JP2006509526A - トリ胚性幹細胞上におけるａｌｖａｃの産生 - Google Patents
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Abstract
本発明は、トリ胚性幹細胞上においてALVACウイルスを産生する方法、およびそのような方法に従って産生したALVACウイルスを含む組成物に関する。
Description
本発明は、トリ胚性幹細胞を使用するALVACウイルス産生の改良法に関する。
現在行われている、ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）上でのALVACワクチン産生過程においては、胚化した卵を非常に多数扱う必要がある。胚を分離した後、細胞をローラーボトル（roller bottle）内に播種してから感染させる。一般的には、120本のローラーボトルに対して感染を行うためには約200個の卵が必要である。懸濁液中で増殖する連続的細胞系を使用することにより、卵の使用数を抑制することができ、ローラーボトルを20Lのバイオファーメンターに置き換えることができる。培養条件を最適化した後、細胞密度を上げること、さらに、最終的なウイルス収量を上げることが期待できる。そのような方法への使用に適した細胞系としては、懸濁液中で増殖する細胞系由来の安定したニワトリ胚繊維芽細胞が挙げられる。
トリ胚性細胞系は、複数の別異の研究者によって確立されている。例えば、ペティート（Pettite）ら（ノースカロライナ州立大学（North Calorina State Univ.）；特許文献１）は、マウス繊維芽細胞フィーダー層の存在下においてトリ胚盤葉細胞を培養することにより、トリ胚性幹細胞の開発に関与した。ペティート（Pettite）ら（特許文献２；特許文献３）は、胚性幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の細胞培養についても開示および請求している。
サマルト（Samarut）ら（国立農業研究所（Institut National de la Recherche Agronomique）：特許文献４；特許文献５）は、特殊な培地を用いてCEF上でトリ胚性幹細胞を産生する方法について記述している。ブーケ（Bouquet）ら（国立農業研究所（Institut National de la Recherche Agronomique）：特許文献６；特許文献７（2001年11月１日公開））は、ゲノム内にSV40 T Agを有する、形質転換したトリ胚性繊維芽細胞について記述している。サマルト（Samarut）およびパン（Pain）（特許文献８（2001年９月６日公開））は、トリES細胞産生用の培養培地およびそのような培地で培養したES細胞内におけるタンパク質産生法について開示している。さらに、ハン（Han）ら（ハンミ・ファーム（Hanmi Pharm.）株式会社：特許文献９）は、特殊な増殖因子および分化阻害因子を含む培養培地内でトリ原始生殖細胞を培養することによってトリ胚性生殖細胞系を確立する方法について記述している。
トリ胚性幹細胞は、組み換えウイルス類の産生に適していることが示されている。例えば、フォスター（Foster）ら（ミネソタ大学理事（Regents of Univ. Minnesota）：特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２）は、ニワトリ胚繊維芽細胞由来の安定細胞系におけるウイルスの増殖法について記述している。
ライリー（Reilly）ら（ミシガン州立大学評議委員（Board of Trustees operating Michigan State University）：特許文献１３；特許文献１４）は、化学的変異誘発物質を用いて変形したニワトリ胚性幹細胞を使用し、マレックウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリレオウイルス、鶏痘ウイルス、鳩痘、カナリア痘、オウムヘルペスウイルス、ハトヘルペスウイルス、タカヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性ファブリキウス病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、トリアデノウイルスおよびトリポリオーマウイルスを産生することに関与している。また、クセンズ（Coussens）ら（ミシガン州立大学評議委員（Board of Trustees operating Michigan State University）：特許文献１５；特許文献１６）は、胚性幹細胞内においてマレック病ウイルスを増殖させることに関与している。ブーケ（Bouquet）ら（国立農業研究所（Institut National de la Recherche Agronomique）：特許文献６；特許文献７）は、SV40 T Agをゲノム内に取り込むことによって形質転換したトリ胚性繊維芽細胞からウイルスを産生する方法について記述している。
当該分野においては、ALVACに基づくワクチンを産生するための改良法が求められている。本明細書においては、懸濁液中で増殖するトリ胚性幹細胞系を用いたALVACベクターの産生法のひとつを開示している。本方法は、生産性および安全性の面で優れている。本発明の特に優れた側面について以下に記載する。
米国特許第5,340,740号明細書
米国特許第5,656,479号明細書
国際公開第93/23528号パンフレット
米国特許第6,114,168号明細書
国際公開第96/12793号明細書
米国特許第6,280,970号明細書
米国特許出願第2001/0036656号明細書
米国特許出願第2001/0019840号明細書
国際公開第00/47717号パンフレット
米国特許第5,672,485号明細書
米国特許第5,879,924号明細書
米国特許第5,985,642号明細書
米国特許第5,989,805号明細書
国際公開第99/24068号パンフレット
米国特許第5,827,738号明細書
米国特許第5,833,980号明細書
本発明は、トリ胚性幹細胞上においてALVACウイルスを培養し、そのような細胞からウイルスを回収することにより、ALVACウイルスを増殖させ、ワクチンを調製し、さらに、宿主にワクチンを投与するための方法を提供する。好ましい細胞はEB1細胞またはEB14細胞である。特定の実施態様においては、該ウイルスはゲノム内に免疫原をコードしている外来性DNAを有しており、ウイルスを投与された宿主内で該DNAが発現することにより、防御免疫応答が得られる。
本発明は、胚性幹細胞上におけるALVACウイルスの培養に関する新規な方法を提供する。本明細書中に引用している全ての参考文献を参照として取り入れておく。
ポックスウイルスは有用な発現ベクターである（スミス（Smith）ら、1983, Gene,25(1):21-8；モス（Moss）ら、1992, Biotechnology, 20:345-62；モス（Moss）ら、1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol.,158:25-38；モス（Moss）ら、；1991, Science,252:1662-1667）。宿主細胞内で外来性DNA配列を発現させるためには、カナリア痘ALVACは特に有用である。ALVACに基づく組み換えウイルス（すなわち、ALVAC(1)およびALVAC(2)）は、本発明の実施には特に有用である（例えば、米国特許第5,756,103号などを参照）。ALVAC(2)は、ワクシニアプロモーターの制御下にあるワクシニアE3LおよびK3L遺伝子を有している点以外はALVAC(1)と同一である（米国特許第6,130,066号；ビーティー（Beattie）ら、1995a,1995b,1991；チャン（Chang）ら、1992；ダビーズ（Davies）ら、1993）。ALVAC(1)およびALVAC(2)は、TA類などの外来性DNA配列の発現に有用であることが示されている（タータグリア（Tartaglia）ら、1993a,b；米国特許第5,833,975号）。ALVACは、ブダペスト協定に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection:ATCC）（アメリカ合衆国ヴァージニア州マナサス、ユニヴァーシティー通り10801、郵便番号20110-2209）にATCCアクセッション番号VR-2547として寄託された。
ALVACは、宿主細胞内における外来性DNA配列の発現に有用であることが示されている（例えば、米国特許第5,756,102号；第5,833,975号；第5,843,456号；第5,858,373号；第5,863,542号；第5,942,235号；第5,98,9561号；第5,997,878号；第6,265,189号；第6,267,965号；第6,309,647号；第6,541,458号；第6,596,279号；および第6,632,438号などを参照）。本発明を実施するにあたっては、ALVACの培養は、天然の状態、または抗原などのタンパク質をコードしている外来性DNAを含む組換え体の状態で行うことができる。特に有用な抗原としては、ヒトにおいて疾患を引き起こす病原体（すなわち、ヒトの病原体）由来のもの（例えば、バクテリア、菌類、ウイルスなど）、または腫瘍由来のもの（すなわち、腫瘍または腫瘍関連抗原）が挙げられる。そのような抗原は当該分野において多数知られており、本発明の実施に適している。ALVACベクターは、免疫共刺激分子（B7.1など）もコードしている。さらに本発明は、薬剤学的に許容される希釈剤中にALVACベクターを含有する組成物を含む。免疫化の必要な動物またはヒト宿主に対してそのような組成物を投与することも本発明の範ちゅうである。
ひとつの実施態様においては、本発明は、トリ胚性幹細胞由来の連続的非腫瘍性トリ細胞上においてALVACウイルスの産生が可能であることを示している。そのような目的に叶う細胞については、例えば、米国特許第5,340,740号；第5,656,479号；第5,672,485号；5,879,924号；5,985,642号；第5,989,805号；6,114,168号；第6,280,970号B1；米国特許出願2001/0036656号A1；米国特許出願2001/0019840 A1号；および国際特許出願WO 93/23528号；WO 96/12793号；WO 99/24068号；WO 00/47717号；FR 02/02945号；およびWO 03/07661号などに記載されている。特定の実施態様においては、そのような細胞としては、例えば、EB1、EB2、EB3、EB4、EB5およびEB14細胞などが挙げられる（FR 02/02945号およびWO 03/07661号などに記載）。これらの細胞は、胚発生のごく初期の段階のニワトリ胚から得られ、幹細胞表現型を示した。該細胞は、天然の状態においては遺伝的に変形されておらず、懸濁液中で増殖した。ひとつの実施態様においては、細胞はヴィヴァリス（VIVALIS SA）から入手したEB1細胞であった（フランス；FR 02/02945号およびWO 03/07661号）。第二の実施態様においては、細胞はヴィヴァリス（VIVALIS SA）から入手したEB14細胞であった（フランス；FR 02/02945号およびWO 03/07661号）。EB1細胞およびEB14細胞は、トリ胚性幹細胞の初期拡張細胞である。これらのような適切な細胞は、「トリ胚性幹細胞系（AES）」という語の定義の範囲に含まれる。その他のAESなどのような任意の細胞は、当該分野において既知であり、本発明の実施に適している。
本発明およびその多数の利点をよりよく理解するために、以下の実施例を例示として挙げておく。
実施例１：材料および方法
Ａ．細胞およびウイルス
EB1細胞（２×50×106個）は、ヴィヴァリス（VIVALIS）からp139（2001年５月）またはp148（2001年７月）を受領した。培養培地（変形５％McCoy培地＋０％SVF）は、細胞と共に提供された。感染は、全てALVAC vCP205 #362（ATCC番号VR-2557；米国特許出願第5,863,542号；HIV発現カセット−ALVAC C3挿入部位にプロテアーゼと共に、ワクシニアH6プロモーター／HIV切断env MN株、I3L gagを有する）を用いて行い、清澄化し（力価7.9 logTCID50/ml）、精製し（ショ糖緩和＋濃度勾配、力価8.5logTCID50/ml）、または半精製（ショ糖緩和＋濃度勾配、力価9.2logTCID50/ml）した。
Ａ．細胞およびウイルス
EB1細胞（２×50×106個）は、ヴィヴァリス（VIVALIS）からp139（2001年５月）またはp148（2001年７月）を受領した。培養培地（変形５％McCoy培地＋０％SVF）は、細胞と共に提供された。感染は、全てALVAC vCP205 #362（ATCC番号VR-2557；米国特許出願第5,863,542号；HIV発現カセット−ALVAC C3挿入部位にプロテアーゼと共に、ワクシニアH6プロモーター／HIV切断env MN株、I3L gagを有する）を用いて行い、清澄化し（力価7.9 logTCID50/ml）、精製し（ショ糖緩和＋濃度勾配、力価8.5logTCID50/ml）、または半精製（ショ糖緩和＋濃度勾配、力価9.2logTCID50/ml）した。
EB1細胞の系統を以下に示す；
Ｂ．感染細胞の処理
感染細胞は遠心分離によって回収した。細胞ペレットは、初期容量の１／20量の血清不含の培養培地中に再懸濁し、培養培地に超音波を短時間あて、再度遠心分離することによって清澄な溶解物を得た。
感染細胞は遠心分離によって回収した。細胞ペレットは、初期容量の１／20量の血清不含の培養培地中に再懸濁し、培養培地に超音波を短時間あて、再度遠心分離することによって清澄な溶解物を得た。
Ｃ．ウイルスの定量
ウイルス調製において、ALVAC DNAの複製を研究することを目的として、LightCycler（商標）装置を用いたALVAC DNAの定量的PCRアッセイ法を開発した。ALVAC DNAは、SYGR Green Dyeの存在下、構造VP8タンパク質をコードしているK10R領域に特異的なプライマーを使用することによって精製および増幅させた。精製したウイルスDNAの既知の濃度から作成した標準曲線を使用し、各サンプル中のウイルスDNA濃度を求めた。以下に記載しているように、SOP V100501/01に従い、LightCycler上でQPCRによってALVAC DNAを定量した：
Ａ．装置：L2クラスゾーン；別異の２色で塗装した２つの独立した室内に設置したII型層流フード；カルーセル（carousel）を備えたLightCycler（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：2011468）；キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：1909339）；遠心分離機用アダプター（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：1909312）；遠心分離機（エッペンドルフ（Eppendorf）社、照会番号:5415D）；カルーセル型遠心分離機（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：2189682）；氷を入れた箱；壁が薄い96穴プレート、モデルM（コスター（COSTAR）社、照会番号：6511）；微量試験管（1.5ml）（エッペンドルフ（Eppendorf）社、照会番号:24077）；８チャネル電気ピペット、0.2〜10μｌ（バイオヒット（BIOHIT）社、照会番号:710200）；バリアチップ10、20、50、200、1000μｌ；ならびに手動ピペット10、50、200、1000μｌ。
ウイルス調製において、ALVAC DNAの複製を研究することを目的として、LightCycler（商標）装置を用いたALVAC DNAの定量的PCRアッセイ法を開発した。ALVAC DNAは、SYGR Green Dyeの存在下、構造VP8タンパク質をコードしているK10R領域に特異的なプライマーを使用することによって精製および増幅させた。精製したウイルスDNAの既知の濃度から作成した標準曲線を使用し、各サンプル中のウイルスDNA濃度を求めた。以下に記載しているように、SOP V100501/01に従い、LightCycler上でQPCRによってALVAC DNAを定量した：
Ａ．装置：L2クラスゾーン；別異の２色で塗装した２つの独立した室内に設置したII型層流フード；カルーセル（carousel）を備えたLightCycler（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：2011468）；キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：1909339）；遠心分離機用アダプター（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：1909312）；遠心分離機（エッペンドルフ（Eppendorf）社、照会番号:5415D）；カルーセル型遠心分離機（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：2189682）；氷を入れた箱；壁が薄い96穴プレート、モデルM（コスター（COSTAR）社、照会番号：6511）；微量試験管（1.5ml）（エッペンドルフ（Eppendorf）社、照会番号:24077）；８チャネル電気ピペット、0.2〜10μｌ（バイオヒット（BIOHIT）社、照会番号:710200）；バリアチップ10、20、50、200、1000μｌ；ならびに手動ピペット10、50、200、1000μｌ。
Ｂ．生成物：ALVAC 標準DNAの10倍希釈液を５サンプル：20〜200,000コピー；抽出および定量用の内部標準：ALVACウイルス、107TCID50／ml（約２×109コピー／ml）；FastStart DNA Master SYBR Green Iキット（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社、照会番号：2239264）；水（DNaseおよびRNase不含）（プロメガ（PROMEGA）社、照会番号：P1193）；サンプル：ALVAC DNAまたはALVAC ウイルス；プライマー：CPK1011（５μM）およびCPK1012（５μM）（以下を参照）；
Ｃ．注意事項：手袋を装着；マスター混合物およびDNAの希釈は２つの別異のフード内で行うこと；SYBR Green は光を避け、５℃±１℃で保存すること；アダプター類は冷却ブロック内で予め５℃±１℃に冷却しておくこと。
Ｄ．手順：
・LightCyclerを始動：サンプルを調製する前に、LightCyclerソフトウェアを使用して、プログラムを選択し（FastStart 50℃）、サンプル数を決定し、適切にラベルをした。
・マスター混合物の調製（氷上）：
○第１フードを使用し、氷上で反応混合物を調製した。1.5mlの反応管を使用し、標準点５点、ネガティブ点１点、参照点１点およびサンプル数ｎ＋１に必要な容量を計算した
○１ｂ管のうちの60μlを１ａ管に加えた。ピペッッティングによって混合した（渦動混合はしなかった）
○各キャピラリーに18μｌの混合物を入れた。次に冷却ブロックを第２フードに移した。
・ＤＮＡの調製：
○氷上、マイクロチューブまたは96穴プレート内において、DNase／RNase不含水を用いてALVAC DNAサンプルを希釈し、キャピラリーあたり200,000コピー以下になるようにした。
○200,000〜20コピーになるようにALVAC DNA標準を希釈した（10倍希釈）。
○ALVAC参照DNAを100倍希釈した。
○各キャピラリーに、２μｌのDNA鋳型、またはネガティブサンプルには２μｌのH2Oを加えた。プラスチック栓を用いてキャピラリーを密閉した。キャピラリーを入れたアダプターを100ｇで30秒間遠心分離し、キャピラリーをカルーセルに入れた。サンプルが入ったカルーセルをLightCyclerに入れ、ふたを閉めた。
○始動させた。
・LightCyclerソフトウェアによる分析
○定量選択分析法
・「Fits Points法」を選択した
・ステップ１：「算術ベースライン」を選択した
・標準サンプルを選択した
・ステップ２：ノイズバンドを調製して蛍光バックグラウンドを排除した。
・ステップ３：交叉ラインを調整することにより、誤差は0.1以下、傾きは−3.3〜−4.0（至適理論値は3.4）、切片は30〜40の間になった。直線用の至適設定においては、標準サンプル用の計算値は既知の値に近似するはずである。
○Tm分析選択溶解曲線分析
・ステップ１：「バックグラウンドありの直線」法を選択した。
・サンプルを選択した
・ステップ２：メルティングピー（melting pea）の始点および終点にカーソルを合わせた。
・ステップ３：「手動Tm」を選択した。ソフトウェアがサンプル用のTmを計算した。
・対照
○全てのサンプルに関し、ベースラインの蛍光値は０に近くなければならない。
○２つのパラメーターを用いて標準曲線の検証をした。第１パラメーターは誤差であり、その値は0.1以下でなければならない。第２パラメーターは二次方程式であり、傾きは−3.3〜−4.0（至適理論値は3.4）、切片は30〜40の間である。
○PCR生成物の溶解曲線はプライマーの特異性を規制するものである。通常、Tm値は約78＋／−１℃である。アガロースゲル電気泳動によっても特性を規制することができる。110bpにおいて単一の生成物が増幅されていなければならない。
○内部参照を用いてDNA抽出の精度を規制した。
感染力価は標準PFUアッセイによって測定した。
・LightCyclerを始動：サンプルを調製する前に、LightCyclerソフトウェアを使用して、プログラムを選択し（FastStart 50℃）、サンプル数を決定し、適切にラベルをした。
・マスター混合物の調製（氷上）：
○第１フードを使用し、氷上で反応混合物を調製した。1.5mlの反応管を使用し、標準点５点、ネガティブ点１点、参照点１点およびサンプル数ｎ＋１に必要な容量を計算した
○１ｂ管のうちの60μlを１ａ管に加えた。ピペッッティングによって混合した（渦動混合はしなかった）
・ＤＮＡの調製：
○氷上、マイクロチューブまたは96穴プレート内において、DNase／RNase不含水を用いてALVAC DNAサンプルを希釈し、キャピラリーあたり200,000コピー以下になるようにした。
○200,000〜20コピーになるようにALVAC DNA標準を希釈した（10倍希釈）。
○ALVAC参照DNAを100倍希釈した。
○各キャピラリーに、２μｌのDNA鋳型、またはネガティブサンプルには２μｌのH2Oを加えた。プラスチック栓を用いてキャピラリーを密閉した。キャピラリーを入れたアダプターを100ｇで30秒間遠心分離し、キャピラリーをカルーセルに入れた。サンプルが入ったカルーセルをLightCyclerに入れ、ふたを閉めた。
○始動させた。
・LightCyclerソフトウェアによる分析
○定量選択分析法
・「Fits Points法」を選択した
・ステップ１：「算術ベースライン」を選択した
・標準サンプルを選択した
・ステップ２：ノイズバンドを調製して蛍光バックグラウンドを排除した。
・ステップ３：交叉ラインを調整することにより、誤差は0.1以下、傾きは−3.3〜−4.0（至適理論値は3.4）、切片は30〜40の間になった。直線用の至適設定においては、標準サンプル用の計算値は既知の値に近似するはずである。
○Tm分析選択溶解曲線分析
・ステップ１：「バックグラウンドありの直線」法を選択した。
・サンプルを選択した
・ステップ２：メルティングピー（melting pea）の始点および終点にカーソルを合わせた。
・ステップ３：「手動Tm」を選択した。ソフトウェアがサンプル用のTmを計算した。
・対照
○全てのサンプルに関し、ベースラインの蛍光値は０に近くなければならない。
○２つのパラメーターを用いて標準曲線の検証をした。第１パラメーターは誤差であり、その値は0.1以下でなければならない。第２パラメーターは二次方程式であり、傾きは−3.3〜−4.0（至適理論値は3.4）、切片は30〜40の間である。
○PCR生成物の溶解曲線はプライマーの特異性を規制するものである。通常、Tm値は約78＋／−１℃である。アガロースゲル電気泳動によっても特性を規制することができる。110bpにおいて単一の生成物が増幅されていなければならない。
○内部参照を用いてDNA抽出の精度を規制した。
感染力価は標準PFUアッセイによって測定した。
実施例２：EB1細胞増殖の最適化
細胞の使用前に、増殖に関する至適条件を分析した。上述したように、EB1細胞は、特殊変形McCoy−５％FCS培地に入った状態でヴィヴァリス（VIVALIS）から提供された。２つのパラメーター、FCS（2.5％対５％）およびCO2（０％対５％）がEB1細胞の増殖に与える影響については調査済みである。DMEM-12培地への細胞の適合についても調査済みである。各条件に対して世代時間を計算した。
細胞の使用前に、増殖に関する至適条件を分析した。上述したように、EB1細胞は、特殊変形McCoy−５％FCS培地に入った状態でヴィヴァリス（VIVALIS）から提供された。２つのパラメーター、FCS（2.5％対５％）およびCO2（０％対５％）がEB1細胞の増殖に与える影響については調査済みである。DMEM-12培地への細胞の適合についても調査済みである。各条件に対して世代時間を計算した。
試験を行うにあたり、選択した条件下で、細胞の初期濃度が104個／mlとなるようにスピナーに播種し、振とうしながら37℃でインキュベートした。培地が酸性になるとすぐに細胞を希釈し、新鮮培地中で104〜105個／mlとなるようにした。トリパンブルー染色により、細胞の生存率を測定した。各実験における細胞生存率は非常に低く（すなわち、＜70％）、Ficoll濃度勾配を行って死細胞を除去した（グラフの矢印ＡおよびＣで示している）。
DMEM/F12培地への細胞の前進的適合は、初期培地（McCoy培地）をDMEM/F12培地で段階的に希釈することによって達成された（グラフの矢印Ｃで示している）。世代時間（Ｇ）は、１日あたりの倍加時間（または世代）に対応しており、Ｇ＝Ｎ／Ｄ式で計算され、このとき、Ｄは培養日数であり、ＮはＣf＝Ｃi×２Nで表される式から求められた世代数であり、ＣfおよびＣiはそれぞれ、最終および初期の細胞濃度を表す。
データは、非感染細胞の細胞を計数することによって求められ、細胞の初期密度の関数として表される。これらの実験の結果は図１および表１にまとめている。
これらの実験から、以下の結論が導かれた：
・懸濁培養におけるEB1細胞の平均倍加時間は約1.1世代／日であった。
・2.5％または５％のFCSの存在下で細胞を培養した場合に、増殖曲線に顕著な差は見られなかった。
・細胞はFicoll濃度勾配遠心分離に感受性であり、条件を最適化する必要があった。
・発明者らの条件においては、細胞の最高密度は約800,000個／mlに達した。密度が高くなると、培養培地が酸性になって細胞増殖が停止し、細胞のアポトーシスが進行して迅速に変性した。
・EB1細胞は、2.5％のFCS含有標準DMEM/F12培地中、懸濁培養で増殖させることができ、その場合の平均倍加時間は約１世代／日であった。
・スピナーにおける最高細胞密度は５×105〜106個／mlの間であったが、バイオジェネレーター内の培養条件はバイオマスの増加に有用であると考えられる。
・懸濁培養におけるEB1細胞の平均倍加時間は約1.1世代／日であった。
・2.5％または５％のFCSの存在下で細胞を培養した場合に、増殖曲線に顕著な差は見られなかった。
・細胞はFicoll濃度勾配遠心分離に感受性であり、条件を最適化する必要があった。
・発明者らの条件においては、細胞の最高密度は約800,000個／mlに達した。密度が高くなると、培養培地が酸性になって細胞増殖が停止し、細胞のアポトーシスが進行して迅速に変性した。
・EB1細胞は、2.5％のFCS含有標準DMEM/F12培地中、懸濁培養で増殖させることができ、その場合の平均倍加時間は約１世代／日であった。
・スピナーにおける最高細胞密度は５×105〜106個／mlの間であったが、バイオジェネレーター内の培養条件はバイオマスの増加に有用であると考えられる。
実施例３：スピナー内におけるEB1細胞の感染
Ａ．実験１
DMEM/F12−０％FCSにEB1細胞（P138）を懸濁した培養液100ml（初期密度：４×105個／ml）にALVAC-HIV vCP205の清澄調製物（m.o.i. 0.1）を加え、37℃で１時間培養した。次に、変形McCOY5A−５％FCSを等容量加えて培養液を希釈し（最終細胞密度：２×105個／ml）、５％CO2濃度下、振とう（スピナー）しながら37℃でインキュベートした。感染48時間および96時間後に細胞フラクションおよび培養液を回収し、感染性ウイルス量（CEP上におけるPFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を分析した。各時点において20mlの培養物を分析した。遠心分離後、上清フラクション（S）を回収し、定量に直接使用した。細胞フラクション（C）に対応するペレットは、10mMのTris（pH9）１ml（初期容量の１：20）に再懸濁した後、超音波破砕し、定量した。力価は、mlあたり（表の左側）またはフラクションあたり（表の右側）の値で表した。スピナー内で産生されたウイルス性材料の総量は、２つのフラクションから求められた値を加算することによって計算した：総量＝（Ｓ／ml×200）＋（Ｃ／ml×10）。総量／mlは、この結果を200で除することによって求めた。本実験の結果を表２に示す。
Ａ．実験１
DMEM/F12−０％FCSにEB1細胞（P138）を懸濁した培養液100ml（初期密度：４×105個／ml）にALVAC-HIV vCP205の清澄調製物（m.o.i. 0.1）を加え、37℃で１時間培養した。次に、変形McCOY5A−５％FCSを等容量加えて培養液を希釈し（最終細胞密度：２×105個／ml）、５％CO2濃度下、振とう（スピナー）しながら37℃でインキュベートした。感染48時間および96時間後に細胞フラクションおよび培養液を回収し、感染性ウイルス量（CEP上におけるPFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を分析した。各時点において20mlの培養物を分析した。遠心分離後、上清フラクション（S）を回収し、定量に直接使用した。細胞フラクション（C）に対応するペレットは、10mMのTris（pH9）１ml（初期容量の１：20）に再懸濁した後、超音波破砕し、定量した。力価は、mlあたり（表の左側）またはフラクションあたり（表の右側）の値で表した。スピナー内で産生されたウイルス性材料の総量は、２つのフラクションから求められた値を加算することによって計算した：総量＝（Ｓ／ml×200）＋（Ｃ／ml×10）。総量／mlは、この結果を200で除することによって求めた。本実験の結果を表２に示す。
Ｂ．実験２
DMEM/F12−０％FCSに細胞（P138）を懸濁した培養液22.5ml（初期密度：5.6×105個／ml）にALVAC-HIV vCP205の清澄調製物（m.o.i. 0.1）を加え、37℃で30分間培養した。次に、変形McCOY5A−５％FCSを等容量加えて培養液を希釈し（最終細胞密度：2.8×105個／ml）、５％CO2濃度下、振とう（スピナー）しながら37℃でインキュベートした。感染50、74および96時間後に細胞フラクションおよび培養液を回収し、感染性ウイルス量（PFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を分析した。細胞培養物の分析は、上述の実験１の記載に従って行った。本実験の結果を表３にまとめている。
DMEM/F12−０％FCSに細胞（P138）を懸濁した培養液22.5ml（初期密度：5.6×105個／ml）にALVAC-HIV vCP205の清澄調製物（m.o.i. 0.1）を加え、37℃で30分間培養した。次に、変形McCOY5A−５％FCSを等容量加えて培養液を希釈し（最終細胞密度：2.8×105個／ml）、５％CO2濃度下、振とう（スピナー）しながら37℃でインキュベートした。感染50、74および96時間後に細胞フラクションおよび培養液を回収し、感染性ウイルス量（PFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を分析した。細胞培養物の分析は、上述の実験１の記載に従って行った。本実験の結果を表３にまとめている。
Ｃ．実験３
最小量（５ml）の変形McCOY5A−０％FCS中、m.o.i. 0.1においてEB1細胞（p148）を感染させ、さらに、200mlの変形McCOY−２％FCS中で最終細胞密度が1.5×105個／mlとなるように希釈した。実験は二重で行い（スピナーＡおよびＢ）、vCP205（＃363）を半精製した調製物（ショ糖緩和、スピナーＡ）または精製した調製物（ショ糖緩和＋濃度勾配、スピナーＢ）を用いて細胞を感染させた。感染24、48、72および116時間後の時点において、細胞フラクション中および感染細胞の上清中のウイルスDNAの含量および感染性ウイルスの量を定量した。スピナーＡおよびスピナーＢの間では顕著な差異は見られなかった。細胞培養分析は、上述の実験１の記載に従って行った。本実験の結果は、表４および５、ならびに図２および３にまとめている。図４に示すように、細胞生存率についての計測も同時に行った。
最小量（５ml）の変形McCOY5A−０％FCS中、m.o.i. 0.1においてEB1細胞（p148）を感染させ、さらに、200mlの変形McCOY−２％FCS中で最終細胞密度が1.5×105個／mlとなるように希釈した。実験は二重で行い（スピナーＡおよびＢ）、vCP205（＃363）を半精製した調製物（ショ糖緩和、スピナーＡ）または精製した調製物（ショ糖緩和＋濃度勾配、スピナーＢ）を用いて細胞を感染させた。感染24、48、72および116時間後の時点において、細胞フラクション中および感染細胞の上清中のウイルスDNAの含量および感染性ウイルスの量を定量した。スピナーＡおよびスピナーＢの間では顕著な差異は見られなかった。細胞培養分析は、上述の実験１の記載に従って行った。本実験の結果は、表４および５、ならびに図２および３にまとめている。図４に示すように、細胞生存率についての計測も同時に行った。
Ｄ．振とうなし、静置条件での感染（フラスコ）
75cm2の培養フラスコに、50mlのFCS不含DMEM/F12培地を加えて３×106個の細胞を播種し、vCP205（m.o.i. 0.1）を加えて、５％CO2濃度下、37℃で48時間かけて感染させた。培養液および細胞フラクションを回収し、感染性ウイルス量（PFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を定量した。本実験の結果は、表６および図４にまとめている。
75cm2の培養フラスコに、50mlのFCS不含DMEM/F12培地を加えて３×106個の細胞を播種し、vCP205（m.o.i. 0.1）を加えて、５％CO2濃度下、37℃で48時間かけて感染させた。培養液および細胞フラクションを回収し、感染性ウイルス量（PFUアッセイ）およびウイルスDNAの含量（qPCR）を定量した。本実験の結果は、表６および図４にまとめている。
本実験から、次のような結論が導かれた。
・フラスコよりもスピナーで細胞を培養した場合の方がウイルス収量は高かった（平均値：５PFU/ml 対0.5PFU/ml ）。
・平均PFU力価／細胞：6.3（CEP増殖ウイルスに関しては、vCP205の＃S3317、＃S3292、＃3124、＃LST011および＃LP012から計算した平均値から求めた値は2.5TCID50／細胞）
・平均GEQ力価／細胞：105（CEP増殖vCP205に関しては125GEQ／細胞）。比較として、ニワトリ胚繊維芽細胞（CEP）から得られたウイルス収量は、常時約2.5TCID50／細胞（５〜20PFU）であり、これは、125GEQ／細胞に相当する。
・2.5％のFCSを添加した、McCOY培地：DMEM/F12培地（１：１）、においては、感染後72〜97時間の間に、最高力価（感染性およびゲノム性とも）に達した。2.5％FCS添加McCOY培地においては、感染後116時間までゲノム力価が上昇したが、感染力価は感染48時間後に定常状態に達した。
・実験１および２においては、ウイルスは主に細胞培養上清から回収されたが、これは、細胞溶解によるものであると考えられる。
・EB1細胞は、CEPと同程度の収率でALVAC vCP205を複製した。
・最適化をしなかった場合、ウイルス収量が６PFU／個であったこと、および細胞密度が５×105個／mlであったことに基づけば、ローラーボトル120本を使用する標準的な生成過程は、20Lのバイオジェネレーター１本に置き換えることができる。
・フラスコよりもスピナーで細胞を培養した場合の方がウイルス収量は高かった（平均値：５PFU/ml 対0.5PFU/ml ）。
・平均PFU力価／細胞：6.3（CEP増殖ウイルスに関しては、vCP205の＃S3317、＃S3292、＃3124、＃LST011および＃LP012から計算した平均値から求めた値は2.5TCID50／細胞）
・平均GEQ力価／細胞：105（CEP増殖vCP205に関しては125GEQ／細胞）。比較として、ニワトリ胚繊維芽細胞（CEP）から得られたウイルス収量は、常時約2.5TCID50／細胞（５〜20PFU）であり、これは、125GEQ／細胞に相当する。
・2.5％のFCSを添加した、McCOY培地：DMEM/F12培地（１：１）、においては、感染後72〜97時間の間に、最高力価（感染性およびゲノム性とも）に達した。2.5％FCS添加McCOY培地においては、感染後116時間までゲノム力価が上昇したが、感染力価は感染48時間後に定常状態に達した。
・実験１および２においては、ウイルスは主に細胞培養上清から回収されたが、これは、細胞溶解によるものであると考えられる。
・EB1細胞は、CEPと同程度の収率でALVAC vCP205を複製した。
・最適化をしなかった場合、ウイルス収量が６PFU／個であったこと、および細胞密度が５×105個／mlであったことに基づけば、ローラーボトル120本を使用する標準的な生成過程は、20Lのバイオジェネレーター１本に置き換えることができる。
本発明は、好ましい実施態様について記述していることから、当業者であれば、改良および変形を考えつくはずである。故に、請求の範囲は、本発明の範ちゅうに含まれるそのような全ての等価な変形を全て包含するものである。
Claims (30)
- ALVACウイルスを増殖させる方法であって、（ａ）トリ胚性幹細胞由来の１個またはそれ以上の細胞にALVACウイルスを感染させ；（ｂ）感染させたトリ胚性幹細胞を培養してウイルスを産生させ；さらに、（ｃ）ウイルスを単離する工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記ウイルスがALVACゲノム内に外来性DNA配列を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記外来性DNAは、腫瘍抗原、ヒト病原体由来の抗原、またはそれらのフラグメントをコードしていることを特徴とする請求項２記載の方法。
- 前記病原体がバクテリア、菌類またはウイルスであることを特徴とする請求項３記載の方法。
- 前記外来性DNAが、共刺激性分子をさらにコードしていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
- 前記外来性DNAが、共刺激性分子B7.1をコードしていることを特徴とする請求項５記載の方法。
- ウイルスを増殖させる方法であって、（ａ）トリ胚性幹細胞由来の１個またはそれ以上の細胞にALVACウイルスを感染させ；（ｂ）感染させた細胞を培養してウイルスを産生させ；さらに、（ｃ）ウイルスを単離する工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記細胞がEB1細胞またはEB14細胞であることを特徴とする請求項７記載の方法。
- 前記ウイルスがALVACゲノム内に外来性DNA配列を有することを特徴とする請求項７または８記載の方法。
- 前記外来性DNAは、腫瘍抗原、ヒト病原体由来の抗原、またはそれらのフラグメントをコードしていることを特徴とする請求項９記載の方法。
- 前記病原体がバクテリア、菌類またはウイルスであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
- 前記外来性DNAが、共刺激性分子をさらにコードしていることを特徴とする請求項７から１１のいずれか１項記載の方法。
- 前記外来性DNAが、共刺激性分子B7.1をコードしていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
- ALVACウイルスがALVAC(2)であることを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
- ALVACウイルスを含有する組成物であって、該ウイルスは請求項１から１４のいずれか１項記載の方法に従って産生されたものであることを特徴とする組成物。
- ヒトの疾患を治療するための薬物の製造に有用な組成物であって、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法に従って産生されたALVACウイルスを含有することを特徴とする組成物。
- 免疫原性組成物を調製する方法であって、（ａ）トリ胚性幹細胞由来の１個またはそれ以上の細胞にALVACウイルスを感染させ、ここで、該ウイルスは、ALVACゲノム内にヒト腫瘍抗原由来の抗原、ヒト病原体由来の抗原またはそれらのフラグメントをコードしている少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列を有しており；（ｂ）感染させた細胞を培養してウイルスを産生させ；（ｃ）培養した細胞からウイルスを回収し；さらに、（ｄ）回収したウイルスに対して、（ｉ）ウイルスを不活化する、（ｉｉ）薬剤学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤を加える、（ｉｉｉ）アジュバントを加える、もしくは（ｉｖ）凍結乾燥する、のうちの少なくともいずれか１つの処理を行う工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記ALVACウイルスがALVAC(2)であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
- ALVACウイルスを含有する組成物であって、該ウイルスは請求項１７または１８記載の方法に従って産生されたものであることを特徴とする組成物。
- ヒトの疾患の治療用薬物の製造に有用な組成物であって、請求項１７または１８記載の方法に従って産生されたALVACウイルスを含有することを特徴とする組成物。
- 免疫原性組成物を調製する方法であって、（ａ）トリ胚性幹細胞由来の１個またはそれ以上の細胞にALVACウイルスを感染させ、ここで、該ウイルスは、ALVACゲノム内にヒト腫瘍抗原由来の抗原、ヒト病原体由来の抗原またはそれらのフラグメントをコードしている少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列を有しており；（ｂ）感染させた細胞を培養してウイルスを産生させ；（ｃ）培養した細胞からウイルスを回収し；さらに、（ｄ）回収したウイルスに対して、（ｉ）ウイルスを不活化する、（ｉｉ）薬剤学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤を加える、（ｉｉｉ）アジュバントを加える、もしくは（ｉｖ）凍結乾燥する、のうちの少なくともいずれか１つの処理を行う工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記ALVACウイルスがALVAC(2)であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
- 前記細胞がEB1細胞またはEB14細胞であることを特徴とする請求項２１または２２記載の方法。
- ALVACウイルスを含有する組成物であって、該ウイルスは請求項２１〜２３のいずれか１項記載の方法に従って産生されたものであることを特徴とする組成物。
- ヒトの疾患の治療用薬物の製造に有用な組成物であって、請求項２１〜２４のいずれか１項記載の方法に従って産生されたALVACウイルスを含有することを特徴とする組成物。
- 宿主にワクチンを投与する方法であって、（ａ）トリ胚性幹細胞にALVACウイルスを感染させ、ここで、該ウイルスは、ALVACゲノム内にヒト腫瘍抗原、ヒト病原体由来の抗原またはそれらのフラグメントをコードしている少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列を有しており；（ｂ）感染させた細胞を培養してウイルスを産生させ；（ｃ）培養した細胞からウイルスを回収し；さらに、（ｄ）回収したウイルスに対して、（ｉ）ウイルスを不活化する、（ｉｉ）薬剤学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤を加える、（ｉｉｉ）アジュバントを加える、（ｉｖ）安定剤を加える、あるいは（ｖ）凍結乾燥する、のうちの少なくともひとつの処理を行うことによってワクチン組成物を調製し；さらに、（ｅ）該ワクチン組成物を宿主に投与することにより、宿主内で防御免疫応答を起こさせることを特徴とする方法。
- 前記細胞がEB1細胞またはEB14細胞であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
- 前記ALVACウイルスがALVAC(2)であることを特徴とする請求項２６または２７記載の方法。
- ALVACウイルスを含有する組成物であって、該ウイルスは請求項２６〜２８のいずれか１項記載の方法に従って産生されたものであることを特徴とする組成物。
- ヒトの疾患の治療用薬物の製造に有用な組成物であって、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の方法に従って産生されたALVACウイルスを含有することを特徴とする組成物。
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