MX2007012777A - Procedimiento de fabricacion de vacunas virales en lineas de celulas madre derivadas de embriones aviares en suspension. - Google Patents

Procedimiento de fabricacion de vacunas virales en lineas de celulas madre derivadas de embriones aviares en suspension.

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Abstract

La presente invencion trata del desarrollo y fabricacion de vacunas virales; en particular, la invencion trata del campo de la produccion industrial de vectores y vacunas virales, mas en particular del uso de celulas aviares, para la produccion de vectores y vacunas virales; la invencion es particularmente valida para la produccion industrial de vacunas virales para prevenir la infeccion viral de humanos y animales.

Description

PROCEDIMIENTO DE FABRICACIÓN DE VACUNAS VIRALES EN LINEAS DE CÉLULAS MADRE DERIVADAS DE EMBRIONES AVIARES EN SUSPENSIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención trata del desarrollo y fabricación de vacunas virales. En particular, la invención trata del campo de la producción industrial de vectores y vacunas virales, más en particular del uso de células aviares, preferiblemente de línea de células madre derivadas de embriones aviares, para la producción de vectores virales y virus. La invención es particularmente útil para la producción industrial de vacunas virales para prevenir la infección viral de humanos y animales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vacunación colectiva sería el enfoque más simple y efectivo para controlar pandemias virales, como brotes de gripe en un periodo pandémico e interpandémico, y también para prevenir una amenaza bioterrorista, como los recientes actos terroristas con ántrax en los E.U.A. Sin embargo, para muchas vacunas virales como las vacunas contra la gripe y la viruela que se producen actualmente en sistemas basados en óvulos, es más probable que la capacidad de producción actual de los fabricantes de vacunas no sea suficiente para cubrir las necesidades en caso de una pandemia o ataque bioterropsta A intervalos imprevisibles, y además de la epidemia de gripe leve estacional causada por una evolución o reagrupacion antigénica, surgen cambios antigenicos con subtipos del virus de la gripe completamente nuevos para los cuales no existe inmunidad en la población humana Causan pandemias globales que se extienden rápidamente por todo el mundo Tres de estas pandemias tuvieron lugar en el último siglo (1918, 1957, 1968) La mas grave en 1918, infecto aproximadamente al 50% de la población mundial, cuyo 25% padeció una enfermedad clínica, el índice de mortalidad total se estimó entre 20 y 40 millones, particularmente afectando a personas en la mejor etapa de la vida Esta pandemia redujo el crecimiento de la población durante los siguientes diez años El último brote con un alto índice de mortalidad y potencial de pandemia ocurrió en 1997, cuando un nuevo virus de la gripe (H5N1 ) emergió en Hong Kong, llevando a la muerte a un tercio de los pacientes afectados, principalmente adultos jóvenes Afortunadamente, el virus no pudo extenderse de persona a persona y el brote se pudo detener rápidamente Un virus similar se aisló en 2003 en Hong Kong. En los E U A , se espera que el impacto de la próxima pandemia sea de 18 a 42 millones de consultas ambulatorias, 314,000 a 734,000 hospitalizaciones y 89,000 a 207,000 muertes, considerando que la próxima pandemia será de una magnitud similar a la de la pandemia de 1957 o a la de 1968, y no como la pandemia de 1918 (Meltzer Ml, Cox NJ y Fukuda K The economic impact of pandemic influenza in the United States prio ties for intervention Emerging Infectious Diseases 1999, 5 659-671 ) Extrapolando este impacto previsto proporcionalmente a la población mundial, la estimación bruta del impacto global de la próxima pandemia puede ser de 1 ,000 a 2,000 millones de casos de gripe, 5 3 a 12 3 millones de casos de enfermedad grave y 1 5 a 3 5 millones de muertes Ademas de una posible pandemia, la epidemia de gripe anual causada por vanantes evolucionadas de los virus A y B de la gripe infectan aproximadamente del 10 al 20% de la población cada estación y causan enfermedades con fiebre, hospitalizaciones y muertes Se han utilizado métodos estadísticos indirectos para calcular la carga total de la gripe, entre los cuales se incluyen vanos modelos estadísticos que cuantifican el aumento estacional de la morbilidad y mortalidad durante periodos de epidemia de gripe (Simonsen L, Clarke MJ Wil amson GD, Stroup DF, Arden NH, Schonberger LB The impact of influenza epidemics on mortality introducing a seventy índex Am J Public Health 1997, 87 1944-1950) Utilizando esta metodología, una estación promedio de gripe en los E U A se asocia actualmente a 25 a 50 millones de casos de gripe, 150,000 hospitalizaciones y 20,000 a 40,000 muertes Suponiendo que el nesgo específico de la edad de morbilidad de la gripe es similar al de los E U A la carga mundial promedio anual de gripe inter-pandemica puede estar en el orden de aproximadamente 1 ,000 millones de casos de gripe, aproximadamente 3 a 5 millones de casos de enfermedad grave y 250,000 a 500,000 muertes (consulte el informe de la OMS, Ginebra, abril 2003: State of the art of new vaccines Research & Development - Initiative for Vaccine Research). Las vacunas contra la gripe actualmente disponibles son eficaces para la prevención de enfermedades relacionadas con la gripe inter-pandémica y son muy eficaces en cuanto a la prevención de hospitalizaciones y muertes. A pesar de estos resultados, en países desarrollados y en vías de desarrollo, no llega a la "población de alto riesgo", en parte debido al precio relativamente alto de la vacuna y a la necesidad de re-vacunación anual. Sin embargo, muy recientemente, el uso de la vacuna contra la gripe ha comenzado a aumentar en todo el mundo hasta alcanzar aproximadamente 235 millones de dosis en 2003, pero hay todavía una brecha considerable entre la demanda de la vacuna pandémica y la producción de la vacuna actual. La Organización Mundial de la Salud (WHO) estima que hay aproximadamente 1 ,200 millones de personas en "alto riesgo" de padecer brotes de gripe graves (mayores de 65 años de edad, bebés, niños, adultos con problemas crónicos de salud, trabajadores de asistencia sanitaria, etc.). El sistema actual basado en óvulos utilizado para producir las vacunas contra la gripe autorizadas, a pesar de ser fiable durante más de 50 años, tiene sus limitaciones que son: ° un procedimiento de fabricación largo, complicado y que consume recursos que requiere la obtención y control de calidad de grandes cantidades de óvulos para cada campaña de producción individual. Este sistema actual de producción basado en óvulos no promueve a otras empresas farmacéuticas a entrar en el negocio de vacunas contra la gripe derivadas de óvulos porque el margen de ganancias posibles es demasiado estrecho. ° la necesidad de seleccionar qué cepas de virus estarán en la vacuna al menos 6 meses antes de la estación de la gripe. Esta decisión temprana sobre qué cepas se deben incluir en la vacuna contra la gripe no será siempre la correcta y el largo plazo de producción necesario para producir la vacuna hace que sea imposible la acción correctiva en una etapa intermedia del procedimiento. ° la necesidad de producir las suficientes vacunas contra la gripe cada año para cumplir con la demanda en continuo crecimiento (aproximadamente 250 millones de dosis en países industrializados en 2004, aproximadamente 100 millones de dosis para los E.U.A. únicamente). La reciente insuficiencia de vacunas contra la gripe en los E.U.A. durante el invierno 2004-2005 debido a una contaminación en la planta en el Reino Unido de un fabricante de vacunas contra la gripe derivadas de óvulos realza este tema. Además, la capacidad de producción mundial actual de la vacuna contra la gripe no es suficiente para cubrir partes de la población mundial en "alto riesgo". En realidad, es discutible si la infraestructura mundial puede encargarse de la distribución y entrega oportuna de la vacuna contra la gripe pandémica. • los requisitos de cientos de millones de óvulos aviares fertilizados para fabricar la vacuna con los riesgos asociados del suministro insuficiente de óvulos en casos de infecciones epidémicas en los grupos aviares donantes • la necesidad en casos de virus contra la gripe vivos atenuados para utilizar costosos óvulos aviares exentos de patógenos específicos (SPF) • los costos inflacionarios asociados con el uso de suero bovino que procede de países libres de BSE • la alergenicidad de los componentes derivados de óvulos en algunos individuos • la incapacidad de utilizar óvulos para la propagación de virus que son muy virulentos y letales para las aves Además, la tecnología actual en vacunas produce vacunas con un reducido espectro de producción y es, por lo tanto, más probable que las vacunas disponibles en reserva protejan contra una cepa pandémica del virus de la gripe completamente nueva De forma alternativa, la amenaza bioterronsta se ha convertido en una gran preocupación para numerosos gobiernos de países occidentales en estos últimos años, como los recientes actos terroristas con ántrax El gobierno de los Estados Unidos está tomando medidas apropiadas para un rápido diagnóstico, defensa y reacción frente a los ataques biológicos a través de la implementación de la "Bioterropsm Preparedness and Response Act" (ley de respuesta y preparación sobre el bioterronsmo) en 2002 Las armas biológicas son relativamente accesibles y, para las organizaciones bioterronstas, constituyen una forma económica y eficaz de amenazar y atemorizar a la población y a los gobiernos. En particular, el uso del virus contra la viruela como arma biológica ha aumentado en los últimos años y numerosos países han desarrollado planes de emergencia para enfrentarse a dicho riesgo. Se considera que la viruela tiene el potencial más alto para causar un daño generalizado en caso de una diseminación deliberada, seguida por la peste, ántrax y botulismo. La viruela se declaró erradicada en 1980 y todos los países del mundo han quitado desde entonces los programas de vacunación contra la viruela. Lo que ha conducido a una reducción constante de la inmunidad de la población a la infección viral, convirtiendo al virus contra la viruela en un agente aun más peligroso en caso de una emisión bioterrorista. El Centro para el Control de Enfermedades de los E.U.A. (CDC) ha clasificado a la viruela como un agente bioterrorísta de clase A, es decir, entre los microorganismos más peligrosos dada su fácil propagación y alto índice de mortalidad. Una vacunación colectiva rápida sería el enfoque ideal para controlar un brote de viruela. El gobierno de los E.U.A. ha tomado la iniciativa asegurando una solución madre adicional de la vacuna, vacunando al personal militar y a los principales trabajadores de asistencia sanitaria y estableciendo un programa para el desarrollo de una vacuna segura que pudiera ser administrada a toda la población sin importar el estado de salud de los habitantes. Otros gobiernos están observando el progreso de los E.U.A. así como evaluando la preparación de emergencia de sus países.
En el pasado, los gobiernos estaban adquiriendo o produciendo sus propias soluciones madres de primera generación en laboratorios del gobierno o convocando licitaciones comerciales. Las vacunas de primera generación que se recogieron directamente de los animales demostraron ser eficaces; sin embargo, con frecuencia contenían impurezas y bacterias, lo que aumenta enormemente la posibilidad de reacciones adversas y complicaciones especialmente en individuos con inmunidad comprometida. Desde la erradicación de la viruela, una cantidad limitada de empresas farmacéuticas pudo intervenir rápidamente y producir vacunas contra la viruela. De ese grupo aun una menor cantidad pudo producir vacunas de segunda generación utilizando Dryvax® y las cepas vaccinia Lister-Elstree en cultivos celulares cualificados según los estándares de buenas prácticas de fabricación. Sin embargo, como ocurrió con la primera generación, estas vacunas tampoco fueron adecuadas para los individuos con inmunidad comprometida. Una vacunación colectiva con vacunas de la primera y segunda generación podría causar complicaciones que llevarían a la muerte a uno de cada millón de individuos y que causarían enfermedades graves en 10 veces más casos. Por lo tanto, aun una menor cantidad de empresas farmacéuticas ha desarrollado una vacuna de tercera generación más segura. Las vacunas de tercera generación se basan en una cepa del virus vaccinía ankara modificado (MVA) utilizada durante la campaña de erradicación de la viruela en Alemania en los años 70. En ensayos clínicos, se administró el MVA sin efectos secundarios significativos a aproximadamente 150,000 individuos, incluyendo muchos considerados en riesgo para la vacunación contra la viruela convencional. Todas estas vacunas contra la viruela se producen en fibroblastos derivados de embriones aviares primarios aislados de los embriones aviares. Estos sistemas de producción se relacionan con numerosas limitaciones graves, incluyendo: - un procedimiento de fabricación largo, complicado y que consume recursos que requiere la obtención y control de calidad de grandes cantidades de óvulos o CEF para cada campaña de producción individual; - la necesidad en muchos casos de utilizar costosos embriones aviares exentos de patógenos específicos (SPF); - los riesgos del suministro insuficiente de óvulos en casos de infecciones epidémicas en los grupos aviares donantes; - los costos inflacionarios asociados con el uso de suero bovino que procede de países libres de BSE. - la alergenicidad de los óvulos en algunos individuos; - la incapacidad de utilizar óvulos para la propagación de virus que son muy virulentos y letales para las aves. Mientras que el procedimiento de producción de fibroblastos derivados de embriones aviares y basado en óvulos sigue siendo un procedimiento relativamente fiable, un sistema eficaz de producción basado en células representaría una mejora importante en el suministro de un método más rápido, más económico y menos complicado para producir virus.
Además, en el caso de una pandemia de gripe, un procedimiento de fabricación basado en un cultivo celular ofrece ventajas adicionales: - la producción de la vacuna contra la gripe puede comenzar inmediatamente después de que se haya identificado, aislado y distribuido la cepa pandémica; - no hay necesidad de esperar el desarrollo de los llamados agrupadores de alto crecimiento (virus adaptados a un crecimiento de alto rendimiento en óvulos de gallinas embrionados) necesarios para la producción de óvulos; - la disponibilidad del lote de la primera vacuna sería de aproximadamente 9 semanas después de la recepción de la cepa, en lugar de 6 a 9 meses con el procedimiento derivado de óvulos; - un procedimiento derivado de óvulos permite la producción de cepas que no pueden crecer adecuadamente en óvulos (por ejemplo, la gripe aviar de Hong Kong en 1997); - no hay problema de escasez de óvulos durante una pandemia; Además, el uso de líneas de células para la fabricación de vacunas virales, en lugar de plataformas de fibroblastos derivados de embriones aviares u óvulos, tendrían las siguientes ventajas adicionales con relación a la inocuidad de la vacuna: no hay aditivos antibióticos en la formulación de la vacuna; no se necesitan conservantes tóxicos (como tiomersal); hay reducción en los niveles de endotoxinas, no se producen alergias a los óvulos, hay crecimiento de proteínas y medios sin suero (sin agentes adventicios/BSE), hay una gran pureza de la preparación de la vacuna contra el virus. Existe, por lo tanto, una necesidad urgente de mejorar las actuales tecnologías de producción de vacunas virales basadas en óvulos o fibroblastos derivados de embriones aviares. El desarrollo de plataformas de cultivos celulares como alternativa a los sistemas de producción de fibroblastos derivados de embriones aviares (CEF) y óvulos para la fabricación de vacunas virales es probablemente la solución más rápida y prometedora para superar los actuales problemas en la producción de la vacuna y restricciones de tiempo. Además, las tecnologías de producción de cultivos celulares mejorarían las posibilidades de avanzar en las capacidades de producción de la vacuna ante una pandemia o un ataque terrorista. Basado en estos requisitos específicos, el inventor ha aprovechado su pericia en la biología aviar y en las células madre (ES) derivadas de embriones aviares para emprender el desarrollo de nuevas líneas de células aviares estables que permiten la replicación eficaz de vacunas para uso veterinario y humano y candidatos a las vacunas y que cumplen con las especificaciones industriales, regulatorias y médicas. Utilizando un procedimiento patentado (consulte WO 03/076601 y WO 05/007840), el inventor ha generado de esta manera una serie de líneas de células bien caracterizadas y documentadas (las células EBx®) que se obtienen a partir de células madre ES derivadas de embriones aviares sin pasos de inmortalización genética, química o viral. Las células EBx® se han generado utilizando un procedimiento en 2 pasos completamente documentado y teniendo en cuenta los requisitos regulatorios: Paso 1 Aislamiento, cultivo in vitro y expansión de las células madre derivadas de embriones aviares: Las células madre derivadas de embriones son únicas porque: (i) se pueden autorrenovar indefinidamente in vitro como células indiferenciadas, (ii) tienen capacidad regenerativa ilimitada, (iii) mantienen un contenido cromosómico estable; (iv) expresan altos niveles de telomerasa y marcadores de superficie celular específicos. A pesar de los numerosos esfuerzos en todo el mundo, las células madre derivadas de embriones EM se han aislado con éxito de sólo una cantidad muy limitada de especies (ratones, humanos, monos). El inventor ha dedicado importantes recursos durante los últimos años para aislar y establecer células madre derivadas de embriones EM a partir de varias especies aviares. Dichos esfuerzos de investigación condujeron al aislamiento y caracterización con éxito de las células madre derivadas de embriones EM aviares [Pain y col. 1999. Cell Tissues Organs 165: 212-219]. El inventor luego desarrolló procedimientos patentados que permiten el cultivo in vitro eficaz y la expansión a gran escala de células madre derivadas de embriones EM aviares sin inducción de diferenciación.
Paso 2 Derivación de células EBx®: Luego, el inventor estableció un procedimiento patentado para derivar líneas de células adherentes, estables y en suspensión a partir de células madre derivadas de embriones ES aviares. El procedimiento incluye el retiro progresivo del suero, células alimentadoras y factores de crecimiento a partir de un medio de cultivo celular y la adaptación de las células a un cultivo en suspensión. Estas líneas de células aviares derivadas de embriones mantuvieron la mayoría de las características deseables de las células madre derivadas de embriones ES (es decir, proliferación indefinida, expresión de marcadores específicos de células madre derivadas de embriones ES como la telomerasa, estabilidad del cariotipo) pero además mostraron nuevas caracteristicas "que favorecen a la industria" (crecimiento en suspensión en medios sin suero). Basado en sus propiedades biológicas atractivas, el inventor seleccionó algunas líneas de células EBx® aviares para un mayor desarrollo, como las líneas de células adherentes EB45 (también llamadas S86N45 en WO 03/076601 y WO 05/007840), de las cuales se ha originado la línea de células en suspensión EB14. Más preferiblemente, las células aviares EBx® de la invención se seleccionan entre las líneas de células EB45 y EB14. En una modalidad más preferible, la línea de células aviares EBx® es la EB14 o su subclon EB14-074. Para hacerlo más sencillo, la EB14 y la EB14-074 se llamarán a partir de ahora EB14. Las células EB45 y EBM muestran un fenotipo de células madre derivadas de embriones (es decir, un alto índice núcleo-citoplasmático) en un cultivo a largo plazo (>150 pasos). Las células EB45 y EB14 son pequeñas células con un gran núcleo y nucléolo y muestran un pequeño pseudópodo que se extiende desde la membrana plasmática (figura 1 ) Las células EB45 y EB14 son muy activas metabólicamente y presentan un citoplasma rico en mitocondrias y ribosomas. Un análisis genético de células EB45 y EB14 mostró que son masculinas, diploides y genéticamente estables a lo largo de las generaciones (figura 2). Las células EB45 y EB14 expresan fosfatasa alcalina, marcadores de superficie celular específicos de células madre como EMEA-1 y SSEA-1 (figuras 5A y 5B) y el gen ENS1 específico de células madre derivadas de embriones (figura 4). De particular importancia, las células EB45 y EB14 también expresan altos niveles de actividad enzimática de telomerasa, que se mantienen estables durante los pasos (figura 3). La telomerasa en una enzima clave porque promueve el continuo crecimiento celular y actividad cromosómica. Un análisis de oncogenia de tres semanas y 2.5 meses realizado en un modelo de ratas recién nacidas con inmunidad deprimida mostró que las células EB14 no son oncógenas in vivo. Las células EB45 y EB14 se caracterizan por un tiempo muy corto de generación de aproximadamente 16 horas a 39 °C (la temperatura corporal aviar) y aproximadamente 20h a 37 °C. Estas líneas de células presentan, por lo tanto, propiedades únicas que las hacen sustratos celulares más eficaces, seguros y rentables para la producción industrial de vacunas virales como las vacunas contra la gripe y la viruela. Las células EBx®, y más específicamente las células EB14, de la invención serán de un gran valor para la fabricación de vacunas contra la gripe y viruela así como también otras importantes vacunas virales para animales y humanos (cuadro 1 ) actualmente producidas en óvulos embrionados o en fibroblastos aviares primarios, como sarampión, paperas, vacunas contra la fiebre amarilla o poxvirus en investigación contra enfermedades infecciosas como VIH o cáncer. Los datos actuales ya han demostrado la capacidad de la línea de células EBx® y más específicamente para replicar los numerosos virus recombinantes y silvestres. Por ejemplo, experimentos preliminares han establecido que las células EBx® admiten la replicación del virus contra la gripe (consulte la solicitud de patente del documento de prioridad francés FR 05 03583 presentado el 11 de abril de 2005, ejemplo 3, páginas 30 a 41 ) y virus vaccinia ankara modificado (MVA) (consulte WO 05/007840).
CUADRO 1 Las propiedades únicas enumeradas anteriormente de las células EBx®, y más específicamente las células EB14, implican el desarrollo de un procedimiento específico para la fabricación de vacunas virales en las células EBx®. Sin una teoría de apoyo, el alto nivel metabólico de las células EBx® exige que el medio de cultivo celular proporcione la energía suficiente para las células a fin de asegurar el crecimiento celular y la replicación viral. El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento de fabricación eficaz e innovador basado en las células madre derivadas de embriones aviares EBx®, más específicamente las células EBM, para la producción industrial de una vacuna viral que actualmente se produce en óvulos y fibroblastos derivados de embriones aviares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un procedimiento de replicación de un virus en células madre derivadas de embriones aviares EBx®, más preferiblemente las células EBM, dicho procedimiento comprende las etapas de: - infección de un cultivo celular EBx con un virus de interés; estas células EBx se cultivan preferiblemente en un medio sin suero animal; - cultivo de células EBx infectadas para replicar dicho virus; - cosecha del virus en un sobrenadante del cultivo celular y/o dentro de dichas células. Según una modalidad preferible, dicho procedimiento comprende las etapas de: a) proliferación de dichas EBx®, más preferiblemente las células EBM, en un recipiente de cultivo, en suspensión, en un medio sin suero N°1 ; b) infección de dichas células con el virus seleccionado cuando la densidad celular es de al menos 1.5 millones de células/ml; c) un momento antes, simultáneamente o un momento después de añadir la infección al medio sin suero del cultivo celular Nc2; y d) cultivo de dichas células infectadas para permitir la replicación del virus; y e) opcionalmente, la cosecha de dicho virus. El término "virus" como se utiliza en el presente documento se refiere no sólo a los virus naturales sino también a los virus atenuados, virus agrupadores, cepas de vacunas así como también virus recombinantes y vectores virales, etc. Los virus de la invención se seleccionaron preferiblemente del grupo formado por adenovirus, hepadnavirus, virus herpes, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, picornavirus, poxvirus, reovirus y retrovirus. En una modalidad preferible, los virus, vectores virales relacionados, partículas vírales y vacunas virales pertenecientes a la familia de poxvirus, y más preferiblemente a la de cordopoxviridae. En una modalidad, el virus o los vectores virales relacionados, las partículas virales y las vacunas virales son un avipoxvirus seleccionado entre el virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario (es decir, ALVAC), virus de la viruela del junco, virus de la viruela de los mainates, virus de la viruela de las palomas, virus de la viruela de los psitacinos, virus de la viruela de las codornices, virus de la viruela de los gorriones, virus de la viruela de los estornino pintos, virus de la viruela de los pavos. Según otra modalidad preferible, el virus es una virus vaccinia seleccionado entre la cepa del virus vaccinia Lister-Elstree, virus vaccinia modificado como el virus vaccinia ankara modificado (MVA) que se pueden obtener de la ATCC (ATCC Número VR- 1508), NYVAC (Tartaglia y col., 1992 Virology 188: 217-232), LC16m8 (Sugimoto y Yamanouchi 1994 Vaccine 12:675-681 ), CVI78 (Kempe y col., 1968 Pediatrics 42: 980-985) y demás virus vaccinia recombinantes y no recombinantes. En otra modalidad preferible, los virus, los vectores virales relacionados, las partículas virales y las vacunas virales pertenecientes a la familia de ortomixovirus, y más preferiblemente a la del virus de la gripe. El virus de la gripe se selecciona del grupo formado por el virus de la gripe humana, virus de la gripe aviar, virus de la gripe equina, virus de la gripe porcina, virus de la gripe felina. El virus de la gripe se selecciona preferiblemente entre las cepas A, B y C. Entre las cepas A, se pueden enumerar virus con diferentes subtipos de hemoglutinina y neuraminidasa, tal como sin limitación H1 N1 , H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1 , H5N2, H7N7 y H9N2. Entre las cepas H1 N1 , se pueden enumerar A/Porto Rico/8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91 , A/Singapore. Entre las cepas H3N2, se pueden enumerar A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94. Entre las cepas B, se pueden enumerar sin limitación B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1 /86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01 , B/Yamanashi/166/98. El virus de la gripe de la invención se selecciona entre los virus silvestres, aislado viral primario obtenido de un individuo infectado, virus recombinante, virus atenuado, virus sensible a la temperatura, virus adaptado a las bajas temperaturas, virus agrupador, retrovirus modificado con ingeniería genética. Si el virus de la invención es el virus de la gripe, el procedimiento de la invención comprende la etapa adicional de añadir la enzima proteolítica en el medio de cultivo en condiciones que permiten la propagación del virus. La enzima proteolítica se selecciona del grupo formado por tripsina, quimotripsina, termolisina, pepsina, pancreatina, papaína, pronasa, subtilisína A, elastasa, furina y carboxipeptidasa. Según una modalidad preferible, la enzima es la tripsina. La concentración final de tripsina en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 0.5 a 1 mg/ml hasta 25 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración final de tripsina en el medio de cultivo celular es de 0.01 a 10 usp/ml (usp: unidad farmacopea de E.U.A.) preferiblemente alrededor de 0.05 a 2 usp/ml, más preferiblemente alrededor de 0.3 a 1 usp/ml. Preferiblemente, la enzima proteolítica es una proteína recombinante producida en un huésped procariota. En otra modalidad preferible, los virus, los vectores virales relacionados, las partículas virales y las vacunas pertenecientes a la familia de paramixovirus, en particular el virus del sarampión, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas y virus de la rubéola.
En otra modalidad preferible, los virus, los vectores virales relacionados, las partículas virales y las vacunas virales pertenecientes a la familia de birnavirus, en particular el virus de la bursitis infecciosa. Los virus recombinantes incluyen, pero no se limitan a, los vectores virales que contienen un gen heterólogo. En algunas modalidades, la célula hospedadora EBx®, un virus auxiliar o un plásmido auxiliar proporcionan una función auxiliar para la replicación de virus. Los vectores representativos incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que no infectarán las células aviares o de mamíferos. El término «aviar» como se utiliza en el presente pretende referirse a toda especie, subespecíe o raza de organismos de la clase taxonómica «ava», como, pero no limitado a, organismos como pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios. El término incluye las diferentes variedades de Gallus gallus (gallo rojo) o pollos (por ejemplo, Leghorn blanco, Leghorn marrón, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Minorca, Amrox, gris de California, Italian Partridge-colored) así como también cepas de pavos, faisanes, codornices, patos, avestruces y demás aves de corral que se crían habitualmente. En una modalidad preferible, la célula aviar de la presente invención es una célula de pollo. El recipiente de cultivo de la invención se selecciona más preferiblemente entre un biorreactor tipo tanque agitado, biorreactor Wave™, biorreactor Bello™ , matraz centrifugador, matraz y una fábrica celular.
Típicamente, las células se colocan en una escala que va desde un vial del banco de células de trabajo o principal a través de varios tamaños de matraces T o frascos rotativos y, preferiblemente, finalmente a los biorreactores. La suspensión celular resultante se coloca luego generalmente en un biorreactor de producción de siembras (típicamente 20 a 30 L de volumen) para un mayor cultivo y, en algunas modalidades, en un biorreactor de mayor producción (típicamente 150 a 180L de volumen). La proporción del volumen del segundo biorreactor (más grande) con respecto al biorreactor de siembra depende del grado al que se propagó la línea de células en el primer biorreactor, pero es típicamente de 3:1 a 10:1 , por ejemplo, en el intervalo de (6 a 8): 1 . Según una modalidad preferible, el recipiente de cultivo es un biorreactor tipo tanque agitado continuo que permite el control de la temperatura, insuflación de aire, pH y demás condiciones controladas y que está equipado con: - entradas apropiadas para introducir las células, oxígeno estéril, varios medios de cultivo, etc. - salidas para quitar las células y medios; y - medios para agitar el medio de cultivo en el biorreactor. Según la presente invención, un "medio sin suero" (SFM) se refiere a un medio de cultivo celular listo para su uso, es decir, que no requiere la adición de suero permitiendo la supervivencia y crecimiento de las células. Este medio no se define necesariamente químicamente y puede contener hidrolizados de varios orígenes, por ejemplo de plantas.
Preferiblemente, dichos medios sin suero "no son de origen animal", es decir que no contienen componentes de origen animal o humano (estado FAO: "sin origen animal"). En los medios sin suero, las proteínas de suero nativas se sustituyen por proteínas recombinantes. Alternativamente, un medio sin suero según la invención no contiene proteínas (medio PF: "medio sin proteínas") y/o se define químicamente (medio CDM: "medio definido químicamente"). Los medios sin suero tienen numerosas ventajas: (i) la primera de todas es el cumplimiento regulador de dichos medios (no hay riesgo alguno de contaminación por agentes adventicios como BSE, virus); (¡i) la optímízación del procedimiento de purificación; (iii) la mejor reproducibílidad en el procedimiento debido al medio mejor definido. Ejemplos de medios sin suero disponibles en el mercado son: VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catálogo 2003), Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catálogo 2003), Episerf (InVitrogen Ref 10732-022, catálogo 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, catálogo 2003), LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM (Cambrex ref 12-766Q, catálogo 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), medio Ex cell 293 (JRH Biosciences ref 14570-1 OOOM), medio sin proteínas Ex cell 325 PF CHO (JRH Biosciences ref 14335-1 OOOM), medio Ex cell VPRO (JRH Biosciences ref 14560-1 OOOM), medio sin suero Ex cell 302 (JRH Biosciences ref 14312-1 OOOM), Ex cell 65319 (JRH Bioscíences), Ex cell 65421 (JRH Biosciences), Ex cell 65625 (JRH Biosciences), Ex cell 65626 (JRH Biosciences), Ex cell 65627 (JRH Biosciences), Ex cell 65628 (JRH Biosciences), Ex cell 65629 (JRH Biosciences), medio para terapias génicas 3 (sin componentes animales) (SIGMA-Aldrich, ref. G-9916) (de ahora en adelante llamado medio G9916). Según la primera modalidad preferible, el medio sin suero N°1 y el medio sin suero N°2 son el mismo medio. Según una segunda modalidad preferible, el medio sin suero N°1 y el medio sin suero N°2 tienen una composición diferente. Por ejemplo, el medio sin suero N°1 es Excell 65319 (SAFC Biosciences) y el Opti Pro médium (InVitrogen Ref 12309-019, catálogo 2003) puede ser el medio sin suero N°2. Según una modalidad preferible, el medio sin suero N°1 es Ex cell 65319 (JRH Biosciences). Según una segunda modalidad preferible, el medio sin suero N°1 es Ex cell 65421 (JRH Biosciences). Según una modalidad preferible, el medio sin suero N°2 es Ex cell 65319 (JRH Bíosciences). Según una segunda modalidad preferible, el medio sin suero N°2 es G9916 (SIGMA-Aldrich). El procedimiento de la invención incluye la extracción de todo o de una parte del medio sin suero 1 , seguido por su sustitución por el medio sin suero N°2. Sin embargo, es más conveniente quitar una fracción sustancial (por ejemplo, hasta aproximadamente el 50%) del medio sin suero 1 y luego reabastecerla con el medio sin suero N°2 mientras que todavía se quita el medio 1 , por ejemplo, a través del filtro recambiable. Según una modalidad preferible, el medio sin suero N°2 se añade directamente al medio sin suero N°1 sin quitar una parte del medio sin suero N°1. Se añaden de 0.25 a 10 volúmenes de medio sin suero N°2 a 1 volumen del medio sin suero N°1 . En una modalidad preferible, aproximadamente se añaden 0.5 a 8 volúmenes de medio sin suero N°2 a 1 volumen de medio sin suero N°1 . En una modalidad más preferible, aproximadamente se añade 3 a 6 volúmenes de medio sin suero N°2 a 1 volumen de medio sin suero N°1 . El medio sin suero N°1 y/o el medio sin suero N°2 se complementan con al menos un ingrediente seleccionado del grupo formado por aminoácidos, lípidos, ácidos grasos, colesterol, carbohidratos, hidrolizados proteicos de origen no animal y una mezcla de ellos. Alternativamente, el procedimiento de la invención es un procedimiento por lotes que comprende el paso adicional de alimentar las células con al menos un ingrediente seleccionado del grupo formado por aminoácidos, lípidos, carbohidratos, hidrolizados proteicos de origen no animal, tensíoactivo y una mezcla de ellos. Según una primera modalidad preferible, la alimentación se realiza durante los pasos a) a d), alternativamente sólo durante los pasos b) a d) o alternativamente sólo durante los pasos d). La alimentación puede realizarse diaria o continuamente. Cuando la alimentación es discontinua, puede realizarse una vez al día, más de una vez al día o menos de una vez al día. Los medios sin suero de la invención comprenden una cantidad de ingredientes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, fuentes de carbohidratos, cada ingrediente presente en una cantidad que permite el cultivo de una célula in vitro. Sin embargo, para mejorar el crecimiento celular o productividad viral, se añaden ingredientes adicionales a los medios sin suero. La elección de los aminoácidos que se añadirán al cultivo celular se puede determinar mediante un análisis del consumo de aminoácidos por parte de las células del cultivo. Según una modalidad preferible, los aminoácidos añadidos al medio se seleccionan del grupo formado por asparragina y glutamina o una mezcla de ellas. En una modalidad más preferible, se añade glutamina y la alimentación de glutamina se realiza durante el paso a) a d) para mantener la concentración de glutamina en el medio alrededor de 0.5 mM a alrededor de 5 mM, preferiblemente alrededor de 1 mM a alrededor de 3 mM y más preferiblemente alrededor de 2 mM. En una modalidad preferible, la alimentación de glutamina se realiza en forma continua. Según una modalidad preferible, los carbohidratos añadidos al medio se seleccionan del grupo formado por D-glucosa, D-sacarosa y D-galactosa o una mezcla de ellas. Según una modalidad más preferible, el carbohidrato añadido es la D-glucosa. La alimentación de D-glucosa se realiza durante los pasos a) a d), más preferiblemente entre b) y d) para mantener la concentración de D-glucosa en el medio alrededor de 0.5g/l a 25g/l de D-glucosa, preferiblemente alrededor de 1 g/l a 10 g/l de D-glucosa, preferiblemente alrededor de 2 a 3 g/l de D-glucosa En una modalidad preferible, la alimentación de la D-glucosa se realiza en forma continua Este resultado coincide con el número de cromosomas esperado de las células aviares CUADRO A Según una modalidad preferible, los lípidos se seleccionan del grupo formado por colesterol, esteroides y ácidos grasos como acido palmítico, ácido palmitoleico, acido esteárico, ácido oleico, ácido noleico, ácido linolenico y sus derivados o una mezcla de ellos Más preferiblemente, los ácidos grasos son de SIGMA-ALDRICH (Ref F7050) y se añade aproximadamente 0 35 ul/ml de solución de ácidos grasos al medio de cultivo Según una modalidad preferible, los hidrolizados proteicos de origen no animal se seleccionan del grupo formado por tnptona de bacterias, triptona de levadura, hidrolizados de plantas, como hidrolizados de soya o una mezcla de ellos En una modalidad preferible, el hidrolizado proteico de origen no animal es el hidrolizado de levadura El término "hidrolizado" se refiere a una digestión enzimática de peptona de soya o extracto de levadura. El hidrolizado se puede obtener de una variedad de preparaciones de peptona de soya o extracto de levadura, respectivamente, que se pueden digerir de forma enzimática (por ejemplo, con papaína) y/o formar mediante autolisís, termólisis y/o plasmolisis. Los hidrolizados también pueden obtenerse en el mercado, como Yeastolate, Hy-Soy, Hy- Yeast 412 y Hi-Yeast 444, de fuentes como JRH BioSciences (Lenaxa, KA), Quest International (Norwich, N.Y.), OrganoTechnie S.A. (Francia) o Deutsche Hefewerke GmbH (Alemania). Las fuentes de extractos de levadura también se divulgan en WO 98/15614. Las fuentes de extractos de levadura e hidrolizados de soya también se describen en WO 00/03000. Los hidrolizados utilizados en medios de la invención se purifican preferiblemente a partir de una fracción cruda porque las impurezas que pudieran interferir en el cultivo eficaz se eliminan preferiblemente durante esta purificación, mejorando así la consistencia del hidrolizado. La purificación se puede realizar por ultrafiltración o cromatografía Sephadex (por ejemplo, con Sephadex G25, Sephadex G10 o materiales equivalentes), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía "de fase inversa". Preferiblemente, la purificación se realiza mediante ultrafiltración utilizando un filtro discriminante de 10kDa. Estos procedimientos son conocidos en el campo. Utilizando estos métodos, se pueden seleccionar fracciones que contengan hidrolízados de soya o levadura de peso molecular definido. Preferiblemente, los pesos moleculares promedio de los hidrolizados de soya y levadura son preferiblemente alrededor de 220 y 375 daltons. Preferiblemente, el hidrolizado de levadura está presente en el medio de cultivo celular. El hidrolizado de levadura 50X (aproximadamente 200 g/l) obtenido del ejemplo de JRH-BIOSCIENCES (Ref 58902) está presente en el medio de cultivo celular en una concentración final que comprende alrededor de 0.1 X a 2X, preferiblemente alrededor de 0.5X a alrededor de 1X en el medio de cultivo. También se puede añadir el hidrolizado de soja al medio de cultivo celular. El hidrolizado de soya 50X obtenido del ejemplo de JRH- BIOSCIENCES (Ref 58903100M) se añade a una concentración final que comprende alrededor de 0.1 X a 2X, preferiblemente alrededor de 1X en el medio de cultivo. Alternativamente, se puede añadir una mezcla de hidrolizado de soya e hidrolizado de levadura al medio de cultivo celular como se describe en US 2004/0077086. El medio puede contener sustancias auxiliares, como sustancias reguladoras de pH como bicarbonato de sodio, estabilizantes de oxidación, estabilizantes para contrarrestar tensión mecánica o inhibidores de proteasa. En caso de ser necesario, un tensioactivo no iónico, como polipropilenglicol (PLURONIC F-61 , PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 o PLURONIC F-108) se puede añadir al medio como un antiespumante. Estos agentes se utilizan generalmente para proteger a las células de los efectos negativos de la insuflación de aire, sin añadir un agente tensioactivo, las burbujas de aire que ascienden y estallan pueden producir daños en aquellas células que se encuentren en la superficie de dichas burbujas de aire ("rociado") La cantidad de agente tensioactivo no iónico es preferiblemente alrededor de 0 05 y alrededor de 10 g/L, típicamente alrededor de 0 1 y alrededor de 5 g/L Según otra modalidad de la invención, la concentración de agente tensioactivo en el medio de cultivo celular puede disminuir para aumentar el tamaño de los paquetes celulares Según una modalidad de la invención, la adición del medio sin suero N° 2 al cultivo celular se realiza después del paso de infección b), preferiblemente alrededor de 0 5 a 4 horas después del paso b) y más preferiblemente alrededor de 1 hora después del paso b) Según otra modalidad de la invención, la adición del medio sin suero N° 2 al cultivo celular se realiza antes del paso de infección b), preferiblemente alrededor de 0 5 a 4 horas después del paso b), y mas preferiblemente alrededor de 1 hora antes del paso b) Según otra modalidad de la invención, la adición del medio sin suero N° 2 al cultivo celular se realiza simultáneamente al paso b de la infección La infección viral del paso b) se realiza a una m o i (multiplicidad de infección) de aproximadamente 10 a 10~6, preferiblemente alrededor de 10" 2 a 10~5 y más preferiblemente de alrededor de 10 4 El experto en la materia determinara la m o i óptima según el tipo de virus En el paso c), las células infectadas son preferiblemente cultivadas durante al menos 24h, al menos 48h, al menos 72h, al menos 96h, al menos 120h, al menos 144h. Si el virus es un poxvirus, las células infectadas se cultivan al menos 144 h. En el procedimiento de la invención, el cultivo celular del paso a) se lleva a cabo mediante un cultivo discontinuo, cultivo discontinuo repetido, cultivo por lote o cultivo de perfusión. Más preferiblemente, el cultivo celular del paso a) se realiza mediante cultivo por lotes. La infección en el paso b) se realiza cuando la densidad celular es al menos de alrededor de 4 millones, preferiblemente 6 millones de células/ml, más preferiblemente 8 millones de células/ml en el procedimiento discontinuo o por lotes. Cuando se realiza un procedimiento de perfusión, la infección en el paso b) se realiza cuando la densidad celular es de al menos 8 millones de células/ml, preferiblemente alrededor de 9 a 10 millones de células/ml o aun más. El pH del medio de cultivo sin suero de los pasos a), b), c) y d) se controla preferiblemente con el biorreactor. El pH estará en un intervalo de 6.5 a 7.8, preferiblemente alrededor de 6.8 a 7.5 y más preferiblemente alrededor de 7.2. En el procedimiento de la invención, el paso d) tiene una duración de 2 a 10 días antes de la cosecha. Según una modalidad preferible, el paso d) tiene una duración de 3 a 7 días antes de la cosecha. El cultivo celular se realiza a una temperatura de entre 32 °C y 39 °C dependiendo del tipo de virus. Para la producción del virus de la gripe, la infección del cultivo celular se realiza preferiblemente a 33 °C.
Las células EBx® tienen la capacidad de crecer en un cultivo en suspensión con células agrupadas en agregados sueltos de pocas células, hasta más de cientos de células. Sin una teoría de apoyo, el tamaño de los paquetes celulares puede variar según la composición del medio de cultivo celular. Por ejemplo, la presencia de un agente tensioactivo como el polipropilenglicol (PLURONIC F-61 , PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 o PLURONIC F-108) y la agitación pueden tener un efecto sobre el tamaño de los paquetes celulares. El inventor ha descubierto que la producción viral puede aumentar permitiendo que las células EBx® de la invención se agrupen entre si para formar los paquetes durante al menos el paso a) del procedimiento. Durante el avance desde un vial del banco de células de trabajo o principal a través de varios tamaños de matraces T o frascos rotativos a los biorreactores, las células en suspensión se pasan generalmente a un recipiente más grande, ya sea por dilución en un medio nuevo o por centrifugación seguida de resuspensión de sedimentos celulares en un medio nuevo. El inventor ha descubierto que durante los pasos celulares, se recomienda tener grandes paquetes celulares en el cultivo. Para esto, es mejor no fragmentar los paquetes celulares para mejorar la replicación del virus en células EBx®. Por ejemplo, durante las fases iniciales del cultivo del paso a) en matraces T o frascos rotativos, se recomienda diluir el cultivo celular para pasar las células a un recipiente más grande y no se recomienda centrifugar o fragmentar los paquetes celulares mediante traspaso por pipeta o agitación. Sin embargo, paquetes muy grandes pueden no ser del todo óptimos para una gran producción viral. En consecuencia, el experto en la materia determinará si una fragmentación parcial de los paquetes, mediante traspaso por pipeta o agitación, durante los pasos celulares iniciales del paso a) puede mejorar la producción viral. Según una modalidad preferible, los poxvirus, y preferiblemente los virus MVA, ALVAC y de la viruela aviar se obtienen a partir de un procedimiento de la invención que incluye el paso a) de la proliferación de EBx® agrupadas en agregados sueltos de pocas células, hasta más de al menos cien células, al menos doscientas células, al menos quinientas células, al menos miles de células. Esta invención también es apropiada para otros tipos de células utilizadas para propagar virus como, pero sin limitarse a, fibroblastos derivados de embriones aviares, células VERO, PerC6, MDCK y que son capaces de crecer en suspensión como los paquetes celulares. La invención también trata del virus que se obtiene mediante un procedimiento de la invención. Esta invención también trata de la vacuna que contiene el virus de la invención. El procedimiento de fabricación de una vacuna viral comprende el procedimiento de replicación de un virus según la invención donde el paso e) de la cosecha del virus está compuesto por al menos un paso seleccionado entre el filtrado, concentración, congelación y estabilización, añadiendo un estabilizador. La cosecha del virus se realiza según las tecnologías conocidas por el experto en la materia. Según una modalidad preferible, el paso de cosechar dicho virus está formado por la recolección del sobrenadante del cultivo celular, luego el filtrado, concentración, congelación y estabilización de la preparación del virus, añadiendo el estabilizador. Por ejemplo, para el virus de la gripe, consulte Furminger, In Nicholson, Webster y Hay (Eds) Textbook of influenza, capítulo 24 pág. 324-332. El procedimiento de fabricación de una vacuna viral según la invención puede también estar formado por el paso adicional de la inactivación del virus cosechado. La inactivación se realiza preferiblemente mediante tratamiento con formaldehído, betapropiolactona, éter, éter y detergente (como Tween 80™), bromuro de cetíltrimetilamonio y Tritón N 102, desoxícolato sódico y trifosfato( N-butilo). Según otra modalidad, la invención también trata de un procedimiento de preparación de proteínas antigénicas virales del virus que se obtiene a partir de un procedimiento de la invención, dicho procedimiento comprende los siguientes pasos adicionales: a) opcionalmente, la incubación del sobrenadante del cultivo celular compuesto por todo el virus con una enzima de restricción de ácido desoxirribonucleico, preferiblemente ADNasas (consulte la clasificación EC3.1 .21 y EC3.1 .22) y nucleasas (consulte la clasificación EC3.1 .30 y EC3.1 .31 ). Preferiblemente, la enzima de digestión de ADN es la benzonasa (nucleasa Benzon) o ADNasa I; b) adición de detergente catiónico. Ejemplos de detergentes catiónicos son, sin limitarse a: sal de cetiltrimetilamonio como CTAB, sal de miristílico-trimetilamonio, lipofectina, DOTMA y Tween™ ; c) aislamiento de proteínas antigénicas. Este último paso se debe realizar mediante centrifugación o ultrafiltración. El virus en la vacuna puede estar presente ya sea como partículas del virus intactas o como partículas del virus desintegradas. Según una modalidad, la vacuna es una vacuna asesinada o inactiva. Según otra modalidad, la vacuna es una vacuna viva atenuada en la que dicha vacuna principalmente comprende el sobrenadante del cultivo celular EBx que se obtiene a partir del procedimiento de la invención, preferiblemente sin suero, opcionalmente filtrado y/o concentrado y comprendiendo dicho virus. Según una tercera modalidad, la vacuna está compuesta por proteínas antígénicas virales que se obtienen a partir de un virus preparado según el procedimiento de la invención. La invención también se trata de proporcionar una vacuna compuesta por una línea de células infectadas EBx®, preferiblemente EBM, que se obtiene a partir del procedimiento de la invención y donde las líneas de células infectadas EBx®, preferiblemente EBM, se cosechan en el paso d). La vacuna de la invención puede estar formada por el virus de la invención junto con sustancias farmacéuticamente aceptables que aumentan la respuesta inmune. Los ejemplos sin limitaciones de sustancias que aumentan la respuesta inmune son adyuvante de Freund incompleto, saponina, sales de hidróxido de aluminio, lisolecitina, políoles de plutonio, polianiones, péptidos, bacilo Calmette-Guerin (BCG) y corynebacterium parvum. Un ejemplo de un adyuvante sintético es el QS-21. Además, las proteínas inmunoestimulantes (interleucinas 111 , II2, IL3, IL4, IL12, IL13, factores de estimulación colonial de macrófagos y granulocitos, etc.) se pueden utilizar para incrementar la respuesta inmune de la vacuna. La vacuna de la invención es preferiblemente una formulación líquida, una preparación congelada, una preparación deshidratada y congelada, opcionalmente adaptada a una vía de administración intranasal. La vacuna de la invención se utiliza preferiblemente para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un humano infectado con un virus seleccionado de los virus de la viruela, gripe, sarampión, paperas y rubéola. La vacuna viral recombinante de la invención también puede utilizarse para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades crónicas como el cáncer o de enfermedades infecciosas como el SIDA. Las líneas de células EBx® de la invención son válidas para generar y producir el virus reagrupado. Se puede reagrupar el virus con un genoma segmentado, como el virus de la gripe. Al infectar simultáneamente las células EBx® de la invención con al menos dos cepas diferentes del virus de la gripe, una mezcla de genoma segmentado de dos cepas diferentes está presente en la misma célula hospedadora. Durante el montaje del virus, teóricamente se pueden generar todas las combinaciones de segmentos genómicos. De esta manera, se pueden aislar virus reagrupados específicos mediante la selección o eliminación, con un anticuerpo por ejemplo, de un virus con un rasgo deseado (consulte Kilnourne E. D en Plotkin SA y Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994). Las líneas de células EBx® también son válidas para generar y producir el virus de la gripe mediante genética de reversión (consulte Enami, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:3802-3805 (1990); Enami y Palese, J. Virol. 65:251 1-2513 (1991 ); Luytjes, Cell 59:1 107-1 1 13 (1989)). La invención también trata de la composición diagnóstica que contiene virus de la invención o constituyentes de la misma. Los ejemplos a continuación desarrollan la invención detalladamente. Las siguientes preparaciones y ejemplos se presentan para que los expertos en la materia entiendan más claramente y pongan en práctica la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada en su alcance por las modalidades ejemplificadas, que tienen como objetivo ser ilustraciones de aspectos individuales de la invención únicamente y los métodos que son funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención. Es más, varias modificaciones de la invención además de las descritas en el presente serán aparentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y de los dibujos adjuntos. Dichas modificaciones pretenden estar incluidas en el alcance de las reivindicaciones incluidas. Para el resto de la descripción, se hará referencia a los nombres de las figuras anexas a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1 : Análisis mediante microscopio electrónico de transmisión de células EBM. Las células EBM presentan una morfología típica de células madre derivadas de embriones (es decir, un alto índice nucleo-citoplas ático) que se asemeja al fenotipo de las células madre derivadas de embriones murinos (mES). Las células EBM son células pequeñas y redondeadas con un gran núcleo y nucléolo con un pequeño pseudópodo que se extiende desde la membrana plasmática. Son muy activas metabólicamente y presentan un citoplasma rico en mitocondrías y ribosomas. La morfología celular de las células EBM es diferente a la de los fibroblastos derivados de embriones aviares (CEF). FIGURA 2: Análisis del cariotipo de las células EBM en los pasos 105 y 118. El análisis de células EBM cultivadas en un medio sin suero hasta los pasos 105 y 118 confirmó la naturaleza diploide de las células, con la presencia de 18 macrocromosomas y 30 microcromosomas. FIGURA 3: Expresión de telomerasa en células EBM. Se investigó la expresión de telomerasa en células EBM cultivadas en un medio sin suero en diferentes pasos utilizando el kit de detección de telomerasa de Roche (Telomerase OCR ELISA). Se encontró que la telomerasa se encuentra en altas expresiones en las células EBM. El alto nivel de expresión de telomerasa se mantiene a lo largo de los pasos, como se muestra en el paso 89, en el paso 160 (que corresponde al banco de células principal de células EBM) y en el paso 179 (que corresponde al final de los pasos de producción). Las líneas de células MDCK caninas se utilizan como control negativo y no expresan telomerasa. Se encontró una ausencia similar de expresión de telomerasa en las células de fibroblastos derivados de embriones aviares (datos no presentados). FIGURA 4: El gen ENS1 gene se expresa en las células EBM. Se describió que el gen ENS1 se expresaba específicamente en las células madre derivadas de embriones aviares (Acloque y col., Mech Dev. 103, p79-91 , 2001 ). Su expresión en las células EBM se evaluó mediante RT-PCR. Se encontró que las células madre derivadas de embriones aviares (células ES), las células derivadas de embriones aviares recolectadas en la oviposición y las células EBM en varios pasos (P21 , P159, P160) expresan fuertemente el gen ENS1 mientras que la línea de células aviares DF1 (US 5,672,485) y los fibroblastos derivados de embriones aviares (CEF) no expresan este gen. El análisis del gen GAPDH de mantenimiento se realiza en forma paralela en las mismas muestras para controlar la presencia de ARN. FIGURAS 5A y 5B: Expresión de los marcadores específicos de las células madre derivadas de embriones en la línea de células EBM (figura 5A) y la línea de células DF1 (figura 5B). Las células EBM expresan los genes EMEA1 y SSEA1 mientras que las células DF1 no lo hacen. El gen de la paxilina es un gen ubicuo utilizado como control. Las células EBM no expresan los marcadores celulares TROMA-1 , MelM, TRA-1-60 y SSEA3. FIGURA 6: Expresión de la superficie celular de los receptores SA 2-3 y SAa2-6 en líneas de células EBM y MDCK. Las células se incuban con lectinas etiquetadas con digoxigenina: la lectina aglutinina de Sambuca nigra se une a Sia2-6Gal, mientras que la lectina aglutinina de Maackia amurensis se une específicamente a Sia2-3Gal. Las lectinas que se unen a células se revelan con el anticuerpo antidigoxigenina etiquetado FICT según técnicas muy conocidas para el experto en la materia. Las células etiquetadas FICT se enumeran con un clasificador de células fluorescente (FACS). Las moléculas SAa2-3 y SAa2-6 se describen para ser los receptores de los virus de la gripe aviar y humana, respectivamente. FIGURAS 7A y 7B: Cinética del crecimiento de células EBM en un biorreactor por lotes de 3L Figura 7A: se dejó que se acumulara la bíomasa derivada de EBM a 37 °C en un medio de crecimiento celular complementado con 0.5X de Yeastolate hasta que se alcance una densidad celular de 5 a 6.106 células/mL. Luego, se diluyó la mezcla 2.9 veces y se realizó un seguimiento de la cinética del crecimiento celular durante un periodo de 10 días. La densidad celular de 13 millones de células/ml se alcanzó el día 5. Figura 7B: flexibilidad del índice de separación para la cinética del crecimiento celular de células EB-14 en un biorreactor por lotes de 3L: Luego de la siembra de células con un índice de separación de 1/10 (0.23 L a una densidad de 0.4.106 células/mL en 2.1 L de volumen final), se dejó que se acumulara la biomasa derivada de EBM en un medio de crecimiento Excell 65319 (SAFC) a 37 °C durante un periodo de 1 1 días. Las concentraciones de L-glutamina (2mM) y D-(+)-glucosa (2g/L) se ajustaron diariamente como un procedimiento por lotes y se fijaron los parámetros del biorreactor de la siguiente manera: velocidad de rotación: 80rpm, p?2: 50%, pH: 7.20. FIGURAS 8A y 8B: Influencia del medio de producción y tamaño de los paquetes celulares para la propagación del virus MVA-GFP en células EBM infectadas: Expresión del GFP. Se dejó que las células EBM formaran paquetes pequeños (8A) o grandes (8B) en matraces tipo tanque agitado T175 durante la proliferación celular en un medio sin suero de crecimiento celular (SAFC: Excell 65319). Luego se infectaron los paquetes con 10-2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en numerosos medios sin suero de producción (Optipro, Excell 65319, Excell 65629). Durante un periodo de propagación del virus de 7 días a 37 °C, se tomaron imágenes diariamente de células infectadas expuestas a UV. Control: Se utilizó optipro (INVITROGEN) como crecimiento celular y medio de producción. FIGURAS 9A y 9B: Influencia del medio de producción y tamaño de los paquetes celulares para la propagación del virus MVA-GFP en células EBM infectadas: valoración del virus infeccioso.
Se dejó que las células EBM formaran paquetes pequeños (figura 9A) o grandes (figura 9B) en matraces tipo tanque agitado T175 durante la proliferación celular en un medio de crecimiento celular (SAFC Excell 65319). Luego se infectaron los paquetes con 10~2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en numerosos medios de producción (Optipro, Excell 65319, Excell 65421 , Excell 65625, Excell 65626, Excell 65627, Excell 65628, Excell 65629, G9916). Durante un periodo de propagación del virus de 7 días a 37 °C, se recolectaron muestras diariamente y se realizó una valoración TCID50 al final de la cinética. FIGURAS 10A - 10C: Influencia del medio de producción y complementos de la propagación del virus MVA-GFP en células EBM infectadas. Se dejó que las células EBM formaran paquetes pequeños en matraces tipo tanque agitado T175 durante la proliferación celular en un medio de crecimiento celular (SAFC Excell 65319). Luego se infectaron las células con 10"2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en numerosos medios de producción (desde la figura 10A a la figura 10C: medio Excell 65319, Excell 65629 o G9916) complementado o no con 1 X de yeastolate (complemento 1 ) y/o 1 X de ácido graso (complemento 2). Durante un periodo de propagación del virus de 7 días a 37 °C, se recolectaron muestras diariamente y se realizó una valoración TCID50 al final de la cinética. FIGURA 11 : Expresión del GFP en células EB-14 infectadas con el virus MVA-GFP en un biorreactor por lotes de 3L.
Se dejó que la biomasa derivada de EBM se acumulara durante la fase de proliferación celular en el medio de crecimiento Excell 65319. Luego se infectaron las células con 10~2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en el medio de producción G9916. Luego se tomaron imágenes diariamente (magnificación X5 o X10) de células infectadas expuestas a UV a 37 °C (Pl: Post-infección). FIGURA 12: Valoración del virus infeccioso del virus de la gripe MVA-GFP derivado de EBM propagado en un biorreactor por lotes de 3L. Se dejó que la biomasa derivada de EBM se acumulara durante la fase de proliferación celular en el medio de crecimiento Excell 65319. Luego se infectaron las células con 10~2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en Excell 65319 complementado con 1 x de Yeastolate. Durante un periodo de propagación del virus de 9 días a 37 °C, se recolectaron muestras diariamente y se realizó una valoración TCID50 al final de la cinética y se comparó con las valoraciones obtenidas de las células de fibroblastos derivados de embriones aviares. FIGURA 13: Análisis mediante micrografia electrónica del virus MVA-GFP producido en células EBM. Las células EBM fueron infectadas con 10-2 TCID/célula del virus MVA-GFP y cosechadas 18h, 48h y 72h después de la infección. Se examinaron delgadas secciones de muestras fijadas y embebidas mediante micrografía electrónica (Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg).
FIGURAS MA y MB: Valoración del virus infeccioso de las múltiples cepas de gripe humana producidas por las células EBM. Se infectaron células EBM en matraces tipo tanque agitado T175 con 10~4 TCID50/célula de varias cepas de gripe humana A/H3N2, A/H1 N1 y B, en presencia de 0J5 USP/mL de tripsina recombinante. Se recolectaron muestras cada 24h y la valoración TCID50 se analizó al final de la cinética mediante la valoración de las células MDCK en ausencia de suero bovino (figura MA). Algunas células EBM infectadas se analizaron en forma paralela mediante micrografía electrónica, revelando la producción de partículas del virus de la gripe (figura MB; Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg). FIGURAS 15A y 15B: Replicación productiva de las múltiples cepas del virus de la gripe en las células EBM. Figura 15A: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de hemoglutinina (HA) en células EBM infectadas con varias cepas del virus de la gripe Las células EBM se cultivan en un medio sin suero en matraces de agitación T175 y se infectan con las cepas virales indicadas a una multiplicidad de infección de 10~4, en presencia de 0J5 USP/mL de tripsina. Se recolectan 4µL de sobrenadantes del cultivo celular y se analizan mediante electroforesis a través de SDS-PAGE del 10% y análisis de inmunotransferencia tipo Western. Las proteínas se transfirieron por adsorción a una membrana de difluoruro de polivinilideno y se detectaron subunidades sin cortar (HAO) o posteriores al corte (HA1 y HA2) de hemoglutínina medíante incubación con un suero ovino anti-hemoglutinina policlonal específico. Para la inmunotinción, se utilizó un IgG anti-ovino conjugado con una peroxidasa. Para cada cepa de virus, se compara la acumulación de hemoglutinina de una post-infección de 72h a 168h con las cantidades en aumento de los reactivos de hemoglutinina estándar derivada de óvulos. Figura 15B: Análisis SRID de niveles de producción de hemoglutinina derivada de las EBM para varios virus de la gripe. Se infectaron células EBM en matraces de agitación T175 con 10~4 TCID50/célula de varias cepas de gripe humana A/H3N2, A/H1 N1 y B, en presencia de 0J5 USP/mL de tripsina. Se recolectaron muestras cada 24h y se realizó el análisis de inmunodifusión radial simple (SRID) al final de la cinética. Para cada cepa del virus, el cálculo de acumulación de hemoglutinina se relaciona con la curva dosis-respuesta de los correspondientes antígenos estándar bien definidos. FIGURAS 16A - 16D: Producción de las cepas del virus de la gripe A/H3N2 en células EBM en biorreactores de 3L. Figura 16A y 16B: Cinética del crecimiento de las células EBM infectadas con la cepa del virus de la gripe A/H3N2/NewYork/55/2005. Se dejó que la biomasa de EBM se acumulara a 37 °C durante la fase de proliferación celular en un medio de crecimiento celular. Luego, se infectaron células con 10-4 TCID50/célula del virus de la gripe A/H3N2/New York/55/2005, la mezcla se diluyó en un medio de producción Excell65629 (medio E) complementado con 0.3 USP/mL de tripsina y la temperatura se redujo a 33 °C. Durante un periodo de propagación del virus de 10 días, se recolectaron muestras diariamente y se almacenaron a -80 °C. Figura 16A: densidad celular (x106 células/mL), figura 16B: número total de células (rombo amarillo, x107 células) y viabilidad (círculos rojos, %). Figura 16C y 16D: Análisis de hemoglutinína mediante ensayos de inmunotransferencia tipo Western y SRID. Se analizaron muestras recolectadas del biorreactor de 3L durante un periodo de post-infección de 7 días para la detección y cuantificación de la hemoglutinina producida con un suero ovino anti-hemoglutinina policlonal específico. Figura 16C: análisis de inmunotransferencia tipo Western de 4µL de sobrenadante viral al que se le realizó una inmunotinción con un anticuerpo ovino anti-hemoglutinina junto con un IgG anti-ovino conjugado con peroxidasa. Se compara la acumulación de hemoglutinina con las cantidades en aumento de reactivos estándar derivados de óvulos. HAO: subunidad de hemoglutinina sin cortar, HA1 y HA2: subunidades de hemoglutinina cortada. Figura 16D: cuantificación SRID de 10µL de sobrenadante viral. El cálculo del contenido en hemoglutinina se relaciona con una curva dosis-respuesta de los mismos reactivos estándar. FIGURAS 17A - 17C: Producción de la cepa del virus de la gripe B en células EBM en un biorreactor de 3L Figura 17A y 17B: Cinética del crecimiento de células EBM infectadas con la cepa del virus de la gripe B/Johannesburg/5/99 Se dejó que las células EBM se acumularan a 37 °C durante la fase de proliferación celular en un medio de crecimiento celular. Luego, se infectaron células con 10-4 TCID50/célula del virus de la gripe B/Johannesburg/5/99, la mezcla se diluyó en un medio de producción SAFC Excell 65629 (medio E) complementado con 0.3 USP/mL de tripsina y la temperatura se redujo a 33 °C. Durante un periodo de propagación del virus de 10 días, se recolectaron muestras diariamente y se almacenaron a -80 °C. Figura 17A: densidad celular (x106 células/mL), figura 17B: número total de células (rombo amarillo, x107 células) y viabilidad (círculos rojos, %). Figura 1 7C: Análisis de inmunotransferencía tipo Western de la hemoglutinina del virus de la gripe B/Johannesburg/5/99 derivado de las EBM. Se analizaron muestras durante un periodo de post-infección de 7 días para la detección de la hemoglutinina producida con un suero ovino anti-hemoglutinina policlonal específico. Se utilizaron 4µL de sobrenadante viral para realizar el análisis de inmunotransferencia viral tipo Western, en el que a los anticuerpos capturados con antígenos se les realizó una inmunotínción con un IgG anti-ovino conjugado con peroxidasa. Se compara la acumulación de hemoglutinina con las cantidades en aumento de antígenos estándar derivados de óvulos. HAO: subunidad de hemoglutinina sin cortar, HA1 y HA2: subunidades de hemoglutinina cortada. FIGURAS 18A - 18C: Producción de las cepas del virus de la gripe A/H1 N1 en células EBM en biorreactores de 30L.
Figura 18A: Cinética del crecimiento de las células EBM infectadas con la cepa del virus de la gripe A/H1 N1/NewCaledonia/20/99. Se dejó que las células EBM se acumularan a 37 °C durante la fase de proliferación celular en un medio de crecimiento celular. Luego, se infectaron células con 10-4 TCID50/célula del virus de la gripe A/H1 N1/NewCaledonia/20/99, la mezcla se diluyó en un medio de producción SAFC Excell 65629 (medio E) complementado con 0.3 USP/mL de tripsina y la temperatura se redujo a 33 °C. Durante un periodo de propagación del virus de 8 días, se recolectaron muestras diariamente y se almacenaron a -80 °C. Figura 18B y 18C: Análisis de hemoglutinína del virus de la gripe A/H1 N1/NewCaledonia/20/99 derivado de las EBM. Se analizaron muestras durante un periodo de post-infección de 7 días para la detección y cuantificación de la hemoglutinina producida con un suero ovino anti-hemoglutinina policlonal específico. Figura 18B: análisis de inmunotransferencia tipo Western de 4µL de sobrenadante viral en el que a los anticuerpos capturados con antígenos se les realizó una inmunotinción con un anticuerpo ovino anti-hemoglutinina junto con un IgG anti-ovino conjugado con peroxidasa. Se compara la acumulación de hemoglutinina con las cantidades en aumento de reactivos estándar derivados de óvulos. HAO: subunidad de hemoglutinina sin cortar, HA1 y HA2: subunidades de hemoglutinina cortada. Figura 18C: cuantificación SRID de 10µL de sobrenadante viral. El cálculo del contenido en hemoglutinina se relaciona con una curva dosis-respuesta de los mismos reactivos estándar.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Procedimiento de derivación de las líneas de células EBx® El procedimiento de establecimiento de las líneas de células madre derivadas de embriones aviares EBx® se ha descrito anteriormente en WO03/076601 y WO05/007840. Brevemente, este procedimiento de establecimiento de líneas de células EBx® consta de los siguientes pasos: a) aislamiento, cultivo y expansión de células aviares, preferiblemente células madre derivadas de embriones aviares, en un medio de cultivo completo que contiene todos los factores que permiten su crecimiento y en presencia de una capa alimentadora de fibroblastos de ratones, preferiblemente inactívados y complementados con suero animal; b) paso mediante modificación del medio de cultivo para obtener un retiro progresivo o total de dichos factores, de dicho suero y de dicha capa alimentadora; c) establecimiento de líneas de células aviares adherentes y no adherentes capaces de proliferar en un medio basal en la ausencia de factores de crecimiento exógenos, capa alimentadora ¡nactivada y un nivel bajo de suero o sin suero; En este caso, el medio basal del paso c) todavía consta de un nivel bajo de suero (es decir, alrededor del 2% o menos), dicho procedimiento puede constar opcionalmente de un paso adicional d) del cambio del medio basal que ya no contiene un factor de crecimiento exógeno, que ya no contiene una capa alimentadora inactivada y que contiene un nivel bajo de suero con un medio de cultivo seleccionado entre - un medio basal complementado con suero (i) y diluido con un medio sin suero, luego el cultivo durante pasos sucesivos de dichas células aviares en el medio basal (i) en el que el índice de medio sin suero aumenta progresivamente hasta la desaparición completa de dicho medio basal que no contiene un factor de crecimiento exogeno, capa alimentadora mactivada ni suero, - un medio sin suero complementado con suero (n), luego el cultivo durante pasos sucesivos de dichas células aviares en dicho medio (n) en el que el índice de suero aumenta progresivamente hasta obtener el medio sin suero, - un medio sin suero (ni), luego el cultivo de dichas células aviares en el medio (ni), luego el mantenimiento en un medio sin suero de dichas células aviares adaptadas al cambio de medio El termino "factor que permite su crecimiento" como se emplea en el presente se refiere al factor de crecimiento necesario para la supervivencia y el crecimiento de las células aviares en el cultivo Según la invención, los factores de crecimiento constan de los factores tróficos y atocinas Los factores tróficos son principalmente SCF, IGF— 1 y bFGF Las citocinas son principalmente atocinas cuya acción se realiza mediante un receptor que se asocia con la proteína gp130 como LIF, interleucina 1 1 , interleucina 6, receptor de interleucina 6, CNTF, oncostatina y cardiotrofina. Las células aviares del paso a) son células seleccionadas entre las células derivadas de embriones aviares, más preferiblemente entre las células madre derivadas de embriones aviares y células primarias aviares. En una modalidad preferible, las células son células madre derivadas de embriones aviares totipotentes o pluripotentes aisladas de una suspensión de población de células blastodérmicas en etapa X disasociadas que se obtienen a partir de un embrión aviar, más preferiblemente un embrión de pollo (consulte la clasificación EYAL-GILADI: EYAL-GILADI y KOCHAN, 1976, « From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development ¡n the chick ». "General Morphology" Dev. Biol. 49 : 321-337). Estas células madre derivadas de embriones aviares se caracterizan por un tiempo de doblado lento que va desde 48 a 72 horas en cultivo a 39 °C. La modificación del medio de cultivo del paso b) del procedimiento de establecimiento de líneas de células EBx® para obtener el retiro total o progresivo de los factores de crecimiento, suero y/o capa alimentadora se puede realizar en forma simultánea, sucesiva o separada. La secuencia de ablación del medio de cultivo se puede seleccionar entre: - capa alimentadora / suero / factores de crecimiento - capa alimentadora / factores de crecimiento / suero - suero / factores de crecimiento / capa alimentadora - suero / capa alimentadora / factores de crecimiento - factores de crecimiento / suero / capa alimentadora - factores de crecimiento / capa alimentadora / suero. En una modalidad preferible, la secuencia de ablación es factores de crecimiento / capa alimentadora / suero. Este procedimiento permite la selección de clones de células que se adaptan a estas nuevas y cada vez más drásticas condiciones de cultivo hasta que se obtienen líneas estables que son capaces de crecer en un medio reducido en suero o en un medio completamente sin suero. Las líneas EBx® establecidas son preferiblemente células madre adherentes que proliferan en suspensión en un medio sin factores de crecimiento exógenos y suero sin células alimentadoras. Por "medio de cultivo completo" se entiende un medio basal complementado con factores de crecimiento y suero animal. Un ejemplo de un medio de cultivo completo se describe en Pain y col. (1996, Development 122:2339-2348), EP 787,180 y US 6,114,168, US 5,340,740, US 6,656,479 y US 5,830,510. Según la invención, "medio basal" se refiere a un medio con una formulación clásica de medios que permite, por sí mismo, al menos la supervivencia celular y, aun mejor, el crecimiento celular. Ejemplos de medios básales son los medios SFM como los descritos anteriormente o medios como BME (medio basal de Eagle), MEM (medio mínimo de Eagle), medio 199, DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), GMEM (medio de Eagle modificado por Glasgow), DMEM-HamF12, Ham-F12 y Ham-F10, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio 5A de MacCoy, RPMI 1640. Un medio basal consta de sales inorgánicas (por ejemplo: CaCI2, KCl, NaCI, NaHC03, NaH2P04, MgS04, etc.), aminoácidos, vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido fólico, pantotenato D-Ca, etc.) y demás componentes como glucosa, beta-mercaptoetanol, píruvato de sodio. Es posible distinguir esquemáticamente dos familias de factores de crecimiento: las citocinas y los factores de crecimiento. Las citocinas son principalmente citocinas cuya acción se realiza mediante un receptor que se asocia con la proteína gp130. De esta manera, LIF, interleucína 1 1 , interleucina 6, receptor de interleucina 6, CNTF, oncostatina y cardíotrofina tienen un modo de acción similar con la incorporación a nivel del receptor de una cadena específica y la combinación de ésta última con la proteína gp130 en una forma monomérica y a veces heterodimérica. Los factores tróficos son principalmente SCF, IGF— 1 y bFGF. Más preferiblemente, el medio completo consta de un medio basal, factor de crecimiento de insulina 1 (IGF— 1 ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor de la célula madre (SCF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), opcionalmente ¡nterleucina 1 1 (IL-1 1 ) y suero animal. Las células aviares, preferiblemente las células derivadas de embriones aviares del paso a) se cultivan durante numerosos pasos en el medio completo. El medio se complementa con al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados del grupo de: LIF, IGF-1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, ?L— 1 1 , oncostatína, cardiotrofina. Según una modalidad preferible, el medio de cultivo completo es un medio basal complementado con IGF— 1 y CNTF. Según otra modalidad preferible, el medio de cultivo completo es el medio basal complementado con IGF- , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, opcionalmente IL-1 1. La concentración de los factores de crecimiento IGF— 1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, opcionalmente IL-11 en el medio basal consta de aproximadamente 0.01 a 10 ng/ml, preferiblemente, 0.1 a 5 ng/ml, y más preferiblemente alrededor de 1 ng/ml. Después de aproximadamente los pasos 3 a 10, el medio completo se reduce en factores de crecimiento (paso b). Preferiblemente, para cada factor de crecimiento, la reducción se realiza directamente en un paso, de un paso a otro. Alternativamente, la reducción del factor de crecimiento se realiza gradualmente, mediante una disminución progresiva de la concentración del factor de crecimiento en el medio completo. En una modalidad más preferible, la reducción de los factores de crecimiento se realiza simultáneamente durante al menos dos factores de crecimiento. En una modalidad preferible, cuando el medio de cultivo completo es un medio basal complementado con IGF— 1 y CNTF; la reducción de los factores de crecimiento se realiza en un ciclo de reducción. En otra modalidad preferible, cuando el medio de cultivo completo es el medio basal complementado con IGF-1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, opcionalmente IL-11 , la reducción de los factores de crecimiento se realiza en dos ciclos de reducción: en primer lugar, SCF, IL6, IL6R, bFGF opcionalmente IL11 se quitan directamente del medio completo; las células aviares se mantienen entonces en el cultivo durante al menos un paso en un medio completo que consta de IGF1 y CNTF, opcionalmente IL-11 y complementado con suero animal. En segundo lugar, IGF1 y CNTF, opcionalmente IL-1 1 se quitan directamente del medio de cultivo, que consta en última instancia del medio basal sólo complementado con suero. Habitualmente, el medio se reduce totalmente a factores de crecimiento en aproximadamente los pasos 20 a 30. En una modalidad preferible, la privación de células alimentadoras se realiza después de la privación de factores de crecimiento. La privación de células alimentadoras es progresiva y se realiza a lo largo de numerosos pasos. Las células aviares ahora se siembran en un matraz a una concentración más baja que la del paso a), aproximadamente alrededor de 4 x 104 célula/cm2 a 5 x 104 célula/cm2. Las células alimentadoras se siembran en un matraz a aproximadamente 4.2 x104 célula/cm2. Progresivamente, la concentración de las células alimentadoras en el matraz disminuye. Prácticamente, la misma concentración de las células alimentadoras se utiliza para 2 a 4 pasos, luego se utiliza una concentración más baja de células alimentadoras para 2 a 4 pasos adicionales, etc. El matraz luego se siembra con aproximadamente 4.2 x104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 2.2 x104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 1.8 x 104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 1.4 x 104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 1.1 x 104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 0.9 x 104 células alimentadoras/cm2, luego aproximadamente 0.5 x 104 células alimentadoras/cm2. Luego, el matraz se siembra con 6.5 x 104 células aviares/cm2 a 7.5 x 104 células aviares/cm2 y sin células alimentadoras. En la hipótesis de que las células aviares no estén en buena forma después de una disminución de la concentración de células alimentadoras en el matraz, entonces las células aviares se cultivan para pasos adicionales con la misma concentración de células alimentadoras antes de llevar a cabo la privación de células alimentadoras. En otra modalidad preferible, la privación de suero se realiza después de la privación del factor de crecimiento y de las células alimentadoras. El medio basal se cambia por un medio seleccionado entre: - El medio basal (i) complementado con suero y diluido con un medio sin suero nuevo (¡i). Luego las células aviares se cultivan a través de sucesivos pasos en el medio (i) en el que la proporción del medio sin suero aumenta progresivamente hasta la completa desaparición del medio basal complementado con suero (dilución progresiva). - Un medio sin suero nuevo (ii) complementado con suero. Luego las células aviares se cultivan a través de sucesivos pasos en el medio (ii) en el que la proporción del medio disminuye progresivamente hasta la obtención de un medio sin suero (ablación progresiva). - Un medio sin suero nuevo (ii) no complementado con suero.
Luego, las células aviares se encuentran directamente en el medio sin suero (ii) (ablación directa).
En una modalidad preferible, la privación de suero se realiza mediante una ablación progresiva Las células ahmentadoras son células animales que han sido preferiblemente inactivadas mediante irradiación o químicamente tratadas con mitomicina El alimentador se puede modificar genéticamente para expresar factores de crecimiento como el SCF Preferiblemente, las células alimentadoras son líneas de células de fibroblastos de ratones como STO (American Type Culture Collection ATCC N°CRL-1503) Este procedimiento lleva al establecimiento de líneas de células derivadas de embriones aviares llamadas EBx® que se mantienen en un cultivo in vitro durante un periodo de tiempo considerable De forma ventajosa, las células EBx® obtenidas en el paso c) son capaces de pro ferar durante al menos 50 días, 100 días, 150 días, 300 días o preferiblemente al menos 600 días Los 600 días no constituyen un límite de tiempo porque las células EBx® obtenidas están todavía vivas después de periodos de tiempo mucho más largos Por ejemplo, un banco de células principal de células EBM se ha producido en el paso P160 y un banco de células de final de producción de EBM se ha producido en P184 y las células EBM son todavía capaces de proliferar Por lo tanto, se considera que estas líneas pueden crecer indefinidamente en un medio de cultivo básico sin factores de crecimiento exógenos, suero y/o capa ahmentadora inactivada La expresión "línea" se refiere a toda población de células capaz de proliferar indefinidamente en un cultivo in vitro mientras mantiene a un grado mayor o menor las mismas características morfológicas y fenotípicas. Por supuesto, el método mencionado anteriormente facilita la obtención de clones celulares que derivan de células obtenidas a partir de líneas establecidas. Estos clones son células que son genéticamente idénticas a la célula de la que derivan por división. Las líneas de células establecidas y las células derivadas de las mismas (paso c o d) son preferiblemente líneas de células madre aviares derivadas de embriones, más precisamente aquellas células son células madre derivadas de embriones aviares pluripotentes. Las células madre derivadas de embriones aviares EBx® que se obtienen a partir del procedimiento de la invención son células pequeñas, redondas e individualizadas con un tiempo de doblado de aproximadamente 24 horas o menos a 39 °C. Las células que se obtienen a partir del procedimiento de la invención se encuentran al menos en el paso p60, al menos p70, al menos p80, al menos p90, al menos p100, al menos p110 al menos p120, al menos p130, al menos P150, al menos P160, al menos P170, al menos P180 o posterior. Las células madre derivadas de embriones aviares según la invención presentan al menos una de las siguientes características: - un alto índice nucleo-citoplasmático - una actividad de fosfatasa alcalina endógena - una actividad de telomerasa endógena - una reactividad con anticuerpos específicos contra SSEA-1 (TEC01 ), SSEA-3 y EMA-1 ; - expresan el gen ENS1 ; Un tiempo de doblado más corto que el tiempo de doblado de las células aviares del paso a) del procedimiento de la invención (48 a 72h a 39 °C), de aproximadamente 24 horas o menos en las mismas condiciones de cultivo. Estas líneas de células EBx® son capaces de proliferar indefinidamente en un medio basal, en particular en un medio como los medios SAFC Excell, DMEM, GMEM, HamF12 o McCoy complementados con varios aditivos comúnmente utilizados por expertos en la materia. Entre los aditivos, se pueden mencionar aminoácidos no esenciales, vitaminas y piruvato de sodio, ácidos grasos, hidrolizados de levadura y soja. Sin embargo, las células pueden proliferar en un medio basal sin glutamina. Estas líneas de células y las células derivadas de ellas presentan la característica de crecer ya sea como células adherentes o como células en suspensión. Preferiblemente, las células EBx® de la invención, preferiblemente las células EBM, presentan todas las características mencionadas anteriormente y son válidas para la producción de biologías como vacunas virales y péptídos recombinantes y proteínas (es decir, anticuerpos, etc.).
EJEMPLO 2 CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS EBM 2.1 - Cariotipo de células EBM El análisis del cariotipo de células EBM se ha realizado en Pr.
Michel Franck Laboratory, Unité de zootechnie, ethnologie et économie rurale, Ecole Nationale Veterinaire, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy l'Etoíle, Francia. Se elaboró un cariotipo para las células EBM en dos pasos diferentes (paso 105 y 1 18) utilizando técnicas estándar muy conocidas para el experto en la materia. Como era de esperar, las células EBM en los pasos 105 y 118 presentan un cariotipo diploide (figura 2): Paso 105: número modal de cromosomas = 78 (medía promedio: 78.41 - desviación estándar: 4.951 a lo largo de 53 metafases estudiadas) Paso 1 18: número modal de cromosomas = 79 (media promedio: 79.68 - desviación estándar: 3.733 a lo largo de 50 metafases estudiadas). El genoma aviar consta de dos tipos de pares de cromosomas: macro y microcromosomas. El análisis del paso 115 muestra que el número modal de macrocromosomas es 18 con una media promedio de 17.82 y una desviación estándar de 0.833 y un número modal de microcromosomas de 60 con una media promedio de 60.6 y una desviación estándar de 4.7. El análisis del paso 118 muestra que el número modal de microcromosomas es 18 con una media promedio de 18.24 y una desviación estándar de 0.797 y un número modal de microcromosomas de 60 con una media promedio de 61.44 y una desviación estándar de 3.688. No existe una desviación significativa en la distribución de cromosomas entre los dos pasos estudiados. La línea de células EBM muestra en cariotipo diploide masculino normal (ZZ) en los pasos 105 y 1 18 que demuestra la estabilidad cromosómica de células EBM. 2.2 - Análisis de oncoqenia de las células EBM en el modelo de ratas recién nacidas con inmunidad deprimida Se ha evaluado la oncogenia de las células EBM en el paso 127 en el modelo de ratas recién nacidas con inmunidad deprimida (Sanofi-Aventis, Francia) (informe técnico de la OMS N° 878 (1998). Se utilizaron células Hela como controles positivos. Se inyectaron subcutáneamente 10 millones de células EBM a diez ratas recién nacidas con inmunidad deprimida y se inyectaron subcutáneamente 10 millones de células Hela a diez ratas adicionales recién nacidas con inmunidad deprimida. Todos los animales recibieron 0.1 ml de suero de ratas anti-timocíto los días 0, +2, +7 y +14. Se observaron los animales con regularidad durante tres semanas para detectar nodulos en el lugar de la inyección. Después de 3 semanas, los animales fueron matados y examinados para detectar la proliferación celular en el lugar de la inyección y en otros órganos. No se observaron nodulos o tumores en el lugar de la inyección de células EBM o en órganos distantes. Las EBM no son oncógenas en el modelo de ratas recién nacidas con inmunidad deprimida. 2.3 - Las células EBM expresan receptores del virus de la gripe humana y aviar La detección de receptores en los virus de la gripe aviar (Sia 2-3Gal) y humana (Sia 2-6Gal) en las células EBM se realiza medíante un análisis clasificador de células fluorescente utilizando lectinas etiquetadas con digoxigenína (Boehringer): - la lectína aglutinina Sambuca nigra (SNA) se une específicamente a Sia 2-6Gal; - la lectina aglutinina Maackia amurensís (MAA) se une específicamente a Sia 2-3Gal. Las líneas de células EBM y MDCK se lavaron en 10mM de HEPES, 150mM de NaCI pH 7.5 y se resuspendieron en el mismo regulador de pH a una concentración final de 5.106. Las células se incubaron 30 min en hielo, luego durante unos 15 a 30 minutos adicionales en presencia de SNA o MAA. Las células tratadas con lectina se lavaron en 10mM de HEPES, 150mM de NaCI pH7.5, antes de la incubación en hielo durante 15 a 30 minutos con un anticuerpo antidigoxigenina etiquetado FICT. Luego, las células se lavan en 0.9% de NaCI y se analiza el FACS. Las células EBM expresan receptores de superficie celular con oligosacáridos con residuos Sia 2-6Gal y Siaa2-3Gal (figura 6).
EJEMPLO 3 PRODUCCIÓN DE MVA EN CÉLULAS EB14 3.1 - Materiales y métodos Se utilizó un virus MVA recombínante que codifica un gen de proteína fluorescente verde. Se realizó una valoración de los virus MVA-GFP infecciosos en células DF-1. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pozos de fondo plano a una densidad de 15.103 células/pozo en un medio DMEM (Biowhittaker) complementado con 5% de suero de ternero fetal (FCS) (SAFC) y 2 mM de L-glutamina (Biowhittaker). Veinticuatro horas después, las células se infectaron con muestras diluidas en serie diez veces en DMEM y se incubaron durante una semana a 37 °C, en una atmósfera húmeda con un 5% de C02. Se midió la infectividad del virus mediante observación microscópica del efecto citopático global (ECP) y de las células infectadas expuestas a UV. Luego, se calcularon las valoraciones TCI D50 según el método de Reed y Muench (1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97). 3.2- Infección en matraces de cultivo tisular 3.2.1 - Materiales Recipiente: matraz F175 (Starstedt, Ref. 83 1812502) Agitador orbital: IKA KS260 o equivalente Baño de ultrasonidos: IKA U50 (controlado con sonda US50-3) Medio: Excell 65319 (SAFC-JRH) con 2.5 mM de glutamina (Cambrex Ref. BE17605E); 3.2.2 - Métodos Paso 1 Preparación de células EBM Las células se deben preparar 2 semanas antes de empezar el experimento de infección. Día 0: Las células EBM se siembran en un matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina [1a siembra después de la rotura de los paquetes]. Las células se incuban a 37 °C, 7.5% de C02, atmósfera húmeda bajo agitación (60 rpm) Día 1 : se añaden 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 2: se añaden 50 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 3: se numeran las células. Se siembra una alícuota de células EBM en un nuevo matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de un medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Lo que representa la dilución +1.
Día 4: se añaden 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 5: se añaden 50 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Dia 6: se numeran las células. Se siembra una alícuota de células EBM en un nuevo matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de un medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Lo que representa la dilución +2. Luego, la amplificación de las células continúa así hasta formar una dilución que consta de preferiblemente entre +3 a +7, más preferiblemente +3 a +5. Luego se debe continuar con el paso 2 de la infección de células. Para obtener un cultivo celular con grandes células EBx® agrupadas (de ahora en adelante llamado: condiciones de "grandes paquetes"), cuando las células pasan por dilución a recipientes más grandes, las células EBx® no se centrifugan y los paquetes no se rompen mediante traspaso por pipeta o agitación. Por otro lado, para obtener un cultivo celular sin una proporción sustancial de células EBx® agrupadas, los paquetes se fragmentan mediante traspaso por pipeta o agitación cuando pasan las células (de ahora en adelante llamadas: condiciones "sin paquetes").
Paso 2 Infección de células EBM con MVA-GFP (proteína fluorescente verde) Día 1 : las células EBM se siembran en un matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 40 ml de medio JRH Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Las células se incuban a 37 °C, 7.5% de C02, atmósfera húmeda bajo agitación (60 rpm). Días 2 y 3: se numeran las células. Día 4: se numeran las células. Cuando la densidad celular en el matraz es de aproximadamente 4x106 céiulas/ml, las células EBM se infectan con una MOI de 0.01 TCID50/célula con 1 ml de mezcla de infección viral por matraz. Se prepara la mezcla de infección viral justo antes de su uso mediante una dilución del virus en el medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Cada inoculo se somete a ultrasonidos durante 30 segundos (amplitud 100% y ciclo continuo) en hielo en un tubo Falcon™ de 15 ml. El inoculo se calienta a temperatura ambiente antes de la mezcla con el cultivo celular. Después de la inoculación, el medio de cultivo infectado se incuba 1 h a 37 °C. Luego, se añaden al matraz 60 ml del medio nuevo Excell 65319 complementado con 2.5 mM de glutamina, O.dx de Yeastolate y 0.35ml/L de ácidos grasos. El cultivo celular infectado se incuba a 37 °C durante al menos 144h (nótese bien: el pico de producción viral se encuentra entre pi + 72 h y pi + 120 h).
Las muestras de cultivo celular (1 mL) se recolectan cada 24h y se mantienen congeladas a -80°C. Antes de la recolección de las muestras, se homogeniza el cultivo celular mediante traspaso suave por pipeta. Se realiza una valoración del virus en cada muestra recolectada al final del experimento utilizando el método de Reed y Muench TCID50/mL (1938). 3.3- Infección en centrifugador 3.3.1 - Materiales Recipiente: frasco centrifugador de 500 ml y 1 litro (Corning) Agitador orbital: IKA KS260 o equivalente Baño de ultrasonidos: IKA U50 (controlado con sonda US50-3) Medio: Excell 65319 (SAFC-JRH) con 2.5 mM de glutamina (Cambrex Ref. BE17605E); 3.3.2 - Método Paso 1 Preparación de células EBM Las células se deben preparar 2 semanas antes de empezar el experimento de infección.
Día 0: las células EBM se siembran en un matraz F1 75 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina [1 a siembra después de la rotura de los paquetes]. Las células se incuban a 37 °C, 7.5% de C02, atmósfera húmeda bajo agitación (60 rpm) Día 1 : se añaden 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 2: se añaden 50 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 3: se numeran las células. Se siembra una alícuota de células EBM en un nuevo matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de un medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Lo que representa la dilución + 1. Día 4: se añaden 25 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 5: se añaden 50 ml de medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Día 6: se numeran las células. Se siembra una alícuota de células EBM en un nuevo matraz F175 a 0.4x106 células/mL en 25 ml de un medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Lo que representa la dilución +2. Luego, la amplificación de las células continúa así hasta formar una dilución que consta de preferiblemente entre +3 a +7, más preferiblemente +3 a +5. Luego se debe continuar con el paso 2 de la infección de células. Para obtener un cultivo celular con grandes células EBx® agrupadas (de ahora en adelante llamados: "grandes paquetes"), cuando las células pasan por dilución a recipientes más grandes, las células EBx® no se centrifugan y los paquetes no se rompen mediante traspaso por pipeta o agitación. Por otro lado, para obtener un cultivo celular sin una proporción sustancial de células EBx® agrupadas, los paquetes se fragmentan mediante traspaso por pipeta o agitación cuando pasan las células (de ahora en adelante llamadas: "sin paquetes").
Paso 2 Infección de células EBM con MVA-GFP Día 1 : Las células EBM se siembran en un frasco centrifugador de 500 ml (o 1000 ml) a 0.4x106 células/mL en un medio de 150 mL (o 300ml) JRH Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Las células se incuban a 37 °C, 7.5% de C02, atmósfera húmeda bajo agitación (100 rpm). Días 2 y 3: se numeran las células. Día 4: se numeran las células. Cuando la densidad celular en el centrifugador es de aproximadamente 4x106 células/ml, las células EBM se infectan con una MOI de 0.01 TCID50/célula con 1 ml de mezcla de infección viral por frasco centrifugador. Se prepara la mezcla de infección viral justo antes de su uso mediante una dilución del virus en el medio Excell 65319 con 2.5mM de glutamina. Cada inoculo se somete a ultrasonidos durante 30 segundos (amplitud 100% y ciclo continuo) en hielo en un tubo Falcon™ de 15 ml. El inoculo se calienta a temperatura ambiente antes de la mezcla con el cultivo celular. Después de la inoculación, el medio de cultivo infectado se incuba 1 h a 37 °C. Luego, se añaden al matraz 60 ml del medio nuevo Excell 65319 complementado con 2.5 mM de glutamina, 0.5x de Yeastolate y 0.35ml/L de ácidos grasos en un frasco centrifugador de 500ml (o 1000 ml). El cultivo celular infectado se incuba a 37 °C durante al menos 144h (nótese bien: el pico de producción viral se encuentra entre pi + 72 h y pi + 120 h). Las muestras de cultivo celular (1 mL) se recolectan cada 24h y se mantienen congeladas a -80°C. Antes de la recolección de las muestras, se homogeniza el cultivo celular mediante traspaso suave por pipeta. Se realiza una valoración del virus en cada muestra recolectada al final del experimento utilizando el método de Reed y Muench TCID50/mL (1938)*. *Reed L & Muench H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97. 3.4 - Infección en biorreactor tipo tanque agitado de 3L 3.4.1 Método Descongelación de células Se almacenan crioviales de células en nitrógeno líquido a -196 °C; cada criovial contiene 20.106 células. El criovial se congela directamente en un baño de agua precalentado a 37 °C para descongelar el vial congelado rápidamente. La suspensión celular se coloca con una pipeta en un tubo estéril PP de 50 mL con 30 mL de medio de cultivo pre-calentado. La suspensión celular se centrifuga durante 5 min a 300 ±20g, a temperatura ambiente, el sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspende en 15 ml del medio de cultivo nuevo y se homogeniza suavemente. La suspensión celular se coloca en un matraz de T75 cm2 y se incuba a 37 °C en una atmósfera con 7.5% de C02 en un agitador orbital a 50 rpm. Después de 24 horas y 48 horas de cultivo, se añaden 15 ml del medio de cultivo pre-calentado al cultivo celular. Después de 72 horas de cultivo, se recolecta una muestra (después de la homogeneización a granel) y se realiza una numeración: se esperan > 40.106 células. Luego se realiza la primera amplificación. Primera amplificación celular: centrifugación, disociación y dilución.
Las células en suspensión se recolectan del matraz y se colocan en un tubo estéril PP de 50 mL. Después de 5 min de centrifugación a 300 ±20 g, a temperatura ambiente, el sobrenadante se desecha y se añaden 10 mL del medio de cultivo nuevo pre-calentado en el sedimento. Los paquetes celulares se disocian suavemente con una pipeta de 10 mL y las soluciones celulares se combinan en un tubo estéril PP de 50 mL, en caso de ser necesario. El volumen del cultivo se completa hasta 20 mL con el medio de cultivo nuevo pre-calentado, en caso de ser necesario. Se realiza una numeración utilizando un azul de tripano para determinar la densidad celular y la viabilidad celular (la viabilidad celular se encuentra generalmente en aproximadamente el 80%). En 1 matraz de T1 75 cm2, se siembran 0.4.106 células. mL"1 en el medio de cultivo pre-calentado de 40 ml. El cultivo celular se incuba a 37 °C en una atmósfera con 7.5 % de C02 en un agitador orbital a 50 rpm. El día 2, se añaden 60 ml del medio de cultivo pre-calentado al cultivo celular. El día 3, se realiza la dilución celular. Dilución +1 a +5 (sin centrifugación, sin disociación, sólo dilución). Se toma una muestra del matraz T175 (después de mezclar suavemente) para realizar una numeración utilizando un azul de tripano para determinar la densidad celular. Se toma una muestra del matraz T175 (después de mezclar suavemente) para sembrar 0.4.106 células. mL"1 en 1 matraz T1 75 cm2 en un volumen total de 25 ml medio de cultivo precalentado. Lo que representa la dilución +1 .
El día 1 , se añaden 50 ml de medio de cultivo pre-calentado. El día 2, se realiza la dilución +2 utilizando la misma forma utilizada para la dilución+1 (consulte más arriba). La amplificación celular se realiza de esta manera, hasta formar la dilución +3 a +5. El inoculo para el biorreactor de 3L se puede preparar a partir de la dilución +3 hasta la dilución +5. Se preparan dos matraces T175 como inoculo.
Siembra de células en un biorreactor tipo tanque agitado de 3L Siembra - Dia 0 Se prepara el inoculo (se necesitan 320.106 células para inocular el biorreactor de 3L). Se combinan 2 matraces T175. Se toma una muestra después de mezclar suavemente (los paquetes celulares no deben romperse) para realizar una numeración utilizando un azul de tripano para determinar la densidad celular. Se prepara una mezcla celular de 150 mL para obtener una concentración celular de 0.40.106 células. mL"1 en el volumen del cultivo final de 800 ml en el biorreactor. Antes de las células de siembra, se determina el pH en el recipiente a 7.2 (porque el pH disminuirá por la inyección de superficie de C02). El p02 se determina en saturación de 50% de 02 (el regulador de caudal-masa se ajusta en 100 % lo que corresponde a una velocidad de flujo del rociado máxima a 50 mL.min"1). Al inicio del procedimiento, el pH se mantiene con una inyección de superficie de C02, más adelante, se controla añadiendo 7.5 % de NaHC03. La insuflación de aire de superficie se inicia con aire a una velocidad de flujo de 0.3 mL.min"1.
Seguimiento del cultivo / Adición de la alimentación (Día 1 , Dia 2 La numeración celular se realiza en forma rutinaria. Los metabolitos como glutamato, glutamina, lactato y glucosa se analizan durante todo el cultivo con el software BioProfile Basic. La concentración de metabolitos se ajusta, en caso de ser necesario. Por ejemplo, la concentración de glutamina se ajusta a 2 mM.
Infección con MVA-GFP (Dia 3) Después de 3 días de cultivo, la densidad celular debería ser mayor a 3.106 células. mL"1. Si se alcanza la densidad celular diana (3 a 5.106 células. mL"1), se realiza la infección del virus a una MOI de 10"2 TCÍDso/célula. La cepa del virus se congela en hielo. La mezcla de la infección se prepara en un tubo estéril PP de 50 mL con 10 mL del medio de producción. La mezcla se somete a ultrasonidos durante 30 segundos (amplitud 100% y ciclo continuo) en hielo. La mezcla de la infección se inocula en el biorreactor. Después de 1 hora de adsorción viral, el medio de producción final se añade al reciente. El medio de producción de Excell 65319 en 1.5 L se complementa con Yeastolate y ácidos grasos a una concentración final de respectivamente 0.5X y 0.35ml/L (volumen final: 2.3L).
Producción siguiente/Adición de la siembra (Día 4, Día 5, Día 6, Día 7, Día 8, Día 9, Día 10) El pico de producción viral de MVA se alcanza entre las 72h y 120h posteriores a la infección. Todos los días, se recolecta una muestra de aproximadamente 15 ml del biorreactor para realizar la numeración celular, análisis de morfología celular y para observar el ECP. Los metabolitos como glutamato, glutamina, lactato y glucosa se analizan durante todo el cultivo con el software BioProfile Basic. La concentración de metabolitos se ajusta, en caso de ser necesario. Por ejemplo, la concentración de glutamina se ajusta a 2 mM, en caso de ser necesario. La concentración de glucosa se ajusta a 2 g.L"1, en caso de ser necesario.
Análisis Se realiza la valoración del virus al final del experimento utilizando todas las muestras recolectadas. 3.5 - Resultados 3.5.1 - Cinética del crecimiento celular de células EBM en un biorreactor por lotes de 3L Las células EBM se cultivan en forma rutinaria en un biorreactor tipo tanque agitado. Se deja acumular la biomasa derivada de EBM a 37 °C en un medio de crecimiento celular hasta que se alcance una densidad celular de 5 a 6.106 células/mL. Luego, se diluye la mezcla 3 veces y se realiza un seguimiento de la cinética del crecimiento celular durante un periodo de 10 días. En tales condiciones, se alcanza la densidad celular de 12 a 16 millones de células/ml habitualmente alrededor del día 5 a 8 (figura 7A). Se puede aumentar el índice de separación de las células EBM. La figura 7B muestra una cinética de crecimiento de células EBM diluidas 10 veces. 3.5.2 - Flexibilidad de las células EB-14: purificación de colonias del virus MVA-GFP en células adherentes Las células EBM crecen en un cultivo de suspensión. Sin embargo, las células EBM también tienen la capacidad de crecer en adherencia en matraces y placas. Esta característica permite a los inventores realizar la purificación de colonias de MVA-GFP en células EBM adherentes. Para realizarlo, se inocularon diluciones seriadas diez veces del virus MVA-GFP en células EB-14 adherentes sembradas en placas de 6 pozos 24h antes a una densidad de 7.104 células/cm2. Después de la adsorción viral, las células fueron estratificadas con una mezcla de 1.2% de LMP agarosa/2.5% de FCS DMEM e incubadas a 37 °C durante varios días. Finalmente, los pozos se tiñeron con un rojo neutro. Luego, se puede calcular la valoración de la unidad de formación de colonias con diluciones proporcionando placas aisladas. 3.5.3 - Influencia del medio de producción y tamaño de los paquetes celulares para la propagación del virus MVA-GFP en células EBM infectadas Se dejó que las células EBM formaran paquetes pequeños o grandes en matraces tipo tanque agitado T175 durante la proliferación celular en un medio de crecimiento celular (Excell 65319). Luego se infectaron los paquetes con 10"2 TCID50/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en numerosos medios de producción (Optipro, Excell 319, Excell 421 , Excell 625, Excell 626, Excell 627, Excell 628, Excell 629, G9916). La presencia de grandes paquetes de células EBM mejora la infección y propagación del virus (figuras 8A y 8B), causando valoraciones del virus MVA más altas (figuras 9A y 9B). La adición de complementos como yeastolate (complemento 1 ) y ácidos grasos (complemento 2) en el medio de producción del virus mejora aun más las valoraciones del virus MVA. Como se muestra en las figuras 10A a 10C, cuando el 1X de yeastolate (complemento 1 ) se añade solo en el medio, la producción viral de MVA-GFP aumenta y se obtiene un efecto sinérgico cuando se añade yeastolate (complemento 1 ) y ácidos grasos (complemento 2) en el medio de cultivo celular. Es más, 1X de ácido graso solo no aumenta las valoraciones virales. 3.5.4 - Producción del virus MVA en un biorreactor de 3L Se dejó que la biomasa derivada de EBM se acumulara durante la fase de proliferación celular en el medio de crecimiento Excell 65319. Luego se infectaron las células con 10"2 TCID 0/célula del virus MVA-GFP y se diluyó la mezcla en el medio de producción Excell 65319. Después de la adición de Excell 65319, la densidad celular disminuyó (día 3) y el día 5, la densidad celular de las células infectadas aumentó y alcanzó 4 millones de células/ml. El hecho de que no se realice una centrifugación durante la amplificación celular permite obtener un gran tamaño de paquetes en la postinfección de 2 a 4 dias del cultivo (figura 11 ). En tales condiciones, la productividad de MVA-GFP es alta. Desde la post-infección del día 6, la valoración del MVA-GFP es aproximadamente 108 32 TCID50/ml (concentración celular de 1.49x106 células/ml) que corresponde a TCID50/célula = 414 (factor de amplificación 41000) (figura 12). Parece que cuando las células EBM se amplifican sin fragmentar los paquetes (por dilución por ejemplo), se obtiene una valoración viral más alta en un biorreactor de 3L en comparación con la obtenida en ausencia de grandes paquetes (factor de amplificación de aproximadamente 1900 y TCID50/célula = 19) en el cultivo celular. 3.5.5- Ultraestructura normal de las células EBM infectadas con MVA Se analizaron las células EBM infectadas con el virus MVA mediante micrografía electrónica (Dr. Daniele Spehner y Robert Drillien, IGBMC, Strasbourg Francia). La maduración del virus MVA producido en las células EBM es normal y similar a la observada en los fibroblastos derivados de embriones aviares primarios.
EJEMPLO 4 PRODUCCIÓN DEL VIRUS DE LA GRIPE EN CÉLULAS EBM 4.1 - Materiales y métodos 4.1.1 - Ensayo de infectividad del virus de la gripe (TCID50) Se realizó la valoración de los virus infecciosos de la gripe en células MDCK. En breve, las células se siembran en placas de 96 pozos de fondo plano a una densidad de 3.103 células/pozo en un medio UltraMDCK complementado con 2.5 mM de L-glutamina. Veinticuatro horas después, las células se infectaron con muestras diluidas en serie diez veces en UltraMDCK con 6µg.mL"1 de tripsina-EDTA e incubadas durante una semana a 33°C, en una atmósfera húmeda con un 5% de C02. Luego se analizó la replicación del virus en un ensayo de hemoglutinina utilizando eritrocitos aviares y se calcularon valoraciones de TCI D50 según el método de Reed y Muench (1938)*. *Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97. 4.1.2 - Ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID) Se determinó la concentración de hemoglutinína en muestras derivadas de las células EBM infectadas con el virus de la gripe según lo descrito por Wood y sus colegas*. Brevemente, las placas de vidrio se revistieron con un gel de agarosa con suero anti-gripe (se recomienda la concentración proporcionada por NIBSC). Después de que se coloca el gel, se colocaron 10 µL de las diluciones apropiadas de la referencia y las muestras en pozos perforados 0 de 3mm. Después de una incubación de 18 a 24 h en una cámara húmeda a temperatura ambiente, las placas se remojaron en 0.9% de NaCI y se lavaron en agua destilada. Luego, el gel fue presionado y secado. Las placas se tiñeron con una solución azul brillante de Coomassie durante 15 min y se les quitó el tinte dos veces en una mezcla de metanol y ácido acético hasta que estuvo claramente definido que las zonas teñidas se volvieron visibles. Después de secar las placas, el diámetro de las áreas teñidas alrededor de los pozos de los antígenos se midió en dos direcciones en los ángulos derechos. Se realizaron las curvas dosis-respuesta de diluciones de antígenos sobre la superficie y se calcularon los resultados según los métodos de ensayo de razón de la pendiente estándar. *Wood JM. y col. "An improved single-radial- immunodíffusion technique for the assay of influenza haemagglutínin antígen: applicatíon for potency determinations of inactívated whole virus and subunit vaccines". J Biol Stand. 1977;5(3):237-47). 4.1.3 - Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la proteína hemoglutinina de la gripe Se realizó un SDS-PAGE como lo describe Laemmli UK (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685) en el gel de políacrilamida al 10%. Se transfirieron proteínas desnaturalizadas (SDS al 1 %, 70mM de ß-mercaptoetanol) a una membrana de difluoruro de polivinilideno (hybond P, Amersham) mediante un procedimiento de transferencia semiseco (Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of múltiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteíns from polyacrylamíde to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods 10:203-209). Las transferencias se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con una mezcla de 5% de leche en polvo rica en materia grasa en TBST complementado con FCS al 1 % (SAFC). Luego, las transferencias se incubaron durante toda la noche en una solución de bloqueo complementada con suero ovino anti-hemoglutinina policlonal específico (1 :500 (NIBSC). Las transferencias se lavaron 6 veces con TBST y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal IgG anti-ovino de conejo conjugado a HRP (1 :5000 (Rockiand) en la solución de bloqueo. Después de 6 lavados con TBST, el complejo conjugado a proteínas se reveló finalmente utilizando quimioluminiscencia (ECL kit, Amersham) y películas (Hyperfilm, Amersham). 4.2 - Infección con virus de la gripe de células EBM en un biorreactor de 3L 4.2.1 - Materiales y equipamiento Material de descongelamiento de células Matraces de T75 cm2 (Sarstedt, Cat# 831813502) Medio de cultivo (medio sin suero) 200 mM de L-glutamina (Bíowhittaker, Cat# BE17-605E) Agitador orbital IKA KS260 (Fisher Bioblock, Cat# F35044) Material de amplificación celular Matraces de T175 cm2 (Sarstedt, Cat# 831812502) Medio de cultivo (medio sin suero): Excell 65319 (JRH, Cat# 65319-1 OOOM 1687) añadido con 2.5mM de glutamina 200 mM de L-glutamina (Biowhittaker, Cat# BE17-605E) Solución Yeastolate UF 50X (JRH, Cat# 58902-100M) D (+) glucosa (45%) (Sigma, Cat# G8769) Material de producción Medio de producción (medio sin suero): Excell 65629 (JRH, Cat# 65629) complementado con 2.5 mM de gln Solución Yeastolate UF 50X (JRH, Cat# 58902-100M) 200 mM de L-glutamína (Biowhittaker, Cat# BE17-605E) D (+) glucosa (45%) (Sigma, Cat# G8769) Tripsina (Trypzean 1 X, Sigma, Cat# T3449) Solución de bicarbonato de sodio al 7.5 % (Sigma, Cat# 205- 633-8) Cepa del virus de la gripe (congelada a -80°C) 4.2.2 - Método Descongelación de células Se almacenan crioviales de células en nitrógeno líquido a -196 °C; cada criovial contiene 20.106 células. El criovial se descongela directamente en un baño de agua pre-calentado a +37 °C. La suspensión celular se coloca con una pipeta en un tubo estéril PP de 50 mL con 30 mL de medio de cultivo pre-calentado. Después de la centrifugación (5 min a 300 ±20 g, a temperatura ambiente), se añade 15 mL de medio de cultivo nuevo en el sedimento y se debe homogeneizar suavemente. La muestra se numera utilizando el azul de tripano. La numeración tiene que ser > 20.106 células y la viabilidad tiene que ser > 70 % para garantizar un buen cultivo. La suspensión celular se coloca en un matraz de T75 cm2 y se incuba a + 37 °C en una atmósfera con 7.5% de C02 en un agitador orbital a 50 rpm. Después de 24 horas y 48 horas de cultivo, se añaden 15 ml del medio de cultivo precalentado al cultivo. Después de 72 horas de cultivo, se recolecta una muestra (después de la homogeneización a granel) y se numera: se esperan 20 a 30.106 células. Luego se realiza la primera amplificación. Primera amplificación celular: centrifugación, disociación y dilución La célula en suspensión se recolecta del matraz y se coloca en un tubo estéril PP de 50 mL y se centrifuga durante 5 min a 300 ±20 g, a temperatura ambiente. Se añaden 10 mL del medio de cultivo nuevo precalentado al sedimento. Los paquetes celulares se disocian suavemente y se agrupan las suspensiones celulares; el volumen se completa hasta 40 mL con el medio de cultivo nuevo pre-calentado. En 1 matraz de T1 75 cm2, se coloca 0.25.106 células. mL"1 en 40 ml de un medio pre-calentado y se incuba a +37 °C en una atmósfera con 7.5 % de C02 en un agitador orbital a 50 rpm. El día 2, se añaden 60 ml del medio de cultivo pre-calentado. El día 3, se realiza un segundo ciclo de amplificación.
Siembra de células en un biorreactor tipo tanque agitado de 3L Siembra - Día 0 Se prepara el inoculo (se necesitan 320.106 células para inocular el biorreactor de 3L). Se combinan 2 matraces T175. Se toma una muestra después de mezclar suavemente (los paquetes celulares no deben romperse) para realizar una numeración utilizando el azul de tripano para determinar la densidad celular. Se prepara una mezcla celular de 150 mL para obtener una concentración celular de 0.40.106 células. mL"1 en el volumen del cultivo final de 800 ml en el biorreactor. Antes de las células de siembra, se determina el pH en el recipiente a 7.2 (porque el pH disminuirá por la inyección de superficie de C02). El p02 se determina en saturación de 50 % de 02 (el regulador de caudal-masa se ajusta en 100 % lo que corresponde a una velocidad de flujo del rociado máxima a 50 mL.min"1). Al inicio del procedimiento, el pH se mantiene con una inyección de superficie de C02, más adelantes, se controla añadiendo 7.5 % de NaHC03. La insuflación de aire de superficie se inicia con aire a una velocidad de flujo de 0.3 mL.min"1.
Seguimiento del cultivo / Adición de la alimentación (Día 1 , Día 2} La numeración celular se realiza en forma rutinaria. Los metabolitos como glutamato, glutamina, lactato y glucosa se analizan durante todo el cultivo con el software BioProfile Basic. La concentración de metabolitos se ajusta, en caso de ser necesario. Por ejemplo, la concentración de glutamina se ajusta a 2 mM.
Infección - Dia 3 Después de 3 días de cultivo, la densidad celular tiene que estar por encima de 4-5.106 células. mL"1. Si se logra la densidad celular diana, la infección del virus se realiza a una MOI de 10"4. La temperatura del recipiente se fija en 33 °C. La cepa del virus se descongela en hielo. La mezcla de la infección se prepara en 10 mL del medio de producción. Después de la inoculación de la mezcla de la infección en el biorreactor, se realiza la adsorción viral durante 1 hora. Se prepara el medio de producción final: en 1 .5 L del medio de producción, se añade la tripsina para obtener una concentración final en el recipiente de 0.3 U.mL"1 (2.3 L en total) y se añade 0.5X de Yeastolate. Luego se añade el medio de producción final precalentado.
Producción siguiente / Adición de la alimentación (Día 4, Día 5, Dia 6, Dia 7, Día 8, Día 9, Día 10) Todos los días, se recolecta una muestra de aproximadamente 15 ml del biorreactor para realizar la numeración celular, análisis de morfología celular y para observar el ECP. Los metabolitos como glutamato, glutamina, lactato y glucosa se analizan durante todo el cultivo con el software BioProfile Basic. La concentración de metabolitos se ajusta, en caso de ser necesario. Por ejemplo, la concentración de glutamina se ajusta a 2 mM, en caso de ser necesario. La concentración de glucosa se ajusta a 2 g.L"1 , en caso de ser necesario.
Análisis Al final del experimento, se realizan una valoración del virus, ensayo de hemoglutinina (HAU) y cuantificaciones de antígeno hemoglutinina (inmunotransferencia tipo Western, SRID) utilizando todas las muestras recolectadas. 4.3 - Resultados Los inventores demuestran que las células EBM son un sustrato celular fiable y eficaz para la replicación de varias cepas A y B del virus de la gripe. La producción del virus de la gripe se puede realizar en varios recipientes, como matraces y agitadores (datos no presentados) y biorreactores. Los inventores obtuvieron un procedimiento por lotes eficaz y reproducible de producción del virus de la gripe en biorreactores tipo tanque agitado de 3L y 30L. Se logran rutinariamente productividades por encima de 25 mg/l de hemoglutinina en matraces y se logran rutinariamente productividades por encima de 35 mg/l de hemoglutinina en matraces con cepas A y B del virus de la gripe.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un procedimiento de replicación de un virus seleccionado del grupo formado por adenovirus, hepadnavirus, virus herpes, ortomixovirus, papovavirus, paramixovírus, picornavirus, poxvirus, reovirus y retrovirus, en células madre derivadas de embriones aviares EBx®, dicho procedimiento consta de los siguientes pasos: a) proliferación de dichas células EBx® en un recipiente de cultivo, en suspensión, en un medio sin suero N°1 ; b) infección de dichas células con el virus seleccionado cuando la densidad celular es de al menos 1.5 millones de células/ml; c) un momento antes, simultáneamente o un momento después de añadir la infección al medio sin suero de cultivo celular N°2; y d) nuevo cultivo de dichas células infectadas para permitir la replicación del virus; y e) opcionalmente, la cosecha de dicho virus. 2.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el recipiente del cultivo es un biorreactor tipo tanque agitado continuo. 3.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado además porque el medio sin suero N°1 y el medio sin suero N° 2 son el mismo medio. 4 - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado además porque el medio sin suero N°1 y el medio sin suero N° 2 tienen una composición diferente. 5.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque se añaden entre 0.25 a 10 volúmenes del medio sin suero N°2 al medio sin suero N°1. 6.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el medio sin suero N°1 y/o el medio sin suero N°2 se complementan con al menos un ingrediente seleccionado del grupo formado por aminoácidos, lípidos, ácidos grasos, colesterol, carbohidratos, hidrolizados proteicos de origen no animal y una mezcla de ellos. 1.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque consta del paso adicional de alimentar las células con al menos un ingrediente seleccionado del grupo formado por aminoácidos, ácidos grasos, carbohidratos, hidrolizados proteicos de origen no animal y una mezcla de ellos. 8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la alimentación se produce durante los pasos a) a d), preferiblemente durante los pasos b) a d). 9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la alimentación se produce diariamente. 10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la alimentación se produce continuamente. 1 1.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la alimentación se produce más de una vez al día. 12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la alimentación se produce menos de una vez al día. 13.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado además porque se seleccionan los aminoácidos del grupo formado por asparragina y glutamina o una mezcla de ellas. 14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la alimentación de glutamina se realiza durante el paso a) a d) para mantener la concentración de glutamina en el medio entre 0.5 mM a 5 mM, preferiblemente alrededor de 2 mM. 15.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado además porque se seleccionan los carbohidratos del grupo formado por D-glucosa y D-galactosa o una mezcla de ellas. 16.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la alimentación de D-glucosa se realiza durante el paso b) a d) para mantener la concentración de D-glucosa en el medio aproximadamente de 0.5g/l a 25g/l de D-glucosa, preferiblemente alrededor de 2g/l de D-glucosa. 17.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado además porque los ácidos grasos se seleccionan del grupo formado por ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico o una mezcla de ellos. 18.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado además porque los hidrolizados proteicos de origen no animal se seleccionan del grupo formado por triptona de bacterias, triptona de levadura, hidrolizados de plantas o una mezcla de ellos. 19.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque las células EBx® se cultivan en suspensión como células agrupadas. 20.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque en el paso a) al menos un paso, preferiblemente al menos todos los pasos, de cultivo de células EBx® de un recipiente de cultivo a otro se realiza mediante dilución sin fragmentar los paquetes de células EBx®. 21.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque en el paso a) al menos un paso, preferiblemente al menos todos los pasos, de cultivo de células EBx® de un recipiente de cultivo a otro no incluye el paso de centrifugación y/o fragmentación de los paquetes celulares. 22.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque el paso c) se realiza después del paso de infección b), preferiblemente alrededor de 1 hora después del paso b). 23.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado además porque el paso de infección b) se realiza a una m.o.i (multiplicidad de infección) de aproximadamente 10 a 10"6, preferiblemente alrededor de 10"3 a 10"5, y más preferiblemente alrededor de 10"4. 24.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado además porque el virus es un poxvirus espontáneo o un poxvirus recombinante seleccionado del grupo formado por el virus vaccinia ankara modificado (MVA), virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario (es decir, ALVAC), virus de la viruela del junco, virus de la viruela de los mainates, virus de la viruela de las palomas, virus de la viruela de los psitacinos, virus de la viruela de las codornices, virus de la viruela de los gorriones, virus de la viruela de los estornino pintos, virus de la viruela de los pavos. 25.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado además porque el virus es un virus espontáneo o un virus recombinante seleccionado del grupo formado por el virus del sarampión y de las paperas. 26.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado además porque el virus se selecciona entre el virus de la gripe humana, virus de la gripe aviar, virus de la gripe porcina, virus de la gripe equina, virus de la gripe felina. 27 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho virus de la gripe humana es una cepa A seleccionada entre las cepas H1 N1 , H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1 , H7N7 y H9N2 28 - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 y 27, caracterizado además porque el cultivo del paso a) se realiza mediante cultivo discontinuo, cultivo discontinuo repetido, cultivo por lote o cultivo de perfusión 29 - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque la infección del paso b) se realiza cuando la densidad celular es de al menos 4 millones de células/ml en un procedimiento discontinuo o por lotes, preferiblemente 6 millones de células/ml 30 - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado además porque la infección del paso b) se realiza cuando la densidad celular es de al menos 8 millones de células/ml en un procedimiento de perfusión, preferiblemente alrededor de 9 a 10 millones de células/ml 31 - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado además porque el pH del medio de cultivo sin suero de los pasos a), b), c) y d) se encuentran en un intervalo de 6 5 a 7 8 32.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 31 , caracterizado además porque el paso d) tiene una duración de 2 a 10 días antes de la cosecha. 33.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 32, caracterizado además porque el cultivo celular se realiza a una temperatura que va desde 30 °C a 39 °C, preferiblemente a alrededor de 37 °C. 34.- Un virus obtenido mediante un procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 33. 35.- Una vacuna con un virus de conformidad con la reivindicación 34, si es apropiado en combinación con las sustancias que aumentan la respuesta inmune. 36.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el virus está presente como partículas del virus intactas. 37.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el virus está presente como partículas del virus desintegradas. 38.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el virus está presente como virus atenuado. 39.- Una vacuna con constituyentes de un virus de conformidad con la reivindicación 34, si es apropiado en combinación con las sustancias que aumentan la respuesta inmune. 40.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque la vacuna está formada por proteínas aisladas del virus. 41.- Una vacuna que consta de una línea de células EBx® infectadas obtenibles a partir del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 33, y en donde la línea de células EBx® infectadas|se cosechan en el paso d). 42.- Una composición diagnóstica que consta del virus de conformidad con la reivindicación 34 o constituyentes del mismo.
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