CN105505877A - 恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：先对恶性胸腔积液样本进行去细胞处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用EpCAM抗体标记磁珠吸附，从恶性胸腔积液中分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体。本发明方法简单可行，首次实现了胸腔积液中肿瘤源外泌体的提取；本发明方法方便有效，实现了胸腔积液中可检测浓度的肿瘤源外泌体的获得；本发明方法准确可靠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，实现了在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。而且，本发明方法具有特异性强、方便易行、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有较高的临床推广应用价值。

Description

恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
背景技术
恶性胸腔积液(malignantpleuraleffusion，MPE)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。据统计，美国每年MPE的患者数超过150000人。几乎所有的恶性肿瘤均可出现MPE。肺癌是最常见的病因，约占MPE的1/3，乳腺癌次之，淋巴瘤也是导致出现MPE的重要原因，卵巢癌和胃肠道癌出现MPE者也不少见，5％-10％的MPE找不到原发肿瘤病灶。一旦出现MPE表明肿瘤播散或已进展至晚期，患者预期寿命将显著缩短。MPE从确立诊断开始计算，中位生存期为3-12个月，这与原发肿瘤类型和分期有关。已有证据显示，肺癌所致MPE患者生存期最短，卵巢癌所致MPE生存期最长，无法找到原发灶的MPE患者生存期介于上述两者之间。
由于恶性胸腔积液的病因非常复杂，胸腔积液中的细胞成分也相当复杂，而且MPE确立诊断后，患者生存期都不长，所以，很少有MPE的相关研究工作尤其是其机理和免疫治疗研究工作报道，目前国内外针对MPE流行病学的调查研究资料十分缺乏。当下，临床上诊断和鉴定胸腔积液最常用的方法是采用胸腔穿刺进行细胞学检查，但是该方法存在敏感性较低、主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊，因此需要寻找新的更敏感可靠的检测指标。
外泌体(Exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在外周循环中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，在肿瘤生长与转移中发挥调控作用。
外泌体也能被肿瘤细胞释放在胸腔积液中，但是其为什么会被肿瘤释放到胸膜内以及发挥何种作用尚不清楚。现有的从胸腔积液中提取外泌体的方法复杂且设备要求高，例如，文献报道了蔗糖梯度超离心法提取胸腔积液的外泌体的方法，该方法步骤繁杂费时，损耗量大，而且还需配置超高速离心机，这些都大大限制了研究者对其的研究。此外，胸腔积液中的外泌体来源复杂，无法评估其中属于肿瘤细胞分泌的外泌体。基于以上的限制，目前尚未有文献公开报道从胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，能够从肿瘤患者的胸腔积液中获得高量、特异性高且能直接用于后续的流式技术检测的肿瘤细胞来源的外泌体。
一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤：
(1)将恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在2～8℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；
(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
(3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)抗体标记磁珠的第四离心管中，在2～8℃孵育6～16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
其中，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将所述胸腔积液总外泌体用缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的pH值为7～8。所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline，PBS)，更优选为1×磷酸缓冲液。
本发明优选的技术方案中，还可以对所得产物进行进一步清洗，即：在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2～3次。优选所述的缓冲液为磷酸缓冲液，最优选为1×磷酸缓冲液。
本发明中，所述的总外泌体抽提液可以采用现有技术中常用的市售总外泌体抽提液，例如：ExosomeIsolationkit(LifeTechnologies)、Exoquick(SystemBioscience)、Exo-spin(CellGuidanceSystem)等；优选Invitrogen公司生产的TotalExosomeIsolation，可由市场购得。
本发明中，所述的上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠可以通过商业途径购买得到，例如：Exosome-HumanEpCAMIsolationReagent(Invitrogen)、CD326(EpCAM)MicroBeads(MiltenyiBiotec)、EasySepTMHumanEpCAMPositiveSelectionKit(StemCell)；优选Invitrogen公司生产的EpCAMbeads。
本发明中，优选胸腔积液样本的体积为2～5ml。在最优选的技术方案中，经由两次离心分离得到的上清液的体积不超过1ml，而所用总外泌体抽提液的体积不超过1ml，这样，所用总外泌体抽提液的成本不超过80元。
因此，本发明还提供了以下优选的技术方案：
一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤：
(1)将2～5ml恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在4℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在4℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；
(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，4℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
(3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第四离心管中，在4℃孵育6～16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
其中，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将将所述胸腔积液总外泌体用0.5～2.5ml缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的pH值为7～8。所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline，PBS)，更优选为1×磷酸缓冲液。
同样，在优选的技术方案中，还可以对所得产物进行进一步清洗，即：在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2～3次。优选所述的缓冲液为磷酸缓冲液，最优选为1×磷酸缓冲液。
将通过上述方法制备得到的产物进行电子显微镜观察、免疫印迹检测、流式细胞仪分析和Real-timePCR检测，结果发现：产物具有exosome的双膜50-100nm的大小形态，表达了exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsg101，以及Epcam蛋白，并且在产物中检测到了一些肿瘤高表达的miR-21的表达，从而，分别从形态学层面、蛋白层面和小分子RNA层面证实了该产物为肿瘤来源的外泌体，为后续的胸腔积液肿瘤来源exosome的临床应用及下一步的研究工作奠定了基础。
本发明的恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：进行胸腔积液中总外泌体的提取和磁珠抗体的纯化。在从恶性胸腔积液中提取总外泌体的过程中，将样本的去细胞预处理和使用抽提试剂(总外泌体抽提液)抽提相结合，克服了目前使用超高速离心机进行梯度离心所存在的方法复杂和有线粒体、大蛋白复合物等其他细胞碎片污染的缺陷；在磁珠抗体纯化的过程中，采用EpCAM抗体标记磁珠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，从而使在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。而且，本发明制备得到的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体可直接用于后续的流式技术检测。综上，本发明方法简单可行，首次实现了胸腔积液中肿瘤源外泌体的提取；本发明方法方便有效，实现了胸腔积液中可检测浓度的肿瘤源外泌体的获得；本发明方法准确可靠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，实现了在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
本申请发明人基于长期的外泌体研究，克服了基于长期以来对于胸腔积液中外泌体提取困难的认识所造成的局限性，将二次高速离心和抽提试剂结合，完成了胸腔积液中总外泌体的提取，并进一步采用EpCAM抗体标记磁珠提纯得到胸腔积液中可检测浓度的肿瘤来源的外泌体，该外泌体特异性强，能够有效提高后续临床诊断应用及研究的准确性。
本发明所公开的方法，能够简单有效低成本地实现从恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体，从而使得后续的机理研究和免疫治疗应用成为可能，具有极大的理论价值和临床应用价值。
而且，本发明所公开的方法，只需要在10000g高速离心即可实现，一般检测实验室均能满足该条件，相对而言，现有技术中对于外泌体的提取则是必须要求100000g以上的超高速离心，对设备要求高，所需要的费用也高，严重限制了其应用。就此而言，本发明方法在临床应用上更适合推广。
综合而言，本发明方法具有特异性强、准确可靠、方便易行、简单有效、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1所得产物的电子显微镜照片。
图2是对本发明实施例1所得产物中的蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsg101表达的免疫印迹(WesternBlot)检测结果。
图3是对本发明实施例1所得产物中EpCAM表达进行流式细胞仪分析的检测结果。
图4是对本发明实施例1所得产物进行Real-timePCR检测的结果。
图5是对本发明实施例2所得产物中CD63的表达进行流式细胞仪分析的检测结果。
图6a是本发明实施例2所得产物在明场的磁珠光图；图6b是对本发明实施例2所得产物进行荧光免疫检测所显示的磁珠荧光图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件或者制造厂商所建议的条件实施。
本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。
实施例1：肺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞来源exosome的提取
①得到患者知情及伦理的同意下，收集肿瘤患者病人(病理活检已经确认为肺癌)术前的胸腔积液标本2ml于10ml第一离心管中，在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，分离以去除胸腔积液中的细胞，然后得到上层液体。
②将①得到的上层液体移入第二离心管中，在4℃、10000g的离心条件下离心15分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液。
③将上清液移入第三离心管中，并加入与上清液的体积相同量的exosome抽提液(TotalExosomeIsolation,Invitrogen)混合，震荡均匀后，4℃孵育过夜(6～16小时均可)，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的胸腔积液总外泌体(exosome)。
④用0.5ml的1×PBS(pH值为7～8)对③所得胸腔积液总外泌体进行重悬，得到胸腔积液总外泌体的重悬液。
⑤将20ul抗体磁珠(EpCAMbeads,Invitrogen)和1ml的1×PBS在第四离心管中混匀后上磁力架吸附2分钟，移除管内液体，这样在该离心管中吸附有EpCAM抗体标记磁珠。
⑥将上述④所得的0.5ml胸腔积液总外泌体的重悬液加入上述⑤所得的吸附有EpCAM抗体标记磁珠的第四离心管中，4℃孵育过夜(6～16小时均可)。
⑦将⑥中的第四离心管置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体。
⑧再向上述第四离心管中加入1ml的1×PBS，置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体；重复一次；获得磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome。
整个过程在无菌操作台完成，避免细菌、真菌等的污染。由于1×PBS和exosome抽提液通常在4℃保存，在取用后的短时间内进行重悬、混合或磁力吸附操作，基本仍能保持在4℃，所以，上述整个过程可视为均在4℃下进行操作。
产物的表征和鉴定
1、将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml低pH(pH值为5-6)的TE缓冲液洗脱磁珠上结合的细胞，并使用电子显微镜观察。电子显微镜观察到的照片如图1所示，可以发现：从磁珠上洗脱下的细胞为50-100nm大小的双分子层膜结构泡体，形态学和其他文献报道的外泌体一致。
2、免疫印迹(WesternBlot)检测蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsg101的存在
具体检测步骤如下：
(1)将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，加入1ml裂解液，提取总蛋白。
(2)制作BSA标准曲线，加入1ml的考马斯蓝，化学分光仪上检测exosome蛋白含量。
(3)制作10％及4％的梯度胶，加入足够的缓冲液，每孔上样50ug的exosome总蛋白。
(4)在电压40V～60V进行4～5h的电泳。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
(5)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。后加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
(6)封闭结束后，立即加入稀释好的一抗(CD9,CD63,Hsp90,Tsg101)。4℃缓慢摇动孵育过夜后，回收一抗，Western洗涤液洗涤3次。
(7)按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，Western洗涤液洗涤3次。
(8)膜上蛋白面加入ECL液进行显影。
检测结果如图2所示，其中，T1、T2、T3代表单样品重复，从图2可以发现：在实施例1所得产物中检测到了exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsg101的表达，因此，从分子特性上说明了实施例1所得产物为exosome。
3、流式细胞仪检测肿瘤exosome的EpCAM表达
将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，分别加入Epcam-FITC和Igm-FITC抗体进行4℃闭关孵育1小时后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，加入500ul的1×PBS上流式细胞仪进行检测。
检测结果如图3所示，可以发现：在实施例1所得产物(如图3中线2所示)中检测到了EpCAM蛋白表达，且荧光强度强于同型对照组(如图3中线1所示)。这说明了实施例1所得产物为肿瘤细胞来源的exosome。
4、Real-timePCR检测miR-21及U6表达
(1)总miRNA提取：用350ul的1×PBS重悬由上述实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)，并加入700ulQiazol(Qiagen)裂解后，加入200ul甲醇震动混匀，分2次移入总RNA抽提柱中，12000rpm离心移除离心液；依次加入700ul缓冲液RWT和700ul缓冲液RPE液进入离心柱，12000rpm离心10分钟后移除离心液；利用miRNA抽提系统(Qiagen)提取TotalRNA，20ulRnase-FreeWater加入离心柱过膜，12000rpm离心10分钟，获得离心液中包含TotalRNA。
(2)反转录:取11ultotalRNA、10ul的反应液(Takara)、2ulBSA液(Takara)、2ulRT液(Takara)进入50ul离心管中，轻微振荡摇匀后37℃反应60分钟及85℃5秒的条件下进行反转录成cDNA。
(3)Real-timePCR检测：取12.5ulSYBRGREEN液(Takara)、1ulmiR-21或U6的引物混合液、10.5ulddH2O液、1ulcDNA进入96孔PCR反应孔中进行PCR反应。反应条件设置：先95℃10分钟，后进行40个循环的95℃15秒，56℃30秒，75℃35秒。
Real-timePCR扩增miR-21和U6的结果如图4所示，可以发现：在实施例1所得产物中成功检测到肿瘤exosomeU6和miR-21的表达。取扩增对数期RN＝0.257，U6为18个Ct，miR-21为23个Ct值。这说明了实施例1所得产物为肿瘤细胞来源的exosome。
综合以上，从形态学层面、蛋白层面和小分子RNA层面对提取的产物进行了检测，证实了产物具有exosome的50-100nm大小的双膜形态，证明了产物中存在exosome特有蛋白表达及肿瘤抗原的表达，还成功的检测到了一些肿瘤高表达的miR-21的表达，从而说明提取产物为肿瘤来源外泌体。即，采用实施例1中的方法，能够实现从恶性胸腔积液中成功分离肿瘤细胞来源的外泌体，且分离的肿瘤细胞来源的外泌体高量、特异性高、能直接用于后续的流式技术检测。
实施例2：食管癌患者胸腔积液中肿瘤源exosome的提取
采用与实施例1基本相同的方法提取食管癌患者病人胸腔积液中的肿瘤源exosome。即：①中胸腔积液样本为5ml食管癌患者病人术前的胸腔积液标本，其它步骤与实施例1中完全相同。
同样，采取实施例1中的方法对实施例2所得产物进行电子显微镜观察，同样观察到与文献记载一致的外泌体形态。
进一步，采用免疫荧光和流式细胞仪检测CD63表达：
将实施例2得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，即1ml食管癌患者胸腔积液肿瘤源exosome重悬液。向其中加入5ul流式抗体CD63进行常温下孵化2小时，600g离心5min后弃上清，1ml1×PBS重悬后重复1次。避光加入荧光2抗(BioLegend,AlexaFluora488-conjugatedaffinipureGoatanti-mouseIgG(H+L))，20-30℃避光孵化1小时，600g离心5min后弃上清，1ml1×PBS重悬后重复1次。200ul1×PBS重悬后上流式细胞仪上检测CD63的表达并加样20ul到载玻片上用绿色激发光观察免疫成像。
流式细胞仪检测结果如图5所示，可以发现：在实施例2所得产物中检测到了CD63的表达，且荧光强度强于同型对照组(IgG)。免疫荧光检测结果如图6所示，其中，图6a是本发明实施例2所得产物在明场的磁珠光图，图6a中显示信号和背景均为黄色；图6b是对本发明实施例2所得产物进行荧光免疫检测所显示的磁珠荧光图，图6b中显示信号为红色，显示背景为蓝色，即，免疫荧光检测结果显示：上述产物在绿色激发光下呈明显的红色荧光显影，这说明上述产物中存在蛋白CD63的表达。从而，证明了实施例2所得产物为exosome。同时，免疫荧光检测结果也说明上述产物中外泌体与磁珠偶联成功。
此外，还采用实施例1中的方法检测实施例2所得产物中EpCAM的表达，结果显示：提取出的exosome强表达EpCAM蛋白，从而证实胸腔积液中提取出的exosome来源于肿瘤细胞。
实施例3：卵巢癌患者胸腔积液中肿瘤源exosome的提取
采用与实施例1基本相同的方法提取卵巢癌患者病人胸腔积液中的肿瘤源exosome。即：①中胸腔积液样本为2.5ml卵巢患者病人术前的胸腔积液标本，其它步骤与实施例1中完全相同。
采用实施例1中产物表征方法，对实施例3所得产物进行观察和检测，结果显示：实施例3所得产物具有与文献记载一致的外泌体形态，并且在产物中检测到外泌体的特有蛋白CD9,CD63,Hsp90,Tsg101表达及肿瘤抗原EpCAM蛋白的强表达，从而证明实施例3所得产物为胸腔积液中提取出的肿瘤细胞来源exosome。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (10)

1.一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)将恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在2～8℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；
(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
(3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第四离心管中，在2～8℃孵育6～16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将所述胸腔积液总外泌体用缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的pH值为7～8。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为1×磷酸缓冲液。
6.一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)将2～5ml恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在4℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在4℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；
(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，4℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
(3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第四离心管中，在4℃孵育6～16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将所述胸腔积液总外泌体用0.5～2.5ml缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的pH值为7～8。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为1×磷酸缓冲液。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106289927A (zh) * 2016-08-28 2017-01-04 浙江省中医院 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法
CN110551680A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种提取胸水外泌体的方法和系统
CN110551687A (zh) * 2019-09-17 2019-12-10 四川大学华西医院 一种基于固相金属亲和色谱的分离血浆中外泌体的方法
CN112553151A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法
CN113249302A (zh) * 2021-06-23 2021-08-13 北京求臻医学检验实验室有限公司 一种高效的外泌体分离纯化方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102301236A (zh) * 2008-12-15 2011-12-28 牛津生物医学（英国）有限公司 方法
US8530228B2 (en) * 2010-12-28 2013-09-10 Bexmart Integrated versatile and systems preparation of specimens
CN103468642A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 山西大学 一种分离细胞培养基中外泌体的方法
CN103767985A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102301236A (zh) * 2008-12-15 2011-12-28 牛津生物医学（英国）有限公司 方法
US8530228B2 (en) * 2010-12-28 2013-09-10 Bexmart Integrated versatile and systems preparation of specimens
CN103767985A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用
CN103468642A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 山西大学 一种分离细胞培养基中外泌体的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID W.GREENING等: "A Protocol for exosome isolation and characterization: Evaluation of ultracentrifugation, Density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods", 《PROTEOMIC PROFILING:METHOD AND PROTOCOLS》 *
PATRICIA A.GONZALES等: "Isolation and purification of exosomes in urine", 《PROTEOMIC PROFILING:METHOD AND PROTOCOLS》 *
崔世英等主编: "《实用miRNA研究进展》", 31 August 2015, 清华大学出版社 *
杨子楠等: "外泌体在肿瘤发展中的研究进展", 《肿瘤》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106289927A (zh) * 2016-08-28 2017-01-04 浙江省中医院 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法
CN106289927B (zh) * 2016-08-28 2019-04-16 浙江省中医院 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法
CN110551680A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种提取胸水外泌体的方法和系统
CN110551687A (zh) * 2019-09-17 2019-12-10 四川大学华西医院 一种基于固相金属亲和色谱的分离血浆中外泌体的方法
CN112553151A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法
CN113249302A (zh) * 2021-06-23 2021-08-13 北京求臻医学检验实验室有限公司 一种高效的外泌体分离纯化方法

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