CN117836320A - 用于制备和使用细胞纤连蛋白组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了用于制备和使用纤连蛋白组合物的方法和过程，以及用于使用本文所述的细胞纤连蛋白组合物来治疗眼部疾患和/或病症的方法。

Description

用于制备和使用细胞纤连蛋白组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年7月2日提交的美国临时申请号63/217,952和2021年8月20日提交的美国临时申请号63/235,605的优先权，所有这些临时申请均以引用的方式整体并入本文。

背景技术

眼睛的爆破伤和钝伤会导致眼部内容物的一系列机械破坏，包括视网膜震荡、创伤性白内障、晶状体带状附着的破坏、房角后退、虹膜透析和瞳孔括约肌破裂。这些损伤的治疗仅限于虹膜的机械修复(如果可能的话)、用塑料晶状体植入物替换晶状体以及修复视网膜脱离。目前还没有修复视网膜或前房的细胞结构的治疗方法。此外，在伊拉克自由行动期间，创伤性视神经病变和视神经撕脱为需要专门眼科护理的六种主要眼部损伤类型中的眼部病症(Cho和Savitsky，“Ocular Trauma Chapter 7”，于Comba Casualty Care：Lessons learned from Oef and Oif中，由Brian Eastbridge和Eric Savitsky编，第299-342页，Ft.Detrick，Md.：Borden Institute(US)Government Printing Office，2012)，其全部内容以引用方式并入本文。百分之六十的创伤性头部损伤导致神经眼科异常(VanStavern等人，J Neuro-Ophthamol 21(2)：112-117，2001)(以引用方式整体并入本文)，其中一半涉及视神经或视觉通路。对神经元的创伤性损伤会导致轴突损伤和不可逆的神经元丢失，从而导致永久性缺陷。虽然已经在动物中鉴定出许多潜在的神经保护疗法，但这些单一剂通常无法转化为人临床试验中的疗法(Tumer等人，J Neurosurg 118(5)：1072-1085，2013，以引用方式整体并入本文)。可能需要影响多个细胞靶点的组合疗法来预防神经元损伤。

角膜作为眼睛的最外层组织具有保护作用；但它极易受到严重损伤和疾病的影响。它缺乏血管使得其为透明的，但也限制了它的愈合能力。角膜损伤由于可能导致不可逆的失明，因此需要及时干预和积极治疗。对改进的眼睛表面愈合疗法的迫切需要对于化学烧伤和严重的角膜疾病(例如急性慢性移植物抗宿主病(GvHD)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson Syndrome)、眼黏膜类天疱疮和其他导致持续性角膜上皮缺陷的疾病特别明显，这些疾病总的发病率每年超过100，000例。(参见Dietrich-Ntoukas等人Cornea.2012，31(3)：299-310；Stevenson W等人，Clin Ophthalmol.2013，7：2153-2158。White KD等人，J Allergy Clin Immunol Pract.2018；6(1)：38-69；Tauber J.(2002)Autoimmune Diseases Affecting the Ocular Surface.于：Ocular Surf ace DiseaseMedical and Surgical Management.Springer，New Yor k，NY.；以及Wirostko B等人，Ocul Surf.2015年7月；13(3)：204-21；以及Haring，RS.等人，JAMA Ophthalmol.2016年10月1日；134(10)：1119-1124。)

此外，局部眼科药物的开发受到许多解剖学限制的阻碍，包括泪液周转和稀释、鼻泪引流和反射性眨眼，通常不到5％的局部施用剂量到达更深的眼部组织(Gaudana等人，2009)。在角膜伤口的情况下，最初的损伤会导致角膜上皮出现裂痕，从而使局部施用的MSC-S通过以穿透上皮层。

因此，本领域迫切需要可靶向眼睛并将治疗有效载荷递送至可能由于继发于创伤(例如烧伤、急性炎症、年龄和/或氧化应激)的炎症而变性的难以到达的感官组织的眼部疗法。

发明内容

本发明通过提供用于此类治疗的包含纤连蛋白，任选地非共价连接至纤连蛋白(FN)的一种或多种生长因子的组合物，以及用于制备此类组合物的方法来满足这种需要。

在一些实施方案中，FN是MSC来源的FN。

在一些实施方案中，FN是MSC分泌的FN。

在一些实施方案中，FN是细胞FN。

在一些实施方案中，细胞FN是细胞来源的FN，并且其中FN非共价连接至一种或多种生长因子。

在一些实施方案中，细胞FN是EDA+和/或EDB+。

在一些实施方案中，细胞纤连蛋白从条件培养基获得。

在一些实施方案中，细胞纤连蛋白由间充质干细胞(MSC)分泌。

在一些实施方案中，条件培养基从MSC的培养物获得。

在一些实施方案中，组合物包含MSC分泌蛋白质组。

在一些实施方案中，MSC来源于骨髓。在一些实施方案中，MSC来源于健康人供体的骨髓。

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自由以下各项组成的组的生长因子：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。

在一些实施方案中，细胞纤连蛋白结合至一种或多种选自由以下各项组成的组的生长因子：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。

在一些实施方案中，组合物中的细胞纤连蛋白的浓度为约0.5-50ng/mL。

在一些实施方案中，组合物中的细胞纤连蛋白的浓度为约25ng/mL。

在一些实施方案中，组合物还包含至少约0.1ng/mL PDGF。

在一些实施方案中，组合物还包含约0.3-4.5ng/mL HGF。

在一些实施方案中，组合物还包含约1pg/mL-400pg/mL VEGF。

在一些实施方案中，组合物还包含张力调节剂。在一些实施方案中，张力调节剂选自NaCl、KCl、甘露醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇和甘油。

在一些实施方案中，组合物包含：0.5-50ng/ml FN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、10-12mg/ml磷酸氢二钠、11-13mg/ml甘露醇、2-25mg/ml海藻糖二水合物和0.5-2mg/ml羟丙甲纤维素。

在一些实施方案中，组合物包含：0.5-50ng/ml FN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、11.45mg/ml磷酸氢二钠、12.2mg/ml甘露醇、24mg/ml海藻糖二水合物和1mg/ml羟丙甲纤维素。

在一些实施方案中，组合物包含：0.5-50ng/ml FN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、4.5-7mg/ml磷酸氢二钠、5.5-7.5mg/ml甘露醇、11-13mg/ml海藻糖二水合物和0.1-1.5mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

在一些实施方案中，组合物包含：0.5-50ng/ml FN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、5.73mg/ml磷酸氢二钠、6.1mg/ml甘露醇、12mg/ml海藻糖二水合物和0.5mg/ml羟丙甲纤维素。

在一些实施方案中，组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

在一些实施方案中，本文的本公开内容提供了一种治疗有需要的受试者的眼部疾患的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的组合物。

在一些实施方案中，眼部疾患选自由以下各项组成的组：视网膜疾患、慢性移植物抗宿主病(GvHD)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson Syndrome)、眼粘膜类天疱疮、持续性角膜上皮缺陷(PCED)、干眼症、眼部神经组织损伤和眼睛震荡性损伤(诸如震荡性损伤、眼挫伤或化学烧伤)。

在一些实施方案中，本文的本公开内容提供了组合物用于根据本文公开的方法治疗有需要的受试者的眼部疾患的用途。

在一些实施方案中，本文的本公开内容提供了一种制备FN组合物的方法，所述方法包括：

(a)在细胞培养基中培养干细胞，从而产生包含由所述干细胞分泌的因子的条件培养基；

(b)收获所述条件培养基，从而产生收获的条件培养基；以及

(c)过滤收获的条件培养基，以产生加工的条件培养基。

在一些实施方案中，所述方法还包括浓缩加工的条件培养基。

在一些实施方案中，使加工的条件培养基进一步经受与配制缓冲液的缓冲液交换。

在一些实施方案中，配制缓冲液包含以下中的一者或多者：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和柠檬酸/磷酸氢二钠。

在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞(MSC)。

在一些实施方案中，细胞培养基不含血清。

在一些实施方案中，在步骤(a)之前的产生方法还包括：

(i)在生长培养基中培养所述干细胞；以及

(ii)用步骤(a)的所述细胞培养基来更换所述生长培养基。

附图说明

图1.纤连蛋白制备、加工和使用的一个实施方案的示意图。

图2.纤连蛋白刺激人角膜上皮细胞迁移。

图3.纤连蛋白的消耗损害人角膜上皮细胞的迁移。

图4.纤连蛋白的消耗损害人角膜上皮细胞的体外伤口闭合。

图5.提供了显示免疫沉淀的纤连蛋白含有结合的HGF的数据。

图6.分泌蛋白质组中的纤连蛋白的表征。从MSC分离的分泌蛋白质组通过免疫印迹使用对EDA序列、EDB+纤连蛋白和普通纤连蛋白(FN)具有特异性的抗体来评估。抗EDA和抗EDB抗体均与纤连蛋白发生交叉反应，表明分泌蛋白质组中存在的物质是细胞纤连蛋白。

图7.使用夹心ELISA进行的细胞EDA+纤连蛋白的检测。使用重组细胞纤连蛋白和对EDA序列具有特异性的捕获抗体来建立EDA+纤连蛋白的ELISA标准曲线(空心圆圈)。用于产生标准曲线的重组纤连蛋白含有用作产生抗EDA抗体的免疫原的EDA序列。在EDA夹心ELISA中对MSC分泌蛋白质组进行测定，并且很容易检测到细胞纤连蛋白(蓝点)。

具体实施方式

I.简介

纤连蛋白(FN)是一种大糖蛋白，含有约5％的碳水化合物。血浆纤连蛋白的特征性形式是440,000道尔顿的二硫键键合的二聚体，每个亚基具有约220,000道尔顿的分子量。纤连蛋白通常以约300μg/mL的浓度存在于血浆中，可使用Hynes，R.O.，Methods foridenti fication of fibronectin(第2章，第12页)，IN：Fibronectins New-York：Springer-Verlag，1990所述的方法进行提取和纯化。血浆纤连蛋白还有各种其他名称，包括冷不溶性球蛋白、抗明胶因子、细胞附着蛋白、细胞扩散因子和调理素α2-表面结合糖蛋白。这些名称反映了纤连蛋白的生物学活性，诸如细胞募集、颗粒碎片的调理作用以及伤口收缩的促进。纤连蛋白的结构和活性的描述可见于Hynes，R.O.，Methods foridentification of fibronectin(第2章，第12页)，IN：Fibronectins New-York：Springer-Verlag，1990，和Hynes，R.O.，Methods for identification of fibronectin(第2章，第7-23页)和Wound healing，inflammation，and fibrosis(第14章，第349-64页)，IN：Fibronectins New-York：Springer-Verlag，1990.3，和Brotchie，H.，Wakefield，D.Australas J Dermatol 1990；31：47-56(所有这些文献均以引用的方式整体并入本文)。

伤口愈合通常分为三个阶段：炎症期、增殖期和重塑期。据报道，纤连蛋白参与伤口愈合过程的每个阶段，尤其是通过产生入侵细胞可以粘附的支架来说实现。最初，很多介质(诸如纤连蛋白和纤维蛋白原)被释放至伤口部位。纤连蛋白促进炎症细胞迁移至伤口并且促进由单核细胞进行的碎片吞噬。其后，发生血管生成和上皮再形成。在这个阶段，纤连蛋白对内皮细胞施加趋化活性，并且促进上皮细胞和成纤维细胞向基底膜上的迁移。

纤连蛋白似乎也是重塑期的重要组分，在此期间在胶原蛋白原纤维的组织中发挥重要作用。纤维状胶原蛋白最终形成纤维束，纤维束大大增强组织的拉伸强度，引发伤口闭合。据报道，血浆纤连蛋白可用于提高诸如角膜伤口和腿部溃疡的伤口愈合率。

纤连蛋白有两种形式：血浆纤连蛋白和细胞纤连蛋白。血浆纤连蛋白由肝细胞合成并分泌至血浆中，而细胞纤连蛋白由多种细胞类型(诸如成纤维细胞、内皮细胞、干细胞、肌细胞和软骨细胞)产生。

据报道，在伤口愈合中，体内受伤后血浆纤连蛋白在伤口处显著积聚，这对于血小板、成纤维细胞和内皮细胞的各种功能(诸如粘附、迁移和聚集)至关重要，这表明血浆纤连蛋白很可能作为加速体内伤口修复的合适底物。事实上，在动物模型中，含有血浆纤连蛋白的临时基质在上皮再形成过程中显著支持表皮细胞粘附和迁移，这表明血浆纤连蛋白在人伤口愈合和组织修复方面具有临床潜力。

虽然这两类纤连蛋白在物理和免疫学方面具有广泛的相似性，但是它们在电泳行为、溶解度和生物学活性方面有所不同。Tamkun等人，J.Biol.Chem.258(7)：4641-47(1983)；Yamada等人，J.Cell Biol.80：492-98(1979)；Yamada等人Biochemistry 16(25)：2552-59(1977)。

此外，Hayashi等人J.Biol.Chem.256(21)：11，292-11，300(1981)通过肽图谱绘制，Atherton等人Cell 25：133-41(1981)通过免疫技术发现了血浆和细胞纤连蛋白之间的主要结构差异。最近，在来自人成纤维细胞和两种人肿瘤细胞系的mRNA中鉴定出编码恰好一个90个氨基酸的III型结构重复序列的差异区域，但是在人肝脏mRNA中未检测到。Kornblihtt等人EMBO J.4(7)：1755-59(1985)；Kornblihtt等人，EMBO J.3(1)：221-26(1984)；Kornblihtt等人，Nucleic Acids Res.12(14)：5853-68(1984)。由于血浆纤连蛋白由肝细胞合成，因此额外的III型重复序列很可能是细胞纤连蛋白的独特结构域。Schwarzbauer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82：1424-28(1985)；Komblihtt等人，EMBOJ.3(1)：221-26(1984)；Kornblihtt等人，Nucleic Acids Res.12(14)：5853-68(1984)。血浆纤连蛋白和细胞纤连蛋白之间的差异的更多讨论提供于W.S.等人，FibrogenesisTissue Repair 4，21(2011)中。

细胞纤连蛋白的特征在于循环血浆纤连蛋白库中不存在纤连蛋白剪接变体。这些可变剪接变体使得纤连蛋白序列具有额外的结构域(III型结构域)，称为EIIIA和EIIIB(或者EDA和EDB)。White等人The Journal of pathology.vol.216(1)：1-14(2008)；White和Muro，IUBMB Life，63：538-546(2011)。因此，在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是EDA+和/或EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是EDA+、EDB+和/或V+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是EDA+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是V+。可以并入一种或两种III型结构域。细胞纤连蛋白可以是这些同种型的混合物。

虽然人们对纤连蛋白在促进伤口愈合方面的治疗应用产生了极大的兴趣，但是迄今为止的临床研究一直集中于血浆纤连蛋白。迄今为止，尚未有细胞纤连蛋白的临床研究的报道，并且血浆纤连蛋白的临床研究在患有眼部疾病的患者中显示出不一致的结果。例如，McCulley，JP.等人报道，令人失望的是，患有持续性角膜上皮缺陷的患者对血浆纤连蛋白治疗没有反应。McCulley JP，Horowitz B，Husseini ZM，Horowitz M.Trans AmOphthalmol Soc.1993；91：367-86；discussion 386-90。

越来越多的研究表明，生长因子可以在不同的位点与FN结合。因此，FN可以作为保持生长因子的有效储存库，以增加它们在生理微环境中的局部浓度。例如，据报道，HGF结合HGF受体和整合素以及FN，在促进细胞迁移的过程中组装成多聚体复合物。Rahman，Salman等人，BMC cell biology第6卷，18.2005年2月17日。另外发现，FN通过其C-末端肝素-II结构域(FN III)与PDGF/VEGF和FGF家族中的各种生长因子，以及来自转化生长因子-β(TGF-β)和神经营养蛋白家族的一些生长因子结合。虽然FN隔离的生长因子被认为具有局部、延长和增强的GF活性，但是重组FN和生长因子(保持它们的内源生物化学和生物物理学属性)的重组组合疗法的开发仍然具有挑战性。

A.定义

除非另有说明，否则权利要求书和说明书中使用的术语如下定义。在与母本临时专利申请中使用的术语直接冲突的情况下，应以本说明书中使用的术语为准。

如本文所用，“分离”是指从其原始环境中移除并因此“通过手动”改变其自然状态的材料。

如本文所用，“富集”是指通过从混合物中消除不需要的材料或选择和分离所需材料来选择性地浓缩或增加一种或多种材料的量(例如，将具有特定细胞标志物的细胞与异质细胞群体分离，其中并非群体中的所有细胞都表达该标志物)。

如本文所用，术语“基本上纯化的”意指对于特定标志物或标志物组合而言基本上同质的细胞群。基本上同质意指对于特定标志物或标志物组合而言至少90％并且优选地95％同质的。如本文所用，术语“多能干细胞”为真正的干细胞，但只能分化为有限数量的类型。例如，骨髓含有多能干细胞，其可产生血液中的所有细胞，但可能无法分化为其他细胞类型。

术语“无动物”当是指本文所述的某些组合物、生长条件、培养基等时，意指不含非人动物来源的材料，例如牛血清、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、维生素等，用于某些组合物或过程的制备、生长、培养、扩增、储存或配制。“不含非人动物来源的材料”意指所述材料从未接触过或接触非人动物身体或物质，因此它们不会受到异种污染。通常，临床级材料(例如重组产生的人蛋白质)用于此类组合物和/或过程的制备、生长、培养、扩增、储存和/或配制。

关于细胞组合物，术语“扩增”意指细胞群构成的细胞浓度显著高于使用先前方法获得的细胞浓度。例如，在AMP细胞的扩增组合物中，每克羊膜组织的细胞水平比原代培养物中5次传代后的细胞数量高至少50倍至150倍，相比之下，使用先前方法使此类细胞增加约20倍。在另一个实例中，在AMP细胞的扩增组合物中每克羊膜组织的细胞水平比原代培养物中3次传代后的细胞数量高至少30倍和最多100倍。因此，与先前方法相比，“扩增的”群体每克羊膜组织的细胞数量至少提高2倍，并且最多提高10倍。术语“扩增”旨在仅涵盖人们为了提高细胞数量而进行干预的那些情况。

如本文所用，“条件培养基”是一种培养基，其中已经培养了特定细胞或细胞群，并且然后去除该培养基。当在培养基中培养细胞时，它们可能会分泌细胞因子来支持或影响其他细胞的行为。这些因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体、趋化因子、受体、抑制剂和颗粒。含有细胞因子的培养基是条件培养基。制备条件培养基的方法的实例已描述于美国专利号6,372,494中，所述专利以引用方式并入本文。如本文所用，条件培养基还是指从条件培养基或例如MSC细胞中回收和/或纯化的组分，例如蛋白质。

如本文所用，术语“间充质干细胞组合物”或“MSC组合物”是指源自MSC且在一些情况下已经历进一步加工的条件培养基。在一些实施方案中，“MSC分泌蛋白质组”可以是指源自MSC的粗制条件培养基。在一些实施方案中，“MSC分泌蛋白质组”可以是指在经过如本文所述的进一步加工之后从粗条件培养基获得的组合物。

如本文所用，术语“悬浮液”意指含有分散组分例如细胞因子的液体。分散的组分可以完全溶解、部分溶解、悬浮或以其他方式分散在液体中。合适的液体包括但不限于水、渗透溶液诸如盐和/或糖溶液、细胞培养基和其他水溶液或非水溶液。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(例如与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三个字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。

“氨基酸取代”是指预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基被第二个不同的“置换”氨基酸残基置换。“氨基酸插入”是指将至少一个额外的氨基酸并入到预定的氨基酸序列中。虽然插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但可以进行目前更大的“肽插入”，例如插入约三至约五个或甚至至多约十、十五或二十个氨基酸残基。插入的残基可以是如上文公开的天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081，1991；Ohtsuka等人，Biol.Chem.260：2605-2608，1985；以及Cassol等人，1992；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98，1994)。对于精氨酸和亮氨酸，第二个碱基的修饰也可能是保守的。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。本文所用的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，它们可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA(可以是单链或更通常的双链，或单链和双链区域的混合物)的杂合分子组成。此外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域组成。多核苷酸还可以包含一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，例如肌苷。多核苷酸还可以包含一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。

如本文所用，术语“分泌蛋白质组组合物”是指包含一种或多种从细胞分泌的物质的组合物。在某些实施方案中，分泌蛋白质组组合物可包含一种或多种细胞因子、一种或多种外来体和/或一种或多种微泡。分泌蛋白质组组合物可以是纯化的或未纯化的。在一些实施方案中，分泌蛋白质组组合物还可包含一种或多种并非从细胞分泌的物质(例如，培养基、添加剂、营养物等)。在一些情况下，分泌蛋白质组组合物不包含和或仅包含痕量的一种或多种并非从细胞分泌的物质(例如，培养基、添加剂、营养物等)。

如本文所用，术语“治疗(treatment、treat或treating)”等涵盖对人或非人哺乳动物(例如，啮齿动物、猫、狗、马、牛、羊和灵长类动物等)的任何治疗，并且包括预防在可能易患疾病或疾患但尚未被诊断为患有所述疾病或疾患的受试者中发生所述疾病或疾患。它还包括抑制疾病、疾患和/或任何相关症状(阻止其发展)、缓解或改善疾病、疾患和/或任何相关症状(导致其消退)或治愈疾病、疾患和/或任何相关症状(永久停止发展或进展)。如本文所用，术语“治疗(treatment、treat或treating)”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病或疾患的任何治疗，并且包括：(a)预防在可能易患疾病或疾患但尚未被诊断为患有所述疾病或疾患的受试者中发生所述疾病或疾患；(b)抑制疾病或疾患，例如阻止其发展；(c)缓解和/或改善疾病或疾患，例如引起疾病或疾患的消退；或(d)治愈疾病或疾患，例如停止其发展或进展。通过本发明的方法治疗的受试者群体包括罹患不希望的疾患或疾病的受试者以及处于发展疾患或疾病的风险下的受试者。在一些实施方案中，“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat或treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征和/或原因、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何疗法的施用。在一些实施方案中，此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或疾患的迹象的受试者，和/或仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者。替代地和/或另外地，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或疾患的一种或多种确定迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断为罹患相关疾病、病症和/或疾患的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有一种或多种易感因子的受试者，这些因子在统计学上与相关疾病、病症和/或疾患的发展风险增加有关。

如本文所用，“伤口”是任何原因对正常解剖结构(内部和/或外部解剖结构)的任何破坏，包括但不限于创伤性损伤，例如机械(例如挫伤、穿透)、热、化学、电、辐射、震荡和切口损伤；选择性损伤，诸如手术和所得的切口疝、瘘管等；急性伤口、慢性伤口、受感染伤口和无菌伤口，以及与疾病状态相关的伤口(例如眼挫伤)。伤口是动态的，愈合过程是一个连续过程，需要一系列整合的、相互关联的细胞过程，这些过程在受伤时开始，并在最初的伤口闭合后继续进行，直至达到稳定的伤口闭合。这些细胞过程由体液物质介导或调节，所述物质包括但不限于细胞因子、淋巴因子、生长因子和激素。根据本发明，“伤口愈合”是指通过某种形式的干预改善组织修复的自然细胞过程和体液物质，从而使愈合更快，和/或所得愈合区域具有较少的疤痕，和/或受伤部位的组织强度更接近于未受伤的组织，和/或受伤的组织达到一定程度的功能恢复。

如本文所用，术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多个/种或至少一个/种。

如本文所用，组合物的“治疗有效”或“有效”剂量或量是足以对给定医学疾患产生积极影响的量。如果不是即时的，治疗有效或有效剂量或量可以在一个时间段内对患者的健康和幸福提供显著或可测量的影响。

如本文所用，“药物组合物”是指有效量的与递送组分组合的本文所述的组合物。药物组合物可以任选地包含其他组分，例如药学上合适的载剂和赋形剂，其可以促进组合物和/或其各个组分对受试者的施用。

术语“药学上可接受的载剂”是指不会对受试者造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。

术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。

如本文所用，术语“混合(mix、mixing)”等描述了各组分的机械过程或机械处理。例如，混合可以是在进行压制和折叠的重复循环或类似的加工步骤的意义上，所述加工步骤导致所提供的疏水性基质的强烈压缩和混合。

成体干细胞可以从各种成体组织中获得，包括骨髓、脂肪和牙髓组织。虽然所有成体干细胞都能够(cable of)自我更新并且被认为是多能的，但它们的治疗功能因来源而异。因此，每种类型的成体干细胞都具有独特的特性，使其适用于某些疾病。间充质干细胞(MSC)通常来源于中胚层，并且是多能、非造血(非血液)干细胞，其从能够分化成各种组织的细胞分离(来源于所述细胞)，包括成骨细胞(例如骨细胞)、软骨细胞(例如软骨细胞)、肌细胞(例如肌肉细胞)和脂肪细胞(例如产生骨髓脂肪组织的脂肪细胞)。如本文所用，“分离的”是指从其原始环境中移出的细胞。干细胞产生调节多种生物过程或对调节多种生物过程很重要的因子，例如生长因子。生长因子是能够刺激细胞生长和/或增殖和/或细胞分化的药剂，例如天然存在的物质。通常，生长因子是蛋白质或类固醇激素。尽管术语“生长因子”和“因子”等在本文中可互换使用，但术语“生物因子”不限于生长因子。

人间充质干细胞(MSC)可以通过CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+/CD44+(或其任何合适的子集)的表面标志物谱来表征。(参见Bourin等人，Cytotherapy，15(6)：641-648(2013))。此外，适当的干细胞在分离时显示CD34+阳性，但在培养期间会丢失该标志物。因此，可以根据本申请使用的一种干细胞类型的完整标志物谱包括CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+。在利用小鼠干细胞的另一个实施方案中，干细胞的特征在于Sca-1标志物而不是CD34，以定义似乎与上述人细胞同源的细胞，其中其余标志物保持相同。

短语“条件培养基”或“CM”是指包含由MSC分泌的生物因子的培养基。这在本文中也可称为“分泌蛋白质组”、“MSC-CM”、“MSC分泌蛋白质组”和/或”MSC来源的分泌蛋白质组”。还提供了加工的“条件培养基”，其包含由MSC分泌的生物因子并且已经通过例如过滤、纯化和/或浓缩程序进一步加工。“条件培养基”是通过如本文中详细描述地在培养基中培养干细胞并将含有干细胞及其分泌的干细胞产物(分泌蛋白质组)的所得培养基分离成含有生物因子和与分离前存在的干细胞相比更少的干细胞的条件培养基中而获得的。条件培养基可用于本文所述的方法并且基本上不含干细胞(可能含有少量百分比的干细胞)或不含干细胞。可能存在于条件培养基中的生物因子包括但不限于蛋白质(例如细胞因子、趋化因子、生长因子、酶)、核酸(例如miRNA)、脂质(例如磷脂)、多糖和/或其组合。这些生物因子的任何组合可以结合在细胞外囊泡(例如，外来体)内或表面上，或者与细胞外囊泡分离。

B.组合物和制剂

本发明通过提供用于此类治疗的包含纤连蛋白，任选地非共价连接至纤连蛋白(FN)的一种或多种生长因子的组合物，以及用于制备此类组合物的方法来满足这种需要。

在一些实施方案中，FN是干细胞来源的。

在一些实施方案中，FN是MSC来源的FN。

在一些实施方案中，FN是MSC分泌的FN。

在一些实施方案中，FN是细胞FN。在一些实施方案中，本发明的细胞FN是可变剪接变体/同种型的混合物，诸如EDA、EDB和V+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+。在一些实施方案中，细胞FN是EDB+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+和EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是V+。

在一些实施方案中，细胞FN是细胞来源的FN，并且其中FN非共价连接至一种或多种生长因子。

在一些实施方案中，本文提供的组合物从条件培养基获得。在一些实施方案中，条件培养基从间充质干细胞(MSC)的培养物获得。

在一些实施方案中，包含FN的组合物来源于MSC分泌蛋白质组(包括加工的MSC分泌蛋白质组)。

在一些实施方案中，本文提供了包含条件培养基的组合物，所述条件培养基包含间充质干细胞(MSC)分泌蛋白质组和/或间充质干细胞(MSC)分泌蛋白质组(包括加工的MSC分泌蛋白质组)。

在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-6,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-3,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-100,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-6,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-6,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-30,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-6,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含50-5000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50-4000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含100-4000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含150-3500ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含1000-70,000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500-50,000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000-40,000ng/mLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1500-35,000ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含约0.5-50g/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含5-45ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含10-40ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含15-35ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含20-30ng/mL FN。在一些实施方案中，细胞FN组合物包含约25ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物还包含一种或多种生长因子。在一些实施方案中，包含一种或多种生长因子的FN组合物来源于MSC分泌蛋白质组。在一些实施方案中，组合物中的细胞FN连接至一种或多种生长因子。在一些实施方案中，FN非共价连接至一种或多种生长因子。在一些实施方案中，一种或多种生长因子选自由以下各项组成的组：FGF(诸如FGF-2；也称为成纤维细胞生长因子-2)、PDGF(也称为血小板源性生长因子)、HGF(也称为肝细胞生长因子)、VEGF、TGFβ1(也称为TGFbeta1或转化生长因子β1)、TGFβ2(也称为TGFbeta2或转化生长因子β2)、IGF-1(也称为胰岛素生长因子1)、IGF-2(也称为胰岛素生长因子2)、NGF(也称为神经生长因子)、神经营养蛋白和EGF(也称为表皮生长因子)。

在一些实施方案中，FN组合物还包含FGF。在一些实施方案中，FGF是FGF-2。在一些实施方案中，FN组合物还包含FGF-2。

在一些实施方案中，FN组合物还包含PDGF。在一些实施方案中，组合物还包含至少约0.1ng/mL PDGF。

在一些实施方案中，FN组合物还包含HGF。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1-10ng/mL或2.0+/-0.3ng/mL HGF。

在一些实施方案中，FN组合物还包含VEGF。在一些实施方案中，VEGF的浓度为约100-800pg/mL或304+/-44pg/mL。

在一些实施方案中，FN组合物还包含TGFβ1。

在一些实施方案中，FN组合物还包含TGFβ2。

在一些实施方案中，FN组合物还包含IGF-1、IGF-2和EGF。

在一些实施方案中，FN组合物还包含IGF-2。

在一些实施方案中，FN组合物还包含NGF。

在一些实施方案中，FN组合物还包含神经营养蛋白。

在一些实施方案中，FN组合物还包含EGF。

在一些实施方案中，FN组合物在约pH 4.5至约pH 8的pH下配制。在一些实施方案中，FN组合物在约pH 4.7至约pH 7.8的pH下配制。在一些实施方案中，FN组合物在约pH 5.0至约pH 7.5的pH下配制。在一些实施方案中，FN组合物在约pH 5.5至约pH 7.5的pH下配制。在一些实施方案中，FN组合物在约pH 6至约pH 7.5的pH下配制。

在一些实施方案中，FN组合物在约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH6.5、约pH 7.0、约pH 7.4、约pH 8.0的pH下配制。在一些实施方案中，细胞FN组合物在约pH4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH下配制。

在一些实施方案中，FN组合物不包含某些组分。在一些实施方案中，FN组合物不包含细胞培养基中存在的某些组分。在一些实施方案中，FN组合物不包含一种或多种选自由以下各项组成的组的组分：异生物质组分(例如，动物血清)；酚红；肽和生物分子<3kDa；抗生素；蛋白质聚集体(例如，>200nm的蛋白质聚集体)；细胞；细胞碎片(细胞碎片不包含外来体/细胞外囊泡(EV)；例如，非外来体、非EV细胞碎片)；激素(例如，激素包括但不限于胰岛素和/或氢化可的松)；和/或L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，FN组合物不包含异生物质组分。在一些实施方案中，FN组合物不包含酚红。在一些实施方案中，FN组合物不包含≤3kDa的肽和生物分子。在一些实施方案中，FN组合物不包含抗生素。在一些实施方案中，FN组合物不包含蛋白质聚集体(例如，蛋白质聚集体>200nm)。在一些实施方案中，FN组合物不包含细胞。在一些实施方案中，FN组合物不包含细胞碎片(细胞碎片不包含外来体/EV；例如，非外来体、非EV细胞碎片)。在一些实施方案中，FN组合物不包含激素(例如，激素包括但不限于胰岛素和/或氢化可的松)。在一些实施方案中，FN组合物不包含L-谷氨酰胺。

在一些实施方案中，FN组合物还包含甘露醇、乳糖、山梨醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、右旋糖和/或其组合。在一些实施方案中，FN组合物还包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钠或磷酸钾。在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钠。在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钾。在一些实施方案中，FN组合物还包含磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、甘露醇和海藻糖，其中组合物具有约pH 7.4的pH。

在一些实施方案中，FN组合物可以包含一种或多种额外剂，所述额外剂包括但不限于：甘氨酸、甘油、氯化钠、氯化钾和/或右旋糖。在一些实施方案中，FN组合物可以包含一种或多种额外剂，所述额外剂选自由以下各项组成的组：甘氨酸、甘油、氯化钠、氯化钾和右旋糖。在一些实施方案中，FN组合物可以包含一种或多种额外剂，所述额外剂选自由以下各项组成的组：甘氨酸和甘油以及右旋糖。在一些实施方案中，FN组合物可以包含一种或多种额外剂，所述额外剂选自由以下各项组成的组：氯化钠和氯化钾。

在一些实施方案中，FN组合物在缓冲体系中配制。在一些实施方案中，FN组合物在包括但不限于以下的缓冲系统中配制：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和/或柠檬酸/磷酸氢二钠。在一些实施方案中，FN组合物在选自以下的缓冲系统中配制：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和/或柠檬酸/磷酸氢二钠。在一些实施方案中，FN组合物在磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲体系中配制。在一些实施方案中，FN组合物在柠檬酸钠/柠檬酸缓冲体系中配制。在一些实施方案中，FN组合物在硼酸/柠檬酸钠缓冲体系中配制。在一些实施方案中，FN组合物在硼酸/四硼酸钠缓冲体系中配制。在一些实施方案中，FN组合物在柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲体系中配制。

在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钠或磷酸钾。在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钠。在一些实施方案中，磷酸盐源是磷酸钾。在一些实施方案中，细胞FN组合物包含磷酸氢二钠/柠檬酸、甘露醇和海藻糖，其中组合物具有约pH 6.4的pH。

在一些实施方案中，细胞FN组合物还包含张力调节剂(tonicity adjustingagent或tonicity modifying agent)。在一些实施方案中，张力调节剂包括但不限于NaCl、KCl、甘露醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇和/或甘油。在一些实施方案中，张力调节剂选自NaCl、KCl、甘露醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇和/或甘油。

在一些实施方案中，FN组合物还包含粘合剂。在一些实施方案中，FN组合物还包含粘合剂，包括但不限于羟丙甲纤维素、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、羟丙甲纤维素(HPMC)、HEC、聚卡波非、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、PVA(聚乙烯醇)、聚酰亚胺、透明质酸钠、结冷胶、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚硅氧烷、聚酰亚胺、羧甲基纤维素(CMC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维蛋白胶、聚乙二醇和GelCORE。在一些实施方案中，粘合剂是羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，粘合剂是纤维蛋白胶。在一些实施方案中，粘合剂是聚乙二醇。在一些实施方案中，粘合剂是GelCORE(参见Sani等人，Science Advances，第5卷，第3期(2019))。

在一些实施方案中，FN组合物包含(a)加工的条件培养基，所述加工的条件培养基包含通过本文所述的方法中的任一种产生的MSC分泌蛋白质组；以及(b)聚合物。在一些实施方案中，细胞FN组合物包含条件培养基，所述条件培养基包含如本文所述产生的MSC分泌蛋白质组和聚合物。在一些实施方案中，细胞FN组合物包含加工的条件培养基，所述加工的条件培养基包含如本文所述产生的MSC分泌蛋白质组和聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是可生物降解的聚合物，组合物组分可以从可生物降解的聚合物中释放。在一些实施方案中，聚合物能够持续(缓慢)释放组分。

在一些实施方案中，本文提供的FN组合物呈治疗绷带的形式(例如，用细胞FN组合物浸渍的聚合物)。治疗绷带可以根据需要构造，这取决于应用。在一些实施方案中，绷带呈贴片形式或构造为网状物。

在一些实施方案中，FN组合物表现出生物渗透性，例如眼渗透性、角膜渗透性和/或角膜渗透性。在一些实施方案中，FN组合物表现出被眼睛吸收的能力。在一些实施方案中，FN组合物表现出固有的生物渗透性。在一些实施方案中，FN组合物表现出赋形剂赋予的生物渗透性。在一些实施方案中，FN组合物由于较小因子的上调而表现出生物渗透性。在一些实施方案中，FN组合物由于生物防腐剂的存在而表现出生物渗透性。在一些实施方案中，FN组合物由于生物防腐剂苯扎氯铵的存在而表现出生物渗透性。

在一些实施方案中，与其他治疗相比，FN组合物表现出较长半衰期和/或具有增加的稳定性。在一些实施方案中，如本文提供的细胞FN组合物允许上调蛋白质，这允许增加MSC分泌蛋白质组的稳定性。在一些实施方案中，如本文提供的细胞FN组合物允许上调分子伴侣蛋白，以改善MSC分泌蛋白质组中的其他蛋白质的稳定性。

在一些实施方案中，当施用于有需要的受试者时，FN组合物表现出超功效。在一些实施方案中，FN组合物允许每天一滴或一次施用具有治疗功效。

C.生产/制造方法

在一些实施方案中，本文提供的细胞FN由细胞分泌至条件培养基中。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如间充质干细胞。在一些实施方案中，条件培养基被进一步加工，以除去不期望的成分，从而产生细胞FN组合物。

在一些实施方案中，可以从收集自待治疗的患者或个体(有需要的患者)或其他(供体)个体(诸如年轻和/或健康供体)的间充质干细胞和/或商业上获得的间充质干细胞获得条件培养基，从中获得细胞FN组合物(并且因此获得间充质干细胞分泌因子)。例如，从待治疗的个体(自体干细胞)或供体(同种异体干细胞)获得的MSC可以用于产生本文所述的条件培养基，然后可以将条件培养基进一步加工成如本文所述的细胞FN组合物。

根据本发明，制备间充质干细胞(MSC)分泌蛋白质组的方法包括：

i.在第一培养基中培养间充质干细胞(MSC)；

ii.从MSC中去除来自步骤(i)的第一培养基；

iii.洗涤步骤(ii)中的MSC；

iv.添加第二培养基并培养约1-5天；

v.收获来自步骤(iv)的第二培养基作为条件培养基；和

vi.将步骤(v)中的条件培养基加工成如本文所述的MSC分泌蛋白质组组合物。

在一些实施方案中，可以使用用于培养细胞的生物反应器系统进行培养。在一些实施方案中，可以使用用于培养干细胞的生物反应器系统进行培养。在一些实施方案中，可以使用用于培养间充质干细胞的生物反应器系统进行培养。在一些实施方案中，可以使用培养基混合技术进行培养。在一些实施方案中，可以使用PBS Vertical Wheel^TM混合技术(从PBS Biotech，Inc.商购获得)进行培养。

在一些实施方案中，在步骤(iv)中将步骤(v)中的条件培养基加工成分泌蛋白质组组合物包括：

a)过滤来自步骤(v)的收获的条件培养基以去除细胞微粒；

b)浓缩来自步骤(a)的过滤的条件培养基；和

c)用配制缓冲液进行缓冲液交换。

在一些实施方案中，步骤c)包括用选自以下的缓冲系统进行缓冲液交换：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和柠檬酸/磷酸氢二钠。

在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用0.45μm过滤器、0.22μm过滤器、0.8μm过滤器和0.65微米过滤器、低蛋白质结合PVDF膜和/或PES(聚醚砜)。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用0.45μm过滤器。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用0.22μm过滤器。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用0.8μm过滤器。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用0.65微米。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用低蛋白质结合PVDF膜。在一些实施方案中，过滤步骤(a)包括使用PES(聚醚砜)。

在一些实施方案中，浓缩步骤(b)包括使用中空纤维过滤器、切向流过滤系统或基于离心的尺寸排阻技术。在一些实施方案中，浓缩步骤(b)包括使用中空纤维过滤器技术。在一些实施方案中，浓缩步骤(b)包括使用切向流过滤系统。在一些实施方案中，浓缩步骤(b)包括使用基于离心的尺寸排阻技术。

在一些实施方案中，基于离心的尺寸排阻技术采用3-10kDa MW截止值。在一些实施方案中，基于离心的尺寸排阻技术采用至少3kDa MW截止值、至少4kDa MW截止值、至少5kDa MW截止值、至少6kDa MW截止值、至少7kDa MW截止值、至少8kDa MW截止值、至少9kDaMW截止值、至少10kDa MW截止值、至少11kDa MW截止值、至少12kDa MW截止值、至少13kDaMW截止值，在至少14kDa MW截止值、至少15kDa MW截止值、至少16kDa MW截止值、至少17kDaMW截止值、至少18kDa MW截止值、至少19kDa MW截止值、至少20kDa MW截止值、至少21kDaMW截止值、至少22kDa MW截止值、至少23kDa MW截止值、至少24kDa MW截止值、至少25kDaMW截止值、至少26kDa MW截止值、至少27kDa MW截止值、至少28kDa MW截止值、至少29kDaMW截止值和/或至少30kDa MW截止值。

在一些实施方案中，所述方法产生如上文所述的MSC分泌蛋白质组组合物和/或制剂。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基是MSC培养基和/或MSC-XF。

可以使MSC或从MSC分化的细胞产生包含细胞FN和任选的其他所期望的分泌蛋白质组组分的条件培养基，例如，条件培养基包含如本文所述的所需细胞因子和/或所需治疗特性。例如，分泌蛋白质组可以从超级供体细胞系的MSC产生。分泌蛋白质组也可以从商业获得的MSC中产生。在接下来的实施方案中，可以为大量个体制备和储存同种异体MSC(和/或由其获得的细胞)和/或同种异体MSC来源的分泌蛋白质组组合物。可以提前制备同种异体MSC(和/或由其获得的细胞)和/或MSC来源的分泌蛋白质组组合物，以便在人们需要时准备就绪。在某些实施方案中，可以加工MSC(和/或由其获得的细胞)和/或MSC来源的分泌蛋白质组组合物，以制造更浓缩的溶液或组合物(例如，如本文所述的间充质干细胞来源的分泌蛋白质组组合物或MSC分泌蛋白质组组合物)。

在一些实施方案中，初始培养基和第一培养基不同。在一些实施方案中，初始培养基和第一培养基相同。可用于培养MSC以产生包含根据本发明的MSC分泌蛋白质组的条件培养基的一种或多种细胞培养基的非限制性实例包括hMSC Media Booster XFM、hMSC高性能基础培养基、伊格尔最低必需培养基(Minimum Essential Medium Eagle，MEME)、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(具有和没有Fitton-Jackson改良)、StemPro、MSCGro，MesenCult，NutriStem、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle)(BME-添加厄尔氏盐基(Earle′s salt base))、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(DMEM-含或不含血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥改良伊格尔培养基(Glasgow Modification Eagle Medium，GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5A培养基、培养基M199(M199E-带厄尔盐基)、培养基M199(M199H-具有汉克盐基(Hank′s salt base))、最低必需培养基α(MEM-α)、最低必需培养基(MEM-E-具有厄尔盐基)、最低必需培养基(MEM-H-具有汉克盐基)和最低必需培养基(MEM-NAA具有非必需氨基酸)以及许多其他培养基，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MR 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。用于本发明的优选培养基是MEM-α。这些和其他有用的培养基可从GIBCO(Grand Island，N.Y.，USA)和Biological Industries(BetHaEmek，Israel)等处获得。许多这些培养基汇总于Methods in Enzymology，第LVIII卷，“Cell Culture”，第6272页，由William B.Jakoby和Ira H.Pastan编辑，由AcademicPress，Inc.出版。

在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基可以是无血清培养基。在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基可以补充有血清。在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基可补充人血小板裂解液。在一些实施方案中，血清可包括胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基可以补充血清，例如牛或其他物种的胎血清。在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基可以补充有其他组分以促进细胞生长和/或促进细胞健康，例如巯基乙醇和/或抗生素。在一些实施方案中，用于间充质干细胞的细胞培养基没有补充抗生素。

在一些实施方案中，改变氧百分比以促进细胞生长和/或促进细胞健康。在一些实施方案中，氧气体积为5％、10％、15％、20％或25％以促进细胞生长和/或促进细胞健康。在一些实施方案中，间充质干细胞在氧分压下生长以促进细胞生长和/或促进细胞健康。在一些实施方案中，间充质干细胞在低氧分压环境下生长以促进细胞生长和/或促进细胞健康。

一方面，本发明涉及包含间充质干细胞所分泌的生物因子的条件培养基(CM)，其可称为包含MSC分泌蛋白质组的条件培养基。条件培养基可通过如本文所述在培养基中培养间充质干细胞并将含有间充质干细胞及其分泌的间充质干细胞产物(称为生物因子和/或分泌蛋白质组)的所得培养基分离成含有分泌蛋白质组和在条件培养基中生长的间充质干细胞的条件培养基的组成部分来获得。分离后的条件培养基包含间充质干细胞分泌蛋白质组并且可以根据本文所述的方法进一步加工和/或使用并且基本上不含间充质干细胞(可以含有小百分比的干细胞和/或痕量的干细胞)或不含间充质干细胞。MSC分泌蛋白质组包含多种生物因子，包括激素、细胞因子、细胞外基质、蛋白质、囊泡、抗体、趋化因子、受体、抑制剂和颗粒。如本文所述，包含MSC分泌蛋白质组的一种或多种条件培养基(CM或包含MSC分泌蛋白质组的条件培养基)可被进一步加工，从而产生浓缩的条件培养基(pCM或浓缩的MSC分泌蛋白质组)。

在一些实施方案中，包含MSC分泌蛋白质组或浓缩的MSC分泌蛋白质组的条件培养基是通过在培养基中培养间充质干细胞、更换其中已经培养了间充质干细胞的培养基来产生的。在一些实施方案中，收获(收集)包含MSC分泌蛋白质组的所得条件培养基，然后加工以产生浓缩的MSC分泌蛋白质组。在某些实施方案中，包含MSC分泌蛋白质组的收获的条件培养基的加工包括去除一些、大部分或基本上所有的培养基，或去除一些、大部分或基本上所有的条件培养基的所选组分。

在一些实施方案中，将包含MSC分泌蛋白质组的收获的条件培养基过滤以产生浓缩的MSC分泌蛋白质组。在一些实施方案中，将包含MSC分泌蛋白质组的收获的条件培养基超滤以产生浓缩的MSC分泌蛋白质组。

一方面，本文提供了产生加工的条件培养基(包含细胞FN)的方法，其包括(a)在细胞培养基中培养干细胞，从而产生包含间充质干细胞分泌的因子的条件培养基(例如，包含间充质干细胞分泌蛋白质组的条件培养基)；(b)收获条件培养基，从而产生收获的条件培养基(例如，收获的间充质干细胞分泌蛋白质组)；以及(c)过滤收获的条件培养基(例如，收获的间充质干细胞分泌蛋白质组)，以产生加工的条件培养基(间充质干细胞分泌蛋白质组)。在一些实施方案中，(a)的干细胞在生长培养基中培养(已经培养)，之后在无生长因子培养基中培养。因此，在一些实施方案中，所述方法包括：(a)在第一生长培养基中培养间充质干细胞；(b)用第二生长培养基替换第一生长培养基并在第二生长培养基中培养干细胞，从而产生包含间充质干细胞分泌蛋白质组的条件培养基；(c)收获包含间充质干细胞分泌蛋白质组的条件培养基，从而产生包含间充质干细胞分泌蛋白质组的收获的条件培养基；以及(d)过滤收获的条件培养基以产生包含间充质干细胞分泌蛋白质组的加工条件培养基。

在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)是多能的(能够分化为多种但并非全部的细胞谱系)、非造血(非血液)干细胞，这些干细胞从各种成人组织(包括骨髓和脂肪组织)中分离出来(源自所述成人组织)。在某些实施方案中，间充质干细胞是从骨髓中分离的。“分离的”是指从其原始环境中移出细胞。间充质干细胞可分化为中胚层细胞，例如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。MSC的细胞体小，细胞突少，且为细长的。细胞体含有一个大而圆的细胞核，核仁突出，周围环绕着精细分散的染色质颗粒，使细胞核外观清晰。细胞体的其余部分含有少量高尔基体、粗面内质网、线粒体和多核糖体。细胞体的其余部分含有少量高尔基体、粗面内质网、线粒体和多核糖体。细长的细胞广泛分散，并且相邻的细胞外基质由一些网状原纤维填充，但缺乏其他类型的胶原原纤维[Brighton等人1991 The Journal of Bone and Joint Surgery 73(6)：832-47]。本文所述的MSC可表达以下分子标志物(细胞或细胞类型的质膜的蛋白质分子特征)谱：骨形态发生蛋白受体”¹”(BMPR⁺)；CD34⁺Scal⁺Lin”；CD44⁺；c-kit⁺；Sca-1⁺；Thy-1⁺；NOTCH3；JAG1；ITGA11。MSC还可以表达其他细胞类型特异性标志物(参见万维网stemcells.nih，gov；Kaltz等人2010ExpCell Res Oct 1；316(16)：2609-17，其以引用方式并入本文]。可以基于集落形成单位测定来鉴定本文所述的MSC，以检测MSC的多能分化潜能(MSC产生何种细胞类型)。然而，也可以使用稍微分化的细胞(祖细胞)。

i.FN组合物-加工

在一些实施方案中，为了产生FN组合物，可以在一些实施方案中收集和过滤和/或纯化包含本文所述的MSC分泌蛋白质组的条件培养基，以去除细胞微粒和/或其他有害组分。例如，如上文所述，在步骤(v)下从步骤(iv)收获第二培养基作为条件培养基。本文所用的过滤膜可选自本领域已知的具有合适膜和构造的任何过滤膜，使得它们能够保留所需MSC分泌蛋白质组组分，同时允许细胞微粒和/或其他有害组分通过。因此，可以使用任何合适的膜，其允许在所选的流体动力学条件下保留细胞，同时允许有害组分通过以去除。在一些实施方案中，孔径约5微米的上限和约0.1微米的下限将是合适的。在一些实施方案中，可以使用微孔过滤器进行过滤。在一些实施方案中，可以使用0.5μm至0.2μm过滤器进行过滤。在一些实施方案中，可以使用0.5μm、0.45μm、0.4μm、0.35μm、0.3μm、0.25μm、0.22μm和/或0.2μm过滤器进行过滤。在一些实施方案中，可以使用0.45μm过滤器进行过滤。在一些实施方案中，可以使用0.22μm过滤器进行过滤。在一些实施方案中，可以使用低蛋白质结合聚偏二氟乙烯(PVDF)膜进行过滤/纯化。在一些实施方案中，可以使用聚醚砜(PES)进行过滤/纯化。

在一些实施方案中，过滤是通过超滤进行。在一些实施方案中，使用3kD的过滤器尺寸过滤条件培养基(以在加工的条件培养基中实现大于过滤器尺寸的分子的纯化、脱盐和浓缩)。在一些实施方案中，使用小于3kD的过滤器尺寸过滤条件培养基，而在其他实施方案中，使用大于3kD的过滤器尺寸，这取决于使用加工的条件培养基的应用。在其他实施方案中，使用不同孔径(例如，2kD、<2kD或>2kD)的过滤器进行收获的条件培养基的超滤，所述过滤器被选择以确定包含MSC分泌蛋白质组的所得加工的条件培养基的组分的大小。

在一些实施方案中，生长支持培养基中的有害组分通过培养基交换去除，优选地通过“错流过滤”去除。错流过滤是指一种过滤模式，其中MSC分泌蛋白质组细胞的悬浮液基本上平行于过滤器而流动，所述过滤器为悬浮液的除细胞之外的组分可渗透的。错流过滤过程的特征在于一组流体动力学参数，包括Re＝雷诺数(Reynolds number)、γw＝壁面剪切速率、Δp＝压降和TMP＝跨膜压力。Re、γw和ΔP将取决于过滤系统的几何形状、流动条件和流体特性。在一些实施方案中，这种错流过程也可以包括中空纤维过滤系统。参见例如美国专利号5,053,334，其以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，FN组合物可以在没有过滤的情况下和/或在过滤后进一步浓缩。在一些实施方案中，可以使用中空纤维切向流技术浓缩FN组合物。

在一些实施方案中，可以使用基于离心的尺寸排阻技术来浓缩FN组合物，例如可以在离心步骤期间使用浓缩器(amicon)和/或离心器(centricon)。在一些实施方案中，大小截止值为3-10kDa MW截止值。在一些实施方案中，在基于离心的尺寸排阻技术浓缩方法期间使用的分子量截止值为至少约3kDa、至少约4kDa、至少约5kDa、至少约6kDa、至少约7kDa、至少约8kDa、至少约9kDa或至少约10kDa或至少约15kDa或至少约20kDa或至少约25kDa或至少约30kDa。

在一些实施方案中，FN组合物浓缩约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍或约100倍。在一些实施方案中，与浓缩前的条件培养基相比，FN组合物浓缩约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍或约100倍。

在一些实施方案中，FN组合物在浓缩步骤后进一步缓冲液交换到最终制剂缓冲液中。在一些实施方案中，FN组合物在浓缩步骤后进一步缓冲液交换到没有粘合剂的最终制剂缓冲液中。在一些实施方案中，缓冲液交换包括改变FN组合物的缓冲液组分。在一些实施方案中，FN组合物在缓冲液交换步骤期间不被稀释。在一些实施方案中，FN组合物在缓冲液交换步骤期间被稀释小于1％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％或小于25％。

在一些实施方案中，FN组合物在浓缩步骤后进行缓冲液交换，使得去除所有痕量的培养基组分。在一些实施方案中，FN组合物在浓缩步骤后进行缓冲液交换，使得小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％或约0％的培养基组分得到保留。

ii.FN组合物-配制

在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含0.1ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50-5000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含100-4000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含150-3500ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-100,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-10,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-7,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-6,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-4,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含50ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-30,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-6,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-150,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-140,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-130,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约135,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-120,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-110,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-100,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-90,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-80,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-70,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-60,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-50,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-40,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-30,000ng/MLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-20,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-10,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-9,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-8,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-7,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-6,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-5,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-4,000ng/ML FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000ng/mL-3,000ng/ML FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含1000-70,000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含500-50,000ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含1000-40,000ng/mLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含1500-35,000ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含约0.5-50g/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含5-45ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含10-40ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含15-35ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含20-30ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN处于上文提供的范围内的任何合适值的浓度。在一些实施方案中，FN组合物包含约20ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约21ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约22ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约23ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约24ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约25ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约26ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约27ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约28ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约29ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约30ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约25ng/mL FN。

在一些实施方案中，FN组合物包含约0.5-20ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约3-8ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约3ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约3.5ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含4ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约4.5ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含5ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约5.5ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含6ng/mLFN。在一些实施方案中，FN组合物包含约6.5ng/mL FN。在一些实施方案中，FN组合物包含7ng/mL细胞FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约7.5ng/mL细胞FN。在一些实施方案中，FN组合物包含约8ng/mL细胞FN。

在一些实施方案中，FN组合物以包含约2mg-3mg/mL磷酸二氢钠的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约4％至5％/mL磷酸二氢钠的制剂制备。

在一些实施方案中，FN组合物以包含约11mg-12mg/mL磷酸氢二钠的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约21.5％至23％/mL磷酸氢二钠的制剂制备。

在一些实施方案中，FN组合物以包含约11.5mg-13mg/mL甘露醇的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约23％至25％/mL甘露醇的制剂制备。

在一些实施方案中，FN组合物以包含约23mg-25mg/mL海藻糖二水合物的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约46％至48％/mL海藻糖二水合物的制剂制备。

在一些实施方案中，FN组合物以不包含羟丙甲纤维素的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以任选包含羟丙甲纤维素的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约0.5mg-2mg/mL羟丙甲纤维素的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含约1％至3％/mL羟丙甲纤维素的制剂制备。

在一些实施方案中，FN组合物以包含盐酸和/或氢氧化钠的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含盐酸的制剂制备。在一些实施方案中，FN组合物以包含氢氧化钠的制剂制备。在一些实施方案中，使用盐酸和/或氢氧化钠来获得所需的pH值。

在一些实施方案中，制剂包含NaCl。在一些实施方案中，制剂不包含NaCl。在一些实施方案中，制剂不包含可检测水平的NaCl。在一些实施方案中，制剂包含MgCl₂。在一些实施方案中，制剂不包含MgCl₂。在一些实施方案中，制剂不包含可检测水平的MgCl₂。在一些实施方案中，制剂不包含NaCl或MgCl₂。在一些实施方案中，制剂不包含可检测水平的NaCl或MgCl₂。

在一些实施方案中，FN制剂与泪液等渗，所述泪液包括例如天然存在的以及合成的泪液或泪液样溶液。

在一些实施方案中，FN组合物以包含如下表1中提供的组分的制剂制备：

表1：FN制剂实施方案。

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	2.28mg
		磷酸氢二钠	11.45mg
甘露醇	12.2mg
		海藻糖二水合物	24mg
羟丙甲纤维素	1mg
		盐酸和/或氢氧化钠	根据需要调整

表2：FN制剂实施方案。

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	1.31mg
		磷酸氢二钠	5.73mg
甘露醇	6.1mg
		海藻糖二水合物	12mg
羟丙甲纤维素	0.5mg
		盐酸和/或氢氧化钠	根据需要调整

在一些实施方案中，FN组合物包含：

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	2.28mg
		磷酸氢二钠	11.45mg
甘露醇	12.2mg
		海藻糖二水合物	24mg
羟丙甲纤维素	1mg

在一些实施方案中，FN组合物包含：

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	1.31mg
		磷酸氢二钠	5.73mg
甘露醇	6.1mg
		海藻糖二水合物	12mg
羟丙甲纤维素	0.5mg

在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl，并且包含：

在一些实施方案中，FN组合物不包含MgCl₂，并且包含：

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	1.31mg
		磷酸氢二钠	5.73mg
甘露醇	6.1mg
		海藻糖二水合物	12mg
羟丙甲纤维素	0.5mg

在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl或MgCl₂，并且包含：

存在的成分	每1mL产品的量
		FN	0.5-50ng
磷酸二氢钠	1.31mg
		磷酸氢二钠	5.73mg
甘露醇	6.1mg
		海藻糖二水合物	12mg
羟丙甲纤维素	0.5mg

在一些实施方案中，FN组合物包含0.5-50ng/ml FN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、10-12mg/ml磷酸氢二钠、11-13mg/ml甘露醇、2-25mg/ml海藻糖二水合物和0.5-2mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

在一些实施方案中，FN组合物包含0.5-50ng/ml FN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、11.45mg/ml磷酸氢二钠、12.2mg/ml甘露醇、24mg/ml海藻糖二水合物和1mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

在一些实施方案中，FN组合物包含0.5-50ng/ml FN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、4.5-7mg/ml磷酸氢二钠、5.5-7.5mg/ml甘露醇、11-13mg/ml海藻糖二水合物和0.1-1.5mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

在一些实施方案中，FN组合物包含0.5-50ng/ml FN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、5.73mg/ml磷酸氢二钠、6.1mg/ml甘露醇、12mg/ml海藻糖二水合物和0.5mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

D.测定方法/治疗特性

在本发明的一些实施方案中，加工FN组合物以获得某些的成分比例/浓度以及FN组合物的特性。

在本发明的一些实施方案中，加工FN组合物以达到某些效力性能标准。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤增强FN组合物的效力。

细胞外囊泡是膜结合颗粒，其携带上述可溶性和不溶性物质。术语“细胞外囊泡”是指不同物种的一组分泌或脱落的囊泡。这些囊泡通常分为以下亚型：1)微泡或棚微泡，通常表现出50-1500nm的大小范围；2)外来体，通常表现出30-120nm大小范围；和3)囊泡，通常表现出小于500nm(即<500nm)的大小范围。(参见例如WO2019016799，其全部内容以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，可以分析FN组合物的颗粒计数和/或定量分泌蛋白质组中存在的细胞外囊泡(EV)。

在一些实施方案中，EV以以下浓度存在：约2.5x 10^5/uL、2.6x 10^5/uL、2.7x 10^5/uL、2.8x 10^5/uL、2.9x 10^5/uL、3.0x 10^5/uL、3.1x 10^5/uL、3.2x 10^5/uL、3.3x10^5/uL、3.4x 10^5/uL、3.5x 10^5/uL、3.6x 10^5/uL、3.7x 10^5/uL、3.8x 10^5/uL、3.9x10^5/uL、4.0x 10^5/uL、4.1x 10^5/uL、4.2x 10^5/uL、4.3x 10^5/uL、4.4x 10^5/uL、4.5x 10^5/uL、4.6x 10^5/uL、4.7x 10^5/uL、4.8x10^5/uL、4.9x 10^5/uL或约5.0x 10^5/uL。在一些实施方案中，EV以约3.8x 10^5/uL+/-0.8x 10^5的浓度存在。

在一些实施方案中，EV以约2.5x 10^5/uL、2.6x 10^5/uL、2.7x 10^5/uL、2.8x 10^5/uL、2.9x 10^5/uL、3.0x 10^5/uL、3.1x 10^5/uL、3.2x 10^5/uL、3.3x 10^5/uL、3.4x10^5/uL、3.5x 10^5/uL、3.6x 10^5/uL、3.7x 10^5/uL、3.8x 10^5/uL、3.9x 10^5/uL、4.0x10^5/uL、4.1x 10^5/uL、4.2x 10^5/uL、4.3x 10^5/uL、4.4x 10^5/uL、4.5x 10^5/uL、4.6x 10^5/uL、4.7x 10^5/uL、4.8x 10^5/uL、4.9x10^5/uL或约5.0x 10^5/uL的浓度和平均110-120nm的直径存在。在一些实施方案中，EV以约2.5x 10^5/uL、2.6x 10^5/uL、2.7x10^5/uL、2.8x 10^5/uL、2.9x 10^5/uL、3.0x 10^5/uL、3.1x 10^5/uL、3.2x 10^5/uL、3.3x10^5/uL、3.4x 10^5/uL、3.5x 10^5/uL、3.6x10^5/uL、3.7x 10^5/uL、3.8x 10^5/uL、3.9x10^5/uL、4.0x 10^5/uL、4.1x 10^5/uL、4.2x 10^5/uL、4.3x 10^5/uL、4.4x 10^5/uL、4.5x10^5/uL、4.6x 10^5/uL、4.7x 10^5/uL、4.8x 10^5/uL、4.9x 10^5/uL或约5.0x 10^5/uL的浓度和平均112-116nm的直径存在。在一些实施方案中，EV以约2.5x 10^5/uL、2.6x 10^5/uL、2.7x 10^5/uL、2.8x 10^5/uL、2.9x 10^5/uL、3.0x 10^5/uL、3.1x 10^5/uL、3.2x10^5/uL、3.3x 10^5/uL、3.4x 10^5/uL、3.5x 10^5/uL、3.6x 10^5/uL、3.7x 10^5/uL、3.8x10^5/uL、3.9x 10^5/uL、4.0x 10^5/uL、4.1x10^5/uL、4.2x 10^5/uL、4.3x 10^5/uL、4.4x10^5/uL、4.5x 10^5/uL、4.6x 10^5/uL、4.7x 10^5/uL、4.8x 10^5/uL、4.9x 10^5/uL或约5.0x 10^5/uL的浓度和平均114nm的直径存在。在一些实施方案中，EV以约3.8x 10^5/uL+/-0.8x 10^5的浓度和平均114nm的直径存在。

iii.FN组合物-治疗特性

在一些实施方案中，本发明的FN组合物包含细胞FN。在一些实施方案中，FN组合物包含细胞FN。在一些实施方案中，本发明的细胞FN是可变剪接变体/同种型的混合物，诸如EDA、EDB和V+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+。在一些实施方案中，细胞FN是EDB+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+和EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是V+。

在一些实施方案中，本公开的FN组合物还包含一种或多种生长因子。

在一些实施方案中，本公开的FN组合物表现出多种治疗特性，包括例如抗血管生成特性(血管和/或淋巴管)、抗纤维化特性、抗炎特性、促进细胞迁移、增殖、细胞粘附、扩散、存活和细胞外基质(ECM)组装和构造的特性、促有丝分裂促进特性、抗氧化应激/损伤特性。

在一些实施方案中，FN组合物表现出抗纤维化特性。在一些实施方案中，这种抗纤维化特性可以使用标准测定来测定。在一些实施方案中，关于FN组合物的各种因子和/或活性的存在指示抗纤维化特性。在一些实施方案中，指示抗纤维化特性的因子包括一种或多种选自由以下各项组成的组的生长因子：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。

在一些实施方案中，FN组合物表现出抗炎特性。在一些实施方案中，FN组合物抑制炎症。在一些实施方案中，FN组合物抑制炎症5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。90％或100％(例如，完全减少炎症)。在一些实施方案中，FN组合物预防肥大细胞脱粒。

在一些实施方案中，FN组合物促进细胞迁移和增殖，包括例如促有丝分裂和促运动活性。在一些实施方案中，FN组合物促进促有丝分裂活性。在一些实施方案中，FN组合物促进促运动活性。在一些实施方案中，FN组合物还包含一种或多种选自由以下各项组成的组的生长因子：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF，它们提供FN组合物的额外细胞迁移和增殖活性。

在一些实施方案中，FN组合物还包含FGF，诸如FGF-2，它提供FN组合物的额外细胞迁移和增殖活性。

在一些实施方案中，FN组合物还包含HGF，它提供FN组合物的额外细胞迁移和增殖活性。

在一些实施方案中，FN组合物还包含抗细胞凋亡剂，其提供FN组合物的细胞迁移和增殖活性。在一些实施方案中，FN组合物包含抗细胞凋亡剂，其包括但不限于FGF-2、HGF和IGF-1，并且提供FN组合物的额外的细胞迁移和增殖活性。在一些实施方案中，FN组合物包含抗细胞凋亡剂，其选自FGF-2、HGF和IGF-1，并且提供FN组合物的额外的细胞迁移和增殖活性。

iv.FN组合物-生物物理学/生物化学特性

生物化学和生物物理学表征：

在一些实施方案中，本发明提供了用于表征FN组合物的方法。在一些实施方案中，FN组合物表征将包括：1)FN组合物中分子实体的综合和/或定量定位；2)测量所选因子对生物活性的贡献；以及3)测量生物物理学参数。在一些实施方案中，为了确定FN组合物的特性，可以如本文所述对FN组合物进行各种效力测定。在一些实施方案中，对于FN组合物，可以对FN组合物中的分子实体进行全面和/或定量定位；2)测量所选因子对生物活性的贡献；以及3)测量生物物理学参数。在一些实施方案中，表征测定包括但不限于生物物理学测定、生物化学测定和生物测定。在一些实施方案中，表征测定可以包括但不限于物理组分表征、氧化应激测定、安全性分析、稳定性测定、增殖测定、迁移测定、新血管形成测定、分化/瘢痕形成测定、炎症测定和/或上皮屏障完整性测定。在一些实施方案中，表征测定选自物理组分表征、氧化应激测定、安全性令析、稳定性测定、增殖测定、迁移测定、新血管形成测定、分化/瘢痕形成测定、炎症测定和/或上皮屏障完整性测定。

物理组分特性：

在一些实施方案中，FN组合物的表征包括采用生物分析技术的组合的方法。在一些实施方案中，FN组合物的表征包括确定FN组合物的物理组分。在一些实施方案中，FN组合物的表征包括采用蛋白质阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱和免疫印迹。在一些实施方案中，FN组合物的表征可用于鉴定FN组合物中的分子。在一些实施方案中，可以使用蛋白质阵列来鉴定FN组合物中的因子。在一些实施方案中，可采用质谱法来鉴定FN组合物中一种或多种因子的存在。在一些实施方案中，可以采用定量技术来测量一种或多种因子的水平。在一些实施方案中，可以采用定量技术例如ELISA来测量每个因子的水平。

在一些实施方案中，FN组合物包含细胞FN。在一些实施方案中，本发明的细胞FN是可变剪接变体/同种型的混合物，诸如EDA、EDB和V+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+。在一些实施方案中，细胞FN是EDB+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+和EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是V+。

在一些实施方案中，FN组合物包含MSC分泌蛋白质组，所述MSC分泌蛋白质组包含蛋白质因子和细胞外囊泡(EV)。在一些实施方案中，细胞FN组合物包含营养因子。

在一些实施方案中，分泌蛋白质组包含大小范围为30-200nm和1x10⁸至5x10⁹个EV/mL的细胞外囊泡(EV)。

在一些实施方案中，可以进行消耗研究以提取关键因子的个体贡献。在一些实施方案中，使用基于抗体的下拉方法，可以从FN组合物中去除限定的因子。在一些实施方案中，可以通过蛋白质印迹验证消耗，然后通过如下文所述的一种或多种生物测定进行评估。在一些实施方案中，可以进行消耗研究以评估蛋白质级分和EV级分的贡献。

氧化应激：

在一些实施方案中，可以对FN组合物进行氧化应激预防测定。在一些实施方案中，FN组合物预防角膜上皮损伤。在一些实施方案中，细胞FN组合物减少炎症的存在。在一些实施方案中，如通过抗炎标志物的存在增加所确定的，FN组合物减少炎症的存在。在一些实施方案中，如通过抗炎标志物例如像IL-8的存在增加所确定的，FN组合物减少炎症的存在。

安全性表征：

在一些实施方案中，可以评估FN组合物的血液相容性并实施无菌以及热原和内毒素水平的测试。在一些实施方案中，可以评估FN组合物的血液相容性。在一些实施方案中，评估血液相容性包括溶血和血凝的测定。在一些实施方案中，FN组合物不表现出全身暴露的有害影响。在一些实施方案中，FN组合物不表现出全身暴露(例如严重的眼部烧伤)的有害影响。在一些实施方案中，FN组合物不表现出血凝活性。在一些实施方案中，FN组合物不诱导溶血。在一些实施方案中，FN组合物不诱导溶血活性。

在一些实施方案中，FN组合物可以是无菌的，使得它可以作为药物制剂的一部分施用。在一些实施方案中，FN组合物可以不含或基本上不含内毒素。在一些实施方案中，FN组合物可以不合或基本上不含微生物。

稳定性：

在一些实施方案中，可以评估和/或确定FN组合物的生物物理学特性。在一些实施方案中，使用荧光、静态光散射和动态光散射来表征蛋白质稳定性度量。在一些实施方案中，可以测量以下参数以进一步表征分泌蛋白质组：热熔化、热聚集、ΔG和/或粘度。在一些实施方案中，采用热熔化测定来确定FN组合物稳定性。在一些实施方案中，采用热聚集测定来确定FN组合物稳定性。在一些实施方案中，采用ΔG作为用于确定FN组合物稳定性的量度。在一些实施方案中，测量粘度作为FN组合物特征。在一些实施方案中，粘度用于确定FN组合物稳定性。

在一些实施方案中，可以采用生物物理学度量来建立用于表征不同FN组合物制剂的稳定性参数。

在一些实施方案中，FN组合物在-20℃、4℃和室温(20℃)下稳定至少7天。在一些实施方案中，FN组合物在-20℃、4℃和室温(20℃)下稳定至少14天。在一些实施方案中，FN组合物稳定至少7天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。在一些实施方案中，FN组合物在约-20℃下稳定至少7天、至少14天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月或至少3个月。在一些实施方案中，FN组合物在约4℃下稳定至少7天、至少14天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。在一些实施方案中，FN组合物在约20℃(或室温)下稳定至少7天、至少14天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。

在一些实施方案中，FN组合物在约-20℃下稳定至少7天。在一些实施方案中，FN组合物在约4℃下稳定至少7天。在一些实施方案中，FN组合物在约20℃下稳定至少7天。在一些实施方案中，FN组合物在约25℃(室温)下稳定至少7天。

在一些实施方案中，FN组合物在约-20℃下稳定至少14天。在一些实施方案中，FN组合物在约4℃下稳定至少14天。在一些实施方案中，FN组合物在约20℃(或室温)下稳定至少14天。在一些实施方案中，FN组合物在约25℃(室温)下稳定至少14天。

上皮屏障完整性测定

角膜上皮，更准确地说，上皮的顶端表面对角膜的整体屏障特性有重大贡献，并且角膜屏障的变化用作用于生物相容性分析的敏感因素。在一些实施方案中，可以例如通过上皮屏障完整性测定来评估和/或确定FN组合物的生物物理学特性。在一些实施方案中，上皮屏障完整性测定是跨上皮电阻(TEER)。在一些实施方案中，可以评定跨上皮电阻(TEER)以测量整体屏障特性。在一些实施方案中，可将3D组织转移到含有2mL TEER缓冲液的24孔板中并孵育10分钟。在一些实施方案中，可使用上皮伏欧姆计和EndOhm-12腔室(World Precision，Sarasota，FL)测量TEER。在一些实施方案中，在程序结束时，可以使用以下公式将组织用于组织活力评估：

％屏障完整性＝100x[TEER(治疗的组织)/TEER(安慰剂对照)]

在一些实施方案中，TEER可以用于评估在局部应用FN组合物之后对屏障完整性的影响。在一些实施方案中，TEER可用于评估在使用EpiCorneal组织模型(MatTek Corp)局部暴露于氮芥(NM)引起的角膜上皮损伤之后在局部应用FN组合物之后对屏障完整性的影响。在一些实施方案中，FN组合物可以例如以6μg/mL(在安慰剂溶液中稀释)局部应用，如实施例6中所述。在一些实施方案中，表皮角膜组织在标准培养条件下在5ml培养基中培养24h。

生物测定

在一些实施方案中，可以采用生物测定来表征FN组合物。在一些实施方案中，生物测定可与以下角膜伤口愈合相关：上皮细胞迁移和增殖、基质细胞分化(例如，瘢痕形成)；新血管形成和炎症。新血管形成和炎症。在一些实施方案中，可以采用生物测定来评估FN组合物介导以下角膜伤口愈合的能力：上皮细胞迁移和增殖、基质细胞分化(瘢痕形成)；新血管形成；和炎症。在一些实施方案中，本文提供和测定的FN组合物包含细胞FN。在一些实施方案中，本发明的细胞FN是可变剪接变体/同种型的混合物，诸如EDA、EDB和/或V+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+。在一些实施方案中，细胞FN是EDB+。在一些实施方案中，细胞FN是EDA+和EDB+。在一些实施方案中，细胞纤连蛋白是V+。

在一些实施方案中，可以评估FN组合物促进伤口愈合诸如眼部伤口愈合的能力。在一些实施方案中，可以评估FN组合物促进增殖和迁移的能力。在一些实施方案中，可以评估FN组合物促进增殖的能力。在一些实施方案中，可以评估FN组合物促进迁移的能力。

在一些实施方案中，FN组合物包含细胞FN。在一些实施方案中，FN组合物促进增殖和/或迁移。在一些实施方案中，FN组合物促进眼部伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物促进增殖。在一些实施方案中，FN组合物促进迁移。在一些实施方案中，FN组合物促进细胞粘附。在一些实施方案中，FN组合物促进细胞扩散。在一些实施方案中，FN组合物促进细胞存活。在一些实施方案中，FN组合物促进细胞外基质(ECM)的正确组装和/或构造。在一些实施方案中，FN组合物可以使用划痕测定来评估以确定促进愈合的能力。在一些实施方案中，可以使用跨孔迁移测定来评估FN组合物以确定增殖促进能力。在一些实施方案中，可以使用跨孔迁移测定来评估FN组合物以确定增殖促进能力。

划痕测定

在一些实施方案中，本发明的测定可以包括“划痕测定”(也称为“划痕伤口测定”、“划痕伤口闭合测定”、“伤口闭合测定”或“伤口愈合测定”)。在一些实施方案中，FN组合物促进迁移并且使用“划痕测定”确定和/或检查这种迁移促进。在一些实施方案中，FN组合物促进增殖并且使用划痕测定确定和/或检查这种增殖促进。通常，划痕测定方法是基于人工间隙(也称为“划痕”)何时出现在融合的细胞单层上。可以监测新产生的间隙边缘上的细胞向开口迁移的“划痕”以关闭/覆盖“划痕”。参见例如Liang，C.，Park，A.&Guan，J.In vitroscratch assay：a convenient and inexpensive method for analysis of cellmigration in vitro.Nat Protoc 2，329-333(2007))。在一些实施方案中，使用划痕测定筛选能够诱导伤口愈合的候选物。

在一个示例性实施方案中，本文提供的划痕测定包括以下步骤：

(a)提供细胞层；

(b)将伤口间隙/划痕引入所述细胞层；和

(c)确定在所述测试组合物的存在下所述伤口间隙是否愈合/闭合，其中在步骤(b)之前或之后将所述组合物施用于所述细胞；其中所述伤口间隙的闭合指示所述测试组合物诱导所述眼部伤口愈合的能力。

在一些实施方案中，将划痕测定用于角膜细胞。在一些实施方案中，所测定的细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所测定的细胞是人细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于视网膜细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于角质细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于成纤维细胞。在一些实施方案中，将划痕测定法用于视觉神经元细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于神经节细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于晶状体上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于虹膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于结膜成纤维细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于非色素纤毛上皮细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于小梁网细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于眼脉络膜成纤维细胞。在一些实施方案中，将划痕测定用于结膜上皮细胞。

在一些实施方案中，在引入一个或多个划痕(也称为“间隙”或“伤口”)时，所测定的细胞形成融合层。在一些实施方案中，所测定的细胞的融合层是单层。

在一些实施方案中，将一个或多个划痕引入细胞。在一些实施方案中，引入单个划痕。在一些实施方案中，将多个划痕引入细胞。在一些实施方案中，将一个或多个划痕以化学方式引入细胞。在一些实施方案中，将一个或多个划痕通过化学烧伤引入细胞。在一些实施方案中，通过现成的药物或化合物引入一个或多个划痕。在一个示例性实施方案中，化学烧伤是碱性烧伤。在另一个示例性实施方案中，化学烧伤是氮芥气体烧伤。在一些实施方案中，通过机械破坏细胞层将一个或多个划痕引入细胞。在一些实施方案中，通过热冲击引入一个或多个划痕。在一些实施方案中，通过激光脉冲引入一个或多个划痕。

在一些实施方案中，引入细胞的划痕包括线性划痕。在一些实施方案中，引入细胞的划痕包括交叉影线划痕。在一些实施方案中，引入细胞的划痕包括圆形划痕。在一些实施方案中，引入细胞的划痕包括锯齿形划痕。在一些实施方案中，引入细胞的划痕包括一种或多种上述形状的组合。

在一些实施方案中，引入的划痕的尺寸(即，任一侧上的伤口/划痕的单独迁移前沿的横向长度)为约0.01mm至10mm。在一些实施方案中，划痕的尺寸为约0.01mm至0.1mm、0.1mm至1mm、1mm至10mm，或这些范围内的任何合适的值。

在一些实施方案中，在引入一个或多个划痕之后，将测试试剂/组合物施用于细胞。在一些实施方案中，在引入一个或多个划痕之前将测试试剂/组合物施用于细胞。在一些实施方案中，测试试剂/组合物是FN组合物。在一些实施方案中，测试试剂/组合物是条件培养基。在一些实施方案中，测试试剂/组合物是生物聚合物，例如蛋白质。在一些实施方案中，测试试剂/组合物是一种或多种活性化合物的药物组合物。在一些实施方案中，筛选测试试剂/组合物促进眼部伤口愈合的能力。

在一些实施方案中，在施用于细胞之前浓缩测试试剂/组合物。在一些实施方案中，在施用于细胞之前稀释测试试剂/组合物。在一些实施方案中，测试试剂/组合物在被施用于细胞之前经历纯化，例如缓冲液交换。在一些实施方案中，测试试剂/组合物在被施用于细胞之前被冻干。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约10-100μg/mL活性组分。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约10-100μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约10-90μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约20-80μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约30-70μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约40-60μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约45μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约50μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，施用于细胞的测试试剂/组合物包含约55μg/mL蛋白质。

在一些实施方案中，一个或多个划痕的闭合指示测试试剂促进眼部伤口愈合的能力。在一些实施方案中，一个或多个划痕的闭合指示测试试剂促进细胞增殖的能力。在一些实施方案中，一个或多个划痕的闭合指示测试试剂促进细胞迁移的能力。在一些实施方案中，划痕的闭合表征为迁移到划痕中的细胞总数。在一些实施方案中，迁移到划痕中的细胞总数通过物理计数(图像分析软件)在染色或不染色(比色或荧光)的情况下测量。在一些实施方案中，迁移到划痕中的细胞总数通过基于吸光度或荧光测定的方法测量，以对划痕中的细胞质量进行光谱定量。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为伤口闭合或其数学变型的百分比，即伤口的初始表面积减去在某一时间的剩余划痕表面积，然后除以划痕的初始表面积。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为剩余划痕面积的百分比，即伤口闭合百分比的倒数。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为划痕的尺寸(即，伤口任一侧上的单独迁移前沿的横向长度)。在一些实施方案中，采用图像分析软件来建立迁移的划痕前沿(或边界)并测量剩余划痕的距离(以像素、μm等为单位)。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为划痕的表面积。在一些实施方案中，划痕的表面积(例如，像素^2或μm^2)由图像分析软件确定。在一些实施方案中，划痕的闭合被被表征为时间函数。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为闭合所有或一定百分比(例如，50％)的划痕所需的时间。在一些实施方案中，划痕的闭合被表征为速率，例如划痕的无细胞表面积作为时间的函数。在一些实施方案中，测量的速率是细胞迁移的距离/迁移时间。

在一些实施方案中，测量一个或多个划痕的闭合持续约1至5天。在一些实施方案中，测量一个或多个划痕的闭合持续约2至4天。在一些实施方案中，测量一个或多个划痕的闭合持续约2至3天。在一些实施方案中，测量一个或多个划痕的闭合持续约2天。在一些实施方案中，测量一个或多个划痕的闭合持续约3天。在一些实施方案中，以规则的间隔测量一个或多个划痕的闭合。在一些实施方案中，每天测量一个或多个划痕的闭合。在一些实施方案中，连续测量一个或多个划痕的闭合。

在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的划痕测定法中诱导眼部伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物在本文提供的划痕测定法中诱导眼部伤口愈合。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少1倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少2倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少3倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少4倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少5倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少6倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少7倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少8倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少9倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10倍。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少20％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少30％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少40％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少50％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少60％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少70％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少80％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少90％。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少100％。

在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的划痕测定法中诱导眼部伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物在本文提供的划痕测定法中诱导眼部伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少1倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少2倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少3倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少4倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少5倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少6倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少7倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少8倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少9倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10倍。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少10％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少20％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少30％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少40％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少50％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少60％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少70％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少80％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少90％。在一些实施方案中，FN组合物在划痕测定中使伤口闭合增加至少100％。

在一些实施方案中，在如本文提供的划痕测定中，需要至少30μg/mL的测试试剂来实现眼部伤口愈合。在一些实施方案中，在如本文提供的划痕测定中，需要至少35μg/mL的测试试剂来实现眼部伤口愈合。在一些实施方案中，在如本文提供的划痕测定中，需要至少40μg/mL的测试试剂来实现眼部伤口愈合。在一些实施方案中，在如本文提供的划痕测定中，需要至少45μg/mL的测试试剂来实现眼部伤口愈合。在一些实施方案中，在如本文提供的划痕测定中，需要至少50μg/mL的测试试剂来实现眼部伤口愈合。

在一些实施方案中，测试试剂是FN。在一些实施方案中，FN是细胞FN。

跨孔迁移测定

在一些实施方案中，本发明的测定包括“跨孔迁移测定”(也称为“跨孔细胞侵入测定”或“跨孔测定”)。在一些实施方案中，利用跨孔迁移测定来评估候选试剂对细胞迁移和/或增殖的能力。在一些实施方案中，利用跨孔迁移测定来评估候选试剂对细胞迁移的能力。在一些实施方案中，利用跨孔迁移测定来评估候选试剂对细胞增殖的能力。在一些实施方案中，利用跨孔迁移测定来筛选能够诱导细胞迁移/增殖的候选物。

在一个示例性实施方案中，本文提供的跨孔迁移测定包括以下步骤：

(a)将细胞加入包含具有孔的膜的上腔室，其中在不存在所述测试试剂/组合物的情况下，向所述细胞补充基础培养基；

(b)将所述上腔室置于包含所述测试试剂/组合物的容器中，其中所述上腔室中的所述角膜细胞通过所述具有孔的膜与所述容器中的所述测试试剂/组合物分离；

(c)孵育所述细胞；和

(d)测量/定量迁移通过所述膜的所述细胞，作为所述测试试剂/组合物诱导所述细胞迁移和/或增殖的能力的指示。

在一些实施方案中，将迁移测定用于角膜细胞跨孔。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于视网膜细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于角质细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于成纤维细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于视觉神经元细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于神经节细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于晶状体上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于虹膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于结膜成纤维细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于非色素纤毛上皮细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于小梁网细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于眼脉络膜成纤维细胞。在一些实施方案中，将跨孔迁移测定用于结膜上皮细胞。

在一些实施方案中，跨孔迁移测定的上腔室被具有孔的膜密封。在一些实施方案中，上腔室是玻璃腔室。在一些实施方案中，上腔室是塑料腔室。在一些实施方案中，上腔室是Boyden腔室。

在一些实施方案中，上腔室的膜是具有限定孔径的聚碳酸酯膜。在一些实施方案中，膜是基底膜。在一些实施方案中，膜的平均孔径小于所测定的细胞的尺寸。在一些实施方案中，膜的平均孔径为约1至15μm。在一些实施方案中，膜的平均孔径为约3μm。在一些实施方案中，膜的平均孔径为约5μm。在一些实施方案中，膜的平均孔径为约8μm。在一些实施方案中，膜的平均孔径为约12μm。

在一些实施方案中，上腔室的膜经过预处理。在一些实施方案中，膜被一种或多种增强细胞粘附和/或增殖的化合物或生物聚合物预包被。在一些实施方案中，膜被细胞外基质预包被。在一些实施方案中，膜被胶原蛋白预包被。在一些实施方案中，膜被纤连蛋白预包被。在一些实施方案中，膜被层粘连蛋白预包被。

在一些实施方案中，将细胞加入包含基础细胞培养基的上腔室。在一些实施方案中，上腔室中的基础细胞培养基不合血清。细胞培养基的非限制性实例包括hMSC MediaBooster XFM、hMSC高性能基础培养基、伊格尔最低必需培养基(Minimum EssentialMedium Eagle，MEME)、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(具有和没有Fitton-Jackson改良)、StemPro、MSCGro、MesenCult、NutriStem、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle)(BME-添加厄尔氏盐基(Earle′ssalt base))、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(DMEM-含或不含血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥改良伊格尔培养基(Glasgow Modification EagleMedium，GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5A培养基、培养基M199(M199E-带厄尔盐基)、培养基M199(M199H-具有汉克盐基(Hank′s salt base))、最低必需培养基α(MEM-α)、最低必需培养基(MEM-E-具有厄尔盐基)、最低必需培养基(MEM-H-具有汉克盐基)和最低必需培养基(MEM-NAA具有非必需氨基酸)以及许多其他培养基，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。用于本发明的示例性培养基是MEM-a。在一些实施方案中，将所测定的细胞加入包含凝胶的上腔室。在一些实施方案中，凝胶包含生物基质，例如细胞外基质。

在一些实施方案中，上腔室悬浮在包括一种或多种测试试剂/组合物的容器中。在一些实施方案中，上腔室和容器包括除一种或多种测试试剂/组合物之外的相同组合物。在其它实施方案中，上腔室和容器包括除一种或多种测试试剂/组合物之外的不同组合物。在一些实施方案中，容器还包含一种或多种生长因子。

在一些实施方案中，容器是反应容器。在一些实施方案中，容器是多孔板中的孔。在一些实施方案中，容器是多孔板中的孔，例如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。

在一些实施方案中，本文提供的测试试剂/组合物包含用于所测定的细胞的化学引诱物。在一些实施方案中，测试试剂/组合物包含FN组合物。在一些实施方案中，测试试剂/组合物包含条件培养基。在一些实施方案中，测试试剂/组合物包含生物聚合物，例如蛋白质。在一些实施方案中，测试试剂/组合物包含一种或多种活性化合物的药物组合物。在一些实施方案中，筛选测试试剂/组合物促进细胞迁移和/或增殖的能力。

在一些实施方案中，测试试剂/组合物仅存在于容器中并从上腔室排出。在一些实施方案中，测试试剂/组合物存在于上腔室和容器中。在一个示例性实施方案中，存在从上腔室朝向容器的测试试剂/组合物的增加的浓度梯度。

在一些实施方案中，在加入之前浓缩测试试剂/组合物。在一些实施方案中，在加入之前稀释测试试剂/组合物。在一些实施方案中，测试试剂/组合物在加入之前经历纯化，例如缓冲液交换。在一些实施方案中，测试试剂/组合物在加入之前被冻干。在一些实施方案中，容器中的试验试剂/组合物包含约10-100μg/mL活性组分。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约10-100μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约10-90μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约20-80μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约30-70μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约40-60μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约45μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约50μg/mL蛋白质。在一些实施方案中，容器中的测试试剂/组合物包含约55μg/mL蛋白质。

在一些实施方案中，在上腔室中孵育细胞约6至72小时。在一些实施方案中，孵育期为约12小时至60小时。在一些实施方案中，孵育期为约18小时至48小时。在一些实施方案中，孵育期是这些范围内的任何合适的值。在一些实施方案中，孵育期为约6小时。在一些实施方案中，孵育期为约18小时。在一些实施方案中，孵育期为约24小时。在一些实施方案中，孵育期为约30小时。在一些实施方案中，孵育期为约36小时。在一些实施方案中，孵育期为约42小时。在一些实施方案中，孵育期为约48小时。

在一些实施方案中，迁移通过膜的细胞总数通过物理计数(图像分析软件)在染色或不染色(比色测定(例如钙黄绿素AM)或荧光测定(例如结晶紫)的情况下测量。在一些实施方案中，活细胞染色用于定量迁移的细胞。在一些实施方案中，通过基于吸光度或荧光测定的方法测量迁移通过膜的细胞总数，以对细胞质量进行光谱定量。在一些实施方案中，通过流式细胞术定量迁移的细胞。

在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中表现出诱导眼部伤口愈合的能力。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞迁移。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞增殖。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中表现出诱导眼部伤口愈合的能力。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞迁移。在一些实施方案中，本发明的FN组合物在本文提供的跨孔迁移测定中诱导细胞增殖。

在一些实施方案中，本发明的FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少1倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少2倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少3倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少4倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少5倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少6倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少7倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少8倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少9倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在-些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少20％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少30％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少40％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少50％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少60％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少70％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少80％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少90％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少100％。

在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少1倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少2倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少3倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少4倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少5倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少6倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少7倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少8倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少9倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10倍。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少10％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少20％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少30％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少40％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少50％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少60％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少70％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少80％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少90％。在一些实施方案中，FN组合物在跨孔测定中使细胞迁移和/或增殖增加至少100％。

在一些实施方案中，在本文提供的跨孔迁移测定中，需要至少30μg/mL的测试试剂/组合物来诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，在本文提供的跨孔迁移测定中，需要至少35μg/mL的测试试剂/组合物来诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，在本文提供的跨孔迁移测定中，需要至少40μg/mL的测试试剂/组合物来诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，在本文提供的跨孔迁移测定中，需要至少45μg/mL的测试试剂/组合物来诱导细胞迁移和/或增殖。在一些实施方案中，在本文提供的跨孔迁移测定中，需要至少50μg/mL的测试试剂/组合物来诱导细胞迁移和/或增殖。

在一些实施方案中，可以对FN组合物进行内皮细胞管形成测定。在一些实施方案中，内皮细胞管形成测定可以指示FN组合物不是促血管生成的。在一些实施方案中，内皮细胞管形成测定提供了FN组合物的血管生成潜力的量度。在一些实施方案中，FN组合物表现出抗血管生成特性。在一些实施方案中，FN组合物具有抗血管生成特性。在一些实施方案中，内皮细胞管形成测定提供了抗血管生成信号和促血管生成信号的比率。在一些实施方案中，内皮细胞管形成测定的阴性结果将证实抗血管生成信号：促血管生成信号比率高并且将确保FN组合物不会促进新血管形成。在一些实施方案中，内皮细胞管形成测定的阴性结果将证实抗血管生成信号：促血管生成信号比率高并且将确保FN组合物不会促进CNV(脉络膜新血管形成)或一般的新血管形成。在一些实施方案中，可以对细胞FN组合物进行TGFb(也称为TGFbeta或TGFβ)诱导的肌成纤维细胞分化测定的抑制。在一些实施方案中，可以对细胞FN组合物进行TGFb诱导的肌成纤维细胞分化测定的抑制，以显示FN组合物预防瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物预防瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物预防瘢痕形成性角膜混浊。在一些实施方案中，细胞FN组合物具有较低的血管生成诱导。在一些实施方案中，FN组合物具有降低的血管生成反应。在一些实施方案中，FN组合物具有降低的血管生成能力。在一些实施方案中，FN组合物在支持血管生成的介质存在下损害和/或减少正常血管形成。在一些实施方案中，当FN组合物与未处理的对照相比时，FN组合物具有降低的血管生成能力。在一些实施方案中，与处理成含血清培养基的样品相比，FN组合物具有降低的血管生成能力。在一些实施方案中，FN组合物减弱血管生成反应。在一些实施方案中，FN组合物减少由无血清培养基诱导的血管生成反应。在一些实施方案中，当将分泌蛋白质组加含血清培养基(降低的或无血管生成反应)与含血清培养基(血管生成反应)进行比较时，FN组合物诱导血管生成反应的降低。在一些实施方案中，血管生成反应由基于细胞的测定中的管形成指示。在一些实施方案中，血管生成反应由内皮细胞管形成测定中的管形成指示。

分化/瘢痕形成：

在一些实施方案中，可以评估FN组合物预防分化和预防瘢痕形成的能力。在一些实施方案中，FN组合物预防和/或削弱瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物预防瘢痕形成。在一些实施方案中，与其他标准治疗相比，FN组合物减少瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物预防和/或削弱分化。在一些实施方案中，FN组合物预防和/或削弱肌成纤维细胞分化。在一些实施方案中，FN组合物减少角膜透明度的损失。在一些实施方案中，FN组合物通过预防和/或削弱肌成纤维细胞分化来减少角膜透明度的损失。

在一些实施方案中，可以针对FN组合物调节参与分化的因子的能力来评估FN组合物。在一些实施方案中，可以针对FN组合物调节参与分化的因子的能力来评估FN组合物，所述因子包括但不限于TGFB2、胶原蛋白I、胶原蛋白III(通常在分化期间上调)、TFGB3、MMP-2和MMP-9(通常在分化期间下调)。在一些实施方案中，细胞FN组合物调节选自以下的因子：TGFB2、胶原蛋白I、胶原蛋白III(通常在分化期间上调)、TFGB3、MMP-2和MMP-9(通常在分化期间下调)。在一些实施方案中，FN组合物诱导在正常分化期间上调的因子降低。在一些实施方案中，FN组合物诱导在正常分化期间下调的因子增加。在一些实施方案中，细胞FN组合物诱导因子(例如SMA)的表达降低。在一些实施方案中，FN组合物诱导因子(例如SMA)的表达降低，这指示FN组合物效力。

新血管形成：

在一些实施方案中，可以针对FN组合物预防新血管形成的能力来评估MSC分泌蛋白质组。在一些实施方案中，FN组合物预防、削弱、抑制和/或减少新血管形成。在一些实施方案中，FN组合物抑制或不促进新血管形成。在一些实施方案中，可以针对预防血管生成的能力来评估FN组合物。在一些实施方案中，FN组合物预防、削弱、抑制和/或减少血管生成。在一些实施方案中，FN组合物抑制血管生成。

在一些实施方案中，可以使用消耗测定进一步评估FN组合物。在一些实施方案中，FN组合物可以消耗指定因子。在一些实施方案中，FN组合物可以消耗指定因子，包括例如但不限于TIMP1和/或丝氨酸蛋白酶抑制剂E1。在一些实施方案中，FN组合物可以消耗TIMP1和/或丝氨酸蛋白酶抑制剂E1。在一些实施方案中，FN组合物可以消耗TIMP1。在一些实施方案中，FN组合物可以消耗丝氨酸蛋白酶抑制剂E1。

炎症：

在一些实施方案中，可以针对预防、削弱、抑制和/或减少炎症的能力来评估FN组合物。在一些实施方案中，FN组合物预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，FN组合物抑制炎症。在一些实施方案中，在体外和/或体内表征FN组合物，以确定预防、削弱、抑制和/或减少炎症的能力。在一些实施方案中，FN组合物在体外和/或体内预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，FN组合物在体外预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，FN组合物在体内预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，组织模型可用于表征体外预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，3D组织模型可用于表征体外预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，氮芥(NM)气体燃烧模型可用于评估体外预防、削弱、抑制和/或减少炎症。在一些实施方案中，氮芥(NM)气体燃烧模型可用于评估体外预防、削弱、抑制和/或减少炎症并作为体内条件的替代方案。在一些实施方案中，可以确定响应于使用FN组合物的治疗和/或其施用的细胞因子谱。在一些实施方案中，可以确定特定细胞因子的水平。在一些实施方案中，可以确定IL-8的水平。在一些实施方案中，在用FN组合物处理的组织中IL-8表达水平可以降低。在一些实施方案中，在用FN组合物处理的组织中IL-8表达水平降低，并且这指示预防、削弱、抑制和/或减少炎症。

E.治疗方法

本公开还提供了使用FN组合物(诸如细胞FN组合物)的治疗方法，所述FN组合物任选地包含一种或多种选自由以下各项组成的组的生长因子：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。具体而言，FN组合物可用于治疗眼部疾患。具体而言，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括但不限于眼部疾病。在一些实施方案中，眼部疾病与眼表相关。在一些实施方案中，眼部疾病与受损的眼部组织和/或受损的眼部组织适应症相关。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括加速伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括减少瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括减少炎症。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括减少炎症并因此促进生长。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如减少眼表的炎症。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括减少新血管形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括减少角膜中的新血管形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，包括干眼症治疗(包括例如治疗严重干眼症，包括上皮细胞受损的部位)。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如恢复受损眼部组织的完整性。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如加速受损眼部组织的愈合。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如使受损的眼部神经组织再生。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如视网膜疾患。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如使与PCED相关的受损的眼部神经组织再生。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如PCED。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，诸如眼表炎症性损伤。在一些实施方案中，FN组合物可用于治疗眼部疾患，例如GvHD和/或干燥综合征(Sjogrens syndrome)。

在一些实施方案中，眼部疾患选自由以下各项组成的组：视网膜疾患、慢性移植物抗宿主病(GvHD)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson Syndrome)、眼粘膜类天疱疮、持续性角膜上皮缺陷(PCED)、干眼症、眼部神经组织损伤和眼睛震荡性损伤(诸如震荡性损伤、眼挫伤或化学烧伤)。

在一些实施方案中，FN组合物可用于加速伤口愈合。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少瘢痕形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少炎症。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少炎症并因此促进生长。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少眼表的炎症。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少新血管形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于减少角膜中的新血管形成。在一些实施方案中，FN组合物可用于保护和修复视网膜上皮细胞和视网膜神经节细胞。在一些实施方案中，FN组合物可用于诱导小梁网再生并降低眼内压。

在一些实施方案中，施用FN组合物以治疗眼部疾病。在一些实施方案中，治疗包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的FN组合物。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便促进或诱导眼部伤口愈合。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便减少和/或抑制新血管形成，减少和/或抑制瘢痕形成，促进和/或保持视力，和/或增加伤口闭合率(例如，减少伤口闭合时间)。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便预防、减少和/或抑制新血管形成。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便预防、减少和/或抑制减少瘢痕形成。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便促进和/或保持视力。在一些实施方案中，施用FN组合物以促进和/或诱导伤口闭合更快的伤口闭合(例如，减少伤口闭合所需的时间量)。在一些实施方案中，FN组合物预防、减少和/或抑制或不促进新血管形成和减少瘢痕形成，以便促进视力保持。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便预防、减少和/或抑制新血管形成和减少瘢痕形成以促进视力保持。在一些实施方案中，FN组合物预防、减少和/或抑制炎症。在一些实施方案中，向有需要的患者施用FN组合物以便预防、减少和/或抑制炎症。

在一些实施方案中，施用FN组合物以治疗眼部结构创伤性损伤后的视觉功能障碍。在一些实施方案中，治疗包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的FN组合物

在一些实施方案中，施用FN组合物以治疗震荡性损伤后视神经变性的创伤性损伤。在一些实施方案中，眼睛震荡性损伤选自眼挫伤和眼睛钝性损伤。在一些实施方案中，施用FN组合物以治疗视神经的创伤性损伤。在一些实施方案中，治疗包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的FN组合物。

在一些实施方案中，施用FN组合物以改善眼睛震荡性损伤后的视神经变性。在一些实施方案中，用于改善视神经变性的方法包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的FN组合物。在一些实施方案中，眼睛震荡性损伤选自眼挫伤和眼睛钝性损伤。在一些实施方案中，眼睛震荡性损伤是眼挫伤。在一些实施方案中，眼睛震荡性损伤是眼睛钝性损伤。

功效读数可以包括症状的减轻和/或疾病状态的减轻，包括例如生活质量提高。在一些实施方案中，症状减少和/或疾病状态减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％指示治疗功效。在一些实施方案中，炎症减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％指示治疗功效。在一些实施方案中，瘢痕形成减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％指示治疗功效。在一些实施方案中，新血管形成减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％指示治疗功效。

在一些实施方案中，疾病或疾患是眼部疾病或眼部疾患。在一些实施方案中，疾病或疾患是眼部结构创伤性损伤后的视觉功能障碍。在一些实施方案中，疾病或疾患是眼睛震荡性(例如，钝性或非钝性)损伤。在一些实施方案中，疾病或疾患是烧伤，包括对眼睛的化学烧伤。

在一些实施方案中，将FN组合物施用于特定靶向区域。在一些实施方案中，特定靶向区域是眼睛。在一些实施方案中，将FN组合物施用于特定靶向区域并且配制为不扩散到其他周围区域。

在一些实施方案中，将FN组合物施用于特定靶向区域并且配制为不扩散到其他周围区域。

在一些实施方案中，将FN组合物施用于特定靶向区域并配制成在靶向区域内停留至少1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟、至少约60分钟、至少约70分钟、至少约80分钟、至少约90分钟或至少约2小时。

在一些实施方案中，在受伤或损伤之后立即将FN组合物施用于受影响的区域。在一些实施方案中，将FN组合物在15秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时或96小时内施用于受影响区域。

在一些实施方案中，FN组合物局部施用。在一些实施方案中，细胞FN组合物通过结膜下注射施用。在一些实施方案中，当施用于有需要的受试者时，FN组合物表现出超功效。在一些实施方案中，FN组合物每天局部施用一次、两次、三次、四次、五次和/或最多六次。在一些实施方案中，FN组合物允许每天一滴或一次施用具有治疗功效。在一些实施方案中，施用一滴，每天施用1、2、3、4、5或6次。在一些实施方案中，以1小时、2小时、3小时或4小时间隔施用一滴。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少一次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少两次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少3次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少4次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少5次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在一些实施方案中，施用一滴，每天至少6次，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含低水平的VEGF。在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含1pg/mL-400pg/mL的VEGF。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物具有约4.7至约7.5的pH。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物在选自以下的缓冲系统中配制：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和柠檬酸/磷酸氢二钠。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含张力调节剂。在一些实施方案中，张力调节剂选自NaCl、KCl、甘露醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇和甘油。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、甘露醇和海藻糖，并且其中组合物具有约pH 7.4的pH。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含二价阳离子。在一些实施方案中，二价阳离子选自Mg2+、Ca2+和Zn2+。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含磷酸氢二钠/柠檬酸、甘露醇和海藻糖，并且其中组合物具有约pH 6.4的pH。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物还包含粘合剂。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物不包含一种或多种选自由以下各项组成的组的组分：异生物质组分；酚红；<3kDa的肽和生物分子；抗生素；>200nm的蛋白质聚集体；细胞；非外来体/非细胞外囊泡细胞碎片；激素；和L-谷氨酰胺。

在一些实施方案中，用于治疗方法的FN组合物包含抗血管生成因子或抗瘢痕形成因子。

F.试剂盒

试剂盒可包括如本文所公开的容器中的FN组合物或也在容器中的用于制备FN组合物的条件培养基以及使用说明书。此外，试剂盒可包括用于混合以制备用于眼部治疗的溶液的组分以及混合和使用说明书。

容器可包括至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，容器中的FN组合物或用于制备FN组合物的条件培养基放入其中，并且在一些情况下，适当分装。在提供附加组分的情况下，试剂盒可包括可放置该组分的附加容器。此类容器可以包括注射或吹塑塑料容器，所需小瓶保持在其中。容器和/或试剂盒可以包括具有使用说明和/或警告的标签。

本公开通过以下实施例进一步说明，其不应被解释为进一步限制。在整个本申请中引用的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容以引用方式明确并入本文。

本发明可提供包含一组用于表征MSC分泌蛋白质组的测试和/或测定的试剂盒，其中所述组包括至少两种表征测定，其中表征测定选自物理组分表征、氧化应激测定、安全性分析、稳定性测定、增殖测定、迁移测定、新血管形成测定、分化/瘢痕形成测定、炎症测定和/或上皮屏障完整性测定。在一些实施方案中，所述一组测试和/或测定鉴定如本文所述的MSC分泌蛋白质组。

本发明可提供包含一组用于确定FN批次之间的一致性的测试和/或测定的试剂盒，其中所述组包括一种或多种表征测定，其中表征测定选自物理组分表征、氧化应激测定、安全性分析、稳定性测定、增殖分析、迁移测定、新血管形成测定、分化/瘢痕形成测定、炎症测定和/或上皮屏障完整性测定。在一些实施方案中，所述一组测试和/或测定鉴定如本文所述的细胞FN组合物。

实施例

实施例1：纤连蛋白表征

MSC分泌蛋白质组MSC分泌蛋白质组中的FN最初通过质谱来鉴定，随后通过ELISA 来定量

在条件培养基(即，直接收获细胞的培养基)中检测到FN的浓度为约0.5-50ng/mL。

基于细胞的体外测定的结果显示：

FN的消耗显著损害伤口闭合(划痕伤口测定)

MSC分泌蛋白组的添加促进HCEC的粘附和扩散；FN的消耗损害HCEC的粘附和扩散；外源FN的添加促进HCEC的粘附和扩散

外源纤连蛋白的添加促进HCEC跨孔迁移；FN的消耗损害HCEC跨孔迁移

纤连蛋白刺激人角膜上皮细胞迁移。

相对于阴性对照(无血清培养基)，在36小时后外源重组人纤连蛋白(1ug/mL)的添加刺激细胞通过跨孔膜的显著迁移。所示为用龙胆紫染色的跨孔迁移插入物的底侧(图2)。

纤连蛋白的消耗损害人角膜上皮细胞的迁移。

在跨孔迁移测定中，纤连蛋白免疫消耗的MSC分泌蛋白质组显示出相对于单独的MSC分泌蛋白质组的迁移受损。所示为用龙胆紫染色的跨孔迁移插入物的底侧(图3)。

纤连蛋白的消耗损害人角膜上皮细胞体外伤口闭合。

在跨孔迁移测定中，纤连蛋白免疫消耗的MSC分泌蛋白质组显示出相对于单独的MSC分泌蛋白质组的细胞向伤口间隙的迁移受损。在24小时后，MSC分泌蛋白质组处理的细胞显示出30％±1.2％的闭合率，相比之下，FN消耗的MSC分泌蛋白质组处理的伤口的闭合率为16％±1.9％(图4)。

实施例2：纤连蛋白结合至生长因子

使用抗纤连蛋白捕获抗体从MSC分泌蛋白质组中免疫消耗纤连蛋白，并且使用蛋 白G缀合的磁珠进行下拉

通过ELISA来测定溶液中的级分以及珠粒级分的HGF。将珠粒用PBS洗涤三次，并重悬于100uL PBS中，然后在80℃处加热10分钟。然后对样品进行稀释，使用重组HGF通过ELISA进行测量，以生成标准曲线，HGF测定结果参见图5，单位为pg/mL。

实施例3：MSC分泌蛋白质组含有细胞纤连蛋白

使用免疫学测定对MSC分泌蛋白质组进行分析。结果表明，MSC分泌蛋白组含有细胞纤连蛋白，如通过EDA+和EDB+纤连蛋白剪接变体的检测所证明。

分泌蛋白组中的纤连蛋白的表征

将从MSC分离的分泌蛋白质组通过免疫印迹使用对EDA序列、EDB+纤连蛋白和普通纤连蛋白(FN)具有特异性的抗体来评估。抗EDA和抗EDB抗体均与纤连蛋白发生交叉反应，表明分泌蛋白质组中存在的物质是细胞纤连蛋白(图6)。

使用夹心ELISA进行的细胞EDA+纤连蛋白的检测

使用重组细胞纤连蛋白和对EDA序列具有特异性的捕获抗体来建立EDA+纤连蛋白的ELISA标准曲线(空心圆圈)。用于产生标准曲线的重组纤连蛋白含有用作产生抗EDA抗体的免疫原的EDA序列。在EDA夹心ELISA中对MSC分泌蛋白质组进行测定，并且很容易检测到细胞纤连蛋白(蓝点)(图7)。

Claims (34)

1.一种组合物，其包含纤连蛋白(FN)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述FN是间充质干细胞(MSC)来源的FN。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述FN是MSC分泌的FN。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述FN是细胞FN。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述细胞FN是细胞来源的FN，并且其中FN非共价连接至一种或多种生长因子。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述细胞FN是EDA+和/或EDB+。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述FN从条件培养基获得。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述条件培养基从间充质干细胞(MSC)获得。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含MSC分泌蛋白质组。

10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述MSC来源于骨髓。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种生长因子，所述生长因子选自由以下各项组成的组：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述FN非共价连接至一种或多种生长因子，所述生长因子选自由以下各项组成的组：FGF(诸如FGF-2)、PDGF、HGF、VEGF、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1、IGF-2、NGF、神经营养蛋白和EGF。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述FN的浓度为约0.5-50ng/mL。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述FN的浓度为约25ng/mL。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少约0.1ng/mL PDGF。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中组合物还包含约0.3-4.5ng/mLHGF。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中组合物还包含约1pg/mL-400pg/mL VEGF。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其还包含张力调节剂。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述张力调节剂选自由以下各项组成的组：NaCl、KCl、甘露醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇和甘油。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：0.5-50ng/mlFN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、10-12mg/ml磷酸氢二钠、11-13mg/ml甘露醇、2-25mg/ml海藻糖二水合物和0.5-2mg/ml羟丙甲纤维素。

21.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：0.5-50ng/mlFN、2.28mg/ml磷酸二氢钠、11.45mg/ml磷酸氢二钠、12.2mg/ml甘露醇、24mg/ml海藻糖二水合物和1mg/ml羟丙甲纤维素。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：0.5-50ng/mlFN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、4.5-7mg/ml磷酸氢二钠、5.5-7.5mg/ml甘露醇、11-13mg/ml海藻糖二水合物和0.1-1.5mg/ml羟丙甲纤维素。在一些实施方案中，所述FN组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

23.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：0.5-50ng/mlFN、1.31mg/ml磷酸二氢钠、5.73mg/ml磷酸氢二钠、6.1mg/ml甘露醇、12mg/ml海藻糖二水合物和0.5mg/ml羟丙甲纤维素。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含NaCl和/或MgCl₂。

25.一种治疗有需要的受试者的眼部疾患的方法，其包括向所述受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述眼部疾患选自由以下各项组成的组：视网膜疾患、慢性移植物抗宿主病(GvHD)、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼粘膜类天疱疮、持续性角膜上皮缺陷(PCED)、干眼症、眼部神经组织损伤和眼睛震荡性损伤(诸如震荡性损伤、眼挫伤或化学烧伤)。

27.权利要求1至26中任一项所述的组合物用于根据权利要求21或22所述的方法治疗有需要的受试者的眼部疾患的用途。

28.一种制备权利要求1至27中任一项所述的组合物的方法，其包括：

(a)在细胞培养基中培养干细胞，从而产生包含由所述干细胞分泌的因子的条件培养基；

(b)收获所述条件培养基，从而产生收获的条件培养基；以及

(c)过滤收获的条件培养基，以产生加工的条件培养基。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括浓缩所述加工的条件培养基。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中使所述加工的条件培养基进一步经受与配制缓冲液的缓冲液交换。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述配制缓冲液包含以下中的一者或多者：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、柠檬酸钠/柠檬酸、硼酸/柠檬酸钠、硼酸/四硼酸钠和柠檬酸/磷酸氢二钠。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。

33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不含血清。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前的所述方法还包括：

(i)在生长培养基中培养所述干细胞；以及

(ii)用步骤(a)的所述细胞培养基来更换所述生长培养基。