CN112426439A - 猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用，涉及生物工程技术领域。本发明通过实验证明猫脂肪间充质干细胞能有效缓解猫急性肾损伤的症状，减少肾脏组织损伤。

Description

猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用。

背景技术

猫急性肾损伤是一种由肾小球滤过能力突然下降所引起的临床综合征，初始发病症状为口干、尿频、嗜睡等，如果救治及时，大多数情况下肾损伤可以得到缓解，但是由于猫本身性格比较安静，耐受性和忍耐性强，患病时不容易被人们发现，错过最佳救治时间，急性肾损伤转变为慢性肾功能衰竭，猫患病的死亡的概率也会大大增加。

虽然医疗技术有了很大的发展与进步，但肾脏疾病的治愈率依然很低。目前，治疗猫肾损伤的方法主要包括：(1)使用利尿剂、多巴胺、钙通道拮抗剂、中药等药物治疗；(2)肾脏替代疗法，如透析；(3)肾移植。但是，这些方法存在供体短缺及各种并发症、免疫抑制剂副作用大等问题。因此，有必要开发新的治疗方式来克服现有技术中存在的问题。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用，实验证明猫脂肪间充质干细胞能有效缓解猫急性肾损伤的症状，减少肾脏组织损伤，而且免疫原性低，不会引起免疫排斥反应。

本发明的目的在于提供一种猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用。猫脂肪间充质干细胞具有向肾实质细胞分化的潜能，可分化为系膜细胞、上皮细胞以及内皮细胞等多种类型肾脏细胞，从而修复肾小管，恢复肾小管结构与功能。

在其中一个实施例中，所述猫脂肪间充质干细胞通过以下方法制备得到：

消化：取猫腹部皮下脂肪组织，清洗后剪碎为组织块，加入胶原酶溶液进行消化，消化后过滤，将滤液离心，保留沉淀；

培养：向上述沉淀中加入培养液制成细胞悬液，接种至培养皿中进行培养，定期更换培养液、传代，即得猫脂肪间充质干细胞。

在其中一个实施例中，所述消化步骤具体为：取猫腹部皮下脂肪组织，置于含双抗的PBS 溶液中，取出用酒精浸泡清洗2-4次，用PBS清洗2-3次，用含双抗的PBS溶液清洗2-3次，清洗后剪碎约为0.8-1.2mm³大小的组织块，加入2-3倍体积的浓度为0.8-1.2mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液，于37±1℃中消化20-40min，消化液用200目细胞筛过滤，滤液以1100-1300r/min 离心4-6min，弃去上清液，保留沉淀。

在其中一个实施例中，所述培养步骤具体为：向上述沉淀中加入含FBS、L-Glutamine、双抗的DMEM培养液悬浮细胞，接种于培养板中，放置于37±0.5℃、氧气体积百分含量为5±0.5％、二氧化碳体积百分含量为5±0.5％的条件下培养，每2-3天换一次培养液，直到细胞长满80-90％，进行传代，P1代、P2代细胞冻存，取P3-P6代细胞用于制备治疗急性肾损伤制剂。其中，双抗是指青霉素-链霉素。

本发明另一方面还提供一种治疗猫急性肾损伤制剂，该制剂中包括猫脂肪间充质干细胞。优选地，所述猫脂肪间充质干细胞为采用上述方法培养的P3-P6代细胞。

在其中一个实施例中，所述猫脂肪间充质干细胞的阳性表面标记物CD44、CD90和CD105 的表达量≥99％，阴性表面标记物CD34表达量≤1％。

在其中一个实施例中，所述猫脂肪间充质干细胞，在37±0.5℃、氧气体积百分含量为5 ±0.5％、二氧化碳体积百分含量为5±0.5％的条件下培养得到。

在其中一个实施例中，所述制剂中还包括间充质干细胞保存液和生理盐水。

在其中一个实施例中，所述间充质干细胞保存液包括以下重量百分数的原料：

在其中一个实施例中，所述制剂中猫脂肪间充质干细胞的浓度0.8-1.2×10⁵个/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的通过实验证明猫脂肪间充质干细胞能有效缓解猫急性肾损伤的症状，减少肾脏组织损伤，而且免疫原性低，不会引起免疫排斥反应。

附图说明

图1为实施例中AD-MSCs标记物检测结果；

图2为实施例中各组猫的体重变化；

图3为血液中肌酐、尿素氮和无机磷等指标检查结果；

图4为AD-MSCs治疗对猫血生化指标UREA、CREA、POHS的影响(x±S，n＝6)；

图5为肾病理解剖观察；

图6为肾的HE染色结果(标尺＝20μm)。

图中，Control或正常组为空白对照组，GM为模型组，AD-MSC或MSC为治疗组。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中，“双抗”是指Penicillin-Streptomycin，购自Gibco(10,000U/mL,Gibco,cat.no. 15140163)。

实施例1

一、猫脂肪间充质干细胞制备。

通过无菌术，取猫腹部皮下脂肪约拇指指甲盖大小，放于含双抗的PBS的15mL离心管内。取到的脂肪在无菌操净台内依次用75％酒精浸泡3次，每次3s，PBS洗2次，再使用含双抗的PBS洗涤两次。然后剪碎约为1mm²大小的组织块，剪碎后转移至15mL离心管中，加入两倍体积的浓度为1mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液，于37℃水浴锅中消化30min，终止消化。消化液用200目细胞筛过滤，滤液以1200r/min离心5min，弃去上清液。加入含1％L-谷氨酰胺、1％双抗和10％胎牛血清的DMEM中，混匀制成细胞悬液，接种至60mm²细胞培养皿中。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后换液，置于37℃、氧气体积百分含量为 5％、二氧化碳体积百分含量为5％的条件下培养，以后每3d换一次液，直到细胞长满 80％-90％，进行传代，P1、P2代细胞冻存。

取出冻存在液氮罐的猫脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)，37℃水浴使之尽快融化。1000rpm 离心5min，弃去冻存液，加入含10％FBS、1％L-Glutamine的DMEM培养液悬浮细胞，并以3-5×10⁴/cm²接种于塑料培养板中。37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，2-3d换液一次，取第3-6代AD-MSCs用于后续制剂的制备。

二、鉴定

取P3代细胞，待细胞长至80％时，用0.25％的胰酶消化、用含10％FBS的培养基终止，调整细胞数为1×10⁶个，1200r/min离心5min，弃上清，加PBS缓冲液清洗2次、1 200r/min 离心5min。分别加入抗体CD34、CD44、CD90和CD105，室温孵育20min，1h内上流式细胞仪检测。结果：阳性表面标记物CD44、CD90和CD105的表达量在99％以上，阴性表面标记物CD34表达量在1％以下。结果见表1和图1。

表1标记物表达量

实施例2

干细胞制剂的组分。

将5×10⁶个AD-MSCs和5ml间充质干细胞保存液混合，再加入生理盐水定容至50ml，混匀，即得用于治疗猫急性肾损伤的干细胞制剂。

其中，间充质干细胞保存液的配方为：羟乙基淀粉(130/0.4)3g、葡萄糖1g、柠檬酸0.028g、柠檬酸钠0.4g、氯化钠0.9g、蒸馏水100ml。制备和保存方法：将以上配方中的固体成分溶解于蒸馏水中后高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存，备用。

实施例3

急性肾损伤的建立及干细胞制剂的治疗。

一、急性肾损伤模型的建立

18只中华家猫，4-5月龄大小，平均体重1.31±0.19kg，进行妙三多和狂犬疫苗接种，并进行体内外驱虫，在29℃的室温环境笼子饲养。待猫的排便、排尿正常时，将猫随机分为空白对照组、治疗组和模型组，每组6只。

治疗组和模型组猫每天注射2次GM(庆大霉素)，剂量为200mg/kg/次，空白对照组注射等量生理盐水，在此过程中对猫进行采血，监测肌酐、尿素氮和血磷浓度变化，当三者中的其中一个指标超出正常值或者为基线的1.5倍时，停止注射GM。

二、AD-MSCs治疗

注射GM时每天对猫进行观察记录，当治疗组和模型组的猫均出现多饮、多尿、精神萎靡、嗜睡和食欲减退等现象时，治疗组进行AD-MSCs(P3代)干细胞制剂静脉治疗，细胞数量为2×10⁶个/kg体重，每隔5d注射一次，连续注射5次。模型组和空白对照组注射等量安慰剂。

三、临床观察

视诊发现：实验刚开始时，各组猫精神状态较好，比较活泼，见人喜叫，饮食正常，体型丰满，排便成型，未见异常行为。随着注射GM次数和时间的增加，有猫出现精神低迷、嗜睡、不好动、卷缩成一团或保持较长时间的蹲姿等症状，食欲逐渐减退和消瘦。注射GM 第5d时，大部分猫出现多尿、多饮症状；第7d时，模型组和治疗组均有猫出现不吃不喝、呕吐、不愿走动、精神呆滞和嗜睡等症状，血清肌酐、尿素氮和血磷等生化指标的检测结果表明，此时治疗组和模型组已经造模成功。第10d时，模型组有5只猫精神状态极差，少尿、少饮、呕吐，脱水严重；此时治疗组只有1只猫出现与模型组相同的症状，其余的猫精神稍好，但食欲也不振，不愿起身走动。14d时，模型组已有3只猫死亡，而治疗组只有1只死亡，此时模型组剩下的猫精神状态极差，少尿、不饮水、呕吐，严重脱水；治疗组中有2只猫出现与模型组相似症状，但3只猫精神有所好转，有少许食欲，吃少量猫粮。第21d时，模型组只剩2只猫，其中一只精神极差、体况不好、不吃不喝、消瘦，另一只状态稍好；治疗组剩3只猫，状态较好，食欲较好，吃的猫粮也增多。第25d时，模型组仅剩1只猫，状态较差，而治疗组还剩3只猫，状态较好。到第36d时，治疗组和模型组剩下的猫状态均很好，饮食正常、比较活泼、见人喜叫。

触诊发现：实验开始阶段，猫的毛发顺滑，体型丰满，用手提起猫的皮肤，可见皮肤回弹较快；注射GM的第7d，即造模成功时，治疗组和模型组猫的被毛脏乱、粗糙，此时提起猫的皮肤，可见皮肤回弹较慢。第21d时，模型组的猫毛发脏乱，比较消瘦，触感几乎是骨头，皮肤弹性极差；治疗组的体格较实验开始时差，但比模型组好，皮肤弹性较好。

四、各组猫的体重变化

在造模后7d，模型组和治疗组猫体重均呈下降趋势，第21d模型组和治疗组存活的猫体重在增加，且治疗组体重比模型组要重，但仍低于空白对照组(见表2、图2)。

表2 AD-MSCs治疗对试验猫体重的影响(

n＝6)

注：同列的不同字母表示差异显著性(P＜0.05)

五、血液中肌酐、尿素氮和无机磷等指标的检查结果

注射GM后第7d时，治疗组和模型组血液肌酐、尿素氮值高于或显著高于对照组，且均超过基线值的1.5倍，但模型组的显著高于比治疗组(P＜0.05)；治疗组和模型组的血磷高于空白对照组，但无差异显著性差异；第14d时治疗组和模型组血液肌酐、尿素氮值高于或显著高于空白对照组，而模型组高于或显著高于治疗组。第21d时，治疗组的三个指标均在下降，而模型组的依然很高。第36d时，治疗组的肌酐、尿素氮和无机磷等三个指标回落到正常范围内，但比仍比基线高1.5倍，模型组的依然未恢复至正常值(见图3、图4)。

六、各组猫的存活率与存活时间

AKI造模成功后7d时，模型组死亡3只猫，死亡率为50％；治疗组死亡1只猫，死亡率为16.7％。实验结束时，模型组的死亡率为83.3％，治疗组的为50％。同时计算各组猫实验开始后21d的平均存活时间，发现治疗组的存活时间比模型组的长(见表3)。

表3各组猫存活率与平均存活时间

七、病理解剖观察

造模后第14d，病理解剖发现：空白对照组的腹腔湿润、无积液，模型组和治疗组死亡猫的腹腔均出现大量淡黄色渗出液；造模后第21d，空白对照组的腹部湿润、无积液，模型组的腹部肾区发现有大量淡黄色的渗出液，治疗组无渗出液；造模后36d，各组猫腹腔均无渗出。见图5。

八、肾的病理组织学观察

造模后第14d，模型组的大部分肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，基底膜暴露，几乎看不到完整的肾小管上皮细胞，管腔内充满粉红色蛋白液；治疗组大部分小管上皮细胞肿胀，少数小管上皮细胞坏死、脱落，管腔内充满粉红色蛋白液，基底膜裸露。造模后第21d，模型组大部分肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，管腔内充满粉红色蛋白液，部分区域可见间质增厚；治疗组只有少数肾小管上皮肿胀、坏死脱落及管腔有粉红色蛋白液，大部分小管管型清晰，上皮细胞排列整齐，可见刷状缘结构。造模后第36d，模型组依然可见上皮细胞肿胀、脱落，管腔有渗出物及管腔扩大，肾小球系膜和间质增生；治疗组的大部分管型清晰，可见刷状缘，管腔无渗出物。见图6。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.猫脂肪间充质干细胞在制备治疗猫急性肾损伤制剂中的应用。

2.一种治疗猫急性肾损伤制剂，其特征在于，包括猫脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的治疗猫急性肾损伤制剂，其特征在于，所述猫脂肪间充质干细胞的阳性表面标记物CD44、CD90和CD105的表达量≥99％，阴性表面标记物CD34表达量≤1％。

4.根据权利要求2所述的治疗猫急性肾损伤制剂，其特征在于，所述猫脂肪间充质干细胞，在37±0.5℃、氧气体积百分含量为5±0.5％、二氧化碳体积百分含量为5±0.5％的条件下培养得到。

5.根据权利要求2所述的治疗猫急性肾损伤制剂，其特征在于，所述制剂中还包括间充质干细胞保存液和生理盐水。

6.根据权利要求2～5任一项所述的治疗猫急性肾损伤制剂，其特征在于，所述制剂中猫脂肪间充质干细胞的浓度0.8-1.2×10⁵个/ml。

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