CN117925543A - 复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，至少缺失了所述基因组中C12基因至K2基因部分的基因序列。通过在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，表明本发明中VTT基因组分别缺失C20‑K2、C17‑K2、C12‑K2基因后，毒力较亲本株VTT明显下降。进一步研究表明缺失A45R基因可以增强其免疫原性，rVTT‑C12‑K2‑A45免疫小鼠和兔后能诱发产生针对猴痘病毒抗原的体液免疫反应。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药领域，具体地，本公开涉及一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用。
背景技术
痘苗病毒是目前已知结构上最为复杂的一种病毒，基因组为线状双链DNA，长约200kb，编码200多个蛋白。通过HindⅢ酶切鉴定，基因组包括16个HindⅢ酶切片段，根据大小排序为A-P。基因组中央为保守区，基因高度保守，编码病毒外壳蛋白和病毒复制所需酶类；两侧为非保守区，基因变异较大，包括宿主范围基因、毒力基因、免疫调节基因等。
痘苗病毒用于天花疫苗，与猴痘病毒同属正痘病毒，存在广泛的血清交叉反应。多项观察性研究证明，天花疫苗对猴痘病毒的保护率约为85％。目前共两款猴痘疫苗获批，分别是由丹麦巴伐利亚北欧公司生产的MVA-BN疫苗和日本KM Biologics公司生产的LC16疫苗。MVA-BN疫苗的使用毒株为改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)，MVA是由痘苗病毒安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞(CEF)中自然传代570次以上，与亲本株CVA相比丢失了15％的基因，MVA为复制缺陷型，无法在人源细胞中有效复制。LC16疫苗是由痘苗病毒Lister株在低温条件下，经原代兔肾细胞多次传代而得，B5R基因缺失是LC16株的重要突变，L16株具有温度限制性、有限宿主范围、低致病性和低不良反应性。
痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tiantan strain，VTT)作为我国预防天花的疫苗株，具备作为猴痘疫苗的潜能。但VTT小鼠颅内接种实验表明，对小鼠的致死率较高，具有一定的神经毒性，在接种过程中也表现出一定的毒性，可引入多种种痘并发症，如多型疹、水疱疹、紫癜、全身痘、坏疽痘和种痘脑炎等，给我国已普遍停止种痘后再恢复带来困难。而复制缺陷型痘苗病毒无法再人源细胞中有效复制，因此为提高VTT安全性，对其进行减毒改造为复制缺陷型是非常有必要的。通过连续传代方式进行减毒所需时间漫长且具有不可预测性，而目前对痘苗病毒的基因功能已有了较为全面的研究，通过基因工程方法选择性的敲除病毒基因组中的毒力基因、宿主范围基因、免疫调节基因和其它功能基因，从而筛选出安全有效的复制缺陷型痘苗病毒天坛株具有可行性。
痘苗病毒基因组左端C-K区域含有多个宿主范围基因、免疫调节基因和毒力基因，Perkus等人将痘苗病毒WR株C-K区缺失21.7kb基因后，不能在人源细胞MRC-5中生长，将痘苗病毒Copenhagen株C-K区缺失18kb基因后，不能在人源细胞中复制。从VTT基因组C-K区删除一定范围的基因，具有实现复制缺陷的潜能。
然而，尽管复制缺陷型痘苗病毒天坛株具备作为猴痘疫苗的潜能，但通过细胞连续传代方式构建复制缺陷型毒株所需时间漫长且具有不可预测性，通过基因工程方法构建时通常是在基因组C-K区随机删除一段序列，未说明不同删除范围对其减毒效果的影响，而痘苗病毒基因组C-K区删除不同范围基因对病毒减毒效果影响应不同。因此，寻找一种既能够实现复制缺陷潜能，又具有良好免疫原性的痘苗病毒天坛株成为当前研究中急需解决的问题。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少能够保证复制缺陷的潜能，和/或能够最大程度地维持其野生型结构，和/或具有良好的免疫原性的痘苗病毒天坛株，提供了一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用。
具体地，本发明人利用同源重组原理用绿色荧光标记基因EGFP分别替换VTT基因组中C-K区不同长度的非必须基因(C12-K2、C17-K2、C20-K2)，构建重组病毒rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP和rVTT-C20-K2-EGFP，通过研究这3个重组病毒在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，验证了其复制缺陷的能力，从而解决了现有技术中存在的问题。
本发明提供的技术方案为：
一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，至少缺失了所述基因组中C12基因至K2基因部分的基因序列。
具体地，在本公开的某些实施方式中，复制缺陷型痘苗病毒天坛株的构建方式如图1所示。选择敲除VTT基因组(GeneBank No:AF095689)中C12-K2(11762bp-25450bp，包含18个基因：C12、C11、C10、C9、C8、C7、C6、C5、C4、C3、C2、C1、N1、N2、M1、M2、K1、K2)，C17-K2(7504bp-25450bp，包含23个基因，较C12-K2多5个基因：C17、C16、C15、C14、C13)及C20-K2(4274bp-25450bp，包含26个基因，较C12-K2多8个基因：C20、C19、C18、C17、C16、C15、C14、C13)，构建重组病毒rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP和rVTT-C20-K2-EGFP。通过研究这3个重组病毒在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，获得毒力小的复制缺陷型毒株。
为了进一步实现本公开的目的，在上述VTT缺失C12-K2等实施方式的基础上，敲除A45R(144139bp-144669bp)以增强复制缺陷型毒株的免疫原性。
为了研究，在本公开的某些实施方式中，利用同源重组原理用绿色荧光标记基因EGFP分别替换VTT基因组中C-K区不同长度的非必须基因(C12-K2、C17-K2、C20-K2)，构建重组病毒rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP和rVTT-C20-K2-EGFP。具体构建方法包括：首先设计重组臂基因，依次为5’-拟删除基因左侧同源重组臂(500bp)-loxP序列-P7.5启动子-绿色荧光筛选标记基因EGFP-T5nT终止信号-loxP序列-右侧同源重组臂(500bp)-3’，缺失VTT基因组中C12-K2、C17-K2、C20-K2及A45所使用重组臂基因序列分别为SEQ ID No.1、2、3、4、5和6，化学合成并连接至载体pUC57，分别为pUC57-C12-K2、pUC57-C17-K2、pUC57-C20-K2及pUC57-A45。
利用同源重组的原理将EGFP基因作为外源筛选标记基因替换VTT基因组中拟敲除的基因。然后运用Cre/Loxp系统敲除EGFP基因，获得不含外源标记基因的重组痘苗病毒。
基于以上研究，在本公开的某些实施方式中，所述C12至K2部分的基因序列由C12基因、C11基因、C10基因、C9基因、C8基因、C7基因、C6基因、C5基因、C4基因、C3基因、C2基因、C1基因、N1基因、N2基因、M1基因、M2基因、K1基因和K2基因组成。
在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了C17基因、C16基因、C15基因、C14基因和C13基因。
在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了C20基因、C19基因、C18基因、C17基因、C16基因、C15基因、C14基因和C13基因。
在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了A45R基因。
本公开的另一个方面，是提供了上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备预防或治疗痘病毒科病毒感染的药物中的用途。作为优选，在本公开的一个实施方式中，所述痘病毒科病毒为猴痘病毒。
本公开的另一个方面，是提供了一种痘病毒科病毒疫苗，所述痘病毒科病毒疫苗包含上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株，以及药学上可接受的载体。
本公开的另一个方面，是提供了上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备外源基因载体中的用途。
本公开的另一个方面，是提供了一种重组病毒，所述重组病毒的基因组中包括上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株的序列。
本公开的另一个方面，是提供了上述重组病毒在制备疫苗或基因治疗药物中的用途。
本发明的有益效果为：
通过在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，表明本发明中VTT基因组分别缺失C20-K2、C17-K2、C12-K2基因后，毒力较亲本株VTT明显下降。进一步研究表明缺失A45R基因可以增强其免疫原性，rVTT-C12-K2-A45免疫小鼠和兔后能诱发产生针对猴痘病毒抗原的体液免疫反应。
附图说明
图1为本公开实施例中复制缺陷型痘苗病毒天坛株构建方案图；
图2为本公开实施例中重组病毒的PCR鉴定结果图；
图3为本公开实施例中rVTT-C12-K2的PCR鉴定结果图；
图4为本公开实施例中rVTT-C12-K2-A45-EGFP的PCR鉴定结果图；
图5为本公开实施例中rVTT-C12-K2-A45的PCR鉴定结果图；
图6为本公开实施例中rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP在不同细胞上形成的蚀斑结果图；
图7为公开实施例中rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP在不同细胞中生长曲线结果图；
图8为本公开实施例中小鼠的生存曲线结果图；
图9为本公开实施例中兔皮肤痘斑形成情况结果图；
图10为本公开实施例中兔皮肤形成痘斑大小变化结果图；
图11为本公开实施例中ELISPOT检测IFN-γ细胞因子结果图。
序列说明
SEQ ID No.1为本公开中缺失VTT基因组中C12-K2所使用左侧同源重组臂的核苷酸序列；
SEQ ID No.2为本公开中缺失VTT基因组中C17-K2所使用左侧同源重组臂的核苷酸序列；
SEQ ID No.3为本公开中缺失VTT基因组中C20-K2所使用左侧同源重组臂的核苷酸序列；
SEQ ID No.4为本公开中缺失VTT基因组中C12-K2、C17-K2、C20-K2所使用右侧同源重组臂的核苷酸序列；
SEQ ID No.5为本公开中缺失VTT基因组中A45所使用左侧同源重组臂的核苷酸序列；
SEQ ID No.6为本公开中缺失VTT基因组中A45所使用右侧同源重组臂的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可见Lewin’s GENES XII，JocelynE.Krebs/Elliott S.Goldstein/Stephen T.Kilpatrick，出版Jones&Bartlett，2018。
术语“基因组”是一个生物体中所有遗传物质的总和。在分子生物学和遗传学领域，基因组通常指的是生物体的所有遗传物质，包括DNA或RNA(病毒RNA)。基因组包括编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。
术语“复制缺陷型”是指病毒不能够完全、有效复制，因而不能产生感染性病毒粒子(virion)。
术语“原始”在本公开中是指处于缺失所述基因前的状态的痘苗病毒天坛株。其可以是野生型痘苗病毒天坛株，即未经过人为改变的痘苗病毒天坛株(GeneBank No:AF095689)；也可以是经过人为基因改造后的痘苗病毒天坛株。
术语“基因”是指负责产生一种或更多种细胞产物和/或实现一种或更多种细胞间或细胞内功能的特定核酸序列。更具体地，所述术语涉及核酸部分(通常为DNA；但是在RNA病毒的情况下为RNA)，其包含编码特定蛋白质或功能性或结构性RNA分子的核酸。
术语“痘病毒科”是一类较大的DNA病毒，感染人和动物后常引起局部或全身化脓性皮肤损害。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒和昆虫痘病毒两个亚科。脊椎动物痘病毒亚科包括可感染人和哺乳类动物的多种痘病毒。该亚科的正痘病毒属成员包括天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒和传染性软疣病毒等，多数引起全身性疹病。示例性的例子包括，天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、口疮病毒、假牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒；特纳河痘病毒、亚巴猴肿瘤病毒；传染性软疣病毒(MCV)。
在本公开的某些实施方式中，术语“疫苗”或称为“免疫原性组合物”包含所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株，还可以包含其他免疫原性物质，从而形成联合疫苗。在本公开的某些实施方式中，术语“疫苗”或称为“免疫原性组合物”还可以包含药学上可接受的载体，以实现某种功能，例如，保留生物活性、增加稳定性，等。所述药学上可接受的载体示例性的例子，如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。术语“疫苗”或称为“免疫原性组合物”还可以包含至少一种佐剂。所述佐剂示例性的例子，如，弗氏佐剂、铝佐剂、QS-21、MF59、CpG，等。
由于痘苗病毒宿主范围广泛，外源基因容量大，且其生活周期在宿主胞质内完成，不存在将基因整合至宿主细胞的风险，因此本公开中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株可以作为疫苗株用于感染性疾病的预防及肿瘤的治疗。在本公开的某些实施方式中，可以通过缺失所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株基因组中的，例如，TK基因、F4L基因或B2R基因作为外源基因的插入位点，进而作为所述外源基因的载体。其可以被应用于其他传染病疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例：
本实施例中使用的痘苗病毒天坛株(VTT)由国药中生生物技术研究院有限公司保存，GeneBank No:AF095689。SPF鸡蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，293细胞购自ATCC。
实施例1：构建
1、VTT基因组中用EGFP基因中分别替代C12-K2、C17-K2、C20-K2
(1)293细胞转染构建含绿色荧光的痘苗病毒
转染前一天，使用DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)将293细胞以1.6×106/孔加入六孔板中。
使用磷酸钙转染试剂盒分别配置转染体系，A(3μg供体质粒pUC57-C12-K2或pUC57-C17-K2或pUC57-C20-K2，12.4μl Ca2+,补水至200μl)及B(200μl HBS)，震荡A同时将B逐滴加入A中，室温放置15min，逐滴加入六孔板中，每孔200μl。
转染第二天，换液为新的DMEM完全培养基，每孔加入3×104PFU VTT。
VTT感染后3天，用培养液重悬细胞，反复冻融。
(2)CEF细胞上蚀斑纯化含绿色荧光蚀斑
使用MEM完全培养基(MEM+10％FBS+1％PS)将CEF细胞悬液以1×106/孔加入六孔板中，37℃、5％CO2培养箱培养1-5天。
将(1)中反复冻融获得的病毒液用MEM完全培养基10倍系列稀释后，感染CEF六孔板，37℃感染1-2h，弃病毒液，每孔加入含1％甲基纤维素的MEM培养基，37℃、5％CO2培养2-3天。
荧光显微镜下观察，六孔板底部用记号笔标记绿色荧光蚀斑，超净工作台内，使用枪尖挑取标记处荧光蚀斑置于1ml MEM完全培养基中。
按上述步骤反复蚀斑纯化5-6次，直至显微镜下观察病毒蚀斑均表达绿色荧光。
(3)重组病毒rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP的PCR鉴定
对3个重组病毒的不同克隆的基因组缺失区域扩增测序，结果如图2所示，通过PCR产物测序确认，获得了拟敲除基因已被替换为EGFP的rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP单克隆毒株。
2、利用Cre/loxp系统敲除rVTTΔC12-K2-EGFP中EGFP基因
(1)293细胞转染敲除rVTTΔC12-K2-EGFP中EGFP基因
转染前一天，使用DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)将293细胞以1.6×106/孔加入六孔板中。
使用磷酸钙转染试剂盒配置转染体系，A(3μg pcDNA3.1(+)-cre，12.4μl Ca2+,补水至200μl)及B(200μl HBS)，震荡A同时将B逐滴加入A中，室温放置15min，逐滴加入六孔板中，每孔200μl。
转染第二天，换液为新的DMEM完全培养基，加入病毒rVTTΔC12-K2-EGFP。
感染后3天，用培养液重悬细胞，反复冻融。
(2)CEF细胞上蚀斑纯化无荧光蚀斑
使用MEM完全培养基将CEF细胞悬液以1.6×106/孔加入六孔板中，37℃、5CO2培养箱培养1-5天。
将(1)中反复冻融获得的病毒液用MEM完全培养基10倍系列稀释后，感染CEF细胞六孔板，37℃感染1-2h，弃病毒液，每孔加入含1％甲基纤维素的MEM培养基，37℃、5％CO2培养2-3天。
荧光显微镜下观察，六孔板底部用记号笔标记无荧光蚀斑，超净工作台内，使用枪尖挑取标记处无荧光蚀斑置于1ml MEM完全培养基中。
按上述步骤反复蚀斑纯化3次，直至显微镜下观察病毒蚀斑均不表达绿色荧光。
(3)rVTT-C12-K2的PCR鉴定
使用引物(C12 F：5’-TCTGAACCGGATTCTAGCAGT-3’,C12 R：5’-ACGGTTCCCATGATGAACGTA-3’)对rVTT-C12-K2的不同克隆的基因组缺失区域扩增测序，结果如图3所示，通过PCR产物测序确认，获得了EGFP基因已敲除的rVTT-C12-K2单克隆毒株。
3、rVTT-C12-K2基因组中用EGFP基因中替代A45R
(1)293细胞转染构建含绿色荧光的痘苗病毒
转染前一天，使用DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)将293细胞以1.6×106/孔加入六孔板中。
使用磷酸钙转染试剂盒分别配置转染体系，A(3μg供体质粒pUC57-A45，12.4μlCa2+,补水至200μl)及B(200μl HBS)，震荡A同时将B逐滴加入A中，室温放置15min，逐滴加入六孔板中，每孔200μl。
转染第二天，换液为新的DMEM完全培养基，每孔加入3×104PFU rVTTΔC12-K2。
VTT感染后3天，用培养液重悬细胞，反复冻融。
(2)CEF细胞上蚀斑纯化含绿色荧光蚀斑
使用MEM完全培养基(MEM+10％FBS+1％PS)将CEF细胞悬液以1×106/孔加入六孔板中，37℃、5％CO2培养箱培养1-5天。
将(1)中反复冻融获得的病毒液用MEM完全培养基10倍系列稀释后，感染CEF六孔板，37℃感染1-2h，弃病毒液，每孔加入含1％甲基纤维素的MEM培养基，37℃、5％CO2培养2-3天。
荧光显微镜下观察，六孔板底部用记号笔标记绿色荧光蚀斑，超净工作台内，使用枪尖挑取标记处荧光蚀斑置于1ml MEM完全培养基中。
按上述步骤反复蚀斑纯化5-6次，直至显微镜下观察病毒蚀斑均表达绿色荧光。
(3)重组病毒rVTT-C12-K2-A45-EGFP的PCR鉴定
分别使用引物(A45 F：5’-AGGTTGCGTCTAGCACTACG-3’，A45 R：5’-GGGCCCTTGCTAACTACGAC-3’)对rVTT-C12-K2-A45-EGFP的不同克隆的基因组缺失区域扩增测序，结果如图4所示，通过PCR产物测序确认，获得了拟敲除基因已替换为EGFP的rVTT-C12-K2-A45-EGFP。
4、利用Cre/loxp系统敲除rVTTΔC12-K2-A45-EGFP中EGFP基因
(1)293细胞转染敲除rVTTΔC12-K2-A45-EGFP中EGFP基因
转染前一天，使用DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)将293细胞以1.6×106/孔加入六孔板中。
使用磷酸钙转染试剂盒配置转染体系，A(3μg pcDNA3.1(+)-cre，12.4μl Ca2+,补水至200μl)及B(200μl HBS)，震荡A同时将B逐滴加入A中，室温放置15min，逐滴加入六孔板中，每孔200μl。
转染第二天，换液为新的DMEM完全培养基，加入病毒3×104PFU rVTTΔC12-K2-A45-EGFP。
感染后3天，用培养液重悬细胞，反复冻融。
(2)CEF细胞上蚀斑纯化无荧光蚀斑
使用MEM完全培养基将CEF细胞悬液以1.6×106/孔加入六孔板中，37℃、5CO2培养箱培养1-5天。
将(1)中反复冻融获得的病毒液用MEM完全培养基10倍系列稀释后，感染CEF细胞六孔板，37℃感染1-2h，弃病毒液，每孔加入含1％甲基纤维素的MEM培养基，37℃、5％CO2培养2-3天。
荧光显微镜下观察，六孔板底部用记号笔标记无荧光蚀斑，超净工作台内，使用枪尖挑取标记处无荧光蚀斑置于1ml MEM完全培养基中。
按上述步骤反复蚀斑纯化3次，直至显微镜下观察病毒蚀斑均不表达绿色荧光。
(3)rVTT-C12-K2-A45的PCR鉴定
使用引物(A45 F：5’-AGGTTGCGTCTAGCACTACG-3’，A45 R：5’-GGGCCCTTGCTAACTACGAC-3’)对rVTT-C12-K2-A45的不同克隆的基因组缺失区域扩增测序，结果如图5所示，通过PCR产物测序确认，获得了EGFP基因已敲除的rVTT-C12-K2-A45单克隆毒株。
实施例2：rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP毒力检定
1、病毒蚀斑形态
方法：使用CEF、Vero及人源细胞MRC-5、WI-38进行检测。六孔板中接种细胞生长至单层，每孔按100PFU接种重组病毒或亲本病毒VTT，37℃、5％CO2培养，分别于感染3-4天后通过结晶紫染色。使用斑点分析仪(厂家：CTL，型号：S6 Universal)测量病毒蚀斑直径大小。
结果：在不同细胞上形成的蚀斑见图6，病毒蚀斑直径大小见表1。可观察到在MRC-5和WI-38细胞上rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP这三株重组病毒均无明显蚀斑形成；Vero细胞中rVTT-C12-K2-EGFP形成的蚀斑最小。
表1rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP、rVTT-C20-K2-EGFP在不同细胞上形成的蚀斑直径大小
2、不同细胞系中病毒复制水平
方法：使用CEF、Vero及人源细胞MRC-5、WI-38进行检测。六孔板中接种细胞生长至单层，每孔接种1×103PFU重组病毒或亲本株VTT，37℃、5％CO2培养，分别于感染后1天、2天、3天收集培养液及细胞，反复冻融3次后，测定病毒滴度，绘制不同细胞系中的病毒生长曲线。
结果：病毒生长曲线见图7，VTT基因组分别缺失C20-K2、C17-K2、C12-K2后，可以同亲本株VTT一样在生产细胞CEF细胞中高效复制。然而在MRC-5、WI-38中，重组病毒无法有效复制，滴度峰值较亲本株VTT低约4lg。在Vero细胞中，rVTT-C12-K2-EGFP滴度峰值最小。
3、小鼠脑内毒力
方法：将重组病毒滴度调整至1×107PFU/ml。使用微量进样器将病毒接种至3周龄Balb/C和Balb/C nude小鼠脑内，每只接种50μl。感染后观察21天，记录小鼠死亡数。
结果：Balb/C小鼠中3个重组病毒感染均未引起小鼠死亡；Balb/C nude小鼠中，rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP感染未引起小鼠死亡，rVTT-C20-K2-EGFP感染有1只小鼠死亡。
总结：由以上1、2、3的实验结果看出，rVTT-C12-K2-EGFP、rVTT-C17-K2-EGFP和rVTT-C20-K2-EGFP毒力较亲本株VTT均明显下降。在人源细胞MRC-5、WI-38中，3个重组病毒无法有效复制，不能形成明显蚀斑；在Vero细胞中，rVTT-C12-K2-EGFP滴度峰值最小，且形成蚀斑直径也最小。Balb/c nude小鼠脑内毒力试验中，rVTT-C20-K2-EGFP感染组有1只动物死亡。
实施例3：rVTT-C12-K2与rVTT-C12-K2-A45毒力检定
1、小鼠脑内毒力
方法：3周龄Balb/C和Balb/C nude小鼠按下表2进行分组。将VTT调整至1×106PFU/ml，再进行10倍系列稀释；将重组病毒滴度调整至1×108PFU/ml。使用微量进样器将病毒接种至小鼠脑内，每只接种50μl。感染后观察21天，记录小鼠死亡数。
表2小鼠脑内毒力试验动物分组
结果：生存曲线见图8。Balb/C和Balb/C nude小鼠中2个重组病毒感染均未引起小鼠死亡；Balb/C小鼠实验中，VTT感染剂量为5×104、5×103、5×102PFU时，小鼠全部死亡，VTT感染剂量为50PFU时，小鼠死亡6只。Balb/C nude小鼠中，VTT感染剂量为5×104、5×103、5×102、50PFU时，小鼠全部死亡。2个重组病毒较亲本株VTT均减毒105倍以上。
2、家兔皮肤毒力试验
使用脱毛剂脱去兔背毛，将VTT、rVTT-C12-K2和rVTT-C12-K2-A45用DPBS调整至1×108PFU/ml，在兔背部脊椎两侧对称接种病毒，每侧选取3个位点，通过皮内注射，每位点注射0.1ml病毒。每日测量背部皮肤形成痘斑直径，连续观察21天。
结果：如图9所示，rVTT-C12-K2和rVTT-C12-K2-A45在兔皮肤形成的皮损反应明显小于亲本株VTT。各组痘斑大小变化如图10所示，平均痘斑直径：rVTT-C12-K2-A45<rVTT-C12-K2<VTT。
总结：由以上1、2的实验结果看出，小鼠脑内毒力试验和家兔皮肤毒力试验中，rVTT-C12-K2和rVTT-C12-K2-A45的毒力明显小于亲本株VTT。小鼠脑内毒力试验中，2个重组病毒感染小鼠全部存活，较亲本株VTT均减毒105倍以上。家兔皮肤毒力试验中，rVTT-C12-K2-A45感染形成的痘斑小于rVTT-C12-K2。
实施例4：免疫原性检测
1、rVTT-C12-K2与rVTT-C12-K2-A45免疫原性比较
将重组病毒和亲本株VTT调整至1×107PFU/ml，肌肉免疫Balb/C小鼠，每只接种100μl，共免疫2针，免疫间隔14天。末次免疫7天后取脾。ELISPOT检测IFN-γ细胞因子，如图11所示，rVTT-C12-K2-A45诱导IFN-γ细胞因子水平显著高于rVTT-C12-K2。
2、rVTT-C12-K2-A45诱导小鼠和兔抗猴痘病毒抗体检测
将rVTT-C12-K2-A45调整至1×108PFU/ml，免疫Balb/C小鼠和大耳白兔，小鼠每只接种0.1ml，兔每只接种0.5ml。共免疫2针，免疫间隔28天，末次免疫7天后取血分离血清。用ELISA分别检测血清中抗猴痘病毒抗原A35、B6、H3、M1特异性结合抗体，如表3、表4所示，rVTT-C12-K2-A45免疫小鼠和兔后能诱发产生针对猴痘病毒抗原的体液免疫反应。
表3小鼠血清抗猴痘病毒抗原抗体水平检测
表4兔血清抗猴痘病毒抗原抗体水平检测
总结：由以上1、2的实验结果看出，rVTT-C12-K2缺失A45基因后能有效提高细胞免疫水平。rVTT-C12-K2-A45免疫小鼠和兔后能诱发产生针对猴痘病毒抗原的体液免疫反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，至少缺失了所述基因组中C12基因至K2基因部分的基因序列。
2.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述C12至K2部分的基因序列由C12基因、C11基因、C10基因、C9基因、C8基因、C7基因、C6基因、C5基因、C4基因、C3基因、C2基因、C1基因、N1基因、N2基因、M1基因、M2基因、K1基因和K2基因组成。
3.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了C17基因、C16基因、C15基因、C14基因和C13基因。
4.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了C20基因、C19基因、C18基因、C17基因、C16基因、C15基因、C14基因和C13基因。
5.根据权利要求1～4任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了A45R基因。
6.如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备预防或治疗痘病毒科病毒感染的药物中的用途；
优选地，所述痘病毒科病毒为猴痘病毒。
7.一种痘病毒科病毒疫苗，其特征在于，所述痘病毒科病毒疫苗包含如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备外源基因载体中的用途。
9.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒的基因组中包括如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株的序列。
10.如权利要求9所述的重组病毒在制备疫苗或基因治疗药物中的用途。
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