CN111212653A - 经纯化间充质干细胞外排体及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了来自间充质干细胞(MSC)的分离的外排体。这样的分离的外排体基本上不含污染物并且在治疗多种疾病(例如，肺疾病如BPD)方面具有治疗活性。分离的MSC外排体通过本文中所述的一种或更多种蛋白质标志物来鉴定。还提供了对这样的MSC外排体进行纯化的方法。

Description

经纯化间充质干细胞外排体及其用途

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年8月15日提交的并且标题为“PURIFIEDMESENCHYMAL STEM CELL EXOSOMES AND USES THEREOF”的美国临时申请No.62/545,610的权益，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持

本发明是在由NIH授予的授权号RO1 HL085446、RO1 HL055454和T32 HD007466的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。

背景技术

已显示，不同器官(例如，肺)中的间充质干细胞/基质细胞(mesenchymal stem/stromal cell，MSC)的治疗能力包含在它们的分泌组(secretome)中(例如，在它们释放的外排体中)。还已经报道了在许多疾病模型包括心肌梗死、肾损伤、变态反应和类似的免疫调节病症以及神经保护中MSC外排体治疗的有益特性。然而，经常地，粗外排体分离技术外加差的分析表征使MSC外排体的治疗影响减小，损害生物利用度并且与非外排体物质共同污染制剂。

发明内容

本文提供了对经纯化MSC外排体(例如，来自人脐带沃顿胶(Wharton's Jelly)或骨髓)的表征。使用本文中所述的纯化方法，分离出对肺疾病(例如，支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD))提供治疗效力的MSC外排体，并鉴定与这样的经纯化MCS外排体相关的标志物。本文还提供了使用经纯化MSC外排体治疗肺疾病(例如，BPD)的方法。在一些实施方案中，推注剂量(bolus dose)的MSC外排体有效降低了肺疾病(例如，BPD)的严重程度。

因此，本公开内容的一些方面提供了分离的间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MCS)外排体，其中：(i)分离的MSC外排体包含选自以下的一种或更多种标志物：FLT1、PLAUR、MME、CDH2、SLC16A3、CDH13、ITGB5、ITGA11、APP、GPC6、IGSF8、IRP2、TSPAN9、DAG1、SLC38A2、SLC12A8、GJA1、ITGA1、PLXNB2、SLC16A1和PROCR；(ii)分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：PTk7、CD109、SLC1A5、ITGA3、ITGA2、BSG、DPP4、ATP1A1、FAP、VASN、IGF2R和CD82；和/或(iii)分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：RCN1、RAP1B、GDF15、FLT1、OLFML3、PLOD2、PSMA4、PAPPA、INHBA、SPOCK1、HSPB1、LOXL4、POLD3、CALU、IGFBP4、C4B、TINAGL1、SULF1、TPM3、AHNAK、CALR、RRAS2、PFKP和COL16A1。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体包含选自以下的一种或更多种标志物：FLT1、PLAUR、MME、CDH2、SLC16A3、CDH13、ITGB5、ITGA11、APP、GPC6、IGSF8、IRP2、TSPAN9、DAG1、SLC38A2、SLC12A8、GJA1、ITGA1、PLXNB2、SLC16A1和PROCR。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：PTk7、CD109、SLC1A5、IGTA3、ITGA2、BSG、DPP4、ATP1A1、FAP、VASN、IGF2R和CD82。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：RCN1、RAP1B、GDF15、FLT1、OLFML3、PLOD2、PSMA4、PAPPA、INHBA、SPOCK1、HSPB1、LOXL4、POLD3、CALU、IGFBP4、C4B、TINAGL1、SULF1、TPM3、AHNAK、CALR、RRAS2、PFKP和COL16A1。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体还包含选自以下的一种或更多种标志物：FLOT1、CD9和CD63。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。在一些实施方案中，MSC来自沃顿胶或骨髓。在一些实施方案中，分离的MSC外排体基本上不含非外排体蛋白质污染物。在一些实施方案中，分离的MSC外排体具有约30至150nm的直径。在一些实施方案中，分离的MSC外排体具有免疫调节活性。

本文还提供了包含本文中所述的分离的MSC外排体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含第二试剂。在一些实施方案中，第二试剂是肺表面活性物质、类固醇、抗氧化剂或吸入一氧化氮。在一些实施方案中，药物组合物还包含可药用载体。

本公开内容的另一些方面提供了治疗肺疾病的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文中所述的分离的间充质干细胞(MSC)外排体或药物组合物。

在一些实施方案中，所述对象是人对象。在一些实施方案中，人对象在妊娠37周之前出生。在一些实施方案中，人对象在妊娠26周之前出生。在一些实施方案中，对象患有高氧诱导的肺损伤。在一些实施方案中，对象已施用氧或已上呼吸机。在一些实施方案中，对象患有支气管肺发育不良(BPD)或处于发生支气管肺发育不良(BPD)的风险之中。在一些实施方案中，对象患有高氧诱导的肺动脉高压。在一些实施方案中，对象表现出周围肺动脉重塑(peripheral pulmonary arterial remodeling)。在一些实施方案中，对象在肺中有炎症。

在一些实施方案中，对象小于四周龄。在一些实施方案中，对象为3至18岁。在一些实施方案中，对象是成体。

在一些实施方案中，将分离的MSC外排体以推注剂量施用于对象。在一些实施方案中，将分离的MSC外排体重复施用于对象。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体改善肺功能。在一些实施方案中，分离的MSC外排体恢复肺结构。在一些实施方案中，分离的MSC外排体降低肺纤维化。在一些实施方案中，分离的MSC外排体降低肺中的炎症。在一些实施方案中，分离的MSC外排体降低周围肺动脉重塑。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体在出生一小时内施用。在一些实施方案中，分离的MSC外排体在出生一个月内施用。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体静脉内或鼻内施用。在一些实施方案中，将分离的MSC外排体施用于对象的肺或气管。在一些实施方案中，分离的MSC外排体通过吸入施用。在一些实施方案中，分离的MSC外排体以气雾剂施用。在一些实施方案中，分离的MSC外排体使用雾化器施用。在一些实施方案中，分离的MSC外排体使用气管内导管施用。

在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

本文中所述的分离的间充质干细胞(MSC)外排体药物组合物也可用于制备用于治疗肺疾病的药物。

本公开内容的另一些方面提供了分离间充质干细胞(MSC)外排体的方法，该方法包括使用碘克沙醇(IDX)垫层梯度(cushion gradient)对MSC条件培养基进行分级(fractionate)以及收集基本上不含非外排体蛋白质污染物的级分。在一些实施方案中，在分级之前将MSC条件培养基浓缩。在一些实施方案中，通过切向流过滤将MSC条件培养基浓缩。在一些实施方案中，分级包括使MSC条件培养基漂浮在IDX垫层梯度上以及超速离心。

还提供了使用本文中所述的分离方法分离的MSC外排体。

以上发明内容意在以非限制性方式举例说明本文中所公开技术的一些实施方案、优点、特征和用途。通过详细描述、附图、实施例和权利要求书，本文中所公开技术的其他实施方案、优点、特征和用途将是明显的。

附图简述

附图不旨在按比例绘制。在附图中，在多个附图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，并非在每个附图中都标记了每个组件。专利或申请文件包含以彩色绘制的至少一张附图。在请求并支付必要的费用之后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。在附图中：

图1A至1F外排体(EV)的纯化、分离和表征。(图1A)WJMSC、BMSC和HDF分泌异质EV，这些异质EV可通过偶联的持续差速离心进行分离并通过切向流过滤进行浓缩。(图1B)使经浓缩(50×)条件培养基(conditioned media，CM)漂浮在碘克沙醇(IDX)垫层梯度上以纯化和分离EV群(级分9，密度约1.18g/ml)。(图1C)使用纳米颗粒追踪分析(nanoparticletracking analysis，NTA)和蛋白质浓度分别评估IDX垫层(12×1ml级分)中的EV浓度和颗粒：蛋白质比率。线表示蛋白质浓度，并且条形图反映根据NTA的纳米颗粒浓度。级分密度表示为g/ml。(图1D)分离自其相应的级分9梯度的WJMSC-EV、BMSC-EV和HDF-EV的代表性尺寸分布。(图1E)显示异质EV形态的透射电子显微术(TEM)图像(高放大率，×30,000，比例尺＝100nm)。(图1F)使用代表外排体标志物筏蛋白(flotillin)(FLOT-1)和四次穿膜蛋白CD63和CD9的蛋白质的抗体，通过Western印迹分析IDX垫层梯度级分(级分1至6和7至12，并行)。每个泳道加载等体积的每个级分，并示出了代表性图像。

图2A至2B.MSC-EV处理改善了短期肺结构结果。将新生FVB小鼠暴露于HYRX(75％O₂)7天。将经HYRX暴露的小鼠与保持在NRMX(室内空气)的小鼠进行比较。在PN4时静脉内(IV)递送EV处理。在PN14时评估短期结果(图2A中示出的示意图)。(图2B)对收获的肺切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。插入物以200×放大率拍摄。HYRX对照和经HDF-EV处理的小鼠表现出显著的肺泡简化，其特征在于大的气腔(airspace)和不完全的肺泡化。与HYRX对照小鼠的肺气肿样外观相比，接受推注剂量的WJMSC-EV或BMSC-EV的经HYRX暴露动物的肺肺泡化明显改善。平均线性截距(mean liner intercept，MLI，μm)的量化表示平均气腔直径的替代。数据表示来自3项单独研究的结果。平均值±SEM，每组n＝5至15，**p<0.01，***p<0.001。比例尺＝100μm。

图3.MSC-EV处理改善了肺结构并降低了HYRX诱导的纤维化。对于长期结果，在PN42(6周)时对小鼠进行评估。对肺切片进行H&E和马森三色(Masson's Trichrome)染色以分别评估肺泡简化和纤维化的程度。使用Nikon Eclipse 80i显微镜以100×(H&E)和200×(马森三色)放大率捕获切片以显示广泛的肺泡简化以及适度的肺纤维化，其表示为隔区中的胶原蛋白沉积。与HYRX对照动物的肺气肿样外观相比，接受WJMSC-EV或BMSC-EV的小鼠呈现出类似于NRMX对照的恢复的肺泡发育(H&E染色)。评估胶原蛋白沉积，与NRMX对照相比，HYRX对照的隔胶原蛋白沉积适度但显著提高，如通过箭头突出显示的(马森三色染色)。在接受WJMSC-EV或BMSC-EV的经HYRX暴露小鼠中，水平恢复至NRMX对照。通过测量平均线性截距(MLI，μm)来进行肺泡简化的量化。胶原蛋白沉积被用作纤维化的替代并报告为隔区的％。平均值±SEM，每组n＝4至5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。H&E比例尺＝100μm。马森三色比例尺＝50μm。

图4A至4F.MSC-EV施用改善肺动脉高压、挽救周围肺动脉重塑并改善高氧诱导的肺损伤之后的肺功能。几乎没有证据表明WJMSC-exo与BMSC-exo处理之间存在差异，关于它们对长期肺结构、纤维化和肺血管的有益作用，将我们的外排体处理(WJMSC-EV和BMSC-EV)划分在一起并称为MSC-EV。为了评估MSC-EV对HYRX诱导的周围肺血管重塑的潜在影响，用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)对PN42时收获的小鼠的肺切片进行染色。(图4A)HYRX对照与它们的NRMX对应物相比肺血管重塑明显提高，并且MSC-EV处理使HYRX诱导的肺血管重塑的提高钝化(blunt)。插入物以200×放大率拍摄。(图4B)内侧壁厚度指数(media wall thickness index)＝100×(面积_[ext]-面积_[int])/面积_[ext])。面积_[ext]和面积_[int]分别表示α-SMA层的外部边界和内部边界内的面积。平均值±SEM，每组n＝4至5。比例尺＝50μm。(图4C)为了量化肺动脉高压的程度，进行了直接RVSP测量。(图4D)右心室与体重(RV：BW)比率的评估。平均值±SEM，每组n＝6至12。(图4E至4F)在出生后第42天时进行了肺功能测试。(图4E)通过MSC-EV处理显著改善了肺总量(total lung capacity)。(图4F)压力-容积(pressure-volume，PV)关系描绘了代表性的PV环(loop)并显示了HYRX对照动物的向上和向左的显著移动，与NRMX对照相比，指示了肺疾病和空气滞留的肺气肿样特征。接受单剂量MSC-EV的经HYRX暴露的动物显示PV环向下和向右的显著移动(图4F)。平均值±SEM，每组n＝5至8，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(图4G)MSC-exo防止HYRX诱导的周围微脉管系统中的血管损失。在PN42时收获的小鼠中，对肺切片进行冯·维勒布兰德因子(vonWillebrand Factor，vWF)染色。在8至12个随机视图中以100×放大率对25至150μm外径的vWF阳性血管进行计数。代表性的免疫荧光染色显示出经HYRX暴露小鼠中与NRMX对照小鼠相比的小血管(<50μm直径)显著损失以及MSC-exo对小(<50μm)血管数的保护作用。平均值±SEM，每组n＝5至10。比例尺＝100μm。箭头突出显示了经vWF染色的肺血管。(图4H)在图4G中获得的结果的量化。

图5A至5B.WJMSC-EV处理调节高氧肺转录组并使HYRX诱导的炎症钝化。在NRMX对照(n＝3)、HYRX对照动物(n＝2)和经WJMSC-EV处理动物(n＝3)的亚组上进行了PN7时总小鼠肺mRNA的Poly-A捕获RNA测序。(图5A)编目了前50个差异表达基因的热图，这些基因按PN7时的经调整p值排名。(图5B)选择基因谱的验证，表明通过MSC-EV处理抑制促炎标志物，如在分开的实验中通过RT-qPCR评估的。在此，将外排体处理(WJMSC-外排体和BMSC-外排体)的结果划分在一起并称为MSC-EV。盒须图(Box and whiskers plot)表示中值(最小-最大)，每组n＝3至8，*p<0.05。

图6A至6D.MSC-EV的免疫调节能力：巨噬细胞极化效力测定。巨噬细胞极化在调节发育中的肺中的免疫应答和炎症中发挥重要作用。(图6A)向极化至促炎性M1表型的小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)或肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage，MH-S细胞)添加WJMSC-EV降低了标志物例如Il6、Ccl5和TNFα的mRNA诱导。(图6B)向交替(M2)极化的巨噬细胞添加WJMSC-EV超诱导了精氨酸酶-1(Arg-1)mRNA并调节了抵抗素样α(Retnla)和Cd206诱导。使用流式细胞术评估肺巨噬细胞(Cd45^+ve、Cd11b^-ve、Cd11c^+ve、Cd64^+ve)表型。(图6C)在PN7和PN14时评估M1标志物Cd40和Cd86以及M2标志物Cd206。记录中值荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)。(图6D)Cd40、Cd86和Cd206的代表性直方图(图6D)。平均值±SEM，每组n＝4至8，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图7A至7B.细胞表面标志物的细胞计数分析。来自第4代细胞的细胞计数分析的代表性直方图。人脐带WJMSC(图7A)和人真皮成纤维细胞(HDF)(图7B)二者均表达CD105、CD90、CD73和CD44，但缺乏CD11b、CD31、CD34和CD45的表达。未经染色的对照示于浅灰色直方图中，经缀合抗体染色的细胞则示于深灰色中。

图8.间充质干细胞分化能力。使用商业购买的试剂盒评估了WJMSC和HDF培养物对骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系的体外分化潜能。与HDF相比，在接受相应的分化培养基时WJMSC显示出钙沉积(使用茜素红S染色显现的)、脂滴(脂肪生成，然后使用油红对其进行染色)和阳性软骨细胞形成(阿尔新蓝染色)。

图9A至9F.来自PN7和PN14时小鼠肺的mRNA测序数据的全局分析。(图9A)获自从PN7或PN14时小鼠肺提取的RNA的基因表达谱的主成分分析(Principle componentanalysis，PCA)。(图9B)对于PN7和PN14，NRMX小鼠相对于经HYRX暴露小鼠与NRMX相对于用MSC-EV处理的经HYRX暴露小鼠之间的MA图。MA图显示了与平均表达相比的mRNA表达的log倍数变化(归一化计数)。DESeq2用于确定差异表达的转录物(padj<0.1)，其用红色标记。(图9C)与HYRX和NRMX对照相比，通过MSC-EV处理独特上调的基因(在PN7时)的基因本体(gene ontology，GO)富集分析(生物学过程)中前10个类别。(图9D)与NRMX小鼠相比，在HYRX组中升高的基因。(图9E)与HYRX对照小鼠相比，通过MSC-EV处理显著抑制的基因的GO富集分析(生物学过程)中前10个类别。(图9F)突出显示了PN14时通过MSC-EV处理显著调节的基因的热图。

图10A至10B.肺泡巨噬细胞-WJMSC-EV相互作用。(图10A)使用荧光显微术观察到，WJMSC-EV容易与肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)相互作用。比例尺＝20μm。(图10B)以剂量依赖性方式，向MH-S细胞添加WJMSC-EV降低了经典活化的(M1)巨噬细胞标志物(例如Ccl5和TNFα)的mRNA诱导，而向交替极化(M2)巨噬细胞添加WJMSC-EV剂量依赖性地增加了Arg-1mRNA的诱导。+0.05至0.5×10⁶是指MSC-EV(细胞当量)剂量。平均值±SEM，每组n＝3至5，*p<0.05，**p<0.01。

图11.代表性体内肺巨噬细胞门控策略。用于鉴定小鼠肺中的肺巨噬细胞群的代表性门控策略。从酶促消化的小鼠肺分离细胞。排除细胞聚集体和细胞碎片(基于前向和侧向散射参数)，通过Cd45染色鉴定免疫细胞。将顺序门控策略用于鉴定表达特定标志物的肺巨噬细胞群(Cd45^+ve、Cd11b^-ve、Cd11c^+ve、Cd64^+ve)。肺巨噬细胞鉴定之后，通过与适当的荧光减一(fluorescence-minus-one)对照进行比较来评估阳性巨噬细胞表型标志物(Cd40、Cd86和Cd206(上文选择的))。左直方图：(Cd45^+ve、Cd11b^-ve、Cd11c^+ve、Cd64^+ve和Cd206^-ve)：右直方图：(Cd45^+ve、Cd11b^-ve、Cd11c^+ve、Cd64^+ve和Cd206^+ve)。

图12.WJMSC-exo施用对非损伤肺没有作用。NRMX对照动物在PN4时接受了单静脉内(IV)剂量的WJMSC-exo(如方法中所述)。在评估PN14时的肺结构时，未发现NRMX对照小鼠与用WJMSC-exo处理的NRMX小鼠之间的差异(p＝0.9)。MLI：平均线性截距。

图13A至13D.WJMSC-exo和BMSC-exo处理在改善肺动脉高压、防止高氧诱导的微脉管系统损失、挽救周围肺动脉重塑方面显示出相似的趋势。(图13A)为了评估MSC-exo处理对HYRX诱导的周围肺血管重塑的潜在影响，用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)对在PN42时收获的小鼠的肺切片进行染色。内侧厚度指数＝100×(面积_[ext]-面积_[int])/面积_[ext])。面积_[ext]和面积_[int]分别表示α-SMA层的外部边界和内部边界内的面积。显示了与NRMX和HYRX对照相比的两个MSC-exo组(WJMSC-exo和BMSC-exo)的内侧壁厚度值。每组n＝4至5。(图13B)MSC-exo防止高氧诱导的周围微脉管系统中的血管损失。在PN42时收获的小鼠中，对肺切片进行冯·维勒布兰德因子(vWF)染色。每组n＝5。为了量化肺动脉高压的程度，我们在PN42时的小鼠中进行了直接RVSP测量(图13C)并评估了富尔顿指数(Fulton's index)(图13D)。每组n＝6至12。平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，

相对于HYRX。

图14.WJMSC-exo和BMSC-exo改变了肺转录组。在分开的实验中通过RT-qPCR评估了所选全肺RNA测序(RNA-seq)数据的有效性以及WJMSC-exo和BMSC-exo处理对候选促炎标志物的抑制。平均值±SEM，每组n＝3至4，*p<0.05，相对于HYRX对照。

具体实施方式

本公开内容至少部分地基于以下令人惊讶的发现：间充质干细胞外排体(MSC外排体)是异质的并且总MSC外排体的亚群提供了MSC外排体在治疗肺疾病例如支气管肺发育不良(BPD)中的治疗效力。MSC外排体的经纯化级分的外排体含量高并且蛋白质污染物低。鉴定了与来源于其他细胞类型的外排体(exome)或MSC外排体的另一些级分相比，在MSC外排体的经纯化级分上差异表示的蛋白质标志物。发现经纯化MSC外排体具有免疫调节活性并在治疗多种病症(例如，肺疾病)方面有效。还提供了对外排体亚群进行纯化的方法。

因此，本公开内容的一些方面涉及分离的MSC外排体。“外排体”是从细胞(例如，任何真核细胞)释放的膜(例如，脂双层)囊泡。外排体存在于真核生物的流体包括血液、尿和细胞培养的培养基中。本公开内容的外排体从间充质干细胞(MSC)释放并且可互换地称为“间充质干细胞外排体”或“MSC外排体”。类似地，从成纤维细胞释放的外排体在本文中称为“成纤维细胞外排体”。在本文中出人意料地发现，从其他细胞类型(例如，成纤维细胞)释放的外排体不具有与MSC外排体相同的特性(例如，蛋白质标志物和生物学活性)。

“间充质干细胞(MSC)”是具有分化为神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、心脏组织和其他内皮或上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如Wang，Stem Cells2004；22(7)；1330-7；McElreavey；1991Biochem Soc Trans(1)；29s；Takechi，Placenta1993年3月/4月；14(2)；235-45；Takechi，1993；Kobayashi；Early Human Development；1998；7月10日；51(3)；223-33；Yen；Stem Cells；2005；23(1)3-9.)这些细胞可以通过基因或蛋白质表达在表型上定义。这些细胞的特征在于表达以下中的一种或更多种(并因此对其呈阳性)：CD13，CD29，CD44，CD49a、b、c、e、f，CD51，CD54，CD58，CD71，CD73，CD90，CD102，CD105，CD106，CDw119，CD120a，CD120b，CD123，CD124，CD126，CD127，CD140a，CD166，P75，TGF-bIR，TGF-bIIR，HLA-A、B、C，SSEA-3，SSEA-4，D7和PD-L1。这些细胞的特征还在于不表达CD3，CD5，CD6，CD9，CD10，CD11a，CD14，CD15，CD18，CD21，CD25，CD31，CD34，CD36，CD38，CD45，CD49d，CD50，CD62E、L、S，CD80，CD86，CD95，CD117，CD133，SSEA-1和ABO(并因此对其呈阴性)。因此，可以根据MSC的分化潜能在表型和/或功能上对其进行表征。

MSC可从许多来源收获，这些来源包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如，沃顿胶)和胎盘。用于收获MSC的方法在本领域中，例如在美国专利No.5486359中有所描述，其通过引用并入本文。

MSC可基于它们对组织培养塑料的黏附性而分离自多种来源，例如，骨髓单个核细胞、脐带血、脂肪组织、胎盘组织。例如，MSC可分离自市售骨髓抽吸物。MSC在细胞群内的富集可以使用本领域已知的方法包括但不限于荧光激活细胞分选(fluorescence-activatedcell sorting，FACS)来实现。

市售培养基可用于MSC的生长、培养和维持。这样的培养基包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)。在这样的培养基中可用于MSC、成纤维细胞和巨噬细胞的生长、培养和维持的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然)、盐、糖、植物来源的水解物、丙酮酸钠、表面活性物质、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸酯或有机物、DMSO、动物来源的产品、基因诱导物、非天然糖、细胞内pH的调节物、甜菜碱或渗透保护剂、痕量元素、矿物质、非天然维生素。可用于补充市售组织培养基的另外的组分包括例如，动物血清(例如，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、马血清(HS))、抗生素(例如，包括但不限于青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、吉欧霉素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如，L-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长还取决于适当的有氧环境、pH和温度的维持。MSC可以使用本领域已知的，例如如Pittenger et al.，Science，284：143-147(1999)中所述的方法来维持，该文献通过引用并入本文。

成纤维细胞是合成细胞外基质和胶原蛋白(动物组织的结构框架(例如，基质))并且在伤口愈合中发挥关键作用的一类细胞。成纤维细胞是动物中最常见的结缔组织细胞。成纤维细胞通常在具有两个或更多个核仁的椭圆的、有斑点的核周围具有分支的细胞质。活性成纤维细胞可以通过其丰富的粗面内质网(rough endoplasmic reticulum)来识别。非活性成纤维细胞(也称为纤维细胞)较小并且呈纺锤状。它们具有减少的粗面内质网。

成纤维细胞的来源包括结缔组织，例如疏松、致密、弹性、网状和脂肪结缔组织。此外，还有胚胎结缔组织以及专门的结缔组织，其包括骨、软骨和血液。其他来源包括皮肤。用于分离和培养成纤维细胞的方法是本领域公知的(参见例如，Weber et al.，“Isolationand Culture of Fibroblasts，Vascular Smooth Muscle，and Endothelial Cells Fromthe Fetal Rat Ductus Arteriosus.”Pediatric Research.2011；70，236-241；Huschtscha et al.，“Enhanced isolation of fibroblasts from human skinexplants.”Biotechniques.2012；53(4)：239-44；其全部内容在此通过引用并入)。

本公开内容的一些方面涉及分离的外排体。如本文中所用的，“分离的外排体”是与其天然环境物理分离的外排体。分离的外排体可从其天然存在的组织或细胞(包括MSC、成纤维细胞和巨噬细胞)全部或部分地物理分离。在一些实施方案中，分离的外排体是分离的MSC外排体。在一些实施方案中，分离的MSC外排体分离自来自人骨髓或脐带沃顿胶的MSC的培养基。这样的培养基在本文中称为“MSC条件培养基”。在一些实施方案中，分离的外排体可以不含细胞例如MSC，或者其可以不含或基本上不含条件培养基，或者其可以不含任何生物污染物例如蛋白质。通常，与在未经操纵的条件培养基中存在的外排体相比，分离的外排体以更高的浓度提供。

本公开内容的分离的MSC外排体的特征在于与来源于其他细胞类型(例如，成纤维细胞)的外排体或纯化过程产生的其他级分相比存在或富集的标志物(例如，蛋白质)。如本文中所用的，“标志物”是指与MSC外排体相关并在本文中所述的纯化方法中与MSC外排体共纯化的分子(例如，蛋白质)。与MSC外排体相关的标志物可以与MSC外排体的脂质膜结合(例如，在外表面上结合，或者被插入到脂质膜中)，或者被MSC外排体包封。在外排体中检测某些标志物的方法是本领域技术人员已知的，例如，western印迹、免疫染色或质谱。

在一些实施方案中，本公开内容的分离的MSC外排体包含选自以下的一种或更多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种)标志物：FLT1(血管内皮生长因子受体1，Uniprot ID P17948)、PLAUR(尿激酶纤溶酶原激活物表面受体，Uniprot ID Q03405)、MME(脑啡肽酶(Neprilysin)，Uniprot ID P08473)、CDH2(钙黏着蛋白-2，P19022)、SLC16A3(单羧酸转运蛋白4，Uniprot ID：O15427)、CDH13(钙黏着蛋白-13，Uniprot ID：P55290)、ITGB5(整合素β-5，Uniprot ID：P18084)、ITGA11(整合素α-11，Uniprot ID：Q9UKX5)、APP(淀粉样β A4蛋白，Uniprot ID：P05067)、GPC6(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6，Uniprot ID：Q9Y625)、IGSF8(免疫球蛋白超家族成员8，Uniprot ID：Q969P0)、IRP2(铁反应元件结合蛋白2(Iron-responsive element-binding protein 2)，也称为IREB2，uniprot ID：P48200)，TSPAN9(四次穿膜蛋白-9，Uniprot ID：O75954)、DAG1(肌氧蛋白聚糖，Uniprot ID：Q14118)、SLC38A2(钠偶联中性氨基酸转运蛋白2，Uniprot ID：Q96QD8)、SLC12A8(溶质载体家族12成员8(Solute carrier family 12member 8)，Uniprot ID：AOAV02)、GJA1(间隙连接α-1蛋白，Uniprot ID：P17302)、ITGA1(整合素α-1，Uniprot ID：P56199)、PLXNB2(丛状蛋白-B2(Plexin-B2)，Uniprot ID：O15031)、SLC16A1(单羧酸转运蛋白1，Umiprot ID：P53985)和PROCR(内皮细胞蛋白C受体，Uniprot ID：Q9UNN8)。分离的MSC外排体“包含标志物”意指该标志物在分离的外排体中是可检测的，例如，通过western印迹、免疫染色或质谱。在一些实施方案中，标志物在来源于除MSC之外的细胞类型(例如，成纤维细胞)的外排体中不存在(例如，不可检测)。

在一些实施方案中，本公开内容的分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种)标志物，所述一种或更多种标志物选自：PTk7(非活性酪氨酸蛋白激酶7，Uniprot ID：Q13308)、CD109(CD109抗原，Uniprot ID：Q6YHK3)、SLC1A5(中性氨基酸转运蛋白B(0)，Uniprot ID：Q15758)、ITGA3(整合素α-3，Uniprot ID：P26006)、ITGA2(整合素α-2，Uniprot ID：P17301)、BSG(基础免疫球蛋白(Basigin)，Uniprot ID：P35613)、DPP4(二肽基肽酶4，Uniprot ID：P27487)、ATP1A1(钠/钾转运ATP酶亚基α-1，Uniprot ID：P05023)、FAP(脯氨酰内肽酶FAP，Uniprot ID：Q12884)、VASN(Vasorin，Uniprot ID：Q6EMK4)、IGF2R(阳离子非依赖6-磷酸甘露糖受体，Uniprot ID：P11717)和CD82(CD82抗原，Uniprot ID：P27701)。

在一些实施方案中，本公开内容的分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种)标志物，所述一种或更多种标志物选自：RCN1(网钙结合蛋白-1(Reticulocalbin-1)，Uniprot ID：Q15293)、RAP1B(Ras相关蛋白Rap-1b，Uniprot ID：P61224)、GDF15(生长/分化因子15，Uniprot ID：Q99988)、FLT1(血管内皮生长因子受体1，Uniprot ID：P17948)、OLFML3(嗅介蛋白样蛋白3(Olfactomedin-like protein 3)，Uniprot ID：Q9NRN5)、PLOD2(前胶原-赖氨酸(Procollagen-lysine)，2-氧化戊二酸5-双加氧酶2，Uniprot ID：O00469)、PSMA4(蛋白酶体亚基α4型，Uniprot ID：P25789)、PAPPA(冠毛素-1(Pappalysin-1)，Uniprot ID：Q13219)、INHBA(抑制素βA链，Uniprot ID：P08476)、SPOCK1(睾丸蛋白聚糖(Testican)-1，Uniprot ID：Q08629)、HSPB1(热休克蛋白β-1，Uniprot ID：P04792)、LOXL4(赖氨酰氧化酶同源物4，Uniprot ID：Q96JB6)、POLD3(DNA聚合酶δ亚基3，Uniprot ID：Q15054)、CALU(钙腔蛋白(Calumenin)，Uniprot ID：O43852)、IGFBP4(胰岛索样生长因子结合蛋白4，Uniprot ID：P22692)、C4B(补体C4-B，Uniprot ID：P0C0L5)、TINAGL1(肾小管间质性肾炎抗原样，Uniprot ID：Q9GZM7)、SULF1(胞外硫酸酯酶Sulf-1，Uniprot ID：Q8IWU6)、TPM3(原肌球蛋白α-3链，Uniprot ID：P06753)、AHNAK(成神经细胞分化相关蛋白AHNAK，Uniprot ID：Q09666)、CALR(钙网蛋白，Uniprot ID：P27797)、RRAS2(Ras相关蛋白R-Ras2，Uniprot ID：P62070)、PFKP(ATP依赖性6磷酸果糖激酶，血小板类型，Uniprot ID：Q01813)和COL16A1(胶原蛋白α-1(XVI)链，Uniprot ID：Q07092)。

在分离的MSC外排体中“富集的”标志物意味着，在分离的MSC外排体中该标志物以以下水平存在：至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多，高于来源于其他细胞类型(例如，成纤维细胞)的外排体中该标志物的水平。在一些实施方案中，在分离的MSC外排体中标志物以以下水平存在：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多，高于来源于其他细胞类型的外排体(例如，成纤维细胞外排体)中该标志物的水平。

在一些实施方案中，本文中所述的分离的MSC外排体包含一种或更多种(例如，1、2、3、4、5或更多种)已知的外排体标志物。在一些实施方案中，所述已知的外排体标志物选自：FLOT1(筏蛋白-1，Uniprot ID：O75955)、CD9(CD9抗原，Uniprot ID：P21926)和CD63(CD63抗原，Uniprot ID：P08962)。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体基本上不含污染物(例如，蛋白质污染物)。当分离的MSC外排体的制剂中包含少于20％、15％、10％、5％、2％、1％、或少于1％的任何其他物质(例如，蛋白质)时，分离的MSC外排体“基本上不含污染物”。在一些实施方案中，当分离的MSC外排体的制剂为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％纯(相对于污染物(例如，蛋白质))时，分离的MSC“基本上不含污染物”。

“蛋白质污染物”是指与分离的外排体不相关并且对外排体的生物学活性没有贡献的蛋白质。蛋白质污染物在本文中也称为“非外排体蛋白质污染物”。

本文中所述的分离的MSC外排体的直径为约30至150nm。例如，分离的MSC外排体的直径可以为30至150、30至140、30至130、30至120、30至110、30至100、30至90、30至80、30至70、30至60、30至50、30至40、40至150、40至140、40至130、40至120、40至110、40至100、40至90、40至80、40至70、40至60，40至50、50至150nm、50至140nm、50至130nm、50至120nm、50至110nm、50至100nm、50至90nm、50至80nm、50至70nm、50至60nm、60至150nm、60至140nm、60至130nm、60至120nm、60至110nm、60至100nm、60至90nm、60至80nm、60至70nm、70至150nm、70至140nm、70至130nm、70至120nm、70至110nm、70至100nm、70至90nm、70至80nm、80至150nm、80至140nm、80至130nm、80至120nm、80至110nm、80至100nm、80至90nm、90至150nm、90至140nm、90至130nm、90至120nm、90至110nm、90至100nm、100至150nm、100至140nm、100至130nm、100至120nm、100至110nm、110至150nm、110至140nm、110至130nm、110至120nm、120至150nm、120至140nm、120至130nm、130至150nm、130至140nm或140至150nm。在一些实施方案中，分离的MSC外排体的直径可以为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。在一些实施方案中，分离的MSC外排体表现出双凹形态。

如本文中所述，分离的MSC外排体具有生物学活性，并且MSC外排体在治疗肺疾病中的治疗效力可以归因于该分离的(经纯化)级分。因此，分离的MSC外排体可用于治疗疾病(例如，肺疾病)，或用于制备治疗疾病(例如，肺疾病)的药物。

本公开内容的一些方面涉及包含本文中所述的分离的MSC外排体的药物组合物。在一些实施方案中，这样的药物组合物还包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和/或其他(即，第二)治疗剂。

可药用载体是可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或运输预防性或治疗性活性剂。每种载体必须是从与制剂的其他成分相容且对对象无害的意义说的“可接受的”。可用作可药用载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等张盐水；林格溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。

在一些实施方案中，将包含分离的MSC外排体的药物组合物配制成用于治疗肺疾病。另外，药物组合物还可包含可用于治疗肺疾病的其他治疗剂(第二试剂)。如本文中所用的，治疗剂是指可用于预防、治疗和/或控制肺疾病的任何药剂，例如本文所讨论的那些。这些包括但不限于表面活性物质、吸入一氧化氮、二甲磺酸阿米三嗪(almitrinebismesylate)、免疫调节剂和抗氧化剂。免疫调节剂的实例包括类固醇和皮质类固醇，例如但不限于甲基泼尼松龙。抗氧化剂的实例包括但不限于超氧化物歧化酶。

用于治疗或控制某些肺疾病和其他疾病(包括但不限于肺动脉高压)的某些第二治疗剂包括氧；抗凝剂，例如华法林(warfarin)(可迈丁(Coumadin))；利尿剂，例如呋塞米(furosemide)

或螺内酯(spironalactone)

钙通道阻滞剂；钾，例如

变力剂(inotropic agent)，例如地高辛；血管扩张药，例如硝苯地平

或地尔硫

内皮素受体拮抗剂，例如波生坦

和安倍生坦

前列环素类似物，例如依前列醇

曲前列尼尔钠(treprostinil sodium)

和伊洛前列素

以及PDE-5抑制剂，例如西地那非

和他达拉非

在一些实施方案中，为了治疗肺疾病，第二药剂是肺表面活性物质。“肺表面活性物质”是可用于保持肺气道开放(例如，通过防止肺泡壁彼此间的黏附)的脂蛋白混合物。肺表面活性物质可以由以下构成：磷脂，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、磷脂酰胆碱(phosphotidylcholine，PC)、磷脂酰甘油(phosphotidylglycerol，PG)；胆固醇；以及蛋白质，例如SP-A、B、C和D。肺表面活性物质可来源于天然存在的来源，例如牛或猪肺组织。实例包括Alveofact^TM(来自牛肺灌洗液)、Curosurf^TM(来自碎的猪肺)、Infasurf^TM(来自小牛肺灌洗液)和Survanta^TM(来自碎的牛肺，具有另外的组分，包括DPPC、棕榈酸和三棕榈精)。肺表面活性物质也可以是合成的。实例包括Exosurf^TM(由DPPC与十六醇和泰洛沙泊构成)、Pumactant^TM或人造肺扩张剂(Artificial Lung Expanding Compound，ALEC)(由DPPC和PG构成)、KL-4(由DPPC、棕榈酰基-油酰基磷脂酰甘油(palmitoyl-oleoyl phosphatidylglyercol)、棕榈酸和模拟SP-B的合成肽构成)、Venticute^TM(由DPPC、PG、棕榈酸和重组SP-C构成)。肺表面活性物质可从商业供应商获得。

本公开内容的另一些方面提供了治疗肺疾病的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文中所述的分离的MSC外排体，或包含这样的分离的MSC外排体的药物组合物。可使用本文中所述方法治疗的肺疾病包括但不限于肺动脉高压(PH)(也称为肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH))、哮喘、支气管肺发育不良(BPD)、变态反应、结节病和特发性肺纤维化。这些疾病还包括可没有炎性组分的肺血管疾病。可根据本公开内容治疗的另一些肺部病症包括急性肺损伤，其可与脓毒症或与通气相关。后一种情况的一个实例是在大龄儿童和成人中发生的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome)。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗支气管肺发育不良(BPD)。BPD是影响已给予氧或已在呼吸机上的新生儿或者早产的新生儿，特别是极早产的那些(例如，妊娠32周之前出生的那些)的病症。其也称为新生儿慢性肺病。BPD的病因包括机械损伤(例如由于通气引起)、氧中毒(例如由于氧治疗引起)和感染。该疾病可随着时间从非炎性进展为炎性。症状包括带蓝色的皮肤、慢性咳嗽、呼吸快速和呼吸短促。患有BPD的对象更易受感染例如呼吸道合胞病毒感染(respiratory syncytial virus infection)的影响。患有BPD的对象可发生肺动脉高压。患有BPD的对象也可在肺中有炎症，并表现出周围肺动脉重塑和肺纤维化。本公开内容提供了在对象中治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法。如本文中所证明的，推注剂量的分离的MSC外排体在改善与BPD相关的短期和长期症状方面有效。可以使用本文中提供的方法治疗的对象可以是正患有或已患有BPD的新生儿、儿童或成人。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗肺动脉高压。肺动脉高压是肺疾病，其特征在于肺动脉中的血压高于正常水平。症状包括呼吸短促，胸痛(特别是在身体活动期间)，虚弱，疲劳，昏厥，轻度头痛(特别是在锻炼期间)，眩晕，异常的心音和杂音，颈静脉充盈，流体在腹、腿和踝中滞留，以及甲床呈蓝色。在一些实施方案中，高氧条件(例如，当将氧施用于对象时)可诱导肺动脉高压(高氧诱导的肺动脉高压)。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。ARDS也称为呼吸窘迫综合征(RDS)或成人呼吸窘迫综合征是由于肺损伤或急性疾病引起的病症。肺损伤可以是通气、创伤、烧伤和/或抽吸引起的。急性疾病可以是感染性肺炎或脓毒症。其被认为是严重形式的急性肺损伤，并且通常是致命的。其特征在于肺炎症、气体交换受损、和炎性介质释放、低氧血症和多器官衰竭。ARDS也可定义为在胸部X射线上存在双侧浸润的情况下，动脉部分氧张力(arterial partial oxygen tension，PaO₂)与吸入氧分数(fraction of inspired oxygen，FiO₂)的比值低于200mmHg。在双侧浸润的情况下，PaO2/FiO2比值小于300mmHg指示急性肺损伤，其通常是ARDS的前兆。ARDS的症状包括呼吸短促、呼吸急促和由于氧水平低而引起的精神错乱。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗特发性肺纤维化。特发性肺纤维化的特征在于没有已知原因的肺部瘢痕化或增厚。其最常在50至70岁的人中发生。其症状包括呼吸短促、经常咳嗽(通常是干咳)、胸痛和活动水平降低。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗变态反应。变态反应是免疫系统的超敏性病症，症状包括红眼、痕痒(itchiness)和流鼻涕、湿疹、荨麻疹(hives)或哮喘发作。变态反应在病症例如哮喘中发挥主要作用。对环境或饮食变应原或药物的严重变态反应可导致称为过敏反应的威胁生命的反应。当人的免疫系统对环境中常常为通常无害的物质起反应时，就会发生变应性反应。变态反应是四种超敏反应形式之一，并且有时称为I型(或速发)超敏反应。由于免疫球蛋白E(IgE)过度激活特定白细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)，因此变态反应是独特的。该反应导致炎性应答，其可从轻微不适变化到危险。存在用于诊断变应性病症的多种测试。测试包括在皮肤上放置可能的变应原以及寻找反应(例如肿胀)和血液测试来寻找变应原特异性IgE。

在一些实施方案中，本文中所述的方法用于治疗缺氧诱导的肺炎症。缺氧诱导的肺炎症通常是由急性肺损伤和/或ARDS引起的病症，在此，炎性应答是由长期暴露于缺氧条件导致的。在暴露于低压性缺氧的人的支气管肺泡灌洗液中，这样的炎性应答包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和炎性细胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的提高。

“有效量”是实现期望结果的药剂的量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用的材料、以单剂量还是多剂量施用，以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、身材大小、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且仅通过常规实验即可解决。

在一些实施方案中，有效量是不引起对于对象的毒性的药剂剂量。在一些实施方案中，有效量是引起对于对象的毒性降低的药剂剂量。用于测量毒性的方法是本领域公知的(例如，肝、脾和/或肾的活检/组织学；用于肝毒性的丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和胆红素测定；以及用于肾毒性的肌酐水平)。

“治疗”包括但不限于预防肺疾病的发生、降低或停止肺疾病的发展、减轻或消除肺疾病的症状、或者预防肺疾病。

对象应意指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类动物(例如猴子)。本公开内容的方法可用于治疗有此需要的对象。有此需要的对象可以是具有发生肺疾病的风险(即，通过基因测试)的对象或患有肺疾病的对象。

所述对象可以是患有适合使用本公开内容中所述的外排体进行治疗的本文中所述疾病(或病症)的那些，或者其可以是处于发生这样的疾病(或病症)的风险之中的对象。这样的对象包括新生儿并且特别是在低孕龄出生的新生儿。如本文中所用的，人新生儿是指从出生时间至约4周龄的人。如本文中所用的，人婴儿是指约4周龄至约3岁的人。如本文中所用的，低孕龄是指给定物种在正常妊娠期(gestational term)之前发生的出生(或分娩)。在人中，完整的妊娠期为约40周并且可从37周至多于40周。在人中，类似于早产的低孕龄被定义为在妊娠37周之前发生的出生。因此，本公开内容考虑了预防和/或治疗在妊娠37周之前出生的对象，包括以甚至更短的妊娠期(例如，在妊娠36周之前、35周之前、34周之前、33周之前、32周之前、31周之前、30周之前、29周之前、28周之前、27周之前、26周之前或25周之前)出生的那些。在一些实施方案中，对象已施用氧。在一些实施方案中，对象已进行机械干预，例如有或没有外源氧施用的通气。在一些实施方案中，对象患有高氧诱导的肺损伤。在一些实施方案中，对象已发生BPD或处于发生BPD的风险之中。

对于婴儿或新生儿，甚至超过新生儿阶段以及进入儿童期和/或成年期，本公开内容考虑了其治疗。例如，在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象为3至18岁。在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象可以为3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9、6至8、6至7、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、7至8、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、8至9、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、9至13、9至12、9至11、9至10、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、10至13、10至12、10至11、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、11至13、11至12、12至18、12至17、12至16、12至15、12至14、12至13、13至18、13至17、13至16、13至15、13至14、14至18、14至17、14至16、14至15、15至18、15至17、15至16、16至18、16至17或17至18岁。在一些实施方案中，对象是成人，例如18岁或大于18岁。

某些对象可对本文中所述的某些形式的疾病(或病症)(例如肺动脉高压)具有遗传易感性，并且那些对象也可以根据本公开内容进行治疗。

对于新生儿并且特别是低孕龄的新生儿，本公开内容考虑了在出生1年、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内施用分离的MSC外排体。在一些实施方案中，分离的MSC外排体在出生1小时内(例如，1小时内、55分钟内、50分钟内、45分钟内、40分钟内、35分钟内、30分钟内、25分钟内、20分钟内、15分钟内、10分钟内、5分钟内或1分钟内)施用。

本公开内容还考虑了即使在不存在指示如本文中所述的疾病或病症的症状的情况下施用分离的MSC外排体。

在一些实施方案中，将分离的MSC外排体或包含分离的外排体的组合物以推注剂量施用于对象(例如，新生儿)。“推注剂量”是指为了达到治疗有效水平而单次施用药物、药或其他化合物的个别量。在一些实施方案中，考虑了重复施用分离的MSC外排体，包括两次、三次、四次、五次或更多次施用分离的MSC外排体。在一些情况下，分离的MSC外排体可以持续施用。取决于所治疗病症的严重程度，重复或持续施用可在数小时(例如，1至2、1至3、1至6、1至12、1至18或1至24小时)、数天(例如，1至2、1至3、1至4、1至5、1至6天或1至7天)或数周(例如，1至2周、1至3周或1至4周)的时间内进行。如果重复但不持续施用，则施用之间的时间可以为数小时(例如，4小时、6小时或12小时)、数天(例如，1天、2天、3天、4天、5天或6天)或数周(例如，1周、2周、3周或4周)。施用之间的时间可以相同或者它们可以不同。例如，如果疾病的症状显示出会恶化，则可以更频繁地施用a型外排体，并随后一旦症状稳定或减轻，就可以不那么频繁地施用a型外排体。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体在出生24小时内施用至少一次并随后在出生1周内再施用至少一次。在一些实施方案中，分离的MSC外排体在出生1小时内施用至少一次并随后在出生3至4天内再施用至少一次。

分离的MSC外排体可通过影响向肺或其他组织的递送的任何途径施用。全身性施用途径例如静脉内推注注射(intravenous bolus injection)或持续输注(continuousinfusion)是合适的。本公开内容还考虑了更直接的途径，例如鼻内施用、气管内施用(例如，通过插管)和吸入(例如，通过穿过口或鼻的气雾剂)，并且在一些情况下这些更直接的途径可更合适，特别是在需要速效性作用(rapid action)的情况下。如本文中所用的，气雾剂是在气体中作为小颗粒分散的液体悬浮液，并且其包含细雾或包含这样的颗粒的喷雾。如本文中所用的，雾化是通过将液体悬浮液转变成小颗粒或小滴来产生气雾剂的过程。这可以使用气雾剂输送系统例如加压包装或雾化器来完成。雾化器包括空气喷射(即气动)、超声和振动网孔式(vibrating-mesh)雾化器，例如使用合适的推进剂例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。除雾化器之外，用于肺部递送的其他装置包括但不限于定量吸入器(metered dose inhaler，MDI)和干粉吸入器(dry powder inhaler，DPI)。可以配制例如用于吸入器或吹入器(insufflator)的明胶的胶囊和药筒(cartridge)，其包含冻干的外排体和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉。

当期望全身性递送分离的MSC外排体时，可将其配制成用于通过注射(包括例如通过推注注射或持续输注)进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以在有或没有添加防腐剂的情况下以例如安瓿中或多剂量容器中的单位剂型存在。组合物可以采取如在油性或水性载剂中的水溶性混悬剂、溶液剂或乳剂这样的形式，并且可包含配制剂(formulatoryagent)，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬剂可包含提高混悬剂黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮剂还可包含合适的稳定剂或提高溶解度的试剂。作为替代地，外排体可以是冻干的或其他粉末或固体形式以用于在使用之前与合适的载剂例如无菌的无热原水一起配制。

应理解的是，根据本公开内容向所治疗对象施用的其他药剂可通过任何合适的途径施用，包括经口施用、鼻内施用、气管内施用、吸入、静脉内施用等。本领域普通技术人员将知晓这样的第二药剂的习惯性施用途径。

在一些实施方案中，当将分离的MSC外排体或包含MSC外排体的药物组合物施用于对象时，其改善了肺功能。在本文中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了至少20％时，认为肺功能得到“改善”。例如，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可认为肺功能得到改善。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为肺功能得到改善。

评价肺功能的方法是本领域技术人员已知的。这样的方法的非限制性实例包括肺量计法(spirometry)(测量空气流速并估计肺的大小)、肺容量测试(测量肺可容纳多少空气)、肺弥散量(diffusion capacity)(评估氧从吸入的空气进入血液的程度如何)、脉搏氧饱和度法(pulse oximetry)(估计血液中的氧水平)、动脉血气测试(直接测量血液中气体例如氧和二氧化碳的水平)以及呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide)测试(测量空气中有多少呼出的一氧化氮)。

在一些实施方案中，当将分离的MSC外排体或包含MSC外排体的药物组合物施用于对象时，其恢复了肺结构。在本文中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的结构(例如，如由具有正常(例如，在健康对象中)结构形态的肺泡的百分比所指示的)提高了至少20％时，认为肺结构是“恢复的”。例如，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的结构(例如，如由具有正常(例如，在健康对象中)结构形态的肺泡的百分比所指示的)改善了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可认为肺的结构是“恢复的”。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺的结构(例如，如由具有正常(例如，在健康对象中)结构形态的肺泡的百分比所指示的)改善了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，可认为肺的结构是“恢复的”。技术人员熟悉评估肺结构的方法。

在一些实施方案中，当将分离的MSC外排体或包含MSC外排体的药物组合物施用于对象时，其降低了肺纤维化。“肺纤维化”是指其中肺组织受损并瘢痕化，导致肺组织增厚和僵硬以及肺功能下降的病症。肺纤维化可有多种原因。肺纤维化通常见于患有BPD的对象。在本文中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺纤维化的程度(例如，如通过肺组织上的胶原蛋白沉积所指示的)降低了至少20％时，认为肺纤维化“降低”。例如，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺纤维化的程度(例如，如通过肺组织上的胶原蛋白沉积所指示的)降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％时，可认为肺纤维化降低。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中当肺纤维化的程度(例如，如通过肺组织上的胶原蛋白沉积所指示的)降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％时，认为肺纤维化降低。

在一些实施方案中，当将分离的MSC外排体或包含MSC外排体的药物组合物施用于对象时，其降低了肺中的炎症。本领域技术人员熟悉评估肺中的炎症程度的方法，例如通过测量肺或血液中炎症的生物标志物水平。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中，肺中的炎症降低了至少20％。例如，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中炎症可降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中炎症降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。不希望受到科学理论的束缚，本文中所述的分离的MSC外排体可能通过调节参与免疫应答和炎症的基因的表达和/或调节巨噬细胞极化而显示出具有免疫调节活性。“免疫调节活性”是指在调节(例如，增强或降低)免疫应答和/或炎性应答中描述的分离的MSC外排体的活性。如本文中所述，分离的MSC外排体下调多种促炎基因的表达(例如，在图9E中)。

在一些实施方案中，当将分离的MSC外排体或包含MSC外排体的药物组合物施用于对象时，其降低了周围肺动脉重塑。“周围肺动脉重塑”是肺动脉高压(PAH)的重要病理特征，其导致肺血管阻力提高和依从性降低，同时肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterysmooth muscle cell，SMC)和/或内皮细胞(EC)显著增殖，导致阻力肺动脉中的血流阻塞。某些形式的肺动脉重塑是可逆的。“降低”肺动脉重塑可通过防止新的重塑或逆转旧的重塑来实现。本领域技术人员熟悉评估肺动脉重塑程度的方法。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中肺动脉重塑降低了至少20％。例如，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中肺动脉重塑可降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，与在未施用分离的MSC外排体的对象中相比，在已施用分离的MSC外排体的对象中肺动脉重塑降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

本公开内容的另一些方面提供了分离本文中所述的MSC外排体的方法。分离的MSC外排体基本上不含其他物质例如蛋白质污染物，并保留了MSC外排体的治疗效力。如本文中(例如，图1A和1B中)所述，将MSC(例如，来自沃顿胶或骨髓的MSC)的培养基浓缩(例如，通过切向流过滤)，并通过10％至55％梯度的碘克沙醇(IDX)垫层进行分级。通过使经浓缩培养基漂浮在IDX垫层的顶部并对混合物进行超速离心来实现分级。如图1B中所示收集级分，并且级分9包含本文中所述的分离的MSC外排体。级分9中的MSC外排体蛋白质含量较低并且MSC外排体含量高。在一些实施方案中，级分9中的MSC外排体基本上不含非外排体蛋白质污染物。

分离的MSC外排体(级分9)可立即使用(例如，在本文中所述的方法中)，或者作为替代地，可将分离的MSC外排体在使用之前例如以冷藏保存的状态短期和/或长期储存。蛋白酶抑制剂通常包含在冷冻培养基中，因为它们可在长期储存期间提供外排体的完整性。在-20℃下冷冻不是优选的，因为其与外排体活性损失的提高相关。在-80℃下快速冷冻是更优选的，因为其可以保存活性。(参见例如Kidney International(2006)69，1471-1476.)可以使用冷冻培养基的添加剂以增强外排体生物活性的保存。这样的添加剂将类似于用于冷冻保存完整细胞的添加剂并且可包括但不限于DMSO、甘油和聚乙二醇。

通过以下实施例，将更充分地理解本文中所公开技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在举例说明本公开内容的一些益处并描述一些特定实施方案，但不旨在示例本公开内容的全部范围，并因此，不限制本公开内容的范围。

实施例

实施例1：干细胞外排体通过巨噬细胞免疫调节改善支气管肺发育不良并恢复肺功能。

支气管肺发育不良(BPD)是几乎仅在需要机械通气和氧治疗的早产儿中发生的慢性肺疾病。其特征在于肺生长受限(组织简化)、肺泡和血管发育受到抑制以及肺功能受损。数个BPD结果与长期肺部并发症例如异常的肺功能测试结果、气道高反应性改变以及在中度至重度病例中继发性肺动脉高压(PH)相关(1-5)。由于没有有效的单一治疗来预防或治疗发育性肺损伤，迫切需要新的工具来治疗与极早产相关的这样的终身并发症以及减轻与极早产相关的这样的终身并发症的负担。

除肺发育受限之外，数名调查人员还已注意到干细胞/祖细胞群的损失，其可能是观察到的组织简化的基础(6-8)。这样的发现为将基于干细胞的治疗应用于改善与早产相关的肺损伤提供了平台。不同的干/祖细胞类型，例如间充质干细胞(MSC)(9-11)、内皮集落形成细胞(endothelial colony forming cell，ECFC)(12)和人羊膜上皮细胞(humanamnion epithelial cell，hAEC)(13)的施用已在用于预防和/或治疗BPD和其他主要早产后遗症的临床前模型中显示出了希望(14，15)。

尽管MSC治疗之后接受者肺中有了实质性生理学改善，但数项临床前研究指出，肺中没有显著的供体细胞移入，表明其治疗性作用机制可能是旁分泌的或间接的(16，17)。事实上，先前的工作(9，18，19和20)已证明，在临床前BPD模型中，MSC的无细胞条件培养基(CM)在保护肺部结构和防止肺泡损失方面比MSC本身提供更优的保护作用。间充质干细胞(MSC)治疗已在BPD的临床前模型中显示出了希望，并且最近的研究确定，MSC的主要治疗载体之一包含在其分泌组中并以外排体(细胞外囊泡；EV)为代表，并且特别是通过胞吞途径产生的较小(直径小于150nm)亚群，称为外排体(19)。

注意到在肺中MSC的治疗能力包含在其分泌组中，先前的研究表明，治疗载体以其释放的EV为代表(21-23)。还报道了MSC-EV治疗对多种疾病模型(包括心肌梗死(24，25)、肾损伤(26，27)、免疫应答的调节(28，29)和神经保护(30，31))的有益特性；对于最近的综述，参见(32)。然而，通常，粗EV分离技术外加差的分析表征使MSC-EV的治疗影响模糊，损害生物利用度并且与非EV物质共同污染制剂。本文描述了对来自人脐带沃顿胶(WJMSC)和骨髓MSC(BMSC)二者的经纯化MSC-EV的详细表征。此外，调查了MSC-EV治疗在BPD的实验模型中的效力。本文概述的结果表明，在高氧诱导的BPD模型中，推注剂量的经纯化MSC-EV显著改善了肺形态和肺部发育，降低了肺纤维化并改善了肺血管重塑。进一步表明，MSC-EV治疗改善了肺功能测试结果并减轻了相关的肺动脉高压。此外，这项研究表明，MSC-EV治疗使高氧诱导的炎症钝化，这是一种部分是通过肺巨噬细胞极化的调节的作用。

在本文中，在无血清培养基(serum-free-media，SFM)中孵育36小时之后，从细胞培养上清液(culture supernatant，CM)分离外排体(直径为30至150nm的EV，表达标志物CD9、CD63和筏蛋白-1，并以约1.18g/ml的密度漂浮)。在进行差速离心以使细胞碎片和相关的凋亡碎屑澄清之后，通过过滤将CM浓缩，并通过在OptiPrep^TM(碘克沙醇，IDX)垫层上浮选分离外排体并进一步表征。详细信息参见在线数据补充。

使用ANOVA随后是Bonferroni多重比较检验(Bonferroni's multiplecomparison test)(GraphPad，v6.0，CA，US)进行统计分析。使用皮尔逊相关系数(Pearsoncorrelation coefficient)来探究免疫组织化学血管重塑参数与PH生理指标之间关系的强度。使用FlowJo软件v10.2(TreeStar，OR，US)进行流式细胞术数据分析。通过RT-qPCR评估炎性标志物mRNA水平，并相对于关联NRMX对照组平均水平表达；认为在p<0.05时有显著性。

对于体内研究，样本量计算基于先前的工作(14)，其表明检测到肺结构改善了15％(通过平均线性截距；MLI评估)，在5％α-水平的效力＞90％，每组需要至少5只动物。

调查人员对实验组的组织学分析和生理测量不知情。

MSC-EV的纯化、分离和表征

人MSC分泌多种囊泡群。许多EV分离方法通常会使EV制剂受到蛋白质的污染，降低EV生物利用度并促进聚集(33)。因此，目的是通过碘克沙醇密度梯度从经浓缩MSC-CM分离并纯化EV，以试图克服上述常规EV分离技术的局限性(图1A和1B)。从IDX垫层上的WJMSC、BMSC或人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast，HDF)培养物浮选CM，使得在梯度的级分9中提取EV。比较通过透射电子显微术(TEM)和纳米颗粒追踪分析(NTA)在级分6至10之间评估的囊泡，级分9拥有优异的蛋白质：颗粒比率，其对应于约1.18g/ml的密度(图1C)。

级分9的TEM和NTA分析揭示，占据典型直径为50至150nm的WJMSC-EV、BMSC-EV和HDF-EV样品的异质EV群具有最少的蛋白质污染物，并且表现出EV的明显双凹形态特征(图1D和1E)。IDX垫层梯度的免疫印迹揭示，所有细胞类型的级分9对CD9、CD63和筏蛋白-1(Flot-1)均呈阳性(图1F)。

短期评估(PN14)：单剂量MSC-EV处理恢复肺结构

将新生小鼠暴露于HYRX(75％O₂)持续7天(出生后(postnatal，PN)第1至7天)，然后再回到室内空气中另外7天。将经HYRX暴露的小鼠与保持在NRMX(室内空气)的小鼠进行比较。在PN4时开始HYRX暴露之后，处理组接受单次静脉内(IV)剂量的WJMSC-EV、BMSC-EV或HDF-EV(图2A中所示的示意图)。与NRMX对照小鼠相比，经HYRX暴露的小鼠显示出让人联想到人BPD的组织学模式，其特征在于肺泡生长严重受损、大的气腔和不完全的肺泡分隔(图2B)。在PN14时，与NRMX组相比，在HYRX对照小鼠中平均线性截距(MLI)值升高(分别为38.7±1相对于25.1±1，p<0.0001)。与HYRX对照组相比，用MSC-EV处理的动物显示出肺泡化显著改善并且肺结构几乎完全恢复。这种改善与MSC起源无关，并且在使用WJMSC-EV(29.8±1，p<0.001)和BMSC-EV(31.6±2，p<0.001)的处理中均可观察到。HDF-EV用作生物和载剂对照，并且在PN14时没有显示出显著的保护作用(34.24±2μm，p＞0.05)，因此未用于评估长期作用的实验中。比较常氧下的NRMX对照动物和用WJMSC-exo处理的动物，没有发现差异(图E1，p＞0.05)。

长期评估(PN42)：单剂量MSC-EV处理改善肺部发育并改善间隔纤维化(septalfibrosis)

为了评估长期终点，在PN42时评估了肺部结构和胶原蛋白沉积(图3)。HYRX对照小鼠与NRMX对照组相比显示出肺泡结构的持续破坏、较大的气腔和显著的肺泡简化(MLI＝26.7±0.7相对于18.8±0.5μm，p<0.0001)。同样，与HYRX对照小鼠相比，用WJMSC-EV或BMSC-EV处理的动物显示出肺泡化显著改善并且肺结构稳健恢复(WJMSC-EV：MLI＝21.6±0.9μm，p<0.01；BMSC-EV：MLI＝22.7±0.4μm，p<0.01)。

在PN42时评估了胶原蛋白沉积(马森三色染色)以测量肺纤维化的程度。与更严重的BPD模型(其中动物暴露于HYRX 14天)相比，在该BPD模型的所有组中均记录到了轻微的胶原蛋白沉积(<总隔区的1％)(18)。然而，HYRX对照小鼠与NRMX对照小鼠相比胶原蛋白沉积量微妙但显著更高(分别为0.22±0.06相对于0.08±0.01μm；p<0.01)。用WJMSC-EV或BMSC-EV处理的经HYRX暴露小鼠的胶原蛋白沉积显著降低(分别为0.1±0.02和0.13±0.01μm；p<0.01，p<0.05，图3)。

MSC-EV处理挽救高氧诱导的周围肺血管损失和周围肺动脉重塑

为了探究MSC-EV对HYRX诱导的周围肺血管重塑的潜在影响，用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)对PN42时收获的小鼠的肺切片进行染色(图4A)。与NRMX对照动物相比，经HYRX暴露的动物显示出更大的周围肺血管肌化(36.55±2.7内侧厚度指数(MTI))(20.23±2.2MTI，p<0.01)。几乎没有证据表明WJMSC-EV与BMSC-EV在有关长期肺结构改善和降低纤维化方面存在差异，因此将MSC-EV组组合。MSC-EV处理改善了HYRX诱导的血管肌化(26.8±1.3MTI，p<0.01，图4B)。WJMSC-exo和BMSC-exo处理改善了HYRX诱导的血管肌化(分别为26.3±1.1MTI，p<0.05和27.22±2.3MTI，p<0.05，图13A)。

为了量化HYRX诱导的PH的程度，评估了直接右心室收缩压(direct rightventricular systolic pressure，RVSP)、右心室与体重比率(RV：BW)和富尔顿指数。与NRMX对照相比，发现在HYRX对照动物中RVSP适度升高(分别为22.38±0.68相对于30.8±0.85mmHg，p<0.001)。MSC-EV处理改善了RVSP的这种适度升高(26.85±0.83mmHg，p<0.05，图4C和图13C)。相同的趋势在评估RV：BW比率和富尔顿指数时得到概括，其中与其NRMX对应物相比，HYRX对照小鼠的RV：BW比率(分别为7.7±0.01×10^-4相对于8.5±0.02×10^-4，p<0.05)和富尔顿指数(分别为0.22±0.007相对于0.26±0.015，p<0.05，图13D)均有所提高。MSC-EV处理改善了RV：BW比率(7.7±0.01×10^-4，p<0.05，图4D)和富尔顿指数(0.23±0.027，p<0.05)的适度提高，尽管富尔顿指数的趋势并未达到显著性(未示出)。在所有实验组中，血管重塑程度(α-SMA染色)与RV：BW(p＝0.002，r＝0.807)、富尔顿指数(p＝0.001，r＝0.69)和RVSP(p＝0.002，r＝0.806)呈显著相关。

为了确定HYRX暴露对肺血管数目的作用，评估了PN42时小鼠的肺切片中的冯·维勒布兰德因子(vWF)染色。与NRMX对照小鼠相比，HYRX暴露导致直径<50μm的小(外周)血管的显著丧失(分别为4.4±0.3相对于2.9±0.2血管/视野(VPF)，p<0.01)，而WJMSC-exo或BMSC-exo处理恢复了这些血管(分别为3.9±0.4和4.4±0.6VPF，p＝0.06和p<0.01)(图4H和图13B))。组之间直径＞150μm的血管数目无显著性差异(未示出)。

MSC-EV处理改善高氧诱导的肺损伤之后的肺功能

为了确定改变的组织结构和纤维化的功能影响，接下来在PN42时的实验组(特别是用WJMSC-EV处理的经HYRX暴露的小鼠、NRMX对照和HYRX对照)中进行肺功能测试。所有动物均在3cm H₂O的呼气末正压(positive end expiratory pressure，PEEP)下通气。根据肺组织学(简化的肺泡化和肺气肿样肺疾病特征)，与NRMX对照组相比，经HYRX暴露的小鼠表现出改变的压力-容积(PV)环。HYRX对照组的PV环向上和向左移动，指示肺气肿样肺疾病特征和空气滞留(34)。与NRMX对照组(0.77±0.04ml，p<0.0001)相比，HYRX对照小鼠的肺总量(TLC，1.36±0.04ml)升高，这是通过WJMSC-EV处理改善的(1.18±0.02ml，p<0.01，图4E)。MSC-EV处理改善了HYRX诱导的肺气肿变化，使PV环向下和向右显著移动(图4F)。基线测量揭示，三个组之间的气道阻力无差异。但是，HYRX对照组的基线依从性测量升高，未受MSC-EV处理的影响。

MSC-EV调节肺转录组并使高氧诱导的炎症钝化

使用全器官RNA测序生成MSC-EV对肺转录组的影响的无偏概览(图9A至9F)。将来自WJMSC-EV处理的总肺RNA与NRMX和HYRX对照组进行比较。在PN7时，经HYRX暴露的动物与其NRMX对应物相比具有2561个显著富集的和2344个受抑制的mRNA。WJMSC-EV处理显著抑制了HYRX诱导的基因的亚组(117个mRNA)，并且显著上调了受HYRX暴露抑制的83个基因，使总体基因表达谱向其NRMX对应物移动(图5A)。有趣的是，WJMSC-EV处理而非HYRX特异性诱导了41个基因。基因本体(GO)分析表明，这些基因可能与细胞外基质和结构组织、心血管发育/形态发生以及SMAD蛋白导入细胞核相关(图9C)。表1和表2中给出了F9级分中血浆成员相关蛋白质的列表。GO分类如下：膜的整体组分(GO：0016021)和膜的锚定组分(GO：0031225)。

表1：MEX特异性膜蛋白：在经纯化MSC外排体中存在并且在真皮成纤维细胞外排体中不存在。

表2：与真皮成纤维细胞外排体相比的经纯化MSC外排体中富集＞4倍的膜蛋白质。

表3：MEX特异的膜蛋白质：存在于经纯化MSC外排体中，而真皮成纤维细胞外排体中不存在

使用GO分析发现，HYRX暴露上调的基因涉及适应性免疫应答、炎性应答和白细胞介导的免疫(图9D)。WJMSC-EV处理使促炎性HYRX响应基因的诱导钝化，抑制了涉及炎症、适应性免疫应答、IFN-γ介导的信号传导、粒细胞产生以及白细胞趋化作用和细胞因子产生的基因(图9E)。与PN7相反，在PN14时检测到较小的肺mRNA谱变化(图9B)。HYRX对照小鼠与其NRMX对应物相比具有356个显著富集的和282个受抑制的mRNA。经WJMSC-EV处理的小鼠继续显著调节HYRX失调基因的亚组的水平(图9F)。

通过RT-qPCR评估了所选全肺RNA测序数据的有效性。一致地，在PN7时，促炎性标志物和经典活化的M1巨噬细胞的指数(例如Ccl2、Ccl7和I16)与NRMX对照小鼠相比在HYRX对照组中升高并且被MSC-EV处理显著抑制(图5B)。此外，与抗炎M2样极化相关的基因(例如精氨酸酶-1(Argl)、Cd206和Ccl17)在HYRX对照组中也失调，并通过MSC-EV处理得到有效调节(图5B)。可在图14中找到描绘WJMSC-exo或BMSC-exo制剂作用的图。

MSC-EV通过在体内和体外免疫调节巨噬细胞表型来抑制炎症

巨噬细胞极化在调节发育中的肺中的免疫应答和炎症中发挥重要作用(35)。全肺RNA分析表明，MSC-EV调节HYRX诱导的炎性基因的表达，表明EV可通过调节免疫细胞功能为BPD提供治疗益处。为了测试EV是否可以直接调节免疫功能，接下来评估了EV在体外调节巨噬细胞表型的能力。使用荧光显微术观察到，WJMSC-EV容易地被肺泡巨噬细胞吸收(图10A)。然后通过RT-qPCR确定WJMSC-EV是否可以调节关键的巨噬细胞基因。以剂量依赖性方式，向经典活化的(M1)巨噬细胞添加WJMSC-EV显著降低了已确定的促炎性M1标志物(例如TNFα、Il6和Ccl5)的mRNA水平，p<0.05(图6A和1OB)。向M2极化的巨噬细胞添加WJMSC-EV显著抑制了Remla和Cd206诱导(分别为p<0.001和p<0.01，图6B)，并且最重要的是，极大地增强了巨噬细胞Arg1表达水平。这是MSC-EV抗炎作用的直接反映，因为精氨酸(iNOS底物)的耗尽将有效地降低巨噬细胞的M1功能，从而支持M2样状态。HDF-EV被用作载剂和生物对照并显示出最小的作用。

在本文中所述的HYRX诱导的BPD模型中，流式细胞术用于评估PN7和PN14时在体内的肺巨噬细胞(Cd45^+ve、Cdllb^-ve、Cd11c^+ve、Cd64^+ve)表型(图6C、6D和11))。Cd40和Cd86用作促炎性M1标志物，而Cd206用于鉴定交替活化的(M2样)巨噬细胞。类似于体外实验和体内肺mRNA水平，在PN7时WJMSC-EV显著抑制了HYRX诱导的Cd206水平的升高(p<0.05)，这是持续到PN14的趋势(p<0.01)。在PN7和PN14时，经HYRX暴露的小鼠与其NRMX对应物相比Cd40水平升高。在PN14时这种提高受到WJMSC-EV处理的抑制，尽管在PN7时观察到类似趋势，但这不显著。发现，在PN7和PN14二者的所有组之间Cd86水平没有差异。

讨论

已经开发了数种动物模型并将继续对其进行完善，目的是概括在患有BPD的人新生儿的肺中注意到的病理性肺标志。尽管每种BPD临床前模型都有其自身的优点和局限性，但可论证地BPD最常在小鼠中建模。造成这种情况的原因是多方面的并且包括相对短的妊娠时间，其允许对肺发育进行方便的研究。重要的是，鼠肺发育的囊状期(saccular stage)在E17.5与PN5之间出现。因此，足月小鼠肺呈现出类似在24至28周妊娠的人早产新生儿的发育阶段。这代表了发育性肺损伤的绝佳模型，最近在(27)中进行了综述。本研究中使用的模型呈现显著的肺泡简化和继发性PH的微妙升高，非常类似于人“新”BPD的表型。

本文中所述的研究表明，即使在损伤已经开始之后，推注剂量的经纯化人MSC-EV仍可有效缓解和挽救HYRX诱导的BPD的核心特征。具体地，本文中所述的研究是表明MSC-EV治疗从根本上改善了肺形态和肺部发育、降低肺纤维化、挽救肺血管系统损失以及改善肺血管重塑的第一个研究。扩展这些观察结果以表明MSC-EV的细胞保护作用产生理想的功能结果，例如肺功能测试结果的改善和相关PH的改善。此外，还发现，MSC-EV使HYRX诱导的促炎性信号传导和免疫应答钝化，这可部分是通过肺巨噬细胞表型的调节。

先前的研究已表明，在BPD实验模型中，施用MSC分泌组部分地预防和/或逆转实质纤维化和周围肺动脉断流(devascularization)、改善肺泡化以及改善肺功能测试结果(18，20)。然而，负责MSC分泌组的生物介质仍然难以捉摸。因此，该数据支持并扩展了研究结果，表明EV利用MSC-CM内的治疗载体，并且单剂量MSC-EV能够改善HYRX诱导的肺泡简化，改善血管重塑、肺血管损失，并且使肺纤维化钝化。先前的研究已揭示，患有BPD的婴儿表现出肺功能异常，该异常始于婴儿期并且经常整个儿童期持续并且甚至进入青春早期。因此，曾经是BPD婴儿的成人发生慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)的风险可提高(36)。补充了几乎完全恢复的肺结构、血管重塑和血液动力学的组织学发现，该研究还表明，MSC-EV治疗对肺力学具有显著的长期功能益处，从而改善PV环并降低TLC。

尽管嗜中性粒细胞活化是导致肺部炎症的重要因素(37)，但巨噬细胞是新生儿肺免疫应答的关键介质，有助于炎症的引起和消退二者(38、39)。MSC-EV在免疫疾病模型中显示出具有免疫调节作用，并调节巨噬细胞表型(28，29，40)。巨噬细胞表型多样，代表了多维网络对发育、活化和功能多样性的影响(37，38)。传统的M1/M2二元范式被认为已经过时(39)，并且事实上，最近在临床前模型中的精细研究强调了微环境对肺巨噬细胞可塑性的作用，并解决了与肺内稳态和疾病相关的时间和区室巨噬细胞表型的多样性(35，36，40)。

使用MSC-巨噬细胞共培养物表明，MSC分泌组是M1到M2转变的主要旁分泌介质。值得注意的是，慢性M2活化可催化有害的纤维化状况，在这种情况下，扩大的组织重塑可阻止最佳修复(38，41)。据此，Sicco及同事报道，向巨噬细胞添加MSC-EV会引起从促炎性M1表型向M2样状态的转换，并且在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中，MSC-EV调节M1和M2标志物的组织mRNA水平(42)。

这项研究的观察结果提供了证据表明MSC-EV在体外和体内二者均调节M1/M2表型支点，从而抑制促炎性M1状态并调节抗炎性M2样极化。与MSC-EV的抗炎和免疫调节能力直接相关，MSC-EV治疗具有多效性作用，其共同调节大部分(但不是全部)HYRX诱导的信号传导，这些信号传导可以是新生儿肺中发育停止的基础。以前，HYRX诱导的新生儿肺损伤的临床前模型(43)以及临床研究(44)已经表明BPD中的炎性途径失调。具体地，针对1067个极低出生体重婴儿的研究发现，较高的IL-1β、-6、-8、-10和IFN-γ浓度与BPD和婴儿死亡相关(45)。综上所述，与巨噬细胞极化的体外和体内评估结合的全肺转录组分析证明了，在高氧损害期间MSC-EV具有强效的免疫调节能力，能够在炎性状态的峰期发挥作用。在PN14时，在暴露的动物已返回至室内空气一周之后，有证据表明一些(但不是全部)HYRX诱导的基因表达失调有一定程度上的恢复和正常化。因此，早期干预和使HYRX诱导的炎症过程钝化显示出对于维持肺发育至关重要。在PN14时，当暴露的动物已返回至室内空气一周时，大多数(尽管不是全部)高氧诱导的肺基因表达失调已恢复至正常，这表明早期干预并使早期高氧诱导的炎性阶段钝化对于维持适当的肺发育至关重要。

MSC-EV处理之后观察到稳健的生理变化。MSC-EV剂量是根据在缺氧诱导PH的成年鼠模型中使用MSC-EV的先前文献估计的(21)。未来的研究将进一步调查剂量响应和不同的施用途径。

总之，随着慢性新生儿肺疾病的发病率继续上升，很明显，EV治疗可代表新生婴儿疾病的主要范例。在这项研究中，来源于人WJMSC、BMSC和HDF-EV的EV被分离、鉴定和全面表征。另外，本文证明了MSC-EV相对于来源于HDF的囊泡所特有的稳健的治疗作用。重要的是，这代表首次证明了经纯化MSC-EV是肺中MSC作用的主要旁分泌抗炎和治疗介质，其可至少部分地通过调节肺巨噬细胞表型，抑制肺炎症和免疫应答以有利于组织发育而起作用。考虑到公认的MSC-EV的多效性作用(46)，其他早产相关的病理，包括神经功能缺损，可成为基于外排体的治疗的目标。

方法

动物模型和实验设计

在补充方法中描述了对高氧诱导的BPD模型、实验设计和标准分析方法的扩展描述。所有动物实验均获得波士顿儿童医院动物护理和使用委员会(Boston Children'sHospital Animal Care and Use Committee)的批准。

外排体的分离、纯化和表征

EV直接分离自细胞培养上清液。在无血清培养基(SFM)中孵育36小时之后收获细胞培养基以避免EV被FBS污染。将细胞培养基进行差速离心，300×g持续10分钟(以去除悬浮液中的任何细胞)，然后是3000×g持续10分钟以及13,000×g持续30分钟以去除悬浮液中的任何细胞碎片和大的凋亡小体(图1A)。使用具有300kDa MW截止值的改性聚醚砜(mPES)中空纤维(Spectrum Labs，Irving TX)通过切向流过滤(TFF)将MSC-CM浓缩50倍。使用OPTIPREP^TM(碘克沙醇；IDX)垫层密度浮选进一步对EV进行纯化。通过使3ml含NaCl(150mM)和25mM Tris：HCl(pH 7.4)的10％w/v IDX溶液漂浮在3ml 55％w/v IDX溶液上，小心制备IDX梯度。使经浓缩CM(6ml)漂浮在IDX垫层的顶部，并使用SW 40Ti转子以100,000×g超速离心3.5小时(4℃，图1B)。从梯度顶部收集十二个级分(每个1ml)用于即时EV表征或冷冻(-1℃/分钟)并保持在-80℃下。通过重量/体积比(g/ml)评估IDX级分密度。

统计

使用GraphPad Prism(v6.0；GraphPad，CA，US)通过ANOVA随后是Bonferroni多重比较检验对不同组之间的数据进行比较。使用皮尔逊相关系数来探究免疫组织化学血管重塑参数与PH生理指标之间关系的强度。使用FlowJo软件v10.2(TreeStar，OR，US)进行流式细胞术数据分析。除非另有说明，否则值表示为平均值±SEM。通过RT-qPCR对炎性标志物mRNA水平的评估表示为相对于其关联NRMX对照组并表示为中值±范围。除非另有说明，否则认为在p<0.05时有显著性。对于体内研究，样本量计算基于先前的工作(18)，其表明检测到肺结构改善了15％(通过平均线性截距；MLI评估)，在5％α-水平的效力＞90％，每组需要至少5只动物。

细胞分离和培养

使用改良的外植体方法分离出人脐带沃顿胶间充质干细胞(WJMSC)(47)。简短地说，将脐带用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate-buffered saline，dPBS，Invitrogen，MA，US)清洗两次，纵向切开，并去除动脉和静脉。将软凝胶组织细切成小块(约3至6mm²)并单独置于具有α-改良Eagle培养基(α-Modified Eagle Medium，αMEM，Invitrogen，MA，US)的193mm²组织培养皿(24孔板)上，并在37℃下在5％CO₂的湿润气氛中孵育12天，所述培养基补充有20％胎牛血清(FBS，Invitrogen，MA，US)、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。定期添加经补充的αMEM之后，小心地移出脐带组织。用培养基将板洗涤3次；使可塑性黏附细胞集落胰蛋白酶化并在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的αMEM中维持培养。在第4代，将WJMSC扩增至占据了6360cm²的细胞生长区的10层(stack)Corning

细胞培养室(Sigma，PA，US)。使用了数根脐带；每个都产生了单独的MSC集落。如下所述表征了所有克隆和相应的EV。

人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)获自RoosterBio(RoosterBio，MD，US)。除了使用hMSC高性能培养基试剂盒(RoosterBio，MD，US)以外，与WJMSC类似地培养和扩增细胞。将细胞维持在37℃和5％CO₂下的培养箱中。通过组织外植体方法建立了人包皮(真皮)成纤维细胞(Human foreskin(dermal)fibroblastcell，HDF)(48)。将新鲜切除的组织用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗两次。将组织切片维持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的α-MEM中，并在37℃下在5％CO₂的湿润气氛中孵育7天。7天之后，使可塑性黏附细胞集落胰蛋白酶化并在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的αMEM中维持培养。培养细胞并将其与WJMSC类似地扩增(如上所述)。使用台盼蓝排除(trypan blue exclusion)(1∶1v/v)进行细胞计数，并使用Cellometer Auto T4(Nexcelom Biosciences，MA，USA)进行分析。

MSC细胞表面表征和分化

在第4代时进行细胞表面谱的细胞计数评价。用于细胞计数分析的抗体获自BioLegend，CA，USA以及BD Biosciences，MA，US。使用一组荧光-缀合的抗体选择WJMSC和HDF用于表达已确定的MSC标志物，例如：经APC/FITC缀合的CD105、经FITC缀合的CD90、经PE缀合的CD44和经APC缀合的CD73，以及缺少FITC缀合的CD11b、经PE缀合的CD31、经PE缀合的CD34和经PE缀合的CD45(图7)。使用配备有407nm、488nm和640nm激光器以及BD FACS Diva软件(v5.0.3)的BD^TM LSR II流式细胞仪激光台式流式细胞仪进行流式细胞术。

根据制造商的说明书，分别使用

软骨发生、骨发生和脂肪生成分化试剂盒(ThermoFisher Scientific)评估WJMSC和HDF培养物对软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞谱系的分化潜能(图8)。

透射电子显微术(TEM)

为了进行EV可视化和形态评估，将来自EV制剂的等分试样(5至10μl)吸附15秒至聚乙烯醇缩甲醛/碳涂覆网(Electron Microscopy Sciences，PA，US)。用Whatman一级滤纸(Sigma)移除多余的液体，随后用2％乙酸铀酰染色15秒。在JEOL 1200EX透射电子显微镜(TEM)上检查吸附的EV，并用AMT 2k CCD摄像机记录图像。

纳米颗粒追踪分析

如前所述，使用纳米颗粒追踪分析(NTA，NanoSight LM10系统，Malvem仪器，MA，US)确定EV的尺寸和浓度分布(49)。NTA是配备有642nm激光和高灵敏度数字摄像机系统(OrcaFlash2.8，Hamamatsu，NanoSight Ltd)的激光照明显微镜技术，该技术实时确定纳米颗粒的布朗运动以评估尺寸和浓度。使用NanoSight注射泵和脚本控制系统在控制流下对样品进行管理并记录，并且对于每个样品，记录三个60秒持续时间的视频。使用NTA软件(3.0版)对粒子运动进行分析。摄像机快门速度固定在30.01毫秒并且摄像机增益固定于500。摄像机灵敏度和检测阈值分别为(11至14)和(50至52)。EV样品在无EV dPBS中稀释。样品一式三份运行，由此计算出EV分布、大小和平均浓度。

免疫印迹

将EV制剂中的蛋白质在4％至20％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上分离，并随后转移到0.45μm PVDF膜(Millipore，MA，US)上。将兔多克隆抗筏蛋白-1和抗CD63抗体(Santa Cruz Biotech，CA，US)以及小鼠多克隆CD9抗体(Santa Cruz Biotech，CA，US)以制造商推荐的稀释度用于免疫印迹。

实验设计

实验设计的示意图在图2A中突出显示。将新生FVB小鼠暴露于高氧(HYRX，75％O₂)下7天并且用或不用MSC-EV进行处理。作为另外的对照，NRMX对照动物接受了单次静脉内(IV)剂量的WJMSC-exo。将经HYRX暴露的动物与保持在常氧(NRMX，室内空气)下的小鼠进行比较。在PN7时，处死小鼠并收获整个肺用于流式细胞术分析和总肺mRNA谱分析。在两周龄(PN14)时，收获肺组织用于组织学、总肺mRNA分析、流式细胞术和免疫组织化学。在PN42时评估了长期结果。在这里，处死小鼠用于组织学、压力测量、RV肥大和肺功能测试。动物实验获得波士顿儿童医院动物护理和使用委员会的批准。

EV给药

在PN4时，通过颞浅静脉(superficial temporal vein)静脉内(IV)注射EV制剂(50μl的WJMSC-EV、BMSC-EV或HDF-EV)。将EV制剂相应地在dPBS中稀释以达到相当于0.5×10⁶个细胞当量的EV剂量。记录了相应的NTA和蛋白质浓度值(表4)。

表4：EV给药。仍然缺乏用于对基于EV的治疗进行EV量化的“金标准”方法。在PN4时，相应地稀释EV群[对应于级分9]以在36小时内得到相当于0.5×10⁶个细胞的单个推注剂量。用PBS将外排体制剂稀释以达到每只动物50μl的该标准剂量。尽管来自不同细胞类型的外排体制剂包含相当的纳米颗粒数目(如通过NTA评估的)，但其蛋白质含量却不同。这是由于在我们的高度纯化的密度浮选制剂中仍然存在残留的非外排体蛋白质污染物。相比之下，通过差速离心和以100,000xg沉淀75分钟来收获CM产生了其中多至95％的蛋白质代表纤连蛋白聚集体和其他细胞基质碎屑的制剂(我们未公开的观察结果)。这样的沉淀通常称为外排体或细胞外囊泡，但蛋白质浓度与纳米颗粒数目之间几乎没有关系。

高氧(HYRX)室

聚集新生幼崽并将其在树脂玻璃(plexiglass)室中暴露于75％O₂或从PN1开始暴露于室内空气并持续7天(PN1至7)。通过Oxycycler控制器(Biospherix，NY，US)调节通气以去除CO₂以使得其不超过5,000ppm(0.5％)。通过通气和通过空气净化器进行木炭过滤去除氨。每48小时，将障(dam)在室内空气与HYRX室之间旋转以防止对成年小鼠产生过量O₂毒性。

肺组织灌注、解剖和组织学

用60mg/kg戊巴比妥(腹膜内(IP))麻醉之后，在25cm H₂O的恒定压力下通过右心室(RV)用PBS对肺进行灌注。小心移出左肺并储存在-80℃下。用4％多聚甲醛(PFA)原位将右肺充气至15至20cm H₂O的固定压力并在4％PFA中储存过夜。将固定的肺组织转移至75％乙醇(EtOH)，然后进行随后的处理，并将石蜡包埋以切片成四个不同的右肺叶。

肺实质、血管形态计量术、免疫荧光和免疫组织化学

用PFA(4％w/v)进行肺固定之后，对肺切片进行组织学分析。用苏木精和伊红(H&E)以及马森三色(胶原蛋白沉积)对肺切片进行染色。使用Nikon Eclipse 80i显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)，以100×(H&E)和200×(马森三色)放大率捕获了来自5μm厚肺切片的随机选择区域(10至20个视野)。通过使用相同放大率获取标准微米图像来对图像进行校准。避免将较大的气道和血管用于肺形态计量术。为了测量平均线性截距(MLI)，然后将平行线间隔为58μm的网格覆盖在图像上，并使用Metamorph软件v.6.2r(Universal Imaging，Downingtown，PA)记录由与肺泡壁的截距定义的每个弦(chord)的长度。使用Metamorph软件测量胶原蛋白沉积的程度并表示为每个总隔区胶原蛋白沉积的百分比。

使用Metamorph软件，通过以100×放大率(按直径(<50和50至150μm)分层)对8至12个随机图像中的冯·维勒布兰德因子(vWF)-阳性血管数目进行计数来确定肺微脉管系统的损失。将组织切片重新水化并用10mM柠檬酸盐缓冲液进行解掩蔽，并随后与一抗(Dacko；多克隆vWF Ab，1∶200)一起孵育。然后，洗涤载片并与经Alexa fluor 488缀合的驴抗兔(1∶500)抗体一起孵育。

为了评估肺血管生成，对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)进行了免疫组织化学(IHC)分析。简单地说，将肺组织切片在二甲苯中脱石蜡并再水化。将组织载片用甲醇中的0.3％H₂O₂处理以灭活内源性过氧化物酶并用马血清封闭20分钟。在以1∶125的稀释度与单克隆抗小鼠α-SMA抗体(Sigma，MO，US)一起孵育之后，根据制造商的说明(Vector Laboratories，CA，US)应用二抗和过氧化物酶染色。通过在以200×放大率捕获的约15个切片中的直径<100μm的血管中测量α-SMA阳性染色，评估血管壁厚度。使用Metamorph软件测量壁厚度，并使用以下方程在各组之间进行比较：内侧壁厚度指数(MTI)＝100×(面积_[ext]-面积_[int])/面积_[ext])。面积_[ext]和面积_[int]分别表示α-SMA层的外部边界和内部边界内的面积。对于组织学分析，调查人员对实验组不知情。

肺功能测试

为了评价肺功能，将小鼠用通过IP注射施用的氯胺酮(100mg/kg)、甲苯噻嗪(6.5mg/kg)和戊巴比妥(20mg/kg)的混合物麻醉。气管切开之后，用计算机控制的小型动物呼吸机(Scireq，Montreal，Canada)以150次呼吸/分钟的速度、10ml/kg的潮气量和3cm H₂O的呼气末正压(PEEP)对小鼠进行机械通气。如前所述(50)，确定了压力-容积(PV)环、平均气道阻力和肺依从性。

右心室收缩压(RVSP)和右心室肥大(RVH)测量

如前所述(51)测量直接右心室收缩压(RVSP)。简单地说，将小鼠用100％O₂中的异氟烷麻醉。在腹壁上切一个小切口，并露出半透明的隔膜。将具有附接至压力传感器的导管的23号蝴蝶针通过隔膜插入右心室中，并用PowerLab(ADInstruments，CO，US)监测硬件和软件记录压力测量值。排除具有心率每分钟<300次的动物。记录前十次稳定心跳的平均RVSP。为了量化右心室肥大(RVH)的程度，用PBS注射到右心室(RV)中对心脏和肺血管系统进行原位灌注；切除心脏并记录RV与体重(BW)(RV：BW)比率。对于富尔顿指数测量(RV重量与左心室(LV)加上隔(S)重量的比率，RV/[LV+S])。首先将整个心脏称重，然后将RV壁解剖并称重，然后是其余的LV和心室间隔。对于生理测量，调查人员对实验组不知情。

肺RNA测序

在PN7和PN14时收获小鼠用于肺RNA测序。用PBS通过RV灌注之后，移出左肺并从周围肺组织切开大气道。如前所述(52)分离全肺RNA。使用高级分析片段分析仪(AdvancedAnalytical Fragment Analyzer)验证RNA质量。使用基于oligoDT的纯化分离出多腺苷酸化的mRNA(1μg)并将其用作逆转录酶反应的输入。然后使用TruSeq Stranded mRNA试剂盒(Illumina，CA，US)对cDNA进行测序文库制备。使用高级分析片段分析仪确定文库的摩尔浓度，并将文库以等摩尔浓度合并。使用具有高输出单端50个碱基格式(High-Outputsingle-read 50-base format)的HiSeq 2500仪器对文库进行测序。使用Trimmomatic软件移除短(<35个碱基对)或质量差的读取之后(53)，使用STAR将原始RNA测序数据与小鼠参考基因组(mm10构建)进行比对(54)。使用特征计数生成获自UCSC基因组浏览器的小鼠注释基因的计数表(55)，并随后在基于测序深度对数据集进行归一化并使用R中的DESeq2包运行Wald检验之后鉴定出差异表达的基因(56)。使用基因本体(GO)分析和独创性途径分析(Ingenuity PathwayAnalysis，IPA)探究了潜在的mRNA网络和靶标。将RT-qPCR用于验证测序结果的可重现性和所选候选基因的水平(如下所述)。

MSC-EV的免疫调节效力：巨噬细胞极化测定

通过冲洗6至8周大FVB小鼠的股骨和胫骨，并在补充有10％FBS、包含30％v/vL929条件培养基(作为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的来源)的DMEM中培养细胞7天，获得原代鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)。肺泡巨噬细胞(MH-S)细胞系获自ATCC(ATCC，US)。MH-S细胞或BMDM在体外被驱动至M1和M2极化状态。简单地说，M1极化由脂多糖(LPS)100ng/ml和干扰素-γ(IFNγ)20ng/ml刺激引起。M2极化状态由IL-4(20ng/ml)和IL-13(20ng/ml)驱动。在存在/不存在WJMSC-EV制剂(0.05至1×10⁶细胞当量)的情况下，启动巨噬细胞极化(0.5×10⁶BMDM)以评价WJMSC-EV的免疫调节功能。HDF-EV用作生物和载剂控制。如补充方法中所述，分离BMDM总RNA并通过RT-qPCR评估基因表达水平。所有细胞因子均购自Peprotech(Peprotech，NJ，US)。

为了证明MSC-EV与巨噬细胞相互作用，从用8ml DiL(有活力的DiL标记溶液，Invitrogen，在DMEM中以1∶1000稀释)处理30分钟(在37℃和5％CO₂下孵育)的WJMSC(5×10⁶)获得经DiL标记的EV。孵育之后，通过2×10ml PBS洗涤去除游离示踪剂并在18ml无EVSFM中保持24小时。24小时之后，取细胞培养上清液并进行差速离心步骤(先前所述)随后是超速离心(100,000×g持续70分钟，4℃)。沉淀的EV通过超速离心(100,000×g持续70分钟，4℃)在PBS中洗涤。保留最后洗涤阶段的上清液并用作对照，以消除DiL污染。然后将生长至75％汇合的MH-S细胞用经DiL标记的MSC-EV处理3小时(37℃和5％CO₂)。为了去除非黏附的MSC-EV，进行了3×10ml PBS洗涤。将细胞和黏附的EV维持在生长培养基中直到使用NikonEclipse 80i显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)通过荧光显现为止。

小鼠全肺的细胞计数分析

如前所述(57)，将流式细胞术用于评估肺细胞群浓度和肺巨噬细胞表型。在PN7和PN14时收获小鼠。用PBS通过RV灌注之后，移出左肺并从周围肺组织切开大气道。将肺组织切成小块并转移到falcon管(Fisher Scientific，NH，US)中，并在由RPMI-1640(Invitrogen，CA，US)、胶原酶IV(1.6mg/ml)和DNAsel(50单位/ml)(后二者均来自Worthington Biochemical Corp，NJ，US)组成的5ml消化缓冲液中进行处理。将均质化的肺通过40μm细胞滤器(Corning，MA，US)以获得单细胞悬液。使用红细胞裂解缓冲液(Roche，IN，US)裂解剩余的红细胞。用抗体：经PE/Cy7缀合的Cd45、经FITC缀合的Cd11b、经PerCP Cy5.5缀合的Cd11c和经PE缀合的Cd64对细胞悬液进行染色。将巨噬细胞表型标志物Cd40、Cd86和Cd206与brilliant violet 421(BV421)缀合。所有抗体均获自Biolegend或BDBiosciences。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences，MA，US)在BD LSR II流式细胞仪上获取数据。将补偿相应地调整并得到了UltraComp ebeads(Affymetrix，CA，US)的支持。相应地使用荧光减一对照。将细胞群使用顺序门控策略来鉴定并使用CountBright^TM绝对计数珠(ThermoFisher，MA，US)进行量化并记录为绝对浓度或总细胞群的百分比。巨噬细胞活化标志物的表达表示为中值荧光强度(MFI)。

反转录聚合酶链式反应分析

对于肺mRNA评估，如前所述(51，52)，用无菌PBS通过RV灌注之后，移出左肺用于RNA提取，并随后通过RT-qPCR进行mRNA分析。按照制造商的说明，使用TRIZOL(ThermoFisher)来提取BMDM总RNA。用于PCR反应的

引物包括TNFα、Cc12、Cc17、I16、I133、Cd206、Retnla和Arg1均获自Invitrogen。Nup133用作内部标准。如前所述(51)进行倍数变化的分析。

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本文中(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)提及的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)均通过引用在此整体并入如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目都是通过引用特别地和单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案和范围

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的那样。

没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或者以其他方式从上下文中显而易见。除非相反地指出或在其他情况下从上下文中明显看出，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述应被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包括“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案，其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

应当理解的是，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或者来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求的所有改变、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可以被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，应理解的是，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文公开的任何制备或使用方法或者根据本领域已知方法制备或使用组合物的方法(如果有的话)。

在要素以列表(例如，以马库什组格式)表示的情况下，应理解的是，还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可以从该组中移除。还应注意的是，术语“包含/括”意在为开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应当理解的是，一般来说，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或基本上由其组成的一些实施方案、产品或方法。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值在一些实施方案中可以采用所述范围内的任何特定值至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为了简洁起见，每个范围内的值没有在本文中被单独地详细说明，但是应理解的是，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值可假定给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点为以与该范围下限的单位的十分之一相同的精确度表示。

在提供网站的地方，URL地址提供为非浏览器可执行的代码，括号中带有相应网址的句点。实际的网址不包含括号。

另外，应当理解的是，本公开内容的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可以明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可以从任何一个或更多个权利要求中排除。为了简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims (53)

1.分离的间充质干细胞(MCS)外排体，其中：

(i)所述分离的MSC外排体包含选自以下的一种或更多种标志物：FLT1、PLAUR、MME、CDH2、SLC16A3、CDH13、ITGB5、ITGA11、APP、GPC6、IGSF8、IRP2、TSPAN9、DAG1、SLC38A2、SLC12A8、GJA1、ITGA1、PLXNB2、SLC16A1和PROCR；

(ii)所述分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：PTk7、CD109、SLC1A5、ITGA3、ITGA2、BSG、DPP4、ATP1A1、FAP、VASN、IGF2R和CD82；和/或

(iii)所述分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：RCN1、RAP1B、GDF15、FLT1、OLFML3、PLOD2、PSMA4、PAPPA、INHBA、SPOCK1、HSPB1、LOXL4、POLD3、CALU、IGFBP4、C4B、TINAGL1、SULF1、TPM3、AHNAK、CALR、RRAS2、PFKP和COL16A1。

2.根据权利要求1所述的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体包含选自以下的一种或更多种标志物：FLT1、PLAUR、MME、CDH2、SLC16A3、CDH13、ITGB5、ITGA11、APP、GPC6、IGSF8、IRP2、TSPAN9、DAG1、SLC38A2、SLC12A8、GJA1、ITGA1、PLXNB2、SLC16A1和PROCR。

3.根据权利要求1所述的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：PTk7、CD109、SLC1A5、IGTA3、ITGA2、BSG、DPP4、ATP1A1、FAP、VASN、IGF2R和CD82。

4.根据权利要求1所述的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体包含与成纤维细胞外排体相比富集的一种或更多种标志物，所述一种或更多种标志物选自：RCN1、RAP1B、GDF15、FLT1、OLFML3、PLOD2、PSMA4、PAPPA、INHBA、SPOCK1、HSPB1、LOXL4、POLD3、CALU、IGFBP4、C4B、TINAGL1、SULF1、TPM3、AHNAK、CALR、RRAS2、PFKP和COL16A1。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体还包含选自以下的一种或更多种标志物：FLOT1、CD9和CD63。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的MCS外排体，其中所述MSC来自沃顿胶或骨髓。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体基本上不含非外排体蛋白质污染物。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体具有约30至150nm的直径。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的MSC外排体，其中所述分离的MSC外排体具有免疫调节活性。

11.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的分离的MSC外排体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其还包含第二试剂。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第二试剂是肺表面活性物质、类固醇、抗氧化剂或吸入一氧化氮。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的药物组合物，其还包含可药用载体。

15.治疗肺疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至9中任一项所述的分离的间充质干细胞(MSC)外排体或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述对象是人对象。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述人对象在妊娠37周之前出生。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述人对象在妊娠26周之前出生。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述对象患有高氧诱导的肺损伤。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述对象已施用氧或已上呼吸机。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述对象患有支气管肺发育不良(BPD)或处于发生支气管肺发育不良(BPD)的风险之中。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述对象患有高氧诱导的肺动脉高压。

23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述对象表现出周围肺动脉重塑。

24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述对象在肺中有炎症。

25.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述对象小于四周龄。

26.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述对象为四周龄至3岁。

27.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述对象为3至18岁。

28.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述对象是成体。

29.根据权利要求15至28中任一项所述的方法，其中将所述分离的MSC外排体以推注剂量施用于所述对象。

30.根据权利要求15至28中任一项所述的方法，其中将所述分离的MSC外排体重复施用于所述对象。

31.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体改善肺功能。

32.根据权利要求15至31中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体恢复肺结构。

33.根据权利要求15至32中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体降低肺纤维化。

34.根据权利要求15至33中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体降低肺中的炎症。

35.根据权利要求15至34中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体降低周围肺动脉重塑。

36.根据权利要求15至35中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体在出生一小时内施用。

37.根据权利要求15至35中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体在出生一个月内施用。

38.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体静脉内或鼻内施用。

39.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中将所述分离的MSC外排体施用于所述对象的肺或气管。

40.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体通过吸入施用。

41.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体以气雾剂施用。

42.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体使用雾化器施用。

43.根据权利要求15至37中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体使用气管内导管施用。

44.根据权利要求15至43中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

48.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的间充质干细胞(MSC)外排体或根据权利要求10至13中任一项所述的药物组合物，其用于制备用于治疗肺疾病的药物。

49.分离间充质干细胞(MSC)外排体的方法，所述方法包括使用碘克沙醇(IDX)垫层梯度对MSC条件培养基进行分级以及收集基本上不含非外排体蛋白质污染物的级分。

50.根据权利要求49所述的方法，其中在分级之前将所述MSC条件培养基浓缩。

51.根据权利要求50所述的方法，其中通过切向流过滤将所述MSC条件培养基浓缩。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述分级包括使所述MSC条件培养基漂浮在IDX垫层梯度上以及超速离心。

53.使用权利要求49至52中任一项所述的方法分离的MSC外排体。

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