BRPI0609119A2 - processo de replicar um vìrus, vìrus, vacina e composição para diagnóstico - Google Patents

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Abstract

PROCESSO DE REPLICAR UM VìRUS, VìRUS, VACINA E COMPOSIçãO PARA DIAGNóSTICO. A presente invenção está relacionada ao desenvolvimento e fabricação de vacinas virais. Especificamente, a invenção está relacionada ao campo da produção industrial de vetores e vacinas virais, mais especificamente ao uso de células aviárias, preferivelmente de linhas de células tronco derivadas de embriões de frangos, para a produção de vetores e vírus virais. A invenção é particularmente útil para a produção industrial de vacinas virais para prevenir a infecção viral de seres humanos e de animais.

Description

"PROCESSO DE REPLICAR UM VÍRUS, VÍRUS, VACINA ECOMPOSIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO"
A presente invenção está relacionada ao desenvolvimento efabricação de vacinas virais. Especificamente, a invenção está relacionada aocampo da produção industrial de vetores e vacinas virais, maisespecificamente ao uso de células aviárias, preferivelmente de linhas decélulas tronco derivadas de embriões de frangos, para a produção de vetores evírus virais. A invenção é particularmente útil para a produção industrial devacinas virais para prevenir a infecção viral de seres humanos e de animais.
RETROSPECTO
A vacinação em massa seria a abordagem mais simples eefetiva para controlar a pandemia viral, tais como as pandemias e interpandemias de surtos de gripe, porém, também para prevenir a ameaça dobioterrorismo, tais como os recentes atos terroristas envolvendo antrax nosEUA. Porém, para muitas vacinas virais tais como as vacinas contra a gripe evaríola que são produzidas atualmente por sistemas baseados em ovos, é maisprovável que a capacidade de produção atual dos fabricantes de vacinaspoderia não ser suficiente para cobrir as necessidades em caso de pandemiaou de um ataque bioterrorista.
A intervalos imprevisíveis, e adicionalmente à epidemia degripe leve e sazonal causada pelo deslocamento ou reagrupamento antigênico,surgirão mudanças antigênicas com subtipos de vírus da gripe completamentenovos cuja imunidade não existe na população humana. Os mesmos causampandemia global que se espalha rapidamente em todo o mundo. Três destaspandemias ocorreram no último século (1918, 1957, 1968). A mais severa em1918 infetou aproximadamente 50% da população mundial, da qualaproximadamente 25% sofreram a doença clínica; a mortalidade total foiestimada entre 20 - 40 milhões, afetando principalmente as pessoas no iníciode suas vidas. Esta população deprimida pela pandemia cresceu durante osdez anos seguintes. O último surto com mortalidade elevada e potencial depandemia ocorreu em 1997, quando surgiu um novo vírus da gripe (H5N1)em Hong Kong, matando um terço dos pacientes afetados, principalmenteadultos jovens. Afortunadamente, o vírus não apresentava capacidade dedisseminação de pessoa para pessoa sendo possível interromper o surtorapidamente. Um vírus similar foi isolado em Hong Kong no ano 2003. NosEUA, o impacto da próxima pandemia está projetado em 18-42 milhões deconsultas ambulatoriais, 314.000-734.000 hospitalizações e 89.000-207.000mortes, assumindo que a próxima pandemia será de magnitude similar àspandemias de 1957 e 1968, e não similar à pandemia de 1918 (.Meltzer MI,Cox NJ e Fukuda K. . The economic irnpact of pandemic influenza in theUnited States: priorities for intervention. Emerging Infectious Diseases 1999;5:659-671). Extrapolando proporcionalmente este impacto projetado para apopulação global, a estimativa bruta do impacto global da próxima pandemiapode ser estimado em 1-2 bilhões de casos de gripe, 5,3-12,3 milhões de casosde doença grave e 1,5-3,5 milhões de mortes.
Além de uma pandemia potencial, as epidemias anuais degripe causadas por variantes acumuladas do vírus A e B da gripe infetamaproximadamente 10-20% da população em cada estação, e causam doençafebril, hospitalizações e mortes. Foram usados métodos estatísticos indiretospara estimar a carga total da gripe; estes incluem vários modelos estatísticosque quantificam o aumento sazonal da morbidez e mortalidade durante osperíodos epidêmicos de gripe (Simonsen L, Clarke MJ, Williamson GD,Stroup DF, Arden NH, Schonberger LB. The irnpact of influenza epidemics onmortality: introducing a severity index. Am J. Public Health 1997; 87:1944-1950).
Usando esta metodologia, uma estação de gripe comum no E.U.A. estáassociada atualmente a 25-50 milhões de casos de gripe, 150.000hospitalizações, e 20.000-40.000 mortes. Assumindo que o risco demorbidade da gripe específico para idade é similar aquele dos EUA, a médiaanual da carga global da inter pandemia da gripe pode encontrar se na ordemde aproximadamente 1 bilhão de casos de gripe, aproximadamente 3-5milhões de casos de doença grave e 250.000-500.000 mortes (veja relatórioOMS, Genebra, Abril 2003: State of the art of new vaccines Research &Development - Initiative for Vaccine Research)
As vacinas contra a gripe atualmente disponíveis são efetivasna prevenção da inter pandemia da doença relacionada à gripe e altamenteeficazes em termos de prevenção de hospitalizações e mortes. Apesar destesresultados, nos países em desenvolvimento e desenvolvidos, ainda não foiatingida nenhuma "população de alto risco", devido em parte ao preçorelativamente alto da vacina e à necessidade de ser vacinado anualmente.
Porém, muito recentemente, o uso da vacina da gripe começou a aumentar anível global para atingir aproximadamente 235 milhões de doses em 2003,mas ainda existe uma lacuna considerável na demanda de vacina para apandemia devido à produção atual da vacina. De fato, a Organização Mundialda Saúde (OMS) estima que existem aproximadamente 1,2 bilhão de pessoassob "alto risco" de contrair gripe severa (idosos com mais de 65 anos deidade, bebes, crianças, adultos com problemas crônicos de saúde,trabalhadores de cuidados com a saúde,...).
O sistema atual baseado em ovo usado para produzir asvacinas da gripe licenciadas, apesar de ser confiável por mais de 50 anos,mostra suas limitações que incluem:
• Um processo de fabricação longo, incômodo e com elevadoconsumo de recursos que requer a obtenção e controle de qualidadede grandes quantidades de ovos para cada campanha de produçãoindividual. Este sistema de produção atual baseado em ovos nãoestimula que empresas farmacêuticas adicionais entrem no negóciode vacinas contra a gripe derivadas de ovos porque a margem delucro potencial é muito limitada;A necessidade de selecionar quais cepas de vírus estarão na vacinapelo menos com 6 meses de antecedência da estação da gripe. Estadecisão precoce sobre quais cepas serão incluídas na vacina dagripe nem sempre estará correta, e o longo o período de temporequerido para produzir a vacina torna impossível a ação corretivada cepa;
A necessidade de produzir vacina contra a gripe em quantidadesuficiente a cada ano para atender a demanda continuamentecrescente (aproximadamente 250 milhões de doses nos paísesindustrializados em 2004, aproximadamente 100 milhões de dosesapenas para os E.U.A.).
A recente escassez de vacinas da gripe nosE.U.A. durante o inverno de 2004-2005 devido à contaminação dafabrica fabricante de vacinas contra a gripe derivadas de ovolocalizada no Reino Unido tem destaque neste problema. Alémdisso, a capacidade de produção global atual de vacina da gripe nemsempre é suficiente para cobrir parte da população global de "altorisco". Na realidade, é questionável se a infra estrutura global teriacondição de efetuar a distribuição e entrega da vacina contra apandemia da gripe em tempo hábil;
Os requisitos de centenas de milhões de ovos de galinha fertilizadospara fabricar a vacina com os riscos associados ao fornecimentoinsuficiente de ovos nos casos de infecções epidêmicas nos plantéisde galinhas doadoras;
A necessidade de usar em muitos casos embriões de galinha livre depatógeno específico(SPF), de alto custo, nos casos de vírus da gripecom vida atenuada.
Os custos inflacionados associados ao uso de soro bovino originadode países livres de BSE;
A alergenicidade aos componentes derivados de ovos em algunsindivíduos;
• A incapacidade de usar ovos para a propagação dos vírus que sãoaltamente virulentos e letais para as galinhas.
Adicionalmente, a tecnologia atual produz vacinas com umespectro restrito de produção e, portanto, é muito improvável que as vacinasdisponíveis nos estoques poderiam proteger contra uma cepa completamentenova de pandemia do vírus da gripe.
Alternativamente, a ameaça de bioterrorismo se tornou aprincipal preocupação dos governos de vários países ocidentais nesses últimosanos como os recentes atos terroristas envolvendo antraz. O governo dosEstados Unidos adotou medidas apropriadas para o diagnóstico rápido, defesae reação contra ataques biológicos pela implementação do Ato de Resposta ePrevenção Contra o Bioterrorismo em 2002. De fato, as armas biológicas sãorelativamente acessíveis e constituem um modo barato e eficiente para asorganizações bioterroristas de ameaçar e assustar as populações e governos.
Em particular, o uso do vírus da varíola como arma biológica aumentourecentemente em vários países desenvolvidos, os quais desenvolveram planoscontingência para lidar com tal risco.
A varíola é considerada como tendo o maior potencial decausar a disseminação dos danos em caso de disseminação deliberada,seguida por pragas, antraz e botulismo. A varíola foi declarada erradicada em1980, e desde então todos os países do mundo interromperam seus programasde vacinação. Isto causou o declínio contínuo da imunidade da população àinfecção viral, que torna o vírus da varíola um agente inclusive mais perigosono caso de liberação bioterrorista. O Centro de Controle de Doenças dos EUA(CDC) classificou a varíola como um agente bioterrorista classe A, ou seja,entre os microorganismos mais perigosos devido a sua fácil propagação e altataxa de mortalidade.
A vacinação rápida em massa seria a abordagem ideal paracontrolar um surto de varíola. O governo dos EUA adotou as medidasnecessárias para assegurar estoques de vacinas adicionais, vacinando opessoal militar e trabalhadores de cuidados com a saúde em posições chave, eestabeleceu um programa para o desenvolvimento de uma vacina segura quepoderia ser dada para toda a população independentemente de seu estado desaúde. Outros governos estão monitorando o progresso dos E.U.A. comotambém avaliando sua própria prevenção em caso de emergência.
No passado recente, os governos estavam adquirindo ouproduzindo sua própria primeira geração de estoques em laboratóriosgovernamentais ou emitindo concorrências comerciais. A primeira geração devacinas foi colhida diretamente de animais, mostrou ser efetiva; porém,freqüentemente as mesmas continham impurezas e bactérias que aumentamamplamente a chance de reações adversas e complicações, especialmente emindivíduos com comprometimento imunológico.
Desde a erradicação davaríola, um número limitado de empresas farmacêuticas foi capaz de andarrapidamente na produção de vacinas contra a varíola. Uma quantidade aindamenor daquele grupo é capaz de produzir vacinas de segunda geração usandoDryvax® e cepas de Lister Elstree vaccinia em culturas de célulasqualificadas de acordo com os padrões das boas práticas de fabricação.Porém, como com as vacinas de primeira geração, estas vacinas também nãosão adequadas para indivíduos com comprometimento imunológico. Avacinação em massa com vacinas de primeira e segunda geração poderiacausar complicações que matariam um indivíduo em um milhão e causariamdoenças sérias em 10 vezes mais casos. Conseqüentemente, foi desenvolvidauma vacina de terceira geração mais segura por uma quantidade ainda menorde empresas farmacêuticas. As vacinas de terceira geração estão baseadas emuma cepa do vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) usado durante acampanha de erradicação de varíola na Alemanha na década de 1970. Nosestudos clínicos, o MVA foi administrado sem efeitos colaterais significativospara aproximadamente 150.000 indivíduos, incluindo muitos consideradossob risco para a vacinação de varíola convencional.
Todas estas vacinas de varíola são produzidas em fibroblastosprimários isolados de embriões de galinha. Estes sistemas de produção estãoassociados com várias limitações sérias incluindo:
Um processo de fabricação longo, incômodo e com elevadoconsumo de recursos que requer a obtenção e controle de qualidadede grandes quantidades de ovos ou CEFs para cada campanha deprodução individual;
Em muitos casos, a necessidade de usar embriões de galinha livresde patógeno específico (SPF), de custo elevado;
Os riscos de fornecimento insuficiente de ovos em casos deepidemia de infecções nos plantéis de galinhas doadoras;
Os custos inflacionários associados ao uso de soro bovino originadode países livre de B SE;
A alergenicidade a ovos em alguns indivíduos;
A incapacidade de usar ovos para a propagação de vírus que sãoaltamente virulentos e letais as galinhas.
Apesar de que o processo de produção baseado em ovos eCEFs continua sendo relativamente confiável, um sistema de produçãoeficiente baseado em células representaria uma melhora significativa nofornecimento de um método mais rápido, mais barato e menos incômodo parao crescimento dos vírus. Além disso, no caso de uma pandemia de gripe, umprocesso de fabricação baseado em cultura de células oferece vantagensadicionais:
A produção da vacina da gripe pode começar imediatamente depoisda cepa causadora da pandemia ter sido identificada, isolada edistribuída;
Não há necessidade de esperar pelo desenvolvimento dos assimdenominados Recombinantes de Alto Crescimento (vírus adaptadosao alto rendimento do crescimento em ovos com embriões degalinha) necessários para produção em ovos;
A disponibilidade do primeiro lote de vacina seria deaproximadamente 9 semanas após o recebimento da cepa, em vezde 6-9 meses com o processo derivado de ovo;
Um processo derivado células permite a produção de cepas que nãopodem ser crescidas adequadamente em ovos (p. ex.,o GripeAviária de Hong Kong em 1997);
Não há problema de escassez de ovos durante a pandemia.
Além disso, o uso de linhas celulares para a fabricação devacinas virais, no lugar de ovo ou plataformas CEF, teria as seguintesvantagens adicionais com relação à segurança da vacina: sem antibióticosaditivos presentes na formulação da vacina; sem necessidade de conservantetóxico (como tiomersal); nível reduzido de endotoxinas, sem problemas dealergia a ovos; crescimento em meio livre de proteína e soro (sem agenteadventício / BSE); alta pureza de preparação da vacina viral.
Portanto, existe a necessidade urgente de melhorar astecnologias atuais de produção de vacina viral baseadas em ovos oufibroblastos embrionários de galinha. O desenvolvimento de plataformas decultura de células como uma alternativa aos ovos e sistemas de produção CEFpara a fabricação de vacinas virais é, provavelmente, a solução mais rápida epromissora para superar o gargalo de produção atual da vacina e as restriçõesde tempo. Além disso, as tecnologias de produção de cultura de célulasmelhorariam as possibilidades as aumentos crescentes da capacidade deprodução de vacina devido a um ataque terrorista ou em caso de pandemia.
Com base nestes requisitos específicos, o inventor aproveitousua experiência em biologia aviária e em células tronco embrionárias aviárias(ES) para realizar o desenvolvimento de novas linhas de células aviáriasestáveis que proporcionam a replicação eficiente de vacinas humanas eveterinárias e de candidatas à vacina, e que atendem as especificaçõesindustriais, regulatórias e médicas. Usando um processo proprietário (vejaWO 03/076601 e WO 05/007840), o inventor gerou assim uma série de linhascelulares bem caracterizadas e documentadas (as células EBx®) que sãoderivadas de células ES de galinha sem passos de imortalização genética,química ou viral. As células EBx® foram geradas usando um processo de 2passos completamente documentado, e levando em consideração os requisitosregulatórios:
Passo 1: Isolamento, cultura in vitro e expansão de células ESde galinha:
As células tronco embrionárias são únicas devido a: (i) podemse auto renovar indefinidamente in vitro como células não diferenciadas, (ii)apresentam capacidade regenerativa ilimitada, (iii) mantêm um conteúdocromossômico estável; (iv) expressam níveis altos de telomerase emarcadores específicos de superfície celular. Apesar de muitos esforços emtodo o mundo todo, as células ES foram isoladas com sucesso de apenas umnúmero muito limitado de espécies (ratos, humano, macacos). O inventordedicou recursos significativos durante os últimos anos para isolar eestabelecer células ES de várias espécies aviárias. Tais esforços de pesquisaresultaram no isolamento e caracterização bem sucedidos de células ES degalinha [Pain et al. 1999. Cell Tissues Organs 165: 212-219]. A seguir, oinventor desenvolveu procedimentos proprietários que permitem a culturaeficiente in vitro e expansão em ampla escala de células ES de galinha semindução de diferenciação.
Passo 2: Derivação de células EBx®:
A seguir, o inventor estabeleceu um processo proprietário paraderivar linhas celulares aderentes estáveis e linhas de células ES de galinhaem suspensão. O processo inclui a retirada progressiva do soro, alimentadorde células e fatores de crescimento do meio de cultura de células e aadaptação de células para uma cultura da suspensão. Estas linhas celularesderivadas de embriões de galinha mantiveram a maioria das característicasdesejáveis das células ES (ou seja, proliferação indefinida, expressão demarcadores ES específicos como a telomerase, estabilidade do cariótipo),porém, além disso, apresentaram novas características "amigáveis para aindústria" (crescimento em suspensão em meio livre de soro).
Com base em suas propriedades biológicas atrativas, oinventor selecionou algumas linhas celulares EBx® de galinha paradesenvolvimento posterior, tais como as linhas celulares aderentes EB45(também denominada S86N45 na WO 03/076601 e WO 05/007840), as quaisforam derivadas das linhas celulares EB14 em suspensão. Com maiorpreferência, as células EBx® de galinha da invenção são selecionadas entre aslinhas celulares EB45 e EB14. Com um embasamento de maior preferência, alinha celular EBx® da galinha é EB14 ou seu sub clone EB14-074. Paramotivos de simplicidade, as linhas celulares EB14 e EB14-074 serãodenominadas no presente de células EB14. As células EB45 e EB14apresentam um fenótipo de células tronco embrionárias (ou seja, alta relaçãonúcleo - citoplasma) sob cultura a longo prazo(>150 passagens). As célulasEB45 e EB14 são pequenas células com um grande núcleo e nucléolos, emostram pequena pseudopodia que se estende da membrana plasmática(Figura 1). As células EB45 e EB14 apresentam ata atividade metabólica, eapresenta um citoplasma rico em ribossomo e mitocôndria. Uma análisegenética das células EB45 e EB14 mostrou que as mesmas são masculinas,diplóides e geneticamente estáveis ao longo das gerações (Figura 2). Ascélulas EB45 e EB14 expressam fosfatase alcalina, marcadores de superfícieespecíficos de células tronco, como EMEA-I e SSEA-I (Figura 5) e o geneENSl específico de células ES (Figura 4). De importância particular, ascélulas EB45 e EB14 expressam também níveis altos de atividade enzimáticada telomerase que é mantida estável ao longo das passagens (Figura 3). Atelomerase é uma enzima chave que promove o crescimento contínuo dascélulas e a estabilidade cromossômica. Foram realizadas análises detumorigenicidade de três semanas e 2,5 meses no modelo de ratos recémnascidos com supressão imunológica mostrando que as células EB14 não sãotumorigênicas in vivo. As células EB45 e EB14 são caracterizadas por umtempo de geração muito pequeno ao redor de 16 horas a 39°C (a temperaturacorpórea da galinha) e ao redor de 20h em 37°C. Portanto, estas linhascelulares apresentam propriedades únicas que as tornam mais eficientes,seguras e substratos celulares com eficácia de custo para a produção industrialde vacinas virais como as da gripe e vacinas de varíola.
As células EBx®, e mais especificamente as células EB14 dainvenção, seriam de alto valor para a fabricação de vacinas da gripe e varíolacomo também outras das principais vacinas virais para uso humano e animal(Tabela 1) atualmente produzidas em ovos embrionados ou em fibroblastosprimários de galinha, como as vacinas contra o sarampo, caxumba, febreamarela ou diversos vírus investigacionais contra doenças infecciosas, taiscomo o HIV ou diversos tipos de câncer. Os dados atuais já demonstraram acapacidade da linha celular EBx® e, mais especificamente, para reproduzirvários vírus recombinantes e do tipo selvagem. Por exemplo, experiênciaspreliminares estabeleceram que as células EBx® suportam a replicação dovírus da gripe (veja o pedido de patente documento francês de prioridade de sFR 05 03583 depositado em 11 de abril de 2005, Exemplo 3, páginas 30 a 41)e vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) (veja WO 05/007840).Tabela 1:
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As propriedades únicas das células EBx® listadas acima, emais especificamente das células EB14, implicam no desenvolvimento de umprocesso específico para a fabricação de vacinas virais de células EBx®.
Realmente, sem estar ligado por uma teoria, o nível metabólico alto dascélulas EBx® requer que o meio de cultura das células forneça energiasuficiente para as células de forma a assegurar o crescimento e a replicaçãoviral das células. O objetivo da presente invenção é fornecer um processo defabricação inovador e eficiente baseado nas células tronco EBx® derivadas deaves embrionárias, mais especificamente células EB14, para a produçãoindustrial de vacinas virais que são produzidas atualmente com ovos e comCEFs.
DESCRIÇÃOA presente invenção fornece um processo de replicação viralem células tronco EBx derivadas de aves embrionárias, mais preferivelmenteem células EB14, sendo que referido processo inclui os passos de:
Infecção de uma cultura de células EBx com um vírus de interesse;referidas células EBx que são cultivadas preferivelmente em meiolivre de soro animal;
Cultura de células EBx infectadas para reproduzir referido vírus;Colheita do vírus nas superfícies de cultura celular e/ou dentro dereferidas células.
De acordo com uma incorporação preferida, referidosprocessos incluem os passos de:
a) Proliferação das referidas células EBx®, maispreferivelmente células EB14, em um vaso de cultivo, em suspensão, em ummeio livre de soro N01 ;
b) Infecção das referidas células com o vírus selecionadoquando a densidade das células é de pelo menos 1,5 milhões de células/ml
c) Adição ao meio de cultura celular livre de soro N°2brevemente antes da infecção, simultaneamente com a infecção, ou logo apósa infecção; e
d) Cultivo de referidas células infectadas adicionais parapermitir a replicação do vírus; e
e) Opcionalmente, colheita de referido vírus.
O termo "vírus" como usado na presente, inclui não somenteos vírus ocorrendo naturalmente, mas também os vírus atenuados, vírusreabsorventes, cepas de vacina, como também os vírus recombinantes evetores virais, e assim por diante. Os vírus da invenção são selecionadospreferivelmente do grupo consistindo em adenovírus, hepadnavírus, herpesvírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, picornavírus, vírus davaríola, reovírus e retrovírus.Em uma incorporação preferencial, os vírus, vetores viraisrelacionados, partículas virais e vacinas virais pertencem à família do vírus davaríola, e com maior preferência para o chordopoxviridae. Em umembasamento, o vírus òu os vetores virais relacionados, partículas virais evacinas virais são um vírus da varíola aviária selecionado entre o vírus davaríola vírus da galinha, vírus da varíola do canário (ou seja, ALVAC), vírusda varíola junco, vírus varíola do mainata de Rotschild, vírus da varíola dopombo, vírus psittacinepox, vírus da varíola da codorna, vírus da varíola dopardal, vírus da varíola do estorninho malhado, vírus da varíola do pavão. Deacordo com outros embasamentos preferidos, o vírus é um vírus de vacciniaselecionado entre cepas de vírus de vacina de Lister Elstree, vírus de vacinamodificados como o vírus de Vaccinia Ankara Modificado (MVA) que podeser obtido de ATCC (Número ATCC VR - 1508), NYVAC (Tartaglia et al.,1992 Virology 188: 217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi 1994Vaccine 12:675-681), CVI78 (Kempe et al., 1968 Pediatrics 42: 980-985) eoutros vírus de vacina reabsorventes ou não recombinantes.
Em outra incorporação preferida, os vírus, vetores viraisrelacionados, partículas virais e vacinas pertencem à família doortomixovírus, em particular ao vírus da gripe. O vírus da gripe é selecionadodo grupo consistindo em vírus da gripe humana, vírus da gripe aviária, vírusda gripe eqüina, vírus da gripe de suínos, vírus da gripe de felinos. O vírus dagripe é selecionado preferivelmente em cepas A, B e C. Entre as cepas A,podem ser mencionados os vírus com diferentes subtipos de hemaglutinina eneuraminidase, tais como aqueles sem limitação de HlNl, H2N2, H3N2,H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 e H9N2. Entre as cepas HlNl, podem sermencionados os vírus tais como A/Porto Rico/8/34, A/New Caledonia/20/99,A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91, A/Singapore.Entre as cepas H3N2, podem ser mencionadas A/Panama/2007/99,A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94. Entre as cepas B, podem sermencionadas sem limitação B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99,B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1 /86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94,N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98. O vírus dagripe da invenção é selecionado entre os vírus do tipo selvagem, isolado viralprimário obtido de indivíduos infectados, vírus recombinante, vírus atenuado,vírus sensível a temperatura, vírus adaptado a baixa temperatura, vírusreabsorvente, vírus criado por genética reversa.
Quando o vírus da invenção é o vírus da gripe, o processo dainvenção inclui o passo adicional de adição de enzima proteolítica no meio decultura em condições que permitem a propagação do vírus. A enzimaproteolítica é selecionada do grupo consistindo em tripsina, quimiotripsina,termolisina, pepsina, pancreatina, papaina, pronase, subtilisina A, elastase,furina e carboxipeptidase. De acordo com uma incorporação preferencial, aenzima é tripsina. A concentração final de tripsina em meio da cultura celularabrange entre aproximadamente de 0,5 a 1 mg/ml até 25 mg/ml. Com maiorpreferência, a concentração final de tripsina em meio da cultura celularabrange entre 0,01 a 10 usp/ml (usp: unidade da farmacopéia dos EUA)preferivelmente aproximadamente de 0,05 a 2 usp/ml, com maior preferênciaaproximadamente entre 0,3 a 1 usp/ml. Preferivelmente, a enzima proteolíticaé uma proteína recombinante produzida em uma hospedeira procariótica.
Em outra incorporação preferida, os vírus, vetores viraisrelacionados, partículas virais e vacinas pertencem à família doparamixovírus, em particular ao vírus do sarampo, vírus da DoençaNewcastle, vírus da caxumba e vírus da rubéola.
Em outra incorporação preferencial, os vírus, vetores viraisrelacionados, partículas virais e vacinas pertencem à família do birnavírus, emparticular ao vírus da Doença Infecciosa da Bursa.
Os vírus recombinantes incluem, mas não estão limitados, aosvetores virais que incluem um gene heterólogo. Em alguns embasamentos,uma função auxiliar de replicação dos vírus é fornecida pela célula hospedeiraEBx®, um vírus auxiliar, ou um plasmídeo auxiliar. Os vetoresrepresentativos incluem, mas não estão limitados, àqueles que infectarão ascélulas aviárias ou de mamíferos.
O termo "aviário" como usado na presente, foi previsto parareferir-se a qualquer espécie, subespécies ou raça de organismo da classetaxonômica "ave", tal como, mas não limitada a organismos como galinha,peru, pato, ganso, codornizes, faisões, papagaios, pardal alpino, falcões,corvos, avestruz, ema e casuar. O termo inclui as várias cepas de Gallusgallus, ou galinhas (p. ex., Leghorn Branca, Leghorn Marrom, Barred-rock,Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Minorca, Amrox,Califórnia Cinza, Partidge italiano colorido), como também cepas de perus,faisões, codornizes, patos, avestruzes e outras aves criadas comumente. Emuma incorporação preferencial, as células aviárias da presente invenção sãouma célula de galinha.
O vaso de cultivo da invenção é selecionado de preferênciaentre biorreator com tanque de agitação contínua, biorreator Wave™ ,biorreator Bello™, frasco com rotor de pá helicoidal, frasco e fábrica decélulas. Tipicamente, as células são retiradas de um banco de células mestrasou de trabalho através de frascos T ou garrafas rotativas de diversos tamanhose de preferência finalmente para os biorreatores. Tipicamente, a suspensão decélulas resultante é alimentada a seguir para um biorreator de produção desemente (tipicamente com volume de 20-30 L) para cultivo adicional, e emalguns embasamentos, para um biorreator de produção maior (tipicamentecom volume de 150 - 180 L). A relação de volume do segundo biorreator(maior) para o biorreator de semeadura depende do grau para o qual a linhacelular é propagada no primeiro biorreator, mas tipicamente é de 3:1 a 10:1, p.ex., na faixa de (6-8): 1. De acordo com uma incorporação preferencial, ovaso de cultivo é um biorreator de tanque com agitação contínua que permiteo controle de temperatura, aeração, pH e outras condições controladas, o qualestá equipado com:
entradas apropriadas para introdução das células, oxigênio estéril,vários meios de cultivo, etc.;
- saídas para remoção das células e do meio; erecursos para agitação do meio de cultura no biorreator.
De acordo com a presente invenção, "meio livre de soro"(SFM) significa um meio de cultura celular pronto para uso, isto quer dizerque não é requerida adição de soro, permitindo a sobrevivência e crescimentodas células. Este meio não é necessariamente definido quimicamente, e podeconter hidrolisados de várias origens de plantas, por exemplo.
Preferivelmente, referidos SFM são qualificados como "não de origemanimal", quer dizer que não contém componentes de origem animal ouhumana (estado da FAO: "livres de origem animal"). No SFM, as proteínas desoro nativas são substituídas por proteínas recombinantes. Alternativamente, omeio SFM de acordo com a invenção não contém proteína (meio PF: "meiolivre de proteína") e/ou são definidos quimicamente (meio CDM: "meiodefinido quimicamente"). O meio SFM apresenta várias vantagens: (i) aprimeira das vantagens é a aderência regulatória de tais meios (realmente, nãohá risco de contaminação por agentes adventícios como o vírus da BSE); (ii) aotimização do processo de purificação; (iii) a melhor reprodutibilidade noprocesso devido ao meio bem definido. Exemplos de meios SFMcomercialmente disponíveis são: VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020,catálogo 2003), Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catálogo 2003), Episerf(InVitrogen Ref 10732-022, catálogo 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref12765Q, catálogo 2003), LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM(Cambrex ref 12-766Q, catálogo 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone RefSH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref SH30516.02), HyQPF293 (Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02),Ex cell 293 médium (JRH Biosciences ref 14570-1000M), Ex cell 325 PFCHO meio livre de Proteína (JRH Biosciences ref 14335-1000M), Ex cellVPRO médium (JRH Biosciences ref 14560-1000M), Ex cell 302 meio livrede soro (JRH Biosciences ref 14312-1000M), Ex cell 65319 (JRHBiosciences), Ex cell 65421 (JRH Biosciences), Ex cell 65625 (JRHBiosciences), Ex cell 65626 (JRH Biosciences), Ex cell 65627 (JRHBiosciences), Ex cell 65628 (JRH Biosciences), Ex cell 65629 (JRHBiosciences), meio de terapia gene 3 (livre de componente animal) (SIGMA-Aldrich, ref. G-9916) (de aqui em diante denominado meio G9916).
De acordo com a primeira incorporação preferida, o meio N01livre de soro e o meio N°2 livre de soro são o mesmo meio.
De acordo com uma segunda incorporação preferida, o meioN°1 livre de soro e o meio N°2 livre de soro tem composição diferente. Porexemplo, o meio N°1 livre de soro é Excell 65319 (SAFC Biosciences) e omeio Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catálogo 2003) pode ser o meioN°2 livre de soro.
De acordo com uma incorporação preferida, o meio N°1 livrede soro é Ex cell 65319 (JRH Biosciences).
De acordo com uma segunda incorporação preferida, o meioN01 livre de soro é Ex cell 65421 (JRH Biosciences).
De acordo uma incorporação preferida, o meio N°2 livre desoro é Ex cell 65319 (JRH Biosciences).
De acordo com uma segunda incorporação preferida, o meioN°2 livre de soro é G9916 (SIGMA-Aldrich).
O processo de invenção abrange a remoção da totalidade ou deuma parte do meio 1 livre de soro, seguido por sua substituição através domeio N°2 livre de soro. Porém, é mais conveniente remover uma fraçãosignificativa (p. ex.,até aproximadamente 50%) do meio 1 livre de soro e, aseguir, completar com o meio N°2 livre de soro enquanto ainda está sendoremovido o meio 1, p. ex., pelo filtro rotativo. De acordo com umaincorporação preferida, o meio N°2 livre de soro é adicionado diretamente aomeio N°1 livre de soro sem remoção de uma parte do meio N°1 livre de soro.Entre 0,25 a 10 volumes do meio N°2 livre de soro são adicionados a 1volume do meio N°1 livre de soro. Em uma incorporação preferida, entreaproximadamente 0,5 a 8 volumes do meio N°2 livre de soro são adicionadosa 1 volume do meio N01 livre de soro. Em uma incorporação preferida, entreaproximadamente de 3 a 6 volumes de meio N°2 livre de soro são adicionadosa 1 volume de meio N01 livre de soro.
O meio N°1 livre de soro e/ou o meio N°2 livre de soro é/sãocompletados com pelo menos um ingrediente selecionado do grupoconsistindo em aminoácidos, lipídeos, ácidos graxos, colesterol, carboidrato,hidrolisados de proteína de origem não animal, e uma mistura dos mesmos.
Alternativamente, o processo da invenção é um processo delote de alimentação que inclui o passo adicional de alimentação das célulascom pelo menos um ingrediente selecionado do grupo consistindo emaminoácidos, lipídeos, carboidrato, hidrolisados de proteína de origem nãoanimal, tensoativo e uma mistura dos mesmos. De acordo com uma primeiraincorporação preferida, a alimentação ocorre durante os passos a) até d),alternativamente durante os passos b) até d) somente, ou alternativamentesomente durante o passo d). A alimentação pode ocorrer tanto diariamente ouem base contínua. Quando a alimentação não é contínua, a alimentação podeocorrer uma vez ao dia, mais de uma vez ao dia, ou menos de uma vez ao dia.
Os meios SFM da invenção incluem vários ingredientes,inclusive aminoácidos, vitaminas, sais orgânicos e inorgânicos, fontes decarboidratos, cada ingrediente estando presente em uma quantidade quesuporta o cultivo de uma célula in vitro. Porém, para melhorar o crescimentocelular ou a produtividade viral, são incorporados ingredientes adicionais aomeio SFM.A escolha de aminoácido(s) para adicionar à cultura celularpode ser determinada como uma análise de consumo de aminoácidos pelascélulas na cultura. De acordo com uma preferida, os aminoácidos adicionadosao meio são selecionados do grupo consistindo em asparagina e glutamina, ouuma mistura das mesmas. Em uma incorporação mais preferida, é adicionadaglutamina, e a alimentação de glutamina é realizada durante os passos a) atéd), para manter a concentração de glutamina no meio entre aproximadamente0,5 mM até aproximadamente 5 mM, preferivelmente entre aproximadamente1 mM até aproximadamente 3 mM, e de maior preferência deaproximadamente 2 mM. Em uma incorporação preferida, a alimentação deglutamina ocorre de forma contínua.
De acordo com uma incorporação preferida, os carboidratosadicionados ao meio são selecionados do grupo consistindo de D-glicose, D-sacarose e D-galactose ou uma mistura das mesmas. De acordo com umasegunda incorporação mais preferida, o carboidrato adicionado é D-glicose. Aalimentação de D-glicose é realizada durante os passos a) até d), com maiorpreferência entre os passos b) até d) para manter a concentração de D-glicoseno meio entre aproximadamente 0,5g/l até 25g/l de D - glicose,preferivelmente entre aproximadamente 1 g/l até 10 g/l de D-glicose,preferivelmente entre aproximadamente 2 até 3 g/l de D-glicose. Em umaincorporação preferida, a alimentação de D-glicose ocorre de forma contínua.
De acordo com uma incorporação preferida, os lipídeos sãoselecionados do grupo consistindo de colesterol, esteróides, e ácidos graxoscomo ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oléico, ácidolinoleico, ácido linolênico, e seus derivados, ou uma mistura dos mesmos. Demaior preferência, os ácidos gordurosos são da SIGMA-ALDRICH (Ref.F7050) e aproximadamente 0,35 ul/ml da solução de ácidos graxos sãoadicionados ao meio de cultura.
De acordo com uma incorporação preferida, os hidrolisados deproteína de origem não animal são selecionados do grupo consistindo detriptona de bactéria, triptona de levedura, hidrolisados de plantas, comohidrolisados de soja, ou uma mistura dos mesmos. Em uma incorporaçãopreferida, o hidrolisado de proteína de origem não animal é o hidrolisado delevedura.
O termo "hidrolisado" inclui uma mistura enzimática depeptona de soja ou extrato de levedura. O hidrolisado pode ser obtido de umapluralidade de peptona de soja ou preparados de extrato de levedura,respectivamente, que pode ser digerida adicionalmente de forma enzimática(por exemplo, através de papaina), e/ou formado por autólise, termólise e/ouplasmólise. Os hidrolisados também podem ser obtidos comercialmente,como Yeastolate, Hy-soy, Hy-Yeast 412 e Hi-Yeast 444, de fontes como JRHBioSciences (Lenaxa, KA), Quest Internacional (Norwich, N.Y.),OrganoTechnie S.A. (França) ou Deutsche Hefewerke GmbH (Alemanha). Asfontes de extratos de levedura também são divulgadas na WO 98/15614. Asfontes de extratos de levedura e hidrolisados de soja também são divulgadasna WO 00/03000. Os hidrolisados usados no meio da invenção sãopreferivelmente purificadas de uma fração crua, porque as impurezas quepoderiam interferir com o cultivo eficiente são eliminadas preferivelmentedurante esta purificação, melhorando desta forma a consistência dohidrolisado. A purificação pode ser realizada por ultra-filtração oucromatografia Sephadex (por exemplo, com Sephadex G25 ou Sephadex GlOou materiais equivalentes), cromatografia de troca de íons, cromatografia deafinidade, cromatografia de exclusão de tamanho ou "cromatografia de fasereversa". Preferivelmente, a purificação é realizada por ultra-filtraçãoutilizando um filtro de corte de IOkDa. Estes processos são conhecidos nocampo. Usando estes métodos, podem ser selecionadas as frações que contêmsoja ou hidrolisado de levedura com peso molecular definido.Preferivelmente, os pesos moleculares médios da soja e dos hidrolisados delevedura se encontram preferivelmente entre aproximadamente 220 e 375daltons.
Preferivelmente, o hidrolisado de levedura está presente nomeio de cultura celular. O hidrolisado de levedura 5 OX (ao redor de 200 g/l)obtido, por exemplo, da JRH-BIOSCIENCES (Ref 58902) está presente nomeio de cultura celular com uma concentração final que abrange entreaproximadamente 0,1 X até 2X, preferivelmente aproximadamente 0,5X atéaproximadamente IX no meio de cultura. Também podem ser adicionadoshidrolisados de soja ao meio de cultura celular. O hidrolisado de soja 50Xobtido, por exemplo, da JRH - BIOSCIENCES (Ref 58903100M) éadicionado com uma concentração final que abrange de aproximadamente 0,1X até 2X, preferivelmente aproximadamente IX no meio de cultura.Alternativamente, uma mistura de hidrolisado de soja e hidrolisado delevedura pode ser adicionada ao meio de cultura celular como descrito naEUA 2004/0077086.
O meio pode conter substâncias auxiliares, tais comosubstâncias de tamponamento como bicarbonato de sódio, estabilizador deoxidação, estabilizador para anular o estresse mecânico, ou inibidores daprotease. Se necessário, um tensoativo não iônico, como polipropileno glicol(PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 ou PLURONIC F-108) pode ser adicionado ao meio como agente anti-espumante. Geralmente, estes agentes são usados para proteger as células dosefeitos negativos da aeração visto que, sem a adição de um tensoativo, o arascendente e os estouros das bolhas pode causar dano a essas células queestão localizadas na superfície destas bolhas de ar ("espargidas"). Aquantidade de tensoativo não iônico se encontra preferivelmente entreaproximadamente 0,05 e aproximadamente 10 g/L, tipicamente entreaproximadamente 0,1 e aproximadamente 5 g/L. De acordo com outraincorporação da invenção, a concentração de tensoativo no meio de culturacelular pode ser diminuída para aumentar o tamanho das aglomerações dascélulas.
De acordo com uma incorporação da invenção, a adição domeio N0 2 livre de soro na cultura celular, é realizada depois do passo deinfecção b), preferivelmente entre aproximadamente 0,5 até 4 horas depois dopasso b), e com maior preferência em aproximadamente 1 hora depois dopasso b). De acordo com outra incorporação da invenção, a adição do meioN0 2 livre de soro na cultura celular, é realizada antes do passo de infecção b),preferivelmente entre aproximadamente 0,5 até 4 horas depois do passo b), ecom maior preferência em aproximadamente 1 hora antes do passo b). Deacordo com outra incorporação da invenção, a adição do meio N0 2 livre desoro na cultura celular, é realizada simultaneamente com o passo de infecção b.
A infecção viral do passo b) é realizada em um m.d.i(multiplicidade da infecção) de aproximadamente 10 a IO"6, preferivelmenteaproximadamente IO"2 a IO"5, e com maior preferência aproximadamente IO"4.O homem qualificado na arte determinará o m.d.i ótimo de acordo com o tipode vírus.
No passo c), as células infetadas são cultivadaspreferivelmente durante pelo menos 24h, pelo menos 48h, pelo menos 72h,pelo menos 96h, pelo menos 120h, pelo menos 144h. Quando o vírus é umvírus da varíola, as células infestadas são cultivadas durante pelo menos 144h.
No processo da invenção, a cultura de células do passo a) érealizada por cultura de lote, cultura de lote repetida, cultura de lote dealimento ou cultura de perfusão. Com maior preferência, a cultura de célulasdo passo a) é realizada através de cultura de lote de alimento. A infecção dopasso b) é realizada quando a densidade das células é de pelo menosaproximadamente 4 milhões, preferivelmente 6 milhões de células/ml, maispreferivelmente 8 milhões de células/ml em lote ou processo de lote dealimento. Quando é usado um processo de perfusão, a infecção do passo b) érealizada quando a densidade das células é de pelo menos 8 milhões decélulas/ml, preferivelmente de aproximadamente 9 a 10 milhões decélulas/ml, ou até mais alta.
O pH do meio de cultura livre de soro dos passos a), b), c) e d)é monitorado preferivelmente pelo biorreator. O pH deverá estar na faixa de6,5 a 7,8, preferivelmente de aproximadamente 6,8 a 7,5, e maispreferivelmente de aproximadamente 7,2.
No processo de invenção, o passo d) tem duração de 2 a 10dias antes da colheita. De acordo com uma incorporação preferida, o passo d)tem duração de 3 a 7 dias antes da colheita.
A cultura de células é realizada a uma temperatura entre 32°Ca 39°C dependendo do tipo do vírus. Para a produção do vírus da gripe, ainfecção da cultura de células é realizada preferivelmente a 33°C.
As células EBx® têm a capacidade de crescer em cultura desuspensão com células acumuladas em agregados soltos de algumas células,até mais que cem células. Sem ligação a uma teoria, o tamanho dasaglomerações pode variar de acordo com a composição do meio de culturacelular. Por exemplo, a presença de tensoativo como polipropileno glicol(PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 ou PLURONIC F-108) e a agitação podem ter efeito sobre o tamanho dasaglomerações. Agora, o inventor achou que o rendimento viral pode seraumentado permitindo que as células EBx® da invenção se agreguem umasas outras para formar aglomerações durante pelo menos o passo a) doprocesso. Durante a transferência do frasco obtido do banco de célulasmestras e de trabalho, através de vários tamanhos de frasco T ou garrafasrotativas para os biorreatores, as células em suspensão geralmente sãotransferidas para um vaso maior, tanto pela diluição em meio fresco ou porcentrifugação seguida de uma re-suspensão das células pelotizadas para ummeio fresco.O inventor encontrou que durante as transferências das células, érecomendado manter grandes aglomerações de células na cultura. Para fazeristo, é melhor não romper as aglomerações de células para melhorar areplicação do vírus nas células EBx®. Por exemplo, durante as fases iniciaisde cultura do passo a) em frascos T ou garrafas rotativas, é recomendadodiluir a cultura de célula para transferir as células para vasos maiores, e não érecomendado centrifugar, nem romper as aglomerações das células através depipetagem ou agitação. Porém, as aglomerações muito grandes podem ser subótimas para uma produção viral elevada. Conseqüentemente, o homemqualificado na arte definirá se o rompimento parcial das aglomerações,através de pipetagem ou agitação, durante as transferências iniciais de célulasdo passo a) pode melhorar o rendimento viral. De acordo com umaincorporação preferida, o vírus da varíola, e preferivelmente ΜΥΑ, ALVAC evírus da varíola da galinha são obtidos por um processo da invenção queinclui o passo a) de proliferação de EBx® aglomerado em agregados soltos dealgumas células, até mais de que pelo menos cem células, pelo menosduzentos células, pelo menos quinhentas células, pelo menos mil células.
A presente invenção também é apropriada para outros tipos decélulas usadas para a propagação de vírus, tais como, porém sem limitação,fibroblastos embrionários de galinha (CEFs), células VERO, PerC6, MDCK,e aquelas que podem crescer em suspensão como aglomerações de células.
A invenção também está relacionada ao vírus que pode serobtido por um processo da invenção.
A presente invenção também está relacionada à vacina quecontém o vírus da invenção.
O processo de fabricação de uma vacina viral inclui o processode replicação de um vírus de acordo com a invenção, em que o passo e) decolheita de vírus está incluindo pelo menos um passo selecionado entre afiltragem, concentração, congelamento e estabilização por adição de agente deestabilização. A colheita de vírus é realizada de acordo com tecnologias bemconhecidas para o homem qualificado na arte. De acordo com umaincorporação preferida, o passo de colheita de referido vírus inclui a coleta doflutuante da cultura de células obtido da centrifugação da cultura de células e,a seguir, a filtração, concentração, congelamento e estabilização parapreparação do vírus por adição de agente de estabilização. Por exemplo, parao vírus da gripe, veja Furminger, In Nicholson, Webster e Hay (Eds) Livro detexto de gripe, capítulo 24 pp 324-332.
O processo de fabricação de uma vacina viral de acordo com ainvenção, também pode incluir o passo adicional de inativação do víruscolhido. A inativação é realizada preferivelmente através de tratamento comformaldeído, beta propiolactona, éter, éter e detergente (ou seja, como Tween80™), brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) e Triton N 102, deoxicolatode sódio e tri(N-butil)fosfato.
De acordo com outro embasamento, a invenção também estárelacionada a um processo de preparação de proteínas antigênicas virais dovírus que pode ser obtido por um processo da invenção, referido processoinclui os passos adicionais de:
a) opcionalmente, incubação do flutuante da cultura de células, queinclui vírus inteiros com uma enzima de restrição do ácidodesoxirribonucléico, preferivelmente DNAses (veja classificaçãoEC3.1.21 e EC3.1.22) e nucleases (veja classificação EC3.1.30 eEC3.1.31). Preferivelmente, a enzima de digestão do DNA é abenzonase (nuclease de Benzon) ou DNase I;
b) adjunção de detergente catiônico. Exemplos de detergente catiônicosão; sem limitação: sal de cetiltrimetil amônio como CTAB, sal demiristiltrimetil amônio, lipofectina, DOTMA e Tween™;
c) isolamento de proteínas antigênicas. Este último passo pode serrealizado por centrifiigação ou ultra filtração.
O vírus na vacina pode estar presente tanto como partículasintactas de vírus, ou como partículas desintegradas de vírus. De acordo comum embasamento, a vacina é uma vacina morta ou inativada. De acordo comoutro embasamento, a vacina é uma vacina viva atenuada sendo que referidasvacinas incluem principalmente a cultura de flutuante de células EBx quepode ser obtido pelo processo da invenção, preferivelmente sem soro,opcionalmente filtrado e/ou concentrado e incluindo referido vírus. De acordocom um terceiro embasamento, a vacina está incluindo proteínas antigênicasvirais que podem ser obtidas de um vírus preparado de acordo com o processoda invenção.
A invenção também pretende fornecer uma vacina que incluiuma linha de células EBx® infectadas, preferivelmente EB14, que pode serobtida pelo processo da invenção, e na qual a linha de células EBx®infectadas, preferivelmente EB14, são colhidas no passo d).
A vacina da invenção pode incluir o vírus da invenção emcombinação com substâncias aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, queaumentam a resposta imune. Os exemplos não limitantes de substâncias queaumentam a resposta imune incluem o adjuvante incompleto de Freund,saponina, sal de hidróxido de alumínio, lisolecitina, polióis plutônicos,poliânions, peptídeos, bacilos de Calmette-Guerin (BCG) e corynebacteriumparvum. Um exemplo de adjuvante sintético é o QS-21. Além disso, asproteínas imuno estimulantes (interleucinas IL1, IL2, IL3, IL4, IL12, ILl3,fator estimulante de colônias de granulócitos - macrófagos,...) podem serusadas para aumentar a resposta imune à vacina.
A vacina da invenção é preferivelmente uma formulaçãolíquida, uma preparação congelada, uma preparação desidratada e congelada,opcionalmente adaptada à via intranasal de administração.
A vacina da invenção é preferivelmente para uso no tratamentoterapêutico e/ou profílático de um ser humano infectado por um vírusselecionado entre o vírus da varíola e gripe, sarampo, caxumba e rubéola. Avacina viral recombinante da invenção também pode ser usada para otratamento terapêutico e/ou profílático de doenças crônicas como câncer oudoenças infecciosas, como AIDS.
As linhas celulares EBx® da invenção são úteis para gerar eproduzir vírus reabsorvidos. O vírus com um genoma segmentado, como ovírus da gripe pode ser reabsorvido. Ao infectar simultaneamente as célulasEBx® da invenção com pelo menos duas cepas diferentes do vírus da gripe,uma mistura de genoma segmentado de duas cepas diferentes estará presentena mesma célula hospedeira. Durante a montagem do vírus, teoricamentepodem ser geradas todas as combinações de segmentos genômicos. Portanto,os vírus reabsorvidos específicos podem ser isolados por seleção oueliminação com um anticorpo, por exemplo, um vírus com as característicasdesejadas (Veja Kilnourne E.D in Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds,Vacinas 1994).
As linhas de células EBx® da invenção também são úteis paragerar e produzir vírus da gripe através de genética reversa (Veja Enami, Proc.Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese, J. Virol.65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989)).
A invenção também está relacionada aos vírus contendo acomposição diagnostica da invenção ou componentes do mesmo.
Os exemplos abaixo explicam a invenção com mais detalhes.Os seguintes preparados e exemplos são informados para capacitar aquelesqualificados na arte a entender mais claramente e para colocar em prática apresente invenção. Porém, a presente invenção não está limitada em seuescopo pelos embasamentos exemplificados, que foram previstos comoilustrações de aspectos únicos da invenção somente, e os métodos que sãofuncionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Realmente,várias modificações da invenção além daquelas aqui descritas ficarãoesclarecidas para aqueles qualificados na arte, a partir da descrição precedentee dos desenhos de acompanhamento. Tais modificações foram previstas paraserem incluídas no escopo das reivindicações em anexo. Para a parteremanescente da descrição, será feita referência às legendas das figurasabaixo.
FIGURAS
FIGURA 1: Análise Microscópica de Transmissão Eletrônicade células EB14
As células EB14 mostram uma morfologia típica de célulastronco embrionárias (ou seja, alta relação núcleo - citoplasma) que seassemelha ao fenótipo das células tronco embrionárias murinas (mES). Ascélulas EB14 são células redondas, pequenas com um núcleo grande enucléolos com pseudopodia pequena que se estende desde a membranaplasmática. São altamente ativas metabolicamente com um ribossomo ecitoplasma rico em mitocôndria. A morfologia celular das células EB14 édiferente daquela dos fibroblastos embrionários da galinha (CEF).
FIGURA 2: Análise de Cariotipagem de células EB14 nastransferências 105 e 118
A análise de células EB14 cultivadas em meio livre de soro atéas transferências 105 e 118 confirmou a natureza das células diplóides, com apresença de 18 macro cromossomos e 30 micro cromossomos (painelsuperior). Este resultado está de acordo com os números de cromossomosesperados para as células de galinha (painel inferior).
FIGURA 3: Expressão de telomerase em células EB14
A expressão de telomerase em células EB14 cultivadas emmeio livre de soro em transferências diferentes foi investigada usando o kit dedetecção de telomerase da Roche (Telomerase OCR ELISA). A telomerase éencontrada como sendo altamente expressada nas células EB14. O nível altode expressão de telomerase é mantido ao longo das transferências, comomostrado na transferência 89, na transferência 160 (que correspondem aoBanco de Células Mestras das Células EB14), e na transferência 179 (quecorrespondem ao término das transferências de produção). A linha celularMDCK canina é usada como controle negativo e não expressa telomerase. Foiachada ausência similar da expressão de telomerase para as células CEFs(Dados não mostrados).
FIGURA 4: O gene ENSl é expressado nas células EB14O gene ENSl foi descrito como sendo especificamenteexpressado em células ES de galinha (Acloque & ai., Mech Dev. 103, p79-91,2001). Sua expressão nas células EB14 foi avaliada por RT-PCR. As célulastronco embrionárias aviárias (células ES), células embrionárias aviáriascoletadas em oviposição e células EB14 em várias transferências (P21, Pl 59,P160) são encontradas expressadas fortemente no gene ENSl enquanto que alinha celular aviária DFl (EUA 5,672,485) e os fibroblastos embrionários degalinha (CEFs) não expressam este gene. A análise da administração internado gene GAPDH é realizada em paralelo nas mesmas amostras, para controlara presença dos RNAs (painel inferior).
FIGURA 5: Expressão dos marcadores específicos das célulasES na linha celular EB14 (painel a esquerda) e linha celular DFl (painel adireita)
As células EB14 expressam os genes EMEAl e SSEAlenquanto que a célula DFl não o faz. O gene de Paxillina é um geneonipresente usado como controle. As células EB14 não expressam osmarcadores celulares TROMA-1, MeIM, TRA-1-60 e SSEA3.
FIGURA 6: Expressão da superfície celular de receptores SA2-3 e SAa2-6 nas linhas celulares EB14 e MDCK
As células são incubadas com lectinas rotulada digoxigenina:A Sambuca nigra agglutinin lectina está ligada especificamente à Sia2-6Gal,enquanto que a Maackia amurensis agglutinin leetina está ligadaespecificamente à Sia2-3Gal. As lectinas que se ligam às células são reveladascom anticorpo anti digoxigenina FITC-rotulado de acordo com técnicas bemconhecidas pelo homem qualificado na arte. As células FITC-rotuladas sãonumeradas com um separador de células fluorescente (FACS). As moléculasSAa2-3 e SAa2-6 foram descritas como sendo receptores para os vírus dagripe aviária e humana, respectivamente.
FIGURAS 7A e 7B: Cinéticas de crescimento das célulasEB14 em um leito de alimentação do biorreator 3L
Figura 7A - Foi permitido que a biomassa derivada de EB14 seacumulasse a 37°C em um meio de crescimento celular suplementado comextrato aquoso de levedura 0,5X até ter sido alcançada a densidade de 5-6, IO6células/mL. A seguir, a mistura foi diluída 2,9 vezes e o crescimento cinéticoda célula foi acompanhado por um período de 10 dias. A densidade celular de13 milhões de células/ml foi alcançada no dia 5.
Figura 7B - Flexibilidade da relação de divisão paracrescimento cinético da célula em células EB-14 em um em um lote dealimentação do biorreator 3L: Após semear uma célula com uma relação dedivisão de 1/10 (0,23 L com densidade de 0,4. IO6 células/mL em volume finalde 2,1L), foi permitido que a biomassa derivada de EB14 se acumulasse emmeio de crescimento Excell 65319 (SAFC) a 37°C durante um período de 11dias. As concentrações de L glutamina (2mM) e D-(+)-glicose (2g/L) foramajustadas diariamente como um processo de alimentação de lote, e osparâmetros do biorreator eram estabelecidos como segue: velocidade derotação: 80rpm, p02: 50%, pH,: 7,20.
FIGURA 8: Influência do meio de produção e do tamanho dasaglomerações para a propagação do vírus MYA GFP em células EB14infectadas: expressão GFP
Foi permitido que as células EB14 formassem pequenasaglomerações (painel à esquerda) ou grandes aglomerações (painel à direita)em frascos Tl 75 do tanque de agitação durante a proliferação celular em ummeio de crescimento celular SFM (SAFC: Excell 65319). A seguir, asaglomerações foram infectadas com 10" TÜD50/células do vírus MVA-GFPe a mistura foi diluída em vários meios de produção SFM (Optipro, Excell65319, Excell 65629). Durante um período de propagação do vírus de 7 dias a37°C, foram tiradas fotos diariamente das células infectadas expostas a UV.Controle: foi usado optipro (INVITROGEN) como meio de crescimentocelular e de produção.
FIGURA 9: Influência do meio de produção e do tamanho dasaglomerações para a propagação do vírus MVA-GFP em células EB14infectadas: titulação de vírus infeccioso
Foi permitido que as células EB14 formassem pequenasaglomerações (painel à esquerda) ou grandes aglomerações (painel à direita)em frascos Tl 75 do tanque de agitação durante a proliferação celular em ummeio de crescimento celular (SAFC Excell 65319). A seguir, as aglomeraçõesforam infectadas com 10" TCID50/células do vírus MVA-GFP e a mistura foidiluída em vários meios de produção (Optipro, Excell 65319, Excell 65421,Excell 65625, Excell 65626, Excell 65627, Excell 65628, Excell 65629,G9916). Durante o período de propagação do vírus de 7 dias a 37°C, foramcoletadas amostras diariamente e foi realizada a titulação TCID5O ao términoda cinética.
FIGURA 10: Influência do meio de produção e dossuplementos para propagação do vírus MVA-GFP em células EB14infectadas
Foi permitido que as células EB14 formassem pequenasaglomerações em frascos T175 do tanque de agitação durante a proliferaçãocelular em um meio de crescimento celular (SAFC Excell 65319). A seguir, "7as células foram infectadas com 10" TCjtD50/células do vírus MVA-GFP e amistura foi diluída em vários meios de produção (painel da esquerda à direita:meio Excell 65319, Excell 65629 ou G9916) suplementado ou não comextrato aquoso de levedura IX (suplemento 1) e/ou ácido graxo IX(suplemento 2). Durante o período de propagação do vírus de 7 dias a 37°C,foram coletadas amostras diariamente e foi realizada titulação TCID5O aotérmino da cinética.
FIGURA 11: Expressão de GFP em células EB-14 infectadascom vírus de MVA-GFP em um lote de alimentação do biorreator 3L
Foi permitido que a biomassa derivada de EB14 se acumulassedurante a fase de proliferação celular em meio de crescimento Excell 65319.
A seguir, as células foram infectadas comTCID50/células do vírus MVA-GFP e a mistura foi diluída em meio de produção G9916. A seguir, foramrealizadas diariamente as fotografias (ampliação X5 ou Xl 0) das célulasinfectadas expostas a UV a 37°C (PI: Pós infecção).
FIGURA 12: Titulação do vírus infeccioso do vírus da gripeMVA-GFP derivado de EB14 propagado em um lote de alimentação dobiorreator 3 L
Foi permitido que a biomassa derivada de EB14 se acumulassedurante a fase de proliferação celular em meio de crescimento Excell 65319.
A seguir, as células foram infectadas com 10" TCID50/células de vírus MVA-GFP e a mistura foi diluída em Excell 65319 suplementado com extratoaquoso de levedura lx. Durante um período 9 dias de propagação de vírus a37°C, as amostras foram coletadas diariamente e foi realizada a titulaçãoTCID5O ao término da cinética, sendo comparada com as titulações obtidasnas células CEF.
FIGURA 13: Análise de micrografia de elétrons do vírusMVA-GFP produzido nas células EB14
As células EB14 foram infectadas comTCID50/células do
vírus MVA-GFP e colhidas às 18h, 48h e 72h pós infecção. Seções finas deamostras fixadas e embutidas foram examinadas através de microscópio deelétrons (Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg).
FIGURA 14: Titulação de vírus infeccioso de múltiplas cepasda gripe humana produzidas em células EB14
As células EB14 foram infectadas em frascos Tl 75 do tanquede agitação com IO"4 TCID50/células de várias cepas da gripe humanaA/H3N2, A/Hl Nl e B, na presença de 0,75 USP/mL de tripsinarecombinante. As amostras foram coletadas a cada 24h e a titulação TCID50foi analisada ao término da cinética por titulação de células MDCK naausência de soro bovino (painel à esquerda). Algumas células EB14infectadas foram analisadas em paralelo através do microscópio de elétrons,revelando a produção de partículas de vírus da gripe (painel à direita; Dr.D.Spehner, IGBMC, Strasbourg).
FIGURAS 15A e 15B: Replicação produtiva de múltiplascepas do vírus da gripe em células EB14
Figura 15A - Análise Western blot de hemaglutinina (HA) emcélulas EB14 infectadas com várias cepas do vírus da gripe
As células EB14 são cultivadas em meio livre de soro emfrascos de agitação T175 e são infectadas com as cepas virais indicadas, comuma multiplicidade de infecção de IO"4, na presença de 0,75 USP/mL detripsina. São coletadas diariamente 4μΙ, de cultura celular dos flutuantes eanalisadas através de eletroforese através de SDS-PAGE 10% e teste Westernblot. As proteínas foram eletrotestadas em Blot para a membrana de difluoretode polivinilideno e as subunidades não divididas (HAO) ou pós divisão (HAle HA2) de HA foram detectadas através de incubação com soro anti-HApoliclonal específico de ovelha. Um IgG anti ovelha conjugado paraperoxidase foi usado para o imunotingimento. Para cada cepa de vírus, oacúmulo de HA de 72h até 168h pós-infecção é comparado com quantidadescrescentes de reagentes HA padrão derivados de ovos.Figura 15B - Análise SRID de dos níveis de produção HAderivado de EB14 para vários vírus da gripe
As células EB14 foram infectadas em frascos de agitação T175com 10"4TCrD50/células de várias cepas da gripe A/H3N2, A/H1N1 e humanaB, na presença de 0,75 USP/mL de tripsina. Foram coletadas amostras a cada24h e foi realizada a análise de Imunodifusão Radial Consecutiva (SRID) aotérmino da cinética. Para cada cepa de vírus, o cálculo de acúmulo HA estárelacionado a uma curva de dose resposta dos antígenos padrãocorrespondentes bem definidos.
FIGURAS 16A e 16B: Produção de cepas do vírus da gripeA/H3N2 em células EB14 em biorreatores 3L
Figura 16A - Cinética do crescimento de células EB14infectadas com cepas do vírus da gripe A/H3N2/NewYork/55/2005
Foi permitido que a biomassa de EB14 se acumulasse a 37°Cdurante a fase de proliferação celular em um meio de crescimento de célula. Aseguir, as células foram infectadas com IO-4 TCID50/células de vírus da gripeA/H3N2/New York/55/2005, a mistura foi diluída em meio de produçãoExcell65629 (meio E) suplementado com 0,3 USP/mL de tripsina e atemperatura foi abaixada para 33°C. Durante o período de 10 dias depropagação do vírus, as amostras foram coletadas diariamente e armazenadasa -80°C. Painel esquerdo: densidade das células (xlO6 células/mL), painel 7direito: número total de célula (losango amarelo, xlO células) e viabilidade(círculos vermelhos,%).
Figura 16B - Análise de HA através de ensaios Western-blot e SRID
Foram analisadas as amostras coletadas do biorreator 3L porum período pós infecção de 7 dias para detecção e quantificação de HAproduzido com soro policlonal anti-HA específico de ovelha. Painel esquerdo:a análise western-blot de 4 μι de flutuante viral foi imunotingida com umanticorpo anti-HA de ovelha junto com um IgG anti ovelha conjugado paraperoxidase. O acúmulo de HA é comparado com quantidades crescentes dereagentes padrão derivados de ovos. HAO: subunidade HA não dividida,HA1&HA2: subunidade HA dividida. Painel direito: Quantificação SRID deΙΟμΣ de flutuante viral. O cálculo do conteúdo de HA está relacionado a umacurva de dose resposta dos mesmos reagentes padrão.
FIGURAS 17A e 17B: Produção de cepa do vírus da gripe Bem células EB14 em biorreator 3L
Figura 17A - Cinético do crescimento de células EB14infectadas com cepas do vírus da gripe B/Johannesburg/5/99
Foi permitido que as células EB14 se acumulassem a 37°Cdurante a fase de proliferação celular em um meio de crescimento de célula. Aseguir, as células foram infectadas com IO"4 TCID50/células do vírus da gripeB/Johannesburg/5/99, a mistura foi diluída em meio de produção (meio E)SAFC Excell 65629 suplementada com 0,3 USP/mL de tripsina e atemperatura foi abaixada para 33 °C. Durante um período de 10 dias depropagação de vírus, as amostras foram coletadas diariamente e armazenadasa -80°C. Painel esquerdo: densidade de células (xlO6 células/mL), paineldireito: número total de células (losango amarelo, xlO células) e viabilidade(círculos vermelhos,%).
Figura 17B - Análise Western-blot do vírus da gripe HAB/Johannesburg/5/99 derivado de EB14
Foram analisadas amostras coletadas durante um período pósinfecção de 7 dias para detecção de HA produzido com um soro policlonalanti-HA específico de ovelha. Foram usados 4μΙ. de flutuante viral pararealizar a análise Western-blot onde os anticorpos capturados de antígenoforam imunotingindos com um IgG anti-ovelha conjugado para peroxidase. Oacúmulo de HA é comparado com quantidades crescentes de antígenos padrãoderivados de ovos. HAO: subunidade HA não dividida, HA1&HA2:subunidades HA divididas.
FIGURAS 18A e 18B: Produção de cepas do vírus da gripeΑ/Ή1Ν1 em células EB14 em biorreator 3 OL
Figura 18A - Cinética do crescimento de células EB14infectadas com cepas do vírus da gripe A/Hl Nl/NewCaledonia/20/99
Foi permitido que as células EB14 se acumulassem a 37°Cdurante a fase de proliferação celular em um meio de crescimento de células.A seguir, as células foram infectadas com IO"4 TCID50/células de vírus dagripe A/Hl Nl/NewCaledonia/20/99, a mistura foi diluída em meio deprodução (meio E) SAFC Excell 65629 suplementada com 0,3 USP/mL detripsina e a temperatura foi abaixada para 33°C. As amostras foram coletadasdiariamente e armazenadas a -80°C durante o período de 8 dias de propagaçãode vírus. Painel esquerdo: densidade de células (xlO6 células/mL), paineldireito: número de total de células (losango amarelo, xlO células) eviabilidade (círculos vermelhos,%).
Figura 18B - Análise de hemaglutinina do vírus da gripeEB 14-derivado A/HlNl/NewCaledonia/20/99
Foram analisadas amostras coletadas por um período pósinfecção de 7 dias para a detecção e quantificação de HA produzido com soropoliclonal anti-HA específico de ovelha. Painel esquerdo: análise Western-blot de 4μΕ de flutuante viral onde os anticorpos capturados de antígenoforam imunotingidos com um anticorpo anti-HA de ovelha junto com um IgGanti ovelha conjugado para peroxidase. O acúmulo de HA é comparado comquantidades crescentes de reagentes padrão derivados de ovos. HAO:subunidade HA não dividida, HA1&HA2: subunidades HA divididas. Paineldireito: Quantificação SRID de ΙΟμΙ. de flutuante viral. O cálculo deconteúdo HA está relacionado a uma curva dose resposta dos mesmosreagentes padrão.
EXEMPLOSEXEMPLO 1: Processo de derivação das linhas de células EBx®
O processo de estabelecimento das linhas de células EBx®derivadas de células tronco de embriões aviários foi descrita previamente emW003/076601 e W005/007840. Resumidamente, este processo deestabelecimento das linhas de células EBx® inclui os seguintes passos:
a) isolamento, cultura e expansão de células aviárias preferivelmentecélulas tronco de embriões aviários, em um meio de culturacompleto contendo todos os fatores que permitem seu crescimento ena presença de uma camada células alimentadoras de fibroblastosde rato, preferivelmente inativado, e suplementado com soroanimal;
b) transferência pela modificação do meio de cultura para obter aretirada progressiva ou total de referidos fatores, de referido soro ede referida camada células alimentadoras;
c) estabelecimento linhas de células aviárias aderentes ou nãoaderentes, capazes de proliferar em um meio basal na ausência defatores de crescimento exógenos, camada alimentadoras inativada enível baixo de soro ou nenhum soro;
No evento, o meio basal do passo c) ainda inclui um nívelbaixo de soro (ou seja, aproximadamente 2% ou menos); opcionalmente,referido processo pode incluir um passo adicional d) de mudança do meiobasal deixando de conter o fator de crescimento exógeno, sem nenhumacamada alimentadoras inativada e nível baixo de soro com um meio de culturaselecionado entre:
um meio basal suplementado com soro (i) e diluído com um meiolivre de soro e cultivado a seguir durante as transferênciassucessivas de referidas células aviárias no meio basal (i) na qual arelação do meio livre de soro é aumentada progressivamente até odesaparecimento completo de referido meio basal não contendonenhum fator de crescimento exógeno, nenhuma camadaalimentadoras inativada e nenhum soro;
um meio livre de soro suplementado com soro (ii), cultivando omesmo a seguir durante as transferências sucessivas de referidascélulas aviárias em referido meio (ii) no qual a relação de soro édiminuída progressivamente até a obtenção de um meio livre desoro;
um meio livre de soro (iii), cultivando a seguir referidas célulasaviárias em meio (iii); mantendo a seguir em meio livre de sororeferidas células aviárias adaptadas à mudança do meio.
O termo "fator que permite seu crescimento" como usado nopresente significa o fator de crescimento necessário para a sobrevivência e ocrescimento das células aviárias em cultura. De acordo com a invenção, osfatores de crescimento incluem fatores tróficos e citocinas. Os fatores tróficossão principalmente SCF, IGF-I e bFGF. As citocinas são principalmentecitocinas cuja ação é realizada através de receptor que está associado com aproteína gpl30 como LIF, interleucina 11, interleucina 6, receptorinterleucina 6, CNTF, oncostatina e cardiotrofina.
As células aviárias do passo a) são células selecionadas entreas células de embriões aviários, mais preferivelmente entre as células troncoembrionárias aviárias e células primárias aviárias. Em uma incorporaçãopreferida, as células são células tronco embrionárias aviárias totalmentepotentes ou pluralmente potentes isoladas de uma suspensão de população decélulas blastodérmicas de estágio X dissociado, obtidas de um embriãoaviário, mais preferivelmente de um embrião de galinha (veja a classificaçãoEYAL-GILADI: EYAL-GILADI e KOCHAN, 1976, From cleavage toprimitive streack formation : a complementary normal table and a new Iookat the first stages of the development in the chick ». "General Morphology"Dev. Biol. 49 : 321-337). Estas células tronco embrionárias aviárias sãocaracterizadas por um tempo de duplicação lento que abrange entre 48 a 72horas em cultura a 39°C.
A modificação do meio de cultura do passo b) do processo deestabelecimento das linhas de células EBx®, assim como para obter a retiradaprogressiva ou total dos fatores de crescimento, soro e/ou camadaalimentadoras, podem ser feitos simultaneamente, sucessivamente ouseparadamente. A seqüência do desmame do meio de cultura pode serescolhida entre:
camada alimentadoras / soro / fatores de crescimento;
camada de alimentadoras / fatores de crescimento / soro;
soro / fatores de crescimento / camada de cevador;
soro / camada de alimentadoras / fatores de crescimento;
fatores de crescimento / soro / camada de alimentadoras;
fatores de crescimento / camada de alimentadoras / soro.
Em uma incorporação preferida, a seqüência do desmame éfatores de crescimento / camada de alimentadoras / soro.
Este processo permite uma seleção de clones de células quesão adaptados a estas novas condições de cultura crescentemente drásticas, atéque sejam obtidas as linhas estáveis que são capazes de efetuar o crescimentoem um meio esvaziado de soro ou em um meio completamente livre de soro.As linhas EBx® estabelecidas são preferivelmente não aderentes às célulastronco que proliferam em suspensão em um meio livre de fatores decrescimento exógeno e soro, sem células alimentadoras.
Por "meio de cultura completo", entende se um meio basalsuplementado com fatores de crescimento e soro animal. Exemplos de meiode cultura completo estão descritos em Pain et ai. (1996, desenvolvimento122:2339-2348), EP 787,180 e EUA 6,114,168, EUA 5,340,740, EUA6,656,479 e EUA 5,830,510. De acordo com a invenção, "meio basal"significa um meio com uma formulação de meio clássica que permite, por sisó, pelo menos a sobrevivência das células, e até melhor, o crescimento dascélulas. Exemplos de meio basal são meio SFM como previamente descritoou meio tal como BME (Eagle Médium basal), MEM (Eagle Médiummínimo), meio 199, DMEM (Eagle Médium Dulbecco modificado), GMEM(Eagle Médium Glasgow modificado), DMEM-HamF 12, Ham-F 12 e Ham-F10, meio Dulbecco modificado de Iscove, meio 5A de MacCoy, RPMI 1640.O meio basal inclui sais inorgânicos (por exemplos: CaCl2, KCl, NaCl,NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4,...), aminoácidos, vitaminas (tiamina,riboflavina, ácido fólico, D-Ca pantotenato,...) e outros componentes comoglicose, beta-mercaptoetanol, piruvato de sódio.
É possível distinguir esquematicamente duas famílias defatores de crescimento: as citocinas e os fatores tróficos. As citocinas sãoprincipalmente citocinas cuja ação é efetuada através de um receptor que estáassociado com a proteína gpl30. Assim, a LIF, interleucina 11, interleucina 6,receptor interleucina 6, CNTF, oncostatina e cardiotrofina têm um modosemelhante de ação com o recrutamento ao nível do receptor de uma cadeiaespecífica e a combinação deste último com a proteína gpl30 em formamonomérica ou às vezes heterodimérica. Os fatores tróficos sãoprincipalmente SCF, IGF-I e bFGF. Mais preferivelmente, o meio completoinclui o meio basal, fator de Crescimento de Insulina 1 (IGF-1), fator CiliarNeurotrófico (CNTF), Interleucina 6 (IL-6), receptor interleucina 6 (IL-6R),Fator de célula tronco (SCF), Fator de Crescimento de Fibroblasto básico(bFGF), opcionalmente interleucina 11 (IL-Il) e soro animal. As célulasaviárias, preferivelmente as células embrionárias aviárias do passo a) sãocultivadas durante várias transferências no meio completo. O meio ésuplementado com pelo menos um dos fatores de crescimento selecionados nogrupo de: LIF, IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, IL-11, oncostatina,cardiotrofina. De acordo com uma incorporação preferida, o meio de culturacompleto é o meio basal suplementado com IGF-I e CNTF. De acordo comoutra incorporação preferida, o meio de cultura completo é o meio basalsuplementado com IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, opcionalmenteIL-11,. A concentração dos fatores de crescimento IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R,SCF, bFGF, opcionalmente IL-Il no meio basal abrange entreaproximadamente 0,01 até 10 ng/ml, preferivelmente, 0,1 até 5 ng/ml, e maispreferivelmente aproximadamente 1 ng/ml.
Depois de aproximadamente 3 a 10 transferências, o meiocompleto é desdobrado em fatores de crescimento (passo b). Preferivelmente,para cada fator de crescimento, a depleção é realizada diretamente em umpasso, de uma transferência para a outra. Alternativamente, a depleção dofator de crescimento é realizada gradualmente, pela diminuição progressiva daconcentração do fator de crescimento no meio completo. Em umaincorporação de maior preferência, a depleção dos fatores de crescimento érealizada simultaneamente por pelo menos dois fatores de crescimento. Emuma incorporação preferida, quando o meio de cultura completo é o meiobasal suplementado com IGF-I e CNTF, a depleção em fatores decrescimento é realizada em um ciclo de depleção. Em outra incorporaçãopreferida, quando o meio de cultura completo é o meio basal suplementadocom IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, opcionalmente IL-11. Adepleção em fatores de crescimento é realizada em dois ciclos de depleção:primeiramente, SCF, IL6, IL6R, bFGF opcionalmente ILll que sãoremovidos diretamente do meio completo; a seguir, as células aviárias sãomantidas em cultura durante pelo menos uma transferência em um meiocompleto que contém IGFl e CNTF, opcionalmente IL-11, e sãosuplementadas com soro animal. Secundariamente, o IGFl e CNTF,opcionalmente IL-11 são retirados diretamente do meio de cultura que, emúltima instância, inclui apenas o meio basal suplementado com soro.Normalmente, o meio é totalmente desdobrado em fatores de crescimento emaproximadamente as transferências 20 a 30.
Em uma incorporação preferida, a privação de célulasalimentadoras é realizada depois da privação de fatores de crescimento. Aprivação de células alimentadoras é progressiva e realizada ao longo de váriastransferências. A seguir, as células aviárias são semeadas em frascos com umaconcentração mais baixa do que no passo a), com aproximadamente 4 χ IO4células/cm2 até 5 χ IO4 células/cm2. As células alimentadoras são semeadasem frascos com aproximadamente 4,2 χIO4 células/cm2. Progressivamente, aconcentração das células alimentadoras no frasco é diminuída. Praticamente, amesma concentração das células alimentadoras é usada para 2 a 4transferências, a seguir é usada uma concentração mais baixa das célulasalimentadoras para 2 a 4 transferências adicionais, e assim por diante. Aseguir, o frasco é semeado com aproximadamente 4,2 χIO4 célulasalimentadoras/cm2, seguido de aproximadamente 2,2 χ IO4 célulasalimentadoras/cm , então cevador ao redor 1,8 χ 10 células alimentadoras/cm2, seguido de aproximadamente 1,4 χ IO4 células alimentadoras /cm2,seguido de aproximadamente 1,1 χ IO4 células alimentadoras /cm2, seguido deaproximadamente 0,9 χ IO4 células alimentadoras /cm2, seguido deaproximadamente 0,5 χ IO4 células alimentadoras/cm2. A seguir, o frasco ésemeado com 6,5 χ IO4 células aviárias/cm2 até 7,5 χ IO4 células aviárias/cm2e sem células alimentadoras. Na hipótese de que as células aviárias nãoestejam em boa forma após a diminuição da concentração de célulasalimentadoras no frasco, as células aviárias serão cultivadas paratransferências adicionais com a mesma concentração de células alimentadorasantes de realizar a privação de células alimentadoras.
Em outra incorporação preferida, a privação de soro érealizada depois do fator de crescimento e a privação de célulasalimentadoras. O meio basal é mudado por um meio selecionado entre:
- O meio basal (i) complementado com soro e diluído com umnovo meio livre de soro (ii). A seguir, células aviárias sãocultivadas por transferências sucessivas no meio (i) no qual aproporção do meio livre de soro é aumentada progressivamente atéo desaparecimento completo do meio basal complementado no soro(diluição progressiva).
- Um novo meio livre de soro (ii) complementado com soro. Aseguir, as células aviárias são cultivadas por transferênciassucessivas no meio (ii) no qual a proporção de soro é diminuídaprogressivamente até a obtenção de um meio livre de soro(desmame progressivo).
- Um novo meio livre de soro (ii) não complementado com soro. Aseguir, as células aviárias estão diretamente no meio livre de soro(ii) (desmame direto).
Em uma incorporação preferida, a privação de soro é realizadapor desmame progressivo.
As células alimentadoras são células animais que forampreferivelmente inativadas através de irradiação ou quimicamente tratadascom mitomicina. As células alimentadoras podem ser modificadasgeneticamente para expressar fatores de crescimento como SCF.
Preferivelmente, as células alimentadoras são linhas celulares de fibroblastosde camundongo como STO (Coleta de Cultura Tipo Americana ATCCNOCRL-1503).
Este processo conduz ao estabelecimento de linhas celularesderivadas de embriões aviários denominadas EBx® que são mantidas emcultura in vitro por um período considerável de tempo. Vantajosamente, ascélulas EBx® obtidas no passo c) são capazes de proliferação durante pelomenos 50 dias, 100 dias, 150 dias, 300 dias ou preferivelmente pelo menos600 dias. Os 600 dias não constituem um tempo limitado porque as célulasEBx® obtidas ainda estão vivas após períodos de tempo mais longos. Porexemplo, um Banco de Célula Mestre de células EB14 foi produzido natransferência P160 e um banco de células EB14 de Fim do Produção foiproduzido na transferência P184 e as células EB14 ainda são capazes deproliferar. Conseqüentemente, estas linhas são consideradas como sendocapazes de crescer indefinidamente em um meio de cultura básica livre dofator de crescimento exógeno, soro e/ou camada de células alimentadorasinativadas.
A expressão "linha" é entendida como significando qualquerpopulação de células capazes de proliferar indefinidamente em cultura in vitroenquanto mantém em grau maior ou menor as mesmas característicasmorfológicas e fenotípicas. Evidentemente, o método acima mencionadotorna possível obter clones celulares derivados de células obtidas das linhasestabelecidas. Estes clones são células que são geneticamente idênticas àscélulas das quais as mesmas são derivadas através de divisão.
As linhas celulares estabelecidas e as células derivadas dasmesmas (passo c ou d) são preferivelmente linhas celulares de células troncoderivadas de embriões aviários, mais precisamente aquelas células troncoderivadas de embriões aviários pluripotentes. As células tronco derivadas deembriões aviários EBx® que podem ser obtidas pelo processo da invençãosão células pequenas, redondas, individualizadas com um tempo deduplicação de aproximadamente 24 horas ou menos, a 39°C. As células quepodem ser obtidas pelo processo da invenção são pelo menos da transferênciap60, pelo menos p70, pelo menos p80, pelo menos p90, pelo menos ρ 100,pelo menos pl 10 pelo menos ρ 120, pelo menos ρ 130, pelo menos P150, pelomenos P160, pelo menos P170, pelo menos P180 ou posteriores. As célulastronco derivadas de embriões aviários, de acordo com a invenção, têm pelomenos uma das seguintes características:
uma relação alta núcleo citoplasma,
uma atividade de fosfatase alcalina endógena,uma atividade de telomerase endógena,
uma reatividade com anticorpos específicos contra SSEA-I(TEC01), SSEA-3, e EMA-1.
as mesmas expressam o gene ENS1;
Um tempo de duplicação menor que o tempo de duplicaçãodas células aviárias do passo a) do processo da invenção (48 a 72h a 39°C), deaproximadamente 24 horas ou menos nas mesmas condições de cultura. Estaslinhas celulares EBx® são capazes de proliferar indefinidamente em um meiobasal, em particular em um meio como SAFC de Excell, DMEM, GMEM,HamF 12 ou McCoy suplementadas com vários elementos aditivoscomumente usados por pessoas qualificadas na arte. Entre os aditivos, podemser mencionados os aminoácidos não essenciais, vitaminas e piruvato desódio, ácidos graxos, levedura e soja hidrolisada. Porém, as células podemproliferar em meio basal sem glutamina. Estas linhas celulares e as célulasderivadas têm a característica de crescer tanto como células aderentes oucomo células de suspensão.
Preferivelmente, as células EBx® da invenção,preferivelmente as células EB14, têm todas as características acimamencionadas e são úteis para a produção de produtos biológicos como vacinasvirais e peptídeos recombinantes e proteínas (ou seja, anticorpos,...).
EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS EB14
2.1 - Cariótipo das células EB14
A análise de cariotipagem de células EB14 foi realizada nolaboratório Pr. Michel Franck, Unidade de zootecnia, etnologia e economiarural, Escola Nacional de Veterinária, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy1'Etoile, França.
As células EB14 foram cariotipadas em duas transferênciasdiferentes (Transferência 105 e 118) usando técnicas padrão bem conhecidaspara o homem qualificado na arte. Como esperado, as células EB14 nastransferências 105 e 118 mostram um cariótipo diplóide(Figura 2):
Transferência 105: número modal de cromossomos = 78(média geral: 78,41 - desvio padrão: 4,951 mais de 53 metafases estudadas)
Transferência 118: número modal de cromossomos = 79(média geral: 79,68 - desvio padrão: 3,733 mais de 50 metafases estudadas).
O genoma da galinha inclui dois tipos de pares decromossomos: macro e micro cromossomos. A análise da transferência 115mostra que o número modal de macro cromossomos é de 18 com média geralde 17,82 e desvio padrão de 0,833 e um número modal de microcromossomos de 60 com média geral de 60,6 e desvio padrão de 4,7. Aanálise da transferência 118 mostra que o número modal de macrocromossomos é de 18, com média geral de 18,24 e desvio padrão de 0,797 eum número modal de micro cromossomos de 60, com média geral de 61,44 edesvio padrão de 3,688. Não há nenhum desvio significativo na distribuiçãode cromossomos entre as duas transferências estudadas.
As linhas celulares EB14 mostram um cariotipo diplóide (ZZ)macho normal nas transferências 105 e 118, que demonstra a estabilidadecromossômica das células EB14.
2.2 - Análise de tumorigenicidade das células EB14 emmodelo de rato recém nascido imuno suprimido
A tumorogenicidade das células EB14 na transferência 127 foiavaliada no modelo de rato recém nascido imuno suprimido (SanofiAventis, França) (Relatório técnico da OMS N0 878 (1998). Células HeIaforam usadas como controles positivos. Dez ratos recém nascidos imunosuprimidos foram injetados por via subcutânea com 10 milhões de célulasEB14 e dez ratos recém nascidos imuno suprimidos foram injetados por viasubcutânea com 10 milhões de células HeIa. Todos os animais receberam 0,1ml de soro de rato anti timócito nos dias 0, +2, +7 e +14. Os animais foramobservados regularmente durante três semanas para detectar nódulos no localda injeção. Depois de 3 semanas, os animais foram mortos e examinados paradetectar a proliferação de células no local da injeção e em outros órgãos. Nãofoi observado nenhum nódulo ou tumor no local de injeção das células EB14ou em órgãos distantes. As células EB14 não foram tumorigênicas no modelode rato recém nascido imuno suprimido.
2.3 - As células EB14 expressam receptores do vírus da gripeaviária e humana
A detecção de receptores de vírus da gripe aviário (Sia 2-3GaI)e humana (Sia 2-6Gal) em células EB14 é realizada através da análise declassificador de célula por fluorescência usando lectinas rotuladas comdigoxigenina (Boehringer):
□ A Sambuca nigra (SNA) lectina aglutinina liga seespecificamente à Sia 2-6Gal;
□ A Maackia amurensis (MAA) lectina aglutinina liga seespecificamente à Sia 2-3Gal.
As linhas celulares EB14 e MDCK foram lavadas em IOmMHEPES, 150mM NaCl pH 7,5 e re suspendidas no mesmo tamponamentocom uma concentração final de 5, IO6. As células foram incubadas durante 30min em gelo, e a seguir durante 15 a 30 minutos adicionais na presença deSNA ou MAA. As células tratadas com lectina foram lavadas em IOmMHEPES, 150mM NaCl pH7,5, antes da incubação em gelo durante 15 a 30minutos com anticorpo anti digoxigenina rotulado com FITC. A seguir, ascélulas são lavadas em NaCI 0,9% e analisadas através de FACS.
As células EB14 expressam receptores de superfície de célulasque incluem oligossacarídeos com Sia 2-6Gal e Siaa2-3Gal (Figura 6).
EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE MVA EM CÉLULAS EB14
3.1 - Materiais e Métodos
Foi usado vírus MVA recombinante codificando o gene deproteína verde fluorescente. A titulação dos vírus infecciosos de MVA-GFPfoi realizada em células DF-1. Em resumo, as células foram semeadas em 96pratos de poços com fundo bem liso, com uma densidade de 15,10células/poço em médio DMEM (Biowhittaker) suplementado com 5% de sorode feto de bezerro (FCS) (SAFC) e 2 mM de L glutamina (Biowhittaker).Vinte e quatro horas depois, as células foram infectadas com amostrasdiluídas dez vezes consecutivas em DMEM e incubadas durante uma semanaa 37°C, 5% CO2 em uma atmosfera umedecida. A infectividade do vírus foimedida por observação microscópica do efeito citopático global (CPE) e decélulas infectadas expostas a UV. A seguir, foram calculadas as titulaçõesTCID50 de acordo com o método Reed e Muench (1938, A simple method ofestimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97).
3.2 - infecção em frascos de cultura de tecido
3.2.1 - Materiais
o Vaso: frasco F175 (Starstedt, Ref. 83 1812502)
o Agitador Orbital: IKA KS260 ou equivalenteo Ultra-som: IKA U50 (monitorado com sonda US50-3)
o Meio: Excell 65319 (SAFC-JRH) com Glutamina
2,5 mM (Cambrex Ref. BE17605E);
3.2.2 - Métodos
PASSO 1: preparação de células EB14
As células devem ser preparadas 2 semanas antes de começar aexperiência de infecção.
Dia 0: As células EB14 são semeadas em frascos F175 com0,4x106 células/mL em 25 ml de meio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM[Ia semeadura depois da quebra das aglomerações]. As células são incubadasa 37°C; 7,5%C02, atmosfera umedecida sob agitação (60 rpm)
Dia 1: São adicionados 25 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 2: São adicionados 50 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 3: As células são contadas. Uma alíquota de células EB14é semeada em um novo frasco F175 com 0,4x106 células/mL em 25 ml demeio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM. Isto representa a diluição +1.
Dia 4: são adicionados 25 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 5: São adicionados 50 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 6: As células são contadas. Uma alíquota de células EB14é semeada em um novo frasco F175 com 0,4x106 células/mL em 25 ml demeio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM. Isto representa a diluição +2.
A seguir, a amplificação das células continua desta forma, atéuma diluição que esteja incluída preferivelmente entre +3 até +7, maispreferivelmente +3 até +5. A seguir, deve ser executado o passo 2 de infecçãode células.
Para obter uma cultura de célula contendo grandes célulasEBx® aglomeradas (de aqui em diante denominadas: condições de "grandesaglomerações"), quando as células são transferidas por diluição para grandesvasos, as células EBx® não são centrifugadas, e as aglomerações não sãoquebradas através de pipetagem e agitação. Ao contrário, para obter umacultura de célula sem uma proporção significativa de células EBx®aglomeradas, as aglomerações são rompidas através de pipetagem ou agitaçãoquando é realizada a transferência das células (de aqui em diante denominada:condição "sem aglomerações").
PASSO 2: Infecção de células EB14 com MVA-GFP (proteínafluorescente verde)
Dia 1: As células EB14 são semeadas em um frasco F175 com0,4x106 células/mL em 40mL de meio JRH Excell 65319 com Glutamina2,5mM. As células são incubadas a 37°C, 7,5% CO2, com atmosferaumedecida sob agitação (60 rpm).
Dias 2 e 3: As células são contadas.
Dia 4: As células são contadas. Quando a densidade dascélulas no frasco é de aproximadamente 4x106 células/ml, as células EB14são infectadas com um MOI de 0,01 TCID50/células com mistura de infecçãoviral 1 ml por frasco. A mistura de infecção viral deverá preparadaimediatamente antes de usar, por diluição de vírus em meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Cada inóculo é submetido a ultra-som durante 30 segundos(amplitude 100% e ciclo contínuo) em gelo, em um tubo de 15 ml Falcon™.O inóculo é esquentado a temperatura ambiente antes de ser misturado com acultura de células.
Após a inoculação, o meio de cultura infectado é incubadodurante lha 37°C. A seguir, 60 ml de meio fresco Excell 65319 completadocom Glutamina 2,5 mM, 0,5x solução aquosa de levedura e 0,35ml/L deácidos graxos são adicionados ao frasco. A cultura de células infectada éincubada adicionalmente a 310C durante pelo menos 144h (Nota: o pico deprodução viral está entre pi + 72 h e pi + 120 h).
As amostras de cultura de células (ImL) são coletadas a cada24h e mantidas congeladas a -80°C. Antes da coleta da amostra, a cultura decélulas é homogeneizada através de pipetagem suave. A titulação de vírus emcada amostra coletada é realizada ao término da experiência usandoTCID50/mL pelo método de Reed e Muench (1938).
3.3 - Infecção em rotor de pás helicoidais
3.3.1 - Materiais
o Vaso: frasco com rotor de pás helicoidais de 500 ml
e de 1 litro (Corning)
o Agitador Orbital: IKA KS260 ou equivalente
o Ultra-som: IKA U50 (monitorado com sonda US50-3)o Meio: Excell 65319 (SAFC-JRH) com Glutamina
2,5 mM (Cambrex Ref. BE17605E);
3.3.2 - Método
PASSO 1: Preparação de células EB14
As células devem ser preparadas 2 semanas antes de começar aexperiência de infecção.
Dia 0: As células EB14 são semeadas em frasco F175 com0,4x106 células/mL em 25 ml de meio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM[Ia semeadura depois da quebra das aglomerações]. As células são incubadasa 37°C, 7,5%C02, atmosfera umedecida sob agitação (60 rpm)
Dia 1: São adicionados 25 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 2: São adicionados 50 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 3: As células são contadas. Uma alíquota de células EB14é semeada em um novo frasco F175 com 0,4x106 células/mL em 25 ml demeio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM. Isto representa a diluição +1.
Dia 4: São adicionados 25 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 5: São adicionados 50 ml de meio Excell 65319 comGlutamina 2,5mM.
Dia 6: As células são contadas. Uma alíquota de células EB14é semeada em um novo frasco F175 com 0,4x106 células/mL em 25 ml demeio Excell 65319 com GIutamina 2,5mM. Isto representa a diluição +2.
A seguir, a amplifícação das células continua desta forma, atéque a diluição esteja incluída preferivelmente entre +3 a +7, maispreferivelmente +3 a +5. A seguir deve ser executado o passo 2 de infecçãodas células.
Para obter uma cultura de célula contendo células EBx®®com grande aglomeração (de aqui em diante denominada: " grandesaglomerações "), quando as células são transferidas por diluição para vasosgrandes, as células EBx® não são centrifugadas, e as aglomerações não sãoquebradas através de pipetagem e agitação. Ao contrário, para obter umacultura de células sem proporção significativa de células EBx® aglomeradas,as aglomerações são rompidas através de pipetagem ou agitação por ocasiãoda transferência das células (de aqui em diante denominada: "sem aglomerações").
PASSO 2: Infecção de células EB14 com MVA-GFP
Dia 1: As células EB14 são semeadas em frasco com rotor depás helicoidais de 500 ml (ou 1.000 ml) com 0,4x106 células/mL em 15 OmL(ou 300ml) de meio JRH Excell 65319 com Glutamina 2,5mM. As células sãoincubadas a 37°C, 7,5% CO2, atmosfera umedecida sob agitação (100 rpm).
Dias 2 e 3: As células são contadas.
Dia 4: As células são contadas. Quando a densidade da célulano frasco com rotor de pás helicoidais é de aproximadamente 4x106células/ml, as células EB14 são infectadas com um MOI de 0,01TCID50/célula com 1 ml de mistura de infecção viral por frasco com rotor depás helicoidais. A mistura de infecção viral é preparada imediatamente antesde usar por diluição do vírus em meio Excell 65319 com Glutamina 2,5mM.Cada inóculo é submetido a ultra-som durante 30 segundos (amplitude 100%e ciclo contínuo) em gelo, em tubo de 15 ml Falcon™. O inóculo é aquecido atemperatura ambiente antes de ser misturado com a cultura de células. Após ainoculação, o meio de cultura infectado é incubado durante Ih a 37°C. Aseguir, 60 ml de meio fresco Excell 65319 suplementado com Glutamina 2,5mM, 0,5x de solução aquosa de levedura e 0,35ml/L de ácidos graxos sãoadicionados aos 500ml (ou 1 .OOOml) no frasco com rotor de pás helicoidais. Acultura de células infectada é incubada adicionalmente a 37°C durante pelomenos 144h (Nota: o pico de produção viral está entre pi + 72 h e pi + 120 h).As amostras de cultura de células (ImL) são coletadas a cada24h e mantidas congeladas a -80°C. Antes da coleta da amostra, a cultura decélula é homogeneizada através de pipetagem suave. A titulação de vírus emcada amostra coletada é realizada ao término da experiência usandoTCID50/mL pelo método de Reed e Muench (1938) ** Reed L & Muench H(1938) A simple method of estimating flfty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27,493-97
3.4 - Infecção em Biorreator de 3L com agitador no tanque
3.4.1 - Método
Descongelamento das Células
Os frascos criogênicos são armazenados em nitrogênio líquidoa -196°C; cada frasco criogênico contém 20. IO6 células. Os frascoscriogênicos são descongelados diretamente em um banho de água préaquecido a 37°C para descongelar rapidamente o frasco congelado. Asuspensão de células é pipetada para um tubo estéril PP de 50 mL com 30 mLde meio de cultura pré aquecido.
A suspensão de células é centrifugada durante 5 min a 300±20g, a temperatura ambiente, o flutuante é descartado e o aglomerado é resuspendido em 15 ml de meio de cultura fresco, sendo homogeneizado comsuavidade. A suspensão de células é colocada em um frasco T75 cm2 sendoincubada a 37°C sob uma atmosfera de 7,5% CO2 em um agitador orbital a 50rpm. Depois de 24 horas e 48 horas de cultura, 15 ml de meio de cultura préaquecido é adicionado à cultura de células. Depois de 72 horas de cultura,uma amostra é coletada (depois da homogeneização a granel) sendo realizadauma contagem: são esperadas >40. IO6 células. A seguir é realizada a primeiraamplificação.
Primeira amplificação de células: centrifugação, dissociação ediluição.
As células da suspensão são coletadas do frasco(s) em tubo(s)estéril PP de 50 mL. Depois de 5 min de centrifugação a 300 ±20 g, atemperatura ambiente, o flutuante é descartado e 10 mL de meio de culturafresco pré aquecido é adicionado ao aglomerado(s). As aglomerações dascélulas são dissociadas com suavidade com uma pipeta de 10 mL e assuspensões das células são agrupadas em um tubo estéril PP de 50 mL, senecessário. O volume de cultura é completado até 20 mL com meio de culturafresco pré aquecido, se necessário. E realizada uma contagem usando tripanoazul para determinar a densidade e viabilidade das células (a viabilidade dascélulas é tipicamente de aproximadamente 80%). Em 1 frasco T175 cm,0,4. IO6 células.mL"1
são semeados em 40 ml de meio de cultura pré aquecido.A cultura de células é incubada a 37°C sob uma atmosfera de 7,5% CO2 emum agitador orbital a 50 rpm. No dia 2, 60 ml de meio de cultura préaquecido são adicionados à cultura de células. No dia 3, é realizada a diluiçãode célula.
Diluição +1 a +5 Csem centrifugação. sem dissociação,somente diluição).
Uma amostra é coletada do frasco T175 (depois de misturarcom suavidade) para realizar uma contagem usando tripano azul, paradeterminar a densidade das células. Uma amostra é coletada do frasco Tl 75(depois de misturar com suavidade) para semear 0,4. IO6 células.mL"1 em 1frasco Tl 75 cm com volume total de 25 ml de meio de cultura pré aquecido.
Isto representa a diluição +1.
No dia 1, são adicionados 50 ml de meio de cultura préaquecido. No dia 2, é realizada a Diluição +2 usando o mesmo procedimentoda diluição +1 (veja acima). A amplificação de células é realizada destaforma, até a Diluição +3 a +5. O inóculo para o biorreator 3L pode serpreparado a partir da Diluição +3 até a Diluição +5. Dois frascos Tl75 sãopreparados como um inóculo.
Semeadura de células em biorreatores 3L com agitador notanque
Semeadura - Dia O
O inóculo é preparado (são necessárias 320. IO6 células parainocular os biorreatores 3L). Os 2 frascos Tl75 são agrupados. Uma amostraé coletada após misturar com suavidade (as aglomerações de células nãodevem ser quebradas) para realizar uma contagem usando tripano azul paradeterminar a densidade da célula. Uma mistura de célula de 150 mL épreparada para obter uma concentração de células de 0,40. IO6 células.mL"1 novolume de cultura final de 800 ml no biorreator.
Antes de semear as células, o pH é ajustado no vaso a 7,2(porque o pH diminuirá por ocasião da injeção da superfície de CO2). Os ρθ2são ajustados com 50% de saturação de O2 (o controlador de fluxo de massa éajustado a 100%, o que corresponde a uma taxa de fluxo máximo de aspersãocom 50 mL.min"1). No início do processo, o pH é mantido através da injeçãode superfície CO2, a seguir, o pH é controlado por adição de NaHCO3 7,5%.A aeração da superfície é iniciada com ar, com uma taxa de fluxo de 0,3mL.min"1.
Acompanhamento de cultivo / Adição de alimentação (Dia 1. Dia 2)
A contagem de célula é realizada de forma rotineira. Osmetabólitos tais como glutamato, glutamina, lactato e glicose são todosanalisados ao longo da cultura com o software BioProfile Básico. Aconcentração dos metabólitos é ajustada, se necessário. Por exemplo, aconcentração de Glutamina é ajustada a 2 mM.
Infecção com MVA-GFPfDia 3)
Após 3 dias de cultura, a densidade das células deve ser maiorque 3.106 células.mL"1. Se a densidade das células alvo é alcançada (3 a 5.109 2 células.mL"), a infecção com o vírus é realizada com um MOI de 10"TCID50/célula. A cepa de vírus é descongelada dentro de um recipiente comgelo. A mistura de infecção é preparada em um tubo estéril PP de 50 mL com10 mL de meio de produção. A mistura é submetida a ultra-som durante 30segundos (amplitude 100% e ciclo contínuo) em gelo. A mistura de infecção éinoculada no biorreator. Depois de 1 hora de adsorção viral, o meio deprodução final é adicionado ao vaso. O meio de produção 1,5 L Excell 65319em 1,5 L é suplementado com solução aquosa de levedura e ácidos Graxos,com concentração final de 0,5X e 0,35ml/L respectivamente (volume final:2,3L).
Acompanhamento da produção / Adição de Alimento (Dia 4,Dia 5. Dia 6. Dia 7, Dia 8. Dia 9. Dia 10)
O pico da produção viral MVA é alcançado entre 72h e 120hpós infecção. Uma amostra de aproximadamente 15 ml é coletadadiariamente do biorreator para realizar a contagem de células, análise demorfologia das células e para observar o CPE. Os metabólitos comoglutamato, glutamina, lactato e glicose são todos analisados ao longo dacultura com o software BioProfile Básico.
A concentração de metabólitos é ajustada, se necessário. Porexemplo, a concentração de glutamina é ajustada para 2 mM, se necessário. Aconcentração de glicose é ajustada para 2 g.L'1. se necessário.
Análises
A titulação de vírus é realizada ao término da experiência,usando todas as amostras coletadas.
3.5 - Resultados
3.5.1 - Cinética do crescimento de células EB14 em umbiorreator 3L com rotor de pás helicoidais
As células EB14 são cultivadas rotineiramente em umbiorreator com agitador no tanque. E permitido que a biomassa derivadoEB14 se acumule a 37°C em um meio de crescimento de células, até seralcançada uma densidade das células de 5-6.IO6 células/mL. A seguir, amistura é diluída aproximadamente 3 vezes, sendo acompanhada a e cinéticado crescimento das células por um período de 10 dias. Nestas condições, adensidade das células de 12 a 16 milhões de células/ml, a qual é alcançadarotineiramente em aproximadamente no dia 5 a 8 (Figura 7 A). A relação dedivisão das células EB14 pode ser aumentada. A Figura 7B mostra a cinéticado crescimento das células EB14 diluídas 10 vezes.
3.5.2 - Flexibilidade das células EB-14: purificação de placasde vírus MVA-GFP em células aderentes
As células EB14 crescem na cultura em suspensão. Porém, ascélulas EB14 também têm a capacidade de crescer por aderência em frascos epratos. Esta característica permite que os inventores realizem a purificação deplaca de MVA-GFP em células EB14 aderentes. Para fazê-lo, diluições de dezvezes consecutivas do vírus MVA-GFP foram inoculadas em células EB-14aderentes semeadas em 6 poços revestidos 24h antes com densidade de 7. IO4células/cm2. Após a adsorção do vírus, as células estavam sobrepostas emcamadas com uma mistura de 1.2% LMP de agarose/2,5% FCS DMEM eforam incubadas a 37°C durante vários dias. Finalmente, os poços foramtingidos com vermelho neutro. A titulação unitária de formação de placa podeser calculada a seguir com diluições fornecendo placas isoladas.
3.5.3 - Influência do meio de produção e tamanho dasaglomerações para a propagação de vírus MVA-GFP em células EB14infectadas
Foi permitido que as células EB14 formassem aglomeraçõespequenas ou grandes em frascos T175 submetidos a agitação durante aproliferação das células em um meio de crescimento de células (Excell65319). A seguir, as aglomerações foram infectadas com
10" TCID50/célula
de vírus MVA-GFP e a mistura foi diluída em vários meios de produção(Optipro, Excell 319, Excell 421, Excell 625, Excell 626, Excell 627, Excell628, Excell 629, G9916).A presença de grandes aglomerações de células EB14 melhoraa infecção e propagação do vírus (Figura 8), resultando em titulações maioresdo vírus MVA (Figura 9). A adição de suplementos como solução aquosa delevedura (suplemento 1) e ácidos graxos (suplemento 2), adicionalmente nomeio de produção do vírus melhora a titulação do vírus MVA. Comomostrado na figura 10, quando apenas a solução aquosa de levedura IX(suplemento 1) é adicionada ao meio, o rendimento viral do MVA-GFP éaumentado, obtendo-se um efeito de sinergia inclusive quando foremadicionados a solução aquosa de levedura (suplemento 1) e os ácidosgordurosos (suplemento 2) no meio de crescimento de células. Realmente, oácido graxo IX isoladamente não aumenta a titulação viral.
3.5.4 - Produção de vírus MVA em biorreator 3L
Foi permitido que a biomassa derivada de EB14 se acumulassedurante a fase de proliferação das células em meio de crescimento Excell65319. A seguir, as células foram infectadas com 10"z TCIDso/célula de vírusMVA-GFP e a mistura foi diluída em meio de produção Excell 65319. Após aadição de Excell 65319, a densidade das células diminuiu (dia 3), e no dia 5, adensidade das células infectadas aumentou e alcançou 4 milhões decélulas/ml. O fato de não ser realizada nenhuma centrifugação durante aamplificação das células permite que as mesmas adquiram o tamanho degrandes aglomerações em cultura de 2 a 4 dias pós infecção (Figura 11).Nestas condições, a produtividade de MVA-GFP é alta. Desde o dia 6 pósinfecção, a titulação de MVA-GFP é de aproximadamente IO8 32 TCID50/ml(concentração das células de 1.49x106 células/ml) que corresponde aTCID50/célula = 414 (fator de amplificação 41.000) (Figura 12).
Aparentemente, quando as células EB14 são ampliadas sem romper asaglomerações (por diluição, por exemplo), é obtida uma titulação viral maisalta no biorreator 3 L comparada com aquela obtida na ausência de grandesaglomerações (fator de amplificação de aproximadamente 1900 eTCID50/célula = 19) nas culturas de células.
3.5.5 - Ultra-estrutura normal das células EB14 infectadascom MVA
Células EB14 infectadas com vírus MVA foram analisadasatravés de microscópio de elétrons (Drs. Daniele Spehner & Robert Drillien,IGBMC, Strasbourg, França). A maturação do vírus MVA produzida nascélulas EB14 é normal e semelhante àquela observada em fibroblastos deembrião primário de galinha.
EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE VÍRUS DA GRIPE EMCÉLULAS EB14
4.1 - Materiais & Métodos
4.1.1 - Ensaio de infectividade com vírus da gripe (TCID50)
A titulação do vírus infecciosos da gripe foi realizada emcélulas MDCK. Em resumo, as células foram semeadas em 96 pratos compoços de fundo bem liso com uma densidade de 3.10 células/poço em meioUltraMDCK suplementado com 2,5 mM L-glutamina. Vinte e quatro horasdepois, as células foram infectadas com amostras diluídas dez vezes de formaconsecutiva em UltraMDCK contendo 6μg.mL"1 tripsina-EDTA e incubadasdurante uma semana a 33 °C, 5% CO2 em uma atmosfera umedecida. Aseguir, a replicação do vírus foi testada em um ensaio de HA usando hemáciasde galinha e as titulações TCID50 foram calculadas de acordo com o métodode Reed e Muench (1938) ** Reed L, Muench H, 1938. A simple method ofestimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
4.1.2 - Ensaio de imunodifusão radial única (SRID)
A concentração de hemaglutinina em amostras derivadas decélulas EB14 infectadas com vírus da gripe foi determinada como descritopelo Wood e colegas *. Resumidamente, pratos de vidro foram cobertos comum gel de agarose contendo soro anti gripe (concentração recomendadafornecida por NIBSC). Depois da fixação do gel, 10 μί de diluiçõesapropriadas da referência e das amostras foram carregados em poçosperfurados com 0 3mm. Após a incubação de 18-24h em uma câmara úmidaa temperatura ambiente, os pratos foram embebidos em NaCI 0,9% e foramlavados com água destilada. A seguir, o gel foi então prensado e secado. Ospratos estavam tingidos com solução Azul Brilhante Coomassie durante 15min e tiveram a tintura retirada duas vezes com uma mistura de metanol eácido acético até que as zonas tingidas claramente definidas ficassem visíveis.
Depois de secar os pratos, foi medido o diâmetro das zonas tingidas em tornodo antígeno, em duas direções em ângulos retos. Foram desenhadas as curvasdose resposta das diluições do antígeno contra a superfície e os resultadosforam calculados de acordo com o método de ensaio padrão da relação darampa. *Wood JM. Etal. "An improved single-radial-immunodiffusiontechnique for the essay of influenza haemagglutinin antigen: application forpotency determinations of inactivated whole VÍRUS and subunit vaccines". JBiol Stand. 1977;5(3):237-47).
4.1.3 - Análise Western-blot da proteína de hemaglutinina dagripe
Foi realizado o teste SDS-PAGE como descrito por LaemmliREINO UNIDO (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685) em 10% de gel depoliacrilamida. As proteínas desnaturadas (1% SDS, 70mM Bmercaptoetanol) foram transferidas para a membrana de difluoreto depolivinilideno (hybond P, Amersham) através de um procedimento de manchasemi seco (Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels: asimple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins frompolyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods 10:203-209).
As manchas foram bloqueadas durante Ih a temperatura ambiente com umamistura composta de 5% de gordura de leite em pó seco em TBSTsuplementado com FCS 1% (SAFC). A seguir, as manchas foram incubadasdurante a noite em solução de bloqueio suplementada com soro anti-HApoliclonal específico de ovelha (1 :500 (NIBSC). As manchas foram lavadas 6vezes com TBST e foram incubadas durante Ih a temperatura ambiente comum anticorpo policlonal IgG anti ovelha de Iup conjugado de coelho (15000 (Rockland) em solução de bloqueio. Depois de 6 lavagens com TBST,o complexo proteína conjugado foi revelado finalmente usandoquimiluminescência (kit de ECL, Amersham) e filmes (Hyperfilm,Amersham).
4.2 - Infecção pelo vírus da gripe de células EB14 emBiorreator 3L
4.2.1 - Materiais e equipamentos
Material de descongelamento de célulaso Frascos T75 cm2 (Sarstedt, Cat #831813502)o Meio de cultura (meio livre de soro)o L-Glutamina 200mM (Biowhittaker, Cat #BE 17-605E)o Agitador Orbital IKA KS260 (Fisher Bioblock, Cat #F35044)
Material de amplifícação de célulaso Frascos Tl75 cm2 (Sarstedt, Cat #831812502)o Meio de cultura (meio livre de soro): Excell 65319 (JRH, Cat
#65319-1OOOM 1687) adicionado de glutamina 2,5mMo L-Glutamina 200mM (Biowhittaker, Cat #BE 17-605E)o Solução UF de solução aquosa de levedura 50X (JRH, Cat #58902-100M)
o D (+) Glicose (45%) (Sigma, Cat #G8769)
Material de Produçãoo Meio de produção (meio livre de soro): Excell 65629 (JRH, Cat
#65629) suplementado com gin 2,5mMo Solução UF de solução aquosa de levedura 5OX (JRH, Cat #58902-100M)ο L-Glutamina 200mM (Biowhittaker, Cat #BE 17-605E)
o D (+) Glicose (45%) (Sigma, Cat #G8769)
o Tripsina (Trlpzean IX, Sigma, Cat#T3449)
o Solução de bicarbonato de sódio 7,5% (Sigma, Cat #205-633-8)
o Cepa do vírus da gripe (congelado a4.2.2 - Método
Descongelamento das células
As células em frascos criogênicos são colocadas em nitrogêniolíquido a -196°C; cada frasco criogênico contém 20. IO6 células. O frascocriogênico é descongelado diretamente em um banho de água pré aquecida a+37°C. A suspensão de células é colocada em um tubo estéril PP de 50 mLcom 30 mL de meio de cultura pré aquecido. Após a centrifugação (5 min a300 ±20 g, a temperatura ambiente), são adicionados 15 mL de meio decultura fresco ao aglomerado e homogeneizado com suavidade. A amostra écontada usando tripano azul. A contagem deve ser > 20. IO6 células e aviabilidade tem que ser > 70% para garantir uma boa cultura. A suspensão decélulas é colocada em um frasco T75 cm2 e incubada a + 37°C sob umaatmosfera de 7,5% CO2 em um agitador orbital a 50 rpm. Após 24 horas e 48Horas de cultura, são adicionados 15 mL de meio de cultura pré aquecida àcultura. Após 72 horas de cultura, é coletada uma amostra (depois dahomogeneização a granel) e numerada: são esperadas 20 a 3 0.106 células. Aseguir é realizada a primeira amplificação.
Primeira amplificação das células: centrifugação, dissociação e diluição.
A suspensão de células é coletada no frasco(s) em tubo(s)estéril PP de 50 mL e centrifugada durante 5 min a 300 ±20 g, a temperaturaambiente, são adicionados ao aglomerado 10 mL de meio de cultura frescopré aquecido. As aglomerações das células são dissociadas com suavidade esão agrupadas as suspensões de células; o volume é completado com 40 mLcom meio de cultura pré aquecido fresco. Em 1 frasco Tl75 cm , 0,25.10células.mL"1 são colocadas em 40 ml de meio pré aquecido e incubado a+37°C sob
uma atmosfera de 7,5% CO2 em um agitador orbital a 50 rpm. Nodia 2, são adicionados 60 ml de meio de cultura pré aquecida. No dia 3, érealizado um segundo ciclo de amplificação.
Células semeadas em biorreator com tanque de agitação de 3 L
Semeadura - Dia 0
O inóculo é preparado (são necessárias 320. 106 células parainocular o biorreator 3L). Os 2 frascos T175 são agrupados. Uma amostra écoletada após misturar com suavidade (as aglomerações de células não devemser quebradas) para realizar uma contagem usando tripano azul paradeterminar a densidade das células. Uma mistura de células com 150mL estápreparada para obter uma concentração de células de 0,40. IO6 células.mL"1 novolume de cultura final de 800 ml no biorreator.
Antes de semear as células, o pH é ajustado no vaso para 7,2(porque o pH será diminuído devido à injeção de superfície de CO2). O p02 éajustado para 50% de saturação de O2 (o controle de fluxo de massa éajustado para 100% o que corresponde a uma taxa de fluxo aspersão máximade 50 mL.min"1). No início do processo, o pH é mantido por injeção desuperfície de CO2, posteriormente, é controlado por adição de 7,5% NaHCO3.A aeração de superfície é iniciada com ar, com uma taxa de fluxo de 0,3mL.min"1.
Acompanhamento da cultura / Adição de alimentação (Dia 1. Dia 2)
A contagem de células é realizada de forma rotineira. Osmetabólitos como glutamato, glutamina, lactato e glicose são todos analisadosao longo da cultura com o software BioProfile Básico. A concentração demetabólitos é ajustada, se necessário. Por exemplo, a concentração deglutamina é ajustada para 2 mM.Infecção - Dia 3
Após 3 dias de cultura, a densidade das células deve ser maiorque 4-5. IO6 células.mL"1. Se a densidade alvo das células é alcançada, ainfecção com o vírus é realizada com um MOI de IO"4. A temperatura do vasoé ajustada a 33°C. A cepa de vírus é descongelada em gelo. A mistura deinfecção está preparada em meio de produção de 10 mL. Após a inoculaçãoda mistura de infecção no biorreator, é realizada a adsorção viral durante 1hora. O meio de produção final está preparado: a tripsina é adicionada em 1,5L de meio de produção, para obter uma concentração final no vaso de 0,3U.mL"1 (2,3 L em geral) e sendo adicionada a solução aquosa de levedura0,5X. O meio de produção final pré aquecido é adicionado a seguir.
Acompanhamento da Produção / Adição de alimento (Dia 4,Dia 5, Dia 6, Dia 7, Dia 8, Dia 9, Dia 10)
Uma amostra de aproximadamente 15 ml é coletadadiariamente do biorreator para realizar a contagem das células, analisar amorfologia das células e observar o CPE. Os metabólitos como glutamato,glutamina, lactato e glicose são todos analisados ao longo da cultura com osoftware BioProfile Básico. Concentração de metabólitos é ajustada, senecessário. Por exemplo, a concentração de glutamina é ajustada para 2 mM,se necessário. A concentração de glicose é ajustada para 2 g.L"1, se necessário.
Análises
A titulação do vírus, ensaios de hemaglutinina (HAU) equantificações de antígeno HA (Western blot, SRID) são realizadas aotérmino da experiência, usando todas as amostras coletadas.
4.3 - Resultados
Os inventores demonstraram que as células EB14 são umsubstrato de células confiável e eficiente para a replicação de várias cepas A eB do vírus da gripe. A produção do vírus da gripe pode ser realizada emvários vasos, como frascos e frascos com rotor de pás helicoidais (dados nãomostrados) e biorreatores. A reprodutibilidade e o processo de lote dealimentação eficiente para a produção do vírus da gripe em biorreatores de 3 Le 3 OL com agitador de tanque foi obtida pelos inventores. Rotineiramente, sãoobtidas produtividades superiores a 25 mg/l de hemaglutinina em frascos eprodutividades superiores a 35 mg/l de hemaglutinina são obtidasrotineiramente em frascos com cepas A e B do vírus da gripe.

Claims (42)

1. Processo de replicar um vírus selecionado do grupoconsistindo de adenovírus, hepadnavírus, herpes vírus, ortomixovírus,papovavírus, paramixovírus, picornavírus, poxvírus, reovírus e retrovírus, emcélulas tronco derivadas de embriões aviários EBx®, referido processocaracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) proliferar referidas células EBx® em um vaso de cultivo,em suspensão, em um meio livre de soro N0 1;b) infectar referidas células com o vírus selecionado quando adensidade das células é de pelo menos 1,5 milhões de células/ml;c) adicionar, logo antes da infecção, simultaneamente com ainfecção, ou logo após a infecção, meio livre de soro N0 2 à cultura decélulas; ed) cultivar adicionalmente referidas células infectadas parapermitir a replicação do vírus; ee) colher, opcionalmente, referido vírus.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o vaso de cultivo é um biorreator com agitador contínuo notanque.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 2,caracterizado pelo fato de que o meio livre de soro N°1 e o meio livre de soroN0 2 são o mesmo meio.
4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 2,caracterizado pelo fato de que o meio livre de soro N°1 e o meio livre de soroN0 2 têm uma composição diferente.
5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que entre 0,25 a 10 volumes de meio livre de soroN°2 é adicionado ao meio livre de soro N0 1.
6. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o meio livre de soro N0 1 e/ou o meio livre desoro N0 2 é/são suplementados com pelo menos um ingrediente selecionadodo grupo consistindo de aminoácidos, lipídeos, ácidos graxos, colesterol,carboidratos, hidrolisados de proteína de origem não animal, e uma misturados mesmos.
7. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa adicional de alimentar ascélulas com pelo menos um ingrediente selecionado do grupo consistindo emaminoácidos, ácidos graxos, carboidratos, hidrolisados de proteína de origemnão animal, e uma mistura dos mesmos.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a alimentação ocorre durante as etapas a) até d),preferivelmente durante as etapas b) até d).
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a alimentação ocorre diariamente.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a alimentação ocorre de forma contínua.
11. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a alimentação ocorre em mais de um horário por dia.
12. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a alimentação ocorre em menos de uma vez por dia.
13. Processo de acordo com as reivindicações 6 a 12,caracterizado pelo fato de que são selecionados aminoácidos do grupoconsistindo em asparagina e glutamina, ou uma mistura das mesmas.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a alimentação de glutamina é realizada durante as etapas a) ad) para manter a concentração de glutamina no meio entre 0,5 mM a 5 mM,preferivelmente de aproximadamente 2 mM.
15. Processo de acordo com as reivindicações 6 a 12,caracterizado pelo fato de que são selecionados carboidratos do grupoconsistindo em D-glicose e D-galactose ou uma mistura das mesmas.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a alimentação de D-glicose é realizada durante as etapas b) ad) para manter a concentração de D-glicose no meio de aproximadamente 0,5g/l até 25g/l de D-glicose, preferivelmente de aproximadamente 2g/l de D-glicose.
17. Processo de acordo com as reivindicações 6 a 12,caracterizado pelo fato de que são selecionados ácidos graxos do grupoconsistindo em ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácidooléico, ácido linoleico, ácido linolênico ou uma mistura dos mesmos.
18. Processo de acordo com as reivindicações 6 a 12,caracterizado pelo fato de que são selecionados hidrolisados de proteína deorigem não animal do grupo consistindo em triptona de bactéria, triptona delevedura, hidrolisados de planta, ou uma mistura das mesmas.
19. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 18,caracterizado pelo fato de que as células EBx® são cultivadas em suspensãocomo células aglomeradas.
20. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 19,caracterizado pelo fato de que na etapa a) pelo menos uma transferência,preferivelmente pelo menos todas as transferências, de cultura de célulasEBx® de um vaso de cultura para outro é realizada por diluição sem romperas aglomerações de células EBx®.
21. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 19,caracterizado pelo fato de que na etapa a) pelo menos uma transferência,preferivelmente pelo menos todas as transferências, de cultura de célulasEBx® de um vaso de cultura para outro não inclui a etapa de centrifugaçãoe/ou rompimento das aglomerações de células.
22. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 21,caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada após a etapa de infecçãob), preferivelmente em aproximadamente 1 hora depois da etapa b).
23. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 22,caracterizado pelo fato de que a infecção da etapa b) é realizada com um m.o.i(multiplicidade de infecção) de aproximadamente 10 até 10"6, preferivelmenteaproximadamente IO"3 até IO"5, e mais preferivelmente aproximadamente IO"4.
24. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 23,caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus da varíola ocorrendonaturalmente ou um vírus da varíola recombinante selecionado entre o grupoconsistindo em vírus de Vaccinia Ankara Modificado (MVA), vírus da varíolavírus da galinha, vírus da varíola do canário (ou seja, ALVAC), vírus davaríola junco, vírus varíola do mainata de Rotschild, vírus da varíola dopombo, vírus psittacinepox, vírus da varíola da codorna, vírus da varíola dopardal, vírus da varíola do estorninho malhado, vírus da varíola do pavão.
25. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 24,caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus ocorrendo naturalmente ouum vírus recombinante selecionado entre o grupo consistindo em vírus desarampo e vírus de caxumba.
26. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 24,caracterizado pelo fato de que o vírus é selecionado entre os vírus da gripehumana, vírus de gripe aviária, vírus de gripe suína, vírus da gripe eqüina,vírus de gripe felina.
27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que referido vírus da gripe humana é uma cepa A selecionadaentre cepas HlNl, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H7N7 e H9N2.
28. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 27,caracterizado pelo fato de que o cultivo da etapa a) é realizado por cultura delote, cultura de lote repetido, cultura de lote alimento ou cultura de perfusão.
29. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 28,caracterizado pelo fato de que a infecção da etapa b) é realizada quando adensidade das células é de pelo menos 4 milhões de células/ml em lote ouprocesso de lote alimento, preferivelmente 6 milhões de células/ml.
30. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 29,caracterizado pelo fato de que a infecção da etapa b) é realizada quando adensidade das células é de pelo menos de 8 milhões de células/ml no processode perfusão, preferivelmente de aproximadamente 9 a 10 milhões decélulas/ml.
31. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 30,caracterizado pelo fato de que o pH do meio de cultura livre de soro dasetapas a), b), c) e d) está na faixa de 6,5 a 7,8.
32. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 31,caracterizado pelo fato de que a etapa d) demora de 2 a 10 dias antes dacolheita.
33. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 32,caracterizado pelo fato de que a cultura das células é realizada a umatemperatura compreendida entre 3 0°C a 39°C, preferivelmente deaproximadamente 37°C.
34. Vírus caracterizado pelo fato de que é obtido por umprocesso de acordo com uma das reivindicações 1 a 33.
35. Vacina caracterizada pelo fato de que contém o vírus deacordo com a reivindicação 34, se apropriado em combinação comsubstâncias que aumentam a resposta imunológica.
36. Vacina de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que o vírus está presente como uma partícula intacta do vírus.
37. Vacina de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que o vírus está presente como uma partícula desintegrada dovírus.
38. Vacina de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que o vírus está presente como vírus atenuados.
39. Vacina caracterizada pelo fato de que contém componentesde um vírus de acordo com a reivindicação 34, se apropriado em combinaçãocom substâncias que aumentam a resposta imunológica.
40. Vacina de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que a vacina contém proteínas isoladas do vírus.
41. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende umalinha celular infectada EBx® que pode ser obtida pelo processo de acordocom as reivindicações 1 a 33, e em que a linha celular infectada EBx® écolhida na etapa d).
42. Composição para diagnóstico caracterizada pelo fato deque contém o vírus de acordo com a reivindicação 34 ou componentes domesmo.
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