KR20240070501A - 세포 피브로넥틴 조성물의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

세포 피브로넥틴 조성물의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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스펜서 알포드
오드리 스미스
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컴반지오, 인크.
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Abstract

본 출원은 피브로넥틴 조성물을 제조하고 사용하는 방법 및 공정뿐만 아니라, 본원에 기재된 세포 피브로넥틴 조성물로 안구 병태 및/또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

세포 피브로넥틴 조성물의 제조 및 사용 방법
관련 출원의 교차상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 20210년 74월 27일에 제출된 미국 가출원 제63/217,952호 및 2021년 8월 20일에 제출된 미국 가출원 제63/235,605호63/006,680에 대한 우선권을 주장하고, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.
눈에 대한 모세포폭풍 손상 및과 무딘 손상(blast and blunt injuries)은 망막 부종, 외상성 백내장, 렌즈에 대한 띠 부착의 파열, 각도 후전, 홍채 투석 및 동공 괄약근 파열을 포함하여 안구 내용물에 대한 일련의 기계적 파열을 유발할 수 있다. 이러한 손상의 치료는 홍채의 기계적 복구(가능한 경우), 플라스틱 렌즈 임플란트로 수정체의 교체 및 망막 박리의 복구로 제한되어 왔다. 망막 또는 전방 챔버의 세포성 구조를 복구하는 치료법은 없었다. 더욱이, 외상성 시신경병증 및 시신경 이탈은 이라크 자유작전 기간에 안과 전문의 치료가 필요하였던 6가지 주요 안구 손상 유형에 있다 (Cho and및 Savitsky, "Ocular Trauma Chapter 7", in Combat Casualty Care: Lessons learned from Oef and및 Oif, by Brian Eastbridge and및 Eric Savitsky, pp. 299-342, Ft. Detrick, Md.: Borden Institute (US) Government Printing Office, 2012, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨). 외상성 두부 손상의 60%는 신경안과적 이상을 야기하고(Van Stavern, et al., J. Neuro-Ophthamol 21(2): 112-117, 2001, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨), 이들 중 절반은 눈 신경 또는 시각 경로가 관여한다. 뉴런에 대한 외상성 손상은 축삭 손상 및 영구적인 결함을 유발하는 비-가역적 뉴런 소실을 가져온다. 다수의 잠재적인 신경보호 요법이 동물에서 확인되었던 한편, 이들의 단일 제제는 일반적으로 인간 임상 테스트에서 요법으로 개발하는 데 실패하였다(Turner, et al., J. Neurosurg 118(5): 1072-1085, 2013, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨). 여러 세포성 표적에 영향을 미치는 조합 요법이 신경 손상을 예방하는 데 필요할 수 있다.
각막은 눈의 최외부 조직으로서 보호 역할을 하지만, 중증 손상 및 질환에 매우 취약하다. 혈관이 없기 때문에 투명할 수 있지만 치유 능력도 제한된다. 비가역적인 실명을 유발할 잠재력으로 인해 각막 손상은 즉각적 개입과 적극적 치료를 요구한다. 구체적으로, 개선된 안구 표면 치유 요법의 결정적인 필요성은 화학적 화상의 경우 및 여러 각막 질환, 예컨대 급성 만성 이식편대숙주병(GvHD), 스티븐스-존슨 증후군, 안점막 천포창 및 연구적인 각막 상피 결함을 유발하는 기타 병태에서 분명하고, 이는 종합적으로 연간 100,000건 이상의 발병을 포함한다. (Dietrich-Ntoukas et al. Cornea. 2012, 31(3): 299-310; Stevenson W, et al., Clin Ophthalmol. 2013, 7: 2153-2158. White KD, et al., J. Allergy Clin Immunol Pract. 2018, 6(1): 38-69; Tauber J. (2002) Autoimmune Diseases Affecting the Ocular Surface. In: Ocular Surface Disease Medical and및 Surgical Management. Springer, New York, NY.; Wirostko B, et al., Ocul Surf. 2015 7월, 13(3): 204-21; 및 Haring, RS. et al., JAMA Ophthalmol. 2016 10월 1일, 134(10): 1119-1124).
더욱이, 국소 안과용 약물 개발은 종종 더 깊은 안구 조직에 도달하는 5% 미만의 국소 투여 용량과 함께 눈물 회전율 및 희석, 코 눈물 배출 및 반사 깜박임을 포함하여 많은 해부학적 제약으로 인해 방해를 받는다(Gaudana et al., 2009). 각막 상처의 경우, 초기 손상은 각막 상피에 균열을 일으키고, 이로써 국소적으로 적용된 MSC-S가 상피층을 관통할 수 있게 한다.
따라서, 눈을 표적으로 하여 외상(예를 들어, 화상, 급성 염증, 연령 및/또는 산화적 스트레스)에 대한 이차적 염증으로 인해 퇴화될 수 있는 도달하기 어려운 감각 조직으로 치료 페이로드를 전달할 수 있는 안구 요법에 대한 당업계의 절실한 요구가 있다.
본 발명은 이러한 치료에 사용하기 위한 피브로넥틴, 선택적으로 피브로넥틴(FN)에 비공유적으로 부착된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 그러한 조성물의 제조 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족한다.
일부 구현예에서, FN은 MSC 유래 FN이다.
일부 구현예에서, FN은 MSC 분비 FN이다.
일부 구현예에서, FN은 세포 FN이다.
일부 구현예에서, 세포 FN은 세포 유래 FN이고, 여기서 FN은 하나 이상의 성장 인자에 비공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+및/또는 EDB이다.
일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 조건화 배지(conditioned medium)로부터 획득된다.
일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 중간엽 줄기세포(MSC)에 의해 분비된다.
일부 구현예에서, 조건화 배지는 MSC의 배양물로부터 획득된다.
일부 구현예에서, 조성물은 세크레톰을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC는 골수로부터 유래한다. 일부 구현예에서, MSC는 건강한 인간 기증자로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 조성물은 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀, EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자에 결합된다.
일부 구현예에서, 조성물 중 세포 피브로넥틴은 약 0.5~50 ng/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물 중 세포 피브로넥틴은 약 25 ng/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 0.1 ng/mL의 PDGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.3~4.5 ng/mL HGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 1 pg/mL ~ 400 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 긴장성 개질제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 긴장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 10~12 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 11~13 mg/mL 만니톨, 2~25 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5~2 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 11.45 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 12.2 mg/mL 만니톨, 24 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 1 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 4.5~7 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 5.5~7.5 mg/mL 만니톨, 11~13 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.1~1.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 5.73 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 6.1 mg/mL 만니톨, 12 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원의 개시는 본원에 제공된 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체의 안구 병태의 치료 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 안구 병태는 망막 병태, 만성 이식편대숙주병(GvHD), 스티븐스-존슨 증후군, 안점막 유천포창, 지속성 각막 상피 결손(PCED), 안구 건조증, 안구 신경 조직 손상 및 눈의 진탕 손상(예: 진탕 손상, 안구 타박상 또는 화학적 화상)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원의 개시는 본원에 개시된 방법에 따라 치료가 필요한 대상체의 안구 병태를 치료하기 위한 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원의 개시는 하기를 포함하는 FN 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 줄기세포를 세포 배양 배지에서 배양하여, 줄기에서 분비되는 인자를 포함하는 조건화 배지를 생성하는 단계;
(b) 조건화 배지를 수확하여 수확된 조건화 배지를 생성하는 단계; 및
(c) 수확된 조건화 배지를 여과하여 처리된 조건화 배지를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 처리된 조건화 배지를 농축하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 처리된 조건화 배지는 완충용액(formulation buffer)으로 완충액 교환을 추가로 거친다.
일부 구현예에서, 제제화 완충액은 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및 구연산/인산이나트륨 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이다.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 무혈청이다.
일부 구현예에서, 단계 (a) 이전에 제조하는 방법은 하기를 추가로 포함한다:
(i) 줄기세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
(ii) 성장 배지를 단계 (a)의 세포 배양 배지로 교체하는 단계.
도 1은 피브로넥틴의 제조, 처리 및 사용 구현예의 개략도를 나타낸다.
도 2는 피브로넥틴이 인간 각막 상피 세포 이동을 자극하는 것을 나타낸다.
도 3은 피브로넥틴이 고갈되면(depletion) 인간 각막 상피 세포의 이동이 손상되는 것을 나타낸다.
도 4는 피브로넥틴이 고갈되면 시험관내 상처 봉합에서 인간 각막 상피 세포가 손상되는 것을 나타낸다.
도 5는 면역침전된 피브로넥틴이 결합된 HGF를 함유한다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도 6은 세크레톰 내 피브로넥틴의 특성화를 나타낸다. MSC에서 분리된 세크레톰은 EDA 서열, EDB+ 피브로넥틴 및 일반 피브로넥틴(FN)에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯팅을 통해 평가되었다. 항-EDA 및 항-EDB 항체는 둘 다 피브로넥틴과 교차반응하여 세크레톰에 존재하는 종이 세포 피브로넥틴임을 나타낸다.
도 7은 샌드위치 ELISA를 사용한 세포 EDA+ 피브로넥틴의 검출을 나타낸다. EDA+ 피브로넥틴에 대한 ELISA 표준 곡선(빈 원)은 재조합 세포 피브로넥틴과 EDA 서열에 특이적인 포획 항체를 사용하여 확립되었다. 표준 곡선을 생성하는 데 사용된 재조합 피브로넥틴에는 항-EDA 항체를 생성하기 위해 면역원으로 사용된 EDA 서열이 포함되어 있다. MSC 세크레톰은 EDA 샌드위치 ELISA에서 검정되었으며 세포 피브로넥틴은 쉽게 검출되었다(파란색 점).
I. 서론
피브로넥틴(FN)은 약 5%의 탄수화물을 함유한 거대 당단백질이다. 혈장 피브로넥틴의 특징적인 형태는 440,000 달톤의 이황화물 결합 이량체이며, 각 하위 단위의 분자량은 약 220,000 달톤이다. 일반적으로 혈장에서 약 300 μg/mL의 농도로 발견되는 피브로넥틴은 [Hynes, R. O., Methods for identification of fibronectin (chap. 2, page 12), IN: Fibronectins New-York: Springer-Verlag, 1990]에서 설명한 방법을 사용하여 추출 및 정제된다. 혈장 피브로넥틴은 저온 불용성 글로불린, 항-젤라틴 인자, 세포 부착 단백질, 세포 확산 인자 및 옵소닉 α2-표면 결합 당단백질을 비롯한 다양한 다른 이름으로도 알려져 있다. 이러한 이름들은 세포 모집, 미립자 잔해의 옵소닌화, 상처 수축 촉진과 같은 피브로넥틴의 생물학적 활동을 반영한다. 피브로넥틴의 구조와 활동에 대한 설명은 하기에서 찾을 수 있다: Hynes, R. O., Methods for identification of fibronectin (chap. 2, page 12), IN: Fibronectins New-York: Springer-Verlag, 1990. and Hynes, R.O., Methods for identification of fibronectin (chap. 2, pages 7-23) 및 Wound healing, inflammation, and fibrosis (chap. 14, pages 349-64), IN: Fibronectins New- York: Springer-Verlag, 1990. 3, and Brotchie, H., Wakefield, D. Australas J Dermatol 1990; 31:47-56(모두 본원에 참고로 포함됨).
상처 치유는 일반적으로 염증기, 증식기, 재구성기(remodeling phase)의 세 단계로 나누어진다. 피브로넥틴은 특히 침입한 세포가 부착될 수 있는 지지체를 생성함으로써 상처 치유 과정의 각 단계에 관여하는 것으로 보고되었다. 처음에는 피브로넥틴 및 피브리노겐과 같은 많은 매개체가 상처 부위로 방출된다. 피브로넥틴은 염증 세포가 상처로 이동하고 단핵구에 의한 잔해 식균 작용을 촉진한다. 그 후, 혈관신생과 재상피화가 일어난다. 이 단계에서 피브로넥틴은 내피 세포에 화학주성 활성을 발휘하고 상피 세포와 섬유아세포가 기저막으로 이동하는 것을 촉진한다.
피브로넥틴은 또한 콜라겐 원섬유의 조직에서 중요한 역할을 하는 재구성기의 필수 구성요소인 것으로 보인다. 원섬유형 콜라겐은 궁극적으로 조직의 인장 강도를 크게 향상시켜 상처를 봉합하는 섬유 다발을 형성한다. 혈장 피브로넥틴은 각막 상처, 다리 궤양 등의 상처 치유 속도를 높이는 데 유용한 것으로 보고되었다.
피브로넥틴에는 혈장 피브로넥틴과 세포 피브로넥틴의 두 가지 형태가 있다. 혈장 피브로넥틴은 간세포에서 합성되어 혈장으로 분비되는 반면, 세포 피브로넥틴은 섬유아세포, 내피세포, 줄기세포, 근세포 및 연골세포와 같은 많은 세포 유형에 의해 생성된다.
상처 치유에서, 혈장 피브로넥틴은 생체내에서 상처를 입은 후 상처에 현저하게 축적되는 것으로 보고되었으며, 이는 혈소판, 섬유아세포 및 내피 세포의 부착, 이동 및 응집과 같은 다양한 기능에 중요하며, 이는 혈장 피브로넥틴이 생체내 상처 회복을 가속화하는 데 적합한 기질 역할을 할 가능성이 높음을 나타낸다. 실제로 동물 모델에서 혈장 피브로넥틴을 함유한 임시 매트릭스는 재상피화 과정에서 표피 세포 접착과 이동을 크게 지원하여 인간 상처 치유 및 조직 회복에서 혈장 피브로넥틴의 임상적 잠재력을 보여준다.
광범위한 물리적 및 면역학적 유사성에도 불구하고, 두 부류의 피브로넥틴은 전기영동 거동, 용해도 및 생물학적 활성이 다르다. Tamkun et al., J. Biol. Chem. 258(7):4641-47 (1983); Yamada et al., J. Cell Biol. 80:492-98 (1979); Yamada et al. Biochemistry 16(25):2552-59 (1977).
더욱이, 혈장과 세포 피브로넥틴 사이의 주요한 구조적 차이는 펩타이드 매핑을 통해 발견되었다. Hayashi et al. J. Biol. Chem. 256(21): 11,292-11,300 (1981), and immunologic techniques, Atherton et al. Cell 25:133-41 (1981). 최근 인간 섬유아세포와 두 인간 종양 세포주의 mRNA에서 정확히 하나의 90개 아미노산 유형 III 구조 반복을 암호화하는 차이 영역이 확인되었지만, 인간 간 mRNA에서는 검출할 수 없었다. Kornblihtt et al. EMBO J. 4(7):1755-59 (1985); Kornblihtt et al., EMBO J. 3(1):221-26 (1984); Kornblihtt et al., Nucleic Acids Res. 12(14):5853-68 (1984). 혈장 피브로넥틴은 간세포에 의해 합성되기 때문에 추가 유형 III 반복은 세포 피브로넥틴의 독특한 도메인일 가능성이 높다. Schwarzbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:1424-28 (1985); Kornblihtt et al., EMBO J. 3(1):221-26 (1984); Kornblihtt et al., Nucleic Acids Res. 12(14):5853-68 (1984). 혈장 피브로넥틴과 세포 피브로넥틴 사이의 차이점에 대한 추가 논의는 [W.S., et al., Fibresis Tissue Repair 4, 21 (2011)]에 제공되어 있다.
세포 피브로넥틴은 순환 혈장 피브로넥틴 풀에 없는 피브로넥틴 스플라이스 변이체를 특징으로 한다. 이러한 대체 스플라이스 변이체는 EIIIA 및 EIIIB(또는 EDA 및 EDB)라고 불리는 추가 도메인(유형 III 도메인)을 포함하는 피브로넥틴 서열을 렌더링한다. White et al. The Journal of pathology. vol. 216(1): 1-14 (2008); White 및 Muro, IUBMB Life, 63: 538-546 (2011). 따라서 일부 구현예에서 세포 피브로넥틴은 EDA+ 및/또는 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 EDA+, EDB+ 및/또는 V+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 EDA+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 V+이다. 유형 III 도메인 중 하나 또는 둘 다 통합될 수 있다. 세포 피브로넥틴은 이러한 이소형의 혼합물일 수 있다.
상처 치유를 촉진하는 피브로넥틴의 치료 적용에 대한 엄청난 관심에도 불구하고, 현재까지의 임상 연구는 혈장 피브로넥틴에 초점을 맞춰 왔다. 세포 피브로넥틴에 대한 임상 연구는 지금까지 보고된 바 없으며, 혈장 피브로넥틴에 대한 임상 연구는 안구 질환 환자들 사이에서 일관성 없는 결과를 보여주었다. 예를 들어, McCulley JP. 등은 지속적인 각막 상피 결함이 있는 환자가 실망스럽게도 혈장 피브로넥틴 치료에 반응하지 못했다고 보고했다. McCulley JP, Horowitz B, Husseini ZM, Horowitz M. Trans Am Ophthalmol Soc. 1993; 91:367-86; discussion 386-90.
점점 더 많은 연구에서 성장 인자가 다양한 부위에서 FN에 결합할 수 있음을 보여준다. 따라서, FN은 생리적 미세 환경에서 국소 농도를 늘리기 위해 성장 인자를 유지하는 효과적인 저장고 역할을 할 수 있다. 예를 들어, HGF는 HGF 수용체와 인테그린 및 FN과 결합하여 세포 이동을 촉진하는 다량체 복합체로 조립되는 것으로 보고되었다. Rahman, Salman et al., BMC cell biology vol. 6,1 8. 17 Feb. 2005. FN은 또한 C-말단 헤파린-II 도메인(FN III)을 통해 PDGF/VEGF 및 FGF 계열의 다양한 성장 인자와 변환 성장 인자-β(TGF-β) 및 뉴로트로핀 계열의 일부 성장 인자에 결합한다. FN에 의해 격리된 성장 인자는 국부적이고 장기간 지속되며 강화된 GF 활성을 갖는 것으로 추정되지만, 내인성 생화학적 및 생물물리학적 특성을 유지하는 재조합 FN 및 성장 인자를 사용한 재조합 병용 요법의 개발은 여전히 어려운 과제로 남아 있다.
A. 정의
청구범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에 기재된 바와 같이 정의된다. 모체 가특허 출원에 사용된 용어와 서로 모순되는 경우, 본 명세서에 사용된 용어가 우선한다.
본원에 사용된 "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 물질을 말하고, 따라서 자연 상태에서 "사람의 손에 의해" 변경된다.
본원에 사용된 "강화된"은 원치 않는 물질을 제거하거나, 혼합물로부터 원하는 물질을 선택 및 분리함으로써 선택적으로 하나 이상의 물질을 농축하거나, 이의 양을 증가시키는 것을 의미한다(예: 집단 내 세포 모두가 마커를 발현하지는 않는 이종유래 세포 집단으로부터 특이적 세포 마커가 있는 세포를 분리함).
본원에 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 특정한 마커 또는 마커의 조합에 대해 실질적으로 균질한 세포 집단을 의미한다. 실질적으로 균질함은 특정한 마커 또는 마커의 조합에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 95% 균질함을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "다능성 줄기세포"는 진정한 줄기세포이지만, 제한된 수의 유형으로만 분화할 수 있다. 예를 들어, 골수는 혈액의 모든 세포를 생성하지만 다른 세포 유형으로 분화할 수 없는 다능성 줄기세포를 포함한다.
본원에 기재된 특정 조성물, 성장 조건, 배양 배지 등을 언급할 때, 용어 "동물이 없는"은 소 혈청, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 비타민 등과 같은 비-인간 동물 유래의 물질이 특정 조성 또는 공정의 제조, 성장, 배양, 증식, 보관 또는 제형화에 사용되지 않는 것을 의미한다. "비-인간 동물 유래의 물질이 없음"은 물질이 비-인간 동물의 신체 또는 물질과 접촉하거나 접촉한 적이 없어 이종-오염되지 않은 것을 의미한다. 일반적으로, 재조합으로 생산된 인간 단백질과 같은 임상 등급 물질은 이러한 조성물 및/또는 공정의 제조, 성장, 배양, 증식, 보관 및/또는 제형화에 사용된다.
세포 조성물과 관련하여 용어 "증식된(expanded)"은 세포 집단이 이전의 방법을 사용하여 획득된 것보다 유의하게 더 높은 농도의 세포를 구성하는 것을 의미한다. 예를 들어, AMP 세포의 증식된 조성물에서 양막 조직 그램당 세포 수준은 이전의 방법을 사용하여 이러한 세포의 약 20배 증가와 비교하여, 5회 계대 이후 일차 배양물의 세포 수보다 적어도 50배 및 최대 150배 더 높다. 또 다른 예에서, AMP 세포의 증식된 조성물에서 양막 조직 그램당 세포 수준은 3회 계대 이후 일차 배양물의 세포 수보다 적어도 30배 및 최대 100배 더 높다. 따라서 "증식된" 집단은 이전의 방법과 비교하여 양막 조직 그램당 세포 수가 적어도 2배 및 최대 10배 개선된다. 용어 "증식된"은 사람이 세포 수를 늘리기 위해 개입한 상황만 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "조건화 배지(conditioned medium)"는 특이적 세포 또는 세포 집단이 배양된 다음 제거된 배지이다. 세포가 배지에서 배양될 때, 이들은 다른 세포의 행동에 지원을 제공하거나, 영향을 줄 수 있는 세포성 인자를 분비할 수 있다. 이러한 인자는 호르몬, 사이토카인, 세포외 기질 (ECM), 단백질, 소포, 항체, 케모카인, 수용체, 저해제 및 과립을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포성 인자를 포함하는 배지는 조건화 배지이다. 조건화 배지를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 US 6,372,494에 기술되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본원에 사용된 조건화 배지는 또한 조건화 배지 또는 예를 들어 MSC 세포로부터 회수 및/또는 정제되는 단백질과 같은 성분을 말한다.
본원에 사용된 용어 "중간엽 줄기세포 조성물" 또는 "MSC 조성물"은 MSC로부터 유래하고, 일부 경우에 추가의 처리를 거친 조건화 배지를 의미한다. 일부 구현예에서, "MSC 세크레톰"은 MSC로부터 유래한 미정제 조건화 배지를 말할 수 있다. 일부 구현예에서, "MSC 세크레톰"은 본원에 기재된 바와 같이 추가의 처리를 거친 이후 미정제 조건화 배지로부터 획득된 조성물을 말할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "현탁액"은 분산된 성분, 예로 사이토카인을 포함하는 액체를 의미한다. 분산된 성분은 액체에 완전히 용해되거나, 부분적으로 용해되거나, 현탁되거나, 달리 분산될 수 있다. 적합한 액체는 물, 염 및/또는 당 용액과 같은 삼투 용액, 세포 배양 배지 및 기타 수용성 또는 비-수용성 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것, 뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시 프롤린, у-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산, 예로 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α 탄소와 동일한 기본 화학적 구조를 갖는 화합물, 예를 들어 호모 세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예: 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학적 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 말한다. 아미노산은 본원에서 공통적으로 공지된 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회가 권장하는 1개 문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 공통적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"아미노산 치환"은 선결정된 아미노산 서열(출발 폴리펩티드의 아미노산 서열)에서 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기를 제 2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다. "아미노산 삽입"은 적어도 하나의 추가적인 아미노산을 선결정된 아미노산 서열 내에 혼입하는 것을 의미한다. 삽입이 보통 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어지지만, 현재의 더 큰 "펩티드 삽입"은 예로 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 최대 약 10개, 15개 또는 20개 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상기 개시된 바와 같이 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. "아미노산 결실"은 선결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기의 제거를 말한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 말하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
"핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 말한다. 달리 상세하게 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예: 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 의미상 포괄한다. 상세하게, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., Biol. Chem. 260: 2605-2608, 1985; 및 Cassol et al, 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98, 1994). 아르기닌과 류신의 경우, 두 번째 염기에서의 변형도 보존적일 수 있다. 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 인코딩된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 안정성을 위해 또는 다른 이유로 하나 이상의 변형된 염기 또는 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특별한 염기를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 이루어질 수 있고, 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세크레톰 조성물"은 세포에서 분비되는 하나 이상의 물질을 포함하는 조성물을 말한다. 특정 구현예에서, 세크레톰 조성물은 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 엑소좀 및/또는 하나 이상의 미세소포를 포함할 수 있다. 세크레톰 조성물은 정제되거나, 정제되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 세크레톰 조성물은 세포로부터 분비되지 않는 하나 이상의 물질(예: 배양 배지, 첨가물, 영양분 등)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세크레톰 조성물은 세포로부터 분비되지 않는 미량의 하나 이상의 물질(예: 배양 배지, 첨가물, 영양분 등)을 포함하거나, 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는" 등은 인간 또는 비-인간 포유동물(예: 설치류, 고양이, 개, 말, 소, 양 및 영장류 등)의 임의의 치료를 포괄하고, 질환 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 병태의 발생을 예방하는 것을 포함한다. 또한, 이것은 질환, 병태 및/또는 임의의 관련 증상을 억제 (발생의 정지), 완화 또는 개선 (퇴행 유발) 또는 치유 (발생 또는 진행을 영구적으로 중단)하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 포유동물, 구체적으로 인간의 질환 또는 병태의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질환 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 병태의 발생을 예방하는 것; (b) 질환 또는 병태의 억제, 예로 이의 발병을 정지시키는 것; (c) 질환 또는 병태의 완화 및/또는 개선, 예로 질환 또는 병태의 퇴행을 유발시키는 것; 또는 (d) 질환 또는 병태의 치유, 예로 이의 발생 또는 진행을 중단시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 대상체 집단은 원하지 않은 병태 또는 질환으로 고생하는 대상체, 뿐만 아니라 병태 또는 질환의 발병 위험이 있는 대상체를 포함한다. 일부 구현예에서, "치료" (또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정한 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 억제, 발병 지연시키고/거나, 이들의 중증도 감소 및/또는 발병 빈도를 감소시키는 요법의 임의의 투여를 말한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태로 고생하는 것으로서 진단된 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 민감성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체에 대한 것일 수 있다.
본원에 사용된 "상처"는 기계적(예: 타박상, 관통), 열적, 화학적, 전기적, 방사선, 진탕 및 절개 손상과 같은 외상성 손상; 외과 수술 및 결과적 절개 탈장, 누공 등과 같은 선별적 손상; 급성 창상, 만성 창상, 감염된 창상 및 무균 창상, 뿐만 아니라 질환 상태와 관련된 창상(예: 안구 타박상)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상처는 역동적이고, 치유 과정은 상처 입을 시 시작되어 안정한 상처 봉합에 도달하면서 초기 상처 봉합으로 진행되는 일련의 통합되고 상호 연관된 세포성 공정을 요구하는 연속 과정이다. 이러한 세포성 공정은 사이토카인, 림포카인, 성장인자 및 호르몬을 포함하나, 이에 한정되지 않는 체액성 물질에 의해 매개되거나, 조절된다. 본 발명에 따르면, "상처 치유"는 일정 형태의 개입에 의해, 조직 복구의 자연 세포성 공정 및 체액성 물질을 개선하여 치유가 더 신속하고/거나, 생성된 치유된 영역이 흉터가 더 적고/거나, 상처 입은 영역이 손상되지 않은 조직에 가까운 조직 강도를 갖고/거나, 상처 입은 조직이 일정 정도 기능적 회복을 달성하는 것을 말한다.
본원에 사용된 용어 "한" 또는 "하나"는 하나 이상 또는 적어도 하나를 의미한다.
본원에 사용된 조성물의 "치료적 유효" 또는 "유효" 용량 또는 양은 주어진 의학적 병태에 긍정적인 영향을 미치기에 충분한 양이다. 즉각적이지 않은 경우, 치료적 유효 또는 유효 용량 또는 양은 일정 기간 동안 환자의 건강 및 복지에 주목할 만한 또는 측정가능한 효과를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 "약학적 조성물"은 전달 성분과 조합한 본원에 기재된 유효량의 조성물을 말한다. 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있으며, 이는 대상체에게 조성물 및/또는 이의 개별 성분의 투여를 용이하게 할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 상당한 자극을 유발시키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
용어 "부형제"는 화합물의 투여를 추가로 용이하게 하도록 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다.
본원에 사용된 용어 "혼합하다(mix)" 및 "혼합하는" 등은 구성요소의 기계적 공정 또는 기계적 처리를 설명한다. 예를 들어, 혼합은 제공된 소수성 매트릭스의 강한 압축 및 혼합을 유도하는 압축 및 폴딩 또는 비슷한 처리 단계의 반복된 주기를 수행하는 의미일 수 있다.
성체 줄기세포는 골수, 지방 및 치수 조직을 포함한 다양한 성체 조직으로부터 채취할 수 있다. 모든 성체 줄기세포는 자가 재생할 수 있고, 다능성으로 간주되지만, 치료적 기능은 기원에 따라 달라진다. 결과적으로, 각 유형의 성체 줄기세포는 특정 질환에 적합하게 만드는 독특한 특징을 갖는다. 중간엽 줄기세포(MSC)는 전형적으로 중배엽으로부터 유래하고 조골세포(예: 뼈세포), 연골세포(예: 연골세포), 근세포(예: 근육세포) 및 지방세포(예: 골수 지방 조직을 발생시키는 지방세포)를 포함한, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 세포로부터 단리된 (이로부터 유래한) 다능성, 비-조혈 (비-혈액) 줄기세포이다. 본원에 사용된 "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 세포를 말한다. 줄기세포는 다수의 생물학적 공정을 조절하거나 조절하는 데 중요한 성장인자와 같은 인자를 생산한다. 성장인자는 세포 성장 및/또는 증식 및/또는 세포성 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질과 같은 제제이다. 전형적으로, 성장인자는 단백질 또는 스테로이드 호르몬이다. 용어 "성장인자" 및 "인자" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 한편, 용어 "생물학적 인자"는 성장인자에 한정되지 않는다.
인간 중간엽 줄기세포(MSC)는 CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+/CD44+ (또는 이들의 임의의 적합한 하위세트)의 표면 마커 프로파일에 의해 특성화될 수 있다. (Bourin et al., Cytotherapy 15(6): 641-648 (2013) 참조). 또한, 적절한 줄기세포는 단리 시 CD34+ 양성을 나타내지만, 배양 중에 이 마커를 상실한다. 따라서, 본 출원에 따라 사용될 수 있는 하나의 줄기세포 유형에 대한 전체 마커 프로파일은 CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD105+를 포함한다. 마우스 줄기세포를 이용하는 또 다른 구현예에서, 줄기세포는 CD34 대신에 Sca-1 마커에 의해 특성화되어, 동일하게 남아 있는 나머지 마커로 상기에 기재된 인간 세포의 상동체로 보이는 것을 정의한다.
문구 "조건화 배지" 또는 "CM"은 MSC에 의해 분비되는 생물학적 인자를 포함하는 배지를 말한다. 이것은 본원에서 "세크레톰", "MSC-CM", "MSC 세크레톰" 및/또는 "MSC 유래 세크레톰"으로도 지칭될 수 있다. 또한, MSC에 의해 분비된 생물학적 인자를 포함하고, 예를 들어 여과, 정제 및/또는 농축 절차에 의해 추가로 처리되었던 처리된 "조건화 배지"가 제공된다. "조건화 배지"는 본원에 자세하게 설명된 바와 같이 배지에서 줄기세포를 배양하고, 줄기세포 및 이들의 분비된 줄기세포 산물(세크레톰)을 포함하는 생성된 배지를, 생물학적 인자 및 분리 이전에 존재한 것보다 더 적은 수의 줄기세포를 포함하는 조건화 배지로 분리시킴으로써 획득된다. 조건화 배지는 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있고 실질적으로 줄기세포가 없거나(소량의 줄기세포를 포함할 수 있음), 줄기세포가 없다. 조건화 배지에 있을 수 있는 생물학적 인자는 단백질(예: 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 효소), 핵산(예: miRNA), 지질(예: 인지질), 다당류 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 생물학적 인자의 임의의 조합(들)은 세포외 소포(예: 엑소좀)의 내부 또는 표면 상에 결합되거나, 세포외 소포로부터 분리될 수 있다.
B. 조성물 및 제형물
본 발명은 이러한 치료에 사용하기 위한 피브로넥틴, 선택적으로 피브로넥틴(FN)에 비공유적으로 부착된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 그러한 조성물의 제조 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족한다.
일부 구현예에서, FN은 줄기세포 유래이다.
일부 구현예에서, FN은 MSC 유래 FN이다.
일부 구현예에서, FN은 MSC 분비 FN이다.
일부 구현예에서, FN은 세포 FN이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포 FN은 EDA, EDB 및 V+와 같은 대체 스플라이싱 변이체/동형체의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+및 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 V+이다.
일부 구현예에서, 세포 FN은 세포 유래 FN이고, 여기서 FN은 하나 이상의 성장 인자에 비공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 조건화 배지로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 중간엽 줄기세포(MSC)의 배양물로부터 획득된다.
일부 구현예에서, FN을 포함하는 조성물은 MSC 세크레톰(처리된 MSC 세크레톰 포함)으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 및/또는 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰(처리된 MSC 세크레톰 포함) 등의 조건화 배지를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 140,000ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 140,000ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 50~5000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50~4000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 100~4000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 150~3500 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000~70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500~50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000~40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1500~35,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 0.5~50g/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 5~45 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 10~40 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 15~35 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 20~30 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 약 25 ng/mL의 FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 FN 조성물은 MSC 세크레톰으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포 FN은 하나 이상의 성장 인자에 부착된다. 일부 구현예에서, FN은 하나 이상의 성장 인자에 비공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: FGF(예: FGF-2, 섬유아세포 성장 인자-2라고도 함), PDGF(혈소판 유래 성장 인자라고도 함), HGF(간세포 성장 인자라고도 함), VEGF, TGFβ1(TGFbeta1 또는 전환 성장 인자 β1이라고도 함), TGFβ2(TGFbeta2 또는 전환 성장 인자 β2라고도 함), IGF-1(인슐린 성장 인자 1이라고도 함), IGF-2(인슐린 성장 인자 2라고도 함), NGF(신경 성장 인자라고도 함), 뉴로트로핀 및 EGF(표피 성장 인자라고도 함).
일부 구현예에서, FN 조성물은 FGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FGF는 FGF-2이다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 FGF-2를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 PDGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 0.1 ng/mL의 PDGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 HGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ~ 10 ng/mL, 또는 2.0 +/- 0.3 ng/mL HGF를 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF는 약 100~800 pg/mL, 또는 304 +/- 44 pg/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 TGFβ1을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 TGFβ2를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 IGF-1, IGF-2 및 EGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 IGF-2를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 NGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 뉴로트로핀을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 EGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 pH 4.5 내지 약 pH 8의 pH에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 pH 4.7 내지 약 pH 7.8의 pH에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 pH 약 5.0 내지 약 7.5에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 pH 약 5.5 내지 약 7.5에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 pH 약 6 내지 약 7.5에서 제형화된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.4, 약 pH 8.0에서 제형화된다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 pH 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0에서 제형화된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 특정 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포성 배지에서 발견되는 특정 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 생체이물 성분(예: 동물 혈청); 페놀 레드; 펩티드 및 생체분자 < 3kDa; 항생제; 단백질 응집물(예: 단백질 응집물 > 200 nm); 세포; 세포 잔재물(세포 잔재물은 엑소좀/세포외 소포 (EV)를 포함하지 않음, 예를 들어, 비-엑소좀, 비-EV 세포 잔재물); 호르몬(예를 들어, 호르몬은 인슐린 및/또는 히드로코르티손을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 및/또는 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 생체이물 성분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 페놀 레드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 3 kDa 미만의 펩티드 및 생체분자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 항생제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 단백질 응집물(예를 들어, 단백질 응집물 > 200 nm)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 잔재물 (세포 잔재물은 엑소좀/EV를 포함하지 않음; 예를 들어, 비-엑소좀, 비-EV 세포 잔재물)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 호르몬(예를 들어, 호르몬은 인슐린 및/또는 히드로코르티손을 포함하나, 이에 한정되지 않음)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 L-글루타민을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 만니톨, 락토스, 소르비톨, 자일리톨, 슈크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 포도당, 라피노스, 셀로바이오스, 겐티오바이오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 과당 및/또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 포스페이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산나트륨 또는 인산칼륨이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산나트륨이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산칼륨이다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 일/이 인산나트륨, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 글리신, 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 덱스트로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 글리신, 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨 및 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 글리신, 글리세롤 및 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및/또는 구연산/인산이나트륨을 포함하나 이에 한정되지 않는 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및/또는 구연산/인산이나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 인산이/일나트륨 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 구연산나트륨/구연산 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 붕산/구연산나트륨 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 붕산/사붕산나트륨 완충액 시스템에서 제형화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 구연산/인산이나트륨 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산나트륨 또는 인산칼륨이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산나트륨이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 공급원은 인산칼륨이다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 인산이나트륨/구연산, 만니톨 및 트레할로스를 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 긴장성 조절제 또는 긴장성 개질제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 긴장성 조절제 또는 긴장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및/또는 글리세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 등장성 조절제 또는 등장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및/또는 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 접착제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 하이프로멜로스, Poloxamer 407, Poloxamer 188, Poloxamer 237, Poloxamer 338, 하이프로멜로스(HPMC), HEC, 폴리카보필, 폴리비닐피롤리돈(PVP), PVA(폴리비닐알코올), 소듐 히알루로네이트, 젤란검, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리실록산, 폴리이미드, 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸셀룰로스, 피브린 접착제, 폴리에틸렌 글리콜 및 젤코아를 포함하나, 이에 한정되지 않는 접착제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 접착제는 하이프로멜로스이다. 일부 구현예에서, 접착제는 피브린 글루이다. 일부 구현예에서, 접착제는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 접착제는 젤코아이다(Sani, et al., Science Advances, Vol. 5, No. 3 (2019) 참조).
일부 구현예에서, FN 조성물은 (a) 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 MSC 세크레톰을 포함하는 처리된 조건화 배지; 및 (b) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 생산되는 MSC 세크레톰 및 중합체를 포함하는 조건화 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 생산되는 MSC 세크레톰 및 중합체를 포함하는 처리된 조건화 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 조성물 성분이 방출될 수 있는 생분해성 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 성분의 지속적인(느린) 방출을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 FN 조성물은 치료용 붕대의 형태(예: FN 조성물이 함침된 중합체)이다. 치료용 붕대는 용도에 따라 필요한 바와 같이 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 붕대는 패치 형태이거나, 메시 형태로 구성된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 생체 투과성, 예를 들어 안구 침투, 각막 침투 및/또는 각막 투과를 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 눈에 의해 흡수되는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 고유한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 부형제-유도 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 더 작은 인자의 상향조절로 인한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 생물보존제의 존재로 인한 생체 투과성을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 생물보존제 염화 벤즈알코늄의 존재로 인한 생체 투과성을 나타낸다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 다른 치료와 비교하여 긴 반감기를 나타내고/거나, 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포 FN 조성물은 MSC 세크레톰의 안정성을 증가시키는 단백질의 상향조절을 허용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 세포 FN 조성물은 샤페론 단백질을 상향조절을 허용하여 MSC 세크레톰에서 다른 단백질의 안정성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 초효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 매일 한 방울 또는 1회 투여로 치료적 효능을 허용한다.
C. 생산/제조 방법
일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포 FN은 세포에 의해 조건화 배지로 분비된다. 일부 구현예에서, 세포는 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 세포 FN 조성물을 생성하기 위해 바람직하지 않은 성분을 제거하도록 추가로 처리된다.
일부 구현예에서, 세포 FN 조성물의 조건화 배지(및 이와 같은 중간엽 줄기세포 분비 인자)는 치료될 환자 또는 개인(이를 필요로 하는 환자)으로부터, 또는 또 다른(기증자) 개인, 예: 젊고/거나 건강한 기증자로부터 수집한 중간엽 줄기세포로부터, 및/또는 시판되는 중간엽 줄기세포로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 치료될 개인으로부터(자가유래 줄기세포) 또는 기증자(동종이계 줄기세포)로부터 획득한 MSC를 사용하여 본원에 기재된 조건화 배지를 생산할 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 세포 FN 조성물로 추가로 처리될 수 있다.
본 발명에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC) 세크레톰 조성물을 제조하는 방법으로서,
(i) 제1 배양 배지에서 중간엽 줄기세포(MSC)를 배양하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 제1 배양 배지를 MSC로부터 제거하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 MSC를 세척하는 단계;
(iv) 제2 배양 배지를 첨가하여 약 1일 내지 5일 동안 배양하는 단계;
(v) 단계 (iv)의 제2 배양 배지를 조정된 배지로서 수확하는 단계; 및
(vi) 본원에 기술된 바와 같이 단계 (v)에서 조건화 배지를 FN 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 배양하는 단계는 세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 줄기세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 배지 혼합 기술학을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양하는 단계는 PBS Vertical WheelTM 혼합 기술을 사용하여 수행될 수 있다(PBS Biotech, Inc.에서 상업적으로 입수 가능).
일부 구현예에서, (vi) 단계 (v)에서의 조건화 배지를 MSC 세크레톰 조성물로 처리하는 단계는,
(a) 단계 (v)로부터의 수확된 조건화 배지를 여과하여 세포 미립자를 제거하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 여과된 조건화 배지를 농축시키는 단계; 및
(c) 완충용액으로 완충액을 교환하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및 구연산/인산이나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템으로 완충액 교환하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터, 0.22 μm 필터, 0.8 μm 필터 및 0.65 μm 필터, 낮은 단백질 결합 PVDF 막 및/또는 PES(폴리에테르설폰)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.45 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.22 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.8 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 0.65 μm 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 낮은 단백질 결합 PVDF 막의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 여과 단계 (a)는 PES(폴리에테르설폰)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터, 접면 유동 여과 시스템 또는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 중공 섬유 필터 기법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 접선 유동 여과 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축 단계 (b)는 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 3 내지 10 kDa MW 컷오프를 채용한다. 일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법은 적어도 3 kDa MW 컷오프, 적어도 4 kDa MW 컷오프, 적어도 5 kDa MW 컷오프, 적어도 6 kDa MW 컷오프, 적어도 7 kDa MW 컷오프, 적어도 8 kDa MW 컷오프, 적어도 9 kDa MW 컷오프, 적어도 10 kDa MW 컷오프, 적어도 11 kDa MW 컷오프, 적어도 12 kDa MW 컷오프, 적어도 13 kDa MW 컷오프, 적어도 14 kDa MW 컷오프, 적어도 15 kDa MW 컷오프, 적어도 16 kDa MW 컷오프, 적어도 17 kDa MW 컷오프, 적어도 18 kDa MW 컷오프, 적어도 19 kDa MW 컷오프, 적어도 20 kDa MW 컷오프, 적어도 21 kDa MW 컷오프, 적어도 22 kDa MW 컷오프, 적어도 23 kDa MW 컷오프, 적어도 24 kDa MW 컷오프, 적어도 25 kDa MW 컷오프, 적어도 26 kDa MW 컷오프, 적어도 27 kDa MW 컷오프, 적어도 28 kDa MW 컷오프, 적어도 29 kDa MW 컷오프 및/또는 적어도 30 kDa MW 컷오프를 채용한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 본원에 기재된 바와 같은 MSC 세크레톰 조성물 및/또는 제형물을 생산한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 배양 배지는 MSC 배지 및/또는 MSC-XF이다.
MSC 또는 MSC로부터 분화된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 원하는 사이토카인 및/또는 원하는 치료 특성을 포함하는 세포 FN 및 선택적으로 다른 원하는 분비물 구성요소를 포함하는 조건화 배지를 생산하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 세크레톰은 슈퍼 기증자 세포주의 MSC에서 생산될 수 있다. 또한, 세크레톰은 시판되는 MSC로부터 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 MSC(및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 동종이계 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 큰 집단의 개인을 위해 제조 및 보관될 수 있다. 동종이계 MSC(및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 사람들이 필요할 때 준비될 수 있도록 미리 만들어질 수 있다. 특정 구현예에서, MSC (및/또는 이로부터 유래한 세포) 및/또는 MSC 유래의 세크레톰 조성물은 더욱 농축된 용액 또는 조성물(예: 본원에 기재된 바와 같은 중간엽 줄기세포 유래의 세크레톰 조성물 또는 MSC 세크레톰 조성물)을 제조하도록 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 초기 배양 배지 및 제1 배양 배지는 상이하다. 일부 구현예에서, 초기 배양 배지 및 제1 배양 배지는 동일하다. 본 발명에 따른 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 생산하도록 MSC를 배양하는 데 유용한 세포 배양 배지 또는 배지의 비-제한적인 예에는 hMSC Media Booster XFM, hMSC High Performance Basal Media, Minimum Essential Medium Eagle(MEME), ADC-1, LPM(소 혈청 알부민 없음), F10(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ Medium(Fitton-Jackson 변형이 있거나 없음), StemPro, MSCGro, MesenCult, NutriStem, Basal Medium Eagle(얼(Earle) 염 염기를 첨가한 BME), Dulbecco's Modified Eagle Medium(혈청이 있거나 없는 DMEM), Yamane, IMEM-20, Glasgow Modification Eagle Medium(GMEM), Leibovitz L-15 Medium, McCoy's 5A Medium, Medium M199(얼 염 염기가 있는 M199E), Medium M199(행크(Hank) 염 염기가 있는 M199H), Minimum Essential Medium Alpha(MEM-알파), Minimum Essential Medium Eagle(얼 염 염기가 있는 MEM-E), Minimum Essential Medium Eagle(행크 염 염기가 있는 MEM-H) 및 Minimum Essential Medium Eagle(비-필수 아미노산이 있는 MEM-NAA)이 포함되며, 특히 수많은 것 중에, Medium 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153이 포함된다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 배지는 MEM-알파이다. 이들 및 기타 유용한 배지는 특히 [GIBCO, Grand Island, N.Y., USA and Biological Industries, Bet HaEmek, Israel]로부터 입수 가능하다. 이러한 배지 중 다수는 Academic Press, Inc.에서 발행한 [Methods in Enzymology, Volume LVIII "Cell Culture", pp. 62 72, William B. Jakoby 및 Ira H. Pastan] 편집본에 정리되어 있다.
일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 혈청이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 인간 혈소판 용해물이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청은 소태아 혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 소 또는 다른 종의 태아 혈청과 같은 혈청이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 위한 세포 배양 배지는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 메르캅토에탄올 및/또는 항생제와 같은 기타 성분이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포용 세포 배양 배지에는 항생제가 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 산소 백분율은 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 변화된다. 일부 구현예에서, 산소는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 부피이다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 산소 분압 하에 성장시킨다. 일부 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 세포 성장을 용이하게 하고/거나 세포 건강을 촉진하도록 낮은 산소 분압 하에 성장시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 생물학적 인자를 포함하는 조건화 배지(CM)에 관한 것으로, 이는 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지로 지칭될 수 있다. 조건화 배지는 본원에 기재된 바와 같이 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하고, 중간엽 줄기세포 및 이들의 분비된 중간엽 줄기세포 산물(생물학적 인자 및/또는 세크레톰으로 지칭됨)을 포함하는 생성된 배지를 분리함으로써 획득될 수 있다. 조건화 배지의 성분 일부에는 조건화 배지에서 성장한 세크레톰 및 중간엽 줄기세포를 포함한다. 일단 분리된 조건화 배지는 FN 조성물을 포함하고, 본원에 기재된 방법에 따라 추가로 처리 및/또는 사용될 수 있으며, 중간엽 줄기세포가 실질적으로 없거나(소량의 줄기세포 및/또는 미량의 줄기세포를 포함할 수 있음), 중간엽 줄기세포가 없다. MSC 세크레톰은 호르몬, 사이토카인, 세포외 기질, 단백질, 소포, 항체, 케모카인, 수용체, 저해제 및 과립을 포함하여 다양한 생물학적 인자로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지 또는 배지들(CM 또는 MSC 세크레톰을 포함한 조건화 배지들)은 농축된 조건화 배지(pCM 또는 농축된 MSC 세크레톰)를 생산하도록 추가로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰 또는 농축된 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지는 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하고, 중간엽 줄기세포가 배양된 배양 배지를 교환함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 생성된 조건화 배지는 수확(수집)된 다음, 농축된 MSC 세크레톰을 생산하도록 처리된다. 특정 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지의 처리 단계는 배지의 일부, 대부분 또는 필수적으로 모두의 제거, 또는 조건화 배지의 선별된 성분의 일부, 대부분 또는 필수적으로 모두의 제거를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지는 여과되어 농축된 MSC 세크레톰을 생산한다. 일부 구현예에서, MSC 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지는 한외여과되어 농축된 MSC 세크레톰을 생산한다.
일 양태에서, 본원에서는 세포 FN을 포함하는 처리된 조건화 배지를 생산하는 방법으로서, (a) 세포 배양 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 인자를 포함하는 조건화 배지(예: 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함한 조건화 배지)를 생성하는 단계; (b) 조건화 배지를 수확함으로써 수확된 조건화 배지(예: 수확된 중간엽 줄기세포 세크레톰)를 생산하는 단계; 및 (c) 수확된 조건화 배지(예: 수확된 중간엽 줄기세포 세크레톰)를 여과하여 처리된 조건화 배지(중간엽 줄기세포 세크레톰)를 생산하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 줄기세포는 성장인자가 없는 배지에서 배양되기 이전에 성장 배지에서 배양된다(배양되었다). 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 제1 성장 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 제1 성장 배지를 제2 성장 배지로 교환하고, 제2 성장 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 생성하는 단계; (c) 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 조건화 배지를 수확함으로써 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 수확된 조건화 배지를 생산하는 단계; 및 (d) 수확된 조건화 배지를 여과하여 중간엽 줄기세포 세크레톰을 포함하는 처리된 조건화 배지를 생산하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포(MSC)는 골수 및 지방 조직을 포함한 다양한 성인 조직으로부터 단리된(유래한) 다능성(모든 세포 계열은 아니지만 다수의 세포 계열로 분화할 수 있음), 비-조혈(비-혈액) 줄기세포이다. 특정 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 골수로부터 단리된다. "단리된"은 원래 환경으로부터 제거된 세포를 말한다. MSC는 중배엽 계열의 세포, 예를 들어 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화할 수 있다. MSC는 길고 얇은 세포 돌기가 거의 없는 작은 세포체를 갖는다. 세포체는 미세하게 분산된 크로마틴 입자로 둘러싸인 두드러진 핵소체와 함께 크고 둥근 핵을 포함하고 있어, 핵이 분명하게 보인다. 세포체의 잔여 부분에는 소량의 골지체, 거친 세포질세망, 미토콘드리아 및 폴리리보좀을 포함한다. 가늘고 긴 세포는 널리 분산되어 있으며, 인접한 세포외 기질은 소수의 망상 섬유소로 충전되지만 다른 유형의 콜라겐 섬유소는 없다[Brighton, et al., 1991 The Journal of Bone and Joint Surgery 73(6): 832-47]. 본원에 기재된 MSC는 하기 분자 마커(세포 또는 세포 유형의 원형질막의 단백질 분자 특징) 프로파일: 뼈 형태형성 단백질 수용체"1"(BMPR+); CD34+Scal+Lin"; CD44+; c-kit+; Sca-1+; Thy-1+; NOTCH3; JAG1; ITGA11을 발현할 수 있다. 또한, MSC는 다른 세포 유형의 특이적 마커를 발현할 수 있다(본원에 참고문헌으로 통합되는, 월드와이드 웹 stemcells.nih.gov; Kaltz, et al. 2010 Exp. Cell Res. 10월 1일; 316(16): 2609-17 참조). 본원에 기재된 MSC는 MSC의 다능성 분화 잠재력(MSC가 발생시키는 세포 유형)을 검출하도록 콜로니 형성 유닛 검정을 기초로 하여 확인될 수 있다. 그러나 다소간 분화된 세포(전구체 세포)도 사용할 수 있다.
i. FN 조성물 - 처리
일부 구현예에서, FN 조성물을 생성하기 위해, 본원에 기재된 MSC 세크레톰을 포함하는 조건화 배지는 일부 구현예에서 수집 및 여과 및/또는 정제하여 세포 미립자 및/또는 기타 유해한 성분을 제거할 수 있다. 예를 들어, 단계 (v)에서 상기 기재된 바와 같이, 단계 (iv)로부터의 제2 배양 배지를 조건화 배지로서 수확한다. 본원에 사용된 여과막은 세포 미립자 및/또는 기타 유해한 성분이 통과하는 것을 허용하면서 원하는 MSC 분비 성분을 보유할 수 있도록 적합한 막 및 입체구조를 갖는 당업계에 공지된 임의의 여과막으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 선택된 유체 역학 조건하에서 세포의 보유를 허용하는 한편 유해한 성분을 통과시켜 제거하는 임의의 적합한 막을 활용할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 5 마이크론의 공극 크기의 상한 및 약 0.1 마이크론의 하한이 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 여과는 미세공극 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.5 μm 내지 0.2 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.5 μm, 0.45 μm, 0.4 μm, 0.35 μm, 0.3 μm, 0.25 μm, 0.22 μm 및/또는 0.2 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.45 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과는 0.22 μm 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과/정제는 낮은 단백질 결합 폴리비닐리덴 이불화물(PVDF) 막을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 여과/정제는 폴리에테르설폰(PES)을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 여과는 한외여과에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 3 kD의 필터 크기를 사용하여(처리된 조건화 배지에서 필터 크기보다 큰 분자의 정제, 탈염 및 농축을 달성하도록) 여과된다. 일부 구현예에서, 3 kD 미만의 필터 크기가 조건화 배지를 여과하는 데 사용되는 반면, 다른 구현예에서는 처리된 조건화 배지가 사용되는 적용에 따라 3 kD보다 큰 필터 크기가 사용된다. 다른 구현예에서, 수확된 조건화 배지의 한외여과는 생성되어 처리된 MSC 세크레톰을 포함한 조건화 배지의 성분 크기를 결정하도록 선별된 상이한 공극 크기(예: 2 kD, < 2 kD 또는 > 2 kD)의 필터를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 성장 지원 배지 내의 유해한 성분은 배지 교환에 의해, 바람직하게 "교차 흐름 여과"를 통해 제거된다. 교차 흐름 여과는 MSC 세크레톰 세포의 현탁액이 세포 이외의 현탁액 성분에 대해 투과가능한 필터와 실질적으로 나란히 흐르는 여과 방식을 의미한다. 교차 흐름 여과 공정은 Re=레이놀즈 수, γw=벽 전단율, ΔP = 압력 강하 및 TMP=막통과 압력을 포함하는 유체 역학 매개변수 세트에 의해 특성화된다. Re, γw 및 ΔP는 여과 시스템의 기하학, 흐름 조건 및 유체 성질에 의존할 것이다. 이러한 교차 흐름 공정은 일부 구현예에서, 중공 섬유 여과 시스템도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제5,053,334호 참조.
일부 구현예에서, FN 조성물은 여과 없이 및/또는 여과 이후에 추가로 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 중공 섬유 접선 유동 기술학을 사용하여 농축될 수 있다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 원심분리 기반의 크기 배제 기법을 사용하여 농축될 수 있으며, 예를 들어 아미콘 및/또는 센트리콘이 원심분리 단계 동안 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 크기 컷오프는 3 내지 10 kDa MW 컷오프이다. 일부 구현예에서, 원심분리 기반의 크기 배제 기법의 농축 방법 동안 사용되는 분자량 컷오프는 적어도 약 3 kDa, 적어도 약 4 kDa, 적어도 약 5 kDa, 적어도 약 6 kDa, 적어도 약 7 kDa, 적어도 약 8 kDa, 적어도 약 9 kDa, 적어도 약 10 kDa, 적어도 약 15 kDa, 적어도 약 20 kDa, 적어도 약 25 kDa 또는 적어도 약 30 kDa이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배 또는 약 100배 농축된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 농축 이전의 조건화 배지와 비교하여 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배 또는 약 100배 농축된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 농축 단계 이후에 최종 완충용액으로 추가로 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 농축 단계 이후에 접착제 없이 최종 완충용액으로 추가로 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, 완충액 교환은 FN 조성물의 완충액 성분을 변경하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 완충액 교환 단계 동안 희석되지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 완충액 교환 단계 동안 1% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만 또는 25% 미만으로 희석된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 미량의 배양 배지 성분이 모두 제거되도록 농축 단계 이후에 완충액 교환된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만 또는 약 0%의 배양 배지 성분이 남도록 농축 단계 이후에 완충액 교환된다.
ii. FN 조성물 - 제형화
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 0.1 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50~5000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 100~4000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 150~3500 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 50 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 150,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 140,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 130,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 135,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 120,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 110,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 100,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 90,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 80,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 60,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL 내지 50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 30,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 20,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 10,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 9,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 8,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 7,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 6,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 5,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 4,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000 ng/mL ~ 3,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 1000~70,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 500~50,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1000~40,000 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 1500~35,000 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 0.5~50 g/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 5~45 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 10~40 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 15~35 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 20~30 ng/mL FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN은 위에 제공된 범위 내의 임의의 적합한 값의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 20 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 21 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 22 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 23 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 24 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 25 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 26 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 27 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 28 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 29 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 30 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 25 ng/mL의 FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 0.5~20 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 3~8 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 3 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 3.5 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 4 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 4.5 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 5 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 5.5 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 6 ng/mL FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 6.5 ng/mL의 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 7 ng/mL 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 7.5 ng/mL 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 8 ng/mL 세포 FN을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 일염기성 인산나트륨 mL당 약 2 mg 내지 3 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 일염기성 인산나트륨 mL당 약 4% 내지 5%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 이염기성 인산나트륨 mL당 약 11 mg 내지 12 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이염기성 인산나트륨 mL당 약 21.5% 내지 23%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 만니톨 mL당 약 11.5 mg 내지 13 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 만니톨 mL당 약 23% 내지 25%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 트레할로스 이수화물 mL당 약 23 mg 내지 25 mg을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트레할로스 이수화물 mL당 약 46% 내지 48%를 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 하이프로멜로스를 포함하지 않는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 선택적으로 하이프로멜로스를 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 하이프로멜로스를 mL당 약 0.5 mg 내지 2 mg 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 하이프로멜로스를 mL당 약 1% 내지 3% 포함하는 제형물로 제조된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 염산 및/또는 수산화나트륨을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염산을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 수산화나트륨을 포함하는 제형물로 제조된다. 일부 구현예에서, 염산 및/또는 수산화나트륨을 사용하여 원하는 pH를 획득한다.
일부 구현예에서, 제형물은 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형물은 NaCl을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형물은 검출가능한 수준의 NaCl을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형물은 MgCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형물은 MgCl2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형물은 검출가능한 수준의 MgCl2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형물은 NaCl 또는 MgCl2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형물은 검출가능한 수준의 NaCl 또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 제형물은 예를 들어 자연 발생뿐만 아니라 합성 눈물 또는 눈물 유사 용액을 포함하는 눈물과 등장성이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 아래 표 1에 제공된 바와 같은 성분을 포함하는 제형물로 제조된다:
FN 제형물 구현예
존재하는 성분 산물 1 mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 2.28 mg
이염기성 인산나트륨 11.45 mg
만니톨 12.2 mg
트레할로스 이수화물 24 mg
하이프로멜로스 1 mg
염산 및/또는 수산화나트륨 필요에 따라 조정
FN 제형물 구현예
존재하는 성분 산물 1mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 1.31 mg
이염기성 인산나트륨 5.73 mg
만니톨 6.1 mg
트레할로스 이수화물 12 mg
하이프로멜로스 0.5 mg
염산 및/또는 수산화나트륨 필요에 따라 조정
일부 구현예에서, FN 조성물은 하기를 포함한다:
존재하는 성분 산물 1 mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 2.28 mg
이염기성 인산나트륨 11.45 mg
만니톨 12.2 mg
트레할로스 이수화물 24 mg
하이프로멜로스 1 mg
일부 구현예에서, FN 조성물은 하기를 포함한다:
존재하는 성분 산물 1 mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 1.31 mg
이염기성 인산나트륨 5.73 mg
만니톨 6.1 mg
트레할로스 이수화물 12 mg
하이프로멜로스 0.5 mg
일부 구현예에서, FN 조성물은 MgCl2를 포함하지 않고 하기를 포함한다:
존재하는 성분 산물 1 mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 1.31 mg
이염기성 인산나트륨 5.73 mg
만니톨 6.1 mg
트레할로스 이수화물 12 mg
하이프로멜로스 0.5 mg
일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 또는 MgCl2를 포함하지 않고 하기를 포함한다:
존재하는 성분 산물 1 mL당 양
FN 0.5~50 ng
일염기성 인산나트륨 1.31 mg
이염기성 인산나트륨 5.73 mg
만니톨 6.1 mg
트레할로스 이수화물 12 mg
하이프로멜로스 0.5 mg
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 10~12 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 11~13 mg/mL 만니톨, 2~25 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5~2 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 11.45 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 12.2 mg/mL 만니톨, 24 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 1 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 4.5~7 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 5.5~7.5 mg/mL 만니톨, 11~13 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.1~1.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 0.5~50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 5.73 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 6.1 mg/mL 만니톨, 12 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는다.
D. 검정 방법/치료적 성질
본 발명의 일부 구현예에서, FN 조성물은 FN 조성물에 대한 성질뿐만 아니라 특정 성분 비율/농도를 달성하도록 처리된다.
본 발명의 일부 구현예에서, FN 조성물은 특정 효능 성능 판정기준을 달성하도록 처리된다. 일부 구현예에서, 완충액 교환 단계는 FN 조성물의 효능을 강화한다.
세포외 소포는 상기 언급된 가용성 및 불용성 물질을 화물 운반하는 막 결합 입자이다. 용어 "세포외 소포"는 다양한 종의 분비 또는 방출된 소포의 일군을 말한다. 이들은 일반적으로 다음의 하위유형: 1) 일반적으로 50 nm 내지 1500 nm의 크기 범위를 나타내는 미세소포 또는 셰드 미세소포; 2) 전형적으로 30 nm 내지 120 nm의 크기 범위를 나타내는 엑소좀; 및 3) 전형적으로 500 nm 미만(즉, < 500 nm)의 크기 범위를 나타내는 소포로 나뉜다(예를 들어, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제 특허출원 WO2019016799 참조). 일부 구현예에서, FN 조성물은 입자 수에 대해 및/또는 세크레톰에 존재하는 세포외 소포(EV)를 정량화하도록 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, EV는 약 2.5 Υ 105개/μL, 2.6 Υ 105개/μL, 2.7 Υ 105개/μL, 2.8 Υ 105개/μL, 2.9 Υ 105개/μL, 3.0 Υ 105개/μL, 3.1 Υ 105개/μL, 3.2 Υ 105개/μL, 3.3 Υ 105개/μL, 3.4 Υ 105개/μL, 3.5 Υ 105개/μL, 3.6 Υ 105개/μL, 3.7 Υ 105개/μL, 3.8 Υ 105개/μL, 3.9 Υ 105개/μL, 4.0 Υ 105개/μL, 4.1 Υ 105개/μL, 4.2 Υ 105개/μL, 4.3 Υ 105개/μL, 4.4 Υ 105개/μL, 4.5 Υ 105개/μL, 4.6 Υ 105개/μL, 4.7 Υ 105개/μL, 4.8 Υ 105개/μL, 4.9 Υ 105개/μL 또는 약 5.0 Υ 105개/μL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 3.8 Υ 105개 +/-0.8 Υ 105개/μL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, EV는 약 2.5 Υ 105개/μL, 2.6 Υ 105개/μL, 2.7 Υ 105개/μL, 2.8 Υ 105개/μL, 2.9 Υ 105개/μL, 3.0 Υ 105개/μL, 3.1 Υ 105개/μL, 3.2 Υ 105개/μL, 3.3 Υ 105개/μL, 3.4 Υ 105개/μL, 3.5 Υ 105개/μL, 3.6 Υ 105개/μL, 3.7 Υ 105개/μL, 3.8 Υ 105개/μL, 3.9 Υ 105개/μL, 4.0 Υ 105개/μL, 4.1 Υ 105개/μL, 4.2 Υ 105개/μL, 4.3 Υ 105개/μL, 4.4 Υ 105개/μL, 4.5 Υ 105개/μL, 4.6 Υ 105개/μL, 4.7 Υ 105개/μL, 4.8 Υ 105개/μL, 4.9 Υ 105개/μL 또는 약 5.0 Υ 105개/μL의 농도 및 110 nm 내지 120 nm의 평균 지름으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 2.5 Υ 105개/μL, 2.6 Υ 105개/μL, 2.7 Υ 105개/μL, 2.8 Υ 105개/μL, 2.9 Υ 105개/μL, 3.0 Υ 105개/μL, 3.1 Υ 105개/μL, 3.2 Υ 105개/μL, 3.3 Υ 105개/μL, 3.4 Υ 105개/μL, 3.5 Υ 105개/μL, 3.6 Υ 105개/μL, 3.7 Υ 105개/μL, 3.8 Υ 105개/μL, 3.9 Υ 105개/μL, 4.0 Υ 105개/μL, 4.1 Υ 105개/μL, 4.2 Υ 105개/μL, 4.3 Υ 105개/μL, 4.4 Υ 105개/μL, 4.5 Υ 105개/μL, 4.6 Υ 105개/μL, 4.7 Υ 105개/μL, 4.8 Υ 105개/μL, 4.9 Υ 105개/μL 또는 약 5.0 Υ 105개/μL의 농도 및 112 nm 내지 116 nm의 평균 지름으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 2.5 Υ 105개/μL, 2.6 Υ 105개/μL, 2.7 Υ 105개/μL, 2.8 Υ 105개/μL, 2.9 Υ 105개/μL, 3.0 Υ 105개/μL, 3.1 Υ 105개/μL, 3.2 Υ 105개/μL, 3.3 Υ 105개/μL, 3.4 Υ 105개/μL, 3.5 Υ 105개/μL, 3.6 Υ 105개/μL, 3.7 Υ 105개/μL, 3.8 Υ 105개/μL, 3.9 Υ 105개/μL, 4.0 Υ 105개/μL, 4.1 Υ 105개/μL, 4.2 Υ 105개/μL, 4.3 Υ 105개/μL, 4.4 Υ 105개/μL, 4.5 Υ 105개/μL, 4.6 Υ 105개/μL, 4.7 Υ 105개/μL, 4.8 Υ 105개/μL, 4.9 Υ 105개/μL 또는 약 5.0 Υ 105개/μL의 농도 및 114 nm의 평균 지름으로 존재한다. 일부 구현예에서, EV는 약 3.8 Υ 105개 +/-0.8 Υ 105개/μL의 농도 및 114 nm의 평균 직경으로 존재한다.
iii. FN 조성물 - 치료적 성질
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포 FN은 EDA, EDB 및 V+와 같은 대체 스플라이싱 변이체/동형체의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+ 및 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 V+이다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 FN 조성물은 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 예를 들어 항-혈관형성 성질(혈관 및/또는 림프관), 항-섬유증 성질, 항-염증 성질, 세포 이동, 증식, 세포 부착, 퍼짐, 생존, 세포외 기질(ECM) 조립 및 구조를 촉진하는 성질, 유사분열 촉진 성질, 항-산화 스트레스/손상 성질을 포함하는 다양한 치료적 성질을 나타낸다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 항-섬유증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항-섬유증 성질은 표준 검정법을 사용하여 검정될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물과 관련된 다양한 인자 및/또는 활성의 존재는 항-섬유증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항-섬유증 성질을 나타내는 인자는 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 항-염증 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 억제한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 100%(예: 염증의 완전한 감소) 억제한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 비만 세포의 탈과립화를 예방한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 예를 들어 체세포 분열 및 운동성 활성을 포함한 세포 이동 및 증식을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 체세포분열 활성을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 운동성 활성을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함하며, 이는 FN 조성물의 추가적인 세포 이동 및 증식 활성을 제공한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 FN 조성물의 추가적인 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 FGF-2와 같은 FGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 FN 조성물의 추가적인 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 HGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 FN 조성물의 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 세포사멸 방지제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 FGF-2, HGF 및 IGF-1을 포함하지만 이에 국한되지 않는 세포사멸 방지제를 포함하며, 이는 FN 조성물의 추가적인 세포 이동 및 증식 활성을 제공한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 FGF-2, HGF 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되고 FN 조성물의 추가적인 세포 이동 및 증식 활성을 제공하는 항-세포사멸제를 포함한다.
iv. FN 조성물 - 생물리학적/생화학적 성질
생화학적 및 생물리학적 특성화:
일부 구현예에서, 본 발명은 FN 조성물의 특성화 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, FN 조성물 특성화는 (1) FN 조성물에서 분자적 실체의 종합적 및/또는 정량적 맵핑; (2) 생물학적 활성에 대한 선별 인자의 기여도를 측정하는 것; 및 (3) 생물리학적 매개변수를 측정하는 것을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, FN 조성물의 성질을 결정하기 위하여, 본원에 기재된 바와 같이 FN 조성물에 관한 다양한 효능 검정을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 (1) FN 조성물에서 분자적 실체의 종합적 및/또는 정량적 맵핑; (2) 생물학적 활성에 대한 선별 인자의 기여도를 측정하는 것; 및 (3) 생물리학적 매개변수를 측정하는 것에 적용될 것이다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 생물리학적 검정, 생화학적 검정 및 생물학적 검정을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
물리적 성분 특성화:
일부 구현예에서, FN 조성물의 특성화는 생체분석 기법의 조합을 사용하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물의 특성화는 FN 조성물의 물리적 성분을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물의 특성화는 단백질 어레이, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 질량 분광분석법 및 면역블롯팅을 활용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물 특성화는 FN 조성물 내의 분자를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 어레이를 활용하여 FN 조성물 내의 인자를 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법을 활용하여 FN 조성물에서 하나 이상의 인자의 존재를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 정량적 기법을 활용하여 하나 이상의 인자의 수준을 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, ELISA와 같은 정량적 기법을 활용하여 각 인자의 수준을 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포 FN은 EDA, EDB 및 V+와 같은 대체 스플라이싱 변이체/동형체의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+ 및 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 V+이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 단백질 인자 및 세포외 소포(EV)를 포함하는 MSC 세크레톰을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 영양 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 세크레톰은 30 nm 내지 200 nm 크기 범위 및 mL당 1 Υ 108개 내지 5 Υ 109개 EV의 세포외 소포(EV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 고갈 연구는 결정적 인자의 개별 기여도를 분석하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 기반의 풀다운 방법을 사용하여 정의된 인자를 FN 조성물로부터 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 고갈은 하기 본원에 기재된 바와 같이, 웨스턴 블롯에 의해 입증된 다음 하나 이상의 생체검정법에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 고갈 연구는 단백질 분획 및 EV 분획의 기여도를 평가하도록 수행될 수 있다.
산화적 스트레스:
일부 구현예에서, 산화적 스트레스 예방 검정은 FN 조성물에 관해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 각막 상피 손상을 예방한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증의 존재를 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 항-염증 마커의 존재 증가에 의해 결정되는 바와 같이 염증의 존재를 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 예를 들어 IL-8과 같은 항-염증 마커의 존재 증가에 의해 결정되는 바와 같이 염증의 존재를 감소시킨다.
안전성 특성화:
일부 구현예에서, FN 조성물은 혈액 적격성에 대해 평가되고, 발열원 및 내독소 수준, 뿐만 아니라 무균도에 대한 테스트를 시행할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈액 적격성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 적격성을 평가하는 것은 용혈 및 혈구응집에 대한 검정을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 전신 노출로 인한 유해한 효과를 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 중증 안구 화상과 같은 전신 노출로 인한 유해한 효과를 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈구응집 활성을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 용혈을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 용혈 활성을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약학적 제형물의 일부로서 투여될 수 있도록 멸균일 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 내독소가 없거나, 실질적으로 없을 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 미생물이 없거나, 실질적으로 없을 수 있다.
안정성:
일부 구현예에서, FN 조성물의 생물리학적 특징은 평가 및/또는 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광, 정적 광산란 및 동적 광산란은 단백질 안정성 계량을 특성화한다. 일부 구현예에서, 다음의 매개변수: 열 용융, 열 응집, 델타 G 및/또는 점도를 측정하여 세크레톰을 추가로 특성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 열 용융 검정을 활용하여 FN 조성물 안정성을 결정한다. 일부 구현예에서, 열 응집 검정을 활용하여 FN 조성물 안정성을 결정한다. 일부 구현예에서, 델타 G는 FN 조성물 안정성을 결정하는 척도로서 사용된다. 일부 구현예에서, 점도는 FN 조성물 특징으로서 측정된다. 일부 구현예에서, 점도는 FN 조성물 안정성을 결정하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 생물리학적 계량을 활용하여 상이한 FN 조성물 제형물을 특성화하는 안정성 매개변수를 확립할 수 있다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 -20℃, 4℃ 및 실온(20℃)에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 -20℃, 4℃ 및 실온(20℃)에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 적어도 7일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 -20℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 4℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 20℃ 또는 실온)에서 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 안정하다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 -20℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 4℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 20℃에서 적어도 7일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 25℃실온)에서 적어도 7일 동안 안정하다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 약 -20℃에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 4℃에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 20℃(또는 실온)에서 적어도 14일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 약 25℃(실온)에서 적어도 14일 동안 안정하다.
상피 장벽 무결성 검정
각막 상피, 보다 정확하게 상피의 첨단 표면은 각막의 전반적인 장벽 성질에 주요한 기여를 하며, 각막 장벽의 변화는 생체적격성 분석을 위한 민감한 인자로서 작용한다. 일부 구현예에서, FN 조성물의 생물리학적 특징은 예컨대 상피 장벽 무결성 검정에 의해 평가 및/또는 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 장벽 무결성 검정은 경상피 전기 저항(TEER)이다. 일부 구현예에서, 경상피 전기 저항 (TEER)은 전반적인 장벽 성질을 측정하도록 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 조직은 2 mL의 TEER 완충액을 포함하는 24-웰 플레이트로 옮기고, 10분 동안 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, TEER은 상피 볼트-옴 측정기 EVOMO 및 EndOhm-12 챔버(World Precision, Sarasota, FL)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 절차의 종료 시, 조직은 다음의 공식을 사용한 조직 생존력 평가에 사용될 수 있다.
장벽 무결성 % = 100 Υ [TEER(처리된 조직) / TEER(위약 대조군)]
일부 구현예에서, TEER는 FN 조성물의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, TEER은 EpiCorneal 조직 모델(MatTek Corp)을 사용하여 질소 머스타드(NM)에 대한 국소 노출에 의해 유발된 각막 상피 손상에 이어서, FN 조성물의 국소 적용 이후 장벽 무결성에 미치는 효과를 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 구현예 6에 기재된 바와 같이, 예를 들어 6 μg/mL로(위약 용액에 희석됨) 국소적으로 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, EpiCorneal 조직은 표준 배양 조건으로 5 mL 배지에서 24시간 동안 배양되었다.
생체검정법
일부 구현예에서, 생체검정법은 FN 조성물을 특성화하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체검정법은 각막 상처 치유, 상피세포 이동 및 증식, 간질 세포 분화(예: 흉터형성), 혈관신생 및 염증과 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체검정법은 각막 상처 치유, 상피세포 이동 및 증식, 간질 세포 분화(흉터형성), 혈관신생 및 염증을 매개하는 FN 조성물의 능력을 평가하도록 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되고 검정된 FN 조성물은 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포 FN은 EDA, EDB 및/또는 V+와 같은 대체 스플라이싱 변이체/동형체의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 FN은 EDA+ 및 EDB+이다. 일부 구현예에서, 세포 피브로넥틴은 V+이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 상처 치유와 같은 상처 치유를 촉진하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식 및 이동을 촉진하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식을 촉진하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이동을 촉진하는 능력에 대해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 FN을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식 및/또는 이동을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 상처 치유를 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이동을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 접착을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 확산을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포 생존을 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 세포외 기질(ECM)의 적절한 조립 및/또는 구조를 촉진한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 치유 촉진 능력을 결정하기 위해 스크래치 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식 촉진하는 능력을 결정하도록 트랜스웰 이동 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이동 촉진 능력을 결정하기 위해 트랜스웰 이동 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
스크래치 검정
일부 구현예에서, 본 발명의 검정은 "스크래치 검정"("스크래치 상처 검정", "긁힌 상처 봉합 검정", "상처 봉합 검정" 또는 "상처 치유 검정"으로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이동을 촉진하고, 이러한 이동 촉진은 "스크래치 검정"을 이용하여 결정 및/또는 조사된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 증식을 촉진하고 이러한 증식 촉진은 스크래치 검정을 이용하여 결정 및/또는 조사된다. 일반적으로, 스크래치 검정 방법은 "스크래치"로도 지칭되는 인공 간격이 충만한 세포 단일층에서 발생할 때를 기초로 한다. 스크래치는 "스크래치"를 닫거나 도포하는 구멍을 향해 이동하는 새로 생성된 간격의 모서리에 있는 세포에 대해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, Liang, C., Park, A. & Guan, J. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2: 329-333 (2007) 참조. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 상처 치유를 유도할 수 있는 후보를 스크리닝하기 위해 사용된다.
예시적인 일 구현예에서, 본원에 제공된 스크래치 검정은 다음 단계를 포함한다:
(a) 세포층을 제공하는 단계;
(b) 상처 갭/스크래치를 세포층에 도입하는 단계; 및
(c) 상처 갭이 테스트 조성물의 존재하에 치유/봉합되는지를 결정하는 단계 - 여기서 조성물은 단계 (b) 전 또는 후에 세포에 투여되고; 상처 갭의 봉합은 안구 상처 치유를 유도하는 시험 조성물의 능력을 나타낸다.
일부 구현예에서, 스크래치 검정은 각막 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 검정된 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 검정된 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 망막 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 각질세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 시신경 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 신경절 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 망막 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 망막 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 수정체 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 홍채 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 결막 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 착색되지 않은 모양체 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 섬유주 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 안구 맥락막 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치 검정은 결막 상피 세포에 사용된다.
일부 구현예에서, 검정된 세포는 하나 이상의 스크래치("갭" 또는 "상처"라고도 함)가 도입될 때 합류층을 형성한다. 일부 구현예에서, 검정된 세포의 합류층은 단층이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치가 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 단일 스크래치가 도입된다. 일부 구현예에서, 다수의 스크래치가 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치가 세포에 화학적으로 도입된다. 일부 구현예에서, 화학적 연소를 통해 하나 이상의 스크래치가 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치는 기성품 약물 또는 화학적 화합물을 통해 도입된다. 예시적인 일 구현예에서, 화학적 연소는 알칼리성 연소이다. 다른 예시적인 구현예에서, 화학적 연소는 질소 머스타드 가스 연소이다. 일부 구현예에서, 세포층을 기계적으로 파괴함으로써 하나 이상의 스크래치가 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 열 충격에 의해 하나 이상의 스크래치가 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치가 레이저 펄스를 통해 도입된다.
일부 구현예에서, 세포에 도입된 스크래치는 선형 스크래치를 포함한다. 일부 구현예에서, 셀에 도입된 스크래치는 빗금 친(crosshatched) 스크래치를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 도입된 스크래치는 원형 스크래치를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 도입된 스크래치는 지그재그 스크래치를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 도입된 스크래치는 하나 이상의 전술한 형상의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 도입된 스크래치는 그 크기가 약 0.01 mm 내지 10 mm이다(즉, 양쪽에서 상처/스크래치의 개별 이동 전면의 횡단 길이). 일부 구현예에서, 스크래치는 그 크기가 약 0.01 mm 내지 0.1 mm, 0.1 mm 내지 1 mm, 1 mm 내지 10 mm 또는 이들 범위 내의 임의의 적합한 값이다.
일부 구현예에서, 테스트 시약/조성물은 하나 이상의 스크래치가 도입된 후 세포에 투여된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 하나 이상의 스크래치가 도입되기 전에 세포에 투여된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 FN 조성물이다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 조건 배지이다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 단백질과 같은 생체 고분자이다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 하나 이상의 활성 화합물의 제약 조성물이다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 안구 상처 치유를 촉진하는 능력에 대해 스크리닝된다.
일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 세포에 투여하기 전에 농축된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 세포에 투여되기 전에 희석된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 세포에 투여되기 전에 완충제 교환과 같은 정제를 거친다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 세포에 투여되기 전에 동결건조된다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 10~100 μg/mL 활성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 10~100 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 10~90 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 20~80 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여된 시험 시약/조성물은 약 30~70 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 40~60 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 45 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여되는 시험 시약/조성물은 약 50 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 투여된 시험 시약/조성물은 약 55 μg/mL 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 안구 상처 치유를 촉진하는 시험 시약의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 세포 증식을 촉진하는 시험 시약의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 세포 이동을 촉진하는 시험 시약의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 스크래치로 이동된 세포의 총 수로 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치로 이동된 세포의 총 수는 염색(비색 또는 형광)이 있거나 없는 물리적 계수(이미지 분석 소프트웨어)에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 스크래치 내로 이동된 세포의 총 수는 스크래치 내의 세포 덩어리를 분광학적으로 정량화하기 위한 흡광도 또는 형광계 기반 방법에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 상처 봉합의 백분율 또는 이의 수학적 변형, 즉 상처의 초기 표면적에서 특정 시간에 남아 있는 스크래치 표면적을 뺀 다음 상처의 초기 표면적으로 나눈 값으로 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 남아 있는 스크래치 면적의 백분율, 즉 상처 봉합 백분율의 역수로 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 스크래치의 크기(즉, 양쪽에서 상처의 별개의 이동 전면의 횡단 길이)로서 특징지어진다. 일부 구현예에서, 이미지 분석 소프트웨어는 이동하는 스크래치 프론트(또는 경계)를 설정하고 남아 있는 스크래치의 거리(픽셀, um 등)를 측정하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 표면이 스크래치인 것으로 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치의 표면적(예: 픽셀^2 또는 μm^2)은 이미지 분석 소프트웨어에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 시간적 기능으로서 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 스크래치의 전체 또는 백분율(예: 50%)의 봉합에 필요한 시간으로서 특징지어진다. 일부 구현예에서, 스크래치의 봉합은 시간의 함수로서 스크래치의 무세포 표면적과 같은 속도로서 특징지어진다. 일부 구현예에서, 측정된 속도는 세포 이동/이동 시간의 거리이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 약 1 내지 5일 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 약 2 내지 4일 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 약 2 내지 3일 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 약 2일 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 약 3일 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 규칙적인 간격으로 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 매일 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스크래치의 봉합은 연속적으로 측정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 스크래치 검정에서 안구 상처 치유를 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 본원에 제공된 스크래치 검정에서 안구 상처 치유를 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 1배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 2배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 3배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 4배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 5배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 6배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 7배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 8배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 9배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 10배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 10% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 20% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 30% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 40% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 60% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 70% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 80% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 90% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 100% 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 스크래치 검정에서 안구 상처 치유를 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 본원에 제공된 스크래치 검정에서 안구 상처 치유를 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 1배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 2배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 3배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 4배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 5배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 6배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 7배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 8배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 9배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 10% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 20% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 30% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 40% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 50% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 60% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 70% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 80% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 90% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 스크래치 검정에서 상처 봉합을 100% 이상 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 스크래치 검정에서 안구 상처 치유에 영향을 미치기 위해 적어도 30 μg/mL의 시험 시약이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 스크래치 검정에서 안구 상처 치유에 영향을 미치기 위해 적어도 35 μg/mL의 시험 시약이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 스크래치 검정에서 안구 상처 치유에 영향을 미치기 위해 적어도 40 μg/mL의 시험 시약이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 스크래치 검정에서 안구 상처 치유에 영향을 미치기 위해 적어도 45 μg/mL의 시험 시약이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 스크래치 검정에서 안구 상처 치유에 영향을 미치기 위해 적어도 50 μg/mL의 시험 시약이 필요하다.
트랜스웰 이동 검정
일부 구현예에서, 본 발명의 검정은 "트랜스웰 이동 검정"("트랜스웰 세포 침입 검정" 또는 "트랜스웰 검정"이라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 세포 이동 및/또는 증식에 대한 후보 시약의 능력을 평가하기 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 세포 이동에 대한 후보 시약의 능력을 평가하기 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 세포 증식에 대한 후보 시약의 능력을 평가하기 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 세포 이동/증식을 유도할 수 있는 후보를 스크리닝하기 위해 이용된다.
일 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정은 다음 단계를 포함한다:
(a) 기공이 있는 막을 포함하는 상부 챔버에 세포를 첨가하는 단계; 여기서 세포는 시험 시약/조성물의 부재 하에 기초 배지로 보충된다.
(b) 상부 챔버를 시험 시약/조성물을 포함하는 용기에 위치시키는 단계; 여기서 상부 챔버의 각막 세포는 기공을 갖는 막에 의해 용기 내의 시험 시약/조성물로부터 분리된다.
(c) 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 세포의 이동 및/또는 증식을 유도하는 시험 시약/조성물의 능력을 나타내는 것으로서 막을 통해 이동하는 세포를 측정/정량하는 단계.
일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 각막 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 망막 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 각질세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 시신경 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 신경절 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 망막 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 망막 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 수정체 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 홍채 색소 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 결막 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 착색되지 않은 모양체 상피 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 섬유주 세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 안구 맥락막 섬유아세포에 사용된다. 일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 검정은 결막 상피 세포에 사용된다.
일부 구현예에서, 트랜스웰 이동 분석의 상부 챔버는 기공이 있는 막에 의해 밀봉된다. 일부 구현예에서, 상부 챔버는 유리 챔버이다. 일부 구현예에서, 상부 챔버는 플라스틱 챔버이다. 일부 구현예에서, 상부 챔버는 Boyden 챔버이다.
일부 구현예에서, 상부 챔버의 막은 기공 크기가 정의된 폴리카보네이트 막이다. 일부 구현예에서, 막은 기저막이다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 분석된 세포의 크기보다 작다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 약 1 내지 15 ㎛이다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 약 3 μm이다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 약 5 μm이다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 약 8 μm이다. 일부 구현예에서, 막의 평균 기공 크기는 약 12 μm이다.
일부 구현예에서 상부 챔버의 멤브레인은 사전 처리된다. 일부 구현예에서, 막은 세포 접착 및/또는 증식을 향상시키는 하나 이상의 화합물 또는 생체고분자로 사전 코팅된다. 일부 구현예에서, 막은 세포외 기질로 사전 코팅된다. 일부 구현예에서, 막은 콜라겐으로 사전 코팅된다. 일부 구현예에서, 막은 피브로넥틴으로 사전 코팅된다. 일부 구현예에서, 막은 라미닌으로 사전 코팅된다.
일부 구현예에서, 세포는 기초 세포 배양 배지를 포함하는 상부 챔버에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상부 챔버의 기초 세포 배양 배지에는 혈청이 없다. 세포 배양 배지의 비제한적 예에는 hMSC Media Booster XFM, hMSC High Performance Basal Media, Minimum Essential Medium Eagle(MEME), ADC-1, LPM(소 혈청 알부민 없음), F10(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ Medium(Fitton-Jackson 변형이 있거나 없음), StemPro, MSCGro, MesenCult, NutriStem, Basal Medium Eagle(얼(Earle) 염 염기를 첨가한 BME), Dulbecco's Modified Eagle Medium(혈청이 있거나 없는 DMEM), Yamane, IMEM-20, Glasgow Modification Eagle Medium(GMEM), Leibovitz L-15 Medium, McCoy's 5A Medium, Medium M199(얼 염 염기가 있는 M199E), Medium M199(행크(Hank) 염 염기가 있는 M199H), Minimum Essential Medium Alpha(MEM-알파), Minimum Essential Medium Eagle(얼 염 염기가 있는 MEM-E), Minimum Essential Medium Eagle(행크 염 염기가 있는 MEM-H) 및 Minimum Essential Medium Eagle(비-필수 아미노산이 있는 MEM-NAA)이 포함되며, 특히 수많은 것 중에, Medium 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153이 포함된다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 배지는 MEM-알파이다. 일부 구현예에서, 분석된 세포는 겔을 포함하는 상부 챔버에 첨가된다. 일부 구현예에서, 겔은 세포외 기질과 같은 바이오매트릭스를 포함한다.
일부 구현예에서, 상부 챔버는 하나 이상의 시험 시약/조성물을 포함하는 용기에 현탁된다. 일부 구현예에서, 상부 챔버 및 용기는 하나 이상의 시험 시약/조성물을 제외하고 동일한 조성을 포함한다. 다른 구현예에서, 상부 챔버 및 용기는 하나 이상의 시험 시약/조성물 외에 상이한 조성을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용기는 반응 용기이다. 일부 구현예에서, 용기는 다중-웰 플레이트의 웰이다. 일부 구현예에서, 용기는 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 48-웰 플레이트 또는 96-웰 플레이트와 같은 다중-웰 플레이트 내의 웰이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 시험 시약/조성물은 분석된 세포에 대한 화학유인물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 FN 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 조건 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 단백질과 같은 생체고분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 하나 이상의 활성 화합물의 제약 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 세포 이동 및/또는 증식을 촉진하는 능력에 대해 스크리닝된다.
일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 용기에만 존재하고 상부 챔버에서 제외된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 상부 챔버 및 용기 모두에 존재한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 상부 챔버로부터 용기를 향한 시험 시약/조성물의 증가하는 농도 구배가 존재한다.
일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 첨가되기 전에 농축된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 첨가되기 전에 희석된다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 첨가되기 전에 완충제 교환과 같은 정제를 거친다. 일부 구현예에서, 시험 시약/조성물은 첨가되기 전에 동결건조된다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 10~100 μg/mL 활성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 10~100 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 10~90 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 20~80 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 30~70 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 40~60 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 45 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 50 μg/mL 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기 내의 시험 시약/조성물은 약 55 μg/mL 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 상부 챔버에서 약 6 내지 72시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 12시간 내지 60시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 18시간 내지 48시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 이러한 범위 내의 임의의 적합한 값이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 6시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 18시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 24시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 30시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 36시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 42시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 48시간이다.
일부 구현예에서, 막을 통해 이동된 세포의 총 수는 염색(비색법(예: Calcein AM) 또는 형광법(예: 크리스탈 바이올렛))이 있거나 없는 물리적 계수(이미지 분석 소프트웨어)에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 막을 통해 이동된 세포의 총 수는 흡광도 또는 형광계 기반 방법에 의해 측정되어 세포 덩어리를 분광학적으로 정량화한다. 일부 구현예에서, 이동된 세포는 유세포 분석에 의해 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 안구 상처 치유를 유도하는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 동결건조된 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 안구 상처 치유를 유도하는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 동결건조된 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 동결건조된 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 동결건조된 FN 조성물은 본원에 제공된 트랜스웰 이동 검정에서 세포 증식을 유도한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FN 조성물은 트랜스웰 분석에서 세포 이동 및/또는 증식을 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 1배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 2배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 3배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 4배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 5배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 6배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 7배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 8배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 9배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 10% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 20% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 30% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 40% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 50% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 60% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 70% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 80% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 90% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 100% 이상 증가시킨다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 1배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 2배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 3배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 4배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 5배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 6배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 7배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 8배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 9배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 10배 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 10% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 20% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 30% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 40% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 50% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 60% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 70% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 80% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 90% 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 트랜스웰 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 100% 이상 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기 위해 적어도 30 μg/mL의 시험 시약/조성물이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기 위해 적어도 35 μg/mL의 시험 시약/조성물이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기 위해 적어도 40 μg/mL의 시험 시약/조성물이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기 위해 적어도 45 μg/mL의 시험 시약/조성물이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 트랜스웰 이동 검정에서 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기 위해 적어도 50 μg/mL의 시험 시약/조성물이 필요하다.
일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 FN 조성물에 관해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 FN 조성물이 프로-혈관형성이 아님을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 FN 조성물의 혈관형성 잠재력의 척도를 제공한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 항-혈관형성 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 항-혈관형성 성질이다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정은 항-혈관형성 신호 및 프로-혈관형성 신호의 비율을 제공한다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정에서 음성 결과는 항:프로 비율이 높은 것을 검증할 것이고, FN 조성물이 혈관신생을 촉진하지 않을 것을 입증할 것이다. 일부 구현예에서, 내피세포 관형성 검정에서 음성 결과는 항:프로 비율이 높은 것을 검증할 것이고, FN 조성물이 일반적으로 CNV(맥락막 혈관신생) 또는 혈관신생을 촉진하지 않을 것을 입증할 것이다. 일부 구현예에서, TGFb(TGFbeta 또는 TGFβ라고도 함) 유도 근섬유모세포 분화의 저해 검정은 세포 FN 조성물 상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, TGFb 유도 근섬유모세포 분화의 억제 검정은 세포 FN 조성물 상에서 수행되어 FN 조성물이 흉터형성을 예방하는 것을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성을 예방한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 반흔성 각막 혼탁을 예방한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 낮은 혈관형성을 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성을 지원하는 배지의 존재하에 혈관의 정상적인 형성을 손상 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 처리되지 않은 대조군과 비교할 때 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈청 포함하는 배지로 처리된 시료와 비교하여 혈관형성 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성 반응을 약화시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 무혈청 배지에 의해 유도된 혈관형성 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 세크레톰을 더한 혈청 포함하는 배지(혈관형성 반응의 감소 또는 없음)를 혈청 포함하는 배지(혈관형성 반응)와 비교할 때, 혈관형성 반응의 감소가 FN 조성물에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 세포 기반의 검정법에서 관형성에 의해 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈관형성 반응은 내피세포 관형성 검정에서 관형성에 의해 나타낸다.
분화/흉터형성:
일부 구현예에서, FN 조성물은 분화를 예방하고, 흉터형성을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성을 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성을 예방한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 다른 표준 치료와 비교하여 흉터형성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 분화를 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 근섬유모세포 분화를 예방 및/또는 손상시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 각막 투명도의 소실을 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 근섬유모세포 분화를 예방하고/거나 손상시킴으로써 각막 투명도의 소실을 감소시킨다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 분화에 관여하는 인자를 조절하는 FN 조성물의 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 TGFB2, 콜라겐 I, 콜라겐 III(정상적으로 분화 과정 동안 상향조절됨), TFGB3, MMP-2 및 MMP-9(정상적으로 분화 과정 동안 하향조절됨)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 분화에 관여하는 인자를 조절하는 FN 조성물의 능력을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 TGFB2, 콜라겐 I, 콜라겐 III(정상적으로 분화 과정 동안 상향조절됨), TFGB3, MMP-2 및 MMP-9(정상적으로 분화 과정 동안 하향조절됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 인자를 조절한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 정상 분화 과정 동안 상향 조절되는 인자의 감소를 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 정상 분화 과정 동안 하향 조절되는 인자의 증가를 유도한다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 SMA와 같은 인자의 발현 감소를 유도한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 FN 조성물 효능을 나타내는 SMA와 같은 인자의 발현 감소를 유도한다.
혈관신생:
일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 억제하거나, 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성을 예방하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관형성을 억제한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 고갈 검정을 사용하여 추가로 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 특정 인자가 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 예를 들어 TIMP1 및/또는 Serpin E1을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 인자가 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 TIMP1 및/또는 Serpin E1이 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 TIMP1이 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 Serpin E1이 고갈될 수 있다.
염증:
일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 능력에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 억제한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 시험관내 및/또는 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 능력을 결정하도록 특성화된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 시험관내 및/또는 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 생체내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키고, 또는 시험관내에서 작용한다. 일부 구현예에서, 조직 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 특성화하도록 채용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 조직 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 특성화하도록 채용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질소 머스타드 (NM) 가스 연소 모델은 시험관내에서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질소 머스타드 (NM) 가스 연소 모델은 시험관내에서 및 생체내 병태의 대용물로서 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 평가하도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, FN 조성물로의 치료 및/또는 이의 투여에 반응하여 사이토카인 프로파일이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 특이적 사이토카인의 수준이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8의 수준이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8 발현의 수준은 FN 조성물로 처리된 조직에서 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-8 발현의 수준은 FN 조성물로 처리된 조직에서 감소되고, 이것은 염증을 예방, 손상, 억제 및/또는 감소시키는 것을 나타낸다.
E. 치료 방법
본 개시는 또한 선택적으로 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 세포 FN 조성물과 같은 FN 조성물을 사용하여 치료하는 방법을 제공한다. 특히, FN 조성물은 안구 병태의 치료에 사용된다. 특히, FN 조성물은 안구 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 안구 질환은 안구 표면과 관련된다. 일부 구현예에서, 안구 질환은 손상된 안구 조직 및/또는 손상된 안구 조직 적응증과 관련된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 상처 치유의 가속화를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증 감소 및 이로 인한 성장 촉진을 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 표면에서 염증 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 각막에서 혈관신생의 감소를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 건조증의 치료(예를 들어, 상피세포가 손상된 곳을 포함하는 중증 안구 건조증의 치료를 포함함)를 포함한 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 손상된 안구 조직에 대한 무결성의 회복과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 손상된 안구 조직의 치유 가속화와 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 손상된 시신경 조직의 재생과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 망막 병태와 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 PCED와 연관된 손상된 시신경 조직의 재생과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 PCED와 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 표면에 대한 염증성 손상과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 예를 들어 GvHD 및/또는 쇼그렌 증후군과 같은 안구 병태의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 안구 병태는 망막 병태, 만성 이식편대숙주병(GvHD), 스티븐스-존슨 증후군, 안점막 유천포창, 지속성 각막 상피 결손(PCED), 안구 건조증, 안구 신경 조직 손상 및 눈의 진탕 손상(예: 진탕 손상, 안구 타박상 또는 화학적 화상)으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 상처 치유를 가속화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성의 감소에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증 감소에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 감소시켜 성장을 촉진하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 표면에서 염증을 감소하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 감소하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 각막에서 혈관신생을 감소하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 망막 상피세포 및 망막 신경절 세포의 보호 및 복구에 사용된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 섬유주망 재생의 유도 및 안압 감소에 사용된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 질환의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 FN 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 상처의 치유를 촉진하거나 유도하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 감소 및/또는 억제하고/거나, 흉터형성을 감소 및/또는 억제하고/거나, 시력을 증진 및/또는 보존하고/거나, 상처 봉합 속도를 증가시키기 위해(예: 상처 봉합 시간의 감소) 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 흉터형성을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 시력을 증진 및/또는 보존하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 더 신속한 상처 봉합을 촉진 및/또는 유도하기 위해(예: 상처 봉합에 필요한 시간의 감소) 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 시력 보존을 증진하기 위해 혈관신생 및 흉터형성을 예방, 감소 및/또는 억제하거나, 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 혈관신생을 예방, 감소 및/또는 억제하고, 시력 보존을 증진하기 위해 흉터형성을 감소시키기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 예방, 감소 및/또는 억제한다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 염증을 예방, 감소 및/또는 억제하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능장애의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 FN 조성물 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 진탕 손상에 이어진 시신경 변성의 외상성 손상의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상 및 눈에 대한 무딘 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 시신경의 외상성 손상의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 FN 조성물 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 눈의 진탕 손상에 이어진 시신경 변성을 개선하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 시신경 변성을 개선하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 FN 조성물 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상 및 눈에 대한 무딘 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 안구 타박상이다. 일부 구현예에서, 눈의 진탕 손상은 눈의 무딘 손상이다.
효능 판독은 예를 들어 삶의 질 향상을 포함한 증상의 감소 및/또는 질환 상태의 감소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%로 증상의 감소 및/또는 질환 상태의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%로 염증의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%로 흉터형성의 감소는 치료적 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%로 혈관신생의 감소는 치료적 효능을 나타낸다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 안구 질환 또는 안구 병태이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 안구 구조에 대한 외상성 손상에 이어진 시각 기능장애이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 눈의 진탕(예: 무딘 또는 무디지 않음) 손상이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 눈에 대한 화학적 화상을 포함한 화상이다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 특정한 표적화 영역에 투여된다. 일부 구현예에서, 특정한 표적화 영역은 눈이다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 다른 주변 영역으로 퍼지지 않도록 제형화된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 다른 주변 영역으로 퍼지지 않도록 제형화된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 특정한 표적화 영역에 투여되고, 적어도 1시간, 적어도 약 2분, 적어도 약 3분, 적어도 약 4분, 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분, 적어도 약 60분, 적어도 약 70분, 적어도 약 80분, 적어도 약 90분 또는 적어도 약 2시간 동안 표적화 영역에 체류하도록 제형화된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 상처 또는 손상 직후에 환부에 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 96시간 이내에 환부에 투여된다.
일부 구현예에서, FN 조성물은 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 FN 조성물은 결막하 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 초효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 매일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 및/또는 6회 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, FN 조성물은 매일 한 방울 또는 1회 투여로 치료적 효능을 허용한다. 일부 구현예에서, 한 방울은 매일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 3회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 5회 투여된다. 일부 구현예에서, 한 방울은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 동안 매일 적어도 6회 투여된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 낮은 수준의 VEGF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 1 pg/mL 내지 400 pg/mL의 VEGF를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물의 pH는 약 4.7 내지 약 7.5이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및 구연산/인산이나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액 시스템에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 긴장성 변형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 긴장성 변형제는 NaCl, KCl, 만니톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 일/이 인산나트륨, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 2가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 인산이나트륨/구연산, 만니톨 및 트레할로스를 추가로 포함하고, 여기서 조성물의 pH는 약 6.4이다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 접착제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 생체이물 성분, 페놀 레드, 펩티드 및 생체분자 < 3kDa, 항생제, 단백질 응집체 > 200 nm, 세포, 비-엑소좀/비-세포외 소포 세포 잔재물, 호르몬 및 L-글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 FN 조성물은 항-혈관신생 또는 항-흉터형성 인자를 포함한다.
F. 키트
키트는 본원에 기재된 바와 같이 용기 내의 FN 조성물 또는 FN 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한 용기 내의 조건화 배지 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 안구 치료에 사용되는 용액을 제조하도록 혼합하기 위한 구성요소 및 혼합과 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
용기는 적어도 하나의 바이알, 웰, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기, 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있으며, 용기 내의 FN 조성물 또는 FN 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한 조건화 배지를 포함하고, 일부 경우에, 적합하게 분취될 수 있다. 추가적인 구성요소가 제공되는 곳에서, 키트는 이 구성 요소를 둘 수 있는 추가적인 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 주사 또는 취입 성형되는 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 용기 및/또는 키트는 사용 설명서 및/또는 경고가 있는 라벨을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 구현예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, Genbank 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고문헌으로 명시적으로 통합된다.
본 발명은 FN 조성물을 특성화하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 포함하는 키트를 제공할 수 있고, 패널은 적어도 2가지 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 및/또는 검정법의 패널은 본원에 기재된 바와 같은 FN 조성물을 확인한다.
또한, 본 발명은 FN 조성물 로트 사이에 일관성을 결정하는 테스트 및/또는 검정법의 패널을 포함하는 키트를 제공할 수 있고, 패널은 하나 이상의 특성화 검정법을 포함하며, 특성화 검정법은 물리적 성분 특성화, 산화적 스트레스 검정, 안전성 분석, 안정성 검정, 증식 검정, 이동 검정, 혈관신생 검정, 분화/흉터형성 검정, 염증 검정 및/또는 상피 장벽 무결성 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 및/또는 검정법의 패널은 본원에 기재된 바와 같은 세포 FN 조성물을 확인한다.
실시예
실시예 1: 피브로넥틴 특성화
FN은 처음에 질량 분석(Mass Spec)을 통해 MSC 세크레톰에서 확인되었으며 이후 ELISA를 통해 정량화되었다.
FN은 조건화 배지(즉, 세포에서 직접 수확된 배지)에서 0.5 내지 50 ng/mL의 농도로 검출되었다.
세포 기반 시험관내 검정 결과는 다음과 같다:
FN 고갈은 상처 봉합을 상당히 손상시켰다(스크래치 상처 검정)
MSC 세크레톰의 첨가는 HCEC의 부착 및 확산을 촉진하고; FN 고갈은 HCEC의 부착과 확산을 손상하고; 외인성 FN 추가는 HCEC의 부착 및 확산을 촉진했다.
외인성 피브로넥틴의 첨가는 HCEC 트랜스웰 이동을 촉진하고; FN 고갈은 HCEC 트랜스웰 이동을 손상했다.
피브로넥틴은 인간 각막 상피 세포 이동을 자극한다.
외인성 재조합 인간 피브로넥틴(1 ug/mL)의 첨가는 음성 대조군(무혈청 배지)에 비해 36시간 후 트랜스웰 막을 통한 세포의 상당한 이동을 자극한다. Gentian Violet으로 염색된 트랜스웰 이동 삽입물의 바닥면이 묘사되어 있다(도 2).
피브로넥틴이 고갈되면 인간 각막 상피 세포의 이동이 손상된다.
피브로넥틴에 대해 면역이 고갈된 MSC 세크레톰은 트랜스웰 이동 검정에서 MSC 세크레톰 단독에 비해 손상된 이동을 나타낸다. Gentian Violet으로 염색된 트랜스웰 이동 삽입물의 바닥면이 묘사되어 있다(도 3).
피브로넥틴이 고갈되면 시험관내 상처 봉합에서 인간 각막 상피 세포가 손상된다.
피브로넥틴에 대해 면역이 고갈된 MSC 세크레톰은 트랜스웰 이동 검정에서 MSC 세크레톰 단독에 비해 상처 간극으로의 세포 이동 장애를 나타낸다. 24시간 후, MSC 세크레톰 처리 세포는 FN이 고갈된 MSC 세크레톰 처리 상처의 16±1.9% 봉합과 비교하여 30±1.2% 봉합을 나타냈다(도 4).
실시예 2: 피브로넥틴은 성장 인자와 결합되어 있다
피브로넥틴은 항-피브로넥틴 포획 항체를 사용하여 MSC 세크레톰에서 면역 고갈되었고 단백질 G 접합 자기 비드를 사용하여 풀다운(pull down) 되었다.
용액 내 분획과 비드 분획을 ELISA를 통해 HGF에 대해 검정했다. 비드를 PBS로 3회 세척하고 100 uL PBS에 재현탁한 후 80℃에서 10분간 가열했다. 그런 다음 재조합 HGF를 사용하여 ELISA로 측정한 대로 샘플을 희석하여 표준 곡선을 생성했다. HGF 검정 결과(pg/mL)는 도 5를 참조한다.
실시예 3: MSC 세크레톰에는 세포 피브로넥틴이 함유되어 있다
MSC 세크레톰은 면역학적 검정을 사용하여 분석되었다. 결과는 EDA+ 및 EDB+ 피브로넥틴 스플라이싱 변이체의 검출에 의해 입증된 바와 같이 MSC 세크레톰에 세포성 피브로넥틴이 함유되어 있음을 나타낸다.
세크레톰에서 피브로넥틴의 특성화
MSC로부터 분리된 세크레톰은 EDA 서열, EDB+ 피브로넥틴 및 일반 피브로넥틴(FN)에 특이적인 항체를 사용하여 면역블로팅에 의해 평가되었다. 항-EDA 및 항-EDB 항체는 둘 다 피브로넥틴과 교차반응하여 세크레톰에 존재하는 종이 세포 피브로넥틴임을 나타낸다(도 6).
샌드위치 ELISA를 사용한 세포 EDA+ 피브로넥틴 검출
EDA+ 피브로넥틴에 대한 ELISA 표준 곡선(빈 원)은 재조합 세포 피브로넥틴 및 EDA 서열에 특이적인 포획 항체를 사용하여 확립되었다. 표준 곡선을 생성하는 데 사용된 재조합 피브로넥틴에는 항-EDA 항체를 생성하기 위해 면역원으로 사용된 EDA 서열이 포함되어 있다. MSC 세크레톰은 EDA 샌드위치 ELISA에서 검정되었으며 세포 피브로넥틴이 쉽게 검출되었다(파란색 점) (도 7).

Claims (34)

  1. 피브로넥틴(FN)을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 FN은 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 FN인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 FN은 MSC 분비 FN인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FN은 세포 FN인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 FN은 세포 유래 FN이고, 상기 FN은 하나 이상의 성장 인자에 비공유적으로 부착되는, 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 세포 FN은 EDA+ 및/또는 EDB+인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FN은 조건화 배지(conditioned medium)로부터 획득되는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조건화 배지는 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 획득되는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 MSC 세크레톰을 포함하는, 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 MSC는 골수로부터 유래되는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FN은 FGF(예: FGF-2), PDGF, HGF, VEGF, TGFβ1, TGFβ2, IGF-1, IGF-2, NGF, 뉴로트로핀 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자에 비공유적으로 부착되는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FN의 농도는 약 0.5 내지 50 ng/mL인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 FN의 농도는 약 25 ng/mL인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 약 0.1 ng/mL PDGF를 추가로 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 0.3 내지 4.5 ng/mL HGF를 추가로 포함하는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 1 pg/mL 내지 400 pg/mL VEGF를 추가로 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    긴장성 개질제(tonicity modifying agent)를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 긴장성 개질제는 NaCl, KCl, 만니톨, 포도당, 자당, 소르비톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 0.5 내지 50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 10 내지 12 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 11 내지 13 mg/mL 만니톨, 2 내지 25 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5 내지 2 mg/mL 하이프로멜로스(Hypromellose)를 포함하는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 0.5 내지 50 ng/mL FN, 2.28 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 11.45 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 12.2 mg/mL 만니톨, 24 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 1 mg/mL 하이프로멜로스를 포함하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 0.5 내지 50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 4.5 내지 7 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 5.5 내지 7.5 mg/mL 만니톨, 11 내지 13 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.1 내지 1.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 0.5 내지 50 ng/mL FN, 1.31 mg/mL 일염기성 인산나트륨, 5.73 mg/mL 이염기성 인산나트륨, 6.1 mg/mL 만니톨, 12 mg/mL 트레할로스 이수화물 및 0.5 mg/mL 하이프로멜로스를 포함하는, 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 NaCl 및/또는 MgCl2를 포함하지 않는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따르는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 상기 대상체의 안구 병태 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 안구 병태는 망막 병태, 만성 이식편대숙주병(GvHD), 스티븐스-존슨 증후군, 안점막 유천포창, 지속성 각막 상피 결손(PCED), 안구 건조증, 안구 신경 조직 손상 및 눈의 진탕 손상(예: 진탕 손상, 안구 타박상 또는 화학적 화상)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 제21항 또는 제22항의 방법에 따라 치료가 필요한 대상체의 안구 병태를 치료하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 줄기세포를 세포 배양 배지에서 배양하여, 상기 줄기에서 분비되는 인자를 포함하는 조건화 배지를 생성하는 단계;
    (b) 상기 조건화 배지를 수확하여 수확된 조건화 배지를 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 수확된 조건화 배지를 여과하여 처리된 조건화 배지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 방법은 상기 처리된 조건화 배지를 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 처리된 조건화 배지는 완충용액(formulation buffer)으로 완충액 교환을 추가로 거치는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 완충용액은 인산이/일나트륨, 구연산나트륨/구연산, 붕산/구연산나트륨, 붕산/사붕산나트륨 및 구연산/인산이나트륨 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)인, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지는 무혈청인, 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 단계 (a) 이전에,
    (i) 상기 줄기세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 성장 배지를 상기 단계 (a)의 세포 배양 배지로 교체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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