KR102359540B1

KR102359540B1 - 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법

Info

Publication number: KR102359540B1
Application number: KR1020200054275A
Authority: KR
Inventors: 박재성; 이지열; 신현우
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2022-02-10
Also published as: KR20210072672A

Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 진단에 사용하는 샘플을 고순도 및 고수율로 회수하여 암을 비롯한 각종 질병을 높은 신뢰도로 정확하게 진단할 수 있는 진단 방법을 개시한다.

Description

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법{Diagnosis method by aqueous two-phase composition}

본 발명은 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법에 관한 것이다.

최근 들어 암의 예방 및 치료방법이 눈부시게 발전했지만 많은 사람들은 아직도 암은 현대 의학이 해결하지 못한 가장 두려운 난치의 병으로 인식하고 있다. 암의 발생 원인은 아직도 정확히 밝혀진 바 없다. 하지만 지금까지 알려진 바에 따르면 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 생겨서 나타난다고 알려져 있다.

암은 가능한 한 조기 발견하여 적절한 치료를 받았을 때 높은 치유율을 보일 수 있다. 현재까지 이용되는 암의 진단 수단은 물리적인 방법으로 이중 조영법, 압박 촬영법 또는 점막 촬영법 등이 있다. 또한, 조직 검사(생검)하여 암이 의심스러운 부분을 직접 진단할 수 있다. 그러나 상기 방법들은 위생상의 문제가 있고, 검사가 진행되는 동안 환자가 고통을 감수해야 하는 단점이 있어, 이를 대체할 만한 진단 방법이 필요하다.

한편, 대표적인 바이오 마커 중 하나인 엑소좀(exosomes)은 체내 세포에서 자연적으로 분비되는 나노미터 크기의 구형 소낭의 일종이다. 상기 엑소좀은 세포간 신호 전달 목적으로 특별히 분비되는 것으로 이해되고 있으며, 특정 세포가 함유하고 있는 단백질, 지질, RNA 등 기능적 활성물질을 그대로 포함하고 있다. 이에 혈액이나 소변을 통해 엑소좀을 분리하고, 이를 분석하여 각종 질환과 관련된 특성을 분석하여 질병을 쉽게 진단할 수 있다.

엑소좀의 양은 진단의 민감도에 영향을 주고, 순도는 진단의 특이도에 영향을 준다. 이에 따라 가능하면 많은 양의 엑소좀을 분리할 수 있고, 동시에 높은 순도를 같는 엑소좀을 분리할 수 있는 기술이 진단이나 치료제 개발에 필요하다. 그러나 체액 속에는 엑소좀 이외의 물질(단백질)이 너무 많고 엑소좀의 양은 상대적으로 적기 때문에 기존 나노 입자 분리방법을 적용하는데 한계가 있다. 지금까지 다양한 분리방법이 개발되어 왔지만 아직까지 엑소좀을 이용한 진단을 성공시킨 사례는 드물다.

엑소좀을 이용하여 질병을 진단하는 경우 항원-항체 반응을 이용하여 분석하는 경우가 많다. 예를 들어 엑소좀의 막 단백질을 분석해서 진단 하는 경우 항원-항체 반응을 이용한다.

이때 목표하는 막 단백질의 양을 측정하기 위해서 엑소좀의 막 단백질에 붙지 않은 항체를 제거하는 분리 기술이 필요하다. 상기 분리 기술로는 주로 초원심 분리 공정이 사용되고 있다(US9,921,223, 및 US7,897,356). 이러한 방법은 공정 도중 많은 입자 손실을 유발해서 분석에 한계를 가져온다. 특히 항원-항체 반응을 여러 번 적용하는 경우(secondary antibody) 분리 과정을 여러 번 거쳐야 해서 항체가 붙은 엑소좀을 대부분 잃게 된다. 이러한 손실로 인한 낮은 함량의 엑소좀은 전체 집단(population)에 대한 정보를 반영하지 못한다. 또한, 분리되지 않은 엑소좀 이외의 물질(단백질)이 여전히 존재한다. 그 결과, 기존 엑소좀 분리방법을 이용한 질병 진단시 순도 및 함량이 낮아 측정과 분석의 정확도를 떨어뜨린다.

이외에도 US 9952215 B2에서 전기 영동(electrophoresis)을 통한 분리 기술및 saline으로 세척하는 방법(CA2453198)을 개시하고 있으나, 이 또한 상기 순도 및 함량 면에서의 문제를 여전히 해결할 수 없었다.

미국 등록 특허 제9,921,223호, 2018.03.20, Analysis of genomic DNA, RNA, and proteins in exosomes for diagnosis and theranosis 미국 등록 특허 제7,897,356호, 2011.03.01, Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes 미국 등록 특허 제9,952,215호, 2018.04.24, Exosome analysis method, exosome analysis apparatus, antibody-exosome complex, and exosome electrophoresis chip 캐나다 공개 특허 제2453198호, 2005.07.07, Quantification and generation of immune suppressive exosomes

이에 본 발명자들은 엑소좀의 손상 또는 손실이 거의 없이 항체만을 선택적으로 제거하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 두 가지 수용액 상으로 이루어진 새로운 조성의 수용액 이상계 상분리 시스템을 설계하고, 이 시스템을 이용할 경우 높은 선택도로 항체만의 제거가 단시간 내에 가능하고, 암, 특히 전립선암의 진단에 적용 시 높은 신뢰도로 진단이 가능함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 항체 제거를 수행하는 질병 진단 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명은

(S1) 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;

(S2) 상기 세포 밖 소포체와 이에 특이적으로 결합하는 일차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계;

(S3) 동정을 위해 착색 또는 형광 특성을 갖는 이차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계;

(S4) 얻어진 복합체의 정보를 검출하는 단계; 및

(S5) 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 질병 진단 방법을 제공한다.

이때 상기 (S2) 및 (S3) 단계 이후 미반응 항체를 포함하는 불순물을 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 한다.

상기 미반응 항체는 일차 항체 및/또는 이차 항체일 수 있다.

특히, 상기 불순물은 제1수용액상과 제2수용액상이 상분리되는 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하도록 수용액 이상계 상분리 조성물로 처리된다:

[수학식 1]

2 X 10^-6 J/m² ≤ γ ≤ 500 X 10^-6 J/m²

상기 제1수용액상은 벌크 형태로 중력 또는 부력에 의해 연속상인 제2수용액상 내에서 유동하며, 확산에 의해 제1수용액상에서 제2수용액상으로 미반응 항체를 포함하는 불순물을 이동시켜 제거한다.

본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물은 항원-항체 반응 후 미반응 항체를 포함하는 불순물을 효과적으로 제거하여 항원 및 항체가 결합된 세포 밖 소포체를 고순도 및 고수율로 회수할 수 있다.

이러한 방법은 종래 원심 분리 공정을 통해 미반응 항체 제거시 세포 밖 소포체의 손상이나 손실이 발생하는 문제를 차단할 수 있으며, 진단 전 준비 시간을 7시간에서 3시간 이내로 단축시키는 이점이 있다.

상기 항원 및 항체가 결합된 세포 밖 소포체는 고순도로 회수됨으로써 각종 질병 진단, 특히 암의 진단, 모니터링 및 예측에 바람직하게 적용 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 질병 진단 방법의 순서를 보여주는 순서도이다.
도 2은 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물의 분리 메카니즘을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3는 제1수용액상 및 제2수용액상의 에너지 배리어를 보여주는 모식도이다.
도 4는 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 시뮬레이션 결과이다.
도 5는 도 4의 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 모식도이다.
도 6은 제1수용액상과 제2수용액상의 계면장력과 입자의 크기에 따른 에너지 장벽를 보여주는 모식도이다.
도 7은 제1수용액상과 제2수용액상에 의한 계면장력에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 8은 입자 크기에 따른 계면에서의 탈출 속도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 9는 온도 변화에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 실시예에서 제2수용액상에 제1수용액상을 형성 후 형광 비드의 이동을 보여주는 사진이다.
도 11은 실시예 1(a) 및 비교예 1(b)에서 얻어진 엑소좀-CD9-Alexa 488 복합체의 전반사현미경 사진이다.
도 12는 엑소좀의 함량 대비 Alexa-488의 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 13은 CD9 농도 대비 Alexa-488의 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 14는 전립선 비대증 환자(BPH) 및 전립선암 환자(Pca)의 CD9 발현양 대비 PSMA 발현양을 보여주는 그래프이다.
도 15는 기존 진단법인 PSA로 진단했을 때와 APIF를 이용한 진단과 PSA 진단을 함께 적용했을 때의 ROC 곡선이다.

본 발명은 높은 신뢰도로 암을 진단할 수 있는 방법에 관한 것으로, 진단을 위한 시료의 준비 단계에서 항원-항체 반응 이후 미반응 항체를 포함하는 불순물을 단시간 내에 효과적으로 제거한다.

질병 진단 방법

도 1은 본 발명에 따른 질병 진단 방법의 순서를 보여주는 순서도이다.

도 1을 참조하면, 질병 진단은

(S1) 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;

(S4) 얻어진 복합체의 정보를 검출하는 단계; 및

이하 각 단계별로 상세히 설명한다.

(S1) 세포 밖 소포체 분리 단계

먼저, 질병 진단을 위해 생물학적 시료를 채취하여 이로부터 세포 밖 소포체를 분리한다.

생물학적 시료는 암 진단을 위해 사람을 포함한 포유류로부터 분리된 조직, 분획, 유체, 및 세포일 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 생물학적 시료는 암을 진단하기 위해 시료(sample)가 될 수 있는 물질로서, 물에 용해될 수 있는 세포 배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 복강액, 정액, 양수, 모유, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 눈물, 콧물 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종이 가능하다. 이러한 생물학적 시료는 단백질을 포함한다.

상기 생물학적 시료로부터 질병 진단을 위해 세포 밖 소포체를 분리한다.

세포 밖 소포체(extracellular vesicle; EV)는 50 내지 500 nm의 크기를 가지는 인지질 이중막으로 싸인 소포체로 단백질, 핵산, 지질, 대사물질 등 여러 가지 물질을 한 번에 수송한다. 상기 세포 밖 소포체는 엑소좀, 엑토솜, 바이러스, 단백질, LDL, HDL, 외부소포 마이크로베지클, 마이크로파티클, 세포자멸체, 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 및 엑토솜 유사 소포 등이 있다.

그 중에서도 엑소좀은 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 세포외 소낭을 의미하는 것이다, 상기 엑소좀은 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 막 단백질, 유전 물질 및 세포질 성분을 가지고 있어 세포의 성질과 상태를 간접적으로 파악할 수 있게 해준다. 또한, 엑소좀은 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs, 단백질(성장 호르몬, 사이토카인 등) 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포외 전달체로 작용한다.

생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체의 분리는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 공지된 바의 초원심분리(ultra-centrifugation isolation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체 기술(microfluidics chip) 및 폴리머를 이용한 방법(polymeric method) 등이 가능하다. 바람직하기로는 본 발명에서 설명하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리 공정이 사용될 수 있다.

(S2) 일차 항체 결합 단계

다음으로, 상기 세포 밖 소포체와 이에 특이적으로 결합하는 일차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계를 수행한다.

일차 항체(primary antibody)는 세포 밖 소포체의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 것으로, 단백질과 관련된 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 모두 포함한다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

일례로, 일차 항체는 엑소좀 특이 마커일 수 있으며, A33, ABL2, ADAM10, AFP, ALA, ALIX, ALPL, ApoJ/CLU, ASCA, ASPH(A-10), ASPH(D01P), AURKB, B7H3, B7H3, B7H4, BCNP, BDNF, CA125(MUC16), CA-19-9, C-Bir, CD10, CD151, CD24, CD41, CD44, CD46, CD59(MEM-43), CD63, CD63, CD66eCEA, CD81, CD81, CD9, CD9, CDA, CDADC1, CRMP-2, CRP, CXCL12, CXCR3, CYFRA21-1, DDX-1, DLL4, DLL4, EGFR, Epcam, EphA2, ErbB2, ERG, EZH2, FASL, FLNA, FRT, GAL3, GATA2, GM-CSF, Gro-알파, HAP, HER3(ErbB3), HSP70, HSPB1, hVEGFR2, iC3b, IL-1B, IL6R, IL6Unc, IL7R알파/CD127, IL8, INSIG-2, 인테그린, KLK2, LAMN, 마모글로빈, M-CSF, MFG-E8, MIF, MISRII, MMP7, MMP9, MUC1, Muc1, MUC17, MUC2, Ncam, NDUFB7, NGAL, NK-2R(C-21), NT5E (CD73), p53, PBP, PCSA, PCSA, PDGFRB, PIM1, PRL, PSA, PSA, PSMA, PSMA, RAGE, RANK, RegIV, RUNX2, S100-A4, 세프라제/FAP, SERPINB3, SIM2(C-15), SPARC, SPC, SPDEF, SPP1, STEAP, STEAP4, TFF3, TGM2, TIMP-1, TMEM211, 트레일-R2, 트레일-R4, TrKB(poly), Trop2, Tsg101, TWEAK, UNC93A, VEGFA, wnt-5a(C-16), 등일 수 있다.

일차 항체를 결합시키기 위한 항원-항체 반응은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 공지된 바의 방법이 사용될 수 있다.

일례로, 상기 일차 항체는 1:10 내지 1:5000 비율로 희석하여 처리하고, 4 내지 37℃ 온도에서 30분 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:100내지 1:500비율로 희석하여 처리하고, 4 내지 27℃ 온도에서 60 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있다. 희석 비율, 온도 및 시간 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우, 일차 항체 반응이 감소되어 세포 염색 과정이 정상적으로 수행되지 않을 수 있다.

이때 질병, 특히 암을 진단하기 위해 암 특이 항원(또는 종양 마커)을 더욱 포함할 수 있다.

암 특이 항원은 암의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 이 분야에서 공지된 모든 특이 항원이 사용될 수 있다. 일례로, 전립선암 특이 항원으로는 PSA, PSMA, PCSA, PSCA, B7H3, EpCam, TMPRSS2, mAB 5D4, XPSM-A9, XPSM-A10, 갈렉틴-3, E-세렉틴, 갈렉틴-1, 또는 E4 (IgG2a 카파), 또는 이의 임의의 조합에 대한 하나 이상의 결합 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 결합 물질로 탐지할 수 있다.

본 항원-항체 반응 후 얻어진 복합체는 미반응된 일차 항체를 제거 후 다음 단계에 사용한다. 이때 미반응된 일차 항체는 하기에서 설명하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거한다.

(S3) 이차 항체 결합 단계

다음으로, 동정을 위해 착색 또는 형광 특성을 갖는 이차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계를 수행한다.

이차 항체(secondary antibody)는 일차 항체에 포획된 표적 단백질을 검출하는(detect) 역할을 하는 항체로, 상기 이차 항체의 사용으로 인해 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

적절한 검출 라벨은 자석 라벨, 형광 모이어티, 효소, 화학적발광 프로브, 금속 미립자, 비-금속 콜로이드성 미립자, 폴리머 염료 미립자, 안료 분자, 안료 미립자, 전기화학적으로 활성 종들, 반도체 나노결정 또는 양자점들 또는 골드 미립자, 형광단, 양자 도트, 또는 방사능 활성 라벨을 포함하는 다른 나노미립자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단백질 라벨은 하기에서 설명된 것과 같이 녹색 형광 단백질 (GFP) 그리고 이의 변이체 (가령, 시안 형광 단백질 그리고 황색 형광 단백질); 그리고 발광 단백질 이를 테면 루시퍼라제를 포함한다. 방사능활성의 라벨 방사능동위원소 (방사능핵종), 이를 테면 3 H, 11 C, 14 C, 18 F, 32 P, 35 S, 64 Cu, 68 Ga, 86 Y, 99 Tc, 111 In, 123 I, 124 I, 125 I, 131 I, 133 Xe, 177 Lu, 211 At, 또는 213 Bi을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 형광 라벨은 희토류 킬레이트 (가령, 유로품 킬레이트), 로다민, 플로우레신, 가령, FITC, 5-카르복시플로우레신, 6-카르복시 플로우레신을 포함 하나 이에 한정되지 않는 유형; TAMRA; 단실; Lissamine; 시아닌; 피코에리틴; Texas Red; Cy3, Cy5, 다폭실, NBD, Cascade Yellow, 단실, PyMPO, 피렌, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산 그리고 기타 쿠마린 유도체들, Marina Blue??, Pacific Blue??, Cascade Blue??, 2-안트라센술포닐, PyMPO, 3,4,9,10-페릴렌-테트라카르복실 산, 2,7-디플로오르플루오레신 (Oregon Green?? 488-X), 5-카르복시플루오레신, Texas Red-X, Alexa Fluor 430, 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA), 6-카르복시테트라메틸로다민 (6-TAMRA), BODIPY FL, 비마네, 그리고 Alexa Fluor 350, 405, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 그리고 750, 그리고 이의 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가령, "The Handbook--A Guide to Fluorescent Probe and Labeling Technologies," Tenth Edition, available on the internet at probe (dot) invitrogen (dot) com/handbook. 형광 라벨은 하나 이상의 FAM, dRHO, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ, Gold540 및 LIZ일 수 있다.

이차 항체를 결합시키기 위한 항원-항체 반응은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 공지된 바의 방법이 사용될 수 있다.

일례로, 상기 이차 항체는 1:100 내지 1:10000 비율로 희석하여 처리하고, 4 내지 37℃ 온도에서 30분 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:1000내지 1:5000비율로 희석하여 처리하고, 4 내지 28℃ 온도에서 60분 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있다. 희석 비율, 온도 및 시간 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우, 이차 항체 반응이 감소되어 세포 염색 과정이 정상적으로 수행되지 않을 수 있다.

본 항원-항체 반응 후 얻어진 복합체는 미반응된 이차 항체를 제거 후 다음 단계에 사용한다. 이때 미반응된 이차 항체는 하기에서 설명하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거한다.

(S4) 정보 검출 단계

다음으로, 상기 일차 항체 및 이차 항체가 결합된 복합체를 분석 장치에 적용하여 이로부터 얻어지는 정보를 검출한다.

분석 장치는 복합체의 세포 밖 소포체의 mRNA 수준 또는 단백질의 발현 정도를 측정한다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는, 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 등의 방법이 사용될 수 있으며, 본 발명에서 특별히 한정하지 않는다.

(S5) 정상 대조군과의 비교를 통한 질병 진단 단계

다음으로, 상기 얻어진 검출 결과를 정상 대조군과 비교하여 질병을 진단한다.

본 발명에서 질병은 암일 수 있으며, 상기 단계를 통해 암을 진단, 모니터링 또는 예측할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 명세서 용어 "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 대장암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 대장암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.

본 명세서에서 용어 "전이(metastasis)"는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다.

적용 가능한 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 안종양, 복막암, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 구강암, 담낭암, 담관암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이고, 바람직하기로 전립선암일 수 있다.

본 단계에서 암에 걸리지 않은 정상 세포를 대조군으로 사용하여, 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교함으로써 암을 진단, 모니터링 또는 예측이 가능하다.

또한, 치료 후 환자의 세포를 대조군으로 사용하여 환자의 상태를 모니터링할 수 있다.

특히, 본 발명에 따라 분리된 복합체를 바이오 마커로서 암 진단에 적용할 경우 환자에게서 비파괴적인 방식으로 구한 미량의 시료만으로 분석이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 암에 대한 특이성(specificity)과 정확성(sensitivity)이 동시에 겸비될 수 있다. 더불어, 시료의 준비에서 진단까지의 시간을 대폭 감축시킬 수 있고 비용 또한 낮출 수 있다는 이점이 있다.

이러한 효과는 항원-항체 반응 이후 미반응된 항체를 어느 정도까지 제거하느냐와, 항체가 결합된 세포 밖 소포체의 손실 및 손상이 어느 정도인지에 영향을 받는다. 종래 항원-항체 반응 이후 미반응 항체는 160,000 x g 에서의 초원심분리 공정이 수행되고 있다. 이러한 초원심분리 공정은 일차 항체 및 이차 항체의 2단계에 걸친 항원-항체 반응이 수행됨에 따라 최소 7시간 이상의 장시간의 준비 시간이 소요된다는 점과, 세포 밖 소포체가 손상이 일어나거나 손실(loss)되는 문제가 발생하였다.

이에 본 발명에서는 단시간 내에 미반응 항체를 분리할 수 있고, 세포 밖 소포체의 손상 또는 손실을 억제하도록 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거한다.

본 발명에서는 상기 (b) 및 (c) 단계의 항원-항체 반응 후 미반응된 일차 항체 및/또는 이차 항체를 포함하는 불순물들을 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거한다.

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 미반응 항체 제거

본 발명에서 언급하는 수용액 이상계란, 밀도가 서로 다른 수용액이 액체-액체 상태로 상분리되어 존재하는 것을 의미한다.

이에, 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물이란 두 종류의 수용액이 상분리된 형태로 존재하고, 상기 상분리된 상태의 계면(즉, 경계면)에서 불순물 및 타겟이 존재하고, 이때 상기 불순물의 탈출을 통해 이들 간의 분리가 가능한 것을 의미한다.

불순물로 대표되는 미반응 일차 항체 및 이차 항체는 약 5 내지 40nm의 크기를 갖는다. 이와 대조적으로, (S2)를 거쳐 얻어진 복합체는 세포 밖 소포체에 일차 항체가 결합된 것으로, 세포 밖 소포체의 최소 크기가 50nm 임을 고려한다면 상기 복합체는 이보다 큰 수치의 크기를 갖는다. 또한, (S3)를 거쳐 얻어진 복합체는 이차 항체가 추가 결합된 것으로, 상기 크기보다 더 큰 범위의 크기를 갖는다.

이에 미반응 일차 항체, 이차 항체와 복합체의 입자 크기의 차이를 고려하며, 특정 범위의 크기만을 통과시킬 수 있는 필터를 사용할 경우 상기 복합체와 미반응 항체를 포함하는 불순물을 효과적으로 분리할 수 있다.

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리 메카니즘

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 미반응 항체를 포함하는 불순물/복합체의 분리를 통한 불순물 제거에 대한 메카니즘은 하기와 같이 설명된다.

이때 상기 불순물은 미반응 항체를 포함하고, 소량의(negligible) 항원 및 세포 밖 소포체를 포함하며, 상기 미반응 항체가 주도적으로 존재한다(dominant). 또한, 복합체는 일차 항체 결합된 세포 밖 소포체 또는 일차 및 이차 항체가 결합된 세포 밖 소포체를 의미한다. 상기 불순물 및 복합체는 나노 수준의 크기를 갖는 입자이므로, 하기에서는 나노 입자의 표현으로서 이들을 기재한다.

도 2은 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물의 분리 메카니즘을 설명하기 위한 모식도이다.

먼저, 분리하고자 하는 2종류의 나노 입자를 준비한다. 상기 2종류의 나노 입자는 설명을 위한 것으로, 분리를 위해 입자 크기가 다른 2종 이상 혼합된 모든 나노 입자가 가능하다.

다음으로, 수용액 이상계를 형성하기 위한 두 개의 수용액을 준비한다. 이때 분리가 필요한 대상(혼합 나노 입자, 즉, 불순물)은 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2) 중 어느 하나의 상에 포함된다. 도 2에서는 설명의 편의를 위해, 제1수용액상(P1)에 혼합하였다.

수용액 이상계의 형성은 두 개의 수용액이 존재하고, 이들 수용액은 접촉에 의해 도 2(a)에 나타낸 바와 같이 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)으로 상분리된다.

제1수용액상(P1)은 중력(gravitational force) 또는 부력(buoyancy)에 의해 제2수용액상(P2) 내에서 유동하는 상태로 존재한다. 제1수용액상(P1)이 제2수용액상(P2) 보다 높은 밀도를 가질 경우 중력 방향으로 이동하되, 부력에 의해 바닥으로 가라앉지 않고 제2수용액상(P2)에 부유하는 상태로 존재한다.

특히, 상기 제1수용액상(P1)은 미세한 입자나 액적 상태로 존재하거나 상층부/하층부와 같이 상하층이 분리된 상태가 아니라, 벌크(bulk) 형태로 부유하여 존재한다. 종래 수용액 이상계를 이용한 입자 분리는 교반(vortexing) 등의 공정을 수행하여 제1수용액 상이 미세한 입자 상태로 쪼개어지며 나노 입자의 분리가 일어나는데 비해, 본 발명은 벌크 형태 내에서 나노 입자의 분리가 수행된다. 또한 종래의 수용액 이상계는 교반(vortexing) 과정에 주어지는 외력에 의해 수용액 경계면의 에너지 장벽(energy barrier)이 달라지게 되며 이러한 외력에 의해 입자가 경계면을 자유롭게 통과할 수 있기 때문에 상경계면에 의한 입자의 필터링 효과보다 입자 표면과 각 수용액상 사이의 친화력(affinity)에 의한 분리효과가 더 두드러지게 나타난다.

도 2(b)를 보면, 벌크 상태의 제1수용액상(P1)에 존재하는 혼합 나노 입자들은 수용액 상 내에서 불규칙하게 운동하는 브라운 운동(Brownian motion)이 활발하게 일어나고, 이 운동에 의해 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 이루는 경계면과 접촉한다.

이때 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 접촉하여 경계면에 트랩(trap)되는데, 이 트랩된 나노 입자의 확산 계수(diffusion coefficient)에 의해 제2수용액상(P2) 또는 제1수용액상(P1)으로 이동하거나 경계면에 잔류한다. 그 결과, 도 2(c)에 나타낸 바와 같이, 제1수용액상(P1)의 혼합 나노 입자들 중 일부가 상기 기공을 통해 제2수용액상(P2)으로 이동한다. 그 결과, 일정 시간 경과 후 혼합 나노 입자들 중 일부는 제2수용액상(P2)에, 나머지는 제1수용액상(P1) 또는 경계면에 잔류하고, 상기 제2수용액상(P2)을 경계면을 포함하여 분리하여 이에 존재하는 나노 입자의 회수를 통해 나노 입자의 분리를 수행할 수 있다.

특히, 제1수용액상(P1)이 제2수용액상(P2)에 주입된 후 중력에 의해 하부측으로 이동하는 과정에서 상기 제1수용액상(P1)이 새로운 제2수용액상(P2)과 계속적으로 만나 계면을 형성하기 때문에, 상기 두 상(P1, P2)의 경계면에서 나노 입자의 이동이 연속적으로 일어나면서 가속화될 수 있다. 상분리 형태 중 하나인 상층부/하층부로 상분리된 형태에서는 지속적인 새로운 경계면의 형성이 불가능하여, 나노 입자의 연속적인 이동이 일어날 수 없다. 또한, 미세한 액적 상태로 상분리된 형태에서는 교반 등에 의해 새로운 경계면이 형성될 수 있으나, 상기 교반 과정에서 주어지는 외력에 의해 경계면에서의 에너지 장벽이 달라져, 이 외력에 의해 입자가 경계면을 자유롭게 통과할 수 있어, 교반 과정에서 경계면을 통한 많은 입자의 손실이 발생하게 되어 적합하지 않다. 이 방법은 경계면에서의 필터링 효과보다는 입자 표면과 각 수용액상(P1, P2) 사이의 친화력(affinity)에 의한 분리 효과가 두드러지게 나타나, 본 발명과는 다른 메커니즘으로 분리가 일어난다.

본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 통한 불순물/복합체 간 분리는 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)을 형성하는 수용액의 경계면에서의 장력에 의해 영향을 받는다.

계면장력(Interfacial tension)은 서로 다른 2종 이상의 물체가 혼합하지 않고 층을 이루고 접할 때, 이 경계면에 발생하는 장력을 의미한다. 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 서로 다른 용질을 포함하여 밀도에 차이가 있고, 서로 다른 용질의 크기차, 물성차로 인해 계면을 경계로 장력이 형성된다. 이러한 장력에 의해 표면에 입자가 넘어야 하는 에너지 장벽이 형성되며 이 에너지 장벽은 마치 기공과 같은 역할을 한다, 장력의 크기가 크면 에너지 장벽의 높이가 높아져 기공이 작아지는 경향이 있어, 상기 힘에 의해 계면에서의 기공의 크기, 즉 임계 직경(threshold diameter, 또는 한계 직경)을 갖는 기공이 형성된다. 이렇게 형성된 기공을 통해 혼합 나노 입자의 일부가 제1수용액상(P1)으로 이동한다.

임계 직경은 통상 nm 수준으로, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면장력이 어느 정도 범위를 가져야만 상기 nm 수준을 유지할 수 있다. 즉, 계면장력이 작다는 것은 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 서로 혼합(miscible)될 수 있다는 것을 의미하여 입자 분리가 일어날 수 없고, 반대로 계면장력이 클 경우 상분리를 일어나나 임계 직경이 매우 작아 복합체의 분리를 수행할 수 없게 된다. 이 계면장력과 임계 직경과의 관계는 수용액 이상계 시스템 연구 분야에서 아직까지 제시한 바가 없는 새로운 개념이다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)에 의해 설정되는 계면장력의 수치는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 조성에 의해 설계될 수 있으며, 이러한 조성의 설계는 분리하고자 하는 생물학적 시료 내 불순물 및/또는 복합체가 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 접촉에 의해 형성되는 경계면에서의 에너지 배리어를 넘어 확산이 가능한지에 따라 달라진다.

도 3은 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 에너지 배리어를 보여주는 모식도이다.

도 3을 참조하면, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)은 서로 다른 용질을 포함하는 수용액으로, 각각 다른 높이를 갖는 에너지 배리어가 존재한다. 상기 제1수용액상(P1)에 존재하는 혼합 나노 입자는 입자 분리를 위해 경계면과 제2수용액상(P1) 사이의 에너지 배리어를 뛰어넘어 제2수용액상(P2)으로 탈출한다. 이때 도 2의 장치를 이용할 경우 제2수용액상(P2)으로 탈출한 일부 나노 입자는 다시 제1수용액상(P1)으로 넘어가지 못한다. 상기 계면에서의 에너지 배리어의 통과, 즉 제1수용액상(P1)에서의 탈출 에너지는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면에서의 계면에서의 장력에 의해 영향을 받는다.

경계면의 표면 장력의 경우 높아질수록 경계면에 있는 입자가 다른 상으로 탈출하기 위해 넘어야 하는 에너지 장벽의 높이가 높아져서 경계면을 탈출할 수 있는 입자의 임계 크기를 감소시킨다. 이는 사용하는 제1 및 제2수용액의 상을 어떻게 선택하느냐에 따라 경계면의 계면장력을 변수로 활용할 수 있음을 의미한다.

또한, 경계면에서 제1수용액상(P1)에서 제2수용액상(P2)으로의 나노 입자의 이동 및 탈출은 픽스 확산 법칙(Fick's laws of diffusion)을 통해 설명된다. 상기 픽스 확산 법칙은 열역학에서 확산 과정을 나타내는 두 개의 법칙으로, 제1법칙과 제2법칙이 있으며, 본 발명에서는 연속적인 확산과 관련된 제2법칙(Fick's second law)으로 설명될 수 있다.

Fick's second law와 경계면에 트랩된 입자의 탈출 비율(escaping rate)을 이용하여 입자의 이동을 예측했다. 경계면에 트랩된 입자가 탈출하는 비율은 식 (1)을 만족한다.

------------------ 식 (1)

(상기 식(1)에서, Γ: 경계면에서 탈출하는 입자의 비율, J: 입자의 flux, n 은 경계면에 있는 입자의 농도, α: 비례 상수, ΔΕ: 경계면에 있는 입자와 경계면에서 탈출한 입자의 에너지 차이, κ: 볼츠만 상수, T: 온도이다.)

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면에 있는 입자의 에너지 장벽(ΔΕ)는 하기 식(2)로 표현할 수 있다.

---식 (2)

(상기 식(2)에서, γ_Phase/Phase2: 제1수용액상과 제2수용액상의 경계면에서 작용하는 장력, R: 입자의 반경, γ_{particle/Phase1}: 제1수용액상 안에 있는 입자의 표면에 작용하는 장력, γ_{particle/Phase2}: 제2수용액상 안에 있는 입자의 표면에 작용하는 장력, κ: 볼츠만 상수, T: 절대 온도, K: 분리 계수이다)

상기 식에서, ΔΕ는 경계면에 있는 입자가 경계면을 벗어나기 위해 넘어야 하는 에너지 장벽(Energy barrier)을 의미하며, 그 값이 클수록 입자의 탈출 비율은 낮아짐을 의미한다.

또한, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면 근처에서의 입자의 유동은 하기 식을 만족한다.

----------------- 식 (3)

--------------식 (4)

(상기 식(3), (4)에서, J_{Phase1-interface}: 제1수용액상과 경계면 사이의 입자의 유동, J_{Interface-Phase2}: 제2수용액상과 경계면 사이의 입자의 유동, C_Phase1: 경계면 근처 제1수용액상에 있는 입자의 농도, C_Phase2: 경계면 근처 제2수용액상에 있는 입자의 농도, C_Interface: 경계면에 있는 입자의 농도, κ1, κ2: 비례 상수 Γ_Phase1: 경계면에서 제1수용액상으로 탈출하는 입자의 비율, Γ_Phase2: 경계면에서 제2수용액상으로 탈출하는 입자의 비율이다)

상기 식을 보면, 제2수용액상(P2)과 경계면 사이 입자의 유동은 제2수용액상(P2)에서 경계면으로 이동하는 입자의 유동과 경계면에서 제2수용액상(P2)으로 탈출하는 입자의 유동의 합이다. 마찬가지로 제1수용액상(P1)과 경계면 사이 입자의 유동은 제1수용액상(P1)에서 경계면으로 이동하는 입자의 유동과 경계면에서 제1수용액상(P1)으로 탈출하는 입자의 유동의 합이다.

상기 식 (1, 2, 3, 4)를 Fick's second law에 적용하여 시뮬레이션을 수행하였다.

입자는 10nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 혼합 비드 입자를 적용하여 제2수용액상(P2)으로 탈출한 비드 입자의 양을 측정하여 지배 방정식과 경계 조건의 계수를 결정했다. 제1수용액상(P1)으로는 덱스트란 수용액(1% 농도)을 사용하였고, 제2수용액상(P2)으로는 폴리에틸렌글리콜(3% 농도)를 사용하였다. 또한, 상기 식에서 제1수용액상(P1)은 새로운 제2수용액상과(P2) 연속해서 접하기 때문에 경계면 근처 제2수용액상(P2)에 있는 입자의 농도는 0에 가깝다고 가정했다. (

). 이에, 제2수용액상(P2)으로 탈출한 비드 입자의 양을 측정하여 지배 방정식과 경계 조건의 계수를 결정했다. 결정된 계수를 바탕으로 입자의 크기, 여과 시간, 분리 계수(partition coefficient), 온도, 경계면의 표면 장력에 따른 입자의 분리를 시뮬레이션 했다.

도 4는 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 시뮬레이션 결과이다.

도 4(a) 및 도 4(b)를 보면, 시간에 따라 경계면을 통과하는 비드 입자의 임계 크기가 점점 증가했으며 이를 바탕으로 크기가 작은 비드 입자부터 제2수용액상(P2)으로 탈출한다는 것을 알 수 있다.

구체적으로, 도 4(a)를 보면, 시간에 따른 경계면을 통과할 수 있는 비드 입자의 임계 크기의 증가는 200초 내에 급격하게 일어나며 그 뒤에는 일정 크기로 수렴한다. 또한, 도 4(b)를 보면, 10nm 크기의 나노 입자의 경우 60분 경과 후 모두 통과되었음을 알 수 있고, 50nm 및 100nm는 계면에 잔류함을 알 수 있다. 이는 수용액 이상계 상분리 조성물이 특정 크기 이하의 입자만 통과시키는 필터의 역할을 한다는 것을 의미한다.

특히, 10nm입자의 경우 60분 이후 완전히 탈출함을 알 수 있어, 혼합 나노 입자로부터 나노 입자의 손실없이 고순도, 즉 100% 또는 이에 가까운 수율로 나노 입자를 분리할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 실제 불순물과 복합체를 포함하는 생물학적 시료를 분리 공정에 적용할 경우 종래 분리막 등의 분리 공정에서 발생하는 복합체의 손실과 같은 문제를 원천적으로 차단하여, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용해 생물학적 시료로부터 복합체를 고순도로 분리할 수 있다는 이점을 확보할 수 있음을 알 수 있다.

이는 도 5의 모식도를 통해 보다 자세하게 알 수 있다.

도 5는 도 4의 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 모식도이다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, 입자는 제1수용액상(P1)으로부터 제2수용액상(P2)이 접촉하여 형성하는 계면으로 이동한다. 경계면과 접촉한 입자의 일부는 경계면에 트랩되며, 이때 입자의 크기에 따라 제1수용액상(P1)으로부터 제2수용액상(P2)으로 탈출한다.

도 5는 3가지 형태의 계면을 도시하였고, Interface A인 경우는 가장 작은 크기의 입자만 통과하고, Interface B는 중간 크기의 입자까지, Interface C의 경우에는 모두 통과가 가능하다. 이를 통해 입자 크기에 따라 선택적으로 혼합 나노 입자에서 나노 입자를 분리할 수 있다.

좀더 설명하면, 3개의 입자 중 가장 작은 크기의 입자를 분리하고자 할 경우 Interface A와 같이 설계하여 제2수용액상(P2)으로 작은 크기의 입자를 통과시킨 후, 이를 회수하여 분리가 가능하다. 또한, 가장 큰 크기의 입자를 분리하고자 할 경우 Interface B와 같이 설계하여, 제1수용액상(P1)에 잔류하는 큰 크기의 입자를 회수하여 분리가 가능하다. 또한, 중간 크기의 입자의 경우, Interface B와 같이 설계한 후, 제2수용액상(P2)을 회수하고, 이를 다시 Interface α(미도시)를 갖도록 설계한 후, 제2수용액상(P2) 내 작은 크기의 입자와 중간 크기의 입자를 다시 한번 더 분리하는 공정을 거쳐 중간 크기의 입자만을 선택적으로 회수할 수 있다.

이 Interface A, Interface B, Interface C에서 나노 입자의 트랩 또는 통과 여부는 상기에서 언급한 바와 같이, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)을 이루는 각 조성에 따른 에너지 장벽과, 이들이 접촉하여 형성하는 계면에서의 장력(즉, 계면장력)에 따라 달라진다. 상기 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 갖는 에너지 장벽이 낮으면, 이들이 접촉하여 이루는 계면장력이 낮아지고, 상기 계면장력이 낮아질수록 계면을 통과하는 입자의 크기(즉, 임계 입경)가 증가할 수 있다.

도 6은 계면장력과 입자 크기에 따른 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이의 에너지 장벽을 보여주는 모식도이다.

도 6에서 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 이루는 계면장력이 클수록 에너지 장벽이 높아진다. 이때 10nm, 50nm, 및 100nm 각각의 나노 입자가 넘어야 하는 에너지 장벽에 차이가 있으며, 10nm에서 가장 낮은 에너지 장벽을 갖는다. 즉, 입자의 크기가 작을수록 경계면에서 다른 상으로 탈출할 때 넘어야 하는 에너지 장벽이 더 낮아지는데 입자가 특정 크기 이상이 되면 에너지 장벽이 너무 높아 계면에서 트랩된 상태로 이 경계면을 입자가 넘지 못하게 된다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 접하여 계면을 형성할 경우 에너지 장벽이 낮은 10nm 크기의 나노 입자부터 제2수용액상(P2)으로의 탈출이 먼저 일어난다. 이에 100nm 크기의 큰 크기의 나노 입자는 경계면에 트랩되고, 상기 경계면에서의 통과를 위해선 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면장력을 낮춰야만 이와 비례적으로 에너지 장벽이 낮아져 제2수용액상(P2)으로의 탈출이 일어날 수 있음을 알 수 있다.

이러한 결과는 계면장력에 따라 트랩된 나노 입자가 경계면을 통과할 수 있는 임계 입경이 주도적으로(dominant) 결정될 수 있음을 의미한다. 다시 말하면, 계면장력이 낮다는 것은 그 만큼 통과하는 나노 입자의 크기가 커질 수 있다는 것을 의미한다.

도 7은 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)에 의한 계면장력에 따른 임계 입경(D_T)의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 7을 참조하면, 계면장력에 따라 경계면에서 트랩된 입자가 탈출하는 임계 입경이 달라짐을 알 수 있다.

구체적으로, 계면장력이 높을수록 경계면을 탈출할 수 있는 입자의 임계 입경이 최종적으로 작아지는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 그리고, 특정 시간에 도달하기 전까지 시간에 따라 입자의 임계 입경이 바뀌지만 최종적으로 도달하는 임계 입경은 동일하다는 것을 알 수 있다. 또한 시간에 따라 입자의 임계 입경이 증가하는 것을 알 수 있는데 이를 해석함으로써 원하는 크기를 제거하는데 걸리는 시간을 알 수 있다. 일례로, 계면장력이 5X10^-6 J/m²으로 설계된 수용액 이상계 상분리 조성물의 경우 임계 입경이 40nm인 나노 입자를 30분 이내에 분리할 수 있음을 알 수 있다.

이러한 결과를 통해, 본 발명에서는 불순물과 복합체를 포함하는 생물학적 시료로부터, 상기 복합체를 분리하기 위해, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)은 하기 수학식 1을 만족하는 계면장력(γ) 범위를 가져야 한다.

[수학식 1]

2 X 10^-7 J/m² ≤ γ ≤ 50 X 10^-5 J/m²

본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 통해 구현 가능한 기공의 크기는 1 내지 500nm, 바람직하기로 3 내지 450nm, 좀더 바람직하기로 5 내지 400nm, 더욱 바람직하기로 5 내지 350nm, 더더욱 바람직하기로 10 내지 250nm, 가장 바람직하기로 30 내지 180nm의 범위를 갖는다.

상기한 기공을 갖기 위해, 수용액 이상계 상분리 조성물은 경계면에서 이루는 계면장력이 2 X 10^-7 J/m² 내지 50 X 10^-5 J/m², 바람직하기로 2 X 10^-7 J/m² 내지 40 X 10^-6 J/m², 좀더 바람직하기로 3 X 10^-6 J/m² 내지 350 X 10^-6 J/m², 더욱 바람직하기로 4 X 10^-6 J/m² 내지 270 X 10^-6 J/m², 더더욱 바람직하기로 5 X 10^-6 J/m² 내지 150 X 10^-6 J/m², 가장 바람직하기로 10 X 10^-6 J/m² 내지 60 X 10^-6 J/m²의 범위를 갖는다.

이때 계면장력이 상기 수학식 1에서 제시한 범위가 아니라 그 수치가 감소하여 어느 정도 한계를 벗어나게 되면, 상분리가 발생하지 않고 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 혼합이 일어나 수용액 이상계 상분리 조성물이 구성되지 않고, 반대로 상기 계면장력이 어느 수치 이상일 경우에는 불순물 또는 복합체가 경계면에 트랩되어 탈출이 발생하지 않는다. 이는 본 발명에서 제시하는 수학식 1의 계면장력 수치 범위를 가져야만 안정한 수용액 이상계 상분리 조성물의 구성이 가능하여 불순물 또는 복합체의 탈출을 통한 분리가 가능해짐을 입증할 수 있는 데이터이다.

또한, 분리 시간을 살펴보면, 불순물 또는 복합체의 크기가 작을수록 계면을 탈출하는 속도가 빨라짐을 알 수 있다.

이 도 7에서 나타내는 계면장력에 따른 임계 입경의 변화에 따라, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 조성물을 특정 계면장력을 갖도록 설계할 경우 복합체를 고순도로 쉽게 분리할 수 있음을 예측할 수 있다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물은 조성물의 설계를 통해 계면장력을 조절하고, 상기 계면장력의 조절에 의해 임계 입경을 제어할 수 있음에 따라 임계 입경이 1 내지 500nm, 3 내지 450nm, 좀더 바람직하기로 5 내지 400nm, 더욱 바람직하기로 5 내지 350nm, 더더욱 바람직하기로 10 내지 250nm, 가장 바람직하기로 30 내지 180nm 의 범위를 갖는 필터를 구현할 수 있다. 이때 상기 수용액 이상계 상분리 조성물은 분리능이 불순물과 복합체 간의 크기 차이가 10nm 정도까지 분리가 가능하다. 이때 분리능이 10nm라는 의미는 나노 입자가 10nm 및 20nm와 같이 10nm의 차이를 갖는 것까지도 분리 가능함을 의미하며, 10nm 및 100nm와 같이 90nm의 차이를 보이는 경우의 분리는 자명하게 수행될 수 있음을 의미한다.

한편, 도 7은 제1수용액상(P1)이 정지상(stationary phase)인 경우와 유동상(moving phase)인 경우를 나뉘어 도식화되었다. 시간이 무한대인 경우에 제1수용액상(P1)이 정지상 및 유동상 모두에서는 동일한 결과를 나타내었으나, 정해진 시간 내에서는 제1수용액상(P1)이 유동상을 가질 경우 나노 입자의 분리에 유리함을 알 수 있다. 통상적으로 나노 입자 분리가 무한대의 시간이 아닌 정해진 시간 내에서 이루어짐을 고려한다면, 제1수용액상(P1)이 유동상인 형태를 가지는 경우 실제 분리 공정에 적용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

수용액 이상계 상분리 조성물의 설계

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면에서의 장력은 제1수용액상과 제2수용액상의 조성 설계를 통해 이루어질 수 있다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이에 계면장력을 갖기 위해선 이들 간의 상분리가 선행되어야 한다. 상기 상분리는 다른 여러 가지 방법이 가능하나, 본 발명에서는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이의 two phase diagram을 통해 이루어질 수 있다. 또한, 불순물과 복합체의 분리는 이들 표면이 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2) 중 어느 하나의 상에 친화력(affinity)에 있느냐에 의해 분리 속도 및 분리능이 향상될 수 있다. 이러한 내용을 고려하여 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)을 이루는 특정 조성을 two phase diagram을 통해 선택하여 수용액 이상계 상분리 조성물 구성할 수 있다.

제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 기본적으로 용질이 물에 용해된 수용액이다.

상기 용질의 종류에 따라 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 고분자 및/또는 염이 존재하는 고분자 수용액 또는 염 수용액일 수 있다.

용질로서의 고분자는 친수성 고분자일 수 있다.

사용 가능한 친수성 고분자로는 폴리아르기닌, 폴리라이신, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 키토산, 프로타민(protamin), 폴리비닐아세테이트, 히알루론산, 콘드로이친황산, 헤파린, 알지네이트, 하이드록시옥시프로필 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 전분, 폴리(비닐 메틸 에테르 에테르), 폴리비닐피롤리돈, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

또한, 용질로서의 고분자는 고분자 다당류일 수 있다. 상기 고분자 다당류는 사이클로덱스트린, 글루코오스, 덱스트란, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스, 피콜(ficoll), 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스-만니톨, 글루코오스-만니톨, 트레할로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-덱스트란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

염 수용액에 사용하는 염은 (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgSO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl, KCl, NaBr, NaI, LiCl, n-Bu₄NBr, n-Pr₄NBr, Et₄NBr, Mg(OH)₂, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, ZnCO₃, Ca₃(PO₄)₂, ZnCl₂, (C₂H₃)₂Zn, ZnCO₃, CdCl₂, HgCl₂, CoCl₂, (CaNO₃)₂, BaCl₂, MgCl₂, PbCl₂, AlCl₃, FeCl₂, FeCl₃, NiCl₂, AgCl, AuCl₃, CuCl₂, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate), 테트라데실황산나트륨(sodium tetradecyl sulfate), 브롬화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrimethylammonium bromide), 염화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrmethylammonium chloride), 브롬화 테트라데실트리메틸암모늄(tetradecyltrimethylammonium bromide), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

또한, 상기 용질로 고분자염이 사용될 수 있으며, 일례로 전술한 바의 고분자와 염의 조합이 될 수 있다.

전술한 바의 고분자 및 염 중에서 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로의 선택은 분리하고자 하는 나노 입자의 특성(예, 표면 특성), 및 상분리가 가능하도록 하는 특성 및 농도에 따라 달라질 수 있다.

그중, 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로 사용 가능한 각각의 조합은 고분자인 경우 친수성-소수성의 특성일 수 있다. 상기 고분자는 기본적으로 수용액에 용해되므로 친수성을 나타내나, 두 가지 조성을 조합할 경우 상대적으로 친수성을 갖거나 상대적으로 소수성을 가질 수 있다. 일례로, 덱스트란과 폴리에틸렌글리콜의 경우, 덱스트란은 상대적으로 친수성을 가지며, 분자 구조가 보다 조밀하고(more denser), 폴리에틸렌글리콜은 상대적으로 소수성을 가지며, 분자 구조가 덜 조밀한(less dense) 특성이 있다. 이에 덱스트란/폴리에틸렌글리콜은 각각 제1수용액상/제2수용액상(P1/P2)으로 사용할 수 있다.

또한, 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로 사용 가능한 각각의 조합은 고분자의 경우 분자량 및 농도는 중요한 선정 이유가 될 수 있다.

고분자는 분자량이 커질수록, 농도가 높아질 수록 제1 수용액과 제 2수용액상이 안정적으로 형성되며 고분자의 분자량이 너무 작을 경우 제1 수용액과 제 2수용액이 쉽게 섞여버리게 된다.

고분자의 분자량은 최소 수용액 내 용해(또는 팽윤)된 상태로 존재해야 하며, 이는 고분자의 종류에 따라 물에 대한 용해도의 차이가 있으므로, 그 범위의 한정이 용이하지 않다. 다만, 전술한 바의 친수성 고분자의 경우 중량평균분자량이 200 내지 2,000,000, 바람직하기로 500 내지 1,000,000, 더욱 바람직하기로 1000 내지 500,000을 갖는다. 일례로, 덱스트란과 조합하는 폴리에틸렌글리콜의 경우 200 내지 60000, 바람직하기로 500 내지 40000 범위의 중량평균분자량을 갖는 것을 사용한다. 또한, 덱스트란은 15 내지 1000,000, 바람직하기로 1000 내지 500,000 범위의 중량평균분자량을 갖는다.

이때 고분자 또는 고분자염 수용액의 농도는 물에 대한 용해도의 차이가 있으나 0.001 내지 20 중량%, 바람직하기로 0.01 내지 15 중량%일 수 있다. 만약 그 농도가 너무 낮을 경우 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 고분자 수용액이 물과 비슷한 유동성을 나타내 이 둘이 서로 혼합(miscible)되어 수용액 이상계의 형성이 어렵다. 반대로, 너무 높을 경우 고분자의 용해에 시간이 걸리고 수용액 이상계의 계면에서의 장력이 너무 높아 임계 입경이 작아져 나노 입자의 분리가 어려워지는 문제가 있다.

고분자 대신 염을 사용할 경우 수용액 이상계를 이루기 위해 고농도의 염이 필요하다. 앞서 설명한 바와 같이 고분자의 분자량이 커질수록 제1 수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 안정적으로 형성되는데 염의 경우 분자량이 고분자보다 작기 때문에 고농도에서만 수용액 이상계를 형성시킬 수 있다. 바람직하기로 고농도염은 1 내지 70 중량%, 더욱 바람직하기로 5 내지 50 %로 사용하는 것이 바람직하다.

이미 제1 수용액상과 제2 수용액 상을 이룰 수 있는 시스템에 저농도의 염을 추가할 경우 염이 수용액 내에서 이온 상태로 해리되어 나노 입자의 이동 속도를 변화시키는 역할을 한다. 이때 염은 평균 분자량이 10 내지 1000 중량부이 바람직 하다.

구체적으로, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물에서 제1수용액상/제2수용액상(P1/P2)의 조합은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 고분자-고분자, 및 고분자-고농도염의 조합으로 사용될 수 있다.

	제1수용액상(P1, 분산상)	제2수용액상(P2, 연속상)
고분자-고분자 조합	1% 덱스트란	3% 폴리에틸렌글리콜(MW= 35000)
	2% 덱스트란	5% 폴리비닐피롤리돈(MW=5000)
	2% 덱스트란	2% 폴리비닐알코올(MW=130000)
	5% 덱스트란	5% 피콜(MW=400)
	3% 폴리비닐메틸에테르에테르(MW=5000)	5% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
고분자-고농도 염 조합	10% (NH₄)₂SO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% Na₂SO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% MgSO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% K₂HPO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% KH₂PO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% Na₂CO₃	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)

상기 표 1에 제시한 조합은 일 예이며, 이외에 전술한 바의 조성을 이용한 다양한 조합이 수학식 1에서 제시한 계면장력을 만족하는 범위이면 그 어느 조합이라도 사용될 수 있다.

복합체는 불순물보다 큰 입경을 가지므로, 입자 크기가 상대적으로 작은 불순물은 계면에 트랩되지 않고 제2수용액상으로 이동하고, 제1수용액상에는 생물학적 표적만 잔류하게 된다. 이어, 상기 제1수용액상을 피펫 또는 스포이드 등의 장비를 이용하여 수용액 이상계로부터 분리하여 생물학적 표적을 회수할 수 있다.

세포 밖 소포체는 50~500nm의 크기를 가지며, 미반응된 항체를 포함하는 불순물은 30nm 이하의 크기를 갖는다. 이에, 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 계면에서의 임계 입경을 30nm를 초과하는 크기를 갖도록 계면장력을 갖는 조성으로 설계할 경우, 항체가 결합된 세포 밖 소포체는 제1수용액상과 제2수용액상 간의 경계면에 트랩되어 제1수용액상에 잔류하고, 나머지 불순물(미반응 일차 항체, 또는 미반응 이차 항체 등)은 제2수용액상으로 이동하여, 순수 항체 결합된 세포 밖 소포체(즉, 복합체)만을 선택적으로 분리할 수 있다.

특히, 본 발명의 수용액 이상계 상분리 조성물은 입자 크기가 10nm의 차이를 갖는 입자에서도 분리가 가능하여, 고순도로 복합체의 분리가 가능하다.

추가로, 상기 분리 공정시 분리능 및 분리 속도를 높이기 위해, 온도를 인가하거나 초음파를 인가할 수 있다.

온도는 분리 속도와 관련된 파라미터로, 온도를 높일수록 복합체와 불순물의 분리 속도가 증가하는 효과를 가져온다.

도 8은 입자 크기에 따른 계면에서의 탈출 속도 변화를 보여주는 그래프이다. 도 8에서 Γ_P1: 경계면에서 제1수용액상으로 탈출하는 입자의 비율을, Γ_P2: 경계면에서 제2수용액상으로 탈출하는 입자의 비율을 의미한다.

도 8을 참조하면, 온도가 증가할수록 입자의 브라운 운동이 가속화되어 경계면에 트랩된 입자의 탈출 속도가 증가한다. 일례로, 생물학적 시료에서 불순물의 입자 크기가 복합체의 크기보다 작을 경우, 경계면에서 트랩된 불순물이 탈출하는 속도가 증가될 수 있음을 의미한다. 이러한 결과를 통해, 아주 정확한 사이즈로 단시간 내에 분리할 필요가 있을 경우 유용하게 사용할 수 있는 공정 조건의 변수로 온도를 이용할 수도 있음을 알 수 있다.

도 9는 온도 변화에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 9를 참조하면, 온도 증가에 따라 임계 입경이 선형적으로 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 임계 입경의 크기 차이가 10nm 이내로 나타나, 불순물과 복합체의 분리시 온도를 증가하더라도 분리 속도만을 증가시킬 뿐 필요 이상의 임계 입경을 증가시키지 않아 고순도로 불순물과 복합체를 분리시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, 제1수용액상(P1)이 정지상(stationary droplet) 및 유동상(moving droplet)인 경우 분리 속도만 달라질 분 임계 입경은 최종적으로 동일해 지는 것을 알 수 있다.

또한, 초음파 인가를 통해 외부로부터의 물리력이 경계면의 에너지 장벽을 낮춰서 임계 입경을 변화시키거나 입자의 확산을 도와줘서 불순물과 복합체의 분리 속도를 증가시킬 수 있다.

입자 크기가 다른 불순물과 복합체는 그 크기의 차이와 같은 역학적 물성의 차이가 발생한다. 상기 크기 외에 그 재질이나 조성이 다른 경우, 재질, 밀도 및 압축률 등의 역학적 물성은 크게 차이가 난다. 여기에 초음파가 혼합 나노 입자에 인가되면 입자 크기에 따라 서로 다른 음향 방사력(acoustic radiation force)을 가져 초음파의 음압마디 선(sound pressure node line)을 따라 나노 입자가 이동한다. 즉, 불순물과 복합체들이 혼재되어 있을 경우 이들을 분리할 수 있으며, 이들의 이동 속도를 높일 수 있다. 특히, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면에 트랩되어 있는 불순물과 복합체들 간의 분리 속도를 높일 수 있어 상기 트랩된 입자로 인한 분리 속도의 저하를 방지할 수 있다.

이러한 음향 방사력은 주파수의 제어에 의해 조절 가능하다. 바람직하기로, 본 발명에서는 0.01 내지 100 kHz의 200 W ~ 400 W의 강도에서 1분 ~ 240 분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이때 인가하는 초음파의 강도가 너무 셀 경우 벌크 형태를 이루어져야 하는 제1수용액상(P1)에 영향을 줘, 상기 제1수용액상(P1)이 미세한 액적을 형성할 수 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 수행한다. 또한, 초음파 인가는 초음파 발생기를 통해 수행할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

실험예 1: 시뮬레이션 시험

상기한 계면장력과 에너지 장벽 및 임계 입경과 관련된 이론적 고찰과 더불어 시뮬레이션 결과를 통해, 본 발명에서 나노 입자의 분리가 실제 공정에서 적용이 가능한지 직접적인 실험을 수행하였다.

먼저, 혼합 나노 입자로서 30nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 형광 비드를 준비하였고, 제1수용액상(P1)으로는 덱스트란 수용액을 사용하였고, 제2수용액상(P2)으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하였다. 분리 계수 (K, partition coefficient)=100, 온도=20°C, 시간=300s, 경계 장력 = 0.013mJ/m ² 의 조건에서 수행하였다.

이때 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 농도를 조절하여 하기와 같이 계면장력을 갖는 수용액 이상계 필터를 설계하였다.

구성	계면장력( X10^-6 J/m²)	제1수용액상(P1) 조성	제2수용액상(P2) 조성
A	5.36	3% 덱스트란	4% PEG
B	3.57	2.5% 덱스트란	3.5% PEG
C	1.65	2% 덱스트란	3% PEG
D	30	3.5% 덱스트란	4.5% PEG
E	55	4% 덱스트란	5% PEG

총 9개의 관형의 시험관을 준비하고, 구성 A, B 및 C의 필터에 30nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 형광 비드를 각각 주입하여 형광 비드의 이동을 형광 현미경(fluorescence microscope)으로 확인하였다. 이때 D 및 E의 구성을 갖는 필터는 임계 입경이 30nm 이하로 나노 입자의 탈출이 없었다.

측정을 위해 먼저, 관형의 시험관(내경 2 mm)에 제2수용액상(P2)을 이루는 폴리에틸렌글리콜 수용액 75 μL를 주입하였다. 제1수용액상의 덱스트란 수용액 3 μl에 형광 비드 5 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 얻어진 분산액 3 μl를 상기 제2수용액상(P2)이 담겨진 관형의 시험관 상부에 천천히 주입하였으며, 제1수용액상(P1)이 시험관의 하부 측으로 이송됨을 확인하였다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 혼합 즉시(T=0분), 30분 및 60분 경과 후 형광 비드의 이동을 형광분광기를 통해 측정하였다.

그 결과, 계면장력이 5.36 X10^-6 J/m²인 경우 30nm, 50nm 및 100nm 각각의 나노 입자 중 30nm의 나노 입자만이 제2수용액상(P2)으로 이동하였음을 알 수 있다. 이와 유사하게, B 조성의 경우 계면장력이 3.57 X10^-6 J/m²이고, 30nm 및 50nm의 나노 입자들이 제2수용액상(P2)으로 이동하고, 100nm인 나노 입자는 경계면에서 트랩되어 제1수용액상(P1)에 잔류함을 확인하였다. 또한, C 조성의 경우 계면장력이 1.65 X10^-6 J/m²이고, 30nm, 50nm 및 100nm 모두 제2수용액상(P2)으로 이동함을 알 수 있다. 이를 통해, 수학식 1에 나타낸 바와 같이, 계면장력이 최소 2 X10^-6 J/m² 이상이 되어야 함을 알 수 있다.

이러한 결과를 통해, 계면장력의 제어를 통해 나노 입자의 분리시 경계면을 통과할 수 있는 임계 입경을 조절할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 1: 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리

(1) 엑소좀-CD9- Alexa 488 복합체 제조

혈장에서 원심분리기로 분리한 엑소좀(50nm~500nm)에 CD9(primary antibody, 150kDa)을 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. 이후 얻어진 용액을 수용액 이상계 상분리 조성물(임계 입경 42nm)을 이용하여 미반응 CD9을 제거하였다.

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 방법은 하기와 같이 수행하였다.

가로*세로의 시험관에 폴리에틸렌글리콜 수용액 5 ml을 첨가하였다. 이어, 시료 500 ㎕를 덱스트란 수용액 0.5 ml과 혼합하여 1시간 동안 용해시킨 후, 얻어진 용액을 상기 시험관에 첨가하여 덱스트란/폴리에틸렌글리콜 상분리를 유도하고, 37℃에서 30분 동안 방치하여 미반응 CD9이 폴리에틸렌글리콜 내로 이동하도록 하였다. 이어, 엑소좀-CD9 복합체를 포함하는 덱스트란 수용액 상을 회수하여 다음 단계에 사용하였다.

다음으로, 상기 엑소좀-CD9 복합체에 Alexa 488(secondary antibody)을 첨가하여 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. 이어, 이후 얻어진 용액을 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 미반응 Alexa 488을 제거하였다.

실시예 2: 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리

불순물 제거 시 30분 대신 60분 동안 수행한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

비교예 1: 초원심 분리 공정을 이용한 분리

불순물 제거를 위해 2시간 동안 160,000에서 초원심 분리 공정을 수행한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

실험예 2 : 엑소좀-CD9 및 엑소좀-CD9-Alexa 488 복합체 분석

(1) 엑소좀-CD9 복합체 회수 효율 및 CD9 제거율 측정

회수된 엑소좀-CD9 복합체를 이용하여 엑소좀-CD9 복합체의 회수 효율 및 CD 항체의 제거율을 측정하였다.

엑소좀-CD9 복합체의 회수 효율을 비교하기 위해, 초기에 있던 전체 엑소좀 또는 CD9의 양과 비교하여 분리된 양을 확인했다. 이를 위해 전체 양에 대하여 분리된 엑소좀 또는 CD9 양의 백분율(%)을 회수 효율(recovery efficiency, E)이라고 정의했으며, 수용액 이상계의 회수 효율을 아래의 수학식 2에 따라 계산하였다. 이때 엑소좀의 양은 RNA 양으로 측정하였고 CD9의 양은 브래드포드 어세이(bradford assay)를 이용하였다.

[수학식 2]

	실시예 1	실시예 2	비교예 1
엑소좀-CD9 복합체 회수효율	97.39%	92.57%	18.8%
미반응 CD9 제거율	93.14%	95%	86.53%

상기 표 3을 참조하면, 본 발명에 따라 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 엑소좀-CD9 복합체의 회수효율을 비교예 1의 초원심 분리 공정 대비 높은 수율로 회수 될 수 있음을 알 수 있다 또한, 미반응 CD9의 제거율 또한 높아 고순도로 엑소좀-CD9 복합체를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

(2) 현미경 분석

전반사현미경 (total internal reflection fluorescence microscope;TIRF)을 이용하여, 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 엑소좀-CD9-Alexa 488 복합체를 측정하였다.

도 11은 실시예 1(a) 및 비교예 1(b)에서 얻어진 엑소좀-CD9-Alexa 488 복합체의 전반사현미경 사진이다. 구체적으로 300 ug의 엑소좀의 지질층을 DII(빨간색)로 염색을 한 후 CD9과 Alexa 488(초록색)로 엑소좀의 막단백질을 결합시켰다. 도 11에서 빨간색과 초록색이 겹쳐서 노란색으로 된 부분이 엑소좀 막 단백질과 지질이 함께 있는 엑소좀을 의미하며 초원심 분리와 APIF 모두 노란색으로 된 입자를 확인할 수 있었다.

도 11의 결과를 보면, 실시예 1의 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 방법이 비교예 1의 초원심 분리 공정 대비 많은 함량의 엑소좀-항체 복합체을 포함함을 알 수 있다.

(3) 엑소좀의 함량 대비 Alexa-488의 함량 변화

1ug, 2.5ug, 6ug, 12.5ug의 서로 다른 양의 엑소좀을 동일 조건의 수용액 이상계 상분리 조성물로 처리한 후, 엑소좀의 함량 대비 Alexa-488의 함량 변화를 측정하였다.

도 12는 엑소좀의 함량 대비 Alexa-488의 함량 변화를 보여주는 그래프이다.

도 12를 참조하면, Alexa 488 형광 시그널이 엑소좀의 양에 대해 선형적(linear)인지 측정한 결과, 형광시그널이 R=0.9927로 선형적임을 확인하였다. 반면, 비교예 1과 같이 초원심 분리 공정을 수행한 경우 엑소좀의 손실이 커서(96%의 엑소좀 손실) 형광측정기로 형광이 측정되지 않아 분석이 불가능했다. 이러한 결과는 기존의 방법으로 분석이 불가능한 소량의 엑소좀 샘플을 수용액 이상계 상분리 조성물로 처리하는 것이 유리하다는 것을 의미한다.

(4) CD9 농도 대비 Alexa-488의 함량 변화

엑소좀의 양을 25 ug으로 고정하고 CD9 항체의 농도를 서로 다르게 결합시킨 후, Alexa 488을 결합시켜 CD9의 농도에 따른 Alexa 488의 함량 변화를 측정하였다.

도 13은 CD9 농도 대비 Alexa-488의 함량 변화를 보여주는 그래프이다.

도 13을 참조하면, Alexa 488을 스테이닝 했을 때 4 ng/ml 이상의 CD9 농도에서 형광량이 일정 수치로 수렴되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 특정 CD9 농도 이상에서 모든 엑소좀이 스테이닝 된다는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 스테이닝이 정상적으로 된다는 것을 의미한다.

상기 (1)~(4)의 결과를 보면, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용할 경우 미반응 항체인 CD9을 효과적으로 제거하고, 엑소좀의 손실 및 손상이 적어 고순도의 엑소좀-항체 복합체를 고수율로 제조할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 고수율 및 고순도의 제조방법은 초기 샘플에 있는 엑소좀의 전체 집단을 분석할 수 있다는 이점이 있다.

실험예 3: 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리 성능 평가

본 발명에 따른 방법 및 교반/원심분리를 수행하는 방법을 이용하여 엑소좀-CD9 복합체를 분리하고, 회수 효율을 확인하였다.

(1) 회수 효율

이때 비교예 2로서, 대한민국 공개특허 제10-2016-0116802호에 의거한 방법을 이용하여 수행하였다. 실시예 1과 동일하게 수행하되, 분리 공정에서 1,000 × g-force로 상온에서 10분간 초원심 분리 공정을 수행하였다.

	실시예 1	비교예 2
엑소좀-CD9 복합체 회수효율	97.39%	68.3%
미반응 CD9 제거율	93.14%	77.5%
순도(엑소좀 회수효율/CD9 회수 효율)	14.2	3.04

실험예 4: 전립선암 진단

본 발명에서는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 복합체를 제조하고, 얻어진 복합체를 실제 전립선암 진단에 사용하여 진단능을 확인하였다.

기존 엑소좀을 이용한 진단은 순도 높고 많은 양의 엑소좀을 혈장에서 추출하기가 어렵기 때문에 분리한 엑소좀의 양이 측정기의 측정 한계보다 적어서 분석자체가 불가능한 경우가 많다. 또한 엑소좀을 분리한 뒤 분석을 위해 항체를 스테이닝 할 때 스테이닝되지 않은 항체를 제거하는 과정에서 엑소좀 손실이 생겨서 분석이 어려워질 뿐 아니라 전체 엑소좀 집단에 대한 분석이 불가능하다.

이에 본 발명에서는 환자로부터 수집된 혈장에서 엑소좀의 분리 및 복합체의 제조시 불순물의 제거의 모든 공정에 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하였다. 전립선암 진단을 위해 전립선암 관련 막단백질 마커인 prostate specific membrane antigen(PSMA)를 사용하였다.

1. 암환자(n=25)와 전립선 비대증환자(n=25)의 혈장 200 uL를 pre-cleaning

2. 혈장 -> 엑소좀 분리

3. 엑소좀- PSMA-CD9 복합체 제조 및 불순물 제거

4. 엑소좀- PSMA-CD9-Alexa 488 복합체 제조 및 불순물 제거

5. Alexa 488 형광량으로 PSMA의 양을 측정

도 14는 전립선 비대증 환자(BPH) 및 전립선암 환자(Pca)의 CD9 발현양 대비 PSMA 발현양을 보여주는 그래프이다. 도 14를 참조하면, 전립선암 환자의 경우 전립선 비대증 환자보다 더 높은 수치를 가지는 것을 확인했다. 이는 암환자의 혈장 엑소좀의 PSMA 발현이 전립선 비대증환자의 경우보다 많다는 결과와 일치한다.

이때 비교를 위해 비교예 1과 같이 초원심 분리 공정을 통해 상기 공정을 수행하였다. 최종적으로 얻어진 엑소좀의 함량이 초기양의 0.2 % 미만으로(총 4번의 원심분리과정이 필요, 한 번에 약 80%의 엑소좀이 손실 됨) PSMA와 CD9의 시그널이 약해서 형광량 측정기로 측정할 수 없었다.

한편, 전립선암을 진단할 때 일반적으로 혈장 내 PSA의 농도를 측정한다. 혈장 내 prostate specific antigen(PSA)를 이용하여 앞서 실험한 50 명의 환자군에 대해 진단을 했을 때 진단 성공 확률은 70%였다.

도 15는 기존 진단법인 PSA로 진단했을 때와 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물(AIF)을 이용한 진단과 PSA 진단을 함께 적용했을 때의 수신자 판단 특성곡선 (receiver operating characteristics curve; ROC 곡선)이다. 상기 ROC 곡선은 민감도 및 특이도를 확인할 수 있는 곡선으로, PSA + AIF는 본 발명에 따른 방식이고, Serum-PSA는 기존 진단 방법을 의미하고, Reference Line은 기준선이다.

도 15를 참조하면, 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 진단과 PSA 진단을 함께 적용했을 때 진단의 민감도와 특이도가 향상됨을 알 수 있다.

결과적으로, 본 발명에서와 같이 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 엑소좀 진단을 PSA와 함께 했을 때 진단 성공 확률은 90%로, 기존 진단 성공 확률이 약 70%인 것 대비 크게 향상되었다. 더욱이, 수용액 이상계 상분리 조성물을 엑소좀을 이용한 진단법에 적용했을 때 기존의 방법으로 진단이 불가능한 소량의 샘플에 대해 진단이 가능했다. 또한 PSA 진단법과 수용액 이상계 상분리 조성물을 결합해서 진단을 했을 때 진단능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims

(S1) 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리하는 단계;
(S2) 상기 세포 밖 소포체와 이에 특이적으로 결합하는 일차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계;
(S3) 동정을 위해 착색 또는 형광 특성을 갖는 이차 항체를 항원-항체 반응을 통해 결합시키는 단계;
(S4) 얻어진 복합체의 정보를 검출하는 단계; 및
(S5) 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하여 질병 진단 시,
상기 (S2) 및 (S3) 단계 이후 미반응 항체를 포함하는 불순물을 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 제거하는 단계를 수행하되,
상기 수용액 이상계 상분리 조성물은 분산상을 이루는 제1수용액상; 및 상기 분산상과 상분리되며, 연속상을 이루는 제2수용액상을 포함하되, 상기 제1수용액상과 제2수용액상은 상하층이 분리된 상태가 아니라, 제1수용액상이 벌크 형태로 연속상인 제2수용액상 내에서 유동하는 상태를 가지며,
상기 제1수용액상과 제2수용액상이 상분리되는 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하는 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
[수학식 1]
2 X 10^-6 J/m² ≤ γ ≤ 50 X 10^-6 J/m²
제1항에 있어서,
상기 미반응 항체는 일차 항체, 또는 이차 항체 중 어느 하나 이상인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 세포배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 복강액, 정액, 양수, 모유, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 눈물, 콧물 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
추가로 항원을 포함하는, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 수용액 이상계 상분리 조성물은 확산에 의해 미반응 항체가 제1수용액상에서 제2수용액상으로 이동하여 제거되는 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1수용액상 및 제2수용액상은 고분자-고분자, 또는 고분자-고농도염 수용액 시스템 중에서 선택된 어느 하나인 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
추가로 상기 세포 밖 소포체는 생물학적 시료로부터 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 분리된 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 질병 진단은 암 진단, 모니터링 또는 예측하는 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 안종양, 복막암, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 구강암, 담낭암, 담관암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.