KR20130116972A - 타인지방줄기세포를 배양하여 만든 모발증식제재 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모발증식제재 및 이의 제조방법에 관한 것으로 상세하게는 자가지방이 아닌 타인의 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 사용하는 것으로 구성된다.
본 발명에 의한 모발증식제재는 타인의 지방으로부터 지방줄기세포를 분리하여 배양하게 되며, 이렇게 배양된 지방줄기세포를 사용하는 방법과 줄기세포를 배양시 수득하게 되는 배양액을 사용하는 방법, 배양된 지방줄기세포와 배양액을 혼합하여 사용하는 방법으로 구성된다.
본 발명의 타인 지방에서 분리한 지방줄기세포는 자가 지방에서 분리한 세포만큼의 효과를 나타내며, 탈모 방지 및 발모 효과가 우수하여 모발증식제재로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

타인지방줄기세포를 배양하여 만든 모발증식제재 및 이의 제조방법{hair growth material and product using culture another adipose-derived stem cells and manufacturing method of it}

본 발명은 모발증식제재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 타인의 지방으로부터 지방줄기세포를 분리, 배양하여 사용하는 모발증식제재 및 그 제조방법에 관한 것이다.

모발은 생명에 직접적인 중요한 생리적 기능은 가지고 있지 않으나, 외부의 충격으로부터 완충과 자외선 차단, 외부자극으로부터 인체를 보호하며, 신체에 불필요한 비소, 수은, 아연 등의 중금속을 흡수하여 체외로 배출하는 기능을 가지고 있다. 모발은 모발이 성장하는 성장기(anagen), 성장이 멈추고 모구부가 축소되면서 대사과정이 늦어지는 퇴행기(catagen), 모낭이 수축되면서 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 모발이 빠지게 되는 휴지기(telogen)로 구분되며, 같은 장소에서 새로운 모발이 생성됨으로 인해 오래된 모발이 탈락하고 성장기로 전화되는 모주기(hair cycle)를 가지고 일생동안 성장과 탈락을 반복한다. 이러한 모발이 정상적으로 있어야 할 곳에 없는 상태를 탈모라 하며, 그 원인으로 남성호르몬 관여에 의한 모포기능의 저하, 두피 생리 기능의 저하, 두피 긴장에 의한 국소혈류장애, 영양불량, 스트레스, 약물에 의한 부작용, 유전적 요인, 화학물질, 백혈병, 결핵, 악성 임파종 등의 질병을 들고 있다. 위와 같은 기능 외에 탈모가 심한 경우 사회생활을 하는데 문제가 있을 수 있으며 심리적으로도 위축되어 심각한 영향을 미칠 수 있어 삶의 질 측면에서 탈모 치료는 매우 중요하다.

현재 탈모 치료법으로 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가 모발이식 수술법과 미녹시딜과 프로페시아를 사용하는 약물치료가 널리 사용되고 있다. 미녹시딜의 경우 혈관확장을 통한 모세포에 영양공급증가 및 potassium channel opening 효과 등이 모발 성장을 유도하며, 프로페시아의 경우 Dihydrotestosterone(DHT)의 생성을 저해하는 효과로 모발 성장을 유도하지만, 이 두 약물 모두 치료할 당시에는 발모 효능이 나타나나 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되며 모발성장의 효과보다는 탈모방지의 효과가 더욱 크며, 프로페시아의 경우 성기능 장애, 임신한 여성의 경우 기형아 출산과 같은 부작용이 나타날 수 있다.

최근 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료법이 나타났으나, 치료의 효능성, 치료 비용, 안전성 등에 대해 불확실하고 치료법이 안전하게 현실화되기까지 상당한 기간이 걸릴 수 있다는 단점 때문에 임상적용이 용이하지 않았다. 이러한 이유로 유전자 치료 외에 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법이 최근 각광받고 있다.

줄기세포는 미분화 상태로 자가 증식하고 다른 조직의 세포로 다중 분화될 수 있는 세포로 우리 몸이 많은 조직에 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 가장 먼저 알려진 것이 골수에서 유래된 골수유래 줄기세포이다. 이후 탯줄 혈액뿐 아니라 말초 혈액, 태반, 피부, 신경조직, 지방, 근육 등 우리 몸 어느 곳에서나 성체 줄기세포가 존재한다. 그 중 골수유래 줄기세포는 가장 많은 연구가 진행된 줄기세포이나 골수유래 줄기세포의 확보는 시술 시 고통이 따르고 이환율이 있으며, 낮은 세포 수의 수득률로 인해 임상적 응용에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다.

반면, 지방에서 추출한 지방유래 줄기세포의 경우 골수유래 줄기세포와 마찬가지로 중간엽 유래의 기관이며, 지방세포, 섬유아세포, 평활근세포, 내피세포와 지방전구세포 등 여러 가지 종류의 세포로 구성되어 있으며, 상피, 연골, 신경, 지방, 근육 세포 등으로 분화가 가능하다. 또한 줄기세포를 추출하기 위한 지방조직을 지방흡입술 과정에서 부수적으로 얻을 수 있으며, 또한 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있다. 또한 효소에 의해 쉽게 분리될 뿐 아니라 이식 후 질병의 발병률이 적다고 보고되었다.

하지만 현재 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법은 줄기세포를 탈모나 무모의 증상을 나타내는 부위에 직접 주입하여 모낭 세포로 분화하도록 유도하는 과정이 대부분이다. 이러한 방법은 현재 자가 줄기세포만을 사용하며 지속적인 치료가 유지되지 못하고 시간과 비용의 문제점이 많다는 단점이 있다.

본 발명은 자가 지방이 아닌 타인의 지방에서 지방줄기세포를 분리, 배양하여 모발증식제재 및 이의 제조방법에 관한 기술을 제공한다.

본 발명에 의한 모발증식제재는 타인지방줄기세포를 배양하여 사용되며, (a)배양된 타인지방줄기세포, (b)타인지방줄기세포 배양액, (c) 배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액 혼합물을 포함하여 구성된다.

또한 본 발명의 줄기세포는 타인의 지방에서 분리하는 것으로 구성되며 상기 구성물들의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 모발증식제재 및 이의 제조방법은 자가 지방이 아닌 타인의 지방을 사용하여 지방줄기세포를 분리하여 배양하여 사용되는 구성을 가진다.

이렇게 배양된 타인지방줄기세포는 지방줄기세포 자체가 모세포로 분화하여 탈모를 치료하는 효과를 나타낼 수 있으며, 지방줄기세포 배양액은 각종 성장인자와 단백질 활성물질이 포함되어 있기 때문에 모세포의 휴지기나 퇴행기를 억제하여 성장기로 활성화하여 탈모방지 및 발모의 효과를 나타낼 수 있다.

또한 배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액을 혼합하여 사용하게 되면 상기의 각각의 효과가 나타남은 물론이며, 상기 효과를 더욱 극대화시키게 된다.

또한 나이 든 사람의 경우 줄기세포의 활성도가 떨어지게 되나, 젊은 사람의 경우 줄기세포의 활성도가 높게 나타난다. 이러한 이유로 나이 든 사람이 자가 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 사용하는 것보다 젊은 타인의 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 사용하게 되면, 자가 지방줄기세포를 사용하는 것보다 탈모 방지 및 발모에 더 큰 효과를 나타낼 수 있다. 또한 타인의 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 사용하게 되면 자가 지방에서 줄기세포를 분리하지 않아도 되기 때문에 비용과 시간을 절약할 수 있으며, 지방줄기세포를 배양하여 사용함으로써 더 많은 수의 세포를 사용할 수 있게 되어 더 큰 효과를 나타낼 수 있다.

도 1의 경우 본 발명에 따른 배양된 타인지방줄기세포를 사용한 모발증식제재의 효과를 나타낸 두피경 사진이다.
도 2의 경우 본 발명에 따른 타인지방줄기세포 배양액을 사용한 모발증식제재의 효과를 나타낸 두피경 사진이다.
도 3의 경우 본 발명에 따른 배양된 타인지방줄기세포와 배양액의 혼합액을 사용한 모발증식제재의 효과를 나타낸 두피경 사진이다.
도 4는 배양된 타인지방줄기세포의 초대배양의 모습(좌)과 계대 배양 이후(우) 현미경 사진이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명의 모발증식제재는 배양된 지방줄기세포와 배양시 수득한 배양액, 그리고 이 두 가지의 혼합물로 구성할 수 있다.

지방줄기세포를 분리하기 위한 지방은 주로 통상적으로는 자가 지방을 사용하나, 본 발명은 자가 지방이 아닌 타인의 지방을 사용하는 것으로 구성된다. 타인의 지방은 타인의 지방흡입술의 과정에서 대량으로 추출하는 지방을 부수적으로 얻을 수 있으며, 이 지방은 무균 상태로 수집하게 된다. 이때 추출한 지방은 무균상태로 분리되어 투메센트 용액과 혈액 등 불순물을 제거하고 순수한 지방조직만을 분리하여 사용하게 된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a)타인의 지방에서 줄기세포를 분리하는 단계; (b)분리한 타인지방줄기세포를 배양하는 단계; (c) 타인지방줄기세포와 배양액을 수득하는 단계;로 구성되며 각 단계의 제조방법을 제공한다.

상기 (a)단계는 지방흡입술 등을 통해 수득한 타인의 지방에서 지방줄기세포를 분리하는 단계로 흡입된 지방조직을 원심분리하여 순수한 지방조직만을 수득한다. 이때 수득한 지방조직을 생리식염수 등으로 세척한 후, 콜라게아나제(SIGMA, SERVA)를 생리식염수와 혼합하여 만든 콜라게나아제 용액을 1:1로 지방조직과 혼합한다. 이렇게 혼합한 지방조직을 37℃에서 20-30분간 효소처리한 후 600G-1000G 3-6분간 원심분리하여 오일층과 지방층 지방줄기세포층으로 층 분리한다. 상기 타인지방줄기세포는 펠렛(pellet)의 형태로 형성된다. 이때 콜라게나아제는 SIGMA를 통상적으로 사용하나 무독성인 SERBA를 사용할 수도 있다. SIGMA를 사용하였을 경우에는 독성 중화과정을 따로 진행할 수 있다. 이렇게 분리된 타인지방줄기세포는 생리식염수, 하트만 용액, PBS(Phosphate buffered saline) 등을 사용하여 300G-500G 3분간 2-3회 세척하여 남아있을 잔여 지방과 오일 등의 불순물을 제거하게 된다. 2-3회 세척한 후 세포성 잔사를 제거하기 위하여 100㎛의 필터를 사용하기도 하나 이에 한정돼있는 것이 아니며 또한 이 과정은 생략해도 무방하다.

상기 (b)단계는 분리한 타인지방줄기세포를 배양하는 단계로 본 발명은 배양된 타인지방줄기세포를 사용한다. 상기에서 분리한 타인지방줄기세포를 배양하는데 통상적으로 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하며 이 DMEM에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)에 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 사용한다. 이때 FBS 대신에 human serum을 사용할 수도 있으며, 추가로 비타민, 성장인자 등 다른 영양분을 첨가할 수도 있다. 초대배양은 24well plate나 12well plate, 3cm plate에서 배양하며, 초대배양 시 미리 혈액을 제거하지 않고 계대 배양하면서 혈액을 제거하는 방법으로 배양한다. 배양 환경은 37℃, 5% CO₂환경하에 배양하며, 세포의 밀도(confluenece)가 80-90% 일 때 계대 배양한다.

상기 (c)단계는 본 발명의 모발증식제재에서 실제로 사용되는 지방줄기세포와 배양액을 수득하는 단계로, 본 발명은 상기 (c)단계서 수득하여 사용한다. 상기 (b)단계에서 계대 배양시 세포의 밀도가 80-90% 이상일 때 타인지방줄기세포 배양액을 수득하나, 타인지방줄기세포를 수득할 경우 세포의 밀도가 90%를 넘을 경우 수득하나, 80% 이상일 경우에도 가능하다. 상기 지방줄기세포 배양액은 지방줄기세포를 계대 배양시 수득할 수 있으며, 계대 배양시마다 상기 타인지방줄기세포가 배양된 배지를 수거하여 800G-1000G 3분간 원심분리를 진행하게 된다. 원심분리 후 가라앉은 세포 잔여물을 마이크로필터 등을 사용하여 제거하여 사용하게 되는데 이 액이 타인지방줄기세포 배양액이다. 이렇게 지방줄기세포를 배양하게 되면 줄기세포가 분비하는 각종 성장인자와 단백질 활성물질이 상기 배지에 녹아있게 된다. 상기 배양액 속에는 줄기세포 자체는 포함되어 있지 않으며 줄기세포만이 분비하는 각종 영양분, 성장인자, 단백질 활성물질과 배지가 함유하고 있던 각종 영양분이 포함되어 있어 탈모 방지와 발모에 뛰어난 효과를 나타내게 된다. 지방줄기세포를 수득하는 방법으로는 초기의 계대 배양된 세포를 사용하게 되며, 5 passage 이전에 배양된 타인지방줄기세포를 사용하게 되나, 5 passage 이후 배양된 세포를 사용하여도 무방하나 다소 효과가 떨어지는 경향이 있다. 5 passage 이전의 초기의 타인지방줄기세포를 0.25% 트립신-EDTA로 배양된 타인지방줄기세포를 떨어뜨린 후 배양시 사용하였던 DMEM이나, PBS 등을 사용하여 세포 부유액을 수득함으로써 배양된 타인지방줄기세포를 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 세포 부유액은 다시 800G-1000G 3분간 원심분리하여 타인지방줄기세포 펠렛을 제외하고 나머지 부유액은 제거한 후, PBS나 생리식염수, 하트만 용액 등을 사용하여 2-3회 세척하여 순수한 배양된 타인지방줄기세포를 수득하게 된다.

상기 (c)에서 수득한 배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액은 각각 모발증식제재로 사용할 수 있으며, 혼합하여도 사용할 수 있다.

모발증식제재의 형태로는 생리식염수나 하트만 용액 등을 혼합하여 주사제로 사용하여 탈모 부위에 직접 주사하는 형태로 사용할 수도 있고, 약학적 조성물이나 화장료의 조성물로 사용하여 스킨, 로션, 토너, 크림, 에센스, 스프레이, 샴푸류 등의 액상이나 크림 또는 젤 등의 제품으로 제조하여 탈모 부위에 도포하는 형태로 사용할 수도 있다. 주사제로 사용하기 위해서 무혈청, 무항생제 배지에 2차 배양하는 과정을 진행할 수도 있으며, 모발증식제재 제조시에 탈모방지 및 발모에 효과가 있는 각종 첨가물을 첨가하는 것도 가능하다. 타인지방줄기세포를 주사제로 사용할 경우 보관이 불가능하기 때문에 타인지방줄기세포 수득 즉시 주사하는 형태로 사용하게 된다.

이러한 구성을 이하 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 쉽게 이해하기 위한 예시일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 타인 지방조직으로부터 지방줄기세포 분리

성형외과 등에서 지방흡입술을 시행한 환자로부터 동의를 구한 후, 무균상태의 지방조직을 수거하였다. 수거한 지방은 10cc 주사기에 옮겨 담은 후 3000-3500rpm으로 2-3분 동안 원심분리 하게 된다. 이러한 원심분리를 통해 투메센트 용액과 혈액, 오일 등 불순물을 제거한 후, 다시 생리식염수 등으로 세척하여 순수한 지방조직만을 모아 10cc 주사기에 담아 둔다. 이렇게 수거한 지방조직에 생리식염수와 혼합된 0.66~0.1% 콜라게나아제와 1:1의 비율로 혼합하여 37℃에서 20-30분간 효소처리 하였다. 이후 다시 800G에서 5분간 원심분리하여 지방세포층과 지방줄기세포층을 분리하였으며, 상층의 지방세포층은 제거한 후 하층의 지방줄기세포층만을 분리하였다. 이렇게 분리한 지방세포층은 생리식염수나 하트만 용액, PBS등을 사용하여 2-3번 세척한 후, 세포성 잔사를 제거하기 위하여 100㎛의 필터를 사용하여 여과하여 타인의 지방으로부터 지방줄기세포를 분리하였다.

< 실시예 2> 타인지방줄기세포 배양

상기에서 분리한 타인지방줄기세포를 세포배양 하였다 세포배양 과정은 통상적으로 사용되는 세포배양법을 사용하였다.

세포배양에 사용되는 배지는 통상적으로 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하며 이 DMEM 에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)에 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. DMEM 외에 다른 세포배양용 배지도 가능하며, DMEM-Ham's-F12, keratinocyte-SF 등 무혈청배지도 가능하다. 37℃, 5% CO₂환경의 배양기에서 배양하였다. 지방조직에서 분리된 타인지방줄기세포는 혈액과 함께 분리되어 초대 배양시 혈액과 함께 배양한다. 24well plate나 12well plate, 3cm plate에 초대 배양시엔 혈액과 함께 배양하며, 초대배양 후 1일 경과 시 PBS나 배양용 DMEM배지 등을 사용하여 2-3회 정도 세척하여 마저 부착되지 않은 타인지방줄기세포와 혈액 세포들을 제거하였다. 완전히 제거되지 않은 혈액 세포들은 계대 배양시 트립신화(trypsinization)에 의해 제거하였다. 세포의 밀도가 80-90% 되었을 때 계대 배양하였으며, 섬유모세포의 형태(fibroblast)를 가진 지방줄기세포를 확인할 수 있었다. 이후 세포가 더 이상 자라지 않을 때까지 계대 배양하였다.

< 실시예 3> 배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액 습득

상기에 배양된 타인지방줄기세포와 배양액을 수득하였다. 모발증식제재에 사용될 타인지방줄기세포는 5 passage 이전의 초기에 배양된 세포들을 수득하였으며, 0.25%의 트립신-EDTA를 사용하여 트립신화(trypsinization) 과정을 2회 정도 하여 세포를 plate에서 떨어뜨렸다. PBS나 배양시 사용하는 DMEM 배지 5ml 정도의 양으로 떨어뜨린 타인지방줄기세포 세포 부유액을 수거하였다. 이렇게 수거한 세포 부유액을 800G에서 3분간 원심분리하여 배양된 타인지방줄기세포 펠렛을 수득하게 된다. 이 펠렛을 다시 PBS나 생리식염수, 하트만 용액 등으로 2-3회 세척하여 순수한 펠렛만을 수득하였으며, 이 펠렛을 모발증식제재에 사용하게 된다.

타인지방줄기세포 배양액은 계대 배양시마다 수득할 수 있으며, 계대 배양의 횟수에 제한을 두지 않는다. 계대 배양시마다 하나의 plate에서 약 8~9ml 의 배지를 수득한다. 각 plate 별로 수득한 배지는 혼합하여 800G-1000G로 3분간 원심분리하여 세포 잔여물을 제거한 배지를 배양액으로 사용한다.

< 실시예 4> 모발증식제재 예시

본 발명의 모발증식제재는 하나의 형태에 국한된 것이 아니라 여러 형태로 제조될 수 있다.

배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액은 주사제로 1cc syringe 등으로 제조하여 탈모 부위에 주사하여 사용한다. 주사제로 사용할 경우 타인지방줄기세포의 경우 상온 보관시 장시간 보관이 불가능하고, 냉장이나 냉동보관시 동결방지제 없이는 세포가 죽어버리기 때문에 타인지방줄기세포를 plate에서 수득 즉시 주사하는 형태로 사용한다. 주사하는 양은 최소 1개 이상의 syringe를 사용하며 최대 사용량은 제한하지 않는다. 이는 의사나 시술자의 판단에 따라 용량을 정할 수 있다. 그러나 타인지방줄기세포 배양액의 경우 지방줄기세포가 포함되어 있지 않은 성장인자나 단백질 활성물질이기 때문에 냉장, 냉동 보관시 일정기간 보관하여도 효과가 크게 떨어지지 않는다. 그러나 상온보관시 변질의 위엄이 있기 때문에 타인지방줄기세포와 마찬가지로 장시간 보관하지 않는다.

약학적 조성물이나 화장료용 조성물 등으로 사용할 경우 스킨, 토너, 에센스, 스프레이 등의 액상 류나 크림, 로션, 샴푸 등의 크림 류, 젤 류 등의 형태로 제조하여 사용한다. 이러한 조성물들은 본 발명의 타인지방줄기세포나 타인지방줄기세포 배양액을 1-100% 까지 사용할 수 있으며, 아미노산이나 성장인자, 비타민류 화학적 성분 등 탈모방지 및 발모에 효과 있는 다른 첨가물을 추가로 첨가할 수 있으며 1-99%까지 사용이 가능하다. 상온에 보관하기 위한 방부제를 첨가할 수 있으며, 이는 통상적으로 사용되고 있는 것을 사용하여 식약청의 방부제 허용 농도를 넘기지 않는다. 또한 유화제나 점증제 등의 첨가물을 사용하여 제품의 농도를 조절한다.

상기의 모발증식제재는 배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액 각각 사용할 수 있으며, 이 두 가지를 혼합하여도 사용하며 이는 상기의 주사제나 약학적, 화장료용 조성물등에 모두 사용할 수 있다.

Claims (5)

1. 타인 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 배양시 수득한 배양액을 유효성분으로 함유하는 모발증식제재
2. 타인 지방에서 지방줄기세포를 분리하여 배양한 지방줄기세포를 유효성분으로 함유하는 모발증식제재
3. 타인 지방에서 지방줄기세포를 분리하여, 배양된 지방줄기세포와 지방줄기세포 배양액의 혼합물을 포함하는 모발증식제재
4. (a)타인으로부터 얻은 지방에서 지방줄기세포를 분리하는 단계;
   (b)타인지방줄기세포를 배양하는 단계;
   (c)배양된 타인지방줄기세포와 타인지방줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는 모발증식제재의 제조방법
5. 스프레이제 주사제를 포함하는 화장품류, 의약외품류 및 의약 등

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