기세포는 다수의 생물학적 공정을 조절하거나 조절하는데 중요한 성장인자와 같은 인자를 생산한다. 성장인자는 세포 성장 및/또는 증식 및/또는 세포성 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질과 같은 제제이다. 전형적으로, 성장인자는 단백질 또는 스테로이드 호르몬이다. 용어 "성장인자" 및 "인자" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 한편, 용어 "생물학적 인자"는 성장인자에 한정되지 않는다.
인간 중간엽 줄기세포 (MSC)는 CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+/CD44+ (또는 이들의 임의의 적합한 하위세트)의 표면 마커 프로파일에 의해 특성화될 수 있다. (Bourin et al., Cytotherapy 15(6): 641-648 (2013) 참조). 또한, 적절한 줄기세포는 단리 시 CD34+ 양성을 나타내지만, 배양 중에 이 마커를 상실한다. 따라서, 본 출원에 따라 사용될 수 있는 하나의 줄기세포 유형에 대한 전체 마커 프로파일은 CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+를 포함한다. 마우스 줄기세포를 이용하는 또 다른 구현예에서, 줄기세포는 CD34 대신에 Sca-1 마커에 의해 특성화되어, 동일하게 남아 있는 나머지 마커로 상기에 기재된 인간 세포의 상동체로 보이는 것을 정의한다.
문구 "조건화 배지" 또는 "CM"은 MSC에 의해 분비되는 생물학적 인자를 포함하는 배지를 말한다. 이것은 본원에서 "세크레톰", "MSC-CM", "MSC 세크레톰" 및/또는 "MSC 유래 세크레톰"으로도 지칭될 수 있다. 또한, MSC에 의해 분비된 생물학적 인자를 포함하고, 예를 들어 여과, 정제 및/또는 농축 절차에 의해 추가로 처리되었던 가공된 "조건화 배지"가 제공된다. "조건화 배지"는 본원에 자세하게 설명된 바와 같이 배지에서 줄기세포를 배양하고, 줄기세포 및 이들의 분비된 줄기세포 산물 (세크레톰)을 포함하는 생성된 배지를, 생물학적 인자 및 분리 이전에 존재한 것보다 더 적은 수의 줄기세포를 포함하는 조건화 배지로 분리시킴으로써 획득된다. 조건화 배지는 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있고 실질적으로 줄기세포가 없거나 (소량의 줄기세포를 포함할 수 있음), 줄기세포가 없다. 조건화 배지에 있을 수 있는 생물학적 인자는 단백질 (예로, 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 효소), 핵산 (예로, miRNA), 지질 (예로, 인지질), 다당류 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 생물학적 인자의 임의의 조합(들)은 세포외 소포 (예로, 엑소좀)의 내부 또는 표면 상에 결합되거나, 세포외 소포로부터 분리될 수 있다.
B. 조성물 및 제형물
본 설명에 따르면, 본원에서는 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰은 포함하는 조건화 배지 및/또는 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 (가공된 MSC 세크레톰을 포함함)를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 일반적으로 혈관형성 인자에 대해 낮다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 다른 세크레톰과 비교하여 혈관형성의 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 또 다른 세크레톰과 비교하여 혈관형성에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰으로 가공하기 이전의 조건화 배지와 비교하여 혈관 형성에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 낮은 혈관형성을 유도한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 지원하는 배지의 존재 하에 혈관의 정상적인 형성을 손상 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 처리되지 않은 대조군과 비교할 때 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈청 포함하는 배지로 처리된 시료과 비교하여 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 반응을 약화시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈청 포함하는 배지에 의해 유도된 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 세크레톰을 더한 혈청 포함하는 배지 (혈관형성 반응의 감소 또는 없음)를 혈청 포함하는 배지 (혈관형성 반응)와 비교할 때, 혈관형성 반응의 감소가 MSC 세크레톰에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 세포 기반의 검정법에서 관형성에 의해 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 내피세포 관형성 검정에서 관형성에 의해 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 CAM (닭 융모막요막) 검정에서 혈관 형성에 의해 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 당업계에 공지된 임의의 혈관 형성 검정에서 혈관 형성에 의해 나타낸다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은
(i) IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성;
(ii) HGF, FGF-7, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및/또는 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인에 대한 "한계치" ppm 수준;
(iii) sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및 HO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자에 대한 "한계치" ppm 수준; 및
(iv) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자에 대한 "한계치" ppm 수준
을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은
(i) 약 250 μM 미만의 IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성;
(ii) HGF, FGF-7, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및/또는 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(iii) sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및/또는 HO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iv) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및/또는 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함한다.
중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은
(i) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(ii) PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iii) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및/또는 IFNγ를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 세린 프로테아제 저해제를 포함하는 세르핀 패밀리 구성원: 세르핀 F1, 세르핀 E1, 세르핀 A1, 세르핀 G1, 세르핀 H1, 세르핀 B6, 세르핀 E2, 세르핀 A3, 세르핀 C1, 세르핀 F2, 세르핀 I1, 세르핀 B1, 세르핀 B7, 세르핀 D1, 세르핀 B3, 세르핀 B8, 세르핀 B2, 세르핀 B12, 세르핀 A7, 세르핀 A4 및/또는 세르핀 A6를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 조성물은 세르핀 F1 (PEDF로도 지칭됨), 세르핀 E1, 및 세르핀 A1을 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 세르핀 F1 (PEDF로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 세르핀 E1을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 세르핀 A1을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 항산화에 관여하는 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 카탈라제, 단백질 디설파이드-이소머라제, 단백질 디설파이드-이소머라제 A3, 단백질 디설파이드-이소머라제 A4, 단백질 디설파이드-이소머라제 A6, 퍼옥시레독신-6, 퍼옥시레독신-1, 퍼옥시레독신-2 및/또는 퍼옥시레독신-4를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 카탈라제를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 단백질 디설파이드-이소머라제를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 단백질 디설파이드-이소머라제 A3를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 단백질 디설파이드 이소머라제 A4를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 단백질 디설파이드-이소머라제 A6을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 퍼옥시레독신-6을 포함한다.　일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 퍼옥시레독신-1을 포함한다.　일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 조성물은 퍼옥시레독신-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 조성물은 퍼옥시레독신-4를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 기질 금속프로테아제를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 MMP2, MMP1 및/또는 MMP14를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 MMP2를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 MMP1을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 MMP14를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 가용성 스캐빈저 수용체 시스테인-강화 도메인 포함하는 단백질 SSC5D, 종양 괴사인자 유도성 유전자 6 단백질 (일명 TSG-6), 혈청 알부민 및 다양한 이소형, LTGFBP-2, LTGFBP-3 및 LTGFBP-4를 포함한 잠복성 형질전화 성장인자 결합 단백질 (LTGFBP-1)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 안지를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 가용성 스캐빈저 수용체 시스테인-강화 도메인 포함하는 단백질 SSC5D를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 종양 괴사인자 유도성 유전자 6 단백질 (일명 TSG-6)을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 혈청 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 LTGFBP-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 LTGFBP-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 LTGFBP-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 LTGFBP-4를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 펜타트락신-3, TIMP-1, 세르핀 E1, TSP-1 및 HGF를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 2 ng/mL 내지 16 ng/mL, 또는 9.8 +/- 0.5 ng/mL 펜트락신-3을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 10 ng/mL 내지 200 ng/mL, 또는 90 +/- 21.5 ng/mL TIMP-1을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 49.2+/- 9.8 ng/mL 세르핀 E1을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 조성물은 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 또는 2.0 +/- 0.3 ng/mL HGF를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 100 pg/mL 내지 800 pg/mL, 또는 304 +/- 44 pg/mL VEGF를 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물은 0.1 pg/mL 내지 100 pg/mL, 또는 < 1 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 약 250 μM 미만이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 0 μM 내지 약 250 μM이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 50 μM 내지 약 250 μM L-카인우레닌/백만 MSC이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 50 μM 내지 약 200 μM L-키누레닌/백만 MSC이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 100 μM 내지 약 250 μM L-키누레닌/백만개 MSC이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 100 μM 내지 약 200 μM L-키누레닌/백만개 MSC이다. 일부 구현예에서, IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성은 약 0 μM, 약 10 μM, 약 20 μM, 약 30 μM, 약 40 μM, 약 50 μM, 약 60 μM, 약 70 μM, 약 80 μM, 약 90 μM, 약 100 μM, 약 110 μM, 약 120 μM, 약 130 μM, 약 140 μM, 약 150 μM, 약 160 μM, 약 170 μM, 약 180 μM, 약 190 μM, 약 200 μM, 약 210 μM, 약 220 μM, 약 230 μM, 약 240 μM, 또는 약 250 μM L-키누레닌/백만개 MSC이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및/또는 HO-1을 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 추가적인 인자에 대한 "한계치" ppm 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및 HO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자에 대한 "한계치" ppm 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 하나의 추가적인 인자를 200 pg/mL 내지 5,000 pg/mL의 농도 범위로 추가로 포함하고, 하나의 추가적인 인자는 sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및/또는 HO-1을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 1,000 pg/mL 내지 3,000 pg/mL의 sFLT-1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 400 pg/mL 내지 800 pg/mL의 TSG-6을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 8,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 7,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 6,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 5,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 4,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 2,000 pg/mL 내지 3,000 pg/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 150 ng/mL 내지 300 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 200 ng/mL 내지 300 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 200 ng/mL 내지 275 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 225 ng/mL 내지 275 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 150 ng/mL 내지 300 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 273 ± 27 ng/mL의 PEDF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "더 높은" 수준으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 세르핀 E1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 세르핀 A1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 TIMP-1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 트롬보스폰딘-1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 펜트락신-3 (TSG-14)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 혈소판인자 4를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "더 높은" 수준의 세르핀 F1을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 20 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 2 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 3 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 4 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 5 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 6 ng/mL 내지 8 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 2 ng/mL 내지 7 ng/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), IGFBP-3 및/또는 uPA를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 인자를 "중간 수준"으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "중간" 수준으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "중간" 수준으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 약 200 pg/mL 내지 약 800 pg/mL로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 약 200 pg/mL 내지 약 700 pg/mL, 약 300 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 200 pg/mL 내지 약 500 pg/mL 또는 약 300 pg/mL 내지 약 500 pg/mL로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 약 200 pg/mL, 약 300 pg/mL, 약 400 pg/mL, 약 500 pg/mL, 약 600 pg/mL, 약 700 pg/mL 또는 약 800 pg/mL로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 300 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 200 pg/mL 내지 약 500 pg/mL 또는 약 300 pg/mL 내지 약 500 pg/mL의 안지오게닌을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 300 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 200 pg/mL 내지 약 500 pg/mL 또는 약 300 pg/mL 내지 약 500 pg/mL의 DPPIV를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 300 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 200 pg/mL 내지 약 500 pg/mL 또는 약 300 pg/mL 내지 약 500 pg/mL의 IGFBP-3을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 300 pg/mL 내지 약 800 pg/mL, 약 200 pg/mL 내지 약 500 pg/mL 또는 약 300 pg/mL 내지 약 500 pg/mL의 uPA를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 "낮은" 수준의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 1 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 10 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 20 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 30 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 40 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 50 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 60 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 70 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 80 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 90 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 125 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 175 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 1 pg/mL 내지 약 400 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 10 pg/mL 내지 약 400 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 50 pg/mL 내지 약 350 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 50 pg/mL 내지 약 300 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 10 pg/mL 내지 약 300 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 100 pg/mL 내지 약 300 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 200 pg/mL 미만의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 200 pg/mL 미만의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 0 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 0 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 10 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 20 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 30 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 40 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 50 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 60 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 70 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 80 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 90 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 100 pg/mL 내지 약 200 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 10 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 20 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 30 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 40 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 50 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 60 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 70 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 80 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 90 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 100 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 10 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 20 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 30 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 40 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 50 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 60 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 70 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 80 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 90 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 100 pg/mL 내지 약 100 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다.
MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 6배 내지 10배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 7배 내지 10배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 8배 내지 10배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 9배 내지 10배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 6배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 7배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 8배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 9배 더 낮다. MSC 세크레톰 조성물의 일부 구현예에서 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 10배 더 낮다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및/또는 PDGF를 약 200 pg/mL 미만, 약 150 pg/mL 미만, 약 100 pg/mL 미만, 약 75 pg/mL 미만, 약 50 pg/mL 미만 또는 약 25 pg/mL 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및/또는 PDGF를 약 200 pg/mL 미만, 약 150 pg/mL 미만, 약 100 pg/mL 미만, 약 75 pg/mL 미만, 약 50 pg/mL 미만 및 약 25 pg/mL 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및/또는 PDGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 미만, 약 150 pg/mL 미만, 약 100 pg/mL 미만, 약 75 pg/mL 미만, 약 50 pg/mL 미만 및 약 25 pg/mL 미만의 bFGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 미만, 약 150 pg/mL 미만, 약 100 pg/mL 미만, 약 75 pg/mL 미만, 약 50 pg/mL 미만 및 약 25 pg/mL 미만의 PLGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 PLGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 200 pg/mL 미만, 약 150 pg/mL 미만, 약 100 pg/mL 미만, 약 75 pg/mL 미만, 약 50 pg/mL 미만 및 약 25 pg/mL 미만의 PDGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 PDGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 bFGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 PLGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 PDGF를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매우 낮은 수준의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매우 낮은 수준의 bFGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매우 낮은 수준의 PLGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매우 낮은 수준의 PDGF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및/또는 IFNγ를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 "더 높은" 수준으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 20 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 20 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 20 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 20 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 30 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 30 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 30 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 30 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 4 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 40 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 40 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 40 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 50 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 50 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 50 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 50 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 60 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 60 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 60 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 60 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 70 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 70 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 70 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 70 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 80 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 80 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 80 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 80 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 90 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 90 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 90 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 90 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 100 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 100 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 100 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 110 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 110 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 110 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 120 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 120 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 120 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 130 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 130 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 130 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 140 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 140 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 140 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 150 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 150 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 150 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 160 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 160 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 160 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 170 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 170 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 170 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 180 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 180 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 180 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 190 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 190 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 190 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 200 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 200 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 210 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 210 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 220 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 220 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 230 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 230 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 240 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 240 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 250 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 250 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 260 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 260 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 270 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 270 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 280 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 280 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 290 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 290 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 310 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 320 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 330 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 340 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 350 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 360 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 370 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 380 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 390 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 90 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 80 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 20 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 30 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 40 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 50 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 70 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 60 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 10 ng/mL 내지 50 ng/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
(ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
(iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
(v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 1.5 ng/mL 내지 3.5 ng/mL HGF;
(ii) 5 ng/mL 내지 15 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 200 pg/mL 내지 400 pg/mL VEGF;
(iv) 50 ng/mL 내지 120 ng/mL TIMP-1;
(v) 30 ng/mL 내지 70 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 3 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 1.5 ng/mL 내지 2.5 ng/mL HGF;
(ii) 8 ng/mL 내지 12 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 250 pg/mL 내지 350 pg/mL VEGF;
(iv) 70 ng/mL 내지 110 ng/mL TIMP-1;
(v) 30 ng/mL 내지 70 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 2 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은
(i) 2.0 +/- 0.3 ng/mL HGF;
(ii) 9.8 +/- 0.5 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 304 +/- 44 pg/mL VEGF;
(iv) 90 +/- 20 ng/mL TIMP-1;
(v) 49.2 +/- 10 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 1 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.5 내지 약 8에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.8에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 5.0 내지 약 7.5에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 5.5 내지 약 7.5에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 6 내지 약 7.5에서 제형화된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.4, 약 pH 8.0에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0에서 제형화된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 특정 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세포성 배지에서 발견되는 특정 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분 (예로, 동물 혈청); 페놀 레드; 펩티드 및 생체분자 < 3kDa; 항생제; 단백질 응집물 (예로, 단백질 응집물 > 200 nm); 세포; 세포 잔재물 (세포 잔재물은 엑소좀/세포외 소포 (EV)를 포함하지 않음, 예를 들어, 비-엑소좀, 비-EV 세포 잔재물); 호르몬 (예를 들어, 호르몬은 인슐린 및/또는 히드로코르티손을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 및/또는 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 페놀 레드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 3 kDa 미만의 펩티드 및 생체분자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 항생제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 단백질 응집물 (예를 들어, 단백질 응집물 > 200 nm)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 세포 잔재물 (세포 잔재물은 엑소좀/EV를 포함하지 않음; 예를 들어, 비-엑소좀, 비-EV 세포 잔재물)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 호르몬 (예를 들어, 호르몬은 인슐린 및/또는 히드로코르티손을 포함하나, 이에 한정되지 않음)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 L-글루타민을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 만니톨, 락토스, 소르비톨, 자일리톨, 슈크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 포도당, 라피노스, 셀로바이오스, 겐티오바이오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 과당 및/또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 포스페이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 소듐 포스페이트 또는 포타슘 포스페이트이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 소듐 포스페이트이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 포타슘 포스페이트이다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 글리신, 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 덱스트로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 글리신, 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨 및 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 글리신, 글리세롤 및 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및/또는 시트르산/디소듐 포스페이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및/또는 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 소듐 시트레이트/시트르산 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 붕산/소듐 시트레이트 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 붕산/소듐 테트라보레이트 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 시트르산/디소듐 포스페이트 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 소듐 포스페이트 또는 포타슘 포스페이트이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 소듐 포스페이트이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 포타슘 포스페이트이다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 디소듐포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 조절제 또는 긴장성 개질제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 긴장성 조절제 또는 긴장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및/또는 글리세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 등장성 조절제 또는 등장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및/또는 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 접착제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), HEC, 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아를 포함하나, 이에 한정되지 않는 접착제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스이다. 일부 구현예에서, 접착제는 피브린 글루이다. 일부 구현예에서, 접착제는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 접착제는 젤코아이다 (Sani, et al., Science Advances, Vol. 5, No. 3 (2019) 참조).
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 (a) 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 MSC 세크레톰을 포함하는 가공된 조건화 배지; 및 (b) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 생산되는 MSC 세크레톰 및 중합체를 포함하는 조건화 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 생산되는 MSC 세크레톰 및 중합체를 포함하는 가공된 조건화 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 MSC 세크레톰 및/또는 가공된 MSC 세크레톰 성분이 방출될 수 있는 생분해성 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 MSC 세크레톰 성분의 지속적인 (느린) 방출을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 MSC 세크레톰 조성물은 치료용 붕대의 형태 (예로, MSC 세크레톰 조성물이 함침된 중합체)이다. 치료용 붕대는 용도에 따라 필요한 바와 같이 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 붕대는 패치 형태이거나, 메쉬 형태로 구성된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생체 투과성, 예를 들어 안구 침투, 각막 침투 및/또는 각막 투과를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 눈에 의해 흡수되는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 고유한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 부형제-유도 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 더 작은 인자의 상향조절로 인한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생물보존제의 존재로 인한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 생물보존제 염화 벤즈알코늄의 존재로 인한 생체 투과성을 나타낸다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 다른 치료와 비교하여 긴 반감기를 나타내고/거나, 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 MSC 세크레톰 조성물은 MSC 세크레톰의 안정성을 증가시키는 단백질의 상향조절을 허용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 MSC 세크레톰 조성물은 샤페론 단백질을 상향조절을 허용하여 MSC 세크레톰에서 다른 단백질의 안정성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 초효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매일 한 방울 또는 1회 투여로 치료적 효능을 허용한다.
C. 생산/제조 방법
본 발명에 따르면, 조건화 배지 (및 이와 같은 중간엽 줄기세포 분비인자)는 치료될 환자 또는 개인 (이를 필요로 하는 환자)으로부터, 또는 또 다른 (기증자) 개인, 예컨대 젊고/거나 건강한 기증자로부터 획득한 중간엽 줄기세포로부터, 및/또는 시판되는 중간엽 줄기세포로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 치료될 개인으로부터 (자가유래 줄기세포) 또는 기증자 (동종이계 줄기세포)로부터 획득한 MSC를 사용하여 본원에 기술된 조건화 배지를 생산할 수 있으며, 이는 다음으로 기술된 바와 같은 MSC 세크레톰 조성물로 추가로 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC는 또한 시판 공급업체로부터 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, 시판 공급된 MSC는 MSC 세크레톰 생산에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항-혈관형성 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 제조하는 방법으로서,
(i) 제 1 배양 배지에서 중간엽 줄기세포 (MSC)를 배양하는 단계;
(ii) 단계 (i)로부터의 제 1 배양 배지를 MSC로부터 제거하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서의 MSC를 세척하는 단계;
(iv) 제 2 배양 배지를 첨가하여 약 1일 내지 5일 동안 배양하는 단계;
(v) 단계 (iv)로부터의 제 2 배양 배지를 조정된 배지로서 수확하는 단계; 및
(vi) 본원에 설명된 바와 같이 단계 (v)에서의 조건화 배지를 MSC 세크레톰 조성물로 가공하는 단계
를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 배양하는 단계는 세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 줄기세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 배지 혼합 기술학을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 PBS 버티칼 휠TM 혼합 기술학을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, (vi) 단계 (v)에서의 조건화 배지를 MSC 세크레톰 조성물로 가공하는 단계는
(a) 단계 (v)로부터의 수확된 조건화 배지를 여과하여 세포 미립자를 제거하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 여과된 조건화 배지를 농축시키는 단계; 및
(c) 제형화 완충액으로 완충액 교환하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템으로 완충액 교환하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터, 0.22 μm 필터, 0.8 μm 필터 및 0.65 μm 필터, 낮은 단백질 결합 PVDF 막 및/또는 PES (폴리에테르설폰)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.22 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.8 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.65 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 낮은 단백질 결합 PVDF 막의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 PES (폴리에테르설폰)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터, 접면 유동 여과 시스템 또는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터 기법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 접선 유동 여과 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 3 내지 10 kDa MW 컷오프를 채용한다. 일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 적어도 3 kDa MW 컷오프, 적어도 4 kDa MW 컷오프, 적어도 5 kDa MW 컷오프, 적어도 6 kDa MW 컷오프, 적어도 7 kDa MW 컷오프, 적어도 8 kDa MW 컷오프, 적어도 9 kDa MW 컷오프, 적어도 10 kDa MW 컷오프, 적어도 11 kDa MW 컷오프, 적어도 12 kDa MW 컷오프, 적어도 13 kDa MW 컷오프, 적어도 14 kDa MW 컷오프, 적어도 15 kDa MW 컷오프, 적어도 16 kDa MW 컷오프, 적어도 17 kDa MW 컷오프, 적어도 18 kDa MW 컷오프, 적어도 19 kDa MW 컷오프, 적어도 20 kDa MW 컷오프, 적어도 21 kDa MW 컷오프, 적어도 22 kDa MW 컷오프, 적어도 23 kDa MW 컷오프, 적어도 24 kDa MW 컷오프, 적어도 25 kDa MW 컷오프, 적어도 26 kDa MW 컷오프, 적어도 27 kDa MW 컷오프, 적어도 28 kDa MW 컷오프, 적어도 29 kDa MW 컷오프 및/또는 적어도 30 kDa MW 컷오프를 채용한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 본원에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물을 생산한다. 일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 배양 배지는 MSC 배지 및/또는 MSC-XF이다.
MSC 또는 MSC로부터 분화된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 원하는 사이토카인 및/또는 원하는 치료 특성을 포함하는 원하는 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 생산하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 세크레톰은 슈퍼 기증자 세포주의 MSC에서 생산될 수 있다. 또한, 세크레톰은 시판되는 MSC로부터 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 MSC (및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 동종이계 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 큰 집단의 개인을 위해 제조 및 보관될 수 있다. 동종이계 MSC (및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 사람들이 필요할 때 준비될 수 있도록 미리 만들어질 수 있다. 특정 구현예에서, MSC (및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 더욱 농축된 용액 또는 조성물 (예로, 본원에 기재된 바와 같은 중간엽 줄기세포 유래의 세크레톰 조성물 또는 MSC 세크레톰 조성물)을 제조하도록 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 초기 배양 배지 및 제 1 배양 배지는 상이하다. 일부 구현예에서, 초기 배양 배지 및 제 1 배양 배지는 동일하다. 본 발명에 따른 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 생산하도록 MSC를 배양하는 데 유용한 세포 배양 배지 또는 배지의 비-제한적인 예는 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, 윌리암 G, 뉴먼과 타이텔, 히구치, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153를 포함하여, 특히 hMSC 배지 부스터 XFM, hMSC 고성능 기본 배지, 최소 필수 이글 배지 (MEME), ADC-1, LPM (소 혈청 알부민 없음), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(피톤-잭슨 변형이 있거나 없음), 스템프로, MSC글로, 메센컬트, 뉴트리스템, 기본 이글 배지 (얼 염 염기를 첨가한 BME), 둘베코 변형된 이글 배지 (혈청이 있거나 없는 DMEM), Yamane, IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지 (GMEM), 레이보비츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 M199 (얼 염 염기가 있는 M199E), 배지 M199 (행크 염 염기가 있는 M199H), 최소 필수 알파 배지 (MEM-알파), 최소 필수 이글 배지 (얼 염 염기가 있는 MEM-E), 최소 필수 이글 배지 (행크 염 염기가 있는 MEM-H) 및 최소 필수 이글 배지 (비-필수 아미노산이 있는 MEM-NAA)를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 배지는 MEM-알파이다. 이들 및 기타 유용한 배지는 특히 미국 뉴욕 그랜드아일랜드, 집코사 및 이스라엘 베트 하에멕, 바이오로지칼 인더스트리스사로부터 입수가능하다. 이러한 배지 중 다수는 아카데믹 출판사가 발행한 Methods in Enzymology, Volume LVⅢ, "Cell Culture", pp. 62 72, William B. Jakoby and Ira H. Pastan 편집본에 정리되어 있다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 혈청이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 인간 혈소판 용해물이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청은 소태아 혈청 (FBS)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는소 또는 다른 종의 태아 혈청과 같은 혈청이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 메르캅토에탄올 및/또는 항생제와 같은 기타 성분이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포용 세포 배양 배지에는 항생제가 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 산소 백분율은 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 변화된다. 일부 구현예에서, 산소는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 부피이다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 산소 분압 하에 성장시킨다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 낮은 산소 분압 하에 성장시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 생물학적 인자를 포함하는 조건화 배지(CM)에 관한 것으로, 이는 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지로 지칭될 수 있다. 조건화 배지는 본원에 기재된 바와 같이 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하고, 중간엽 줄기세포 및 이들의 분비된 중간엽 줄기세포 산물 (생물학적 인자 및/또는 세크레톰로 지칭됨)을 포함하는 생성된 배지를 분리함으로써 회득될 수 있다. 조건화 배지의 성분 일부에는 조건화 배지에서 성장한 세크레톰 및 중간엽 줄기세포를 포함한다. 일단 분리된 조건화 배지는 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하고, 본원에 기재된 방법에 따라 추가로 가공 및/또는 사용될 수 있으며, 중간엽 줄기세포가 실질적으로 없거나 (소량의 줄기세포 및/또는 미량의 줄기세포를 포함할 수 있음), 중간엽 줄기세포가 없다. MSC 세크레톰은 호르몬, 사이토카인, 세포외 기질, 단백질, 소포, 항체, 케모카인, 수용체, 저해제 및 과립을 포함하여 다양한 생물학적 인자로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지 또는 배지들 (CM 또는 MSC 세크레톰을 포함한 조건화 배지들)은 농축된 조건화 배지 (pCM 또는 농축된 MSC 세크레톰)를 생산하도록 추가로 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 또는 농축된 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지는 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하고, 중간엽 줄기세포가 배양된 배양 배지를 교환함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 생성된 조건화 배지는 수확 (수집)된 다음, 농축된 MSC 세크레톰을 생산하도록 가공된다. 특정 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지의 가공 단계는 배지의 일부, 대부분 또는 필수적으로 모두의 제거, 또는 조건화 배지의 선별된 성분의 일부, 대부분 또는 필수적으로 모두의 제거를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지는 여과되어 농축된 MSC 세크레톰을 생산한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지는 한외여과되어 농축된 MSC 세크레톰을 생산한다.
일 양태에서, 본원에서는 가공된 조건화 배지를 생산하는 방법으로서, (a) 세포 배양 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 인자를 포함하는 조건화 배지 (예로, 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함한 조건화 배지)를 생성하는 단계; (b) 조건화 배지를 수확함으로써 수확된 조건화배지 (예로, 수확된 중간엽 줄기세포 세크레톰)를 생산하는 단계; 및 (c) 수확된 조건화 배지 (예로, 수확된 중간엽 줄기세포 세크레톰)를 여과하여 가공된 조건화 배지 (중간엽 줄기세포 세크레톰)를 생산하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 줄기세포는 성장인자가 없는 배지에서 배양되기 이전에 성장 배지에서 배양된다 (배양되었다). 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 제 1 성장 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 제 1 성장 배지를 제 2 성장 배지로 교환하고, 제 2 성장 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 생성하는 단계; (c) 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 수확함으로써 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지를 생산하는 단계; 및 (d) 수확된 조건화 배지를 여과하여 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 가공된 조건화 배지를 생산하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포 (MSC)는 골수 및 지방 조직을 포함한 다양한 성인 조직으로부터 단리된 (유래한) 다능성 (모든 세포 계열은 아니지만 다수의 세포 계열로 분화할 수 있음), 비-조혈 (비-혈액) 줄기세포이다. 특정 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 골수로부터 단리된다. "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 세포를 말한다. MSC는 중배엽 계열의 세포, 예를 들어 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화할 수 있다. MSC는 길고 얇은 세포 돌기가 거의 없는 작은 세포체를 갖는다. 세포체는 미세하게 분산된 크로마틴 입자로 둘러싸인 두드러진 핵소체와 함께 크고 둥근 핵을 포함하고 있어, 핵이 분명하게 보인다. 세포체의 잔여 부분에는 소량의 골지체, 거친 세포질세망, 미토콘드리아 및 폴리리보좀을 포함한다. 가늘고 긴 세포는 널리 분산되어 있으며, 인접한 세포외 기질은 소수의 망상 섬유소로 충전되지만 다른 유형의 콜라겐 섬유소는 없다 [Brighton, et al., 1991 The Journal of Bone and Joint Surgery 73(6): 832-47]. 본원에 기재된 MSC는 하기 분자 마커 (세포 또는 세포 유형의 원형질막의 단백질 분자 특징) 프로파일: 뼈 형태형성 단백질 수용체"1" (BMPR+); CD34+Scal+Lin"; CD44+; c-kit+; Sca-1+; Thy-1+; NOTCH3; JAG1; ITGA11를 발현할 수 있다. 또한, MSC는 다른 세포 유형의 특이적 마커를 발현할 수 있다 (본원에 참고문헌으로 통합되는, 월드와이드 웹 stemcells.nih.gov; Kaltz, et al. 2010 Exp. Cell Res. 10월 1일; 316(16): 2609-17 참조). 본원에 기술된 MSC는 MSC의 다능성 분화 잠재력 (MSC가 발생시키는 세포 유형)을 검출하도록 콜로니 형성 유닛 검정을 기초로 하여 확인될 수 있다. 그러나, 다소간 분화된 세포 (전구체 세포)도 사용할 수 있다.
i. MSC 세크레톰 - 가공
본원에 기재된 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지는 일부 구현예에서 수집 및 여과 및/또는 정제하여 세포 미립자 및/또는 기타 유해한 성분을 제거할 수 있다. 예를 들어, 단계 (v)에서 상기 기재된 바와 같이, 단계 (iv)로부터의 제 2 배양 배지를 조건화 배지로서 수확한다. 본원에 사용된 여과막은 세포 미립자 및/또는 기타 유해한 성분이 통과하는 것을 허용하면서 원하는 MSC 분비 성분을 보유할 수 있도록 적합한 막 및 입체구조를 갖는 당업계에 공지된 임의의 여과막으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 선택된 유체 역학 조건 하에서 세포의 보유를 허용하는 한편 유해한 성분을 통과시켜 제거하는 임의의 적합한 막을 활용할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 5 마이크론의 공극 크기의 상한 및 약 0.1 마이크론의 하한이 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 여과는 미세공극 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.5 μm 내지 0.2 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.5 μm, 0.45 μm, 0.4 μm, 0.35 μm, 0.3 μm, 0.25 μm, 0.22 μm 및/또는 0.2 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.45 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.22 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과/정제는 낮은 단백질 결합 폴리비닐리덴 이불화물 (PVDF) 막을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과/정제는 폴리에테르설폰 (PES)을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 여과는 한외여과에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 3 kD의 필터 크기를 사용하여 (가공된 조건화 배지에서 필터 크기보다 큰 분자의 정제, 탈염 및 농축을 달성하도록) 여과된다. 일부 구현예에서, 3 kD 미만의 필터 크기가 조건화 배지를 여과하는데 사용되는 반면, 다른 구현예에서는 가공된 조건화 배지가 사용되는 적용에 따라 3 kD보다 큰 필터 크기가 사용된다. 다른 구현예에서, 수확된 조건화 배지의 한외여과는 생성되어 가공된 MSC 세크레톰을 포함한 조건화 배지의 성분 크기를 결정하도록 선별된 상이한 공극 크기 (예로, 2 kD, < 2 kD 또는 > 2 kD)의 필터를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 성장 지원 배지 내의 유해한 성분은 배지 교환에 의해, 바람직하게 "교차 흐름 여과"를 통해 제거된다. 교차 흐름 여과는 MSC 세크레톰 세포의 현탁액이 세포 이외의 현탁액 성분에 대해 투과가능한 필터와 실질적으로 나란히 흐르는 여과 방식을 의미한다. 교차 흐름 여과 공정은 Re = 레이놀즈 수, γw = 벽 전단율, △P = 압력 강하 및 TMP = 막통과 압력을 포함하는 유체 역학 매개변수 세트에 의해 특성화된다. Re, γw 및 △P는 여과 시스템의 기하학, 흐름 조건 및 유체 성질에 의존할 것이다. 이러한 교차 흐름 공정은 일부 구현예에서, 중공 섬유 여과 시스템도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 5,053,334 참조.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 여과 없이 및/또는 여과 이후에 추가로 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 중공 섬유 접선 유동 기술학을 사용하여 농축될 수 있다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하여 농축될 수 있으며, 예를 들어 아미콘 및/또는 센트리콘이 원심분리 단계 동안 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 크기 컷오프는 3 내지 10 kDa MW 컷오프이다. 일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법의 농축 방법 동안 사용되는 분자량 컷오프는 적어도 약 3 kDa, 적어도 약 4 kDa, 적어도 약 5 kDa, 적어도 약 6 kDa, 적어도 약 7 kDa, 적어도 약 8 kDa, 적어도 약 9 kDa 또는 적어도 약 10 kDa이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배 또는 약 100배 농축된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 농축 이전의 조건화 배지와 비교하여 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배 또는 약 100배 농축된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 농축 단계 이후에 최종 제형물 완충액으로 추가로 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 농축 단계 이후에 접착제 없이 최종 제형물 완충액으로 추가로 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, 완충액 교환은 MSC 세크레톰의 완충액 성분을 변경하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 완충액 교환 단계 동안 희석되지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 완충액 교환 단계 동안 1% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만 또는 25% 미만으로 희석된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 미량의 배양 배지 성분이 모두 제거되도록 농축 단계 이후에 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만 또는 약 0%의 배양 배지 성분이 남도록 농축 단계 이후에 완충액 교환된다.
ii. MSC 세크레톰 - 제형화
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰 mL 당 약 2 μg 내지 20 μg을 포함하는 제형물으로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰 mL 당 약 0.004 % 내지 0.0375%를 포함하는 제형물으로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰 mL 당 약 2 μg 내지 8 μg을 포함하는 제형물으로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰 mL 당 약 0.008 % 내지 0.015%를 포함하는 제형물으로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 일염기성 소듐 포스페이트 mL 당 2 mg 내지 3 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 일염기성 소듐 포스페이트 mL 당 4% 내지 5%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 이염기성 소듐 포스페이트 mL 당 11 mg 내지 12 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 이염기성 소듐 포스페이트 mL 당 약 21.5 % 내지 23%를 포함하는 제형물으로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 만니톨 mL 당 11.5 mg 내지 13 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 만니톨 mL 당 23% 내지 25%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 트레할로스 이수화물 mL 당 23 mg 내지 25 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 트레할로스 이수화물 mL 당 46% 내지 48%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 하이프로멜로스를 포함하지 않는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 하이프로멜로스를 mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 하이프로멜로스를 mL 당 1% 내지 3% 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염산 및/또는 수산화나트륨을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염산을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 수산화나트륨을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, 염산 및/또는 수산화나트륨을 사용하여 원하는 pH를 획득한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 하기 표 1에 제공된 바와 같은 성분을 포함하는 제형물로 제조된다.
Figure pct00003
D. 검정 방법/치료적 성질
본 발명의 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰에 대한 성질, 뿐만 아니라 특정 성분 비율/농도를 달성하도록 가공된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 1인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 (MSC 세크레톰 조성물이 생산되는 조건화 배지에서 프로-혈관형성 인자의 농도와 비교하여) 프로-혈관형성 인자의 농도 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 VEGF의 수준을 초과하는 여러 항-혈관형성 인자의 합을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 인자 대 VEGF의 1 이상의 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5가 되도록 여러 항-혈관형성 인자의 합을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 세르핀 E1 내지 VEGF-A를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 세르핀 E1이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 VEGF-A이다.
본 발명의 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 특정 효능 성능 판정기준을 달성하도록 가공된다. 일부 구현예에서, 완충액 교환 단계는 효능이 있는 MSC 세크레톰을 획득하는 것을 촉진한다.
세포외 소포는 상기 언급된 가용성 및 불용성 물질을 화물 운반하는 막 결합 입자이다. 용어 "세포외 소포"는 다양한 종의 분비 또는 방출된 소포의 일군을 말한다. 이들은 일반적으로 다음의 하위유형: (1) 일반적으로 50 nm 내지 1500 nm의 크기 범위를 나타내는 미세소포 또는 셰드 미세소포; (2) 전형적으로 30 nm 내지 120 nm의 크기 범위를 나타내는 엑소좀; 및 3) 전형적으로 500 nm 미만 (즉, < 500 nm)의 크기 범위를 나타내는 소포로 나뉜다. (예를 들어, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2019016799 참조). 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 입자 수에 대해 및/또는 세크레톰에 존재하는 세포외 소포 (EV)를 정량화하도록 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, EV는 약 2.5 × 105개/μL, 2.6 × 105개/μL, 2.7 × 105개/μL, 2.8 × 105개/μL, 2.9 × 105개/μL, 3.0 × 105개/μL, 3.1 × 105개/μL, 3.2 × 105개/μL, 3.3 × 105개/μL, 3.4 × 105개/μL, 3.5 × 105개/μL, 3.6 × 105개/μL, 3.7 × 105개/μL, 3.8 × 105개/μL, 3.9 × 105개/μL, 4.0 × 105개/μL, 4.1 × 105개/μL, 4.2 × 105개/μL, 4.3 × 105개/μL, 4.4 × 105개/μL, 4.5 × 105개/μL, 4.6 × 105개/μL, 4.7 × 105개/μL, 4.8 × 105개/μL, 4.9 × 105개/μL 또는 약 5.0 × 105개/μL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 3.8 × 105개 +/-0.8 × 105개/μL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, EV는 약 2.5 × 105개/μL, 2.6 × 105개/μL, 2.7 × 105개/μL, 2.8 × 105개/μL, 2.9 × 105개/μL, 3.0 × 105개/μL, 3.1 × 105개/μL, 3.2 × 105개/μL, 3.3 × 105개/μL, 3.4 × 105개/μL, 3.5 × 105개/μL, 3.6 × 105개/μL, 3.7 × 105개/μL, 3.8 × 105개/μL, 3.9 × 105개/μL, 4.0 × 105개/μL, 4.1 × 105개/μL, 4.2 × 105개/μL, 4.3 × 105개/μL, 4.4 × 105개/μL, 4.5 × 105개/μL, 4.6 × 105개/μL, 4.7 × 105개/μL, 4.8 × 105개/μL, 4.9 × 105개/μL 또는 약 5.0 × 105개/μL의 농도 및 110 nm 내지 120 nm의 평균 직경으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 2.5 × 105개/μL, 2.6 × 105개/μL, 2.7 × 105개/μL, 2.8 × 105개/μL, 2.9 × 105개/μL, 3.0 × 105개/μL, 3.1 × 105개/μL, 3.2 × 105개/μL, 3.3 × 105개/μL, 3.4 × 105개/μL, 3.5 × 105개/μL, 3.6 × 105개/μL, 3.7 × 105개/μL, 3.8 × 105개/μL, 3.9 × 105개/μL, 4.0 × 105개/μL, 4.1 × 105개/μL, 4.2 × 105개/μL, 4.3 × 105개/μL, 4.4 × 105개/μL, 4.5 × 105개/μL, 4.6 × 105개/μL, 4.7 × 105개/μL, 4.8 × 105개/μL, 4.9 × 105개/μL 또는 약 5.0 × 105개/μL의 농도 및 112 nm 내지 116 nm의 평균 직경으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 2.5 × 105개/μL, 2.6 × 105개/μL, 2.7 × 105개/μL, 2.8 × 105개/μL, 2.9 × 105개/μL, 3.0 × 105개/μL, 3.1 × 105개/μL, 3.2 × 105개/μL, 3.3 × 105개/μL, 3.4 × 105개/μL, 3.5 × 105개/μL, 3.6 × 105개/μL, 3.7 × 105개/μL, 3.8 × 105개/μL, 3.9 × 105개/μL, 4.0 × 105개/μL, 4.1 × 105개/μL, 4.2 × 105개/μL, 4.3 × 105개/μL, 4.4 × 105개/μL, 4.5 × 105개/μL, 4.6 × 105개/μL, 4.7 × 105개/μL, 4.8 × 105개/μL, 4.9 × 105개/μL 또는 약 5.0 × 105개/μL의 농도 및 114 nm의 평균 직경으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 3.8 × 105개 +/-0.8 × 105개/μL의 농도 및 114 nm의 평균 직경으로 존재한다.
i. MSC 세크레톰 - 치료적 성질
본 발명의 MSC 세크레톰은 예를 들어 항-혈관형성 성질 (혈관 및/또는 림프관), 항-섬유증 성질, 항-염증 성질, 세포 이동 및 증식을 촉진하는 성질, 유사분열 촉진 성질, 항-산화 스트레스/손상 성질을 포함하는 다양한 치료적 성질을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항-혈관형성 (혈관 및/또는 림프관) 성질은 MSC 세크레톰에서 하나 이상의 인자의 존재 및/또는 수준에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 PEDF, sFLT-1, 더 낮은 수준의 VEGF 및/또는 세르핀 E1 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및/또는 세르핀 E1 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 PEDF이다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 sFLT-1이다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 더 낮은 수준의 VEGF에 해당한다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 세르핀 E1이다.
일부 구현예에서, 프로-혈관형성 (혈관 및/또는 림프관) 성질은 MSC 세크레톰에서 하나 이상의 인자의 존재 및/또는 수준에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2 및 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 VEGF이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 안지오게닌이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 IGFBP-3이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 uPA이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 안지오-1이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 안지오-2이다. 일부 구현예에서, 프로-혈관형성 인자는 엔도텔린-1이다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-섬유증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항-섬유증 성질은 표준 검정법을 사용하여 검정될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰과 관련된 다양한 인자 및/또는 활성의 존재는 항-섬유증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 인자는 FGF7 및/또는 FGF10을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 인자는 FGF7이다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 인자는 FGF10이다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 인자는 HGF이다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 활성은 SMAD의 활성화, TGF
Figure pct00004
경로의 ㅈ억제, 근섬유모세포 분화의 억제, 및/또는 과잉 ECM 침착의 억제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 활성은 SMAD의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 활성은 TGF
Figure pct00005
경로의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 활성은 근섬유모세포 분화의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 활성은 과잉 ECM 침착의 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-염증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 억제시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 100% (예로, 염증의 완전한 감소) 억제시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 비만 세포의 탈과립화를 예방한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 예를 들어 체세포 분열 및 운동성 활성을 포함한 세포 이동 및 증식을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 체세포분열 활성을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 운동성 활성을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 FGF7을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 FGF7을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 HGF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 항-아폽토시스 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 FGF-2, HGF 및 IGF-1을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항-아폽토시스 제제를 포함하고, 이는 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 FGF-2, HGF 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되고, MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 항-아폽토시스 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 NGF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-산화 스트레스 및/또는 세포 손상의 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-산화 스트레스 및 세포 손상의 감소 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-산화 스트레스 및 세포 손상의 감소 인자는 SOD-1, SOD-2, SOD-3, HO-1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 항-산화 스트레스 및 세포 손상의 감소 인자는 SOD-1, SOD-2, SOD-3, HO-1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
ii. MSC 세크레톰 - 생물리학적/생화학적 성질
생화학적 및 생물리학적 특성화:
일부 구현예에서, 본 발명은 MSC 세크레톰의 특성화 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 특성화는 (1) MSC 세크레톰에서 분자적 실체의 종합적 및/또는 정량적 맵핑; (2) 생물학적 활성에 대한 선별 인자의 기여도를 측정하는 것; 및 (3) 생물리학적 매개변수를 측정하는 것을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 성질을 결정하기 위하여, 본원에 기재된 바와 같이 MSC 세크레톰에 관한 다양한 효능 검정을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 (1) MSC 세크레톰에서 분자적 실체의 종합적 및/또는 정량적 맵핑; (2) 생물학적 활성에 대한 선별 인자의 기여도를 측정하는 것; 및 (3) 생물리학적 매개변수를 측정하는 것에 적용될 것이다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 생물리학적 검정, 생화학적 검정 및 생물학적 검정을 포함하나, 이에 한정되지는 않다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
물리적 성분 특성화:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 특성화는 생체분석 기법의 조합을 사용하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 특성화는 MSC 세크레톰의 물리적 성분을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 특성화는 단백질 어레이, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 질량 분광분석법 및 면역블럿팅을 활용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 특성화는 MSC 세크레톰 내의 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 어레이를 활용하여 MSC 세크레톰 내의 인자를 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법을 활용하여 MSC 세크레톰에서 하나 이상의 인자의 존재를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 정량적 기법을 활용하여 하나 이상의 인자의 수준을 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, ELISA와 같은 정량적 기법을 활용하여 각 인자의 수준을 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 세크레톰은 단백질 인자 및 세포외 소포 (EV)를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 자극 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 단백질 인자는 펜타트락신-3, TIMP-1, 세르핀 E1, TSP-1, HGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 EV를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 총 지질을 정량적으로 측정하기 위해 단순한 지질 함량에 대해 분석된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 EV 분획은 EV 마커에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 EV 분획은 AUX, TSG101, CD63, CD9 및 CD8을 포함하나 이에 한정되지 않는 EV 마커에 대해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 세크레톰은 30 nm 내지 200 nm 크기 범위 및 mL 당 1 × 108개 내지 5 × 109개 EV의 세포외 소포 (EV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 결핍 연구는 결정적 인자의 개별 기여도를 분석하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 기반의 풀다운 방법을 사용하여 정의된 인자를 MSC 세크레톰로부터 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 결핍은 하기 본원에 기재된 바와 같이, 웨스턴 블롯에 의해 입증된 다음 하나 이상의 생체검정법에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 결핍 연구는 단백질 분획 및 EV 분획의 기여도를 평가하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, TIMP1 및/또는 세르핀 E1은 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, TIMP1 및/또는 세르핀 E1은 결핍될 수 있다.
산화적 스트레스:
일부 구현예에서, 산화적 스트레스 예방 검정은 MSC 세크레톰에 관해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 각막 상피 손상을 예방한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증의 존재를 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-염증 마커의 존재 증가에 의해 결정되는 바와 같이 염증의 존재를 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 예를 들어 IL-8과 같은 항염증 마커의 존재 증가에 의해 결정되는 바와 같이 염증의 존재를 감소시킨다.
안전성 특성화:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈액 적격성에 대해 평가되고, 발열원 및 내독소 수준, 뿐만 아니라 무균도에 대한 테스트를 시행할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈액 적격성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 적격성을 평가하는 것은 용혈 및 혈구응집에 대한 검정을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 전신 노출로 인한 유해한 효과를 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 중증 안구 화상과 같은 전신 노출로 인한 유해한 효과를 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈구응집 활성을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 용혈을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 용혈 활성을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약제학적 제형물의 일부로서 투여될 수 있도록 멸균일 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 내독소가 없거나, 실질적으로 없을 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 미생물이 없거나, 실질적으로 없을 수 있다.
안정성:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 생물리학적 특징은 평가 및/또는 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광, 정적 광산란 및 동적 광산란은 단백질 안정성 계량을 특성화한다. 일부 구현예에서, 다음의 매개변수: 열 용융, 열 응집, 델타 G 및/또는 점도를 측정하여 세크레톰을 추가로 특성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 열 용융 검정을 활용하여 MSC 세크레톰 안정성을 결정한다. 일부 구현예에서, 열 응집 검정을 활용하여 MSC 세크레톰 안정성을 결정한다. 일부 구현예에서, 델타 G는 MSC 세크레톰 안정성을 결정하는 척도로서 사용된다. 일부 구현예에서, 점도는 MSC 세크레톰 특징으로서 측정된다. 일부 구현예에서, 점도는 MSC 세크레톰 안정성을 결정하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 생물리학적 계량을 활용하여 상이한 MSC 세크레톰 제형물을 특성화하는 안정성 매개변수를 확립할 수 있다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 -20℃, 4℃ 및 실온 (20℃)에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 -20℃, 4℃ 및 실온 (20℃에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 적어도 7일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 -20℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 4℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 20℃ (또는 실온)에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 -20℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 4℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 20℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 25℃ (실온)에서 적어도 7일 동안 안정하다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 -20℃에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 4℃에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 20℃ (또는 실온)에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 약 25℃ (실온)에서 적어도 14일 동안 안정하다.
상피 장벽 무결성 검정
각막 상피, 보다 정확하게 상피의 첨단 표면은 각막의 전반적인 장벽 성질에 주요한 기여를 하며, 각막 장벽의 변화는 생체적격성 분석을 위한 민감한 인자로서 작용한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 생물리학적 특징은 예컨대 상피 장벽 무결성 검정에 의해 평가 및/또는 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 장벽 무결성 검정은 경상피 전기 저항 (TEER)이다. 일부 구현예에서, 경상피 전기 저항 (TEER)은 전반적인 장벽 성질을 측정하도록 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 조직은 2 mL의 TEER 완충액을 포함하는 24-웰 플레이트로 옮기고, 10분 동안 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, TEER은 상피 전압-오옴 측정기 EVOMO 및 엔드오옴-12 체임버 (World Precision, Sarasota, FL)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 절차의 종료 시, 조직은 다음의 공식을 사용한 조직 생존력 평가에 사용될 수 있다.
장벽 무결성% = 100 × [TEER (처리된 조직) / TEER (위약 대조군)]
일부 구현예에서, TEER는 MSC 세크레톰의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, TEER은 에피코니알 조직 모델 (맷테크사)을 사용하여 질소 머스타드(NM)에 대한 국소 노출에 의해 유발된 각막 상피 손상에 이어서, MSC 세크레톰의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 실시예 6에 기재된 바와 같이, 예를 들어 6 μg/mL으로 (위약 용액에 희석됨) 국소적으로 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 에피코니알 조직은 표준 배양 조건으로 5 mL 배지에서 24시간 동안 배양되었다.
생체검정법
일부 구현예에서, 생체검정법은 MSC 세크레톰을 특성화하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체검정법은 각막 상처 치유, 상피세포 이동 및 증식, 간질 세포 분화(예로, 흉터 형성), 혈관신생 및 염증과 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체검정법은 각막 상처 치유, 상피세포 이동 및 증식, 간질 세포 분화(흉터 형성), 혈관신생 및 염증을 매개하는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하도록 활용될 수 있다.
이동 및 증식:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 증식 및 이동을 촉진하는 MSC 세크레톰의 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 증식을 촉진하는 MSC 세크레톰의 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 이동을 촉진하는 MSC 세크레톰의 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 증식 및/또는 이동을 촉진한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 증식을 촉진한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 이동을 촉진한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 증식 촉진하는 능력을 결정하도록 트랜스웰 이동 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 이동 검정은 이동을 촉진하는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하도록 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이동 검정은 이동을 촉진하는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하도록 활용될 수 있으며, 여기서 이동 검정은 시험관내 상처 봉합 검정이다. 일부 구현예에서, 이동 검정은 "스크래치 검정" ("스크래치 상처 검정"으로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 이동을 촉진하고, 이러한 이동 촉진은 "스크래치 검정"을 이용하여 결정 및/또는 조사된다. 일반적으로, 스크래치 검정 방법은 "스크래치"로도 지칭되는 인공 간격이 충만한 세포 단일층에서 발생할 때를 기초로 한다. 스크래치는 "스크래치"를 닫거나 도포하는 구멍을 향해 이동하는 새로 생성된 간격의 모서리에 있는 세포에 대해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, Liang, C., Park, A. & Guan, J. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2: 329-333 (2007) 참조.
일부 구현예에서, 이동 검정은 각막 상피세포 (또는 일단 검증되면 다른 대용물 세포)를 사용하여 트랜스웰 이동 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상처 봉합은 MSC 세크레톰 상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰의 상처 봉합 효능에 대한 테스트으로서 각막 상피를 사용하는 트랜스웰 이동 검정이 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 트랜스웰 이동 검정을 사용하여 결정된 바와 같이 상처 봉합을 촉진한다.
일부 구현예에서, 시험관내 상처 봉합 검정은 "스크래치 검정" ("스크래치 상처 검정"으로도 지침됨), 원형 찰과상 방법 또는 원형 찰과상 검정, 또는 원형 상처 봉합 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 인간 각막 상피세포 증식 검정은 MSC 세크레톰에 관해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 각막 상피세포 증식 검정은 MSC 세크레톰의 상처 봉합 성질에 대한 테스트를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 인간 각막 상피세포 증식 검정을 사용하여 결정된 바와 같이 상처 봉합을 촉진한다.
일부 구현예에서, 원형 찰과상 방법 또는 원형 찰과상 검정, 또는 원형 상처 봉합 검정이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 오리스TM 세포 이동 검정 플랫폼이 사용될 수 있다 (또한, 본원의 실시예 6에 기재된 바와 같이 참조).
일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 MSC 세크레톰에 관해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 MSC 세크레톰이 프로-혈관형성이 아님을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 MSC 세크레톰의 혈관형성 잠재력의 척도를 제공한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 항-혈관형성 성질이다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 항-혈관형성 신호 및 프로-혈관형성 신호의 비율을 제공한다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정에서 음성 결과는 항:프로 비율이 높은 것을 검증할 것이고, MSC 세크레톰이 혈관신생을 촉진하지 않을 것을 입증할 것이다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정에서 음성 결과는 항:프로 비율이 높은 것을 검증할 것이고, MSC 세크레톰이 일반적으로 CNS (맥락막 혈관신생) 또는 혈관신생을 촉진하지 않을 것을 입증할 것이다. 일부 구현예에서, TGFb 유도된 근섬유모세포 분화의 저해 검정은 MSC 세크레톰 상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, TGFb 유도된 근섬유모세포 분화의 억제 검정은 MSC 세크레톰 상에서 수행되어 MSC 세크레톰이 흉터 형성을 예방하는 것을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 흉터 형성을 예방한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 반흔성 각막 혼탁을 예방한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 낮은 혈관형성을 유도한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 지원하는 배지의 존재 하에 혈관의 정상적인 형성을 손상 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 처리되지 않은 대조군과 비교할 때 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰는 혈청 포함하는 배지로 처리된 시료과 비교하여 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성 반응을 약화시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 무혈청 배지에 의해 유도된 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 세크레톰을 더한 혈청 포함하는 배지 (혈관형성 반응의 감소 또는 없음)를 혈청 포함하는 배지 (혈관형성 반응)와 비교할 때, 혈관형성 반응의 감소가 MSC 세크레톰에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 세포 기반의 검정법에서 관형성에 의해 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 내피세포 관형성 검정에서 관형성에 의해 나타낸다.
분화/흉터 형성:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 분화를 예방하고, 흉터 형성을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 흉터 형성을 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 흉터 형성을 예방한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 다른 표준 치료와 비교하여 흉터 형성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 분화를 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 근섬유모세포 분화를 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 각막 투명도의 소실을 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 근섬유모세포 분화를 예방하고/거나 손상시킴으로써 각막 투명도의 소실을 감소시킨다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 분화에 관여하는 인자를 조절하는 MSC 세크레톰의 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 TGFB2, 콜라겐 I, 콜라겐 Ⅲ (정상적으로 분화 과정 동안 상향조절됨), TFGB3, MMP-2, 및 MMP-9 (정상적으로 분화 과정 동안 하향조절됨)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 분화에 관여하는 인자를 조절하는 MSC 세크레톰의 능력을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 TGFB2, 콜라겐 I, 콜라겐 Ⅲ (정상적으로 분화 과정 동안 상향조절됨), TFGB3, MMP-2 및 MMP-9 (정상적으로 분화 과정 동안 하향조절됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 인자를 조절한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 정상 분화 과정 동안 상향조절되는 인자의 감소를 유도한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 정상 분화 과정 동안 하향조절되는 인자의 증가를 유도한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 SMA와 같은 인자의 발현 감소를 유도한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 MSC 세크레톰 효능을 나타내는 SMA와 같은 인자의 발현 감소를 유도한다.
혈관신생:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관신생을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관신생을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관신생을 억제하거나, 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관형성을 억제한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 결핍 검정을 사용하여 추가로 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 특정화된 인자가 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 예를 들어 TIMP1 및/또는 세르핀 E1을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정화된 인자가 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 TIMP1 및/또는 세르핀 E1이 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 TIMP1이 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 세르핀 E1이 결핍될 수 있다.
염증:
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 억제시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 시험관내 및/또는 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 능력을 결정하도록 특성화된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 시험관내 및/또는 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키고, 또는 생체내에서 작용한다. 일부 구현예에서, 조직 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 특성화하도록 채용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 조직 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 특성화하도록 채용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질소 머스타드 (NM) 가스 연소 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질소 머스타드 (NM) 가스 연소 모델은 시험관내에서 및 생체내 병태의 대용물로서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰으로의 치료 및/또는 이의 투여에 반응하여 사이토카인 프로파일이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 특이적 사이토카인의 수준이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8의 수준이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8 발현의 수준은 MSC 세크레톰으로 처리된 조직에서 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8 발현의 수준은 MSC 세크레톰으로 처리된 조직에서 감소되고, 이것은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 나타낸다.
B. 치료 방법
본 발명은 또한 본 발명의 MSC 세크레톰을 사용한 치료 방법을 제공한다. 구체적으로, MSC 세크레톰은 안구 병태의 치료에 사용된다. 구체적으로, MSC 세크레톰은 안구 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 안구 질환은 안구 표면과 관련된다. 일부 구현예에서, 안구 질환은 손상된 안구 조직 및/또는 손상된 안구 조직 적응증과 관련된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 상처 치유의 가속화를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 흉터 형성의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증 감소 및 이로 인한 성장 촉진을 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 안구 표면에서 염증 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관신생의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 각막에서 혈관신생의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 안구 건조증의 치료 (예를 들어, 상피세포가 손상된 곳을 포함하는 중증 안구 건조증의 치료를 포함함)를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 손상된 안구 조직에 대한 무결성의 회복과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 손상된 안구 조직의 치유 가속화와 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 손상된 시신경 조직의 재생과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 PCED와 연관된 손상된 시신경 조직의 재생과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 PCED와 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 안구 표면에 대한 염증성 손상과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 예를 들어 GvHD 및/또는 쇼그렌 증후군과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 상처 치유를 가속화하는데 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 흉터 형성의 감소에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증 감소에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 염증을 감소시켜 성장을 촉진하는데 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 안구 표면에서 염증을 감소시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 혈관신생을 감소시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 각막에서 혈관신생을 감소시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 망막 상피세포 및 망막 신경절 세포의 보호 및 복구에 사용된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰은 섬유주망 재생의 유도 및 안압 감소에 사용된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 안구 질환의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 안구 상처의 치유를 촉진하거나 유도하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고/거나, 흉터 형성을 감소 및/또는 억제하고/거나, 시력을 증진 및/또는 보존하고/거나, 상처 봉합 속도를 증가시키기 위해 (예로, 상처 봉합 시간의 감소) 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 혈관신생을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 흉터 형성을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 시력을 증진 및/또는 보존하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 더 신속한 상처 봉합을 촉진 및/또는 유도하기 위해 (예로, 상처 봉합에 필요한 시간의 감소) 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 시력 보존을 증진하기 위해 혈관신생 및 흉터 형성을 예방, 감소 및/또는 억제하거나, 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 혈관신생을 예방, 감소 및/또는 억제하고, 시력 보존을 증진하기 위해 흉터 형성을 감소시키기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 염증을 예방, 감소 및/또는 억제한다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 염증을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능장애의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 진탕 손상에 이어진 시신경 변성의 외상성 손상의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상 및 눈에 대한 무딘 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 시신경의 외상성 손상의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 눈의 진탕 손상에 이어진 시신경 변성을 개선하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 시신경 변성을 개선하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상 및 눈에 대한 무딘 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상이다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 눈의 무딘 손상이다.
효능 판독은 예를 들어 삶의 질 증가를 포함한 증상의 감소 및/또는 질환 상태의 감소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%으로 증상의 감소 및/또는 질환 상태의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%으로 염증의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%으로 흉터 형성의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%으로 혈관신생의 감소는 치료적 효능을 나타낸다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 안구 질환 또는 안구 병태이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능장애이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 눈의 진탕 (예로, 무딘 또는 무디지 않음) 손상이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 눈에 대한 화학적 화상을 포함한 화상이다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 특정한 표적화 영역에 투여된다. 일부 구현예에서, 특정한 표적화 영역은 눈이다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 다른 주변 영역으로 퍼지지 않도록 제형화된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 다른 주변 영역으로 퍼지지 않도록 제형화된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 적어도 1시간, 적어도 약 2분, 적어도 약 3분, 적어도 약 4분, 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분, 적어도 약 60분, 적어도 약 70분, 적어도 약 80분, 적어도 약 90분 또는 적어도 약 2시간 동안 표적화 역역에 체류하도록 제형화된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 상처 또는 손상 직후에 환부에 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 96시간 이내에 환부에 투여된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 결막하 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 초효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포 세크레톰은 매일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 및/또는 6회 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰 조성물은 매일 한 방울 또는 1회 투여로 치료적 효능을 허용한다. 일부 구현예에서, 한 방울은 매일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 3회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 5회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 6회 투여된다.
일부 구현예에서, 필요로 하는 대상체에서 안구 병태의 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은
(i) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
(ii) PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
(iii) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
를 포함하는, 방법이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 높은 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 200 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 300 ng/mL로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 중간 수준으로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및 세르핀 E1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하고, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2 및 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 낮은 수준의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGF를 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 1,000 pg/mL 미만의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 디소듐포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 접착제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집체 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬, 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 HGF, 펜트락신-3 (TSG-14), VEGF, TIMP-1, 세르핀 E1 및 < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은
(i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
(ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
(iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
(iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
(v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
(vi) < 5 ng/mL IL-8을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
(vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
(vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
(ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨; 및
(v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물을 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
(i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
(ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
(iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
(iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨; 및
(v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물을 포함하고,
pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 방법을 제공한다.
F. 키트
키트는 본원에 기재된 바와 같이 용기 내의 MSC 세크레톰, 또는 MSC 세크레톰을 제조하는데 사용하기 위한 용기 내의 조건화 배지, 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 추가적으로, 키트는 안구 치료에 사용되는 용액을 제조하도록 혼합하기 위한 구성요소, 및 혼합과 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
용기는 적어도 하나의 바이알, 웰, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기, 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있으며, 용기 내의 MSC 세크레톰 또는 MSC 세크레톰을 제조하는데 사용하기 위한 조건화 배지를 포함하고, 일부 경우에, 적합하게 분취될 수 있다. 추가적인 구성요소가 제공되는 곳에서, 키트는 이 구성 요소를 둘 수 있는 추가적인 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 주사 또는 취입 성형되는 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 용기 및/또는 키트는 사용 설명서 및/또는 경고가 있는 라벨을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 진뱅크 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고문헌로 명시적으로 통합된다.
본 발명은 MSC 세크레톰을 특성화하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 포함하는 키트를 제공할 수 있고, 패널은 적어도 2가지 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 및/또는 검정법의 패널은 본원에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰을 확인한다.
또한, 본 발명은 MSC 세크레톰 로트 사이에 일관성을 결정하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 포함하는 키트를 제공할 수 있고, 패널은 하나 이상의 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 및/또는 검정법의 패널은 본원에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰을 확인한다.
실시예
실시예 1: 세크레톰 특성화
생화학적 조성:
MSC 세크레톰의 생화학적 조성은 다음을 포함하는 다양한 인자 및 활성의 존재에 대해 분석될 수 있다:
* IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성 검정;
* ELISA 또는 루미넥스에 의해 평가된 HGF, FGF-7, TIMP-1, TIMP-2 트롬보스폰딘, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A, b-NGF를 포함하나, 이에 한정되지 않는 여러 자극인자/사이토카인에 대한 한계치 ppm 수준; 및
* 추가적인 인자: sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF (FGF2), 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF.
MSC 세크레톰의 생화학적 조성은 약 10 내지 150,000 pg/105개 세포/일의 인자 범위를 기초로 하여 분석될 수 있다.
세크레톰에서 EV (세포외 소포)를 정량화하는 입자 계수도 수행될 것이다.
필요에 따라 지질 함량을 평가할 수 있다.
생화학적 특성화/배포는 (1) FTIR 분광분석법; 2) 완충액 교환/세크레톰 농축 공정을 포함하여 수행될 수 있으며, 완충액 교환 공정은 세크레톰을 농축하는데 사용될 뿐만 아니라, 일부 경우에는 사전 정의된 분자량 컷오프 미만의 임의의 분자를 제거할 수 있는 크기 배제 공정이다. 예를 들어, VEGF는 매우 작은 단백질 (42kDa)이므로, 사용된 여과 컷오프를 기초로 하여 VEGF의 거의 모두 (또는 효과적으로 모두)를 잠재적으로 제거할 수 있다.
일단 정제되고 농축되면, MSC 세크레톰은 추가의 하류 가공에 적용될 수 있다. 이러한 하류 가공은 투여를 위한 MSC 세크레톰을 제조하는 완충액 교환 공정을 포함할 것이다. 완충액 교환은 배지 성분을 제거하고, 이를 원하는 제형물 성분으로 교체하기 위해 중공 섬유 접선 유동 방법을 사용할 수 있다. 또한, 완충액 교환의 가공 단계는 마찬가지로 세크레톰의 농축을 유도할 수 있다.
다음으로 세크레톰은 투여를 위해 제형화될 수 있다.
실시예 2: 세크레톰의 생체효능 및 생물리학적 특성화
본 실시예는 세크레톰 특성을 결정하는 방법, 뿐만 아니라 조성 분석, 생화학적 및 생물리학적 특성화, 그리고 세크레톰 특성화에 사용되는 세포 기반의 검정법을 설명한다.
본 실시예에 설명된 분석 기법을 사용하여 다양한 제형물의 성능과 안정성을 평가할 수 있다. 최고의 안정성 및 내약성 프로파일을 갖는 제형물은 알칼리 설치류 화상 모델을 사용하여 용량-반응 및 투약 요법 평가를 거칠 것이다. 상처 치유 시간 및 상처 부위의 조직병리학, 뿐만 아니라 국소 독성을 평가할 수 있다.
효능 검정:
조건화 배지의 성질을 결정하기 위해, 다음을 포함한 다양한 효능 검정을 수행할 수 있다.
트랜스웰 이동 검정은 각막 상피세포 (또는 일단 검증되면 다른 대용물 세포)를 사용하여 (예로, 상처 봉합) 수행될 수 있다. 이러한 검정법은 세크레톰 (예로, HGF, FGF)에 존재하는 자극 성장인자의 계량을 제공할 것이다.
인간 각막 상피세포 증식 검정 (예로, 상처 봉합). 이러한 검정법은 세크레톰 (예로, HGF, FGF)에 존재하는 자극 성장인자의 계량을 제공할 것이다.
로트가 프로-혈관형성이 아님을 나타내는 특성화 검정법일 수 있는 내피세포 관형성 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정법은 세크레톰 산물의 혈관형성 잠재력의 척도를 제공하고, 이는 억제성 (예로, 항-혈관형성 성질을 나타냄)이어야 한다. 이러한 검정법은 혈관형성 능력의 감소에 대한 테스트를 허용할 것이다. 검정법에서, 혈관형성 반응 또는 혈관형성 능력은 처리되지 않은 것과 비교하여 감소된다. 예를 들어, 실험은 2가지 시료 실험군: (1) 혈청 포함하는 배지 (이는 관형성, 일명 정상 혈관형성 반응을 유도함)이지만 세크레톰으로 처리되지 않음 및 (2) 세크레톰 및 혈청 포함하는 배지로 처리됨으로 이루어질 것이다. 세크레톰은 이러한 정상 혈관형성 반응을 약화시키고, 이와 같이 혈관형성 잠재력의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 도 5 및 도 6 참조. 이러한 검정법은 항-혈관형성 신호 및 프로-혈관형성 신호의 비율을 반영할 것이다. 음성 결과는 항:프로 비율이 높은 것을 검증할 것이고, 세크레톰 산물이 일반적으로 CNS (맥락막 신생혈관) 또는 신생혈관을 촉진하지 않을 것을 입증할 것이다. 예를 들어, MSC 세크레톰의 혈관신생 조절 능력을 평가하기 위해 (본원에 기술된 결핍 연구를 통해 밝혀진 바와 같이) 소수 인자의 발현 수준 및 활성을 평가하는 다른 검정법도 사용될 것이다. TGFb 유도된 근섬유모세포 분화의 억제 검정 (예로, 항-반흔)을 수행할 수 있다. 이러한 검정법은 흉터 형성 (또는 각막 혼탁)을 예방하는 세크레톰의 능력을 평가할 것이고, qPCR, 형광현미경 검사 및 웨스턴블럿에 의해 평가되는 것은 간질 섬유모세포의 근섬유모세포 (예로, 평활근 액틴)로 분화 및 기질 침착을 특징으로 하는 인자이다.
산화적 스트레스 예방 검정이 수행될 수 있다. 또한, 3D 모델 검정을 사용하여 판독값으로서 효능을 평가하고, 각막 상피에 대한 질소 머스타드 가스 손상을 예방/복구할 수 있다. 이러한 검정법의 경우, 육안 관찰이 조직 건강을 보장하도록 조사될 뿐만 아니라, 다양한 항-염증 마커 (예를 들어, IL-8와 같음)에 대한 검정이 시행될 것이다.
FDA 지침은 세포 및 유전자 산물에 대한 산업 지침을 제공하였다. (본원에 참고문헌으로 통합되는, 월드와이드웹 fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/cellularandgenetherapy/ucm243392.pdf 참조). 이러한 지침은 효능 검정 및 테스트를 수행하는 방식, 및 MSC 세크레톰의 치료적 효능과 상관관계가 있는 이러한 효능 검정이 표준 FDA 지침 하에 효능에 대해 평가될 수 있는 방식을 제공한다.
안전성 특성화
세크레톰은 혈액 적격성에 대해 평가되고, 발열원 및 내독소 수준, 뿐만 아니라 무균도에 대한 테스트를 시행할 수 있다. 일반적으로, 현재의 최신 FDA 지침은 이러한 분석적 분석에 사용될 수 있다 (예로, 2012년 FDA 지침: 발열원 및 내독소 테스트). (본원에 참고문헌으로 통합되는, fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM310098.pdf 참조).
또한, 용혈 및 혈구응집에 대한 검정을 포함하는 혈액 적격성을 평가하는 방법은 전신 노출이 예를 들어 중증 안구 화상과 함께 발생하는 경우, 제조된 MSC 세크레톰으로 전신 노출 문제가 없음을 입증하도록 사용될 것이다. 이러한 방법은 기존 기법 (Maji et al., Saswati et al., Nayak et al. )을 기반으로 하며, 동의한 건강한 기증자로부터의 혈액을 사용한다. 간략하게, 용혈의 경우 적혈구 (RBC)가 1시간 동안 37℃에서 MSC 세크레톰과 함께 공동-배양될 수 있다. 삼투 PBS로 처리된 적혈구가 음성 대조군으로서 사용되고, 증류수는 양성 대조군으로서 사용된다. 배양 및 원심분리 이후, 540 nm에서의 흡광도 (헤모글로빈의 경우 A최대)를 측정할 수 있다. 용혈%는 다음과 같이 계산할 수 있다: 100% × (AMSC-S - A공시료) / A증류수. 본 연구는 용혈을 유도하기 시작하는 용량을 확립하고, MSC 세크레톰이 ISO/TR 7406 (용혈 비율 < 5%)에 따라 혈액 적격성인 경우 평가를 수행한다. 혈구응집의 경우, RBC 현탁액을 96-웰 U-바닥 접시에서 MSC 세크레톰과 함께 37℃에서 2시간 동안 공동-배양할 수 있다. 혈구응집에 대한 긍정적인 결과는 RBC 현탁액 (응집된 RBC 격자가 용액을 벗어나지 않음)인 반면, 부정적인 결과는 웰 바닥에 RBC '버튼'이 용액으로부터 침전된 RBC로부터 생성된다. MSC 세크레톰은 혈구응집 활성을 나타내지 않을 것이다.
멸균도 및 내독소 분석 방법도 개발될 것이다. 이러한 방법은 생산된 각 MSC 세크레톰에 대한 무균도 및 내독소 테스트를 수행하는데 유용할 수 있다. 이러한 검정법은 테스트가 살아있는 오염 미생물 또는 오염 내독소의 존재를 신뢰할만하게 검출할 수 있음을 입증하는데 사용될 수 있다. 모든 테스트 성분은 또한 테스트 방법이 살아있는 미생물 또는 내독소의 존재를 일관되게 검출할 수 있음을 입증하도록 검증될 수 있다.
생화학적 및 생물리학적 특성화
MSC 세크레톰은 복잡한 성분 조합이고, 따라서 가장 관련성이 높고 의미있는 효능 검정을 개발하기 위해 세크레톰 성분을 특성화하는 것이 유익하다. 분자적, 생화학적, 생물리학적 분석을 포함한 특성화 기법의 다양한 조합을 사용하여 효능을 측정할 수 있다.
이러한 특성화 연구는 (1) MSC 세크레톰에서 분자적 실체의 종합적 (및 정량적) 맵핑; (2) 생물학적 활성에 대한 선별 인자의 기여도를 측정하는 것; 및 (3) 생물리학적 매개변수를 측정하는 것에 중점을 둘 것이다. 중요하게, 각 중점 영역은 MSC 세크레톰의 각 제조 과정에 적용되어 제조 일관성을 평가할 수 있다.
본 실시예는 MSC 세크레톰의 분자적 제조의 특성화를 설명한다. MSC 세크레톰은 단백질 인자, 뿐만 아니라 세포외 소포 (EV)로 구성되어 있어, 두 분획을 특성화할 필요가 있다. 생체분석 기법의 조합 (단백질 어레이, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 질량 분광분석법 및 면역블럿팅을 포함함)을 사용하여 MSC 세크레톰에서 이들 분자를 특성화할 수 있다. 단백질 어레이 및 질량 분광분석법은 인자의 존재를 결정하고, 인자를 확인하는데 사용되었다. ELISA와 같은 더욱 정량적인 기법을 사용하여 존재하는 각 인자의 수준을 측정하고, 여러 분석물의 범위를 확립할 수 있다.
자극 인자뿐만 아니라 전반적인 낮은 혈관형성 유도와 같은 성질을 포함하여 MSC 세크레톰에 대한 여러 인자가 확인되었다. 현재까지 MSC 세크레톰에 대해 확인된 인자는 펜타트락신-3, TIMP-1, 세르핀 E1, TSP-1, HGF를 포함한다.
자극 및 기타 인자 외에도, EV는 세크레톰의 두드러진 성분이고, 자체가 치료적 캠페인의 중점이었다. 본 발명자의 API의 EV 성분을 평가하기 위해, 일련의 분석을 수행할 수 있다. 첫째, 지질 결합 염료 (예로, 나일레드)를 사용한 간단한 지질 함량 분석을 수행하여 제품 로트의 총 지질에 대한 정량적 측정을 시행할 수 있다. 추가적으로, 나노사이트 NS300을 사용하여 입자 수 및 크기 분포를 평가할 수 있다. 이러한 분석은 입자 농도 및 일정한 입자 분포 크기에 대한 범위를 확립하기 위해 각 로트에서 수행할 수 있다. 표준 마커 (AUX, TSG101, CD63, CD9 및 CD81을 포함함)에 대한 면역블럿팅을 사용하여 EV 분획의 생화학적 특성화를 수행할 수 있다.
생화학적 분석을 보완하기 위해, 결핍 연구를 수행하여 결정적 인자의 개별 기여도를 분석할 수 있다. 간략하게, 항체 기반의 풀다운 방법을 사용하여 정의된 인자를 MSC 세크레톰로부터 제거할 수 있다. 결핍을 웨스턴 블롯에 의해 입증한 다음 일련의 생체검정법에 의해 평가할 수 있다 (하기에 설명됨). 유사한 연구를 수행하여 단백질 분획 및 EV 분획의 기여도를 평가할 수 있다.
또한, MSC 세크레톰의 생물리학적 특징은 형광, 정적 광산란 및 동적 광산란을 사용하는 플랫폼으로 평가하여 단백질 안정성 계량을 특성화할 수도 있다. 다음 매개변수를 측정할 수 있다:
* 열 용융: 입체구조 변화를 겪는 노출된 트립토판 또는 타이로신 잔기 단백질의 고유 형광을 측정한다. 검정법은 단백질이 전개되기 시작하면서 형광 강도의 변화 또는 피크 변위를 측정한다. 상이한 제형물의 순위 정렬 및 비교를 가능하게 한다.
* SYPRO를 사용한 열 용융: 시차 주사 형광측정법 (DSF)를 사용한다. 단백질이 전개되면서 노출된 소수성 잔기에 결합할 때 염료 (SYPRO 오렌지, 분자 프로브사)의 스펙트럼 변위를 측정한다. 형광 민감도는 매우 낮은 농도의 MSC 세크레톰에서 측정을 가능하게 한다.
* 열 응집: 열 처리 범위 동안 API가 응집되는 응집 동작 및 온도를 모니터링한다. SLS를 사용하여 2가지 파장 (266 nm 및 463 nm)에서 측정하여 작은 입자와 큰 입자를 구별한다. 상이한 제형물의 순위 정렬 및 비교를 가능하게 하고, 단백질 전개 및 응집의 역학에 관한 정보를 얻는다.
* 델타 G: 화학적 변성제의 첨가 이후 API의 형광 변화를 측정한다. 단백질 안정성에 대한 정량적 값 또는 MSC 세크레톰, 델타 G를 전개하는데 필요한 에너지 양을 계산할 수 있다.
* 점도: 소량의 물질을 사용하여 MSC 세크레톰 제형물의 점도를 측정한다. 상이한 제형물에 관한 평가 및 비교를 가능하게 한다.
상기 생물리학적 계량은 다양한 MSC 세크레톰 제형물을 평가하고, MSC 세크레톰에 대한 확장된 및/또는 안정성 가속화 연구를 수행하기 위한 핵심 안정성 매개변수를 확립한다. 2가지 상이한 pH 6.4 및 7.4에서 제형화된 MSC 세크레톰에 관한 안정성 분석을 수행하였다.
생체효능
이론적 근거: MSC 세크레톰의 효능을 평가하기 위한 세포 기반의 검정 프로그램의 개발이 시작되었다. 세포 기반의 검정 프로그램은 다음을 달성하는 것을 목표로 한다.
* 제품 개발 전반에 걸쳐 산물 활성, 품질 및 일관성을 입증한다.
* 종합 데이터를 생성하여 로트 배포를 위한 규격을 지원한다.
* 제조 변경을 평가하기 위한 기초를 제공한다.
* MSC 세크레톰 안정성을 평가한다.
MSC 세크레톰을 적절하게 평가하기 위해, 본원에 제공된 실시예에 설명된 바와 같이 일련의 생체검정법을 개발하여 MSC 세크레톰 생체효능을 평가할 수 있다.
생체검정법
MSC 세크레톰에 대한 일련의 생체검정법을 개발하기 위해, 각막 상처 치유: 상피세포 이동 및 증식, 간질 세포 분화 (흉터 형성), 혈관신생 및 염증을 공동-조정하는 주요 과정을 포함하는 공정에 중점을 둘 수 있다. 이러한 각 공정을 매개하는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하는 생체검정법을 사용할 수 있다.
이동 및 증식:
외상에 이어서, 각막 상피세포는 봉합을 매재하도록 상처의 앞쪽 모서리에서 분열하고 이동해야 한다 (Ljubimov AV., Prog. Retin. Eye Res. 2015년 11월; 49: 17-45). 일차 각막 상피세포 (또는 대안적으로 불멸화 각막 상피세포) 및 시험관내 세포 검정은 MSC 세크레톰의 증식 및 이동을 촉진하는 능력을 평가한다.
증식을 위해 각막 상피세포를 정의된 용량의 MSC-S의 존재 하에 배양할 수 있다. 정의된 배양 기간 (예로, 24시간 및 48시간) 이후 살아있는 세포를 정량화하도록 살아있는 세포를 염색시킨다 (예로, MTT 또는 WST-8). 이동의 경우, 각막 상피세포가 성장인자가 없는 기본 배지에서 8 마이크론 폴리카보네이트 막이 있는 체임버에 접종될 수 있는 트랜스웰 이동 검정을 사용할 수 있다. 체임버는 정의된 용량의 API가 보충된 기본 배지를 포함한 배양 접시 웰 (24-웰 접시)에 배치될 수 있다. 24시간 배양 후, 막을 통해 이동한 세포를 형광 (예로, 칼세인 AM) 또는 비색 (예로, 크리스탈 바이올렛) 염색을 사용하여 정량화할 수 있다.
분화/흉터 형성:
각막의 간질층 (상피 아래층)을 파괴하는 안구 외상 이후, 각막 섬유모세포는 성장인자-β (TGFβ)를 변형시킴으로써 매개되는 공정에서 평활근 액틴 (SMA) 발현하는 근섬유모세포로 분화하도록 촉발된다. 이 과정은 정상적인 상처 치유 과정을 동반하지만, 눈에 바람직하지 않은 결과인, 흉터 형성 및 시력 손상을 가져온다. 이러한 시력 손상은 근섬유모세포가 다량의 조직화되지 않은 세포외 기질을 침착시켜 각막 투명도의 소실을 초래하여 발생한다. 근섬유모세포 분화를 방지하거나 손상시키는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하도록 검정법이 개발되었으며, 따라서 이는 MSC 세크레톰의 효능 척도이기도 한다.
인간 각막 섬유모세포는 모델 세포 시스템으로서 사용될 수 있다. 세포를 TGFB1으로 처리하여 증가하는 농도의 API의 존재 (또는 부재) 하에 분화를 유도하고, 추가 24시간 동안 배양할 수 있다. TGFB1로 처리된 섬유모세포는 신속하게 근섬유모세포로 분화하고, 평활근 액틴의 현저하게 증가된 발현 수준, 뿐만 아니라 여러 기타 인자로 TGFB2, 콜라겐 I, 콜라겐 Ⅲ (정상적으로 분화 과정 동안 상향조절됨), TFGB3, MMP-2, MMP-9 (정상적으로 분화 과정 동안 하향조절됨)의 조정을 특징으로 한다. qPCR 및 면역블럿팅 (각각 mRNA 및 단백질)을 사용하여 이러한 분화의 분자 표식의 발현 수준에 미치는 MSC 세크레톰의 효과를 측정할 수 있다. MSC 세크레톰 치료는 SMA와 같은 인자의 발현을 감소시킬 것이며, 이는 효능의 반영 척도가 될 수 있다.
혈관신생:
건강한 각막은 맥관이 없고, 혈관이 부족하다. 그러나, 외상 이후에 종종 각막 혈관신생이 발생하고, 이는 시력 손상 및 심지어 실명에 기여한다. 보다 구체적으로, 혈관신생은 조직 흉터 형성, 지질 침착, 간질 출혈 및 각막 부종을 유발하여, 시력을 심각하게 변경할 수 있다. MSC 세크레톰의 결정적 특징은 치유 과정 동안 혈관신생을 손상시키는 능력이다. 세포 기반의 검정법은 혈관형성을 손상시키는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하도록 구현될 수 있다.
내피 관형성 검정을 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC)를 사용하여 구현할 수 있다. 이러한 검정은 모세혈관 유사 혈관 구조를 형성하는 내피세포 재구성을 측정함으로써 혈관 발생을 평가하는 표준 검정법이다. 간략하게, HUVEC 세포를 기저막 추출물 (콜라겐 또는 매트리겔®; BD 바이오사이언스사)의 얇은 층에 접종하고, API의 존재 또는 부재 하에 배양한다. 2 내지 6시간 이내에, 내피세포가 분열하고, 프로-혈관형성 분자에 의해 지원되는 경우 혈관망을 형성하기 시작할 것이다. MSC 세크레톰이 이러한 혈관망의 형성을 손상시킬 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. 영상를 수집할 수 있고, 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 분지점, 튜브 길이 및 수, 루프 수 및 면적, 세포 적용 영역 등의 매개변수를 측정할 수 있다. MSC 세크레톰은 혈관형성을 억제할 수 있다.
관형성 검정을 보완하기 위해, 특정화된 인자 (예로, TIMP1, 세르핀 E1)이 API로부터 제거되거나 결핍되는 결핍 연구를 수행하고, 검정법의 영향을 평가하는 것이 도움이 될 수 있다. 이러한 검정법을 수행하는 목표는 배포 판정기준을 개발하는데 도움이 될 수 있는, MSC-S (많은 것이 있음)에서 중요한 항-혈관형성 분자를 결정하는 것일 수 있다.
염증:
여러 동물 모델(Yamagami S., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005년 4월; 46(4): 1201-7; Gao, N., et al., Am. J. Pathol. 2011년 11월; 179(5): 2243-53; 및 Jin, Y., et al., Mol. Vis. 2007년 4월 27일; 13: 626-34)는 각막 상피 상처가 변연부 혈관에서 급성 염증 반응을 유발하여, 백혈구 및 호중구가 축적되고 수지상 세포, 대식세포 및 림프구가 간질 및 손상된 상피로 이동하는 것으로 나타났다. 이러한 각막의 증가된 면역 침윤은 혈관신생을 유도하여 실명을 초래할 수 있다. 실제로, 본 발명자의 과학자문위원회의 임상의들은 각막 손상의 급성 단계에서 염증 반응을 저하시키는 것의 중요함을 강조하였다. MSC 세크레톰의 이러한 중요한 능력을 특성화하고, 이를 위한 생체검정법을 개발하기 위하여, 시험관내 세포 검정법, 뿐만 아니라 시험관내 조직 검정법을 개발하고 사용할 수 있다.
시험관내 세포 검정법을 개발하기 위해, 염증 반응을 유발하는 지질다당류 (LPS)의 능력을 활용할 수 있다. LPS는 그램 음성 박테리아의 세포막 성분이며, 염증 세포에 의해 생성되는 다양한 사이토카인의 분비를 위한 강력한 촉발인자이다. 각막 간질 내에 LPS를 주입하면 호중구 및 단핵구를 포함한 염증 세포가 간질 내로 신속하게 침윤하여 토끼에서 각막 궤양을 유도한다. 상세하게, 간질 섬유모세포는 LPS의 존재를 인식하고, 케모카인 및 접착 분자 (예로, IL-8 및 MCP-1)의 발현을 통해 염증 세포 침윤을 유발한다 (Fukuda K., Int. J. Mol. Sci. 2017년 8월 23일; 18(9)). 인간 일차 각막 섬유모세포는 MSC 세크레톰의 존재 또는 부재 하에 LPS로 치료될 수 있다. 세포를 평가 이전에 24시간 동안 배양할 수 있으며, 이 동안 배양 배지에서 IL-8 및 MCP-1 (면역 세포 화학유인제)의 수준을 측정할 수 있다. ELISA는을사이토카인 수준을 측정하는 정량적 기법으로서 사용할 수 있다. MSC 세크레톰으로 치료하면 배지에서 IL-8 및 MCP-1 수준이 감소할 것이다.
둘째, 3D 조직 모델을 사용할 수 있다. 모델은 생체내 각막 조직의 핵심 특징을 구조적 및 기능적으로 재현하는 시험관내 재구성된 인간 각막 조직 모델이다. 중요하게도, 모델이 천연 각막 조직과 유사하게 행동하고, 화학적 화상 (예로, 질소 머스타드)에 대한 염증 반응을 복제한다. 질소 머스타드 (NM) 가스 화상에 대한 모델을 구현할 수 있고, 면역 반응을 저하시키는 MSC 세크레톰의 능력을 평가하는데 사용할 수 있다. 이러한 모델은 일반적으로 염증 반응을 평가하기 위한 생체내 조건을 모방하는데 사용된다. 시험관내 모델과 유사하게, NM 화상 이후 MSC 세크레톰으로의 치료에 반응하는 사이토카인 프로파일 (예로, IL-8 수준)을 평가할 수 있다. IL-8 수준은 MSC 세크레톰으로 처리된 조직에서 감소될 수 있다.
실시예 3: MSC 세크레톰 특성화 및 성질
MSC-S는 상처 치유와 관련된 핵심 인자로 구성된다. 상처 치유 및 복구와 관련된 두드러진 인자는 MSC-S를 구성한다. MSC-S의 생화학적 특성화는 105개의 상이한 단백질을 포함하는 인간 성장인자/사이토카인 어레이를 사용하여 수행되었으며 (도 2), 고도로 대표되는 대부분의 단백질은 상처 치유를 촉진하거나 조직 복구를 위한 중요한 공정을 조정하는데 관여한다 (예로, 산화적 스트레스를 감소시킴).
MSC-S는 낮은 응집 성향을 나타낸다. MSC-S를 분석하여 안정성 및 응집 성향을 평가하였다. 본 연구에서, MSC-S는 pH 6.4 및 7.4의 포스페이트 완충액에서 준비되었다. MSC-S는 먼저 4℃, 실온 (20℃) 및 37℃에서 7일 동안 보관에 의한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 특성화한 다음 SEC에 의해 해당 시료를 재평가하였다. 온도 증가와 상관관계가 있고 시간 경과 시 응집된 물질의 약간의 증가를 반영하는 하나의 SEC 피크 (RT 8.5분)의 약간의 증가만이 관찰되었다.
응집 성향을 추가로 분석하기 위해, 정적 광산란 (SLS) 열 응집 분석을 수행하였다 (도 3). 이 검정법은 266 nm 및 473 nm에서 SLS를 측정한다. SLS266 측정이 시료 강도의 변화에 더욱 민감하여 작은 입자 형성의 시작을 알리는 반면, SLS473 측정은 더 큰 응집물을 검출하는데 유용한다. 작은 응집물의 발생 온도 (Tagg-266nm)는 pH 6.4 (54℃; 도 3b)와 비교하여, pH 7.4 (68℃ 내지 70℃; 도 3a)에서 시료에 대해 더 높은 것으로 관찰되었다. 이것은 MSC-S가 열 응집 성향의 견지에서 pH 7.4에서 더욱 안정적임을 나타낸다. 중요하게도, 테스트된 둘 다의 pH 값 (도 3a 및 도 3b)에 대한 온도 범위 전체를 통해 큰 응집물 (SLS473 nm)에 대한 감지할 수 있는 신호가 관찰되지 않았으며, 큰 응집물 형성 정도가 매우 낮음을 나타낸다.
MSC-S는 인간 일차 각막 상피세포의 이동을 촉진한다 . MSC-S (로트 2)의 능력은 신속한 상처 봉합을 위한 중요한 과정인 각막 상피세포의 이동을 촉진하는 것으로 평가되었다. 이동을 측정하는데 인간 일차 각막 상피세포를 사용하는 트랜스웰 이동 검정이 구현되었다. 세포를 다공성 막 바닥이 있는 상부 체임버의 기본 배지에 접종하였다. 다음으로 체임버를 MSC-S를 포함하는 배지에 배치하였다. 24시간 후 이동된 세포를 정량화한다. 데이터는 MSC-S가 실제로 상피세포의 이동을 촉진함을 보여주었다 (도 4a 및 도 4b). 추가 데이터는 열 변성 (90℃/10분)이 MSC-S의 이동 촉진하는 활성을 없애는 것을 나타내었으며 (도 4b), 검정법을 안정성 표시하는 검정법으로서 확립하였다.
MSC-S는 항-혈관형성 성질을 나타낸다 . MSC-S의 특성화는 혈관형성과 관련된 핵심 단백질을 확인할 뿐만 아니라 시험관내 내피 관형성에 미치는 영향을 평가하도록 수행되었다. MSC-S의 함량은 인간 혈관형성 단백질 어레이 (R&D 시스템사)를 사용하여 분석하였다 (도 5a). 여러 생산 로트를 분석한 결과, 동일성과 상대 정량 둘 다에서 단백질 조성이 일관된 것으로 밝혀졌다. 어레이의 분석은 가장 두드러진 단백질이 항-혈관형성으로 분류되고, 프로-혈관형성 분자의 2배 내지 7배 과량으로 존재함을 보여준다 (도 5b). 주목할만하게, 기질-금속프로테아제 저해제인 TIMP-1은 높은 수준으로 존재하며, 이는 TIMP-1을 MSC에 의해 생성되는 주요 항-혈관형성 조절제로서 확인하는 보고서와 일관된다 (Zanotti, et al., Leukemia. 2016년 5월; 30(5): 1143-54.). 항-혈관형성 생화학적 지문은 혈관형성 특징의 억제가 관찰된 세포 기반의 검정법으로 번역되었다. HUVEC 관형성 검정을 사용하여, MSC-S와 함께 배양하면 전체 튜브 길이, 분지점 수 및 루프 수와 같은 관형성 매개변수가 약화되는 것으로 관찰되었다 (도 6). 종합적으로, 이러한 특징의 억제는 MSC-S가 혈관신생을 손상시키는 점을 강조한다. MSC-S의 이러한 항-혈관형성 성질은 상처 치유 과정 동안 각막 혈관신생을 손상시켜 시력 손상 또는 실명의 기회를 감소시킬 잠재력이 있기 때문에 안과용 치료제로 매우 적합하다.
MSC-S는 항-반흔 성질을 나타낸다 . MSC-S의 항-반흔 성능의 평가를 수행하였다. 각막 외상에 이어서, 간질의 섬유모세포는 여러 바이오마커를 특징으로 하는 과정에서 흉터 형성의 표식인 근섬유모세포로 분화한다. 근섬유모세포 분화는 진피 섬유모세포를 사용하고, 분화의 강력한 유도인자인 TGFβ-1을 사용한 치료를 사용하여 시험관내에서 복제될 수 있다 (Li, M. et al., Int. Wound J. 2017년 2월; 14(1): 64-73). 이 검정법을 사용하여 분화를 손상시키는 MSC-S의 능력을 평가하고, qPCR을 사용하여 근섬유모세포 분화 과정 동안 둘 다 상향조절되는 핵심 바이오마커, TGFβ-2 및 평활근 액틴 (SMA)의 발현을 평가하였다 (도 7). 데이터는 MSC-S가 TGFβ-2 및 SMA 둘 다의 발현을 저하하는데 강력한 효과가 있음을 보여주었으며, 이는 근섬유모세포 분화의 억제를 나타낸다. 따라서, MSC-S는 항-반흔 성질과 흉터 없는 각막 상처 치유를 매재할 수 있는 잠재력을 입증하였다.
MSC-S 는 시험관내 각막 세포 증식을 증가시킨다. 세포 증식을 촉진하는 MSC-S의 능력을 평가하기 위해, 일차 토끼 각막 상피세포를 사용하여 시험관내 검정법을 수행하였다. MSC-S와 함께 배양할 때, 일차 토끼 각막 세포의 배양에 이어서 증식이 용량 의존적 방식으로 증가한다 (예를 들어, Fernandes-Cunha, GM, et al., Stem Cells Transl. Med. 2019 참조).
MSC-S는 다양한 각막 외상 모델에서 생체내 상처 봉합을 개선한다. 시험관내 설정에서 증가된 세포성 증식을 입증한 이후에, 상처 치유를 마우스 모델에서 기계적 각막 손상에 이어서 평가하였다. MSC-S는 4일 동안 매일 한 방울씩 투여되었고, 치료 중단 24시간 후에 평가되었다. 유의한 상처 봉합을 식염수와 비교하여 MSC-S를 투여한 눈에 대해 관찰하였다 (예를 들어, Fernandes-Cunha, GM, et al., Stem Cells Transl. Med. 2019 참조)(*, p < 0.05).
MSC-S의 제 2 로트 (BSS에서 제형화됨)를 래트의 각막 알칼리 화상 모델을 사용하여 평가하였다. 각막 알칼리 화상 유도된 래트에게 MSC-S를 국소 적용하면 각막 손상이 유의하게 감소하였다 (도 8). 알칼리 화상은 중증 상피 상처, 혈관신생 및 혼탁을 포함하여 매우 명백한 중증 각막 손상을 유도하였으며, 이는 8일까지 지속되었다 (도 8). 도 8은 알칼리 화상이 유도된 실질적인 상피 손상이 비히클 대조군의 경우 손상 후 2일, 3일 및 4일째 단지 16.7 ± 14.3%, 48.0 ± 6.04% 및 69.4 ± 6.74%의 상처 봉합 나타내고, 대조적으로 MSC-S 처리된 실험군은 각각 47.0 ± 37.2%, 75.7 ± 23.6% 및 92.1 ± 5.73%의 상처 봉합으로 실질적인 개선을 나타낸다.
MSC-S는 각막 화학적 화상에서 혼탁도 및 신생혈관 크기를 감소시킨다. MSC-S는 각막 알칼리 화상 모델에서 혼탁도 및 신생혈관 크기를 유의하게 감소시켰다 (도 10). 비히클 처리군에 대한 혼탁도 점수는 5일, 6일, 7일 및 8일째 MSC-S 처리군의 경우2.25 ± 0.5, 2.75 ± 0.5, 2.0 ± 0 및 2.5 ± 0.6과 비교하여,3.0 ± 0, 4.0 ± 0, 3.75 ± 0.5 및 3.75 ± 0.5이었다 (각각 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 및 *p < 0.05). 또한, 비히클 대조군 처리군의 신생혈관 크기 점수는 5일, 6일 및 7일째 MSC 처리된 실험군의 경우 각각 1.5.0 ± 0.6, 1.75 ± 0.5 및 1.75 ± 0.5와 비교하여 2.5 ± 0.6, 3.0 ± 0, 3.0 ± 0이었다 (*p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.01). 이 데이터는 MSC-S의 항-혈관형성 성질 (도 5 및 도 6) 및 MSC-S의 항-반흔 성질 (도 7)을 보여주는 시험관내 데이터와 일치한다.
실시예 4: 각막 상처를 치료하는데 안전하고 효과적인 MSC 세크레톰, MSC-S를 포함하는 안과용 약제학적 제형물
국소 안과용 약물 개발은 종종 더 깊은 안구 조직에 도달하는 5% 미만의 국소 투여 용량과 함께 눈물 회전율 및 희석, 코눈물 배출 및 반사 깜박임을 포함하여 많은 해부학적 제약으로 인해 방해를 받는다 (Gaudana et al., 2009). 각막 상처의 경우, 초기 손상은 각막 상피에 균열을 일으키고, 이로써 국소적으로 적용된 MSC-S가 상피층을 관통할 수 있게 한다. 제형화된 치료제의 각막 상의 체류 시간이 지나치게 제한될 수 있고, 따라서 제형화 전략은 (1) 자극 및 열상을 줄이도록 눈물 pH (pH 7.4)의 모방을 포함하는 pH 평가, (2) 부작용 유발 없이 눈물 희석을 극복하고, 전달된 유효 용량을 최적화하도록 MSC 세크레톰의 농도를 최적화하는 것, (3) FDA 승인된 점성 점막접착제, 히드록실프로필메틸 셀룰로스 (HPMC, 하이퍼멜로스)를 활용하여 체류 시간을 증가시키고, 안구 침투를 증가시키며, 지속적인 치료제 전달을 제공하는 것, (4) 비-선택적 진핵생물 독성의 유발 없이 각막 침투를 최적화하도록 제형물의 친유성을 증가시키는 것을 포함하여 평가될 수 있다. 이러한 제형물 모두의 변경은 MSC-S가 안정적이고 강력하게 유지되는 것을 보장해야 한다.
제형물은 치료 효능을 유지하면서 가장 안정한, 내약성 제형물일 수 있다. FDA 승인된 약제학적 부형제, HPMC은 초기 평가를 위해 활용될 수 있으며, 효과적이고 적합하며 안정한 제형물을 달성하기 위해 필요에 따라 변경될 수 있다. HPMC는 반합성, 불활성, 점탄성 중합체로 안과용 윤활제 및 조절 전달제로서 광범위하게 사용된다. 이의 생체접착 성질은 셀룰로스 중합체의 카르복실산 기 및 점막층에 존재하는 뮤신의 당단백질 사이에 수소 결합이 형성되기 때문이다. 염, 소르비톨 또는 프로필렌 글리콜과 같은 삼투압 조절제를 포함하는 포스페이트, 아세테이트 또는 시트레이트와 같은 완충액을 첨가하여 점도, 친유성 및 이에 따른 체류 시간을 증가시킬 수 있다.
적절한 pH (pH 6.8 및 7.4) 및 긴장성 (285 mOsm/L)의 제형물은 안정성 평가를 위해 적절한 점도 (예로, 15 내지 150 mPa*s)로 겔화된다. 치료를 받거나 치료를 받고 있는 임상 환자에게 안정적으로 제공할 수 있는, 2℃ 내지 8℃에서 안정한 1주 가정 배달분을 개발하도록 2가지 프로토타입 제형물을 개발할 수 있다. 1개월 안정성 평가를 시행하여 선택한 프로토타입 제형물의 물리적 및 화학적 안정성을 평가할 수 있다. 시점들은 2℃ 내지 8℃에서 제로 시간에 이어서 1주, 2주 및 4주, 다음으로 실온 (안정성 가속화)에서 1주를 포함할 것이다. 생체활성에 대해 시료를 검정할 수 있다.
이러한 MSC-S 제형물은 제형물의 점도 증가 및 이에 따른 안구 표면 상의 항균제의 체류 시간 증가로 인해 더욱 효과적인 의약품을 제공할 것이다.
최적화된 MSC 세크레톰 제형물의 안구 내약성의 평가:
안구 자극 연구는 MSC-S 및 의약품 제형물에서의 부형제가 환자에게 허용될 수 있는지 확인하는데 사용될 수 있다. 동물 실험을 줄이기 위해, 눈 자극 평가는 에피오쿨라TM (EpiOcularTM) 눈 자극테스트, 인간 세포 유래의 시험관내 각막 조직 모델을 사용하여 시행할 수 있다. 에피오쿨라TM 눈 자극 테스트는 드레이즈 토끼 눈 테스트에 대한 시험관내 대안이다 (Kandarova et al., 2019).
인간 각막 세포에 대한 내약성은 에피오쿨라TM 눈 자극 테스트를 사용하여 평가할 수 있다. 내약성은 또한 생체발광 인간 상피세포 기반의 검정 (루미게닉스사)을 사용하여 평가할 수 있다.
설치류 각막 상처 모델에서 최고의 안전성 프로파일을 가진 제형물을 평가할 수 있다.
설치류 화학적 화상 모델에서 최적화된 제형물의 치료 잠재력의 평가:
각막 알칼리 화상 상처 모델의 사용은 현재 임상적으로 가장 적절한 각막 화상 상처 모델이다 (Chen et al., 2016: Fernandes-Cunha et al., 2019). 각막의 알칼리 화상를 각 래트의 왼쪽 눈에서 유도할 수 있다. 1 M NaOH로 적신 필터 디스크 (직경 5mm)를 각막 중앙에 30초 동안 배치하고, 이어서 식염수 200 mL로 세척하였다. 각막 알칼리 화상 직후부터 동물은 치료를 받았다 (Choi, H., et al., Curr. Eye Res. 2017 10월; 42(10): 1348-1357 참조). 각막 알칼리 화상 상처 모델에서 혈관신생, 혼탁, 상피 결함을 평가할 수 있다.
실험군 사이의 치료 효과를 비교하는 통계 분석은 비히클 대조군 또는 치료 실험군을 기준으로서 사용하는 듀넷 사후 비교 테스트와 함께 원웨이 ANOVA를 사용하여 수행할 수 있다. 데이터는 P < 0.05에서 유의하게 다른 것으로서 간주될 수 있다.
각막 상처는 이러한 임상적으로 적절한 설치류 모델의 강건함 및 이전의 연구에서 나타난 결과에 의해 입증된 바와 같이 비히클 대조군 눈에서 발생할 것으로 예상할 수 있다 (Fernandes-Cunha et al., 2019). 일관된 상처가 관찰되지 않는 경우, 수산화나트륨이 각막에 배치되는 시간 및/또는 래트의 크기 및 변화와 같은 실험 매개변수를 변경하여 사용할 수 있다. HBBS에서 제형화된 의약품과 비교하여 효능이 더 좋은 의약품은 점막접착제인 HPMC의 첨가로 인해 제형물의 점도가 증가하고 이에 따라 안구 표면에서 MSC-S의 체류 시간이 증가하기 때문일 수 있다. 이것은 유의하게 낮은 임상 점수, 상처 크기의 감소, 혈관신생, 혼탁 및 상피 결함으로 나타날 것이다 (적절한 경우 업데이트). 또한, 더 높은 MSC-S 용량은 더 낮은 농도보다 더욱 효과적일 것으로 예상된다. 일부 경우에는, MSC-S의 국소 적용의 빈도를 증가시키거나, MSC-S 제형물 로딩 용량을 변경하여 효능을 평가할 수 있다.
실시예 5: 각막의 화학적 화상 및/또는 지속적인 각막 상피 결함 (PCED)
화학, 제조 및 관리의 요약
인간 골수 유래의 중간엽 줄기세포 세크레톰으로부터 유래한 MSC-S는 생리적 수준으로 존재하는 사이토카인 및 성장인자를 포함한 생물학적 활성이 있는 내인성 성분의 혼합물로 구성된다. 중간엽 줄기세포 세크레톰은 케모카인, 사이토카인, 성장인자, 단백질, 효소 및 리보핵산 (RNA)과 같은 매우 강력한 생물학적 물질을 포함한다.
마스터 세포은행 (MCB) 및 작업 세포은행 (WCB) 제작을 포함한 전체 MSC-S 생산 공정은 현재의 의약품 제조관리기준 (cGMP)을 준수하여 수행된다. 기증자 중간엽 줄기세포 (MSC)는 테스트되고, 검사 결과 바이러스와 전염병에 대해 음성인 것으로 검증되었다.
MSC-S 제조는 기증자 MSC의 단일 회분으로부터 유래한 MCB를 사용하여 시작한다. MCB로부터 WCB를 제작하고, WCB로부터 세크레톰 배치를 생성하고, 농축시키고, 투과여과하여 MSC-S 약물 원료를 생산한다. MSC-S 의약품은 6 μg의 MSC-S 약물 원료를 안과용 약물을 위한 공정서 약제학적 부형제와 조합하여 5 mL의 MSC-S 의약품을 생산함으로써 제형화한다.
MSC-S는 안과용 국소 전달을 위해 제형화되며, 각 병이 하루 동안 사용할 수 있도록 안약 병에 포장된다. 병에 담긴 MSC-S는 사용 전에 최대 24시간 동안 냉장고에서 해동되고, 사용 예정일 동안 냉장 보관된다.
비-임상 결과의 요약
MSC-S의 비-임상 평가는 시험관내 약리학 연구, 래트의 생체내 약리학, 인간 조직 모델의 시험관내 자극성 및 래트 및 토끼의 반복-투약 독성 연구를 포함한다.
트랜스웰 이동 검정은 MSC-S가 각막 상피세포와 인간 일차 섬유모세포의 이동을 자극하는 것으로 나타났다. MSC-S의 이동 촉진 효과는 또한 상처 간격 검정을 사용하여 검증되었으며, 여기서 MSC-S는 대조군과 비교하여 각막 상피세포 단일층에서 간격의 치유를 향상시켰다.
인간 혈관형성 단백질 어레이를 사용하여 MSC-S의 단백질 조성에 대한 생화학적 평가는 존재하는 가장 두드러진 단백질이 혈관형성 촉진 분자의 2배 내지 7배 초과였기 때문에 MSC-S의 항-혈관형성 능력을 지원한다. 치료 화합물의 혈관형성 잠재력을 평가하기 위해 잘 확립된 시험관내 모델인 인간 제대 관형성 검정은 MSC-S가 혈관형성을 촉진하지 않으며 혈관 내피 성장인자 단독과 비교하여 관형성 매개변수를 약화시키는 점을 입증하였다.
MSC-S를 갈색 노르웨이 래트를 대상으로 한 알칼리 화상 용량 범위 연구에서 평가하였다. 본 연구에서 0.6 또는 6 μg/mL의 MSC-S를 매일 3회 국소 투여하면 상처 봉합이 향상되고, 각막 혼탁과 혈관신생이 감소하여, MSC-S가 각막 외상 이후 각막 재상피화에 대한 잠재적 치료제가 될 수 있음을 시사한다.
에피오쿨라 인간 조직 모델에서 시행된 시험관내 자극성 연구에 따르면, MSC-S는 테스트 항목이 처리된 조직의 생존력을 대조군 조직의 50% (ET50)로 감소시키는데 필요한 노출이 대조군 및 MSC-S 둘 다의 경우에 60분 이상으로 자극적이지 않았다.
래트와 토끼에서 반복-투여 독성학을 평가하였다. 공식 연구실 시행기준 (GLP) 토끼 독성학 연구에서 조사할 용량을 확인하기 위해 반복-용량 범위 결과 연구를 래트에서 시행하였다. 임상 연구의 치료 지속기간과 일치시키기 위해, MSC-S의 안구 점적에 이어진 14일 GLP 독성학 연구를 토끼에서 시행하였다. 토끼는 인간의 눈과 해부학적 유사성 때문에 독성학 종으로 선택되었다. 13 mm 토끼 각막 직경 대비 인간의 11 mm 각막 직경 및 깜박임 속도의 감소; 인간에서 매 5초에 비해 토끼에서 매 6분은 따라서 MSC-S의 안구 노출에 대한 엄격한 안전성 테스트를 제공한다 (Vezina 2012).
887 778`564443
소개
산물의 개요
MSC-S는 신규한 중간엽 줄기세포 세크레톰 (MSC-S) 요법이고, 시력을 위협하는 각막 상처를 치료하기 위해 개발되고 있다. MSC-S는 래트의 알칼리 화학적 화상 모델의 비-임상 연구에서 각막 상처 치유를 가속화하고, 흉터 형성, 염증 및 각막 혈관신생을 감소시키는 것으로 나타난 생리적 수준으로 존재하는 사이토카인 및 성장인자를 포함한 생물학적 활성이 있는 성분의 혼합물로 구성된다.
인간 MSC는 골수, 혈액, 골격근, 태반, 양수 및 인간 각막의 변연부 간질을 포함한 많은 성인 조직으로부터 단리된 섬유모세포 유사 세포의 불균질한 집단이다. MSC는 자가 재생 능력, 높은 가소성, 면역 반응 조절의 성능 및 유전자 변형 능력으로 인해 실질적인 재생 잠재력을 나타낸다 (Ferreira et al. 2018; Harkin et al. 2015). 일반적으로 MSC-S로도 지칭되는 MSC에 의해 생성되는 생체-인자는 케모카인, 사이토카인, 성장인자, 단백질, 효소 및 RNA와 같은 매우 강력한 생물학적 내인성 물질을 포함한다. 문헌에는 각막 상피 상처 치유를 포함하여 MSC-S의 치료적 잠재력을 강조하는 전임상 연구가 보완되어 있다 (Samaeekia et al. 2018; Vizoso et al. 2017). 추가적으로, MSC-S는 무-세포 요법이고, 침윤적 세포 수집 절차가 필요하지 않은 조건화 배지로부터 획득되기 때문에, 줄기세포 요법을 능가하는 임상적 및 상업적 전환을 위한 여러 핵심 장점을 소유한다. 이러한 장점은 이식된 MSC의 안전성 위험 (종양원성, 면역계 거부 및 이동)의 제거, 급성 치료에 대한 보다 즉각적인 이용가능성 (침윤적 세포 수집 절차를 회피함으로써 가능함), 생산 조절의 잠재력, 배포 및 효능 (통상적인 제제와 유사함), 장기간 보관, 안정성 및 휴대가능성, 그리고 공급 비용 절감을 포함한다.
MSC-S 약물 원료는 cGMP MSC로부터 유래한 cGMP를 준수하는 MSB를 사용하여 제조된다. MSC를 해동하고, 접종하고, 증식시켜 3.0 L의 중간체 MSC-S 약물 원료를 생산하였다. 다음으로 중간체를 농축하고, 투과여과하고, 점안액 병의 무균 충전을 위한 최종 MSC-S 의약품 제형물을 제형화한다.
MSC-S는 5 mL 점안액 병에 국소 안구 주입을 통해 전달된다. MSC-S는 일염기성 소듐 포스페이트 무수물 (2.28 mg), 이염기성 소듐 포스페이트 건조물 (11.45 mg), 트레할로스 이수화물 (24 mg), 만니톨 (12.2 mg), 하이프로멜로스 (0.1 mg), 미국 약전 (USP) 등급의 주사용수, pH 조절을 위한 염산 및/또는 수산화나트륨에서 제형화된 6 μg/mL의 MSC-S 약물 원료를 포함하도록 제형화된다.
표적 질환 및 적응증의 개요
각막은 눈의 최외부 조직으로서 보호 역할을 하지만, 중증 손상 및 질환에 매우 취약하다. 혈관이 없기 때문에 높은 투명도를 부여하지만, 치유 능력이 제한된다. 미국 (US)에서, 인구 1,000명 당 대략 3.15명의 응급실 또는 눈 외상센터에서 제시된 추정 발병률로는 240만 명이 넘는 개인이 눈 손상을 경험한다 (McGwin and Owsley 2005; Serrano et al., 2013).
화학적 화상과 같은 중증 손상은 안구 표면 상피, 각막, 전안부 및 변연부 줄기세포를 광범위하게 손상시킬 수 있으며, 빈번하게 실명, 기형 및 문제가 되는 안구 표면 합병증을 유발할 수 있다 (Baradaran-Rafii et al. 2017; Singh et al. 2013). 화학적 화상은 산 또는 알칼리 노출로 인해 유발될 수 있으며, 알칼리 화상은 더 심하다. 알칼리 화상은 산보다 더 쉽게 전실을 관통할 수 있으며, 백내장 형성, 섬모체 손상 및 섬유주망에 대한 손상을 유도할 수 있다 (Singh et al. 2013).
안구 손상은 손상 당시의 변연부 관여 정도에 따라 분류되며, 변연부 허혈이 없으면 최고의 예후를 예측한다 (Baradaran-Rafii et al. 2017). 각막의 화학적 화상의 임상 경과는 초기, 급성기, 초기 복구기, 후기 복구 및 후유증의 4단계로 나눌 수 있다. 각막 손상 단계의 임상적 특징은 표 1에 정의되어 요약된다.
Figure pct00006
기존의 치료에도 불구하고 1주 내지 2주의 예상 기간 내에 치유되지 않는 상피 결함은 지속성 각막 상피 결함 (PCED)으로서 정의된다 (Katzman and Jeng 2014). 각막 감각이상, 당뇨병성 각막병증, 변연부 줄기세포 결핍, 안구 건조증, 노출 각막병증 및 헤르페스 감염 또는 이전 각막 이식으로 인한 신경영양성 각막병증을 포함하여 PCED에 기여할 수 있는 많은 위험인자가 있다 (Katzman and Jeng 2014). 병인학과 관계없이 PCED의 치료는 여전히 도전적이며, 결과는 침범된 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미친다.
현재의 치료법
각막 상처의 관리는 지난 수십 년 동안 크게 변화되지 않았으며, 주로 윤활, 항생제, 스테로이드, 패치, 자가 혈청 눈, 일부 경우 봉합된 눈꺼풀 봉합 또는 양막 이식의 형태로 지원하는 척도로 구성된다 (Baradaran -Rafii et al. 2017; Ziaei, Greene, and Green 2018). 이러한 치료는 제한된 성공을 거두었으며, 물류, 절차적 침윤성 및 환자 내성 부족의 문제가 있다. 따라서, 중증 안구 표면 손상이 있는 환자를 위한 개선된 안구 표면 치유 요법에 대한 충족되지 않은 중요한 요구가 있다 (Fernandes-Cunha et al. 2019).
물리적, 화학적, 약제학적 성질 및 제형화
MSC-S는 생리적 수준으로 존재하는 사이토카인 및 성장인자를 포함한 생물학적 활성이 있는 내인성 성분의 혼합물로 구성된다. MSC-S 약물 원료 중간체는 인간 골수 유래의 MSC로부터 유래한 세크레톰이다. 본 예는 단일 기증자로부터의 MSC 단일 회분으로부터 유래한 MCB 및 이러한 MCB로부터의 WCB를 제공한다. WCB 바이알을 사용하여 세크레톰의 배치를 생성한 다음 농축하고, 투과여과하여 MSC-S 약물 원료를 생산하였다. MSC-S 약물 원료는 일염기성 소듐 포스페이트 무수물 (2.28 mg), 이염기성 소듐 포스페이트 건조물 (11.45 mg), 트레할로스 이수화물 (24 mg), 만니톨 (12.2 mg), 하이프로멜로스 (0.1 mg), USP 등급의 주사용수, pH 7.4로 조절하는 염산 및/또는 수산화나트륨에서 6 μg의 MSC-S 약물 원료 (1 mL 당)를 조합함으로써 안과용 약물을 위한 공정서 약제학적 부형제와 함께 제형화하였다.
MCB 및 WCB 제조를 포함한 전체 MSC-S 생산 공정은 cGMP를 준수하여 수행된다. MCB, WCB 및 세크레톰 추출물 및 특성화에 대한 설명은 다음의 섹션에 설명된다.
최초 마스터 세포은행의 제조
MCB (기증자 MSC)를 제작하는데 사용된 MSC는 정상적인 건강한 기증자의 인간 골수로부터 유래하였으며, cGMP 조건 하에 제어된 제조 공정을 사용하여 2회 계대로 증식시켰다. 이들 세포응 지방세포, 골세포 및 연골세포로의 증식 잠재력, 세포 표면 마커 발현 및 분화 잠재력에 대해 특성화하였다. 이들을 2회 계대 증식 이후에 특성화하였으며, 세포 증식 잠재력이 있는 계대 4 (P4)의 세포는 우세하게 (≥ 80%) CD166 및 CD90 양성 세포이면서, CD34 및 CD45 (조혈 계열)에 대해 ≤ 20% 양성이었고, 예상된 골세포, 연골세포 및 지방세포로의 분화를 나타내고, 인터페론-감마 (IFN-γ) 자극 및 키누레닌, 면역 활성화의 마커의 형성에 이어서 염증성 자극에 대한 선천성 및 후천성 면역 반응에 미치는 강력한 국소 효과를 매개하는 효소, 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 유도를 통해 면역조절 활성을 나타내었다. MSC는 또한 계대 및 증식에 이어서 정상 인간 남성으로부터 나온 것을 검증하였다.
기증자 MSC를 인간 면역결핍 바이러스, B형 및 C형 간염, 인체 T-림프자극성 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 인간 파필로나 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 파보바이러스, 인간 전염성 해면상 뇌병증 및 마이코플라스마를 포함한 다양한 바이러스 및 기타 전염병 인자에 대해 테스트하여 음성 판정을 받았다.
기증자 MSC를 cGMP 준수 제조 현장에서 제조하여 특성화하였으며, 기증자 MSC에 대한 분석 인증서는 음성 무균도, 내독소 수준 < 0.50 내독소 단위 (EU)/mL, 음성 마이코플라스마 및 외래성 인자가 검출되지 않음을 기록하고, 100.0% 세포가 CD CD90, 97.8% CD166, 1.2, CD34 및 1.4% CD45 표면 마커를 차지하는 인간 세포로서 검증하였다. 세포 계수는 98% 계산된 생존력을 갖는 바이알 당 2.3 × 107개 세포이었다. 세포를 계대하고, 이러한 증식에 이어서 세포를 특성화하고, 우세하게 (≥ 80%) CD166 및 CD90 양성 세포가 살아있으면서 CD34 및 CD45 (조혈 계열)에 대해 ≤ 20% 양성인 것으로 검증하였다. 계대된 세포를 테스트하고, 마이코플라스마 (음성), 무균성 (음성), 세균증식억제/진균증식억제 (억제 없음) 및 내독소 (< 10 EU/mL)에 대한 배포 기준을 충족하였다.
작업 세포 은행
세포를 이러한 증식에 이어서 세포를 특성화하고, 우세하게 (≥ 80%) CD166 및 CD90 양성 세포가 살아있으면서 CD34 및 CD45 (조혈 계열)에 대해 ≤ 20% 양성인 것으로 검증하였다. 세포는 테스트하여, 마이코플라스마 (음성), 무균도 (음성) 및 내독소 (<10 EU/mL)에 대한 배포 기준을 충족하였다. 이들 바이알을 냉동하고, 하기에 기재된 바와 같이 향후 MSC-S의 제조에 사용하기 위해 보관하였다.
MSC-S 약물 원료의 제조
세포를 임상 등급의 MSC-S를 만드는데 사용하였다. 바이알을 해동하고, 접종하고, 수확하여 3 L 배치의 중간체 MSC-S 약물 원료 (인간 중간엽 줄기/간질 세포 [hMSC] 세크레톰)을 생산하였다. 세크레톰의 내인성 생물학적 성분은 TIMP-1 (금속프로테아제-1의 조직 저해제), HGF (간세포 성장인자), VEGF (혈관 내피 성장인자) 및 EV (세포외 소포)를 포함한다.
다음으로 세크레톰 중간체 약물 원료를 농축하고, 투과여과하여 300 mL의 정제된 MSC-S 약물 원료를 제공하였다. 최종 MSC-S 약물 원료의 물리적 및 화학적 성질은 표 2에 제공된다.
Figure pct00007
약제학적 제안
최종 의약품을 제형화하였다. MSC-S 의약품을 표준 의료 등급 USP 클래스 VI 폴리에틸렌 레진 멸균 안약병 내에 무균적으로 충전하였다. 각 병이 5 mL의 MSC-S 제형물을 포함하였다. 병 당 제형물의 세부사항은 표　2에 제공된다.
MSC-S 의약품은 pH 7.0 내지 7.4 및 280 내지 320 mOsm/kg의 삼투도인 무균의 투명한 무색 용액이었다. 최종 의약품에 대한 분석 인증서는 세포가 마이코플라스마 (음성), 세균증식억제/진균증식억제 (억제 없음), 무균도 (음성) 및 내독소 (< 10 EU/mL)에 대한 배포 기준을 충족함을 검증하였다.
MSC-S 의약품의 각 병 (5 mL)이 하루 투여 용량으로만 사용되도록 하였다.
부형제를 포함하는 제형물
MSC-S 안과용 용액은 표 3에 나타낸 바와 같이 제형화된 멸균 용액이다. MSC-S 의약품은 일염기성 소듐 포스페이트 무수물 (0.27 mg), 이염기성 소듐 포스페이트 건조물 (1.09 mg), 만니톨 (0.4 mg), 하이프로멜로스 (0.1 mg), USP 등급의 주사용수, pH 7.4로 조절하는 염산 및/또는 수산화나트륨을 포함하는 안과용 약물을 위해 승인된 공정서 약제학적 부형제와 함께 6 μg의 MSC-S 약물 원료 (%w/w)를 조합함으로써 제형화하였다.
Figure pct00008
보관 및 취급
각 MSC-S 의약품은 임상 현장에서 -20℃에서 보관하고, 냉장고 (2℃ 내지 8℃)에서 해동한 다음 사용 예정일 전에 최대 24시간 동안 냉장 보관해야 한다. 사용 예정일 동안 MSC-S는 냉장 보관해야 한다. 저장 및 취급 세부사항은 연구 프로토콜에 설명되어 있다.
안정성 데이터
MSC-S 의약품의 안정성을 평가하였다. MSC-S를 25℃ 또는 5℃에서 고정된 기간 동안 보관한 이후 물리적 특징 및 생체활성을 평가하기 위해 제형화하고, 안정성 프로그램에 적용하였다. 상세하게, 물리적 외관, pH, 삼투도 및 점도를 평가하였다. 물리적 특성은 5℃에서 최대 30일 동안 및 25℃에서 1주일 동안 평가하였다. 안정성 프로그램의 지속기간 동안 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, MSC-S의 안정성은 세포 기반의 이동 생체검정 (하기에 설명된 검정법)을 사용하여 평가하였다. 도 10은 MSC-S가 5℃ 및 25℃ (상온)에서 보관될 때 7일 동안 강력한 프로-이동 행동을 유지하는 것을 나타낸다.
병에 든 제품은 제조에 이어서 최대 6개월 동안 -20℃에서 안정적으로 유지된다. MSC-S는 냉장 보관 조건 (2℃ 내지 8℃)에서 적어도 하루 동안 안정하고, 실온에서 단기간 (4시간 미만) 동안 안정하다. 사용가능한 안정성 데이터를 기반으로 하여, 스폰서는 MSC-S 안과용 용액에 대해 제조일로부터 6개월의 보관기간을 할당하였다. 진행 중/향후 안정성 연구로부터 생성된 데이터를 기반으로 하여 보관기간을 연장할 수 있다.
MSC-S 안과용 용액은 -80℃서 보관해야 한다. 이것은 사용 전에 해동하고, 사용 예정일의 사용 전 및 사용 중에 최대 24시간 동안 냉장 (2℃ 내지 8℃) 보관해야 한다.
비-임상 연구
소개
비-임상 개발 프로그램
국소 안구 투여에 의한 각막 상처의 치료를 위한 MSC-S의 임상 개발을 지원하기 위해 종합적인 비-임상 프로그램을 시행하였다. 비-임상 개발 프로그램은 일차 약리학 및 독성학 평가로 구성된다. 이러한 연구의 요약이 본 실시예에서 제공된다. 모든 생체내 연구에서, 임상적 투약의 의도된 경로인 국소 안구 점적을 통해 연구 의약품 (IMP)을 전달하였다.
비-임상 테스트 물질 제형화
비-임상 연구를 위한 테스트 물질은 임상 제형물과 조성이 유사한 완충 식염수에서 제형화되었다. 모든 시험관내 세포 기반의 검정법은 완충 식염수에서 제형화된 테스트 항목으로 직접적으로 수행하였고, 생체내 연구는 HPMC를 더한 완충 식염수에서 제형화된 테스트 항목으로 수행하였다.
시험관내 약리학
MSC-S는 인간 일차 각막 상피세포 및 각막 섬유모세포의 이동을 촉진한다 [연구 CM19_TWM01]
MSC-S는 인간 일차 각막 상피세포의 이동을 촉진하였다. 각막 외상에 이어서, 앞쪽 가장자리에 있는 각막 상피세포는 상처를 봉합하기 위해 이동하기 시작한다. 이동을 촉진하는 MSC-S의 능력은 트랜스웰 이동 검정을 사용하여 평가하였다. 간략하게, 세포를 다공성 막이 있는 상부 체임버의 기본 (영양소 결핍) 배지에 접종하였다. 다음으로 체임버를 MSC-S를 포함하는 기본 배지에 배치하였다. 24시간 후 막 바닥 표면 위의 이동된 세포를 염색하고, 영상화하여 정량화하였다. 먼저, MSC-S는 신속한 상처 치유에 중요한 과정인 각막 상피세포의 이동을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 예상한 바와 같이 열 (90℃/10분)은 단백질 성분의 변성으로 인해 MSC-S의 이동 촉진하는 활성을 없앤다 (도 11).
MSC-S는 각막 상피세포 상처 봉합을 촉진한다 [연구 CM19_WGA01].
MSC-S의 프로-이동 효과도 상처 간격 검정을 사용하여 검증하였다. 이 상처 치유 검정에서, 세포 단일층에 "상처 간격"이 생성되고, 간격 중심을 향한 세포 이동 및 성장에 의한 이러한 간격의 "치유"가 모니터링된다. 본 검정법에서, MSC-S로 처리된 일차 각막 상피세포는 비히클 (음성) 대조군과 비교하여 상처 간격의 향상된 치유를 입증한다 (도 12).
MSC-S는 인간 일차 섬유모세포의 이동을 촉진한다 [연구 CM19_TWM02]
각막 외상에 이어서, 각막 섬유모세포는 주변 간질로부터 침범받은 영역으로 이동한다. 각막 상피세포에서 관찰된 효과와 유사하게, MSC-S로 처리된 일차 각막 섬유모세포에서 강력한 프로-이동 반응을 관찰하였다 (도 13).
MSC-S는 음성 혈관형성 잠재력을 나타낸다.
MSC-S 조성물은 항-혈관형성을 지원한다 [연구 CM19_PA01]
외상 이후에, 종종 각막 혈관신생이 발생하여 시력 손상에 기여한다. 보다 구체적으로, 혈관신생은 조직 흉터 형성, 지질 침착, 간질 출혈 및 각막 부종을 유발하여, 시력을 심각하게 변경시킬 수 있다 (Maddula et al. 2011). 인간 혈관형성 단백질 어레이를 사용한 MSC-S의 단백질 조성에 대한 생화학적 평가는 음성 혈관형성 잠재력을 강조한다 (도 14a). 놀랍게도, 분석은 MSC-S에 존재하는 가장 두드러진 단백질이 항-혈관형성 역할을 하고, 프로-혈관형성 분자의 2배 내지 7배 과량으로 존재함을 보여준다 (도 14b). 주목할만하게, 기질-금속프로테아제 저해제인 TIMP-1은 높은 수준으로 존재하며, 이는 TIMP-1을 MSC에 의해 생성되는 주요 항-혈관형성 조절제로서 확인하는 보고서와 일관된다 (Zanotti, et al., 2016).
MSC-S는 세포 기반의 검정법에서 음성 혈관형성 잠재력을 나타낸다 [연구 CM19_TFA02]
각막 혈관형성을 상세하게 평가하는 시험관내 세포 기반의 검정법이 확립되어 있지 않지만, 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC) 관형성 검정은 치료적 화합물의 혈관형성 잠재력을 평가하기 위한 잘 확립된 시험관내 모델이다. 이러한 검정은 모세혈관 유사 혈관 구조를 형성하는 내피세포 재구성을 측정함으로써 혈관 형성을 촉진하거나 손상시키는 화합물의 능력을 평가한다. 간략하게, HUVEC 세포를 매트리겔® (BD 바이오사이언스사)의 얇은 층에 접종하고, 활성 약물 원료의 존재 또는 부재 하에 배양한다. 2 내지 6시간 이내에, 내피세포가 분열하고, 프로-혈관형성 분자에 의해 지원되는 경우 혈관망을 형성하기 시작할 것이다. 본 방법을 사용하여, 본 발명자들은 MSC-S의 총 인자 집합이 혈관형성을 촉진하지 않고, 전체 튜브 길이, 분지점 수 및 루프 수와 같은 관형성 매개변수를 약화시키는 것을 관찰한다 (도 15). 상대적으로, 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 단독 치료는 강력한 프로-혈관형성 반응을 유도한다.
MSC-S는 항-반흔 성질을 나타낸다 [CM19_CFS04]
각막 외상에 이어서, 간질의 섬유모세포는 여러 바이오마커의 조절이상을 특징으로 하는 과정에서 흉터 형성의 표식인 근섬유모세포로 분화한다. 근섬유모세포 분화는 일차 각막 섬유모세포를 사용하고, 분화의 강력한 유도인자인 TGF
Figure pct00009
-1을 사용한 치료를 사용하여 시험관내에서 복제될 수 있다 (Li, M. et al., 2017). 분화를 손상시키는 MSC-S의 능력은 근섬유모세포 분화 동안 강하게 상향조절되는 핵심 흉터 형성 바이오마커인 평활근 액틴 (SMA)에 대한 면역형광 염색을 사용하여 평가하였다. 본 발명자의 데이터는 MSC-S가 강력한 효과를 갖고 SMA의 발현을 감소시키는 것을 보여주고 (도 16), 근섬유모세포 분화의 억제를 가리키며, 따라서 흉터 형성을 손상시키거나 예방하는 능력을 나타낸다.
생체내 약리학
14일 갈색 노르웨이 래트의 각막 알칼리 화상 용량-범위 연구 [연구 COMB.002]
MSC-S의 국소 안구 제형물에 대한 효능있는 투약 강도 및 섭생을 결정하기 위해, 14일 용량-범위 연구를 갈색 노르웨이 래트의 알칼리 유도된 각막 손상의 개선으로 시행하였다. 갈색 노르웨이 래트 (대략 150 g, 12주령)의 오른쪽 눈에 각막 알칼리 화상을 입히고, 하기 표 4에 개략된 바와 같이 동물을 5 μL의 비히클 (히드록시메틸 셀룰로스 [HPMC], n = 9) 또는 5 μL MSC-S (0.6 μg/mL, n= 8; 6 μg/mL, n = 10, 60 μg/mL, n = 8)로 매일 3회, 또는 6 μg/mL MSC-S (n = 9)로 매일 6회 처리하였다.
알칼리 화학적 화상 모델은 심각한 각막 병리학을 고려할 때 MSC-S가 치료하고자 하는 적응증의 중증도와 가장 임상적으로 관련이 있기 때문에 일차 생체내 효능 모델로 선택되었다 (Chen et al. 2016; Choi, Choi, Joo 2011, Kim et al. 2015).
각막 상피의 천공은 시력에 부정적인 영향을 미치고, 또한 각막이 감염에 취약하게 된다 (Akpek and Gottsch 2003). 따라서 재상피화 속도를 증가시키는 것은 환자가 안구 감염을 일으키거나 각막 융해와 같은 다른 문제를 일으킬 가능성을 감소시키기 때문에 중요하다. 세포성 증식, 이동 및 유착을 조절함으로써 각막 상피 상처 봉합을 향상시키려는 안구 치료는 매우 중요하므로, 100% 상처 봉합률을 평가하였다.
추가적으로, 각막 혼탁 및 각막 혈관신생은 각막 알칼리 손상 모델에서 테스트 물질의 활성을 검출하기 위한, 실명과 더 높은 수준으로 관련된 예측가능한 매개변수이기 때문에 평가하였다 (Epstein et al. 1987; Schrage et al. 2002).
Figure pct00010
연구 결과
각막에 알칼리를 도포하면 도포된 모든 눈에서 중증 화학적 화상이 유발되었다. 예정된 일정 종료 이전에 각 실험군 내에서 사망이 발생하였다. 동물 사망의 빈도는 단일 치료와 상관관계가 없었고, 실험군 간의 전반적인 효능 비교에 영향을 미치지 않았다. 3, 2, 4, 1 및 2마리의 조기 사망은 실험군 1, 2, 3, 4 및 5에서 각각 발생하여, 14일째 평가를 위해 남은 총 6, 6, 6, 7 및 7마리의 동물을 얻었다. 평균 체중 경향은 1일부터 7일까지 매일 체중 감소 및 8일부터 14일까지 매일 체중의 점진적인 증가와 함께 모든 치료 부문에서 일관되었다.
알칼리 화상은 중증 상피 상처, 혈관신생 및 혼탁을 포함하여 매우 명백한 중증 각막 손상을 유도하였다. 각막 알칼리 화상으로 유발된 눈에 MSC-S를 매일 3회 국소 도포한 결과, 비히클 및 60 μg/mL MSC-S로 처리된 눈의 27%와 비교하여, 됨4일째 0.6 μg/mL 및 6 μg/mL로 처리한 눈의 57%에서 완전한 (즉, 100%) 상처 봉합을 나타내었다 (도 17a). 이에 비해, 매일 6회 6 μg/mL MSC-S로 처리한 눈은 12.5%의 상처 봉합률을 보였다. 각 처리군의 대표적인 눈으로부터 각막 손상을 나타내는 플루오세인 혈관 조영상은 도 17b에 나타낸다. 매일 0.6, 6 및 60 μg/mL MSC-S로 매일 3회 처리된 눈은 비히클 매일 3회 투여된 대조군 및 6 μg/mL MSC-S로 매일 6회 투여된 실험군과 비교하여 3일째에 더 작은 상처를 나타낸다. 매일 3회부터 매일 6회까지 6 μg/mL MSC-S의 증가된 투약 적용은 활성의 증가를 유발하지 않았고, 대신에 비히클과 비슷한 결과를 수득하였다. 이것은 상처 부위의 자극이 증가한 결과일 수 있었다.
MSC-S는 0.6 및 6 μg/mL 매일 3회 국소 투여될 때 각막 혼탁을 유의하게 감소시켰고, 6 μg/mL 매일 3회 투여될 때 혈관신생을 유의하게 감소시켰다 (도 18). 10일 동안 매일 3회 0.6 및 6 μg/mL MSC-S 실험군에 대한 혼탁도 점수는 비히클 및 60 μg/mL MSC-S 실험군의 경우 4.0 ± 0 (레벨 4가 가장 높은 혼탁도 수준임) 및 3.86 ± 0.14과 비교하여, 둘 다 3.33 ± 0.21이었으며, 다음으로 매일 6회 전달된 6 μg/mL MSC-S의 경우 4.0 ± 0이었다. 모든 MSC-S 매일 3회 실험군은 비히클 매일 3회 대조군의 4.0 ± 0과 비교하여 더 낮은 각막 혈관신생 점수 (레벨 4가 가장 높은 혈관신생 수준임)를 수득하였으며, 매일 3회 전달된 6 μg/mL 투약 실험군이 3.33 ± 0.21로 가장 효과적이고, 이어서 0.6　μg/mL MSC-S가 3.67 ± 0.21 및 60 μg/mL MSC-S가 3.83 ± 0.17로 이어졌다. 매일 6회 전달된 6 μg/mL MSC-S는 매일 3회의 비히클 대조군보다 더 활성이 없었다.
전반적으로, 10일 동안 매일 3회 0.6 또는 6 μg/mL의 MSC-S의 투여는 비히클과 비교하여 향상된 상처 치유 활성을 나타내었다. 그러나, MSC-S의 긍정적인 효과 중 일부는 실험군 간의 차이를 분간하는데 필요한 본 연구에 적용된 채점 매개변수의 동적 범위의 제한으로 인해 가려졌을 수 있다. 도면에 나타낸 바와 같이, 7일 및 14일째 6 μg/mL MSC-S 매일 3회 및 비히클 처리군의 개별 눈은 상처 치유의 현저한 차이를 도시한다. 모든 MSC-S 처리된 눈은 각막 손상으로부터 회복을 나타내는 반면, 비히클 처리된 눈의 절반은 14일째에 여전히 심각한 각막 손상 징후를 나타낸다.
결론적으로, 각막 화상 상처의 설치류 모델에서 0.6 또는 6 μg/mL MSC-S의 MSC-S를 매일 3회 국소적으로 투여하면 상처 봉합이 향상되고 각막 혼탁과 혈관신생이 감소하였다. 이러한 결과는 MSC-S가 각막 외상 이후 각막 재상피화에 대한 잠재적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 예시적인 예로서, 전형적인 투약 점안액 (20 내지 30 μL)은 120 ng 내지 180 ng의 의약품을 포함할 것이다.
시험관내 자극성
에피오쿨라 인간 조직 모델을 사용한 국소 도포된 제형물의 눈 자극 잠재력의 평가 [연구 046-19]
시험관내 자극성 연구는 MSC-S의 잠재적인 눈 자극성을 평가하기 위해 에피오쿨라 조직을 사용하여 시행하였다. MSC-S를표　2에 따라 6 μg/mL의 제한된 임상 농도로 제형화하고, 비히클 대조군 (MSC-S가 없는 제형물 용액)과 비교하였다. 에피오쿨라 조직을 3분, 30분 및 60분 동안 처리군에 노출시키고, 처리된 조직의 생존력을 ET50을 계산하도록 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브롬화물; 티아졸릴 블루) 생존력 조직 테스트를 사용하여 평가하였다. 초순수한 물을 대조군으로서 사용하고, 조직 생존력 평가 이전에 에피오쿨라 조직에 60분 동안 노출시켰다.
노출 60분째, 모든 테스트 항목은 자극적이지 않은 것으로서 분류되었다. 결과 요약은 표 5에 제공된다.
Figure pct00011
반복 투약 연구
공식 GLP 토끼 독성학 연구에서 조사할 용량을 확인하기 위해 반복-용량 비-GLP 범위 결과 연구를 래트에서 시행하였다. 임상 연구의 치료 지속기간과 일치시키기 위해, MSC-S의 안구 점적에 이어진 14일 GLP 독성학 연구를 토끼에서 시행하였다. 토끼는 인간의 눈과 해부학적 유사성 때문에 독성학 종으로 선택되었다: 13 mm 토끼 각막 직경 대비 인간의 11 mm 각막 직경 및 깜박임 속도의 감소; 인간에서 매 5초에 비해 토끼에서 매 6분. 부분적인 테스트 제제 배출, 깜박임, 눈물막 및 눈물막 교체로 인해, 국소 안구 도포 이후 신속한 제거가 발생한다. 따라서, 잠재적인 독성을 완전히 평가하기 위해 사람에 비해 눈 깜박임 속도가 실질적으로 더 느린 토끼를 사용하여 MSC-S가 눈에 체류하는 시간을 최대화하였다 (Vezina 2012).
갈색 노르웨이 래트에서 7일 동안 반복된 안구 점적 이후 MSC-S의 안구 내약성 연구 [연구 COMB.004]
MSC-S (6 μg/mL)의 안구 내약성은 갈색 노르웨이 래트 (~12주령)에 대한 반복적인 7일 연구에서 매일 3회 (오전 9시, 오후 1시 및 오후 5시; 5 μL/점적) 또는 매일 6회 (오전 7시, 오전 9시, 오전 11시, 오후 1시, 오후 3시 및 오후 5시; 5 μL/점적) 양측 국소 점적 이후에 평가하였으며, 매일 3회 비히클 (1% HPMC) (n = 1/실험군) 처리와 비교하였다. 최종 매일 용량 투여에 이어서 대략 30분에, 1일 내지 7일째 화학증, 충혈 및 배출의 드레이즈 점수에 의해 안구 내약성을 평가하였다.
모든 동물은 예정된 일정 종료까지 생존하였다. 본 연구에서 테스트 실험군의 전달에 이어서 화학증, 충혈 또는 배출이 관찰되지 않았다. 따라서, MSC-S (6 μg/mL)를 7일 동안 매일 3회 (MSC-S 최대 0.09 μg) 또는 매일 6회(MSC-S 최대 0.18 μg) 국소 투여하는 것은 갈색 노르웨이 래트에서 내약성이 좋았다.
국소 안구 투여 (GLP) 이후 토끼에서 MSC-S의 14일의 반복 투약 독성학 연구 [연구 p19-0838-00b]
본 연구의 목적은 더치 벨트 토끼에 2주 동안 반복된 국소 안구 도포에 이어진 MSC-S의 안구 및 전신 독성을 결정하는 것이었다. 토끼의 눈은 해부학적으로 인간의 눈과 유사하다. 13 mm 토끼 각막 직경 대비 인간의 11 mm 각막 직경 및 토끼의 더 느린 깜박임 속도 (인간에서 매 5초에 비해 매 6분)는 눈에 MSC-S의 더 긴 체류 시간을 주어 안전성에 대한 엄격한 평가를 허용한다 (Vezina 2012).
9마리의 수컷 더치 벨트 토끼 (18 내지 28주령)에게 MSC-S (6 μg/mL, 각 용량 30 μL)를 오른쪽 눈에 국소 점적을 통해 1주의 회복 기간과 함께 2주 동안 매일 3회 (낮은 용량; n = 4), 또는 매일 6회 (높은 용량; n = 5) 투여하였다. 처음 투약일을 0일로서 정의하였다. 왼쪽 눈은 반대쪽 대조군으로서 사용하였고, 비히클로 100 mM 소듐 포스페이트, 0.4% 만니톨, 2% HPMC, pH 7.4를 오른쪽 MSC-S 처리된 눈과 동일한 빈도로 투여받았다. 낮은 용량 (3회/일) 및 높은 용량 (6회/일)은 각각 대략 4시간 및 2시간 간격으로 투여하였다.
토끼는 15일째 (낮은 용량의 경우 4마리, 높은 용량의 경우 3마리; 최종 투약 이후 24시간) 또는 22일째 (높은 용량의 경우 2마리, 최종 투약 이후 168시간)에 희생되었다. 독성은 사망률, 임상 관찰 (매일 2회), 체중 (투여 전, 매주 및 종료 시), 안과 검사, 안압 (투여 전 및 종료 시), 임상 병리학 (혈액학, 임상 화학 및 응고; 투여 전 및 종료 시), 육안 병리학, 장기 중량 및 안구 조직병리학을 기초로 하여 평가하였다. 모든 눈의 안과 검사는 전문의 자격을 갖춘 안과 의사가 수행하였다: 투여 전, 다음으로 1일째, 3일째, 14일째 및 종료 시, 맥도날드-샤덕 채점 시스템 및 안구 후방 분절 채점 척도 그리고 간접 검안경을 사용한 슬릿-램프 생체현미경 관찰.
모든 토끼는 예정된 희생까지 생존하였다. 전반적인 병변 및 이상은 기록되지 않았다. 체중, 안압, 임상 병리학, 육안 병리학, 장기 중량, 안과 검사 또는 조직병리학에 관한 테스트 항목 관련 소견은 없었다.
결론적으로, 14일 동안 매일 3회 및 매일 6회 둘 다에서 6 μg/mL의 MSC-S를 매일 반복적으로 국소 투여하는 것은 안전하고 내약성이 좋았으며, 14일 동안 매일 3회 6 μg/mL의 MSC-S에 대한 임상적 연구를 지지한다.
인간에서 효과
MSC-S가 인간 대상체에서 테스트될 것이다. 최초 인간 연구를 위한 용량 선택은 다수의 요인을 기초로 하였다.
용량에 대한 정당화
국소 점적을 통해 6 μg/mL의 MSC-S를 매일 3회 (TID) 투약하는 것은 인간의 눈에 안전한 것으로 예측되며, 선택된 농도는 생체내 동물 연구에 의해 효과적이고 안전한 것으로서 지지된다. 인간 치료에 적절한 용량을 확인하기 위해 MSC-S 내약성 토끼 연구 (2주 투약에 이어진 1주 회복 기간), 뿐만 아니라 약리학적 활성 설치류 연구를 수행하였다. 래트의 화학적 화상 모델에서, 0.6 μg/mL 및 6 μg/mL (매일 3회)의 MSC-S는 각막 상처 치유를 향상시켰다. 매일 3회 투여된 0.6 μg/mL 및 6 μg/mL가 비히클과 비교하여 각막 혼탁을 유의하게 감소시켰으며, 매일 3회 투여된 6 μg/mL는 비히클 대조군과 비교하여 혈관신생을 유의하게 감소시켰다 [연구 COMB.002]. 또한, 건강한 토끼 눈에 14일 동안 매일 3회 또는 6회 투여된 MSC-S의 임상 제형물 6 에서 부작용이 관찰되지 않았다 [연구 p19-0838-00b].
국소 안과용 약물 개발은 종종 더 깊은 안구 조직에 도달하는 5% 미만의 국소 투여 용량과 함께 눈물 회전율 및 희석, 코눈물 배출 및 반사 깜박임을 포함하여 많은 해부학적 제약으로 인해 방해를 받는다 (Gaudana et al., 2009). 각막 상에서 제형화된 치료제의 체류 시간은 지나치게 제한될 수 있고, 따라서 토끼가 느린 눈 깜박임 속도 (인간에서 매 5초과 비교하여 매 6분 (Vezina 2012))를 나타내어 눈 상에서 MSC-S의 더 긴 체류 시간을 허용하고, 엄격한 안정성 평가를 가져오기 때문에, 토끼가 MSC-S의 안전성을 평가하는 독성학 종으로서 선택되었다. 더욱이, 토끼 연구에서 MSC-S 제형물은 체류 시간을 늘리고 안구 투과를 증가시키기 위해 더 높은 농도의 HPMC 점성 및 점막 접착성 중합체를 활용하였다. 따라서 비슷한 용량 저하를 가정하여, 각막 표면 MSC-S 농도는 인간보다 토끼에서 더 높을 것으로 예상되며, 토끼 눈에서는 부작용이 발생하지 않기 때문에 본 발명자들은 MSC-S 농도가 인간 눈에서 더 낮을 것으로 (깜박임 속도 증가로 인함) 기대하고, 인간에서 6 μg/mL (TID)의 용량을 안전한 것으로 합리화한다.
적응증, 사용법, 용량 형태
MSC-S는 각막의 화학적 화상 및/또는 지속적인 각막 상피 결함 (PCED)의 치료에 대해 지시된다. MSC-S의 용량 형태는 멸균 안과용 용액이다. MSC-S는 눈에 한 방울씩 (대략 30 μL/방울) 국소 점적을 통해 매일 3회 투여될 것이다. MSC-S의 농도는 6 μg/mL일 것이다. 추가적으로, 6 μg/mL는 10일 동안 매일 3회 투여 이후 화학적 화상 래트 모델에서 각막 상처 치유를 유의하게 개선하는 것으로 나타났으며, 건강한 토끼의 눈에 14일 동안 매일 최대 6회 도포할 때 부작용을 나타내지 않았다.
실시예 6: MSC 세크레톰의 추가 특성화 및 연구
MSC 세크레톰 - 추가 특성화
새로운 단백질 인자에 대해 추가 ELISA 분석을 수행하였다. 10개 배치에 걸쳐 2가지 추가 단백질 인자를 분석하였다: PEDF (일명 세르핀 F1), 10개 배치 분석: 273 ± 27 ng/mL; 및 DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), 10개 배치 분석: 1.35 ± 0.15 ng/mL.
별도의 MSC 세크레톰 분석에서 많은 다른 인자 및 인자 패밀리를 확인하였다.
세르핀 패밀리 (세린 프로테아제 저해제): 높은 존재의 신뢰도 (세르핀 F1, E1, A1, G1, H1, B6, E2, A3, C1, F2, I1). 더 낮은 신뢰도/풍부함 (세르핀 B1, B7, D1, B3, B8, B2, B12, A7, A4, A6). 세르핀 F1, E1 및 A1은 매우 풍부하다.
*주해 세르핀 F1 (일명 PEDF)은 추가로 확인된 분석물 중 가장 풍부하다.
항산화에 관여된 단백질: 카탈라제, 단백질 디설파이드-이소머라제, 단백질 디설파이드-이소머라제 A3, 단백질 디설파이드-이소머라제 A4, 단백질 디설파이드-이소머라제 A6, 퍼옥시레독신-6, 퍼옥시레독신-1, 퍼옥시레독신-2, 퍼옥시레독신-4.
기질 금속프로테아제: MMP2, MMP1, MMP14.
MSC 세크레톰 분석에서도 확인된 개별 단백질 또는 패밀리. 항-염증제: 가용성 스캐빈저 수용체 시스테인-강화 도메인 포함하는 단백질 SSC5D. 항-염증제: 종양 괴사인자 유도성 유전자 6 단백질 (일명 TSG-6). 혈청 알부민 (가장 풍부함). 잠복성 형질전환 성장인자 결합 단백질 (LTGFBP-1), 또한 이소형, LTGFBP-2, -3, -4.
엑소좀 분획 및 엑소좀 특성화와 관련하여 추가 분석도 수행하였다. 유세포 측정법을 사용하여 엑소좀이 CD81 및 CD63 양성임을 검증하였다.
액체 MSC 세크레톰 제형물의 안정성
안정성 분석을 수행하여 3가지 인자의 생화학적 함량을 조사하였다. 조사된 3가지 인자는 세르핀 E1, 세르핀 F1 및 TIMP-1이었다.
분석을 위해, MSC 세크레톰의 배치를 제조하고, 약물 원료 (제형화 완충액 중, 표 1에 제공된 바와 같음)의 안정성을 평가하였다. 분취량을 7일 또는 14일 프로그램의 일부로서 -20℃, 4℃ 또는 실온에 보관하였다. 연구의 종료 시, 시료는 ELISA에 의해 검정하여 세르핀 E1, 세르핀 F1 및 TIMP-1을 측정하였다. 데이터는 도 22에 제공된다. MSC 세크레톰 인자는 액체 제형물에서 적어도 14일 동안 분해되지 않는다 (도 22 참조). 다수 요인의 안정성은 제형물이 MSC 세크레톰의 전반적 단백질 안정화를 지원함을 시사한다.
생체외 원형 상처 봉합 검정을 사용하여 조사한 생체활성
원형 상처 봉합 검정은 도 23에 제공된 바와 같이, 각막 각질형성세포 (또는 섬유모세포), 뿐만 아니라 각막 상피세포에서 수행하였다. 시간 플롯에 따른 봉합을 나타내는 비율 데이터도 도 23에 도시된 그래프에 제공된다. 도 23 (상단 패널)의 데이터에 나타낸 바와 같이, MSC 세크레톰은 원형 상처 부위에서 일차 각막 각질형성세포의 이동을 자극시킨다. 각막 각질형성세포의 충만한 단일층에서 원형 상처가 생성되었고, 상처 간격의 봉합을 매일 모니터링하였다. 무혈청 배지 중 100 및 50 μg/mL MSC 세크레톰은 48시간 이내에 상처를 봉합시킨다. 도시된 영상은 젠티안 바이올렛으로 염색되고, 상처 입은 2일 이후에 촬영된 상처 면적이다. 또한, 도 23의 하단 패널에 제공된 바와 같이, 하단 패널: MSC 세크레톰은 원형 상처 부위에서 각막 상피세포의 이동을 자극시킨다. 각막 상피세포의 충만한 단일층에서 원형 상처가 생성되었고, 상처 간격의 봉합을 매일 모니터링하였다. 무혈청 배지 중 100 및 50 μg/mL MSC 세크레톰의 용량이 72시간 이내에 상처를 봉합시킨다. 도시된 영상은 젠티안 바이올렛으로 염색되고, 상처 입은 2일 이후에 촬영된 상처 면적이다.
검정법을 위해, 오리스TM 세포 이동 검정 플랫폼은 세포 이동을 위한 중앙 무-세포 검출 영역을 생성하는 "마개" 장벽이 있는 96-웰 플레이트를 사용하였다. 실험에 사용된 세포는 ATCC (Manassas, VI)로부터 입수한 불멸화 세포주이었다. 세포를 증식시켜 80% 충만도로 계대하였다 (1 : 3). 검정에 사용된 세포는 7회 계대를 초과하지 않았다.
먼저, 세포를 밤새 배양 이후 충만한 단일층을 제공하는 밀도 (3.5 x 104)로 각 웰 (콜라겐 코팅됨)에 접종하였다. 둘째, 단일층이 확립된 이후, 세포가 이제 이동할 수 있는 원형의 빈 영역을 만들기 위해 마개를 제거하였다. 마개 제거 이후 세포를 세척하고, 배지를 무혈청 기본 배지로 교환하여 30분 동안 혈청을 결여시켰다. 혈청 결여 이후, 빈 상처 부위는 이동 전 기준으로서 명시야 현미경을 사용하여 영상화되었다. 다음으로 무혈청 배지를 50 μg/mL의 MSC 세크레톰이 보충된 테스트 배지로 교환하고, 세포를 배양기로 돌려보냈다. 무혈청 기본 배지의 음성 대조군과 규칙적인 완전 성장 배지의 양성 대조군을 사용하였다 (3일까지 > 80% 봉합을 제공해야 함). 모든 테스트 및 대조군 조건은 2벌씩 준비되었다. 매일 (사전 이동 영상를 획득한 이후 ~24시간) 상처 영역의 명시야 영상를 획득한다. 배지도 24시간마다 신선한 테스트 또는 대조군 배지로 교환되었다.
시험관내 원형 상처 봉합을 사용하여 조사된 액체 MSC 제형물의 안정성
액체 MSC 세크레톰 제형물의 안정성을 조사하기 위해 상기에 논의된 바와 동일한 원형 상처 봉합 검정을 사용하였다.
MSC 세크레톰의 신선한 배치를 제조하고, 약물 원료 (제형화 완충액 중)의 안정성을 평가하였다. 분취량을 7일 또는 14일 프로그램의 일부로서 -20℃, 4℃ 또는 실온에 보관하였다. 연구의 종료 시, 시료는 각막 상피세포를 사용하여 원형 상처 검정으로 평가하였다. 상처 봉합을 3일 동안 매일 모니터링하였다. 참조 표준으로서, 생산 당시 급속 냉동된 약물 원료를 사용하였다. WC%는 상처 봉합 백분율을 지정하였다. 도 24의 데이터 참조.
3D 조직 모델 - 상피 장벽 무결성 검정
각막 상피, 보다 정확하게 상피의 첨단 표면은 각막의 전반적인 장벽 성질에 주요한 기여를 하며, 각막 장벽의 변화는 생체적격성 분석을 위한 민감한 인자로서 작용한다.
경상피 전기 저항 (TEER)은 전체 장벽 성질을 측정하도록 평가될 수 있다. 3D 조직은 2 mL의 TEER 완충액을 포함하는 24-웰 플레이트로 옮기고, 10분 동안 배양된다. TEER를 상피 전압-오옴 측정기 EVOM 및 엔드오옴-12 체임버 (World Precision, Sarasota, FL)를 사용하여 측정하였다. 절차의 종료 시, 모두 3가지 조직을 조직 생존력 평가에 사용할 수 있다.
장벽 무결성% = 100 × [TEER (처리된 조직) / TEER (위약 대조군)]　
연구의 목표는 에피코니알 조직 모델 (메트텍사)을 사용하여 질소 머스타드 (NM)에 대한 국소 노출로 인한 각막 상피 손상에 이어진 테스트 항목 (MSC 세크레톰)의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하는 것이었다. MSC 세크레톰을 6 μg/mL (위약 용액에 희석됨)로 국소 적용하였다. 에피코니알 조직은 표준 배양 조건으로 5 mL 배지에서 24시간 동안 배양되었다.
상기 기재된 실시예는 당업자에게 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법의 구현예를 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 주도록 제공되고, 본 발명자들이 자신의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 상기 설명한 방식 변형은 다음의 청구항의 범위 내에 속하도록 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본 발명에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌의 전문이 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 바와 동일한 정도로 참고문헌으로 통합된다.
모든 표제 및 섹션 지정은 명확성 및 참고 목적으로만 사용되며, 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 고려되어서는 안 된다. 예를 들어, 당업자들은 본원에 기재된 본 발명의 사상 및 범주에 따라 적절하게 상이한 표제 및 섹션으부터의 다양한 양태를 조합하는 유용성을 인식할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적으로 이들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 바와 같이, 이들의 전문이 모든 목적으로 본원에 참고문헌으로 통합된다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 본 출원의 많은 변형 및 변경이 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 상세한 구현예 및 실시예는 단지 예로서 제공되며, 본 출원은 청구항에 의해 권리가 있는 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구범위의 용어에 의해서만 제한되어야 한다.

Claims (141)

  1. 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물로서,
    (i) 약 250 μM 미만의 IDO (인돌아민-2,3-디옥시게나제) 효소 활성;
    (ii) HGF, FGF-7, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및/또는 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
    (iii) sFLT-1, PEDF (세르핀 F1), 세르핀 A1, IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타, PDGF, SOD1, SOD2, SOD3 및/또는 HO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
    (iv) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및/또는 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
    를 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및/또는 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자의 "더 높은 수준"을 선택적으로 1 ng/mL 내지 400 ng/mL, 선택적으로 1 ng/mL 내지 300 ng/mL, 선택적으로 1 ng/mL 내지 200 ng/mL, 선택적으로 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 선택적으로 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 1 ng/mL 내지 10 ng/mL 또는 선택적으로 1 ng/mL 내지 8 ng/mL 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및/또는 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 선택적으로 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및/또는 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 VEGF의 "낮은" 수준, 선택적으로 0 pg/mL 내지 200 pg/mL 또는 선택적으로 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGE를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮은, MSC 세크레톰 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인, MSC 세크레톰 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준, 선택적으로 1,000 pg/mL 미만을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화되는, MSC 세크레톰 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 2가 양이온을 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 6.4인, MSC 세크레톰 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 접착제를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로오스, 히드록시 에틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로오스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  20. 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (i) 제 1 배양 배지에서 중간엽 줄기세포 (MSC)를 배양하는 단계;
    (ii) 단계 (i)로부터의 상기 제 1 배양 배지를 상기 MSC로부터 제거하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)에서의 상기 MSC를 세척하는 단계;
    (iv) 제 2 배양 배지를 첨가하여 약 1일 내지 5일 동안 배양하는 단계;
    (v) 단계 (iv)로부터의 상기 제 2 배양 배지를 조건화 배지로서 수확하는 단계; 및
    (vi) 단계 (v)에서의 상기 조건화 배지를 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 MSC 세크레톰 조성물로 가공하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 세크레톰 조성물인, 방법.
  22. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (vi) 단계 (v)에서의 상기 조건화 배지를 상기 세크레톰 조성물로 가공하는 단계는
    (a) 단계 (v)로부터 수확된 상기 조건화 배지를 여과하여 세포 미립자를 제거하는 단계;
    (b) 단계 (a)로부터 여과된 상기 조건화 배지를 농축시키는 단계; 및
    (c) 제형화 완충액으로 완충액 교환하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    단계 (c)는 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템으로 완충액 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제 22항 또는 제 23항에 있어서,
    상기 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터, 0.22 μm 필터, 0.8 μm 필터 및 0.65 μm 필터, 낮은 단백질 결합 PVDF 막 및/또는 PES (폴리에테르설폰)의 사용을 포함하는, 방법.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터, 접면 유동 여과 시스템 또는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 3 내지 10 kDa MW 컷오프를 사용하는, 방법.
  27. 안구 질환의 치료 방법으로서, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 조성물을 표적 부위에 투여하는, 방법.
  29. 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능장애를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  30. 필요로 하는 환자에서 안구 상처 치유를 유도하고/거나, 촉진하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 필요로 하는 환자에서 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고/거나, 흉터 형성을 감소 및/또는 억제하고/거나, 시력을 증진 및/또는 보존하고/거나, 상처 봉합 속도를 증가시키는 (예로, 상처 봉합 시간을 감소시킴) 방법으로서, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 시력 보존을 증진시키기 위하여 필요로 하는 환자에서 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고, 흉터 형성을 감소시키는 방법으로서, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물은 국소 투여를 위해 제형화되는, 방법.
  34. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포 세크레톰 조성물은 결막하 주사를 위해 제형화되는, 방법.
  35. MSC 세크레톰을 특성화하는 방법으로서,
    (i) 상기 MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 상기 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
    (ii) (i)에서의 상기 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  36. MSC 세크레톰의 생체효능 및 안정성을 결정하는 방법으로서,
    (i) 상기 MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 상기 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
    (ii) (i)에서의 상기 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  37. 다수의 MSC 세크레톰 로트 사이에 MSC 세크레톰 로트 일관성을 결정하는 방법으로서,
    (i) 상기 MSC 세크레톰을 하나 이상의 특성화 검정법에 적용하는 단계로서, 상기 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계; 및
    (ii) (i)에서의 상기 하나 이상의 검정법으로부터 결과를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  38. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 물리적 성분 특성화로부터의 결과는 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물을 확인하는, 방법
  39. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 안전성 분석으로부터의 결과는 혈액 적격성을 나타내고, 발열원 및/또는 내독소가 적거나 없는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  40. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 안정성 검정으로부터의 결과는 -20℃, 4℃ 및/또는 20℃ (예를 들어, 실온)에서 적어도 7일 동안 또는 적어도 14일 동안 안정성을 나타내는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법
  41. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 증식 검정으로부터의 결과는 증식을 유도하는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  42. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 이동 검정으로부터의 결과는 이동을 유도하는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  43. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 혈관신생 검정으로부터의 결과는 혈관신생을 억제하거나, 촉진하지 않는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  44. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 분화/흉터 형성 검정으로부터의 결과는 분화 및/또는 흉터 형성을 억제하는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  45. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 상기 염증 검정으로부터의 결과는 염증을 억제하는 MSC 세크레톰을 제공하는, 방법.
  46. 제 37항에 있어서,
    (iii) (ii)에서의 결과를 기초로 하여 MSC 세크레톰 로트를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법
  47. MSC 세크레톰을 특성화하는 테스트 및/또는 검정법의 패널로서, 상기 패널은 적어도 2가지 특성화 검정법을 포함하며, 상기 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  48. MSC 세크레톰 로트 사이에 일관성을 결정하는 테스트 및/또는 검정법의 패널로서, 상기 패널은 하나 이상의 특성화 검정법을 포함하며, 상기 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  49. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, 상기 물리적 성분 특성화는 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  50. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 안전성 분석은 혈액 적격성을 나타내고, 발열원 및/또는 내독소가 적거나 없는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  51. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 안정성 검정은 -20℃, 4℃ 및/또는 20℃ (예를 들어, 실온)에서 적어도 7일 동안 또는 적어도 14일 동안 안정성을 나타내는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  52. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 증식 검정은 증식을 유도하는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  53. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 이동 검정은 이동을 유도하는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  54. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 신생혈관 검정은 신생혈관을 억제하거나, 촉진하지 않는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  55. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 분화/흉터 형성 검정은 분화 및/또는 흉터 형성을 억제하는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  56. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 염증 검정은 염증을 억제하는 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  57. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터 형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정이 모두 수행되는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  58. 제 57항에 있어서,
    상기 테스트 및/또는 검정법은 제 49항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 따른 MSC 세크레톰을 확인하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  59. 제 47항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 및/또는 항-반흔 MSC 세크레톰인, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  60. 제 20항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 및/또는 항-반흔 MSC 세크레톰인, 방법.
  61. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물로서, 상기 MSC 세크레톰은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰인, 조성물.
  62. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 1 μg 내지 20 μg, 선택적으로 2 μg 내지 8 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨; 및
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  63. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.004% 내지 0.0375%, 선택적으로 0.008% 내지 0.015% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
    (v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  64. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 6 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2.28 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11.45 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 12.2 mg 만니톨;
    (v) 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 1 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 제형물.
  65. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.012% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4.5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 22.4% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 24% w/w 만니톨;
    (v) 47.1% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 2.0% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 제형물.
  66. 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물로서,
    (a) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
    (b) PEDF (세르핀 F1), IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
    (c) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
    를 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  67. 제 66항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 높은 수준으로 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  68. 제 66항 또는 제 67항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 400 ng/mL로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  69. 제 66항 내지 제 68항 중 어느 한 항에 있어서,
    MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 중간 수준으로 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  70. 제 66항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  71. 제 66항 내지 제 70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  72. 제 66항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  73. 제 66항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및 세르핀 E1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하고, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2, 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  74. 제 66항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 VEGF의 낮은 수준을 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  75. 제 66항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGE를 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  76. 제 66항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮은, MSC 세크레톰 조성물.
  77. 제 66항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인, MSC 세크레톰 조성물.
  78. 제 66항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  79. 제 66항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 1,000 pg/mL 미만의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  80. 제 66항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 조성물.
  81. 제 66항 내지 제 80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화되는, MSC 세크레톰 조성물.
  82. 제 66항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  83. 제 82항에 있어서,
    상기 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  84. 제 66항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 조성물.
  85. 제 66항 내지 제 84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  86. 제 85항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  87. 제 66항 내지 제 86항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 6.4인, MSC 세크레톰 조성물.
  88. 제 66항 내지 제 87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 접착제를 추가로 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  89. 제 88항에 있어서,
    상기 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로오스, 히드록시 에틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로오스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택되는, MSC 세크레톰 조성물.
  90. 제 66항 내지 제 89항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집체 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬, 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는, MSC 세크레톰 조성물.
  91. 제 66항 내지 제 90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 HGF, 펜트락신-3 (TSG-14), VEGF, TIMP-1, 세르핀 E1 및 < 5 ng/mL IL-8을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  92. 제 66항 내지 제 91항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은
    (i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
    (ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
    (iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
    (iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
    (v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
    (vi) < 5 ng/mL IL-8
    을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  93. 제 66항 내지 제 92항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은
    (i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
    (ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
    (iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
    (iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
    (v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1;
    (vi) 100 ng/mL 내지 400 ng/mL 세르핀 F1; 및
    (vii) < 5 ng/mL IL-8
    을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  94. 제 66항 내지 제 93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰을 포함하는, MSC 세크레톰 조성물.
  95. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  96. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  97. 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서,
    중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 MSC 세크레톰 조성물은
    (i) HGF, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 (세르핀 E1), VEGF-A 및 b-NGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 자극인자/사이토카인;
    (ii) PEDF (세르핀 F1), 세르핀 A1, IGFBP-2, IGFBP-3, SDF-1, TSG-14, 칼리크레인 3, MCP-1, bFGF, 안지오게닌, MCP-2, 안지오-2, IL-6, IL-17, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, TNF-베타 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자; 및
    (iii) DPPIV (디펩티딜 펩티다제-4), uPA, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2 및 트롬보스폰딘-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 인자
    를 포함하는, 방법.
  98. 제 97항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 높은 수준으로 추가로 포함하는, 치료 방법
  99. 제 97항 또는 제 98항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 세르핀 E1, 세르핀 A1, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, 펜트락신-3 (TSG-14), 혈소판 인자 4 및 세르핀 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는, 치료 방법.
  100. 제 97항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 중간 수준으로 추가로 포함하는, 치료 방법.
  101. 제 97항 내지 제 100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 암피레귤린, 엔도스타틴, 엔도텔린-1, 트롬보스폰딘-2, 트롬보스폰딘-1, 안지오게닌, DPPIV, IGFBP-3 및 uPA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 400 pg/mL 내지 3,000 pg/mL로 포함하는, 치료 방법.
  102. 제 97항 내지 제 101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 아포지단백질 A1, 보체 인자 D, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, DKK-1, 엠프린, 오스테오폰틴, 비타민 D BP, MIF, RANTES, uPAR, IL-17a, GDF-15 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 추가로 포함하는, 치료 방법.
  103. 제 97항 내지 제 102항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 비율이 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인 항-혈관형성 대 프로-혈관형성의 비율을 포함하는, 치료 방법.
  104. 제 97항 내지 제 103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-혈관형성 인자는 PEDF, 더 낮은 수준의 VEGF 및 세르핀 E1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하고, 프로-혈관형성 인자는 VEGF, 안지오게닌, IGFBP-3, uPA, 안지오-1, 안지오-2 및 엔도텔린-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는, 치료 방법.
  105. 제 97항 내지 제 104항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 VEGF의 낮은 수준을 추가로 포함하는, 치료 방법.
  106. 제 97항 내지 제 104항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGE를 포함하는, 치료 방법.
  107. 제 97항 내지 제 106항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VEGF의 수준은 세르핀 E1의 수준보다 5배 내지 10배 더 낮은, 치료 방법.
  108. 제 97항 내지 제 107항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 인자를 포함하고, VEGF의 농도 대비 하나 이상의 항-혈관형성 인자의 농도 합은 > 2, > 3, > 4 또는 > 5인, 치료 방법.
  109. 제 97항 내지 제 108항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하지 않고/거나, 매우 낮은 수준으로 포함하는, 치료 방법.
  110. 제 97항 내지 제 109항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 1,000 pg/mL 미만의 bFGF, PLGF 및 PDGF를 포함하는, 치료 방법.
  111. 제 97항 내지 제 110항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 pH 약 4.7 내지 약 7.5인, 치료 방법.
  112. 제 97항 내지 제 111항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 디/모노 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트/시트르산, 붕산/소듐 시트레이트, 붕산/소듐 테트라보레이트 및 시트르산/디소듐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화되는, 치료 방법.
  113. 제 97항 내지 제 112항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함하는, 치료 방법.
  114. 제 113항에 있어서,
    상기 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  115. 제 97항 내지 제 114항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 모노/디소듐 포스페이트, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 7.4인, 치료 방법.
  116. 제 97항 내지 제 115항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함하는, 치료 방법.
  117. 제 116항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  118. 제 97항 내지 제 117항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 디소듐 포스페이트/시트르산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 상기 조성물의 pH는 약 6.4인, 치료 방법.
  119. 제 97항 내지 제 118항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 접착제를 추가로 포함하는, 치료 방법.
  120. 제 119항에 있어서,
    상기 접착제는 하이프로멜로스, 폴록사머 407, 폴록사머 188, 폴록소머 237, 폴록소머 338, 하이프로멜로스 (HPMC), 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), PVA (폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로오스, 히드록시 에틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로오스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  121. 제 97항 내지 제 120항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집체 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬, 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는, 치료 방법.
  122. 제 97항 내지 제 121항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 HGF, 펜트락신-3 (TSG-14), VEGF, TIMP-1, 세르핀 E1 및 < 5 ng/mL IL-8을 포함하는, 치료 방법.
  123. 제 97항 내지 제 122항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은
    (i) 0.3 ng/mL 내지 4.5 ng/mL HGF;
    (ii) 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL 펜트락신-3 (TSG-14);
    (iii) 100 pg/mL 내지 600 pg/mL VEGF;
    (iv) 10 ng/mL 내지 200 ng/mL TIMP-1;
    (v) 20 ng/mL 내지 80 ng/mL 세르핀 E1; 및
    (vi) < 5 ng/mL IL-8
    을 포함하는, 치료 방법.
  124. 제 97항 내지 제 123항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물은 항-혈관형성 MSC 세크레톰 또는 항-반흔 MSC 세크레톰을 포함하는, 치료 방법.
  125. 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 치료 방법
  126. 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
    (v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 1% 내지 3% w/w 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 치료 방법.
  127. 제 47항 또는 제 48항에 있어서,
    상기 검정법의 패널은 적어도 하나의 이동 검정을 포함하는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  128. 제 47항, 제 48항 또는 제 127항에 있어서, 상기 이동 검정은 시험관내 상처 봉합 검정인, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  129. 제 128항에 있어서,
    상기 시험관내 상처 봉합 검정은 "스크래치 검정" ("스크래치 상처 검정"으로도 지침됨), 원형 스크래치 상처 방법, 원형 스크래치 상처 검정 및 원형 상처 봉합 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 테스트 및/또는 검정법의 패널.
  130. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 1 μg 내지 20 μg, 선택적으로 2 μg 내지 8 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  131. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.004% 내지 0.0375%, 선택적으로 0.008% 내지 0.015% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
    (v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  132. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 6 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2.28 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11.45 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 12.2 mg 만니톨;
    (v) 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 1 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 제형물.
  133. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.012% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4.5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 22.4% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 24% w/w 만니톨;
    (v) 47.1% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 2.0% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 7.4인, MSC 세크레톰 제형물.
  134. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  135. 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
    (v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, MSC 세크레톰 제형물.
  136. 제 130항 내지 제 135항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는, MSC 세크레톰 제형물.
  137. 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) mL 당 2 μg 내지 20 μg의 MSC 세크레톰;
    (ii) mL 당 2 mg 내지 3 mg 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) mL 당 11 mg 내지 12 mg 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) mL 당 11.5 mg 내지 13 mg 만니톨;
    (v) 23 mg 내지 24 mg 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) mL 당 0.5 mg 내지 2 mg 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 치료 방법.
  138. 필요로 하는 대상체에서 안구 병태에 대한 치료 방법으로서, 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 MSC 세크레톰 조성물은 안정한 중간엽 줄기세포 (MSC) 세크레톰 제형물로서,
    (i) 0.004% 내지 0.08% w/w의 MSC 세크레톰;
    (ii) 4% 내지 5% w/w 일염기성 소듐 포스페이트;
    (iii) 21.5% 내지 23% w/w 이염기성 소듐 포스페이트;
    (iv) 23% 내지 25% w/w 만니톨;
    (v) 46% 내지 48% w/w 트레할로스 이수화물; 및
    (vi) 1% 내지 3% w/w 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하고,
    pH는 약 4.7 내지 약 7.5인, 제형물인, 치료 방법.
  139. 제 137항 내지 제 138항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는, 치료 방법.
  140. 제 1항 내지 제 139항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는, 방법.
  141. 제 1항 내지 제 139항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는, MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물.
KR1020217036569A 2019-04-09 2020-04-07 중간엽줄기세포 유래 세크레톰의 제조 및 사용 방법 KR20220047210A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962831371P 2019-04-09 2019-04-09
US62/831,371 2019-04-09
US201962929035P 2019-10-31 2019-10-31
US62/929,035 2019-10-31
US16/785,463 US10881693B2 (en) 2019-04-09 2020-02-07 Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome
US16/785,470 2020-02-07
US16/785,470 US10758571B1 (en) 2019-04-09 2020-02-07 Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome
US16/785,463 2020-02-07
PCT/US2020/027093 WO2020210248A1 (en) 2019-04-09 2020-04-07 Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220047210A true KR20220047210A (ko) 2022-04-15

Family

ID=72241604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217036569A KR20220047210A (ko) 2019-04-09 2020-04-07 중간엽줄기세포 유래 세크레톰의 제조 및 사용 방법

Country Status (11)

Country Link
US (5) US10758571B1 (ko)
EP (1) EP3952892A4 (ko)
JP (1) JP2022526855A (ko)
KR (1) KR20220047210A (ko)
CN (1) CN114269359A (ko)
AU (1) AU2020270892A1 (ko)
BR (1) BR112021020450A2 (ko)
CA (1) CA3136614A1 (ko)
CL (1) CL2021002655A1 (ko)
MX (1) MX2021012461A (ko)
WO (1) WO2020210248A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10758571B1 (en) 2019-04-09 2020-09-01 Combangio, Inc. Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome
IT201900022029A1 (it) * 2019-11-25 2021-05-25 Dompe Farm Spa Formulazioni oftalmiche
WO2021123320A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 Dr. Kalali Prof. Mostafazadeh Dipl. Ing. Miedl (Kmm) Gesellschaft Bürgerlichen Rechts A composition and its use for a universal therapy against tumor cells
US20210369617A1 (en) * 2020-04-07 2021-12-02 Combangio, Inc. Lyophilized mesenchymal stem cell derived secretome and uses thereof
EP3970732A1 (en) * 2020-09-17 2022-03-23 Hunan Yuanpin Cell Technology Co. Ltd Use of mesenchymal stem cells in the treatment of viral infections and/or complications caused by viral infections
CN112656816A (zh) * 2021-01-15 2021-04-16 浙江大学 一种负载外泌体的纤维蛋白胶及其应用
US20220378846A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-01 U-Neuron Biomedical Inc. Use of secretome of amniotic fluid stem cell in the treatment of dry eye disease
CN113583950A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 合肥滴碧云生物科技有限公司 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN114350603B (zh) * 2022-01-23 2022-08-23 上海揽微赛尔生物科技有限公司 包含外泌体的间充质干细胞胞外基质及其制备和在细胞修复中的应用
CN115282286B (zh) * 2022-02-09 2023-05-02 天津医科大学眼科医院 一种治疗眼部新生血管类疾病的纳米复合体及应用
WO2024011252A2 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Combangio, Inc. Methods and assays for secretome activity analysis
CN116473919A (zh) * 2023-03-13 2023-07-25 陕西初源外泌体生物科技有限公司 一种用于治疗视神经损伤的外泌体滴眼液及其制备方法
WO2024192119A1 (en) * 2023-03-14 2024-09-19 Direct Biologics, Llc Wound healing compositions and methods thereof

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6372494B1 (en) 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US20060165667A1 (en) 2004-12-03 2006-07-27 Case Western Reserve University Novel methods, compositions and devices for inducing neovascularization
US20060222634A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Clarke Diana L Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
US8871198B2 (en) 2006-03-29 2014-10-28 Stemnion, Inc. Methods related to wound healing
EP2617428A1 (en) 2006-08-15 2013-07-24 Agency for Science, Technology and Research Mesenchymal stem cell conditioned medium
US8021882B2 (en) 2006-08-24 2011-09-20 Johnstone Brian H Production of neural protective and regenerative factors from stem cells and treatment of nervous system conditions therewith
PT2185197T (pt) 2007-08-22 2019-01-21 Noveome Biotherapeutics Inc Novas composições de solução contendo fator celular e sua utilização para o tratamento de feridas
WO2009045359A1 (en) 2007-10-01 2009-04-09 Stemnion, Inc. Skin replacement compositions and methods
SI2254586T1 (sl) 2008-02-22 2015-07-31 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Delci mezenhimske matične celice
US20110158958A1 (en) 2009-12-07 2011-06-30 Sing George L Methods for treating ophthalmic disorders, diseases and injuries
WO2010110768A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Regenetech, Inc. Composition and method for producing composition for constructing tissue, and tissue construct
EP2251028A1 (en) * 2009-05-12 2010-11-17 Biocompatibles Uk Ltd. Treatment of eye diseases using encapsulated cells encoding and secreting an anti-angiogenic factor and/or a neuroprotective factor
PT2451964T (pt) 2009-07-10 2018-05-07 Histogen Inc Meio condiconado e composições de matriz extracelular de células cultivadas sob condições hipóxicas
US20110206647A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Abt Holding Company Modulation of Angiogenesis
US8911963B2 (en) 2010-04-05 2014-12-16 Medstar Health Research Institute, Inc. Conditioned medium obtained from stem cells and its use in therapy
FR2974201B1 (fr) 2011-04-18 2013-04-12 Inside Secure Circuit de multiplication de montgomery
US20120276215A1 (en) 2011-04-26 2012-11-01 Riordan Neil H Therapeutic Conditioned Media
US9950016B2 (en) 2011-06-24 2018-04-24 National University Of Ireland, Galway Cell secreted proteins for the treatment of myocardial infarction
ITTO20111183A1 (it) 2011-12-21 2013-06-22 Univ Degli Studi Torino Mezzo condizionato ottenuto da cellule staminali mesenchimali placentari e suo uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia
US20150064273A1 (en) 2012-02-13 2015-03-05 Gamida-Cell Ltd. Mesenchymal Stem Cells Conditioned Medium and Methods of Generating and Using the Same
ITTO20120859A1 (it) 2012-10-02 2014-04-03 Univ Degli Studi Torino Nuova applicazione terapeutica di un mezzo condizionato da cellule staminali mesenchimali placentari
CN103767985A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用
AU2014205557B2 (en) * 2013-01-09 2017-08-10 United Therapeutics Corporation Treatment of vasculopathy with prostacyclin and mesenchymal stem cells
US20140242043A1 (en) 2013-02-23 2014-08-28 Stemnion, Inc. Methods for preventing or treating optic neuritis
US20140255355A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Stemnion, Inc. Methods for treating blepharitis
CL2013003066A1 (es) 2013-10-22 2014-07-25 Univ Chile Composicion para tratamiento de heridas porque comprende matriz soporte y células troncalesmesenquiámicas de gelatina de wharton; metodo para tratar heridas que comprende aplicar dicha composicion
US9636364B2 (en) 2013-12-04 2017-05-02 Stemnion, Inc. Methods for treating ocular contusion and blunt injury and traumatic injury to the optic nerve
US9464272B2 (en) 2013-12-12 2016-10-11 Stemnion, Inc. Cell-derived composition
US20150335712A1 (en) 2014-05-21 2015-11-26 Stemnion, Inc. Treatment of Diseases and Conditions Caused by Increased Vascular Permeability
WO2016083500A1 (en) 2014-11-27 2016-06-02 Med Cell Europe Ag Secretomes and method for producing secretomes
WO2016082882A1 (en) 2014-11-27 2016-06-02 Med Cell Europe Ag Secretomes and method for producing secretomes
US20170080033A1 (en) 2014-12-16 2017-03-23 Janssen Biotech, Inc. Treatment of retinal degeneration using progenitor cells
WO2016099949A2 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Janssen Biotech, Inc. Treatment of retinal degeneration using progenitor cells
US20180327713A1 (en) 2014-12-16 2018-11-15 Janssen Biotech, Inc. Treatment of retinal degeneration using progenitor cells
KR101566450B1 (ko) 2015-04-03 2015-11-05 (유)스템메디케어 중간엽 줄기세포에서 단백질의 대량 생산 방법
TWI741980B (zh) 2015-04-07 2021-10-11 大陸商四川藍光英諾生物科技股份有限公司 一種生物磚及其用途
US20160361253A1 (en) 2015-06-13 2016-12-15 Noveome Biotherapeutics, Inc. Novel Methods for Delivering Therapeutic Agents to the Eye via Nasal Passages
EP3317397B1 (en) 2015-07-02 2019-09-25 Med Cell Bahamas Ltd. Secretomes and method for producing secretomes
CA2993955A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Indiana University Research And Technology Corporation Materials and methods for treating and evaluating ischemic and/or reperfusion-injured tissue and/or tissue susceptible to same
KR20190084207A (ko) * 2016-02-12 2019-07-16 셀 케어 테라퓨틱스, 인크. 지방 조직 유래의 중간엽 기질 세포 조정 배지 및 이것의 제조 및 사용 방법
KR20170111057A (ko) 2016-03-25 2017-10-12 (주)안트로젠 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조방법
RU2708329C2 (ru) 2016-05-31 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "Т-Хелпер Клеточные Технологии" Материал стволовых клеток, композиции и способы применения
WO2017217967A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 Noveome Biotherapeutics, Inc. Novel methods for delivering therapeutic agents to the eye via nasal passages
US20180028570A1 (en) 2016-08-01 2018-02-01 Ucl Business Plc Angiogenic Factors
KR20180024223A (ko) 2016-08-29 2018-03-08 사회복지법인 삼성생명공익재단 중간엽 줄기세포 분비 단백질을 포함하는 말초신경 세포 증식 촉진용 조성물
US20190231694A1 (en) * 2016-10-12 2019-08-01 Agency For Science, Technology And Research Method for lyophilising an exosome
WO2018102174A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of retinal degeneration using progenitor cells
EP3568141B1 (en) 2017-01-16 2020-12-16 Cells for Cells S.A. Composition comprising a substantially pure population of multipotent stromal cells encapsulated in platelet-poor plasma (ppp)
US20180271914A1 (en) 2017-03-21 2018-09-27 Noveome Biotherapeutics, Inc. Methods for Reducing the Extent of Light-induced Tissue Inflammation and Injury
WO2018213795A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeted in situ therapeutic delivery of secreted factors from stem cells for treatment of damaged tissue
CN111093681B (zh) 2017-07-16 2024-07-16 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组
US10364270B2 (en) 2017-10-02 2019-07-30 Pro Sunfun Biotech Research And Developmment Co., Ltd. Eye-care peptide, its composition and method of using the same
CN108517002A (zh) 2018-04-20 2018-09-11 命之本源医疗科技（北京）有限公司 一种干细胞培养上清分泌蛋白的稳定剂
US10758571B1 (en) 2019-04-09 2020-09-01 Combangio, Inc. Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Akpek, E. K. and J. D. Gottsch. 2003. "Immune Defense at the Ocular Surface." Eye (London, England) 17 (8): 949-56. https://doi.org/10.1038/sj.eye.6700617.
Baradaran-Rafii, Alireza, Medi Eslani, Zeeshan Haq, Ebrahim Shirzadeh, Michael J. Huvard, and Ali R. Djalilian. 2017. "Current and Upcoming Therapies for Ocular Surface Chemical Injuries." The Ocular Surface 15 (1): 48-64. https://doi.org/10.1016/j.jtos.2016.09.002.
Chen, Yanfeng, Wenzhao Yang, Xiaobo Zhang, Shu Yang, Gao Peng, Ting Wu, Yueping Zhou, et al. 2016. "MK2 Inhibitor Reduces Alkali Burn-Induced Inflammation in Rat Cornea." Scientific Reports 6 (June): 28145. https://doi.org/10.1038/srep28145.
Choi, Jin A., Jun-Sub Choi, and Choun-Ki Joo. 2011. "Effects of Amniotic Membrane Suspension in the Rat Alkali Burn Model." Molecular Vision 17 (February): 404-12.
conditioned medium accelerates wound healing with fewer scars." Int. Wound J. 2017, 14: 64-73.
Epstein, R. J., R. D. Stulting, R. L. Hendricks, and D. M. Harris. 1987. "Corneal Neovascularization. Pathogenesis and Inhibition." Cornea 6 (4): 250-57. https://doi.org/10.1097/00003226-198706040-00004.
Fernandes-Cunha, Gabriella Maria, Kyung-Sun Na, Ilham Putra, Hyun Jong Lee, Sarah Hull, Yu-Chia Cheng, Ignacio Jesus Blanco, Medi Eslani, Ali R Djalilian, and David Myung. 2019. "Corneal Wound Healing Effects of Mesenchymal Stem Cell Secretome Delivered within a Viscoelastic Gel Carrier." Stem Cells Translational Medicine 8 (5): 478-89.
Ferreira, Joana R, Graciosa Q Teixeira, Susana G Santos, Mario A Barbosa, Graca Almeida-Porada, and Raquel M Gonηalves. 2018. "Mesenchymal Stromal Cell Secretome: Influencing Therapeutic Potential by Cellular Pre-Conditioning." Frontiers in Immunology 9.
Gaudana R, Jwala J, Boddu SH, Mitra AK. 2009. "Recent perspectives in ocular drug delivery." Pharm. Res. 26(5): 1197-216
Harkin, Damien G, Leanne Foyn, Laura J Bray, Allison J Sutherland, Fiona J Li, and Brendan G Cronin. 2015. "Concise Reviews: Can Mesenchymal Stromal Cells Differentiate into Corneal Cells? A Systematic Review of Published Data." Stem Cells 33 (3): 785-91.
Katzman, Lee R, and Bennie H Jeng. 2014. "Management Strategies for Persistent Epithelial Defects of the Cornea." Saudi Journal of Ophthalmology쪧: Official Journal of the Saudi Ophthalmological Society 28 (3): 168-72. https://doi.org/10.1016/j.sjopt.2014.06.011.
Kim, Dae Won, Sung Ho Lee, Min Jea Shin, Kibom Kim, Sae Kwang Ku, Jong Kyu Youn, Su Bin Cho, et al. 2015. "PEP-1-FK506BP Inhibits Alkali Burn-Induced Corneal Inflammation on the Rat Model of Corneal Alkali Injury." BMB Reports 48 (11): 618-23. https://doi.org/10.5483/bmbrep.2015.48.11.041.
Li M, Luan F, Zhao Y, Hao H, Liu J, Dong L, Fu X, Han W. "Mesenchymal stem cell-
Maddula, Surekha, Don K. Davis, Soumya Maddula, Michael K. Burrow, and Balamurali K. Ambati. 2011. "Horizons in Therapy for Corneal Angiogenesis." Ophthalmology 118 (3): 591-99. https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2011.01.041.
McGwin, Gerald, and Cynthia Owsley. 2005. "Incidence of Emergency Department-Treated Eye Injury in the United States." Archives of Ophthalmology 123 (5): 662-66.
Samaeekia, Ravand, Behnam Rabiee, Ilham Putra, Xiang Shen, Young Jae Park, Peiman Hematti, Medi Eslani, and Ali R Djalilian. 2018. "Effect of Human Corneal Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes on Corneal Epithelial Wound Healing." Investigative Ophthalmology & Visual Science 59 (12): 5194-5200.
Schrage, Norbert Franz, Sirpa Kompa, Wolfram Haller, and Stephanie Langefeld. 2002. "Use of an Amphoteric Lavage Solution for Emergency Treatment of Eye Burns. First Animal Type Experimental Clinical Considerations." Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries 28 (8): 782-86. https://doi.org/10.1016/s0305-4179(02)00194-8.
Serrano, Felipe, Lawrence B Stack, R Jason Thurman, Lara Phillips, and Wesley H Self. 2013. "Traumatic Eye Injuries: Management Principles for the Prehospital Setting." JEMS: A Journal of Emergency Medical Services 38 (12): 56.
Singh, Parul, Manoj Tyagi, Yogesh Kumar, K K Gupta, and P D Sharma. 2013. "Ocular Chemical Injuries and Their Management." Oman Journal of Ophthalmology 6 (2): 83-86. https://doi.org/10.4103/0974-620X.116624.
Vezina, Mark. 2012. "Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals." In Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals, 1-21. Springer.
Vizoso, Francisco J, Noemi Eiro, Sandra Cid, Jose Schneider, and Roman Perez-Fernandez. 2017. "Mesenchymal Stem Cell Secretome: Toward Cell-Free Therapeutic Strategies in Regenerative Medicine." International Journal of Molecular Sciences 18 (9): 1852.
Zanotti, L., R. Angioni, B. Cali, C. Soldani, C. Ploia, F. Moalli, M. Gargesha, et al. 2016. "Mouse Mesenchymal Stem Cells Inhibit High Endothelial Cell Activation and Lymphocyte Homing to Lymph Nodes by Releasing TIMP-1." Leukemia 30 (5): 1143-54. https://doi.org/10.1038/leu.2016.33.
Ziaei, Mohammed, Carol Greene, and Colin R Green. 2018. "Wound Healing in the Eye: Therapeutic Prospects." Advanced Drug Delivery Reviews 126: 162-76.

Also Published As

Publication number Publication date
US11129853B2 (en) 2021-09-28
US11654160B2 (en) 2023-05-23
US20200325452A1 (en) 2020-10-15
US20210187034A1 (en) 2021-06-24
US10758571B1 (en) 2020-09-01
MX2021012461A (es) 2022-01-04
JP2022526855A (ja) 2022-05-26
US10881693B2 (en) 2021-01-05
CN114269359A (zh) 2022-04-01
BR112021020450A2 (pt) 2021-12-14
CA3136614A1 (en) 2020-10-15
CL2021002655A1 (es) 2023-01-20
WO2020210248A1 (en) 2020-10-15
US20210052656A1 (en) 2021-02-25
EP3952892A4 (en) 2023-01-25
EP3952892A1 (en) 2022-02-16
US20240033297A1 (en) 2024-02-01
AU2020270892A1 (en) 2021-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11654160B2 (en) Processes for making and using a mesenchymal stem cell derived secretome
AU2017218143B2 (en) Adipose tissue derived mesenchymal stromal cell conditioned media and methods of making and using the same
ES2400916T3 (es) Una terapia celular para degeneración ocular
KR101539700B1 (ko) 연골세포 유래 세포외 기질막을 이용한 신생혈관질환 치료용 조성물 및 각막 또는 결막 이식재
US20210369617A1 (en) Lyophilized mesenchymal stem cell derived secretome and uses thereof
KR102704051B1 (ko) 세포 밖 소포체 함유 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물
US20240091268A1 (en) Preparation and purification methods for mesenchymal stem cell derived secretome
US11891428B2 (en) Cellular fibronectin compositions
CN117836320A (zh) 用于制备和使用细胞纤连蛋白组合物的方法
RU2803286C1 (ru) Композиция для нейропротекции и стимуляции нейрорегенерации головного мозга после повреждения, средство на ее основе, способ его получения и применения
WO2024011252A2 (en) Methods and assays for secretome activity analysis
Wang et al. Anti-inflammatory and Restorative effects of milk exosomes and Dexamethasone-Loaded exosomes in a corneal alkali burn model
WO2022204331A1 (en) Compositions comprising branched kgf-2 derived peptides and methods for use in ocular treatment

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
E902 Notification of reason for refusal