CN110191714A - 制备用于毛发生长的组合物的方法，该组合物包含从引入了nanog的羊水中胎儿衍生间充质干细胞获得的外泌体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于毛发生长的组合物及其制备方法，是通过从过量表达去分化因子Nanog的胎儿来源间充质干细胞在羊水中的培养物中分离外泌体而进行制备的。

Description

制备用于毛发生长的组合物的方法，该组合物包含从引入了 NANOG的羊水中胎儿衍生间充质干细胞获得的外泌体
【技术领域】
本发明涉及一种促进毛发生长的组合物和制备该组合物的方法，其从间充质干细胞的培养液中分离外泌体，所述间充质干细胞是羊水中胎儿来源的、过表达再编程因子Nanog的细胞。
【背景技术】
干细胞是指在体内特征条件和环境下或根据细胞自身的需要程度具有无限自我更新能力、并具有分化成体内所需的特定细胞和组织的能力的细胞。有三种类型的干细胞：从早期胚胎中分离的胚胎干细胞(ES细胞)，从胚胎期的原始生殖细胞中分离的胚胎生殖细胞(EG细胞)，以及从成体骨髓中分离的多能成体祖细胞(MAPC细胞)。
在这些干细胞中，作为成体干细胞众所周知的间充质干细胞已经在临床上被多方面地用作细胞治疗剂和培养液治疗剂，并且其效果也已在很大程度上得到证实。已经证实，这种间充质干细胞可以从各种身体组织中分离，并且这些细胞尤其可以在骨髓、脂肪、脐带血、羊水等中鉴定。众所周知，这些细胞的性质和特征在很大程度上是相同的，并且其作为治疗剂的可获得性(availability)也相似或相同。
在这些细胞中，羊水来源的间充质干细胞具有多种优点，因此在研究和商业可获得性方面具有优异的价值。羊水来源的间充质干细胞可以从母体羊水中分离出来并在体外培养，而羊水可以很容易地从孕妇身上获得。此外，羊水用于检查有关胎儿健康的各种信息。它可以在患者同意后用于研究目的，而获取羊水的方法也非常简单，使得它可以在获得的当天就进行体外培养。由于这些优点，使用羊水来源的间充质干细胞作为治疗剂可以确定是合理的。
人类头发在所需部位维持一定数量的毛发。头发有独特的生长周期，称为头发周期，包括：生长期→退化期→休止期→脱落期。这种机制受到控制，使得位于发根附近的真皮乳头细胞向周围细胞传递信号，这些细胞接收生长因子，并且有不少这样的细胞本身在毛发生长中起主要作用。当脱发进展时，真皮乳头变小，这导致头发厚度减小，且头发周期也缩短，新生长的头发变薄。随着该过程进展，秃发进展，头发变成蓬松的头发，头发生长周期变短，故头发在稍微生长后脱落。秃顶的主要原因是遗传，也有人报道雄性激素睾酮抑制真皮乳头细胞的生长从而诱导脱发。除了这些体内原因之外，多种环境因素引起脱发。具体地，已知与老化相关的脱发是由于头皮细胞减少和头皮脂肪累积增加以及随后为毛囊组织提供营养的问题而导致的对毛囊组织的氧供应不足引起的。此外，还有许多意见认为外部因素如压力，不规律的生活方式，环境污染等可能导致脱发。
一方面秃顶或脱发者情绪极痛苦，另一方面已经开发并且目前可商购的大多数生发剂只有暂时或有限的效果，因此不能充分满足用户的需要。一种适用的生发剂，米诺地尔(minoxidil)，已被证明在某种程度上有效并且目前在使用，还有一种口服生发剂，Propecia，其含有非那甾胺(finasteride)作为活性成分，它们都被广泛用作具有优异防脱发效果的药剂，分别由于血管舒张和由于对雄性激素活化作用的抑制。然而，上述生发剂在一定程度上有效防止脱发，但对毛发生长没有显著影响。也就是说，当停止使用这些生发剂时，脱发再次发生，并且长期使用时副作用和成本增加也是很大问题，因此大多数患者放弃治疗。
因此，本发明的发明人从羊水中胎儿来源间充质干细胞分离的条件培养基中分离并获得了外泌体单元，其通过引入Nanog促进细胞生长和延长细胞寿命，本发明还评价了其对毛发生长的影响，并选择了其主要因素。
[引用的文献]
[专利文献]
韩国专利申请2013-0116972
韩国专利1422559
【发明内容】
【技术问题】
本发明的一个目的是提供一种生产外泌体的方法，该外泌体包括由羊水中来自胎儿的过量表达Nanog的间充质干细胞产生的人生长因子。
本发明的另一个目的是提供一种促进毛发生长的组合物，其包括作为活性成分的外泌体，所述外泌体包括由羊水中的胎儿衍生的过量表达Nanog的间充质干细胞产生的人生长因子，本发明还涉及其的化妆品或药物组合物。
【技术方案】
根据本发明的一个方面，提供了一种产生来自间充质干细胞的外泌体的方法，包括：
(a)从孕妇获得的羊水中分离胎儿来源的细胞；
(b)在含有胎牛血清(FBS)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中对分离的胎儿来源的细胞进行再培养，以获得羊水中胎儿来源的间充质干细胞；
(c)将Nanog引入羊水中胎儿来源的间充质干细胞，以获得羊水中胎儿来源的Nanog过表达间充质干细胞；
(d)将得自羊水中的胎儿来源的Nanog过表达间充质干细胞培养1天至5天，以制得条件培养基；和
(e)从该条件培养基中分离出外泌体。
本文所用术语“间充质干细胞(MSC)”是指骨、软骨、脂肪、骨髓基质、肌肉、神经等的发源细胞，以及通常保留在成人骨髓中的细胞，也可见于脐带血、外周血、其他组织等等，并且可以从它们中获得。由于从孕妇获得的羊水含有产自胎体的各种化学物质，因此可以产生人体的大多数细胞，并且其取样相对容易。此外，已证实羊水中有多种异源细胞，并且在这些细胞中，有与成纤维细胞相同形状的同源MSC，这是MSC的一个特征。
本文所用的术语“Nanog”是再编程因子，源于“再编程”，这是Yama naka教授及其团队于2006年提出的概念。所有成体组织在正常发育过程中逐渐在未分化状态下变得分化，成为功能特化的细胞。这些细胞中，受精卵的细胞是全能的，随着后续发育过程的进行，细胞变成胚泡，可分为内细胞团和外部细胞。在这种情况下，内细胞团可以产生胚胎体细胞和生殖细胞，这被称为多能性。胚胎干细胞表现出特异于多能性的基因表达模式，其实例包括Oct4，Sox2，Nanog，Lin28等。再编程可以是一种如下的技术，其包括在体细胞中诱导这种特异的基因表达、从而使细胞具有类似于胚胎干细胞的性质。Nanog是已用于一系列研究中的多种因子之一，本发明的研究人员利用Nanog作为借助病毒载体将基因导入细胞来诱导过表达的技术。
本文所用的术语“培养基”是指能够在体外维持羊水中胎儿来源的细胞的生长和存活的培养基，并且包括本领域常用的所有培养基，其适于培养来自羊水中胎儿的细胞。可以根据细胞类型选择培养基和培养条件。培养中使用的培养基优选为细胞培养极限培养基(CCMM)，通常包括碳源、氮源和微量元素。CCMM的实例包括但不限于Dulbecco's ModifiedEagle's Medium(DMEM),Minimal Essential Medium(MEM),Basal Medium Eagle(BME),RPMI1640,F-10,F-12,αMinimal Essential Medium(αMEM),Glasgow's MinimalEssential Medium(GMEM),和Iscove's Modified Dulbecco's Med ium(IMEM)。另外，CCMM可含抗生素，如青霉素、链霉素、庆大霉素等。
在本发明中，源自羊水中胎儿的MSC可以通过在含有FBS和bFGF的基础培养基中培养从羊水分离的细胞来获得，并且优选地，可以通过在含10％FBS、并补充有4ng/ml bFGF、5ng/ml硒和50μg/ml抗坏血酸的低葡萄糖DMEM中培养细胞来获得。在本发明的一个示例性实施方案中，低葡萄糖DMEM可进一步包含10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素，以及含有4ng/ml bFGF、5ng/ml硒、和50μg/ml抗坏血酸的溶液。
在步骤(c)中，Nanog的引入可以使用逆转录病毒载体进行。
更具体地，在步骤(d)中，条件培养基可以通过将步骤(c)所得MSC在无血清培养基中培养3天来制备。
特别地，本发明提供了通过在合适培养基中对引入了Nanog的胎儿来源MSC进行培养，以合成Apo-1/Fas，表皮生长因子(EGF)，干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)，瘦素，MIP4，MMP3，Rantes，干扰素-γ(IFNγ)，人转化生长因子-β(TGF-β)，肿瘤坏死因子-α(TNFα)，肿瘤坏死因子受体Ⅰ(TNFRⅠ)，肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)，血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，血管内皮生长因子(VEGF)，白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-7，IL-8，IL-12，IL-15等，更优选地，促进毛发生长的生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)-AA，Wnt7a等。各种成分可以用源自羊水中胎儿的MSC的条件培养基通过酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定，并且可以在体外确认。
在本发明中，为了获得胎儿来源MSC的条件培养基，可以在含有DMEM营养混合溶液的无血清培养基中培养从羊水中分离的MSC，所述DMEM营养混合溶液包含多种氨基酸或其类似物和多种维生素及其类似物。在这方面，可以添加诸如L-谷氨酰胺等氧化营养素，诸如丙酮酸钠等能量代谢物，以及诸如碳酸氢钠等碳控制源。混合溶液是通过以一定比例混合各种矿物质和氨基酸、基于维生素的营养物、以及其他因子而制备的，这些矿物质和氨基酸有助于维持细胞的生长和稳态，促进细胞在初始培养MSCs后的再培养中的稳定性和停留，这些基于维生素的营养素能促进胎儿来源MSCs分泌的生长因子的生成。
本文所用术语“条件培养基(conditioned medium)”是指，通过对细胞进行液体悬浮培养，当细胞达到指数期(即细胞分裂黄金期)时，通过离心或过滤除去分裂的细胞，仅收集培养液，并将培养液与培养基质混合，而制备的培养基。这种培养基利用了从培养基中正在分裂的细胞提取的未知生长因子，并且这种培养基广泛用于低密度细胞铺板或原生质体培养。
本发明的条件培养基大量含有衍生自胎儿来源MSC的生长因子等物质，优选包括Apo-1/Fas，表皮生长因子(EGF)，干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)，瘦素，MIP4，MMP3，Rantes，干扰素-γ(IFNγ)，人转化生长因子-β(TGF-β)，肿瘤坏死因子-α(TNFα)，肿瘤坏死因子受体Ⅰ(TNFRⅠ)，肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)，血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，血管内皮生长因子(VEGF)，白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-7，IL-8，IL-12，和IL-15。最优选地，条件培养基包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)-AA，Wnt7a等，它们都是促进毛发生长的生长因子。
MSC条件培养基生产中的主要限制在很大程度上与干细胞老化有关。细胞老化诱导细胞生长停滞并减少分泌的生长因子和细胞因子的量和导致细胞死亡。另外，它导致细胞衍生的条件培养基的定量和定性损失，使得难以维持一致的组合物，这导致条件培养基和包含条件培养基作为活性成分的组合物的大规模生产和商业化的困难。因此，本发明的发明人在先前的研究中已将重编程技术引入MSC培养物中。根据先前的研究，将各种多能因子如Oct4，Nanog和Lin28引入到羊水来源的MSCs中，结果发现，在这些因子中，引入了Nanog的羊水来源MSC可以建立细胞系并进行连续培养，而其他基因的引入导致细胞死亡且难以进行连续细胞培养。还证实，引入了Nanog的干细胞对促进细胞生长和保持干细胞性(stemness)的作用大于现有的羊膜干细胞。从以上结果可以确认，连续地制备引入了Nanog的羊水来源干细胞的条件培养基，并在培养基中获得大量生长因子是有可能的。
如本文所用术语“外泌体(exosomes)”是指由磷脂膜组成的纳米大小的圆形囊泡，作为用于细胞间相互作用的递送系统材料。外泌体通常在内部包括mRNA，shRNA，蛋白质等，并且这些物质在细胞内外转移以发挥其功能。外部分泌的外泌体将物质递送到其他细胞，接受这些物质的细胞表现出相应的反应机制。迄今为止，已研究了外泌体的多种功能，并且癌症生物标志物、伤口愈合、蛋白质转移、shRNA递送等等已周知。与细胞分泌体(secretomes)相比，外泌体对细胞外环境具有高度抗性，对其他细胞也有很好的吸附作用。另外，外泌体作为功能剂在可获得性方面是足够有价值的，因为其浓度易于控制。
具体地，步骤(e)中分离的外泌体可以包括任何一或多种人生长因子，其选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，无翼型MMTV整合位点家族成员7A(Wnt7a)，以及血小板衍生生长因子(PDGF)-AA，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，证实了分离的外泌体含有与毛发生长因子和大量生长因子等有关的mRNA，并且当用外泌体处理真皮乳头细胞时，外泌体不仅促进了真皮乳头细胞的生长，还激活了毛发生长的信号通路。
在本发明另一实施方案中证实，因为要从条件培养基中除去外泌体并然后分析生长因子等，结果在除去外泌体后生长因子等显著减少，大量生长因子等都包含在外泌体中。因此证实，使用分离的外泌体能更有效地利用外泌体中包含的生长因子等。
本发明还提供了一种用于促进毛发生长的化妆品组合物，其包括作为活性成分的外泌体，所述外泌体是从源自羊水的胎儿MSC分离的。
化妆品组合物可以以各种方式用于有效促进毛发生长，毛发再生和防脱发的毛发化妆品中。
相对于100重量份的化妆品组合物而言，从MSC分离的外泌体的量可以为0.001重量份至10重量份。
化妆品组合物可包括脂质材料，有机溶剂，增溶剂，增稠剂，胶凝剂，柔软剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂，香料，表面活性剂，水，离子或非离子乳化剂，填充剂，金属离子隔离剂(sequestering agent)，螯合剂，防腐剂，维生素，封闭剂，润湿剂，精油，染料，颜料，亲水或亲液活化剂，脂质囊泡，或化妆品或皮肤病学领域中常用的添加剂，例如化妆品中常用的任何其他组分。添加剂以通常用于化妆品或皮肤病学领域的量引入。
化妆品组合物的外部形式包括化妆品学或皮肤病学可接受的介质或基质。介质或基质可以配制成适合表面局部施用的所有制剂，例如溶液，凝胶，固体，糊状无水产品，通过将油相分散在水相中所得乳液，悬浮液，微乳液，微胶囊，微粒，离子(脂质体)和非离子囊泡分散剂，乳膏，皮肤柔软剂，洗液，粉末，软膏，喷雾剂或遮瑕棒。组合物可用本领域常用的方法制备。根据本发明的组合物还可以以泡沫或气溶胶组合物的形式使用，进一步包括压缩的推进剂。
本发明的化妆品组合物在其配方方面没有特别限制，可以配制成化妆品，例如保湿液，收敛剂，滋养液，滋养霜，按摩霜，精华素，眼霜，眼部精华，洁面霜，洁面泡沫，洁面水，敷料，粉末，润肤露，润肤霜，润肤油，体用精华，生发油(hair tonic)，护发素，头发精华，润发露，头发滋养乳液，洗发水，头发清洗剂，头发护理剂，发膏，头发滋养霜，头发保湿霜，头发按摩霜，发蜡，头发气雾剂，头发敷料包，头发滋养霜，头发保湿霜，头发按摩霜，发蜡，头发气雾剂，头发敷料包，头发滋养包，洗头香皂，头发清洁泡沫，发油，头发干燥剂，头发养护剂，头发着色剂，头发造波浪剂，头发脱色剂，发胶，发油，美发剂，粘发剂，头发保湿剂，头发摩丝，或发胶。
上述化妆品组合物可施用到皮肤上，或用微针等施用以吸收到皮肤中。
本发明还提供了一种用于促进毛发生长的药物组合物，其包括作为活性成分的外泌体，所述外泌体分离自羊水中的胎儿来源的MSC。
该药物组合物可以各种方式用于有效促进毛发生长，毛发再生和防脱发的头发医疗产品中。
从MSC分离的外泌体的量相对于100重量份的药物组合物可以为0.001重量份至10重量份。
药物组合物可以以片剂，胶囊，粉末，颗粒，注射剂，凝胶剂，乳剂，糖浆剂，气雾剂，贴剂，喷雾剂，乳膏剂，软膏剂，硬膏剂，洗剂，搽剂，糊剂或泥敷剂的形式制备，用于促进毛发生长，但是本发明不限于此。
当配制药物组合物时，通常使用稀释剂或赋形剂，例如填充剂，增稠剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，表面活性剂等。用于口服给药的固体制剂包括片剂，丸剂，粉剂，粒剂，胶囊剂等，并且通过将一种或多种化合物与至少一种赋形剂混合来制备，所述赋形剂例如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶或类似。另外，除了简单的赋形剂之外，还使用润滑剂如硬脂酸镁，滑石等。用于口服给药的液体制剂可包括悬浮剂，内用液体，乳液，糖浆等，以及不同于常用的简单稀释剂如水或液体石蜡的其他剂，各种赋形剂，例如润湿剂，甜味剂，香氛剂，防腐剂等。肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮剂，乳液，冻干剂和栓剂。作为非水溶剂或悬浮溶剂，可以使用丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，或可注射酯如油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol，Macrogol，吐温61，可可脂，月桂醇，或甘油明胶。
药物组合物可以作为其药学上可接受的盐单独给药或与不同的药物活性化合物或其合适的组合联合给药。盐没有特别限制，可以是任何药学上可接受的盐，例如可以用盐酸，硫酸，硝酸，磷酸，氢氟酸，氢溴酸，甲酸，乙酸，酒石酸，乳酸，柠檬酸，富马酸，马来酸，琥珀酸，甲磺酸，苯磺酸，甲苯磺酸，或萘磺酸的盐。
药物组合物可以根据使用目的肠胃外或口服给药，并且以0.1mg/kg(体重)至500mg/kg(体重)，例如1mg/kg(体重)至100mg/kg(体重)的日剂量给药一次或数次。具体患者的剂量可以根据患者的体重，年龄和性别，健康状况，饮食，给药时间，给药方法，排泄率，疾病的严重程度等而不同。
药物组合物可以通过各种途径(例如胃肠外或口服)对哺乳动物(如大鼠，小鼠，家畜，人等)给药，并且所有给药方法都可以预期，例如口服注射，直肠或静脉注射，肌内注射，皮下注射，子宫内注射，或脑室内注射。
【有益效果】
根据本发明，通过将Nanog作为再编程因子引入源自羊水中的胎儿MSC中，增强了MSC的生长、干细胞性和寿命，并且增强了由其分泌的生长因子的表达。另外，从培养羊水胎儿来源的引入了Nanog的MSC获得的条件培养基中分离的外泌体也显示出毛发生长促进作用，因此可以用作促进毛发生长的化妆品或药物组合物。
【附图说明】
图1显示了根据本发明一个实施方案确认Nanog是否在细胞系中过表达的结果。
图2示出了根据本发明一个实施方案测量羊水来源MSC和引入了Nanog的羊水来源MSC的平均大小和数量的结果。
图3示出了根据本发明一个实施方案，通过PCR分析外泌体内物质的结果。
图4示出了根据本发明一个实施方案，通过ELISA分析外泌体内物质的结果。
图5示出了根据本发明一个实施方案确认所得外泌体的功能的结果。
图6示出了根据本发明一个实施方案确认所得外泌体使毛发生长标志物随毛发乳头生长而变化的碱性磷酸酶(AP)染色结果。
图7示出了根据本发明一个实施方案确认所得外泌体的标志物的变化的结果。
【最佳实施方式】
除非另外指明，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法是本领域熟知的并且是常用的。
[实施例]
实施例1:建立引入了Nanog的羊水来源MSCs
为了获得易于细胞扩增的羊水来源的MSC细胞系，使用逆转录病毒载体系统将Nanog基因导入羊水来源的MSCs中以诱导Nanog过表达，从而建立引入了Nanog的羊水来源MSC细胞系。详细方法如下。
从孕妇获得的羊水中分离胎儿来源的细胞，在低葡萄糖Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中进行传代培养，该DMEM补充有10％胎牛血清(FBS)，1％青霉素/链霉素，1％L-谷氨酰胺，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，5ng/ml硒和50μg/ml抗坏血酸，以获得源自羊水中胎儿的MSC。
用逆转录病毒载体系统将Nanog基因导入所得羊水来源MSC中，以诱导Nanog过表达，从而完成Nanog引入的羊水来源MSC细胞系的制备。
具体地，用限制酶从pBS-Nanog载体(Yamanaka实验室质粒原种#A4，日本)中分离Nanog基因(NCBI GenBank登录号NM_024865.3(SEQ ID NO：1)。用T4连接酶将分离的Nanog基因连至pMXs载体(Cell Biolab，日本)制成pMXs-Nanog。用转染试剂经过6小时将pMXs-Nanog载体转染到293GPG细胞中。使具有Nanog基因的病毒生产72小时，分离上清液，以2000rpm离心10分钟，然后滤过0.45-μm滤器。通过对80％汇合的羊水来源MSCs处理6小时，使病毒感染到细胞中。
实施例2：验证引入了Nanog的羊水来源MSCs的Nanog表达
为进行RT-PCR，使用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)根据制造商的说明从引入了Nanog的羊水来源MSC中分离总RNA。500μg分离的总RNA被cDNA逆转录，使用了cDNA制备混合物(Bioneer)。使测试管在45℃静置60分钟，然后在95℃静置5分钟，然后在-20℃储存直至使用。cDNA用Taq聚合酶(Promega)和Nanog mRNA特异性引物(Exo-Nanog正向：5'-GCTTGGATACACGCCGC-3'(SEQ ID NO：2)；和Exo-Nanog反向：5'-GATTGTTCCAGGATTGGGTG-3'(SEQ ID NO：3))进行扩增。在RT-PCR中，将94℃20秒、60℃30秒和72℃2分钟的循环重复35次，然后最终合成在72℃进行10分钟。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳并分析。
对于确认Nanog过表达的Western印迹实验，将引入了Nanog的羊水来源MSCs在含有10％FBS的DMEM中培养至100％汇合，然后收获，破细胞，将30μg含蛋白的上清液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上，然后用4％脱脂牛奶封闭。随后，膜用检测Nanog受体的抗体(AF1997，R&D)作为第一抗体进行处理，4℃培养过夜，用TBST(补充有0.1％吐温20的Tris缓冲盐水(TBS))洗涤。膜用山羊来源的HRP抗体作为二抗(Santa Cruz Biotechnology，USA)和含有1％牛血清白蛋白(BSA)的TBST处理，使之反应1小时，然后进行western印迹。作为比较表达水平时的对照，使用抗-α-微管蛋白抗体(R&D，USA)作为一抗，用与上述相同的方法确认α-微管蛋白的表达。
结果证实，与羊水来源的MSC(“AF”)相比，引入了Nanog的羊水来源MSCs(“AF-N”)表现出外源Nanog基因的mRNA表达水平和Nanog的蛋白质表达水平的显著增加(参见图1)。
当胎儿来源的MSCs在DMEM低葡萄糖+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸+4ng/ml碱性FGF(bFGF)+5ng/ml硒+50μg/ml抗坏血酸)中培养时，发生连续的细胞生长。
实施例3：分析引入了Nanog的羊水来源MSCs衍生的条件培养基中的外泌体
选取在实施例1和2中建立的每种羊水来源的MSC细胞系的一部分细胞，制备它们的100ml条件培养基，然后从中分离外泌体。
使用Amicon Ultra-15 10K离心过滤装置(Millipore)从条件培养基中提取外泌体，该装置是设计用于过滤胎源MSC产生的条件培养基的某些分子量的蛋白质。将14.8ml所述条件培养基置于该装置的上盖中，然后以5,000×g离心15分钟至40分钟。以这种方式浓缩100ml条件培养基，然后将外泌体分离试剂盒(Invitrogen)以最终体积的1/2的量加入浓缩的培养基中，然后充分混合。将完成的样品在4℃储存12小时。此后，将每份样品以13,200rpm离心30分钟以除去上清液，然后将剩余的白色沉淀用PBS或DMEM溶解，从而完成外泌体样品的制备。
使用Nanosight测量这些外泌体的平均大小和数量，发现，羊水来源的MSCs(“AF”)和引入了Nanog的羊水来源MSCs(“AF-N”)的外泌体平均大小分别记录为直径156nm和147nm，其数量分别测量为20.0x 108和20.1x 108(参见图2)。也即确认了，从这些实验中使用的干细胞系中都正常分离出了外泌体，从引入了Nanog的羊水来源MSCs中也能分离出相同量的外泌体。
实施例4:分析这些外泌体中的物质
为了分析实施例3中分离的外泌体的内部物质，首先，通过RT-PCR检查mRNA的含量。
对于qRT-PCR，在RT-PCR期间以与RNA制备相同的方式获得RNA，并以相同方式制备cDNA。所得cDNA用CFX-96PCR系统进行qRT-PCR，并用特异于bFGF、IGF、Wnt7a和PDGF-AA的mRNA的引物进行扩增。所用bFGF特异性引物是bFGF正向：5'-CAGATTAGCGGACGCGGTGC-3'(SEQ ID NO：4)和bFGF反向：5'-TCACGGATGGGTGTCTCCGC-3'(SEQ ID NO：5)，所用IGF特异性引物是IGF正向：5'-CCATGTCCTCCTCGCATCTCTTCT-3'(SEQ ID NO：6)和IGF反向：5'-CCATACCCTGTGGGCTTGTTGAA-3'(SEQ ID NO：7)，所用Wnt7a特异性引物是Wnt7a正向：5'-TCTTTCTCAGCCTGGGCATGGT-3'(SEQ ID NO：8)和Wnt7a反向：5'-TCCTATGACGATGATGGCGTCG-3'(SEQ ID NO：9)，所用PDFG-AA特异性引物是PDGF-AA正向：5'-CTGCCCATTCGGAGGAAGAGAA-3'(SEQ ID NO：10)和PDGF-AA反向：5'-TGGCACTTGACACTGCTCGTGTT-3'(SEQ ID NO：11)。通过CT方法分析靶mRNA的相对定量。
为了检测bFGF、Wnt7a和PDGF-AA蛋白的分泌，对从引入了Nanog的羊水来源MSC分离的外泌体进行酶联免疫吸附测定(ELISA测定)。使用ELISA试剂盒(RayBiotech)测定各外泌体中bFGF、Wnt7a和PDGF-AA蛋白的含量。为进行ELISA，制得这些外泌体，标准品和样品用生物素抗体处理1小时，然后用链霉抗生物素蛋白处理45分钟。随后，标准品和样品用TMB底物试剂处理30分钟，再向其中加入终止溶液以停止反应。用微孔板分光光度计测量450nm处的吸光度，以定量分析这些结果。
作为通过RT-PCR比较毛发生长相关基因的表达水平的结果，引入了Nanog的羊水来源MSC外泌体(“AF-N-Exo”)表现出bFGF、PDGF和IGF的更高表达水平，只有Wnt7a除外。这表明引入了Nanog的羊水来源MSCs产生的外泌体的数量与现有干细胞的相似，但两种情况下外泌体的内部物质存在轻微差异。为了更准确地检查RT-PCR数据，通过qRT-PCR进行定量分析。与RT-PCR的情况类似，证实除了Wnt7a之外的其他生长因子的mRNA水平是相当高的(参见图3)。总之，这些外泌体中含有毛发生长相关因子的mRNA，这可能被解释为有助于促进毛发生长。通过ELISA分析这些蛋白质的量，并测量Wnt7a、PDGF-AA和bFGF的浓度(参见图4)。根据测量结果，Wnt7a、PDGF-AA和bFGF的含量分别为约8pg/mL，2.5pg/mL和约5.5pg/mL。从这些结果可以确认，这些毛发生长相关蛋白也包含在外泌体中。
实施例5：经外泌体处理的真皮乳头细胞的生长和标记物变化
将得到的外泌液分成不同浓度后，用其处理真皮乳头细胞，以确认在毛发生成中起关键作用的两个因子即真皮乳头细胞的生长和毛发生长标记物的变化。使用的浓度范围为100X至1X，并使用条件培养基和无外泌体的条件培养基进行比较分析。
具体地，收集小鼠的皮肤组织并从中分离细胞，使用与实施例2相同的方法从这些细胞中分离总RNA并用cDNA逆转录，cDNA用Taq聚合酶(Promega)和ALP、LEF和Versican(多能聚糖)mRNA特异性引物扩增。使用的ALP特异性引物是ALP正向：5'-TGGCCCTCTCCAAGACGTACAA-3'(SEQ ID NO:12)和ALP反向：5'-TGGTTCACTCTCGTGGTGGTCA-3'(SEQ ID NO:13)，所用LEF-特异性引物是LEF正向:5'-CTTCCTTGGTGAACGAGTCTG-3'(SEQ IDNO:14)和LEF反向:5'-GTGTTCTCTGGCCTTGTCGT-3'(SEQ ID NO:15)，所用Versican-特异性引物是Versican正向:5'-AACTAGCCGTTGGAGTGGATTC-3'(SEQ ID NO:16)和Versican反向:5'-AAATGCTCTGTGGCTCTGGA-3'(SEQ ID NO:17)。所得产物在1％琼脂糖凝胶上电泳以进行分析，相对mRNA表达水平根据以CT值分析的GAPDH mRNA来定量。
根据这些结果，随着浓度增加，真皮乳头细胞的生长逐渐增加，并且与条件培养基中的情形相比，在一定浓度或更高浓度下表现出更好的生长促进能力。此外，证实去除了外泌体的条件培养基显示出显着降低的功能，这表明外泌体的功能在条件培养基中也占很大比例(参见图5)。
除了真皮乳头的生长之外，毛发生长标志物的变化也通过qRT-PCR和AP染色证实了。为了使真皮乳头细胞诱导毛发生长，必须保持真皮乳头细胞的内在干细胞性，ALP、LEF和Versican是通常已知的代表该干细胞性的标记物。因此，作为区分无外泌体培养基(对照)和各种浓度(10X和50X)中这些标志物的表达水平的结果，证实ALP和LEF的表达水平增加1.5倍至2倍(参见图6上)。在Versican的例子中，它似乎是一个小幅增加但没有太大的不同。为了获得该数据的可靠性，通过AP染色确认ALP，并且证实，与qRT-PCR的情况类似，随着外泌体浓度的增加，染成蓝色的细胞数增加(见图6下)。
另外，由于已知真皮乳头细胞具有一定程度的间充质干细胞功能，它们表达共同的干细胞标记物Oct4和Sox2。作为确认一般干细胞标志物变化的结果，表现出逐渐增加，如ALP和LEF(参见图7)。具体地，Oct4表现出5倍或更高的差异，这可以解释为外泌体对Oct4表达具有很大影响。
根据这些结果，可以确定外泌体通过促进真皮乳头细胞的毛发生长能力而对毛发生长具有有效作用。
<制备例1>制备生发水(Hair Lotion)
根据传统生发水制备方法，制得生发水，其在本发明引入了Nanog的羊水来源MSC的条件培养基中包含外泌体作为活性成分，如表1所示。
[表1]
待混合的各成分 含量(wt％)
从引入了Nanog的羊水来源MSC分离的外泌体 5.0
间苯二酚(resorcinol) 2.0
泛醇(Panthenol) 0.5
Pyrrothonol胺 0.1
色素 适量
香氛剂 适量
纯水 余量
总计 100
<制备例2>制备亲水软膏(Hydrophilic Ointment)
根据常规亲水软膏的制备方法，制备亲水性软膏，其在本发明引入了Nanog的羊水来源MSC的条件培养基中包含外泌体作为活性成分，如表2所示。
[表2]
待混合的各成分 含量(wt％)
从引入了Nanog的羊水来源MSC分离的外泌体 0.5
对羟基苯甲酸乙酯(或甲酯) 0.25
十二烷基硫酸钠 15
对羟基苯甲酸(p-oxybenzoate)丙酯 0.15
白凡士林(White vaseline) 适量
十八烷醇(Stearyl alcohol) 适量
丙二醇 余量
总计 100
序列表
<110> 思特科技公司
<120> 制备用于毛发生长的组合物的方法，该组合物包含从引入了NANOG的羊水中胎儿衍生间充质干细胞获得的外泌体
<130> G19E10C0235P/CN
<150> KR 10-2017-0004242
<151> 2017-01-11
<160> 17
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 918
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60
gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120
tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180
cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240
gagaagagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300
gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360
agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420
acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480
aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ttactcttcc 540
taccaccagg gatgcctggt gaacccgact gggaaccttc caatgtggag caaccagacc 600
tggaacaatt caacctggag caaccagacc cagaacatcc agtcctggag caaccactcc 660
tggaacactc agacctggtg cacccaatcc tggaacaatc aggcctggaa cagtcccttc 720
tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcagt tccagccaaa ttctcctgcc 780
agtgacttgg aggctgcctt ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc 840
actaggtatt ttagtactcc acaaaccatg gatttattcc taaactactc catgaacatg 900
caacctgaag acgtgtga 918
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exo-Nanog foward
<400> 2
gcttggatac acgccgc 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exo-Nanog reverse
<400> 3
gattgttcca ggattgggtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bFGF forward
<400> 4
cagattagcg gacgcggtgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bFGF reverse
<400> 5
tcacggatgg gtgtctccgc 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF forward
<400> 6
ccatgtcctc ctcgcatctc ttct 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF reverse
<400> 7
ccataccctg tgggcttgtt gaa 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt7a forward
<400> 8
tctttctcag cctgggcatg gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt7a reverse
<400> 9
tcctatgacg atgatggcgt cg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGF-AA forward
<400> 10
ctgcccattc ggaggaagag aa 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGF-AA reverse
<400> 11
tggcacttga cactgctcgt gtt 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALP forward
<400> 12
tggccctctc caagacgtac aa 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALP reverse
<400> 13
tggttcactc tcgtggtggt ca 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LEF forward
<400> 14
cttccttggt gaacgagtct g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LEF reverse
<400> 15
gtgttctctg gccttgtcgt 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Versican forward
<400> 16
aactagccgt tggagtggat tc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Versican reverse
<400> 17
aaatgctctg tggctctgga 20

Claims (5)

1.制备间充质干细胞衍生的外泌体的方法，该方法包括：
(a)从孕妇获得的羊水中分离胎儿来源的细胞；
(b)在含有胎牛血清(FBS)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中对分离的胎儿来源的细胞进行再培养，以获得羊水中胎儿来源的间充质干细胞；
(c)将Nanog引入羊水中胎儿来源的间充质干细胞，以获得羊水中胎儿来源的Nanog过表达间充质干细胞；
(d)将得自羊水中胎儿来源的Nanog过表达间充质干细胞培养1天至5天，以制得条件培养基；和
(e)从该条件培养基中分离出外泌体，
其中所述分离的外泌体包含一种或多种选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、Wingless型MMTV整合位点家族成员7A(Wnt7a)、和血小板衍生生长因子(PDGF)-AA的人生长因子。
2.权利要求1的方法，其中，在步骤(c)中，Nanog经由逆转录病毒载体而引入。
3.权利要求1的方法，其中所述再培养在进一步含有硒和抗坏血酸的培养基中进行。
4.一种用于促进毛发生长的化妆品组合物，该化妆品组合物使用权利要求1至3中任一项所述的方法制备，并且包含间充质干细胞衍生的外泌体作为活性成分。
5.一种促进毛发生长的药物组合物，该药物组合物使用权利要求1至3中任一项所述的方法制备，并且包含间充质干细胞衍生的外泌体作为活性成分。
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