CN101194012A - 在悬浮的禽类胚胎衍生的干细胞中制备病毒疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒疫苗的开发和制备。本发明特别的涉及病毒载体和疫苗的工业生产领域，更特别的是应用禽类细胞，优选鸡胚胎衍生的干细胞来生产病毒载体和病毒。本发明特别适用于可防止人和动物病毒感染的病毒疫苗的工业化生产。

Description

在悬浮的禽类胚胎衍生的干细胞中制备病毒疫苗的方法
技术领域
本发明涉及病毒疫苗的开发和制备。本发明特别的涉及病毒载体和疫苗的工业生产领域，更特别的是应用禽类细胞，优选鸡胚胎衍生的干细胞来生产病毒载体和病毒。本发明特别适用于可防止人和动物病毒感染的病毒疫苗的工业化生产。
背景技术
大量接种疫苗是可以最简单和有效的控制病毒流行，比如：全国和世界范围内的流感暴发，而且也可以阻止大量生物恐怖分子的袭击，比如：最近在美国发生的恐怖分子炭疽袭击。然而，许多疫苗诸如流感和天花疫苗是用基于鸡蛋的系统生产的，当前疫苗生产商的生产能力并不能应付大流行的或生物恐怖分子的袭击的需要。
除了由抗原漂移或重配引起的季节性的小型流感流行外，带有完全新型流感病毒亚型的抗原漂移也会不定期的出现，而人群往往对其没有免疫力。它们可以引起全球的流行并且很快在世界范围内传播。上个世纪发生了三次这样的大流行(1918、1957和1968)。最严重的1918大流行感染了世界人口的约一半，其中约25％得病；总的死亡人数估计在2-4千万，尤其是影响青少年。这次流行抑制了随后10年的人口增长。最近的一次有高死亡率和潜在的流行趋势的暴发是在1997，当时在香港发现了一种新的流感病毒(H5N1)，感染的病人1/3死亡，主要是青壮年。幸运的是，病毒不能够在人与人之间传播，所以很快就阻止了其暴发。2003年在香港有分离到一个类似的病毒。假如下一次流行类似于1957或1968的流行，而并不像1918的流行，那么在美国，将有1800-4200万人去门诊就诊，314,000-734,000人住院，89,000-207,000人病死(Meltzer MI，Cox NJ和Fukuda k.Theeconomic impact of pandemic influenza in the United States：priorities forintervention.Emerging Infectious Diseases 1999；5：659-671)。按照全球的人口数推算，下一次暴发流行的影响估计可能是10-20亿人感染，5,300,000-12,300,000人患严重疾病，1,500,000-3,500,000死亡。
除了潜在的流行，每年由A和B型流感病毒漂移的变异体引起的季节性流感流行可感染大约10-20％的人口，并且可引起发热、住院治疗和死亡。间接统计方法用来估算流感的总负荷；这些包括不同的统计学模型，其可以定量在流感流行期间的发病率和死亡率的季节性增加(Simonsen L，Clarke MJ，Williamson GD，Stroup DF，Arden NH，Schonberger LB.The impact of influenza epidemics on mortality：introducing a severity index.Am J.Public Health 1997；87：1944-1950)。应用这种方法估算，最近美国流感流行时期平均25000000-50000000人感染，150000人住院治疗，20000-40000死亡；假设年龄特异性的流感的患病风险与在USA的相应风险相似，可能每年全球的流行会使约10亿人感染，约3000000-5000000人患严重疾病，250000-500000死亡(见WHO报告，Geneva，2003四月：State of the art of new vaccinesResearch&Development-Initiative for Vaccine Research)。
目前可用的流感疫苗在阻止全球范围内的流感相关疾病是有效的，并且可以高效阻止流感引起的住院和死亡。尽管这样，在发达和发展中国家，疫苗仍然没有覆盖全部的高危人群，这部分是因为疫苗价格相对较高以及需要每年重复接种。然而，最近流感疫苗的使用在全球范围内开始增加，2003年达到约235,000,000人，但是在当前的流行病疫苗生产仍然没法满足需要。确实是这样，世界卫生组织(WHO)估计，在严重流感暴发时，约12亿人属于高危人群(65岁以上老人、婴儿、儿童、患慢性病的成年人和卫生工作者等等)。
目前应用基于鸡蛋的系统生产合法的流感疫苗，尽管这项技术已经可靠地应用了50多年，但是有其局限性，包括：
·每次生产要得到大量的鸡蛋并要进行质量控制，致使该方法周期长、工作量大并且资源消耗大。由于利润空间太小，目前这种基于鸡蛋的生产系统对于制药公司没有太大的吸引力使其投入生产鸡蛋来源的流感疫苗；
·需要在流感易发季节前至少6个月时，选择制备疫苗的病毒株。
这样过早的决定制备流感疫苗的病毒株往往是不正确的，而且制备疫苗的时间又很长，将会使疫苗的中途校正活动(mid-stream corrective action)成为不可能；
·需要生产足够的疫苗以满足每年逐渐增加的需求(2004年在工业化国家需要约250000000份，仅仅美国就需要约100000000份)。在2004至2005年的冬天，由于英国生产的鸡蛋来源的流感疫苗发生污染，致使美国流感疫苗短缺的时间已经引起人们的严重关切。而且，目前全球生产的流感疫苗不足以覆盖全球的高危人群。事实上，流感疫苗是否能及时的分配和送到感染者手中仍然值得怀疑；
·生产疫苗需要大量受精的鸡蛋，这就有在供体鸡被感染的情况下，没有足够鸡蛋可提供的风险；
·在流感病毒生命力削弱的情况下，需要用昂贵的没有特异病原体(specific pathogen free SPF)感染的鸡蛋；
·从BSE免税的国家购买的牛血清的价格受通货膨胀的影响；
·在一些个体中，鸡蛋来源的组分是过敏原；
·不能用鸡蛋来繁殖那些对鸡是高剧毒和致命的病毒。
另外，目前生产疫苗技术只能生产窄谱的疫苗，所以储存的疫苗不可能保护一个完全新的流感病毒流行株。
另外，这些年来，生物恐怖分子的袭击成为许多西方国家最为担心的事情，比如：近期发生的炭疽恐怖袭击。美国政府在2002年通过了生物恐怖行动准备和反应草案(Bioterrorism Preparedness andResponse Act)，通过执行该草案并采取适当的措施来对生物恐怖袭击作出快速诊断、防御和反应。生物武器相对容易得到，所以一直被恐怖组织作为袭击人群和政府的便宜和有效的方法。特别是，在最近几年天花病毒作为一个生物武器的使用已经增加，所以一些国家已经制订了应对这种风险的应对计划。
天花病毒被认为最有可能通过有预谋的发散而导致广泛的破坏，然后是瘟疫、炭疽和肉毒杆菌。天花在1980就被宣布消失，并且世界上所有的国家已经停止了针对其的疫苗研究计划。这导致了人群对这种病毒感染的免疫力逐渐下降，这就意味着天花病毒将是更危险的恐怖袭击生物武器。美国疾病控制中心(CDC)已经将天花作为A类恐怖袭击因子，即在最危险的微生物中，它很容易繁殖并具有很高的死亡率。
快速大量的疫苗接种将是理想的控制天花暴发的方法。美国政府已经率先建立了另外的疫苗库，为军事人员和关键的卫生工作人员接种疫苗，并且建立一个发展安全疫苗的计划，该计划可以对全部人群进行疫苗接种，不论他们的健康状况如何。其它国家也正在密切注意着美国的方法并且也在评估自己的应急准备能力。
近几年来，政府通过在州属实验室或者发出商业招标来要求或者建造它们自己的第一代原种(stocks)。直接从动物收集的第一代疫苗是有效的；然而，它们常常含有不洁物和细菌，这将极大增加产生不利反应的机会和产生针对特殊免疫妥协个体的免疫妥协方面的并发症。因为天花已经灭绝，所以只有有限的几个制药公司能够快速的生产天花疫苗。它们中没有一个能应用依照好的操作实践标准进行的规范的细胞培养的Dryvax和Lister-Elsterr疫苗株生产二代疫苗。然而，这些疫苗对一些产生免疫妥协的个体也是不适合的。大量的接种第一代和第二代疫苗可导致一百万分之一的死亡率并且致严重疾病的几率提高10倍多。因此，安全的第三代疫苗已经被少数几个制药公司发展起来。第三代疫苗是基于改造的疫苗Ankara(MVA)病毒株而被生产的，这个病毒株是在19世纪70年代的天花灭绝运动中德国使用的一个病毒株。在临床实验中，MVA给药于大约150000个体均没有副作用，这些人中很多是对传统天花疫苗接种有风险的人。
所有这些天花疫苗是从鸡胚胎中分离出的原代鸡胚胎成纤维细胞中生产的。这些生产系统有一些严重的缺陷，包括：
-每次生产要得到大量的鸡蛋或CEFs并要进行质量控制，致使该方法周期长、工作量大并且资源消耗大。
-在许多情况下，需要没有感染特异病原体(SPF)的鸡胚；
-在供体鸡遭受感染之后，鸡蛋来源不足的风险；
-从BSE免除的国家购买的牛血清的价格受通货膨胀的影响；
-在一些个体中，鸡蛋来源的组分是过敏原；
-不能用鸡蛋来繁殖那些对鸡是高病毒的和致命的病毒。
虽然，基于鸡蛋和CEFs的生产方法是相对可靠的方法，但是有效的基于细胞的生产系统具有明显的改进，其可以提供更快、更便宜和省时省力的方法来繁殖病毒。而且在流感暴发时，基于细胞培养的生产方法有更多的优点：
-在鉴定、分离和分类流行株之后，立即就可以开始流感疫苗的生产；
-不需要等待所谓的用鸡蛋制备所需要的高生长再分配(HighGrowth Reassortants)(病毒在含胚的鸡蛋中高产)；
-第一批疫苗在获得病毒株大约9周之后即可使用，而不是鸡蛋来源方法的6-9个月；
-一些不适合在鸡蛋中生长的病毒株，而可以在细胞来源的系统中产生病毒(比如：1997年香港禽流感病毒)；
-不存在流行过程中的鸡蛋短缺问题。
而且，使用细胞取代鸡蛋或CEF平台进行病毒疫苗的生产在疫苗的安全性方面有以下额外的优点：在疫苗配方中不存在抗生素的添加；不添加有毒的防腐剂(硫柳汞)；降低内源性毒素水平；没有鸡蛋过敏原；在无蛋白质和血清的培养基中生长(无外源试剂/BSE)和高纯度的病毒疫苗制剂。
因此，迫切需要改进目前基于鸡蛋和鸡胚胎纤维原细胞的病毒疫苗生产技术。细胞培养平台的发展可以作为鸡蛋和CEF生产系统的替代方法去生产病毒疫苗，这可能是解决目前疫苗生产中的瓶颈和时间限制的最快和最有前景的方法。而且，细胞培养生产技术具有在遭受流行和恐怖袭击时，进行疫苗扩大再生产的能力。
基于这些特殊要求，发明者已经利用它在禽类生物学和禽类胚胎干细胞研究领域中的专长进行新的禽类稳定细胞株的构建，这些细胞可以有效的复制人类和兽用的疫苗和疫苗候选物，并且可以满足工业的、可控的和医学的特定要求。应用专利方法(见WO03/076601和WO05/007840)，发明者已经制备了一系列的良好表征并且被文献记录的细胞株(EBx细胞)，其来源于没有经过遗传的、化学的或永生化病毒处理的鸡胚胎干细胞。EBx细胞完全按照文件记录的2步骤方法制备，并且考虑一些调整的要求：
步骤1：鸡胚胎干细胞的分离、体外培养和扩增：
胚胎干细胞是独一无二的，因为：(i)在体外可以像未分化细胞一样进行不确定的自我更新，(ii)具有无限的增殖能力，(iii)它们的染色体保持稳定，(iv)表达高水平的端粒酶和特异的细胞表面标记。尽管全世界有许多的人在努力，但是仅仅在有限的几个物种中成功分离到胚胎干细胞(小鼠、人和猴子)。发明者近几年来，投入大量精力从禽类中分离和建立胚胎干细胞。这些研究成功的分离到鸡胚胎干细胞并切了解了其性质(Pain等，1999，Cell Tissues Organs 165：212-219)。然后，发明者发展了受专利保护的方法，可以在体外有效的培养和大规模的扩增鸡胚胎干细胞，而且不没有诱导分化。
步骤2：EBx细胞的衍生物
然后，发明者建立了受专利保护的方法，以构建鸡胚胎干细胞来源的稳定贴壁和悬浮的细胞系。本方法包括从细胞培养基中将血清、饲养细胞和生长因子渐进的撤除和使细胞转到悬浮培养中。这些来源于鸡的胚胎细胞系保持了大多数的胚胎干细胞所有的性质(例如：不确定增殖，胚胎干细胞特定标记的表达，诸如端粒酶，染色体组型的稳定性)，另外显示具有新的“工业上友好”的特点(在无血清的悬浮培养基中生长)。
基于它们诱人的生物学特性，发明者选择一些鸡EBx细胞进行下一步开发，比如贴壁细胞系EB45(在WO 03/076601和WO 05/007840中也命名为S86N45)，从其衍生了悬浮细胞系EB14。更优选本发明的EBx细胞是选自EB45和EB14细胞。在更优选的实施方案中，鸡EBx细胞系是EB14或它的亚克隆EB14-074。为了简单起见，这里将EB14和EB14-074命名为EB14。在长期培养中(超过150代)EB45和EB14表现了胚胎干细胞的表型(例如：高的细胞核-细胞质比例)。EB45和EB14细胞是具有大的细胞核和核仁的小细胞，从细胞膜上有短的伪足延伸(图1)。EB45和EB14具有高的代谢活性，细胞质中富含核糖体和线粒体。EB45和EB14的遗传分析显示它们是雄性双倍体并且具有传代遗传的稳定性(图2)。EB45和EB14细胞表达alcaline磷酸酶、干细胞特异的细胞表面标记，比如：EMEA-1和SSEA-1(图5)和胚胎干细胞特异的ENS1基因(图4)。特别重要的是，EB45和EB14也表达高水平的端粒酶，而且酶活性在传代中保持稳定(图3)。端粒酶非常关键，因为其可以促进细胞的持续生长和染色体的稳定。3周和2.5月的成瘤分析显示在免疫抑制的新生大鼠模型中EB14细胞在体内不形成肿瘤。EB45和EB14细胞具有很短的传代时间，在39℃时(鸡的体温)是16小时，在37℃时是20小时。因此，这些细胞系具有的独一无二的性质使其成为更有效的、更安全的和更经济的用来生产诸如流感和天花病毒疫苗的细胞系。
本发明的EBx细胞和更特殊的EB14细胞具有很高的价值，其可以生产流感和天花病毒疫苗，也可生产其它目前仍在含胚胎的鸡蛋和鸡原代纤维原细胞中生产的主要的人类和动物病毒疫苗(表1)，比如：麻疹病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒或在一些传染性(例如HIV)疾病或癌症患者中具有的痘病毒的疫苗。目前的数据已经证明了EBx细胞的能力，可以非常特定的复制几种重组和野生病毒。例如：已经建立的EBx细胞支持流感病毒(见法国优先权文件，专利申请FR0503583，2005年4月11日提交，实施例3，30到40页)和MVA(改良的牛痘苗病毒Ankara(见WO 05/007840))的复制。
表1
禽类 猪 马 人 重组
流感病毒 流感病毒 流感病毒 天花病毒 金丝雀痘病毒
逆转录病毒 东方马脑脊髓炎 流感病毒 禽痘病毒
禽痘病毒 西方马脑脊髓炎 麻疹病毒 改良的牛痘苗病毒Ankara(MVA)
金丝雀痘病毒 腮腺炎病毒 α病毒属-辛氏(sinbis病毒
鸡痘病毒 狂犬病毒 α病毒属-塞姆利基森
林病毒
鹦鹉疱疹病毒 黄热病毒 α病毒属-委内瑞拉病毒
新城疫病毒 thick-bome脑炎(encephaltis) 禽腺病毒CELO
鹰疱疹病毒
鸽疱疹病毒
传染性法氏囊病病毒
感染性支气管炎病毒
马立克氏病病毒
火鸡疱疹病毒
鸡贫血病毒
禽类脑脊髓炎病毒
多瘤病毒I型&II型
腺病毒I、II&III型
以上所列出的EBx细胞独特的性质，尤其是EB14细胞表明在EBx细胞中可以建立特殊的制备病毒疫苗的方法。确实，不局限于理论，EBx细胞具有的高代谢水平要求细胞培养基提供足够的能量以保证细胞生长和病毒复制。本发明的目的是基于禽类胚胎干细胞EBx，特别是EB14细胞提供创新性的、有效的制备方法，用于进行病毒疫苗的工业生产，从而取代在鸡蛋和CEFs中的生产方法。
发明内容
本发明提供在禽类胚胎衍生的干细胞EBx，尤其是在EB14细胞中复制病毒的方法，所述的方法包含步骤：
-用目的病毒感染EBx细胞；所述的EBx细胞优选的在无动物血清培养基中培养；
-培养感染后的EBx细胞以复制所述的病毒；
-收集细胞培养液中和/或所述细胞内的病毒。
根据一个优选的方案，所述的方法包含步骤：
a)在一个培养容器中，加入无血清的NO1培养基，悬浮培养所述的EBx，尤其是优选EB14细胞；
b)当细胞密度达到至少1500000细胞/ml时，用选择的病毒感染所述细胞；
c)感染之前短时间，感染时，或感染后短时间加入无血清培养基NO2；和
d)进一步培养所述的感染后的细胞以复制病毒；和
e)可选择的收集所述的病毒。
这里使用的术语“病毒”包含的不仅有天然的病毒也有减毒的病毒、重排的病毒、疫苗病毒株，也有重组病毒和病毒载体等。本发明的病毒优选自以下的组：腺病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、正性粘病毒、乳头状病毒、副粘病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、呼肠孤病毒和逆转录病毒。
在一个优选的实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒和病毒疫苗属于痘病毒家族，更优选属于chordopoxviridae。在一个实施方案中，病毒和相关的病毒载体、病毒颗粒和病毒疫苗是选自禽痘病毒，包括鸡痘病毒、金丝雀痘病毒(例如：ALVAC)、灯心草雀痘病毒(juncopox virus)、八哥痘病毒(mynahpox virus)、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒(starling poxvirus)、火鸡痘病毒。根据另一个优选的实施方案，病毒是痘苗病毒，选自Lister-Elstree痘苗病毒、改良的痘苗病毒比如改良痘苗病毒Ankara(MVA)，这些病毒可以从ATCC(ATCC号VR1508)，NYVAC(Tartaglia等，1992 Virology 188：217-232)，LC16m8(Sugimoto，et，Yamanouchi 1994Vaccine 12：675-681)，CV178(Kempe等，1968 Pediatrics 42：980-985)和其它重组或非重组痘苗病毒获得。
在另一个优选的实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于正性粘病毒家族，特别是流感病毒。流感病毒选自：人流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒、猫流感病毒。流感病毒优选A、B、C病毒株。在病毒株A中，其中一种可以复制带有血细胞凝集素和唾液酸苷酶不同亚型的病毒，比如：而非限制任何一种)H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H4N6、H5N1、H5N2、H7N7、H9N2。在H1N1病毒株中，其中一种可以复制A/Porto Rico/8/34、A/NewCaledonia/20/99、A/Beijing/262/95、A/Johannesburg/282/96、A/Texas/36/91、A/Singapore。在病毒株H3N2中，其中一种可以复制A/Panama/2007/99，A/Moscow/10/99，A/Johannesburg/33/94。在病毒株B中，其中一种可以复制(不限制任何一种)B/Porto Rico/8/34、B/Johannesburg/5/99、B/Vienna/1/99、B/Ann Arbor/1/86、B/Memphis/1/93、B/Harbin/7/94、N/Shandong/7/97、B/Hong Kong/330/01、B/Yamanashi/166/98。本发明的流感病毒是选自：野生型、从感染病人中分离得到的原代病毒、重组病毒、减毒病毒、温度敏感病毒、低温适应病毒、重排病毒、反向遗传工程病毒。
当本发明的病毒是流感病毒时，本发明的方法包含在病毒繁殖所要求的条件培养基中加入蛋白水解酶的步骤。蛋白酶选自如下的组：胰蛋白酶、靡蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰液素、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、弹力蛋白酶、furine和羧肽酶。根据一个优选的实施方案，酶时胰蛋白酶。细胞培养基中的胰蛋白酶终浓度介于约0.5-1mg/ml直到25mg/ml之间。更优选的，细胞培养基中的胰蛋白酶的终浓度是介于0.01-10usp/ml(usp：美国药典单位)，优选是约介于0.05-2usp/ml，更优选是约0.3-1usp/ml。蛋白水解酶优选在原核宿主中生产的重组蛋白酶。
在另一个优选的实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于副粘病毒家族，特别是麻疹病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒。
在另一个优选的实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于bimavirus家族，特别是传染性Bursal病病毒。
重组病毒包含但是不限于包括外源基因病毒载体。在一些实施方案中，病毒复制的辅助功能是由宿主细胞EBx、辅助病毒和辅助质粒提供的。典型的载体包含但是不限于那些可感染禽类和哺乳动物细胞的载体。
这里使用的属于“禽类”指得是分类学上的“ava”中的任何种、亚种和品种(race of organism)，比如包含但是不限于：鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑(quails)、野鸡、鹦鹉、金丝雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡等有机体。术语包含不同的原鸡(Gallus gallus)或鸡的种株(例如：白来亨鸡(White Leghom)、褐色来亨鸡(Brown Leghom)、Barred-Rock、Sussex、美国新罕布什尔州鸡(New Hampshire)、美国罗德岛州鸡(Rhode Island)、澳洲黑鸡(Australorp)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、California Gray、Italian Partidge-colored)，也有火鸡、野鸡、鹌鹑(quails)、鸭子、鸵鸟和其它通常饲养的家禽的种株。在一个优选的实施方案中，本发明的禽类细胞是鸡的细胞。
本发明的培养容器更优选可以持续振荡的生物反应器：WaveTM生物反应器、BelloTM生物反应器、微调控制的摇瓶、摇瓶和细胞培养装置(factory)。典型的，细胞扩种是从原种(master)或者工作细胞库到各种大小不同的T培养瓶或滚动培养瓶，最后优选的使用生物反应器。然后将这样制备的细胞悬液接种至一个种子生产生物反应发生器中(典型的体积是20-30I)进行进一步培养，并且在一些实施方案中，使用更大的生物反应器(典型的体积是150-180L)。第二个(较大的)生物反应器体积和种子生物反应器体积之间的比例是根据细胞在第一个(种子反应器)生物反应器中繁殖的程度来确定的，典型的比例是从3∶1到10∶1，例如在(6-8)∶1的范围内。根据一个优选的实施方案，培养皿是持续振荡的生物反应器，其可以控制温度、通风、pH和其它可控的条件，并且其配备有：
-合适的进口用于细胞、消毒氧气、各种培养基等的进料；
-有细胞和培养基的出口；和
-生物发生器中搅拌培养基的设备。
根据本发明，“无血清培养基”(SFM)意味着使用的细胞培养基不需要血清即可保证细胞的存活和生长。这种培养基没必要化学限定，但可能含有多种从植物来源的水解产物。优选的，所述的SFM是“非动物来源”，也就是说其可以没有动物和人来源的成分(FAO标准：“无动物来源”(free of animal origin))。在SFM中，天然的血清蛋白被重组蛋白取代。本发明的SFM培养基可以选择是不包含蛋白质(PF培养基：“无蛋白培养基”(protein free medium))的，和/或是化学限定过的(CDM培养基“化学限定培养基”(chemically defined medium))。SFM培养基具有一些优点：(i)这样的培养基可以被调控(确实是没有污染诸如BSE、病毒等不利因素的风险)；(ii)纯化方法最佳；(iii)由于使用确定的培养基，所以方法的重复行较好。可用的商业化SFM培养基的示例是：VP SFM(InVitrogen Ref 11681-020，目录2003)，OptiPro(InVitrogen Ref 12309-019，目录2003)，Episerf(InVitrogen Ref10732-022，目录2003)，Pro 293 S-CDM(Cambre ref 12765Q，目录2003)，LC17(Cambre RefBESP302Q)，Pro CHO 5-CDM(Cambre ref 12-766Q，目录2003)，HyQ SFM4CHO(Hyclone Ref SH30515-02)，HyQSFM4CHO-Utiliy(Hyclone Ref SH30516.02)，HyQ PF293(Hyclone refSH30356.02)，HyQ PF Vero(Hyclone ref SH30352.02)，Ex cell 293培养基(JRH Biosciences ref 14570-1000M)，Ex cell 325 PF CHO无蛋白培养基(JRH Biosciences ref 14335-1000M)，Ex cell VPRO培养基(JRHBiosciences ref 14560-1000M)，Ex cell 302无血清培养基(JRHBiosciences ref 14312-1000M)，Ex cell 65319(JRH Biosciences)，Ex cell65421(JRH Biosciences)，Ex cell 65625(JRH Biosciences)，Ex cell65626(JRH Biosciences)，Ex cell 65627(JRH Biosciences)，Ex cell65628(JRH Biosciences)，Ex cell 65629(JRH Biosciences)，基因治疗培养基3(无动物成分)(SIGMA-Aldrich ref.G-9916)(这里命名为G9916培养基)。
根据第一个优选的实施方案，无血清培养基NO1和无血清培养基N02是相同的培养基。
根据第二个优选的实施方案，无血清培养基NO1和无血清培养基N02具有不同的组分。例如：无血清培养基NO1是Excell 65319(SAFCBiosciences)而Opti Pro培养基(InVitrogen Ref 12309-019，目录2003)可能是无血清培养基NO2。
根据一个优选的实施方案，无血清培养基NO1是Ex cell 65319(JRH Biosciences)。根据第二个优选的实施方案，无血清培养基NO1是Ex cell 65421(JRH Biosciences)。
根据一个优选的实施方案，无血清培养基NO2是Ex cell 65319(JRHBiosciences)。根据第二个优选的实施方案，无血清培养基NO2是G9916(SIGMA-Aldrich)。
本发明的方法包含全部或部分无血清培养基1的去除，随后用无血清培养基NO2置换。然而，当无血清培养基1去除大部分时(例如：最多至大约50％)即通过例如旋转过滤补充无血清培养基NO2，同时仍然去除培养基NO1是更方便的。根据一个优选的实施方案，无血清培养基NO2直接加入到无血清培养基NO1中，而没有将无血清培养基NO1部分去除。0.25-10倍体积的无血清培养基NO2加入到1倍体积的无血清培养基NO1中。在一个优选的实施方案中，约0.5-8倍体积的无血清培养基NO2加入到1倍体积的无血清培养基NO1中。在一个更优选的实施方案中，约3-6倍体积的无血清培养基NO2加入到1倍体积的无血清培养基NO1中。
无血清培养基NO1和/或无血清培养基NO2中至少添加一种选自如下的成分：氨基酸、脂质、脂肪酸、胆固醇、碳水化合物、非动物来源的蛋白水解产物及其混合物。
本发明的方法可选择分批给料的方法，其包含额外的步骤给细胞培养液中加入至少一种选自如下的成分：氨基酸、脂质、碳水化合物、非动物来源的蛋白水解产物、表面活性剂及其混合物。根据第一个优选的实施方案，添加可在步骤a)到d)，或者仅仅在步骤b)到d)，或者选择仅仅在步骤d)进行。添加可以是每天进行或者是持续添加。当不连续添加时，可以每天一次，也可以每天多次，或每天少于一次。
本发明的SFM培养基包含多种成分，包括：氨基酸、维生素、有机和无机盐、碳源，每种成分的存在都是体外细胞培养所需要的。然而，为了促进细胞生长和病毒产生，也可在SFM培养基中加入其它成分。
通过分析培养的细胞生长所消耗的氨基酸分析来确定加入到培养基中的氨基酸。根据一个优选的实施方案，加入到培养基中的氨基酸选自：天冬酰氨、谷氨酰氨及其混合物。在一个更优选的实施方案中，加入谷氨酰氨，并且在步骤a)到d)中加入以保持其浓度为约0.5mM到5mM，优选的是约1mM到3mM，最优选的是约2mM。在一个优选的实施方案中，谷氨酰氨是以连续方式添加。
根据一个优选的实施方案，添加到培养基中的碳水化合物包括：D-葡萄糖、D-蔗糖、和D-半乳糖或其混合物。根据一个更优选的实施方案，添加的碳水化合物是D-葡萄糖。D-葡萄糖在步骤a)到d)中加入，更优选在步骤b)到d)中加入以保持其在培养基中的浓度为0.5-25g/L，优选浓度介于约1-10g/L之间，优选浓度介于约2-3g/L之间。在一个优选的实施方案中，D-葡萄糖是连续添加的。
根据一个优选的实施方案中，脂质选自：胆固醇、类固醇和脂肪酸诸如：棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和其衍生物或者其混合物。脂肪酸更优选的购自SIGMA-ALDRICH(Ref.F7050)并且在培养基中加入约0.35ul/ml的脂肪酸溶液。
根据一个优选的实施方案，非动物来源的蛋白水解产物是选自：细菌胰蛋白胨、酵母胰蛋白胨、植物水解产物、大豆水解产物或其混合物。在一个优选的实施方案中，非动物来源的蛋白水解产物是酵母水解产物。
术语“水解产物”包含大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解产物。水解产物可以从大量大豆蛋白胨或酵母提取物中获得，它们可以进一步酶解(例如：被木瓜蛋白酶酶解)，和/或通过自我裂解、和/或热分解和/或胞质分离(plasmolysis)形成。水解产物也可购买得到，比如：Yeastolate、Hy-Soy、Hy-Yeast412和Hi-Yeast444，可以从以下公司购买，例如：JRH BioSciences(Lenaxa，KA)，Quest International(Norwich，N.Y.)，Organo Technie  S.A.(France)或Deutsche HefewerkeGmbH(Germany)。酵母提取物的来源也在WO98/15614中揭示。酵母提取物和大豆水解产物的来源也在WO 00/03000中揭示。在本发明的培养基中使用的水解产物优选的从粗提物中纯化，因为可能干扰细胞培养的不纯物优选的通过这种纯化方法去除，因此改进了水解产物的均质性。纯化通过超滤或Sephadex层析(例如：用SephadexG25或SephadexG10或类似材料)、离子交换层析、亲和层析、分子排阻层析或反相层析等方法进行。优选的，应用10KDa截留的滤膜进行超虑纯化。这些方法在本领域中是众所周知的。应用这些方法，包含确定分子量的大豆或酵母水解产物的各组分可以被选择。大豆和酵母水解产物的平均分子量优选在220-375道尔顿。
优选的，酵母水解产物添加到培养基中。50×酵母水解产物(约200g/l)例如购自JRH-BIOSCIENCES(Ref 58902)，在细胞培养基中使用的终浓度为介于约0.1×到2×之间，优选的从约0.5×到1×。大豆水解产物也可能加入培养基中。50×大豆水解产物例如购自JRH-BIOSCIENCES(Ref 58903100M)，在细胞培养基中使用的终浓度为介于约0.1×到2×之间，优选的约1×。也可以选择将大豆和酵母水解产物的混合物加入到细胞培养基中，这在US2004/0077086中描述过。
培养基包含辅助物质，比如：缓冲液物质，如碳酸氢钠、氧化稳定剂、抵消机械压力的稳定剂或蛋白酶抑制剂。如果需要，非离子表面活性剂，比如：聚丙烯乙二醇(PLURONIC F-61，PLURONIC F-68，SYPERONIC F-68，PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)可以作为去泡剂加入培养基中。这些因子一般用来保护细胞以使其免受通风引起的负因素的影响，如果不加表面活性剂，可能导致细胞附着在加速或膨胀形成的空气泡上而致其损伤。非离子型表面活性剂的剂量优选在约0.05-约10g/L之间，特别是约0.1-约5g/L之间。根据本发明的另一个实施方案，可以减少细胞培养基中的表面活性剂的浓度以增大细胞块体积。
根据本发明的一个实施方案，在步骤b)感染之后加无血清培养基N02到细胞培养体系中，优选的时间是步骤b)后约0.5-4小时，并且更优选的时间是步骤b)后1小时左右。根据本发明的另一个实施方案，在步骤b)感染之前加无血清培养基N02到细胞培养体系中，优选的时间是步骤b)之前约0.5-4小时，并且更优选的时间是步骤b)前1小时左右。根据本发明的另一个实施方案，在步骤b)感染的同时加无血清培养基N02到细胞培养体系中。
步骤b)的病毒感染在m.o.i(多重性感染)为约10-10-6，优选在约10-2-10-5时进行，并且更优选在约10-4。本领域的技术人员将根据病毒类型决定合理的m.o.i。
在步骤c)中，感染细胞优选培养至少24小时，至少48小时，至少72小时，至少96小时，至少120小时，至少144小时。当是禽痘病毒时，感染细胞培养至少144小时。
在本发明的方法中，步骤a)的细胞是批次培养、重复批次培养、分批补料培养或灌注培养。更优选的，步骤a)的细胞是通过分批补料培养。在批次或分批补料培养的方法中，当细胞密度至少约4000000，优选6000000细胞/ml，更优选8000000细胞/ml时，进行步骤b)的感染。使用灌注方法时，当细胞密度至少8000000细胞/ml，优选约9000000-10000000细胞/ml，或更高时，进行步骤b)的感染。
在步骤a)、b)、c)、d)中的无血清培养基的pH值优选的用生物反应器检测。pH值在6.5-7.8之间，优选约6.8-7.5之间，更优选约7.2。
在本发明的方法中，在收细胞之前，步骤d)持续2-10天。根据一个优选的实施方案，在收细胞之前，步骤d)持续3-7天。
根据病毒的类型，细胞培养的温度在32℃-39℃之间。对于流感病毒的生产，细胞感染优选在33℃时进行。
EBx细胞能够以最多几百个细胞形成的团块在悬浮培养基中生长。不局限于理论，团块的大小随着培养基的组分不同而变化。例如：诸如聚丙烯乙二醇(PLURONIC F-61，PLURONIC F-68，SYPERONICF-68，PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)的存在和搅拌过程可能影响团块的大小。发明者已经发现在至少本方法的步骤a)中本发明的EBx细胞相互积累并形成团块可以增加病毒的产量。当通过不同大小的T培养瓶或旋转瓶或生物发生器中的从原种和工作细胞库进行扩大规模的培养时，可以通过用新鲜培养基稀释或离心后再用新鲜培养基重悬的方法将悬浮的细胞转移到更大的培养皿中。在细胞传代中，发明者推荐将更大的细胞块传代并进行培养。因此，最好不要打散细胞团块以提高EBx细胞中的病毒复制。例如：在T培养瓶或旋转瓶中的步骤a)的起始培养阶段，推荐通过稀释细胞以传代到更大的培养皿中，而并不推荐使用离心的方法，也不能通过吹吸和搅拌把细胞团打散。然而，太大的细胞团块可能对于病毒生产并不是最合理的。因此，本领域的技术人员会在步骤a)的起始细胞传代中通过吹吸或搅拌使团块部分分散，这样可以提高病毒产量。根据一个优选的实施方案，禽痘病毒，并且优选MVA、ALVAC和禽痘病毒(Fowlpox)是通过本发明的方法获得的，这些方法包括形成最多大于至少100个细胞，最多大于至少200多个细胞，最多大于至少500多个细胞，最多大于至少几千个细胞的松散细胞的增值EBx细胞团块的步骤a)。
本发明也适合于用于繁殖病毒的其它细胞类型，比如但不限于鸡胚胎成纤维细胞(CEFs)、VERO细胞、PerC6、MDCK和那些能以细胞团块行式在悬浮培养基中生长的细胞。
本发明也涉及通过本发明的方法可获得的病毒。
本发明也涉及包含本发明病毒的疫苗。病毒疫苗制备的方法包含复制根据本发明的病毒的方法，其病毒收集的步骤e)包含至少一步是选自：过滤、浓缩、冷冻和加入稳定剂稳定。病毒收集是用本领域技术人员众所周知的方法进行的。根据一个优选的实施方案，收集病毒的步骤包含收集细胞离心后的细胞培养上清，然后要过滤、浓缩、冷冻和加入稳定剂稳定病毒。例如：对于流感病毒的操作见Furminger，在Nicholson，Webster和Hay编辑的流感手册，24章，324-332页。
本发明的病毒疫苗制备方法也包含额外的收集病毒的失活步骤。失活优选用甲醛、β-丙炔酸内酯、醚、醚和去污剂(例如：Tween80TM)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和Triton N102、脱氧胆酸钠和三(N-丁基)磷酸盐。
根据另一个实施方案，本发明也涉及通过本发明方法获得的病毒的抗原蛋白制备的方法，所述的方法包含另外的步骤：
a)可选择的，将包含全病毒的细胞上清与脱氧核糖核酸限制性酶孵育，优选DNA酶(见EC3.1.21和EC3.1.22分类)和核酸酶(见EC3.1.30和EC3.1.31分类)。优选的，DNA消化酶是Benzonase(Benzon核酸酶)或DNA酶I；
b)添加阳离子去污剂。阳离子去污剂的示例是(不限于)：十六烷基三甲基铵盐，例如CTAB、十四烷基三甲基铵盐、lipofectine、DOTMA和TweenTM；
c)抗原蛋白的分离。这步骤可以通过离心和超滤实现。
在疫苗中的病毒可能以完整的病毒颗粒或不完整的病毒颗粒存在。根据一个实施方案，疫苗是一个被杀死的或失活的疫苗。根据另一个实施方案，疫苗是一个活的减毒疫苗，其所述的疫苗主要包括通过本发明的方法获得的EBx细胞培养上清，优选无血清，非必须要过滤和/或浓缩和包含所述的病毒。根据第三个实施方案，疫苗包含来自本发明方法制备的病毒的抗原蛋白。
本发明也适合于提供包含用本发明方法获取的感染的EBx细胞系、优选EB14疫苗，并且其中感染的EBx细胞，优选EB14在步骤d)中收集。
本发明的疫苗也包含本发明的病毒联合可以增加免疫反应的制药学上可接受的物质。可增加免疫反应的非限制的这些物质的示例包括：不完全Freund佐剂、saponine、羟基铝盐、溶血卵磷脂、plutonic多元醇、聚阴离子、肽、卡介苗(BCG)和短小棒状杆菌。合成佐剂的实施例是QS-21。另外，免疫刺激蛋白(白介素II1、II2、IL3、IL4、IL12、IL13，粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子......)可能会增强疫苗免疫反应。
本发明的疫苗优选是液体形式、冷冻制剂、脱水和冷冻制剂、非必须是经鼻内给药。
本发明的疫苗优选是用来预防和/或治疗感染病毒的人类，这些病毒包括：天花和流感、麻疹、腮腺炎和风疹病毒。本发明的重组病毒疫苗也可以用来预防和/或治疗慢性病，比如：癌症或艾滋病等传染性疾病。
本发明的EBx细胞有助于产生重排(re-assorted)的病毒。带有基因组片断的病毒，比如：流感病毒也可以重排。当感染的本发明的EBx细胞带有至少两种不同的流感病毒时，在宿主细胞内有从两种不同病毒株来源的基因组片断的混合物存在。在病毒的重排过程中，理论上基因组片断的所有重组都可能产生。因此，特定重排后的病毒可以通过用抗体的筛选或清除来得到分离，例如：带有所需要的特征的病毒(见Kilnourne E.D in Plotkin SA和Mortimer E.A.Eds，疫苗1994)。
本发明的EBx细胞也有助于通过反向遗传生产流感病毒(见Enami，Proc.Natl.Sci.USA 87：3802-3805(1990)；Enami等Palese，J.Virol.65：2511-2513(1991))；Luytjes，Cell 59：1107-1113(1989)。
本发明也涉及包含本发明的病毒或其组分的诊断组合物。
下面的实施例详细的解释了本发明。本领域的技术人员可以清楚的理解和实施本发明的制备方法和实施例。然而，本发明并不限于实验性的实施方案范围中，其仅仅是作为本发明的一方面被解释，而且功能性等价的方法也在本发明的范围之中。确实，从先前的描述和所附的图中，本领域的技术人员可以明白本发明的除了这里描述的之外的那些不同修饰。这些修饰落入本发明的权利要求的范围。为了描述的完整性，对于下面的图和图例说明也要列出参考文献。
附图说明
图1EB14细胞的透射电子显微镜分析
EB14细胞显示了典型的胚胎干细胞形态学特征(例如：高的核-细胞质比例)，其类似于小鼠胚胎干细胞(mES)的表型。EB14细胞是小的圆形细胞，具有大的细胞核，有短伪足从细胞质膜伸向核仁。它们具有高度的代谢活性，细胞质中富含核糖体和线粒体。EB14的细胞形态与鸡胚胎成纤维细胞(CEF)不同。
图2传代105和118的EB14细胞染色体组型分子
分析在无血清培养基中培养的直到第105和118代的EB14细胞确认是两倍体，有18个巨染色体和30个微染色体存在(图上部)。该结果与预期的鸡细胞染色体数是一致的(图下部)。
图3EB14细胞中端粒酶的表达
用Roche公司的端粒酶检测试剂盒(Telomerase OCR ELISA)研究在不同传代的生长于无血清培养基中的EB14细胞的端粒酶表达。发现端粒酶在EB14细胞中高表达。端粒酶的高水平表达维持在好多代，在第89代，160代(相应于EB14细胞的原种细胞库(Master Cell Bank))和179代(相当于生产传代的末期)。Canine MDCK细胞作为不表达端粒酶的阴性对照。在CEFs细胞中同样缺乏端粒酶的表达(数据未显示)。
图4ENS1基因在EB14细胞中的表达
ENS1基因特异的在鸡胚胎干细胞中表达(Acloque等，Mech Dev.103,79-91，2001)。应用RT-PCR分析该基因在EB14中的表达。禽类胚胎干细胞(ES细胞)、在产卵时收集的禽类胚胎细胞和在不同传代阶段的(P21、P159、P160)EB14细胞均有强的ENS1表达，但是在禽类细胞DF1(US5672485)和鸡胚胎成纤维细胞(CEFs)中没有这个基因的表达。管家基因GAPDH作为内参平行进行分析以保证RNAs样品量的一致性(图下部)。
图5在EB14细胞(左图)和DF1细胞(右图)中胚胎干细胞特异性标记的表达
EB14细胞表达EMEA1和SSEA1基因，但是DF1细胞不表达。普遍存在的Paxilline基因作为对照。EB14细胞不表达细胞标记TROMA-1、MelM、TRA-1-60和SSEA3。
图6在EB14和MDCK细胞中的细胞表面受体SA 2-3和SAa2-6的表达
细胞和血细胞凝集素标记的digoxygenin孵育；Sambuca nigra凝集素血细胞凝集素特异性的结合Sia2-6Gal，而Maackia amurensis凝集素血细胞凝集素特异性的结合Sia2-3Gal。结合细胞的血细胞凝集素用FITC标记的抗digoxygenin抗体来检测(这项技术是本领域技术人员熟知的)。FITC标记的细胞用荧光细胞分选仪(FACS)来计数。SAa2-3和SAa2-6分子分别是禽类和人类梳感病毒的受体。
图7A和7B：在3L分批补料生物反应器中，EB14细胞的生长动力学
图7A-EB14细胞来源的生物菌体在37℃，含有0.5×酵母提取物的培养基中悬浮培养并积累直至细胞密度为5-6×106细胞/ml。然后，稀释2.9倍并以10天作为一个周期进行生长动力学研究。在第五天的时候，细胞密度达到13000000细胞/ml。
图7B-采用灵活的细胞劈分比例(Split ratio flexibility)以保证在3L分批补料生物反应器中EB14细胞生长动力学的研究。细胞种子按照1/10(密度为0.4×106细胞/ml的0.23L细胞，最终体积为2.1L)，来自EB14细胞的生物量(biomass)在37℃的Excell 65319(SAFC)生长培养基中生长11天以使细胞积累。L-谷氨酰氨(2mM)和D-(+)-葡萄糖(2g/L)每天分批给料，生物反应器参数如下：旋转速度：80rpm，pO2：50％，pH：7.20。
图8：生长培养基和团块大小对EB14细胞中MVA-GFP病毒繁殖的影响：GFP表达
EB14在细胞生长SFM培养基(SAFC：Excell 65319)中增殖时，可以在T175搅拌槽(stirred tank)摇瓶中形成小的(左图)或大的(右图)团块。团块用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染，混合物用适量SFM培养基稀释(Optipro，Excell 65319，Excell 65629)。37℃条件下，病毒繁殖的7天中，每天记录感染细胞的UV曝光照片。对照：optipro(INVITROGEN)作为细胞生长和生产培养基。
图9：生长培养基和团块大小对感染EB14细胞中MVA-GFP病毒繁殖的影响：感染病毒滴度
EB14在细胞生长培养基(SAFC：Excell 65319)中增殖时，可以在T175搅拌槽摇瓶中形成小的(左图)或大的(右图)团块。团块用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染，混合物用适量生产培养基稀释(Optipro，Excell 65319，Excell 65421，Excell 65625，Excell 65626，Excell 65627，Excell 65628，Excell 65629，G9916)。37℃条件下，病毒繁殖的7天中，每天收集样品并且在动力学末期进行TCID50滴度测定。
图10：生长培养基和添加物对MVA-GFP病毒在EB14细胞中繁殖的影响
EB14在细胞生长SFM培养基(SAFC：Excell 65319)中增殖时，可以在T175搅拌摇瓶中形成小的团块。细胞用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染，混合物用适量生产培养基稀释(图中从左到右，培养基Excell 65319，Excell 65629或G9916)，可以添加或不加1×酵母提取物(添加物1)和/或1×脂肪酸(添加物2)。37℃条件下，病毒繁殖的7天中，每天收集样品并且在动力学末期进行TCID50滴度测定。
图11：在3L分批补料培养生物反应器中感染了MVA-GFP病毒的EB14细胞中的GFP表达
来自EB14细胞的生物量在Excell 65319生长培养基中增殖并积累。然后用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染，混合物用G9916培养基稀释。每天收集37℃的感染细胞的UV曝光照片(放大5倍或10倍)(PI：感染后)。
图12：在3L分批补料培养生物反应器中EB14细胞来源的MVA-GFP流感病毒的滴度
来自EB14细胞的生物量在Excell 65319生长培养基中在细胞增殖期积累。然后用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染细胞，混合物用添加有1×酵母提取物的Excell 65319培养基稀释。37℃条件下，病毒繁殖的9天中，每天收集样品并且在动力学末期进行TCID50滴度测定，并与在CEF细胞中得到的滴度相比较。
图13：EB14细胞中产生的MVA-GFP病毒的电子显微镜分析
用10-2TCID/细胞的MVA-GFP病毒感染EB14细胞并在感染后18小时、48小时和72小时收取。固定和包埋的样品的薄切片用电子显微镜观察(D.Spehner博士，IGBMC，Strasbourg)。
图14：EB14细胞生产的多种人流感病毒株的病毒滴度
在0.75 USP/ml的重组胰酶存在时，T175搅拌摇瓶中的EB14细胞用10-4TCID50/细胞的不同A/H3N2、A/H1N1和B型人流感病毒株感染。每隔24小时收集样品并在无牛血清的情况下用MDCK细胞滴定来分析动力学末期的TCID50的滴度(左图)。通过电子显微镜平行分析一些感染的EB14细胞，揭示流感病毒颗粒的产生(右图；D.Spehner博士，IGBMC，Strasbourg)。
图15A和15B：在EB14细胞中多种流感病毒的生产性复制
图15A-感染多种流感病毒株的EB14细胞中血细胞凝集素(HA)的Western blot分析
在0.75 USP/ml的胰酶存在时，T175摇瓶中无血清培养的EB14细胞被多重性感染为10-4的指定病毒感染。每天收集4μL细胞培养上清并进行10％SDS-PAGE电泳和Western blot分析。通过电转移将蛋白质转印到聚偏二乙烯二氟酯膜上，HA的未切割或切割后亚单位用特异的多克隆抗HA绵羊血清检测。过氧化物酶标记的抗绵羊IgG作为二抗。对于每一个病毒株，将感染后72小时到168小时收集的样品中的HA积累与鸡蛋来源的标准HA因子比较。
图15B-对于不同流感病毒株的EB14来源HA水平的SRID分析
在0.75 USP/ml的胰酶存在时，T175旋转摇瓶中的EB14细胞用10-4TCID50/细胞的不同A/H3N2、A/H1N1和B型人流感病毒株感染。每隔24小时收集样品，并且在动力学末期进行连续光免疫扩散(SRID)分析。对于每一个病毒株，HA积累的计算是根据定义好的相应标准抗原的剂量效应曲线进行的。
图16A和16B：在3L生物发生器中，用EB14细胞中生产A/H3N2流感病毒株
图16A-感染A/H3N2/NewYork/55/2005流感病毒株的EB14细胞的生长动力学
在37℃条件下，在细胞生长培养基中EB14细胞在细胞增殖期积累。然后用10-4TCID50/细胞的A/H3N2/New York/55/2005流感病毒感染细胞，混合物用添加0.3 USP/mL胰酶的Excell 65629培养基稀释(培养基E)，温度降低到33℃。在病毒增殖的10天中，每天收集样品并储存在-80℃。左图：细胞密度(×106细胞/mL)，右图：总细胞数(黄色菱形，×107细胞)和生存能力(红色圆圈，％)。
图16B-应用Western blot和SRID进行HA分析
从3L生物发生器中收集感染后7天的样品，并用特异的多克隆抗HA绵羊血清检测和定量HA的水平。左图：用抗HA绵羊抗体作为一抗，过氧化物酶标记的抗绵羊IgG作为二抗，对4μL病毒上清进行Western blot分析。HA积累与鸡蛋来源的标准品增加量相比较。HA0：未切割的HA亚单位，HA1&HA2：切割HA亚单位。右图：SRID定量10μL病毒上清。HA的定量用相同标准因子的剂量效应曲线来计算。
图17A和17B：在3L生物反应器中，EB14细胞中B型流感病毒株的生产
图17A-感染B/Johannesburg/5/99流感病毒株的EB14细胞的生长动力学
在37℃条件下，EB14细胞在生长培养基中增殖并积累。然后用10-4TCID50/细胞的B/Johannesburg/5/99流感病毒感染细胞，混合物用SAFC Excell 65629培养基稀释(培养基E)，其添加0.3 USP/mL的胰酶，温度降低到33℃。在病毒增殖的10天中，每天收集样品并储存在-80℃。左图：细胞密度(×106细胞/mL)，右图：总细胞数(黄色菱形，×107细胞)和生存能力(红色圆圈，％)。
图17B-EB14来源的B/Johannesburg/5/99流感病毒HA的Westernblot分析
收集感染后7天的样品，并用特异的多克隆抗HA绵羊血清检测HA的水平。用过氧化物酶标记的抗绵羊IgG免疫印记抗原捕获的抗体，对4μL病毒上清进行Western blot分析。HA积累与鸡蛋来源的标准品增加量相比较。HA0：未切割的HA亚单位，HA1&HA2：切割HA亚单位。
图18A和18B：在30L生物反应器中，EB14细胞中A/H1N1流感病毒株的生产
图18A-感染A/H1N1/NewCaledonia/20/99流感病毒株的EB14细胞的生长动力学
在37℃条件下，EB14细胞在生长培养基中增殖并积累。然后用10-4TCID50/细胞的A/H1N1/NewCaledonia/20/99流感病毒感染细胞，混合物用SAFC Excell 65629培养基稀释(培养基E)，其添加0.3 USP/mL的胰酶，温度降低到33℃。在病毒增殖的8天中，每天收集样品并储存在-80℃。左图：细胞密度(×106细胞/mL)，右图：总细胞数(黄色菱形，×107细胞)和生存能力(红色圆圈，％)。
图18B-EB14来源的A/H1N1/NewCaledonia/20/99流感病毒血细胞凝集素的分析
收集感染后7天的样品，并用特异的多克隆抗HA绵羊血清检测和定量HA的水平。左图：对4μL病毒上清进行Western blot分析，其中用抗HA绵羊抗体和过氧化物酶标记的抗绵羊IgG进行抗原捕获抗体的免疫印记。HA积累与鸡蛋来源的标准品增加量相比较。HA0：未切割的HA亚单位，HA1&HA2：切割HA亚单位。右图：SRID定量10μL病毒上清。HA的含量用相同标准因子的剂量效应曲线来计算。
具体实施方式
实施例1：构建EBx细胞系衍生物的方法
禽类胚胎衍生的干细胞EBx的构建方法在之前的WO03/076601和WO05/007840中描述过。简单的说，EBx细胞系构建的方法包括如下步骤：
a)在包含所有生长所必须的生长因子的完全培养基中，在小鼠成纤维细胞饲养层(优选失活的)存在并辅加有动物血清时，分离、培养和扩增禽类细胞，优选禽类胚胎干细胞；
b)通过改良培养基或全部撤去所述的因子、所述的血清和所述的饲养层来传代，以累积细胞；
c)建立能在无外源性生长因子、失活饲养层和低水平血清或无血清的情况下，在基础培养基中增殖的贴壁和非贴壁禽类细胞系；
如果步骤c)的基本培养基仍旧包含低水平的血清(例如：约2％或更少)，所述的方法可能非必须包含额外的步骤d)以用选自如下的培养基更换无更多的外源性生长因子、无失活的饲养层和低水平血清的基本培养基：
-用血清(i)补充基本培养基，并且用无血清培养基稀释，然后在基本培养基(i)中培养在连续传代的所述的禽类细胞。无血清培养基在其中的比例逐渐提高直至完全取代所述的不含外源性生长因子、失活饲养层和血清的基本培养基；
-用血清(ii)补充无血清培养基，然后在在所述的培养基(ii)中培养连续传代的所述的禽类细胞。血清在其中的比例逐渐下降直至成为无血清培养基；
-无血清培养基(iii)，然后在培养基(iii)中培养所述的禽类细胞；然后保持所述的禽类细胞处于无血清培养基中以适应培养基的变化。
这里使用的术语“生长必须因子”意味着是培养的禽类细胞生存和生长所必须的因子。根据本发明，生长因子包含营养因子和细胞因子。营养因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。细胞因子主要是那些通过与gp130蛋白相关的受体来发挥功能的因子，比如：LIF、白介素11、白介素6、白介素6受体、CNTF、制瘤素和cardiotrophin。
步骤a)的禽类细胞是选自禽类胚胎细胞，更优选选自禽类胚胎干细胞和禽类原代细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是从禽类胚胎，优选鸡胚胎(见EYAL-GILADI的分类：EYAL-GILADI和KOCHAN，1976，《From cleavage to primitive streack formation：a complementarynormal table and a new look at the first stages of the development in thechick》。“General Morphology”Dev.Biol。49：321-337)的X阶段胚盘细胞悬液中分离得到的全能或多能禽类胚胎干细胞。这些禽类胚胎干细胞有一个缓慢的倍增时间，在39℃培养时，在48-72小时之间。
建立EBx细胞系方法的步骤b)的培养基的改良可以在同时、渐进和分别的进行，这些改良目的是渐进的和全部撤去生长因子、血清和/或饲养层。培养基撤除的顺序如下：
-饲养层/血清/生长因子；
-饲养层/生长因子/血清；
-血清/生长因子/饲养层；
-血清/饲养层/生长因子；
-生长因子/血清/饲养层；
-生长因子/饲养层/血清。
在一个优选的实施方案中，撤除的顺序是：生长因子/饲养层/血清。
这个方法可以筛选细胞克隆，其逐渐适应这些新的变化的培养条件直至得到可以在低水平血清培养基或无血清培养基能够生长的稳定细胞株。构建的EBx细胞株优选是非贴壁的干细胞，其可以在无外源性生长因子和无血清，没有饲养细胞的悬浮培养基中增殖。
“完全培养基”指得是基本培养基中添加了生长因子和动物血清。完全培养基的示例在Pain等(1996，Development 122：2339-2348)、EP787180和US6114168，US5340740，US6656479和US5830510中描述。根据本发明，“基本培养基”指得是一个至少可以使细胞存活，更好可以使细胞生长的具有典型培养基特点的一种培养基。基本培养基的示例如在前提到的SFM培养基或诸如BME(基本Eagle培养基)，MEM(最小Eagle培养基)，培养基199，DMEM(Dulbecco′s改良EagleMedium)，GMEM(Glasgow改良Eagle培养基)，DMEM-HamF12，Ham-F12和Ham-F10，Iscove改良Dulbecco培养基，MacCoy5A培养基，RPMI 1640。基本培养基包含无机盐(例如：CaCL2、KCL、NaCL、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4，……)，氨基酸，维生素((维生素B1、核黄素、叶酸、D-泛酸钙，……)和其它成分，比如：葡萄糖、β-巯基乙醇，丙酮酸钠。
区别两个家族的生长因子是可能的：细胞生长因子和营养因子。细胞因子主要是那些通过识别与gp130蛋白相关的受体来发挥功能的因子。因此，LIF、白介素11、白介素6、白介素6受体、CNTF、制瘤素和cardiotrophin有一个类似的功能方式，就是在一个特定链的受体的水平募集和与单体形式或有时候是异源二聚体的gp130蛋白相联合来发挥功能。营养因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。更优选，完全培养基包含基本培养基、胰岛素生长因子1(IGF-1)，纤毛神经营养因子(CNTF)、白介素6(IL-6)、白介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、非必须是白介素11(IL-11)和动物血清。禽类细胞，优选步骤a)的禽类胚胎细胞在多次传代的过程中是用完全培养基培养的。培养基至少添加如下其中之一的生长因子：LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、bFGF、IL-11、制瘤素cardiotrophin。根据一个优选的实施方案，完全培养基是基本培养基添加了IGF-1和CNTF。根据另一个优选的实施方案，完全培养基是基本培养基添加了IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、bFGF，非必须IL-11。IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、bFGF，非必须IL-11生长因子在基本培养基中的浓度是在0.01-10ng/ml，优选在0.1-5ng/ml，更优选在约1ng/ml。
在约3-10的传代之后，完全培养基中去除生长因子(步骤b)。优选的，对于每一种生长因子，从一代到另一代时直接一步去除。可以选择通过逐渐减少生长因子在完全培养基中的浓度来逐步的去除生长因子。在一个更优选的实施例方案中，至少同时去除两种生长因子。在一个优选的实施方案中，当完全培养基是添加了IGF-1和CNTF的基本培养基时，生长因子的去除以一个循环去除(the depletion in growthfactors is made in one round of depletion)。在另一个优选的实施方案中，当完全培养基是添加了IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、bFGF，非必须IL-11的基本培养基时，生长因子的去除可以通过两个循环进行：第一，直接从完全培养基中去除SCF、IL-6、IL-6R、bFGF，非必须IL-11；然后禽类细胞在含有IGF-1和CNTF，非必须IL-11和添加了动物血清的完全培养基中至少培养一代。第二，直接从培养基中去除IGF-1和CNTF，非必须IL-11，最终的培养基包含仅仅添加了血清的基本培养基。通常，培养基中的生长因子在约20-30代时全部去除。
在一个优选的实施方案中，生长因子去除之后，饲养细胞也会去除。饲养细胞的去除是渐进的在几次传代中进行。禽类细胞以比步骤a)低的细胞密度接种在培养瓶中，这个密度是约4×104细胞/cm2到5×104细胞/cm2。饲养细胞以4.2×104细胞/cm2的密度接种在培养瓶中。饲养细胞的浓度逐渐的在培养瓶中降低。在实践中，使用相同浓度的饲养细胞维持2-4代，然后在另一个2-4代，使用更低的饲养细胞浓度，如此进行。然后，按照4.2×104饲养细胞/cm2，然后约2.2×104饲养细胞/cm2，然后约1.8×104饲养细胞/cm2，然后约1.4×104饲养细胞/cm2，然后约1.1×104饲养细胞/cm2，然后约0.9×104饲养细胞/cm2，然后约0.5×104饲养细胞/cm2的密度接种摇瓶。然后按照6.5×104禽类细胞/cm2到7.5×104禽类细胞/cm2并且没有饲养细胞接种至摇瓶。一种假说认为，当摇瓶中的饲养细胞浓度转见降低时，禽类细胞就不能保持很好的形态，所以在撤去饲养细胞之前，用相同浓度的饲养细胞进行另外的传代培养。
在另一个优选的实施方案中，在撤去生长因子和饲养细胞之后，将血清也去除。基本培养基由选自如下的培养基替换(change)：
-基本培养基(i)补充血清并且用新鲜的无血清培养基(ii)稀释。然后禽类细胞在培养基(i)中连续传代培养，在(i)中逐渐加入无血清培养基部分直至含血清的基本培养基被完全取代(渐进稀释)。
-补充血清的新鲜无血清培养基(ii)。禽类细胞在培养基(ii)中连续传代培养，其中的血清部分逐渐被减少直至成为无血清培养基(渐进消失)。
-不补充血清的新鲜无血清培养基(ii)。禽类细胞直接在无血清培养基中培养(直接消失)。
-在一个优选的实施方案中，通过渐进消失的方式撤去血清。
饲养细胞优选那些通过辐射或化学药物如丝裂霉素处理而失活的动物细胞。饲养细胞可以在遗传水平上进行修饰使其表达生长因子，比如：SCF。优选的，饲养细胞是小鼠成纤维细胞系，比如：STO(American Type Culture Collection ATCC N0CRL-1503)。
这种方法建立了源白禽类胚胎细胞系——EBx，这种细胞系可以在体外培养相当长的时间。非常有利的事情就是，在步骤c)中得到的EBx细胞系能够增殖至少50天、100天、150天、300天或优选的至少600天。600天并不是一个时间限制，因为EBx细胞可以存活超过这个时间。例如：在P160代建立了EB14细胞原种细胞库和在P184代建立了最终生产细胞库；并且在P184代时，EB14细胞仍然能够增殖。因此，这些细胞被认为可以在无外源生长因子、血清和/或失活的饲养细胞的基本培养基中无限生长。表述“系”意味着任何能够在体外培养中无限增殖的细胞群体，同时其可以保留较多或较少程度的相同形态和表型特点。当然，上述提到的方法使从建立的细胞系中得到细胞克隆成为可能。这些克隆是那些在遗传学上与其起源细胞相同的细胞。
建立的细胞系和来源于步骤c和d的细胞优选是源自禽类胚胎的干细胞系，更精确的说是禽类胚胎来源的多能干细胞。通过本发明方法得到的禽类胚胎干细胞来源的EBx是小圆形独立细胞，倍增时间在39℃约24小时或更短一些。通过本发明方法得到的细胞至少是传代在p60代，至少在p70代，至少在p80代，至少在p90代，至少在p100代，至少在p110代，至少在p120代，至少在p130代，至少在p150代，至少在p160代，至少在p170代，至少在p180代或更多代。本发明的禽类胚胎来源的干细胞至少具有如下一个特性：
-高核-质比例，
-内源性碱性磷酸酶活性，
-内源性端粒酶活性，
-与针对SSEA-1(TEC01)、SSEA-3和EMA-1的特异抗体的反应，
-表达ENS1基因。
-短于本发明方法步骤a)中禽类细胞(48-72小时，在39℃)的倍增时间，在相同的培养条件下大约24小时和更短。
这些EBx细胞系能够在基本培养基中无限增殖，特别是在诸如SAFC Excell、DMEM、GMEM、HamF12和McCoy并添加本领域技术人员通常使用的多种附加成分的培养基中。这些添加物有非必须(non-essential)氨基酸、维生素和丙酮酸钠、脂肪酸、酵母和大豆水解产物。然而，细胞能够在无谷氨酰氨的基本培养基中增殖。这些细胞系与其来源的细胞具有类似于贴壁细胞或悬浮细胞的生长特性。
优选的，本发明的EBx细胞，优选EB14细胞具有所有以上提到的性质并且可以用作生物产品的制备，比如病毒疫苗和重组肽和蛋白(例如：抗体，……)的制备。
实施例2：EB14细胞的特性
2.1-EB14细胞的染色体组型
Pr.Michel Franck实验室已经分析了EB14细胞的染色体组型(Unite de zootechnie，ethnologie et economie rurale，Ecole NationaleVeterinaire，1 avenue Bourgelat，69280 Marcy I’Etoile，France)。
应用本领域技术人员熟知的标准技术对两个不同代(105和118代)的EB14细胞进行染色体组型分析。正如所期望的那样，105和118代的EB14细胞是双倍体染色体组型(图2)：
105代：染色体数＝78(平均：78.41-标准差：53个被研究的中期染色体为4.951)。
118代：染色体数＝79(平均：79.68-标准差：50个被研究的中期染色体为3.733)。
鸡基因组包含两种类型的染色体对：巨大的和微小的染色体。115代的分析显示：巨大染色体数是18，平均17.82，标准差为0.833；微小染色体数为60，平均60.6，标准差4.7。118代的分析显示：巨大染色体数是18，平均18.24，标准差为0.797；微小染色体数为60，平均61.44，标准差3.688。在这两个研究的代中，染色体分布上没有明显的背离。
105和118代的EB14细胞显示了正常的雄性(ZZ)二倍体染色体组型，这证明了EB14细胞的稳定性。
2.2-在免疫抑制的新生大鼠模型中，EB14细胞的成瘤分析
对127代的EB14细胞在免疫抑制的新生大鼠模型(Sannofi-Aventis，法国)(WHO技术报告N0 878(1998))中进行成瘤分析。HeLa细胞是阳性对照。10只免疫抑制的新生大鼠皮下注射10000000个EB14细胞，另外10只免疫抑制的新生大鼠皮下注射10000000个HeLa细胞。在0、+2、+7和+14天，收集所有动物的抗胸腺大鼠血清0.1ml。在3周的时间内，常规对动物进行观察以检测在注射位点是否形成结节。3周后，处死动物并检测注射位点和其它器官的细胞增殖。在注射位点和其它远端器官没有观察到EB14细胞形成的结节或肿瘤。EB14细胞在免疫抑制的新生大鼠模型中没有成瘤性。
2.3-EB14细胞表达禽类和人流感病毒受体
通过应用异羟基洋地黄毒甙(digoxygenin)标记血凝素(Boehringer)的荧光细胞分选分析进行EB14细胞上的禽类(Sia2-3Gal)和人(Sia 2-6Gal)流感病毒受体的检测。
Sambuca nigra(SNA)凝集素血凝素特异的结合Sia 2-6GAL；
Maackia amurensis(MAA)凝集素血凝素特异的结合Sia 2-3GAL。
用10mM HEPES、150mM NaCl，pH7.5的溶液洗涤EB14和MDCK细胞系并且重悬在相同缓冲液中，细胞密度最终为5×106。细胞在冰上孵育30分钟，然后加入SAN和MAA并继续孵育15-30分钟。用10mM HEPES、150mM NaCl，pH7.5的溶液洗涤血凝素处理的细胞，然后置于冰上，FITC标记的抗异羟基洋地黄毒甙抗体反应15-30分钟。然后在0.9％的NaCL中洗涤细胞并且用FACS分析。
EB14细胞表达细胞表面受体，包含带有Sia 2-6Gal和Siaα2-3Gal残基的寡糖(图6)。
实施例3：在EB14细胞中的MVA生产
3.1材料和方法
在实验中要应用编码绿色荧光蛋白的重组MVA病毒。感染性MVA-GFP病毒的滴度用DF-1细胞测定。简单来说，以15×103细胞/孔的密度接种细胞于96孔平底培养板中，所用培养基为添加了5％胎牛血清(FCS)(SAFC)和2mM L-谷氨酰氨(Biowhittaker)的DMEM培养基(Biowhittaker)。24小时之后，用DMEM培养基10倍系列稀释的样品感染细胞，在37℃，5％CO2的湿润条件下孵育1周。病毒的感染通过显微镜观察球形细胞病变(CPE)和暴露于紫外的被感染细胞来测定。然后，应用Reed和Muench方法计算TCID50滴度(1938，Asimple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97)。
3.2-组织培养瓶中的感染
3.2.1-材料
培养容器：F175培养瓶(Starstedt，Ref.83 1812502)
轨道搅拌器(orbital agitator)：IKA KS260或等效物
超声仪：IKA U50(使用US50-3探头检测)
培养基：含有2.5mM谷氨酰氨(Cambrex Ref.BE17605E)的Excell65319(SAFC-JRH)；
3.2.2-方法
步骤1：EB14细胞准备
在感染实验开始前两周准备细胞。
0天：密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养(团块解聚后的第一次接种)。细胞在37℃，7.5％CO2的湿润条件下60rpm摇荡培养。
第一天：加入25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第二天：加入50ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第三天：细胞计数。密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于新的F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养。这代表+1稀释。
第四天：加入25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第五天：加入50ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第六天：细胞计数。密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于新的F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养。这代表+2稀释。
然后，细胞如此持续扩增，直至稀释度包括：优选+3至+7，更优选+3至+5。然后进行步骤2细胞感染。
为了获得大块的EBx细胞培养物(这里命名为：“大团块”)，在通过稀释传代细胞至大的培养器皿中时，不离心EBx细胞，并且不能吹吸和摇荡以防止团块破碎。相反，为了获得非团块状EBx细胞时，可以在传代细胞时通过吹吸或摇荡破碎团块(这里命名为：“非块状”条件)。
步骤2：用MVA-GFP(绿色荧光蛋白)感染EB14细胞
第一天：密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于F175培养瓶中，用40ml含有2.5mM谷氨酰氨的JRH Excell 65319培养基培养。细胞在37℃，7.5％CO2的湿润条件下60rpm摇荡培养。
第二天和第三天：细胞计数。
第四天：细胞计数。当培养瓶中的细胞密度达到4×106细胞/mL时，用MOI为0.01 TCID50/细胞的病毒感染EB14细胞，每个培养瓶中加入1ml病毒混合液。在使用前用含有2.5mM谷氨酰氨Excell的65319培养基稀释病毒制备病毒感染混合液。在15ml FalconTM管中的每一个接种体超声30秒(100％振幅，连续)，管子要置于冰上。和细胞培养物混合之前，将接种体升温至室温。随后进行接种，感染后的培养基在37℃孵育1小时。然后，将60ml含有2.5mM谷氨酰氨、0.5×酵母提取物和0.35ml/L的脂肪酸的新鲜Exell 65319培养基加入培养瓶中。感染后的细胞培养物进一步在37℃孵育至少144小时(nb：病毒产量的峰值介于pi+72h至pi+120h之间)。
每24小时收集细胞培养样品(1m1)并保存在-80℃中。样品收集之前，要轻轻的吹吸混匀。在实验最后阶段将每次收集的样品的病毒滴度用TCID50/ml Reed和Muench，1938方法测定。
3.3-在旋转培养瓶中的感染
3.3.1-材料
培养器皿：500ml&1L旋转培养瓶(Corning)
轨道搅拌器：IKA IKA KS260或等效物
超声仪：IKAU50(使用US50-3探头监测)
培养基：含有2.5mM谷氨酰氨(Cambrex Ref.BE 17605E)的Excell65319(SAFC-JRH)：
3.3.2-方法
步骤1：EB14细胞准备
在感染实验开始前两周准备细胞。
0天：密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养(团块解聚后的第一批种子)。细胞在37℃，7.5％CO2的湿润条件下60rpm摇荡培养。
第一天：加入25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第二天：加入50ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第三天：细胞计数。密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于新的F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养。这代表+1稀释。
第四天：加入25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第五天：加入50ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基。
第六天：细胞计数。密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于新的F175培养瓶中，用25ml含有2.5mM谷氨酰氨的Excell 65319培养基培养。这代表+2稀释。
然后，细胞如此持续扩增，直至稀释度包括：优选+3至+7，更优选+3至+5。然后进行步骤2细胞感染。
为了获得大块的EBx细胞培养物(这里命名为：“大团块”)，在通过稀释传代细胞至大的培养器皿中时，不离心EBx细胞，并且不能吹吸和摇荡以防止团块破碎。相反，为了获得非团块状EBx细胞时，可以在传代细胞时通过吹吸或摇荡破碎团块(这里命名为：“非块状”条件)。
步骤2：用MVA-GFP感染EB14细胞
第一天：密度为0.4×106细胞/mL的EB14细胞接种于500ml(或1000ml)旋转培养瓶中，用150ml(或300ml)含有2.5mM谷氨酰氨JRH Excell 65319培养基培养。细胞在37℃，7.5％CO2的湿润条件下100rpm摇荡培养。
第二天和第三天：细胞计数。
第四天：细胞计数。当培养瓶中的的细胞密度达到大约4×106细胞/mL时，用MOI为0.01 TCID50/细胞的的病毒感染EB14细胞，每个旋转培养瓶中加入1ml病毒混合液。在使用前用含有2.5mM谷氨酰氨Excell 65319培养基稀释病毒制备病毒感染混合液。在15ml FalconTM管中的每一个接种体超声30秒(100％振幅，连续循环)，管子要置于冰上。和细胞培养物混合之前，将接种体升温至室温。随后进行接种，感染后的培养基在37℃孵育1小时。然后，将60ml含有2.5mM谷氨酰氨、0.5×酵母提取物和0.35ml/L的脂肪酸的新鲜Exell 65319培养基加入500ml(或1000ml)旋转培养瓶中。感染后的细胞培养物进一步在37℃孵育至少144小时(nb：病毒产量的峰值介于pi+72h至pi+120h之间)。
每24小时收集细胞培养样品(1ml)并保存在-80℃中。样品收集之前，要轻轻的吹吸混匀。在实验最后阶段将每次收集的样品的病毒滴度用TCID50/ml Reed和Muench方法测定(1938)*。*Reed L&Muench H(1938)A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97。
3.4-在3L搅拌槽生物反应器中的感染
3.4.1-方法
细胞复苏
细胞冻存管储存在-196℃的液氮中；每个冻存管中有20×106细胞。冻存管直接置于预热到37℃的水浴中，以使细胞快速解冻。将细胞悬液吸到一个装有30ml预热培养基的50ml消毒管中。以300±20g的速度，室温离心5分钟细胞悬液；去除上清，将沉淀重悬在15ml新鲜培养基中并混匀。细胞悬液接种到T75 cm2培养瓶中，在37℃、7.5％CO2条件下，以50rpm速度搅拌培养。在培养24和48小时之后，将15ml预热的培养基加入细胞培养物中。培养72小时之后，收集样品(全部混匀之后)并计数：预期≥40×106细胞。然后进行第一次扩增。
第一次细胞扩增：离心、分散和稀释
培养瓶中的细胞悬液收集在50ml PP消毒管中。以300±20g的速度，室温离心5分钟细胞悬液；去除上清，将沉淀重悬在10ml预热的新鲜培养基中；如果需要，细胞团快用10mL吸管轻轻分散，并将细胞悬液汇集在一个50ml的PP消毒管中。如果需要，培养体积可以最多是20mL(新鲜预热培养基)。用胎盘兰计数细胞以确定细胞密度和细胞活力(细胞活力一般约80％)。在1个T175 cm2培养瓶中，将密度为0.4×106细胞/mL的细胞接种至40ml预热的培养基中。在37℃、7.5％CO2条件下，以50rpm速度搅拌培养。第二天将60ml预热的培养基加入培养体系中。第三天稀释细胞。
稀释+1至+5(不离心，不分散，仅仅稀释)。
用胎盘兰染色计数T175培养瓶中的样品(轻轻混匀之后)以确定细胞密度。T175中的样品(轻轻混匀之后)以0.4×106细胞/mL的密度接种于一个装有总体积为25ml预热培养基的T175培养瓶中。这表示稀释+1。
第一天加入50ml预热培养基。第二天，稀释+2，应用类似于稀释+1的方法进行(见上)。通过这种方法扩增细胞，直到获得稀释+3至+5。3L生物反应器的接种体可以通过稀释+3到稀释+5来制备。
对于一个接种体需要准备两个T175培养瓶。
细胞接种在3L旋转生物反应器中
接种-第0天
准备接种体(需要320×106细胞接种到3L反应器中)。准备好2个T175培养瓶。轻轻混匀样品(不打碎细胞团块)，并用胎盘兰计数以确定细胞密度。制备150ml密度为的细胞混合物，接种于培养体终体积为800ml的生物反应器中，使细胞密度为0.4×106细胞/mL。
接种细胞之前，将培养器皿中的pH设置为7.2(因为CO2注入表面会降低pH值)。pO2设置为50％饱和度(最大流量控制器调整到100％，以适应最大的喷流率达到50ml/分钟)。在开始的时候，pH由CO2注入表面来维持，随后要加入7.5％NaHCO3来调节。表面通风以空气流速0.3ml/分钟开始。
持续培养/补料(第一天，第二天)
按照惯例进行细胞计数。在培养的同时用BoiProfile Basic软件分析代谢物，比如：谷氨酸盐、谷氨酰氨、乳酸盐和葡萄糖。如果需要，代谢物的浓度可以调整。例如：谷氨酰氨浓度可以调整到2mM。
用MVA-GFP感染(第三天)
培养3天之后，细胞密度应该超过3×106细胞/ml。如果靶细胞密度达到3-5×106细胞/ml，则可以MOI＝10-2TCID50/细胞的病毒感染细胞。病毒株在冰上融化。用10ml生产培养基在一个50ml PP消毒管中配制感染混合物。将混合物在冰浴中超声30秒(振幅100％并连续循环)。感染混合物接种到生物反应器中。病毒吸附1小时之后，将最终的生产培养基加入到培养容器中。所用培养基为1.5L的Excell 65319生产培养基，添加酵母提取物和脂肪酸，使其终浓度分别为0.5×和0.35ml/L(终体积：2.3L)。
持续生产/补料(第四天，第五天，第六天，第七天，第八天，第九天，第十天)
感染后72-120小时，MVA病毒生产达到峰值。每天从生物反应器终收集约15ml的样品进行细胞计数，细胞形态分析和观察CPE。在培养的同时用BoiProfile Basic软件分析代谢物，比如：谷氨酸盐、谷氨酰氨、乳酸盐和葡萄糖。如果需要，代谢物的浓度可以调整。例如：谷氨酰氨浓度可以调整到2mM。葡萄糖浓度可以调整到2g/L。
分析
在实验的最后阶段，将收集的样品进行病毒滴度分析。
3.5-结果
3.5.1在3L分批补料生物反应器终EB14细胞的生长动力学
EB14细胞通常在旋转生物反应器中培养。在37℃，细胞生长培养基中的EB14细胞可以积累，直至密度达到5-6×106细胞/mL。然后将混合物稀释约3倍并且进行连续10天的生长动力学研究。在这样的条件下，大约5-8天，细胞密度通常可以达到12-16×106细胞/mL(图7A)。EB14细胞分批的比率可能增加。图7B显示了稀释10倍的EB14细胞的生长动力学。
3.5.2-EB14细胞灵活性：贴壁细胞上MVA-GFP病毒的空斑纯化
EB14细胞生长在悬浮培养基中。然而，EB14细胞也可以贴壁生长于培养瓶和培养皿中。这个性质允许发明者在贴壁的EB14细胞上进行空斑纯化。为了达到这个目的，将MVA-GFP病毒进行10倍的系列稀释，并与贴壁的接种到6孔板中培养24小时，密度达到7×104细胞/cm2的EB14细胞孵育。随后让病毒吸附，细胞用含1.2％LMP琼脂糖/2.5％FCS DMEM的混合物覆盖并在37℃中孵育几天。最后用中性红染色每个培养孔。空斑形成单位滴度可以用稀释后分离的空斑来计算。
3.5.3-生长培养基和团块大小对感染后的EB14细胞中MVA-GFP病毒复制的影响
EB14细胞在生长培养基(Excell 65319)中增殖时，可以在T175搅拌槽培养瓶中形成小的或大的团块。用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染细胞团块，混合物用几种生产培养基稀释(Optipro、Excell319、Excell 421、Excell 625、Excell 627、Excell 628、Excell 629、G9916)。
EB14细胞大团块的存在可以促进病毒感染和繁殖(图8)，导致较高的MVA病毒滴度(图9)。诸如酵母提取物(补充成分1)和脂肪酸(补充成分2)添加到生产培养基中可以进一步提高病毒的滴度。正如图10显示的一样，当只将1×酵母提取物添加到培养基中时，MVA-GFP病毒产量会增加，而当同时添加酵母提取物(补充成分1)和脂肪酸(补充成分2)到培养基中时，病毒滴度的增加可以获得协同效应。确实，1×脂肪酸单独不能引起病毒滴度的增加。
3.5.4-MVA病毒在3L生物反应器中的生产
在Excell 65319生长培养基中的来自EB14细胞生物量，可以在增殖阶段积累。然后，用10-2TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染细胞，混合物用Excell 65319生产培养基稀释。随着Excell 65319的添加，细胞密度会下降(第三天)，但是在第五天，感染后细胞的密度会增加并且达到4×106细胞/mL。在感染后2-4天中，细胞扩增中不进行离心可以促使形成大的团块(图11)。在这种条件下，MVA-GFP产量是高的。在感染后第六天，MVA-GFP病毒滴度约为108.32TCID50/ml(细胞密度为1.49×106细胞/mL)，相应的TCID50/细胞＝414(扩增因子41000)(图12)。这说明与没有大团块(扩增因子约1900，TCID50/细胞＝19)存在时相比，在3L生物反应器中EB14细胞在形成团块时候的增殖(例如通过稀释)可以得到更高的病毒滴度。
3.5.5-MVA感染EB14细胞的正常超微结构
应用电子显微镜分析MVA病毒感染后的EB14细胞(DanieleSpehner和Robert Drillien博士，IGBMC，Strasbourg法国)。在EB14细胞中生产的MVA病毒的成熟时正常的，类似于在原代鸡胚成纤维细胞中所观察到的。
实施例4：EB14细胞中流感病毒的生产
4.1-材料&方法
4.1.1-流感病毒感染能力分析(TCID50)
传染性流感病毒的滴度用MDCK细胞测定。简单来说，细胞以3×103细胞/孔的密度接种在96孔平底板中，培养基用含有2.5mM的L-谷氨酰氨的UltraMDCK培养基。24小时之后，用含有6g/ml胰酶-EDTA的UltraMDCK10倍系列稀释的样品感染细胞并且在33℃，5％CO2的湿润条件下孵育1周。病毒复制用鸡红细胞HA试验检测，TCID50滴度根据Reed和Muench方法计算(1938)*。
*Reed L&Muench H，1938，A simple method of estimating fiftypercent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97。
4.1.2-单向幅射状免疫扩散实验(SRID)
从流感病毒感染的EB14细胞得到的样品中的血细胞凝集素的浓度通过Wood及其同事提出的方法进行测定。简言之，用含有抗流感血清(推荐由NIBSC提供的浓度)琼脂糖胶包被玻璃板。胶聚合之后，取10μl合适稀释度的参考样品和样品穿刺上样于琼脂糖中(直径3mm)。将其置于湿盒中，在室温孵育18-24小时，然后用0.9％NaCl浸泡，再用去离子水洗涤。接着将胶干燥。用考马斯亮兰溶液染色15分钟，用甲醇和乙酸混合液脱色两次直至清晰的染色区域可见。干燥之后，测量抗原周围的染色区域的直径(从直角的两个方向)。建立了针对表面的抗原剂量-效应曲线并且根据标准斜率评价方法计算结果。(*Wood JM.等“An improved single-radial-immunodiffusion techniquefor the assay of influenza haemagglutinin antigen：application for potencydeterminations of inactivated whole virus and subunit vaccines.”J BiolStand.1977；5(3)：237-47)。
4.1.3-Western blot分析流感血细胞凝集素蛋白
按照Laemmli UK(1970，Cleavage of structure proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 259：680-685)描述的方法在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。应用半干转印的方法将变性蛋白质(1％SDS，70mM β-巯基乙醇)转印到聚偏二乙烯二氟酯膜(hybond P，Amersham)上(Kyhse-Andersen J(1984)Electroblottingof multiple gels：a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer ofproteins from polyacrylamide to nitrocellulose.J Biochem BiophysMethods 10：203-209)。用5％脱脂奶粉(用TBST配制，含有1％FCS(SAFC))室温封闭印迹1小时。然后，用封闭液按照1：500(NIBSC)稀释特异性多克隆抗HA绵羊血清，并与印迹孵育过夜。用TBST洗印迹6次，然后在室温条件下与按照1：5000(Rockland)用封闭液稀释的hrp标记的兔抗绵羊IgG多克隆抗体孵育1小时。用TBST洗印迹6次，最后用化学发光法(ECL试剂盒，Amersham)和胶片(Hyperfilm，Amersham)显影蛋白连接的复合物。
4.2-在3L生物反应器中流感病毒感染EB14细胞
4.2.1-材料和设备
细胞复苏设备
T75cm2培养瓶(Sarstedt，Cat#831813502)
培养基(无血清培养基)
L-谷氨酰氨200mM(Biowhittaker，Cat#BE17-605E)
轨道搅拌器IKA KS260(Fisher Bioblock，Cat#F35044)
细胞扩增材料
T175cm2培养瓶(Sarstedt，Cat#831813502)
培养基(无血清培养基)：Excell 65319(JRH，Cat#65319-1000M1678)添加2.5mM谷氨酰氨
L-谷氨酰氨200mM(Biowhittaker，Cat#BE17-605E)
酵母提取物UF溶液50×(JRH，Cat#58902-100M)
D(+)葡萄糖(45％)(Sigma，Cat#G8769)
生产材料
生产培养基(无血清培养基)：Excell 65629(JRH，Cat#65629)添加2.5mM谷氨酰氨
酵母提取物UF溶液50×(JRH，Cat#58902-100M)
L-谷氨酰氨200mM(Biowhittaker，Cat#BE17-605E)
D(+)葡萄糖(45％)(Sigma，Cat#G8769)
胰酶(胰酶1×，Sigma，Cat#T3449)
7.5％碳酸氢钠溶液(Sigma，Cat#205-633-8)
流感病毒株(冷冻在-80℃)
4.2.2-方法
细胞复苏
细胞冻存管储存在-196℃的液氮中；每个冻存管中有20×106细胞。冻存管直接置于预热到37℃的水浴中，以使细胞快速解冻。将细胞悬液吸到一个装有30ml预热培养基的50ml消毒管中。以300±20g的速度，室温离心5分钟细胞悬液；去除上清，将沉淀重悬在15ml新鲜培养基中并混匀。用胎盘兰进行细胞计数。计数必须达到≥20×106细胞并且细胞活力必须＞70％以保证能够很好的培养。悬液接种到T75培养瓶中，在37℃、7.5％CO2条件下，以50rpm速度在轨道搅拌器上培养。培养24小时和48小时之后，培养体系中加入15ml预热的培养基。72小时之后，收集样品(全部混匀之后)并计数：预期20-30×106细胞。然后进行第一次扩增。
第一次细胞扩增：离心、分散和稀释
培养瓶中的细胞悬液收集在50ml PP消毒管中。以300±20g的速度，室温离心5分钟细胞悬液；去除上清，将沉淀重悬在10ml预热的新鲜培养基中；轻轻的分散细胞团块并且积累细胞悬液；用新鲜预热的培养基补充体积到40ml。在1个T175cm2培养瓶中，将密度为0.25×106细胞/mL的细胞接种至40ml预热的培养基中。在37℃、7.5％CO2条件下，以50rpm速度在轨道搅拌器上培养。第二天将60ml预热的培养基加入培养体系中。第三天，进行第二轮扩增。
细胞接种在3L搅拌槽生物反应器中
接种-第0天
准备接种体(320×106细胞接种到3L反应器中)。准备好2个T175培养瓶。轻轻混匀样品(不打碎细胞团块)，并用胎盘兰计数以确定细胞密度。制备150ml的细胞混合物，以获得在生物反应器中培养终体积为800ml的细胞密度为0.40×106细胞/mL。
接种细胞之前，将培养瓶中的pH设置为7.2(因为CO2表面注入会降低pH值)。pO2设置为50％饱和度(最大流量控制器调整到100％，以适应最大的喷流率达到50ml/分钟)。在开始的时候，pH由CO2表面注入来维持，随后要加入7.5％NaHCO3来调节。表面通风以空气流速0.3ml/分钟开始。
持续培养/补料(第一天，第二天)
按照惯例进行细胞计数。在培养的同时用BoiProfile Basic软件分析代谢物，比如：谷氨酸盐、谷氨酰氨、乳酸盐和葡萄糖。如果需要，代谢物的浓度可以调整。例如：谷氨酰氨浓度可以调整到2mM。
感染(第三天)
培养3天之后，细胞密度应该超过4-5×106细胞/ml。如果靶细胞密度达到要求，则可以MOI＝10-4的病毒感染细胞。培养容器的温度设置在33℃。病毒株在冰上融化。用10ml生产培养基配制感染混合物。将感染混合物接种至生物反应器中之后，进行1小时病毒吸附。最终的生产培养基配制：在1.5L生产培养基中，加入胰酶，终浓度为0.3U/ml(总体积2.3L)，再加入0.5×酵母提取物。然后加入最后的预热的培养基。
持续生产/补料(第四天，第五天，第六天，第七天，第八天，第九天，第十天)
每天从生物反应器中收集约15ml的样品进行细胞计数，细胞形态分析和观察CPE。在培养的同时用BoiProfile Basic软件分析代谢物，比如：谷氨酸盐、谷氨酰氨、乳酸盐和葡萄糖。如果需要，代谢物的浓度可以调整。例如：谷氨酰氨浓度可以调整到2mM。葡萄糖浓度可以调整到2g/L。
分析
在实验的最后阶段，将所有收集的样品进行病毒滴度分析、血细胞凝集素分析(HAU)和HA抗原定量(Western blot，SRID)。
4.3-结果
发明者证实了EB14细胞是可以用来复制多种流感病毒株A和B的可靠和有效的细胞。流感病毒的生产可以在多种培养容器中进行，比如：培养瓶和旋转培养瓶(数据未显示)和生物反应器。发明者发展了在3L和30L旋转生物反应器中生产流感病毒的可再生的和有效的分批补料方法。在培养瓶中，通常可以获得超过25mg/l产量的血细胞凝集素，用流感病毒株A和B通常在培养瓶中可以获得35mg/l产量的血细胞凝集素。

Claims (42)

1.在源自禽类胚胎的干细胞EBx中复制选自腺病毒、嗜肝病毒、疱疹病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、呼吸道肠道病毒或逆转录病毒的方法，所述的方法包括步骤：
a)在培养容器中，在无血清培养基NO1中，所述的EBx细胞悬浮增殖；
b)当细胞密度至少为1.5×106细胞/ml时，用选择的病毒感染所述细胞；
c)感染之前短时间内，感染之时，或感染之后短时间内添加无血清细胞培养基NO2；和
d)进一步培养所述的感染细胞以保证病毒复制；和
e)可选择的，收集所述的病毒。
2.权利要求1的方法，其中该培养容器是连续搅拌槽生物反应器。
3.权利要求1-2的方法，其中该无血清培养基NO1和无血清培养基NO2是相同的培养基。
4.权利要求1-2的方法，其中该无血清培养基NO1和无血清培养基NO2含有不同的组分。
5.权利要求1-4的方法，其中介于0.25至10倍体积之间的无血清培养基NO2加入到无血清培养基NO1中。
6.权利要求1-5的方法，其中无血清培养基NO1和/或无血清培养基NO2添加选自氨基酸、脂质、脂肪酸、胆固醇、碳水化合物、非动物来源的蛋白质水解产物或其混合物的至少一种组分。
7.权利要求1-5的方法，包含额外的给细胞补料至少一种组分的步骤，该组分选自氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、非动物来源的蛋白质水解产物或其混合物。
8.权利要求7的方法，其补料发生在步骤a)到d)，优选在步骤b)到d)。
9.权利要求8的方法，其中补料每天进行。
10.权利要求8的方法，其中补料是连续进行的。
11.权利要求8的方法，其中补料每天超过一次。
12.权利要求8的方法，其中补料每天少于一次。
13.权利要求6-12的方法，其中氨基酸选自天冬酰氨或谷氨酰氨，或其混合物。
14.权利要求13的方法，其中谷氨酰氨的补料在步骤a)到步骤d)进行以保持谷氨酰氨在培养基中的浓度介于0.5mM至5mM，优选约2mM。
15.权利要求6-12的方法，其中碳水化合物选自D-葡萄糖或D-半乳糖，或其混合物。
16.权利要求15的方法，其中D-葡萄糖的补料在步骤b)到步骤d)进行以保持D-葡萄糖在培养基中的浓度约为0.5g/1至25g/1，优选约2g/l的D-葡萄糖。
17.权利要求6-12的方法，其中脂肪酸选自棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸或其混合物。
18.权利要求6-12的方法，其中非动物来源蛋白质水解产物选自细菌胰蛋白胨、酵母胰蛋白胨、植物水解产物或其混合物。
19.根据权利要求1-18的方法，其中EBx细胞以团块状细胞悬浮培养。
20.根据权利要求1-19的方法，其中在步骤a)中，从一个培养容器向另一个培养容器传代的EBx细胞的至少一代，优选至少所有代是通过稀释进行传代，而不分散EBx细胞团块。
21.根据权利要求1-19的方法，其中在步骤a)中，从一个培养容器向另一个培养容器传代的EBx细胞的至少一代，优选至少所有代的不包含离心和/或分散细胞团块的步骤。
22.根据权利要求1-21的方法，其中步骤c)在步骤b)感染后进行，优选在步骤b)后约1小时。
23.根据权利要求1-22的方法，其中步骤b)用m.o.i(多重性感染)约为10至10-6，优选约10-3至10-5，更优选约10-4进行感染。
24.根据权利要求1-23的方法，其中病毒是自然发生的痘病毒或重组痘病毒，该重组痘病毒选自改良的牛痘苗Ankara病毒(MVA)、禽痘病毒、金丝雀痘病毒(即ALVAC)、灯芯草雀痘病毒、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒、火鸡痘病毒。
25.根据权利要求1-24的方法，其中病毒是自然发生的病毒或重组病毒，该重组病毒选自麻疹病毒和腮腺炎病毒。
26.根据权利要求1-24的方法，其中病毒选自人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、猫流感病毒。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的人流感病毒是A株，其选自H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H4N6、H5N1、H7N7和H9N2。
28.根据权利要求1-27的方法，其中步骤a)的培养通过分批培养、重复分批培养、分批给料培养或灌注培养而进行。
29.根据权利要求1-28的方法，其中步骤b)的感染是在分批或分批给料方法中，当细胞密度达到至少4×106细胞/ml时，优选6×106细胞/ml时进行。
30.根据权利要求1-29的方法，其中步骤b)的感染是在灌注培养中，当细胞密度达到至少8×106细胞/ml时，优选大约9-10×106细胞/ml时进行。
31.根据权利要求1-30的方法，其中在步骤a)、b)、c)和d)中的无血清培养基的pH是在6.5至7.8之间。
32.根据权利要求1-31的方法，其中步骤d)在收集之前持续2至10天。
33.根据权利要求1-32的方法，其中细胞培养在包含介于30-39℃之间的温度，优选约37℃进行。
34.通过如权利要求1-33中之一的方法获得的病毒。
35.含有如权利要求34的病毒的疫苗，如果适当与增强免疫反应的物质联合。
36.根据权利要求35的疫苗，其中病毒以完整的病毒颗粒存在。
37.根据权利要求35的疫苗，其中病毒以不完整的病毒颗粒存在。
38.根据权利要求35的疫苗，其中病毒以减弱毒性的病毒存在。
39.包含如权利要求34的病毒的成分的疫苗，如果适当，与增强免疫反应的物质联合。
40.根据权利要求35的疫苗，其中疫苗包含病毒分离的蛋白。
41.包含通过权利要求1-33的方法能获得的被感染的细胞系EBx的疫苗，并且其中被感染的细胞系EBx在步骤d)中被收集。
42.包含如权利要求34的病毒的或其成分的诊断组合物。
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