CN103767985A - 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源血液或间充质干细胞分泌 exosome 的制备与应用。其过程为：从健康人体的血液或者干细胞培养上清液中提取间充质干细胞，经过体外培养、扩增，并利用低温分离、纯化等手段制备得到高纯度、高生物活性的exosome。本发明所述的血液或间充质干细胞分泌的exosome按照比例加入到医药、保健品、化妆品中，开发成具有生物活性功能的产品，可以有效调控机体细胞信号转导，激活细胞再生，增强健康细胞增殖、分化能力，进而调整生理性修复或者清除机体损伤，病变和衰老的细胞，从根本上改变机体的生理功能； 通过调节细胞免疫，进而有抗肿瘤疗效。该血液或间充质干细胞分泌的exosome应用于医学、保健和美容领域，具有广泛的应用前景。

Description

人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从健康人体的血液或者干细胞培养上清液中提取间充质干细胞，经过体外分离，从血清或培养液上清中提取获得具有生物活性的exosome并应用。

背景技术

Exosome是一种由细胞分泌的纳米量级的膜性小囊泡，50年前首次发现由绵羊的网状细胞（reticulocytes）分泌，现已证实可以由多种细胞分泌，如：B细胞、树突细胞、肥大细胞、T细胞、血小板细胞、施旺氏细胞、肿瘤细胞、精细胞等。尿液和血浆等多种体液中也发现exosome的存在。

Exosome具有特定的生物物理和生物化学特性。其直径为40-100纳米，蔗糖密度为1.13-1.19克/毫升，可以在100,000g的离心力下沉淀。不同细胞来源的Exosome所含有具体成分不同，一般而言，它含有以下几种物质：MHC I类和（或）II类分子、热休克蛋白、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白及生物酶类。

Exosome内各成分的特性决定了exosome可以执行不同的生理功能。Exosome富含胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、蛋白质、RNA等生物活性因子，这些生物活性因子可以有效调控机体细胞信号转导，进而生理性修复或者清除机体损伤，病变和衰老的细胞。Exosome的生理功能最初由Raposo G于1996年研究调节免疫通信时发现，由抗原呈递细胞（APC）分泌，具有转运MHC抗原呈递复合物的作用。这项发现也提供了exosome可用于疾病治疗的理论依据。随后的研究发现了exosome更多的治疗潜力。例如，exosome可以抑制肿瘤的生长；exosome可防止急性心肌梗塞和急性肾小管损伤等。近年来研究发现exosome与神经元的通信或发病机制有关。由神经元、星形胶质细胞和神经胶质细胞释放的exosome可清除不需要的应激蛋白和阻止淀粉样蛋白原纤维的形成，从而减轻阿尔茨海默氏综合Exosome的旁分泌作用，使其作为替代传统的间充质干细胞(MSC)成为再生医学治疗中应用的新技术成为可能。近年来，由各种干细胞所分泌的exosome在修复各种组织损伤方面的应用得到了广泛的研究。Exosome中含有大量的生长因子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板增殖因子（PDFG）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和肿瘤生长因子（TGF-β）等，具有抑制细胞凋亡和纤维化，促进血管发生和有丝分裂，介导免疫反应的作用。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的exosome治疗急性肾损伤时，exosome所含有的胰岛素样生长因子（IGF-1）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）扮演了关键性的角色。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的exosome脂膜表面表达有多种膜蛋白，包括凝血因子（TF），肿瘤坏死因子（TNF），MHC I类和II类分子以及CCR5趋化因子受体等，^， 。通过这些表面分子，间充质干细胞可以调控T淋巴细胞，树突细胞，天然杀伤细胞等免疫细胞的活性，从而起到抵抗炎症的作用。

    除了可以减轻细胞移植的风险，exosome作为一种双脂质膜囊泡，还有能力将小的可溶性生物因子如生长因子，趋化因子，细胞因子，转录因子，基因和RNA等转运到正确的靶细胞，同时保持这些因子的稳定性、完整性和生物效价，防止被酶或化学品所分解。实验表明，由MSC分泌的exosome，脂膜结构完整时可以保护所包裹的蛋白质和RNA不被胰蛋白酶和RNA酶降解；由MSC分泌的exosome可以在-20℃条件下存储6个月而不会降低其心脏保护作用^, 。最近有科学家利用这一特性发明了用exosome作为载体向脑部运送siRNA的治疗方法。

    此外，由于exosome与一些疾病的病理生理密切相关，因此可作为检测一些疾病的方法。研究报道，血液中exosome的miRNA的可以用来指示和诊断卵巢癌；尿液中exosome的蛋白质可以作为反映急性肾损伤的诊断标志物。

    因此，利用exosome调控机体细胞通信，进而激活自身细胞生理性修复或清除机体损伤，病变及衰老的细胞， 在疾病防止与美容保健领域具有广阔的应用前景。但exosome的体积小，密度低，提取过程繁杂、产量也低，从而制约了对exosome的进一步研究和应用。

鉴于上，我们研究开发从健康人体液或干细胞培养液上清中提取exosome，并在储存中保持其生理活性的方法，利用这种生物活性物质激活人体自身细胞来生理性修复或替代集体损伤，病变和衰老的组织细胞。

发明内容

本发明的目的是：1、提供可以活化机体细胞的exosome；2、提供可以活化机体细胞的exosome的制备方法；3、提供可以活化机体细胞的exosome的用途。

    本发明的技术方案如下：

    从健康人体的脐带或胎盘组织中提取干细胞，利用无血清间充质干细胞培养基（不含动物源成分）进行体外培养，扩增，收集在培养过程中细胞培养上清液。或者从健康人体的血液中提取血清。利用差速离心的技术去除上清液或者血清中的杂质，最后用超速分离等现代生物技术手段取得高纯度的含有丰富生物活性因子的exosome。

    整个过程要求无细菌，真菌，病毒，衣原体和支原体等污染。

    利用上述发明获得的exosome富含胆固醇，鞘磷脂，神经酰胺，蛋白质和RNA等生物活性因子，可以调控机体细胞间信号转导，激活自身细胞生理性修复或清除机体损伤，病变及衰老的细胞，提高机体的免疫力和抗衰老作用。该exosome可制成针剂，涂剂，膏剂，霜剂或粉剂等，在医学，保健和美容领域具有良好的应用前景。

    本发明具有明显的优势：第一，产品纯度高，exosome不含有普通细胞提取产品可能含有的有毒的细胞因子，避免了潜在的安全隐患；第二，生物活性高，更易于被吸收，exosome通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子生物因子（如蛋白质，RNA）被细胞的磷脂双分子膜所阻挡，不容易被细胞吸收的问题；第三，具有较高的生物稳定性，易于保存和运输，exosome可在-20℃条件下存储6个月而不会降解，并且其脂膜结构可以保护所包含的蛋白质和核酸的稳定性，避免生物因子被体内外的酶和化学物质降解。

附图说明

我们已成功的从人体心肌细胞中提纯出exosome见图1.  

A): 经免疫印迹（Westernblot）分析exosome的分子生物学特征；B1-2): 经生物分析仪分析监定出我们分离的（exosome）为高纯度；C): 电子顯微镜镜下顯示exosome超微结构。 

参考文献

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具体实施方式

   实施例1，血清中exosome的提取。人体血液来源广泛，并含有大量的exosome。从健康人的血液中分离去除血细胞和纤维蛋白原，得到血清。利用差速离心的技术去除血清中的细胞碎片和杂质，然后在低温下超速离心血清，去除上清，所得沉淀即为exosome，重悬于PBS中保存于-20℃。具体过程如下：

    采集健康人体血液，离心去除血液中的血细胞和纤维蛋白原，获得血清，血清应为淡黄色液体。

1. 用等量的磷酸缓冲液（PBS）稀释血清。

2. 800g离心血清10分钟，保留上清，弃沉淀，去除血清中的细胞

3. 2000g离心10分钟，保留上清，弃沉淀，去除血清中的死细胞

4. 10000g离心30分钟，保留上清，弃沉淀，去除血清中的细胞碎片

5. 100000g离心70分钟，保留沉淀，弃上清，上清中含有exosome和杂蛋白

6. 用PBS溶液重悬沉淀，杂蛋白溶解于PBS溶液

7. 100000g离心70分钟，保留沉淀，弃上清，上清中成分即为纯化的exosome

8. 重复一次以上清洗杂蛋白步骤

以上所有步骤均需要在4℃下，使用低温离心机完成

9． 将纯化所得的exosome低温保存于-20℃冰箱，或长期保存于-80℃冰箱中。

实施例2，细胞培养上清液中exosome的提取。以人间充质干细胞（MSC）为例，人间充质干细胞来源于健康人体的骨髓、胎盘和脐带组织中，可以在体外条件下稳定培养，细胞活性强，分泌旺盛，其细胞培养上清液中含有大量的exosome。同时，间充质干细胞分泌的exosome来源单一稳定，并且可以使用现代生物技术手段转染表达需要的蛋白，可操控性强。

1. 从健康人体的骨髓，胎盘或脐带血分离间充质干细胞，用无动物源成分的合成培养基培养。

2. 收集细胞培养过程中的更换的培养上清液，-20℃冷冻保存。

3. 将细胞培养过程中收集的上清液融化，混合，800g离心10分钟，保留上清，弃沉淀，去除培养液上清中的细胞

4. 2000g离心10分钟，保留上清，弃沉淀，去除培养液上清中的死细胞

5. 10000g离心30分钟，保留上清，弃沉淀，去除培养液上清中的细胞碎片

6. 100000g离心70分钟，保留沉淀，弃上清，上清中含有exosome和杂蛋白

7. 用PBS溶液重悬沉淀，杂蛋白溶解于PBS溶液

8. 100000g离心70分钟，保留沉淀，弃上清，上清中成分即为纯化的exosome

9. 重复一遍以上清洗杂蛋白步骤

以上所有步骤均需要在4℃下，使用低温离心机完成

10. 将纯化所得的exosome低温保存于-20℃冰箱，或长期保存于-80℃冰箱中。

实施例3，免疫吸附法纯化细胞培养上清液中的exosome。此方法利用抗原抗体反应，通过吸附exosome表面的特异性抗原来达到纯化的目的，具有方法快捷，纯度高和易于进行后续的生化分析的优点，但是成本较高。

1. 同实施例2中方法，获得细胞培养上清液

2. 4℃低温条件下下以2000g离心10分钟，保留上清液，去除沉淀中的细胞碎片。

3. 用PBS清洗抗体包被的磁珠(antibody-coated Dynabeads）

4. 用磁铁沉淀清洗后的磁珠，弃除所有上清液

5. 将获得的磁珠和步骤2中获得的上清液混合均匀，4℃低温下孵育24小时

6. 用磁铁收集已经吸附有exosome的磁珠

7. 用PBS清洗获得的磁珠，重复三次去除可能残留的蛋白和杂质

8. 以上获得的样品低温保存于-20℃冰箱，或长期保存在-80℃冰箱中，用于生化分析。

实施例4 、纯化的exosome的生物活性验证

将纯化的所得exosome配置成15 微克/毫升浓度，加入培养基中，利用此培养基培养正常传代至第8 代的骨髓、脐带或胎盘间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3 天收集细胞，与对照组相比，添加exosome的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。

实施例5，exosome在医疗领域中的应用

将纯化后的exosome按照1:100~1:1000比例稀释加入皮肤外用敷料或者皮肤外用药方中，可以激活细胞再生，显著促进伤口的愈合。特别是在治疗难愈的浅表组织创伤方面，如烧伤，褥疮，体表炎症以及糖尿病和手术导致的伤口不愈等，具有明显的疗效。

    对于心肌梗塞，肾损伤、各部位肿瘤疾病等，将纯化后的exosome按照1:100 ~ 1:500比例稀释制成注射液，进行病灶部位局部注射，可活化靶组织，促进靶组织新陈代谢，增强健康细胞增殖、分化能力，修复或清除衰老，死亡或肿瘤化的细胞，从根本上改变病灶的生理状况。

实施例6，exosome在保健和美容领域中的应用

将纯化的exosome按1：100 ~  1：1000比例稀释加入注射液中制成保健品，进行静脉注射，可活化机体干细胞，修复或清除受损与衰老的细胞，改善新陈代谢，提高机体抵抗力，延缓衰老，减缓肿瘤细胞的增殖。

将纯化的exosome以100 ~ 200 微克/毫升加入到护肤品或沐浴液中，外用于皮肤，可活化皮肤干细胞，促进皮肤细胞增殖、分化，修复或清除衰老的皮肤细胞，从根本上改变皮肤的生理机能。

将纯化的exosome以20 ~ 40 微克/毫升加入到眼药水中，外用于眼部，可活化眼角膜细胞，修复或清除衰老的角质细胞，从根本上改变角膜的生理机能。

Claims (6)

1.人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用，其特征是血液或间充质干细胞分泌的exosome通过以下方法制得：1）采集血液→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度血清含有的exosome；2）提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度干细胞分泌的exosome；3) 提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→低温离心、免疫吸附法纯化→获得高纯度间充质干细胞分泌的exosome，其两者应用领域为医学、保健和美容。

2. 根据权利1要求所述的血液，其特征是来源于健康人体。

3. 根据权利1要求所述的血液分泌的exosome，其特征是健康人体血液经差速离心分离、低温超速纯化获得。

4. 根据权利1要求所述的间充质干细胞，其特征是来源于健康人体的骨髓、胎盘和脐带组织，经体外培养获得。

5. 根据权利1要求所述的间充质干细胞，其特征是体外培养、扩增所用的特定培养基为无血清间充质干细胞培养基（不含动物源成分）。

6. 根据权利1要求所述的血液或间充质干细胞分泌的exosome应用于医学、保健和美容领域，其特征是按照比例加入到医药、保健品、化妆品中，可以有效调控机体细胞信号转导，激活细胞再生，增强健康细胞增殖、分化能力，进而调整生理性修复或者清除机体损伤，病变和衰老的细胞，从根本上改变机体的生理功能； 通过调节细胞免疫，进而有抗肿瘤疗效。