CN106289927B - 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 - Google Patents
一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106289927B CN106289927B CN201610744198.3A CN201610744198A CN106289927B CN 106289927 B CN106289927 B CN 106289927B CN 201610744198 A CN201610744198 A CN 201610744198A CN 106289927 B CN106289927 B CN 106289927B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- supernatant
- microcapsule bubble
- added
- centrifuged
- tumour cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 230000029142 excretion Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 37
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 229940056319 ferrosoferric oxide Drugs 0.000 claims description 15
- -1 carbonyl cyanine Chemical compound 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 8
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 claims description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- GFZPJHFJZGRWMQ-UHFFFAOYSA-M diOC18(3) dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.O1C2=CC=CC=C2[N+](CCCCCCCCCCCCCCCCCC)=C1C=CC=C1N(CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C2=CC=CC=C2O1 GFZPJHFJZGRWMQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108091037787 miR-19b stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108091050874 miR-19a stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091086850 miR-19a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091088468 miR-19a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical compound [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100‑300rpm水平振荡条件下孵育3‑16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；本发明采用的方法提取的总微囊泡，保留了全部微囊泡的结构和成分，产量高。并且可以进行二次分选，对特定的微囊泡进行分析，提高了提取效率和研究价值。总共的提取时间最少只要4小时，就可以完成微囊泡的提纯，最少5小时可以完成外泌体的提纯。而且提取的纯度更高，实验表明，提取的微囊泡占总提取蛋白的90％以上，而有机沉淀的比例不足20％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种微囊泡的分离，具体涉及到从细胞上清中分离肿瘤细胞来源微囊泡及其外泌体的方法。
(二)背景技术
微囊泡(microvesicles，MVs)是从细胞膜上脱落或者释放的一种膜性结构，是具有双分子层的膜性小囊泡。MVs含有脂类、蛋白质、mRNA、microRNA(miRNA)及DNA片段等，这些物质来源于母细胞膜或者细胞器。不仅存在于体外培养的细胞中而且存在于体液中。目前研究发现，其起到在细胞、组织、器官间的传递信息作用，并且能够通过其表面或者内含的生物分子而达到对靶细胞、组织、器官的调控作用。其不仅在多种疾病的发生和发展中发挥重要作用，而且还与肿瘤的侵袭、转移、定植都有着密切的关系。因此，分析微囊泡携带的成分对疾病和肿瘤的研究意义重大，这其中最重要的环节是如何高效获取高纯度的微囊泡。
目前，微囊泡的提取主要采用超高速梯度离心法、密度梯度超速离心法、超速离心-免疫磁珠亲和法、有机沉淀法等。这些方法各有优缺点：超高速离心法采用超高速离心机价格昂贵，通常采用100,000xg离心60-120分钟，对耗材的要求高、免疫磁珠亲和法可以对提取的微囊泡进行特异性标记的纯化，但是由于目前对于不同来源的微囊泡的标记蛋白还不明确，所以获得的微囊泡产量远低于超速离心的产量，并往往需要多种标记的免疫磁珠进行提取，提高了试剂成本，有机沉淀剂提取的微囊泡纯度相对较低，并且可能对微囊泡本身以及后续分析都产生影响。所以，开发一种高效、简易、价廉的微囊泡提取方法，将对微囊泡在科学研究和临床检测中的推广发挥重要作用。
微囊泡虽然能够对疾病和肿瘤的发生和发展起到监测作用，且在细胞上清液和体液中稳定存在，但是由于其体积小、含量低，需要大量细胞上清液，因而采用目前的方法提取成本高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种从细胞上清中分离肿瘤细胞来源微囊泡及其外泌体的方法，能够从细胞培养上清中获得高纯度、高产量的微囊泡，且能直接用于后续的流式技术检测、qPCR检测、免疫印迹检测的微囊泡。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，更优选所述偶联物为亲脂性羰花青染料DiI、亲脂性羰花青染料DiO、亲脂性羰花青染料DiD或亲脂性羰花青染料CM-DiI，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。优选DiO偶联四氧化三铁磁微球，也可以是DiO偶联琼脂糖、DiO偶联葡聚糖、DiO偶联乳胶颗粒、DiO偶联胶体金颗粒等，最优选偶联复合物为DiO偶联四氧化三铁磁微球。本发明采用的偶联载体和亲和小分子对亲和环境的容忍度很高，可以不用调节提取溶液的pH，也可以不用浓缩上清液体积，简便了操作方法。所述DiI(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)分子式为C59H97ClN2O4，分子量为933.88，CAS number为41085-99-8；DiO(3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate)分子式为C53H85ClN2O6，分子量为881.72，CAS number为34215-57-1；
DiD(1,1”-dioctadecyl-3,3,3”,3”-tetramethylindodicarbocyanine-4-
chlorobenzenesulfonate salt)，分子式为C67H103ClN2O3S，分子量为1052.1；
CM-DiI(3H-Indolium,5-[[[4-(chloromethyl)benzoyl]amino]methyl]
-2-[3-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2-ylidene)-1-prop enyl]-3,3-dimethyl-1-octadecyl-chloride)，分子式为C68H105Cl2N3O，分子量为1051.5，CAS number为180854-97-1。
进一步，所述肿瘤细胞为人胃腺癌细胞AGS、人胃腺癌细胞BGC-823、人胃癌细胞(未分化)HGC-27、人胃癌细胞MGC80-3或人胃癌细胞(低分化)MKN-45。
进一步，所述培养液重复离心，取最后一次离心上清液与偶联复合物混合；所述最后一次离心的上清液体积用量以偶联复合物质量计为1000～2000ml/g。
进一步，所述偶联复合物由DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成，所述四氧化三铁磁微球直径50-100nm，1mg磁微球最大微囊泡结合量范围为20-50μg。所述偶联复合物中偶联物负载量为3-4×10-6～3-4×10-5mol/mg，即1mg磁微球可以偶联亲脂性羰花青染料DiO3-4×10-5mol。
进一步，所述肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液200×g离心10分钟，获得上清液a，然后将上清液a再2000×g离心15-40分钟，取上清液b与偶联复合物混合。
进一步，本发明为了提更高效率，在培养液离心过程增加超滤，可以将上清液浓缩至2ml，方便后续的提取过程，具体为：所述上清液b用100KDa超滤管在5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液与偶联复合物混合。
进一步，所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法按如下步骤进行：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液a；
(2)将上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液b；
(3)将上清液b加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，超滤管中剩余液体(即截留液)收集于第三离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，移除液体(优选将离心管置于磁力架上，吸附2分钟，或者直至偶联复合物完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成；
(4)向步骤(3)孵育后的偶联复合物中加入1×PBS充分重悬，移除液体(优选将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)，并用1×PBS充分清洗，去除洗液，获得微囊泡磁微球复合物。
本发明还提供一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡外泌体(50-150nm)的方法，所述方法为：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液A；
(2)将上清液A加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液B；
(3)将上清液B加入第三离心管中，在10000×g离心40-70分钟，获得上清液C；
(4)将上清液C加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，超滤管中剩余液体(即截留液)收集于第四离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，去除液体(优选将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由DiO与磁微球偶联制成；
(5)向步骤(4)孵育后的偶联复合物中加入1×PBS充分重悬，去除洗液(再将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)并用1×PBS充分清洗，去除洗液，获得吸附外泌体的偶联微球。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
现有提取方式，往往采用超高速离心的方法，仪器设备昂贵，通常需要80-100万仪器费用，提取成本高；离心时需要采用特制的离心管，材料的费用高，离心管费用就高达50-100元。本发明采用的方法，仅需提供普通台式离心机(2,000×g)，可选的方案中提供高速离心机(10,000×g)即可完成提取，离心管采用普通的离心管即可，费用仅1.5元。整体的费用不足超速离心费用的十分之一，便于推广应用。
现有的免疫亲和技术，往往选用某个特定的抗体去结合提取某特定标记物的微囊泡或者外泌体，由于这些微囊泡和外泌体，只占目标群的很小一部分，所以往往导致提取效率低，而且对于珍贵的样本，这样的提取方式失去了大部分其他类型的微囊泡和外泌体，容易造成后续研究的偏倚和缺失，研究数据损失巨大。本发明采用的方法提取的总微囊泡，保留了全部微囊泡的结构和成分，产量高。并且可以进行二次分选，对特定的微囊泡进行分析，提高了提取效率和研究价值。
相对于细胞上清液的有机沉淀方法，有机沉淀往往需要4度过夜(16h)，而且提取的纯度低。本发明采用的方法，总共的提取时间最少只要4小时，就可以完成微囊泡的提纯，最少5小时可以完成外泌体的提纯。而且提取的纯度更高，实验表明，提取的微囊泡占总提取蛋白的90％以上，而有机沉淀的比例不足20％。
由于偶联载体对各种试剂的耐受高，可以运用于市售的各种提取试剂和微囊泡分离试剂。
由于DiI、DiO、DiD、CM-DiI，是细胞膜荧光染料，分别呈现DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、CM-DiI(橙色荧光)。它们是亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。且在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。可以直接进行流式分选或者流式分析。
(四)附图说明
图1：是本发明实施例1提取的微囊泡的透射电子显微镜图。
图2：是本发明实施例1提取微囊泡的qPCR图，A为微囊泡中提取miR-19a的qPCR扩增图，B为微囊泡中提取miR-19a的qPCR扩增的溶解曲线图，C为微囊泡中提取miR-19b的qPCR扩增图，D为微囊泡中提取miR-19b的qPCR扩增的溶解曲线图(CE39为内参片段)。
图3：是本发明实施例1提取微囊泡的流式分析图，a直接CD9分选的微囊泡含量；b本发明提取方法后用CD9分选的微囊泡含量。
图4：是本发明实施例1提取微囊泡的免疫印迹图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1微囊泡
(1)偶联DIO的四氧化三铁磁微球颗粒的制备参照专利申请CN200880105993.1实例1-6。通过计算未结合偶联亲脂性羰花青染料含量，获得偶联在1mg磁微球上的亲脂性羰花青染料DIO为3.51x10-5mol，并用1xPBS溶液悬浮制成100mg/ml偶联DIO的四氧化三铁磁微球悬液。
(2)将1*106个人胃癌细胞MGC80-3接种于75cm2细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(购自Gibco公司的RPMI-1640培养液和Gibco公司的胎牛血清)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液10ml，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到9.5ml上清液a；
(3)将10ml上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心20分钟，获得9.0ml上清液b；
(4)将9.0ml上清液b加入第三离心管中，加入步骤(1)制备的0.1ml、100mg/ml偶联DIO的四氧化三铁磁微球悬液，置于4℃、200rpm水平振荡摇床下孵育3小时，保证颗粒充分混匀，然后将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体。
(5)去除步骤(4)磁力架，加入1×PBS充分重悬磁微球，再将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体，再用1×PBS充分清洗磁微球，去除洗液，获得微囊泡磁微球复合物约9mg，其中含微囊泡25μg。对微囊泡磁微球复合物进行电镜观察、流式细胞术分析、qPCR分析和免疫印迹分析，结果见图1-图4所示。结果证实所得微囊泡具有双分子层结构、表达微囊泡的表面标记分子(CD9、CD81、CD63等)、以及肿瘤细胞表达的miRNA19a、miR19b等等。从而从多个方面证实提取产物为微囊泡。
实施例2
(1)将1*106个人胃癌细胞AGS接种于75cm2细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液10ml，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到9.5ml上清液a；
(3)将9.5ml上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心15分钟，获得9.0ml上清液b；
(4)将9.0ml上清液b加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟。倒弃滤液，超滤管中剩余液体约1ml收集于第三离心管中。加入实施例1步骤(1)制备的0.1ml、100mg/ml偶联DIO的四氧化三铁磁微球悬液，置于4℃、100rpm下水平振荡孵育16小时，保证颗粒充分混匀，然后将离心管置于磁力架上，吸附2分钟至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体。
(5)去除步骤(4)磁力架，加入1×PBS充分重悬磁微球，再将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体，再用1×PBS充分清洗磁微球，去除洗液，获得微囊泡磁微球复合物约9mg，其中含微囊泡34μg。
实施例3微囊泡中的外泌体(50-150nm)亚类的提取
(1)将1*106个人胃癌细胞(未分化)HGC-27接种于75cm2细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液10ml，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到9.5ml上清液A；
(2)将9.5ml上清液A加入第二离心管中，在2000×g离心40分钟，获得9.0ml上清液B；
(3)将9.0ml上清液B加入第三离心管中，在10000×g离心40分钟，获得8.5ml上清液C；
(4)将8.5ml上清液C加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟。倒弃滤液，超滤管中剩余液体收集于第三离心管中。加入实施例1步骤(1)制备的0.1ml、100mg/ml偶联DIO的四氧化三铁磁微球悬液，置于4℃、100rpm下水平振荡孵育16小时，保证颗粒充分混匀，然后将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体；
(5)去除步骤(4)磁力架，加入1×PBS充分重悬磁微球，再将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧，移除液体，再用1×PBS充分清洗磁微球，去除洗液，获得外泌体磁微球复合物约9mg，其中含外泌体8.5μg。
Claims (9)
1.一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。
2.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞为人胃腺癌细胞AGS、人胃腺癌细胞BGC-823、人胃癌细胞、HGC-27、人胃癌细胞MGC80-3或人胃癌细胞MKN-45。
3.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述培养液重复离心，取最后一次离心上清液与偶联复合物混合；所述最后一次离心的上清液体积用量以偶联复合物质量计为1000～2000ml/g。
4.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联物为亲脂性羰花青染料DiI、亲脂性羰花青染料DiO、亲脂性羰花青染料DiD或亲脂性羰花青染料CM-DiI。
5.如权利要求4所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成。
6.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液200×g离心10分钟，获得上清液a，然后将上清液a再2000×g离心15-40分钟，取上清液b与偶联复合物混合。
7.如权利要求6所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述上清液b用100KDa超滤管在5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液与偶联复合物混合。
8.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液a；
(2)将上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液b；
(3)将上清液b加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液于第三离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，移除液体，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成；
(4)向步骤(3)孵育后的偶联复合物加入1×PBS充分重悬，再移除液体，然后用1×PBS充分清洗偶联复合物，去除洗液，获得吸附微囊泡的偶联微球。
9.一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡外泌体的方法，其特征在于所述方法为：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液A；
(2)将上清液A加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液B；
(3)将上清液B加入第三离心管中，在10000×g离心40-70分钟，获得上清液C；
(4)将上清液C加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液于第四离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，移除液体，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成；
(5)向步骤(4)孵育后的偶联复合物中加入1×PBS充分重悬，再移除液体，然后用1×PBS充分清洗，去除洗液，获得吸附外泌体的偶联微球。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610744198.3A CN106289927B (zh) | 2016-08-28 | 2016-08-28 | 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610744198.3A CN106289927B (zh) | 2016-08-28 | 2016-08-28 | 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106289927A CN106289927A (zh) | 2017-01-04 |
| CN106289927B true CN106289927B (zh) | 2019-04-16 |
Family
ID=57677508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610744198.3A Active CN106289927B (zh) | 2016-08-28 | 2016-08-28 | 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106289927B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107144688B (zh) * | 2017-04-07 | 2018-09-11 | 浙江大学 | Cd19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒 |
| CN107271621B (zh) * | 2017-07-18 | 2019-06-21 | 东北农业大学 | 一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法 |
| CN108169199B (zh) * | 2018-02-09 | 2020-07-24 | 大连理工大学 | 一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法 |
| RU2678988C1 (ru) * | 2018-03-05 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоСилика" | Способ выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей |
| CN108546671A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-09-18 | 马英淙 | 一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法 |
| CN109136189B (zh) * | 2018-09-14 | 2022-05-13 | 湖南大学 | 一种高生物活性细胞膜仿生微囊泡及其制备方法与应用 |
| CN110106233A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-08-09 | 杭州师范大学 | 一种胞外囊泡/外泌体的数字pcr检测方法 |
| CN110618002A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-12-27 | 浙江大学 | DiI染料标记示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法 |
| CN113249292A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-13 | 上海富劢生物技术有限公司 | 一种细胞外囊泡的分离方法 |
| CN114397141B (zh) * | 2021-12-10 | 2022-11-29 | 连云港市东方医院 | 一种神经内科临床用取液装置 |
| CN114231523A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-03-25 | 西安交通大学 | 一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105388055A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-03-09 | 浙江省肿瘤医院 | 从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 |
| CN105505877A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-20 | 浙江省肿瘤医院 | 恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 |
| CN105716928A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-06-29 | 武汉大复生物科技有限公司 | 细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法 |
-
2016
- 2016-08-28 CN CN201610744198.3A patent/CN106289927B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105388055A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-03-09 | 浙江省肿瘤医院 | 从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 |
| CN105505877A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-20 | 浙江省肿瘤医院 | 恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 |
| CN105716928A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-06-29 | 武汉大复生物科技有限公司 | 细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106289927A (zh) | 2017-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106289927B (zh) | 一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法 | |
| JP6661368B2 (ja) | マルチソート細胞分離法 | |
| JP2016515823A5 (zh) | ||
| JP2019205467A (ja) | ルテリオンおよびその分離・培養方法 | |
| CN106366196B (zh) | 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN107356744A (zh) | 一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法及其试剂盒 | |
| CN106198963A (zh) | 一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN102297968A (zh) | 辅助诊断结核病的试剂盒 | |
| EP2972359B1 (en) | Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells | |
| CN109082400A (zh) | 一种利用deae磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法 | |
| CN107034191A (zh) | 一种在微流控芯片中利用透明质酸功能化的磁珠识别和分离循环肿瘤细胞的方法 | |
| CN106366195B (zh) | 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| US10196631B2 (en) | Cell separation method using a release system for cell-antibody-substrate conjugates containing a polyethylene glycol spacer unit | |
| CN112300994A (zh) | 用于捕获循环肿瘤细胞的纳米磁珠及其制备方法和应用 | |
| Wang et al. | A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation | |
| US11255858B2 (en) | Method for isolating cancer stem cells | |
| CN101845417B (zh) | 一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法 | |
| CN205687938U (zh) | 一种脂肪干细胞分离装置 | |
| CN106350485B (zh) | 一种快速高效分离单个抗原特异性b细胞的方法 | |
| CN114578042A (zh) | 一种抗体修饰的磁性亲和材料及制备和其应用 | |
| CN107338222A (zh) | 基于脂类分子探针的外泌体分离方法 | |
| CN115561147A (zh) | 一种外泌体蛋白检测方法 | |
| CN111172009A (zh) | 一种集成式外泌体分离芯片及其制备方法和应用 | |
| CN106279421B (zh) | 一种cd133、cd24、cd44多重抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN104535772A (zh) | Her2高表达的循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |