CN117015609A - 免疫原性增强的经修饰的副痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫原性增强的经修饰的副痘病毒，优选副痘病毒载体、含有所述经修饰的副痘病毒的生物细胞、含有所述经修饰的副痘病毒载体和/或所述细胞的药物组合物，优选疫苗，以及所述经修饰的副痘病毒的新用途。

Description

免疫原性增强的经修饰的副痘病毒
本发明涉及免疫原性增强的经修饰的副痘病毒(Parapoxvirus)，优选副痘病毒载体，含有所述经修饰的副痘病毒的生物细胞，含有所述经修饰的副痘病毒载体和/或所述细胞的药物组合物，优选疫苗，以及所述经修饰的副痘病毒的新用途。
经修饰的病毒，例如病毒载体，在生物科学、医学和加工工程中有多种应用。例如，基于病毒载体的疫苗有望引发针对任何种类抗原肽的细胞和体液免疫反应。在痘病毒科的副痘病毒属中，羊传染性脓疱病毒(Orf病毒；ORFV)毒株D1701-V包含特别有利于载体平台技术发展的各种特性，并被证明促进了各种疫苗接种方法。
然而，在经修饰的病毒或病毒载体领域中可以发现的一个问题是低免疫原性。低免疫原性降低了基于病毒载体的疫苗的有效性。目前解决这一问题的策略是使用免疫调节元件或将病毒载体的制剂与改善疫苗免疫反应的药理学试剂或免疫学试剂结合使用。然而，这些方法并没有完全成功。一些病毒载体的包装能力有限，免疫调节元件的表达经常使病毒不能工作。此外，佐剂通常对接种的生物体有毒，这就是基于病毒载体的疫苗接种经常伴随副作用的原因。
在此背景下，本领域需要提供新的经修饰的病毒，特别是病毒载体，其可用于有效生产基于病毒载体的疫苗和其他应用，从而减少或甚至避免本领域中已知的问题。
因此，本发明的目的是分别提供这种经修饰的病毒或病毒载体，其特征在于免疫原性增强，而不需要包含免疫调节元件或具有佐剂的载体的制剂。
本发明通过提供经修饰的副痘病毒，优选副痘病毒载体来满足这些和其它需求，所述载体在编码“′NF-κB抑制剂”的病毒开放阅读框(ORF)中包含至少一个功能突变，其中所述载体与没有所述功能突变的相同载体相比免疫原性增强。
根据本发明，“副痘病毒”是痘病毒科和脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)中的病毒属。像痘病毒科的所有成员一样，它们是椭圆形、相对较大的双链DNA病毒。副痘病毒具有区别于其他痘病毒的独特的螺旋外壳。副痘病毒感染脊椎动物，包括多种哺乳动物和人类。根据本发明，所有种类的副痘病毒都适用，然而，Orf病毒是优选的。
根据本发明，“经修饰的”副痘病毒是指在野生型的对应病毒上进行技术性修饰的由副痘病毒衍生的病毒。
根据本发明，“副痘病毒载体”是指基于副痘病毒基因组或由副痘病毒基因组组成的载体或质粒，其被配置用于转染生物细胞，优选哺乳动物和人类细胞，进一步优选还用于在生物细胞中转运和/或表达转基因或外源基因。
根据本发明，“NF-κB抑制剂”是指一组能够降低或引发转录因子NF-κB(活化B细胞的核因子κ-轻链增强子)活性的蛋白质。NF-κB是蛋白质复合物，控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活。NF-κB存在于几乎所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激如应激、细胞因子、自由基、重金属、紫外线照射、氧化低密度脂蛋白和细菌或病毒抗原的反应。NF-κB在调节对于感染的免疫反应中起着关键作用。NF-κB转录因子家族由5个成员组成，它们的负责DNA序列特异性DNA结合和同源或异源二聚化的N-末端Rel同源结构域不同。这些二聚体转移到细胞核中导致涉及从细胞生长和存活、组织和器官发育到免疫反应和炎症的生物过程的基因转录，并依赖于两种主要信号通路的激活，这两种信号通路对不同的刺激做出反应，包括模式识别受体(PRR)、TNF受体(TNFR)超家族成员以及TCR和BCR的配体。虽然经典途径中的转运依赖于多亚基IκB激酶(IKK)复合物对IκBα的磷酸化，但非经典途径涉及NF-κB前体蛋白p100的加工。由于痘病毒感染，以及许多其他病毒感染，是由PRR如TLR或视黄酸诱导基因(RIG-I)样受体感应的，这些病毒已经进化出干扰NF-κB途径的策略。因此，ORFV也被描述为编码至少五种NF-κB抑制剂。除此之外，NF-κB抑制剂编码的病毒开放阅读框119(ORF119)被描述为含有C-末端LxCxE基序，允许与成视网膜母细胞瘤蛋白pRB强烈相互作用，已知pRB具有肿瘤抑制活性。通过阻止TNF受体相关因子2(TRAF2)的募集，ORF119/pRB抑制TNFα诱导的IKK激活和NF-κB信号传导。然而，尽管ORF119在NF-κB信号传导中起作用，但最近也显示其抑制细胞增殖并诱导凋亡，以促进病毒颗粒的释放。因此，NF-κB和凋亡调控之间的相互作用仍需进一步研究。
根据本发明，“功能突变”是指基因和编码的蛋白质的遗传改变，与未突变的野生型相比，其导致活性和/或功能的改变。功能突变包括但不限于敲除突变、点突变、缺失突变、移码突变和置换突变等，它们都导致NF-κB抑制剂功能的改变，无论是NF-κB抑制剂功能失调还是NF-κB抑制剂的表达分别被抑制、减少或避免。
根据本发明，“免疫原性”是副痘病毒载体在人类动物体内引发免疫反应的能力，即诱导体液和/或细胞介导的免疫反应的能力。免疫原性可以通过技术人员熟知的各种方法来测量。关于此类方法的概述可参见Madhwa等人(2015)，Immunogenicity assessmentof biotherapeutic products：An overview of assays and their utility，Biologicals Vol.43，Is.5，pp.298-306。
本发明人能够认识到，具有功能突变的、优选灭活的NF-κB抑制剂的副痘病毒载体的特征在于，分别与未突变的对应载体或野生型病毒相比，其具有特定的实体和提高的免疫原性。载体活化外周血单核细胞或在体外诱导抗原特异性免疫反应的能力证明了免疫原性的增加。同时，本发明人发现根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体仍表现出优异的生长行为，并具有表达转基因或外源基因的能力。发明人进行的分析证明了基于载体的疫苗设计的巨大潜力。
由于已鉴定的增强的免疫原性，根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体也非常适合于其他应用，例如溶瘤病毒或溶瘤病毒载体、免疫刺激剂、基因治疗工具或灭活病毒。
发明人的发现是出人意料的，并且是技术人员所不能预料的。可以假设编码NF-κB抑制剂的ORF对于副痘病毒基因组的功能和可复制性是必要的，或者至少是有利的，因此对于基于副痘病毒的载体是必要的。换句话说，可以假设在副痘病毒载体中，不能免除编码NF-κB抑制剂的ORF。此外，病毒ORF中的功能突变通常导致免疫原性丧失，并且当副痘病毒中编码NF-κB抑制剂的ORF突变时，可以预期具有相同的效果。因此，该技术指向与本发明指向相反的方向。
本发明的根本问题由此得以完全解决。
在本发明的实施方案中，功能突变导致NF-κB抑制剂的活性低于未突变的NF-κB抑制剂。
该实施方案包括编码NF-κB抑制剂的ORF中的任何种类的遗传改变，其分别导致NF-κB抑制剂功能的丧失(功能丧失突变)，或者与野生型对应物相比，NF-κB抑制剂表达或活性显著降低。因此，该实施方案包括NF-κB抑制剂功能的下调，其不需要完全失活。然而，在本发明的实施方案中，NF-κB抑制剂的完全失活或活性降至零是优选的。突变包括但不限于敲除突变、点突变、缺失突变、移码突变和置换突变等，它们都导致NF-κB抑制剂功能的失活，无论是功能障碍性NF-κB抑制剂的结果还是NF-κB抑制剂的表达分别被抑制、减少或避免。
在本发明的实施方案中，经修饰的副痘病毒是羊传染性脓疱病毒(Orf病毒，ORFV)，或者副痘病毒载体是羊传染性脓疱病毒(Orf病毒，ORFV)载体。
羊传染性脓疱病毒或Orf病毒(ORFV)是副痘病毒属的原型，属于痘病毒科。ORFV是有包膜的复杂dsDNA病毒，其形态上类似于羊毛球，平均大小约为260nm×160nm。它们包含具有高GC含量的线性DNA基因组，大小约为130kbp至150kbp，其中心区域在两侧由ITR区域(“反向末端重复”)界定，并以末端为发夹结构，该结构将两条DNA单链彼此共价连接。在基因组的中心区域，主要存在对病毒复制和形态发生至关重要的基因，这些基因在痘病毒中高度保守。相比之下，在ITR区域存在所谓的非保守毒力基因，其显著确定宿主范围、致病性和免疫调节，从而表征病毒。
ORFV具有多种特性，这些特性使其对于重组疫苗的制备是令人感兴趣的，并且优于其他技术。与正痘病毒相比，ORFV的特征在于非常狭窄的天然宿主嗜性，包括绵羊和山羊。因此，几乎可以排除在最常见的牛痘和腺病毒的病毒载体中观察到的由自然感染引起的人体内针对载体的抑制性“前免疫”。此外，极其微弱和短暂的ORFV特异性载体免疫允许用针对其它病原体的基于ORFV的疫苗进行非常有效的加强和/或更新接种或免疫。
在本发明的另一个实施方案中，所述ORFV属于毒株D1701，优选毒株D1701-V。
这种方案的优点是，所用的病毒或载体是减毒的，并仅在宿主中引起渐近感染。根据本发明，涵盖了D1701的所有变体，包括D1701-B和D1701-V，而后者是优选的。Rziha等人(2019)，Genomic Characterization of Orf Virus Strain D1701-V(Parapoxvirus)andDevelopment of Novel Sites for Multiple Transgene Expression.Viruses 11(2)，p.127中公开了毒株D1701-V的特征。
在另一个实施方案中，所述NF-κB抑制剂由病毒开放阅读框119(ORF119)编码，优选地，所述开放阅读框(ORF)位于nt 14.344±100至nt 14.952±100的核苷酸位置。
通过这种方案，提供了特定的开放阅读框作为失活的靶标，其在ORFV D1701中编码NF-κB抑制剂。因此，技术人员获得了突变位置的详细信息。在本文中，所示的核苷酸位置是指31.805nt处，其包含由Rziha，H.-J.确定的ORFV D1701-V基因组右侧部分编码的DNA序列，未公开的数据如图2b所示。
在其他实施方案中，根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体还包含：
(1)至少一个编码转基因的核苷酸序列，和
(2)至少一个控制该编码转基因的核苷酸序列表达的启动子。
根据本发明，“转基因”或同义的外源基因是指非来源于副痘病毒基因组的基因或开放阅读框(ORF)。
根据本发明，“启动子”是指允许在本发明副痘病毒载体中调节转基因表达的核酸片段。优选地，它指ORFV启动子，即存在于野生型ORFV基因组中的启动子或由其衍生的启动子，或人工启动子，如痘病毒启动子、CMV启动子等。
这种方案的优点在于，根据本发明的病毒或载体被用作生产任何外源蛋白如抗原的遗传工具。连同载体的优异免疫原性特性，这种实施方案提高了根据本发明的病毒或载体作为疫苗组合物的活性物质或组分的适用性。
在本发明的另一个实施方案中，将所述编码转基因的核苷酸序列插入到所述编码NF-κB抑制剂的病毒ORF中，和/或，可替代地，所述编码NF-κB抑制剂的病毒ORF被所述编码转基因的核苷酸序列取代。
根据本发明，“插入到所述编码NF-κB抑制剂的病毒ORF中”是指NF-κB抑制剂编码序列或开放阅读框分别在任何位置被删除或开放，转基因编码序列及其启动子被插入。NF-κB抑制剂编码序列的片段可以或不可以通过所述方法去除。根据本发明，“被所述编码转基因的核苷酸序列取代”是指从病毒或载体中去除整个编码NF-κB抑制剂的病毒ORF，序列缺口接收编码转基因的核苷酸序列及其启动子。该实施方案的优点在于，转基因编码核苷酸序列的插入提供了NF-κB抑制剂的功能突变或失活。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，包含多于一个编码转基因的核苷酸序列，优选地，编码转基因的核苷酸序列的数量选自：2个、3个、4个或多于4个。
在该实施方案中，各个转基因或转基因编码序列都可以位于编码NF-κB抑制剂的病毒ORF中。然而，或者，各种转基因编码序列也可以分别位于病毒或载体基因组或构建体中的相同或不同位置。在每个插入基因座中，可以表达多个外源基因，优选2个、3个、4个或多于4个。例如，在ORFV D1701或D1701-V中，转基因编码序列可优选位于任何的病毒ORF112、119、126等中。
该方案的优点在于，通过根据本发明的单个经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，可以表达多个外源基因或转基因。该实施方案特别适合于同时抗多个抗原结构的多价疫苗的生产。
在根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体的另一个实施方案中，启动子是早期ORF启动子，其优选地包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1(eP1)、SEQ ID NO：2(eP1)、SEQ ID NO：3(优化的“早期”)、SEQ ID NO：4(7.5kDa启动子)和SEQ ID NO：5(VEGF)。
这种方法的优点在于，使用的启动子允许转基因的高表达水平和表达的靶向控制。启动子eP1和eP2由发明人开发，并发表于Rziha，H.-J.等人(2019；l.c.)。其余的启动子来源于牛痘病毒，并在Davidson and Moss(1989)，Structure of Vacciniavirus latepromoters，J.Mol.Biol.，Vol.210，pp-771-784，和Yang等人(2011)，Genome-wideanalysis ofthe 5′and 3′ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineatesregulatory sequences of annotated and anomalous transcripts，J.Virology，Vol.85，No.12，pp.5897-5909，Broyles(2003)，Vaccinia virus transcription，J.Gene.Virol.，Vol.84，No.9，pp.2293-2303的其他文章中有所描述。根据本发明人的发现，与eP1相比，P2导致显著增加的表达强度。这是出人意料的，因为启动子eP1与牛痘病毒的共有序列100％对应，而eP2却不是。“最佳”牛痘病毒启动子(正痘病毒)在ORFV(副痘病毒)中的低表达是矛盾且出人意料的。同样出人意料的是，eP2启动子导致了强表达。
在根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体的另一个实施方案中，转基因选自下列抗原：
-病毒抗原，优选
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)抗原，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)；
狂犬病病毒抗原，包括糖蛋白(RabG)；
甲型流感抗原，包括核蛋白(NP)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)；
-肿瘤抗原，优选病毒肿瘤抗原，包括人乳头瘤病毒选择性病毒肿瘤抗原；
-肿瘤相关抗原，包括病毒肿瘤相关抗原，包括HPV选择性病毒肿瘤相关抗原；
-寄生虫抗原，优选疟原虫抗原；
-细胞因子；
-源自或衍生自哺乳动物的蛋白质，优选源自或衍生自哺乳动物受体的蛋白质。
该方案的优点在于，特别重要的抗原，尤其是用于疫苗生产的抗原，可通过根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体表达。
本发明的另一主题涉及生物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选Vero细胞、HEK 293细胞或抗原呈递细胞，其包含根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体。
Vero和HEK 293细胞目前用于生产根据本发明的经修饰的病毒或载体。然而，在宿主中，病毒被抗原呈递细胞吸收。
本发明的另一个主题涉及组合物，优选药物组合物，其包含本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体和/或本发明的细胞，以及药学上可接受的载体。药物组合物可以优选为疫苗，还优选为多价疫苗、免疫刺激剂、基因治疗工具等。
药学上可接受的载体是本领域公知的。它们包括但不限于稳定剂、黏合剂、稀释剂、盐、佐剂、缓冲剂、脂质等。概述见Rowe(2020)，Handbook of PharmaceuticalExcipients，9th edition，Pharmaceutical Press。
根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体的特性、优点、特征和进一步发展以相应的方式适用于本发明的细胞和本发明的组合物。
本发明的另一个主题涉及在编码“NF-κB抑制剂”的病毒开放阅读框(ORF)中包含至少一个失活突变的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体用于在生物中诱导免疫反应的用途，所述生物优选哺乳动物或人类。
根据本发明的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体的特性、优点、特征和进一步发展以相应的方式适用于本发明的用途。
应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，前面提到的特征和下面将要解释的特征不仅可以用在每种情况下指示的组合中，而且还可以用在其他组合中或者独立的位置中。
实施方案
现在通过产生本发明的附加特征、特性和优点的实施方案来进一步解释本发明。这些实施方案纯粹是说明性的，并不限制本发明的范围。在特定实施方案中提到的特征是本发明的特征，并且可以被视为不适用于特定实施方案的一般特征，但是在本发明的任何实施方案的上下文中也是孤立的。参考附图，其中示出了以下内容。
图1：pDel119-2-AcGFP的质粒图。
图2：D1701-V基因组中ORF119缺失的图解说明。A)示出了Rziha等人(2019；l.c.)最近发表的ORFV毒株D1701-V的基因组图谱。B)由基因组右侧部分编码的开放阅读框(ORF)；包含31.805nt的DNA序列由Rziha，H.-J.未公开的数据所确定。C)受每个基因缺失影响的基因组位点的放大图。相应的序列如SEQ ID NO：6所示。
图3：GFP被稳定地并入Del119中。Vero细胞中VCh119GFP第1、5、10、15和20代后的119PCR表明基因119(A)持续缺失，而d119PCR结果显示具有1155bp的GFP特异性片段被插入至Del119基因座(B)中。1％琼脂糖凝胶；ni＝来自未感染的Vero细胞的DNA；M＝即用型1kbLadder，Nippon Genetics。
图4：pDel119的质粒图。
图5：新型Del位点重组VCh119GFP诱导Vero细胞中GFP和mCherry的表达。在用新型Del位点重组体和参照病毒VChD12GFP感染5天后，进行单个噬菌斑的荧光显微镜观察。示出了从明场显微镜、单一GFP和mCherry通道获得的图像以及合并后的图像，而比例尺代表500μm。
图6：转基因gfp和mcherry在Del位点重组VCh119GFP中的遗传稳定性。在10次连续传代(P1-P10)期间，通过感染后72小时后的单个噬斑计数来确定感染的Vero细胞的荧光团表达。示出了从96孔有限稀释度获得的每个Del位点重组体的三个病毒克隆的单一GFP(A)和单一mCherry(B)表达噬菌斑的频率，以及示出单一荧光的噬菌斑的总频率(C)。计算单个荧光噬菌斑的平均总频率，并绘制在(D)中。
图7：Del位点重组VCh119GFP的一步生长曲线。在吸附后2小时(0hpi)和在指定的感染后小时(hpi)洗涤并收集感染的细胞(MOI 1)，同时在Vero细胞上滴定总细胞裂解物以确定病毒滴度(PFU/ml)。120小时后，重组VCh119GFP的病毒生长曲线达到与对照vch 12GFP相当的病毒滴度。
图8：Vero细胞中GFP和mCherry表达的比较。用新型Del位点重组VCh119GFP和参照病毒VChD12GFP感染Vero细胞，收获24hpi和48hpi。mCherry(A)和GFP(B)的几何平均荧光强度(MFI)通过FACS分析确定，并与VChD12GFP的几何平均荧光强度进行标准化。示出了三个独立实验的副本。采用置信区间为95％的非配对t检验进行统计分析：ns＝p≥0.05，*＝p＜0.05，***＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图9：单核细胞THP-1细胞中GFP和mCherry表达的比较。用新型Del位点重组VCh119GFP和参照病毒VChD12GFP感染THP-1细胞，收获24hpi和48hpi。mCherry(A)和GFP(B)的几何平均荧光强度(MFI)通过FACS分析确定，并与VChD12GFP的几何平均荧光强度进行标准化。采用置信区间为95％的非配对t检验计算每个独立实验的平均值以进行统计分析：ns＝p≥0.05，*＝p＜0.05，***＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图10：新型Del位点重组体VCh119GFP活化人PBMC。用VCh119GFP和参照病毒VChD12GFP感染八个不同供体的PBMC 24小时。感染细胞的百分比通过CD14+细胞群(A)的mCherry表达来确定，而CD4+细胞群(B)和CD8+(C)T细胞群、CD19+B细胞群(D)和CD56+NK细胞群(E)的活化使用CD69作为活化标志物来确定。示出了八个独立进行的实验中每个实验的不同PBMC群体的CD69+分数及其平均值。采用置信区间为95％的配对t检验进行统计分析：ns＝p≥0.05，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图11：用新型Del位点重组VHLA119GFP感染后6个不同供体的感染率和记忆T细胞的扩增。用Pepmix或用VHLA119GFP和参照病毒VHLAD12GFP感染的CD14+单核细胞刺激CD14-PBMC群体。D12-Cherry感染和未刺激的细胞用作对照。A)感染率在24hpi时用FACS通过CD14+单核细胞中mCherry或GFP的表达来确定。B)12天后，通过四聚体+CD8+T细胞(抗原特异性CD8+T细胞)的比例来确定记忆T细胞的扩增。以下颜色表示不同供体拥有的记忆T细胞特异性：黑色：GLCTLVAML和GILGFVFTL；蓝色：GILGFVFTL和NLVPMVATV；绿色：GLCTLVAML，GILGFVFTL和NLVPMVATV。显示的是6个独立实验的结果和计算的平均值。采用置信区间为95％的配对t检验进行统计分析：ns＝p≥0.05，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图12：用新型Del位点重组VHLA119GFP感染后6个不同供体的记忆T细胞的扩增和功能。用Pepmix或用VHLA119GFP和参照病毒VHLAD12GFP感染的CD14+单核细胞刺激CD14-PBMC群体。D12-Cherry感染和未刺激的细胞用作对照。A)12天后，记忆性T细胞的扩增通过GILGFVFTL、GLCTLVAML或NLVPMVATV四聚体+CD8+T细胞的比例来确定，用不同的符号表示。B)在用GILGFVFTL、GLCTLVAML或NLVPMVATV重新刺激后，通过TNFα和IFNγ的细胞内染色分析扩增的CD8+T细胞的功能性，并测定TNFα+IFNγ+CD8+T细胞的比例。图示是6个独立实验的结果和计算的平均值。采用置信区间为95％的配对t检验进行统计分析：ns＝p≥0.05，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
图13：SARS-CoV-2 ORFV重组体刺激的体液和细胞免疫反应。用107PFU的表达N-SARS-CoV-2或S1-SARS-CoV-2蛋白的对照ORFV重组体，或含有ORF119缺失的ORFV载体，在两周间隔内免疫CD1小鼠两次。A)-B)在第二次免疫后，通过ELISA评估由ORFV载体诱导的N-特异性和S1-特异性结合总IgG。采用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA来评估与对照ORFV组相比，结合抗体终点滴度之间的差异。
1.前言
本发明涉及经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体作为工具，用于在生物体内诱导增强的免疫反应，并且在进一步的发展中，用于表达转基因或外源基因的用途。为了允许将多个转基因插入到单个副痘病毒载体中，本发明还涉及编码“NF-κB抑制剂”例如羊传染性脓疱病毒(ORF病毒，ORFV)毒株D1701和D1701-V中的ORF119的开放阅读框(ORF)作为转基因表达的插入位点的适用性。对新的缺失突变体进行了插入的AcGFP(GFP)报道基因构建体的遗传稳定性、它们的生长行为和在体外不同靶细胞中诱导转基因表达的能力的详细表征。此外，突变体的免疫原性通过其活化外周血单核细胞和抗原呈递细胞或在体外和体内诱导抗原特异性免疫反应的能力来分析。总之，所进行的分析表明，通过将NF-κB抑制剂编码ORF的敲除整合到副痘病毒基因组中，设计多价、单一载体疫苗的潜力很大。因此，开放阅读框与报道基因GFP的交换不仅导致表达所需转基因的稳定载体的有效复制，而且还使新生成的重组体具有显著的免疫原性。
2.引言
ORFV毒株D1701-V获自牛肾细胞系BK-KL3A适应株D1701-B，并在适应非洲绿猴细胞系Vero中生长后显示出几次基因组重排；Cottone，R.等人(1998)，Analysis of genomicrearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strainD1701，Virus Research 56(1)，p.53-67；Rziha，H.J.等人(2000)，Generation ofrecombinant parapoxviruses：non-essential genes suitable for insertion andexpression of foreign genes，Journal of Biotechnology 83(1)，p.137-145。这些基因组重排包括缺失对毒株复制非必需的基因，并显示适合转基因表达，如缺失区域D(D基因座)；Rziha，H.-J.等人(2019；l.c.)。此外，血管生成因子VEGF-E被预测为在羊中引起血性病变的主要毒力决定因素，Rziha，H.J.等人(2000；l.c.)，因此，作为插入位点以生成ORFV重组体，从而触发对不同宿主中的几种病毒性疾病具有高保护效力的持久免疫。除了这些成功使用的插入位点之外，在D1701-V基因组的末端还发现了其他可能适合转基因表达的基因。由于痘病毒的中心区域通常编码在位置、间距和方向上保守的必需基因，因此这些区域编码影响毒力、致病性或宿主范围的因子，被认为对于体外生长是不可缺少的。虽然预计这些因子会干扰宿主引发的细胞和体液免疫反应的最佳诱导，但这些免疫调节基因的缺失可能会进一步增强D1701-V载体的免疫原性。因此，目前的研究集中于删除编码NF-κB抑制剂的基因，并将其用作转基因表达的插入位点。
NF-κB抑制剂-ORF119
NF-κB转录因子家族由5个成员组成，其负责DNA序列特异性DNA结合和同源或异源二聚化的N-末端Rel同源结构域不同。这些二聚体转移到细胞核中导致涉及从细胞生长和存活、组织和器官发育到免疫反应和炎症的生物过程的基因转录，并依赖于两种主要信号通路的激活，这两种信号通路对不同的刺激做出反应，包括模式识别受体(PRR)、TNF受体(TNFR)超家族成员以及TCR和BCR的配体。虽然经典途径中的转运依赖于多亚基IκB激酶(IKK)复合物对IκBα的磷酸化，但非经典途径涉及NF-κB前体蛋白p100的加工。
由于痘病毒感染，以及许多其他病毒感染，是由PRR如TLR或视黄酸诱导基因(RIG-I)样受体感应的，这些病毒已经进化出干扰NF-κB途径的策略。因此，ORFV也被描述为编码至少五种NF-κB抑制剂。除此之外，NF-κB抑制剂编码的病毒开放阅读框119(ORF119)被描述为含有C-末端的LxCxE基序，允许与成视网膜母细胞瘤蛋白pRB强烈相互作用，已知pRB具有肿瘤抑制活性。通过阻止TNF受体相关因子2(TRAF2)的募集，ORF119/pRB抑制TNFα诱导的IKK激活和NF-κB信号传导；参见Nagendraprabhu，P.，等人(2017)，A parapoxviral virionprotein targets the retinoblastoma protein to inhibit NF-kappaBsignaling.PLoS Pathog.13(12)：p.e1006779。然而，尽管ORF119在NF-κB信号传导中起作用，但最近也显示其抑制细胞增殖并诱导凋亡以促进病毒颗粒的释放；参见Li，W，等人(2018)，Orf Virus Encoded Protein ORFV119 Induces Cell Apoptosis Through theExtrinsic and Intrinsic Pathways.Front.Microbio1.9：p.1056。因此，NF-κB和凋亡调控之间的相互作用仍需进一步研究。
3.材料和方法
新型Del位点重组体的生成和表征
为了生成本研究中使用的ORFV重组体，将从Invitrogen合成并获得的转基因克隆到转移质粒中。在细胞核转染并随后感染Vero细胞后，通过转移质粒和亲本病毒基因组DNA之间的同源重组，实现了转基因向ORFV基因组的稳定整合。
转移质粒的生成
使用相同的限制性内切酶消化DNA插入片段和质粒载体，纯化并连接感兴趣的片段。随后，用连接的质粒转化细菌，并选择菌落以生成转移质粒。为了验证，使用限制性内切酶的对照消化之后进行琼脂糖凝胶电泳，而使用插入特异性引物的DNA测序证实转基因正确插入质粒载体中。下表总结了生成的转移质粒，而质粒图和相应的序列(SEQ ID NO：7)显示在图1中。
ORFV感染的Vero细胞的转染
重组ORFV的生成遵循两个步骤，其中在用ORFV感染之前用转移质粒转染Vero细胞。转染通过基于电穿孔的转染方法进行，称为细胞核转染。由于转移质粒和ORFV基因组上的同源序列，插入片段可以通过同源重组整合到ORFV基因组中。为此，使用胰蛋白酶分离Vero细胞，重新悬浮于5m1NF终止液中并计数。对于每个转染批次，将2.5×106个细胞转移到1.5ml Eppendorf离心管中，并在63rcf下离心10分钟。将细胞沉淀重新悬浮在补充有2μg质粒DNA的100μl转染溶液(Amaxa转染试剂盒的转染补充剂和CLB转染缓冲液以1∶4.5的比例混合)中，并转移到转染试管中。对于转染，使用CLB转染装置。随后，将细胞核转染的细胞重新悬浮在NF终止液中，并使用巴斯德移液管转移到含有6ml预热的Vero细胞培养基的T25细胞培养瓶中。细胞立即用亲代病毒(MOI 1)在37℃和5％CO2下感染4小时，用6ml预热的PBS洗涤，并在新鲜Vero细胞培养基中在37℃和5％CO2下孵育72小时。当可以观察到病毒噬菌斑或细胞病变效应(CPE)时，将细胞分别在-80℃和37℃水浴中冷冻和解冻三次，以破坏细胞并释放病毒子代。
ORFV重组体的选择
同源重组是在转移质粒的插入片段和ORFV基因组中的靶区域之间以大约1∶10000的比率发生的事件。为了选择这种罕见事件并从亲代病毒中分离重组ORFV，可以使用不同的选择方法。
基于FACS选择ORFV重组体
通过荧光活化细胞分选(FACS)进行选择是基于荧光标记如GFP或mCherry的损失或获得。为此，将3×105个Vero细胞接种在含有3ml Vero细胞培养基的6孔板中。转染裂解物经连续稀释在37℃和5％CO2下进行感染20小时至24小时。为了确保最佳的选择过程，收集感染率大约1％至5％的低感染率的细胞，并在400rcf下离心5分钟。随后，用1ml PBE洗涤细胞三次，并最终重新悬浮在500μl PBE中。使用BD FACSjazz(Biosciences)在150μl Vero细胞培养基中的每孔含有104个Vero细胞的96孔板中进行单细胞FACS分选。在37℃和5％CO2下孵育72小时后，可以选择显示重组ORFV的单一病毒噬菌斑的孔用于进一步的增殖和分析。
通过有限稀释选择ORFV重组体
在基于FACS的分选或MACS选择后，通过有限稀释进行重组病毒的进一步选择和纯化。为此，将25ml Vero细胞培养基中的2×106个Vero细胞分成12孔移液池，其中第一个和其余孔分别含有3ml或2ml细胞溶液。在第一个孔中加入3×105个MACS选择细胞或50μl至100μl病毒裂解液，并从第一个孔到最后一个孔各用1∶3稀释。将150μl每种稀释液转移到96孔板的相应孔中，并在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时后，可以选择含有单个病毒噬菌斑的孔，用于通过(荧光)显微镜进一步处理。
通过连续传代测定遗传稳定性
为了研究荧光团编码位点的遗传稳定性，对各个ORFV重组体进行了十次连续传代。为此，将5×105个Vero细胞接种在含有3ml Vero细胞培养基的6孔板中。首先，在有限稀释度下显示单个噬菌斑的病毒裂解物用于连续稀释的感染，并在37℃和5％CO2下进行2小时。用PBS洗涤细胞两次，随后在37℃和5％CO2下在3ml Vero细胞培养基中孵育72小时。使用Eclipse Ti2显微镜(Nikon)测定显示100个至200个噬菌斑的孔的荧光噬菌斑计数。接下来，将细胞在-80℃下冷冻，在室温下解冻，并如上所述用50μl病毒裂解物感染新鲜接种的Vero细胞。
从捐献的血液中分离PBMC
可以从Tübingen献血中心获得的献血中分离外周血单核细胞(PBMC)。首先，用PBS将血液稀释至总体积为100ml。接下来，用25ml稀释血液覆盖50ml试管中的4×15ml Ficoll，并以700×g在室温下离心20分钟。将可通过密度梯度离心后形成白色层来识别的白细胞转移到两个50ml的试管中，每个试管补充PBS至50ml的体积。在400×g和RT下离心10分钟后，将细胞沉淀重新悬浮在50ml PBS中，并在300×g和RT下离心10分钟。合并PBMC并用PBS补充至50ml体积，并测定细胞数。
从PBMC中分离单核细胞
从PBMC中分离单核细胞的原理依赖于单核细胞表达CD14。因此，PBMC在300×g和RT下离心10分钟，并将沉淀重新悬浮在4ml PBE和100μlα-CD14微珠中。悬浮液在4℃下孵育15分钟，并装载到用PBE平衡的LS柱上。在用5ml PBE从柱上洗脱CD14+单核细胞并计数之前，用3ml PBE洗涤柱三次。
单核细胞和PBMC的培养
单核细胞和PBMC在37℃和5％CO2的IMDM完全培养基中培养。对于实验步骤，将3×105个单核细胞和5×105个PBMC以每孔200μl接种在96孔圆底板中，同时接种1×105个单核细胞以分化成树突细胞。
人抗原特异性记忆CD8+T细胞的扩增(12天刺激)
抗原特异性记忆CD8+T细胞的扩增是基于它们在12天的时间内受到单核细胞的刺激，所述单核细胞呈递HLA-A*02限制性EB病毒(EBV)BMLF1280-288 GLCTLVAML、甲型流感病毒MP58-66 GILGFVFTL和人巨细胞病毒(HCMV)pp65495-503 NLVPMVATV表位。因此，如上所述处理来自HLA*A02阳性供体的血液，培养单核细胞以分别用不同ORFV重组体的各种稀释液感染或用1μM合成肽刺激。此外，对CD14+部分进行活细胞计数，将5×105个细胞接种在96孔圆底板中每孔100μl T细胞培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育。20小时至24小时后，将20μl每个感染的单核细胞组转移到新的96孔板中，并用PFEA洗涤三次，以700×g在室温下离心。FACS分析以确定感染率，同时显示感染率约为20％的单核细胞与CD14+部分在总体积为200μl的T细胞培养基中共培养。每隔2天至3天，用含有20U/ml IL-2的新鲜T细胞培养基替换50μl培养基。刺激12天后，通过四聚体染色分析CD8+T细胞的扩增，通过细胞内细胞因子染色评估抗原特异性CD8+T细胞的功能。
流式细胞术
使用BD LSRFortessa流式细胞术系统(BD Biosciences)分析存活率和感染率，以及表面和细胞内分子的表达。样品的制备和用荧光标记的抗体对细胞的染色在96孔U形底板中进行，同时在4℃和400×g下离心5分钟。为了确定感染率，将细胞在200μl PFEA中洗涤两次，并重新悬浮在50μl PFEA中或任选地将其固定用于FACS分析。
Fc受体的抑制
为了防止非特异性抗体结合，在染色程序之前，根据制造商的说明用Fc-block处理表达Fc受体的细胞。
多聚体染色
多聚体经常用于鉴定和定量抗原特异性T细胞。四聚体由四个与荧光标记的链霉亲和素复合物结合的重组MHC分子组成。相反，右旋糖酐由携带几个荧光团和MHC分子的右旋糖酐骨架组成。多聚体可以装载感兴趣的肽，以形成被特异性T细胞识别的肽-MHC复合物，因此用流式细胞术检测。为此，分别用200μl PBS洗涤细胞两次，并重新悬浮在50μl四聚体溶液或PBS中。在用50μl四聚体溶液染色之前，将PE缀合的HLA四聚体与四聚体缓冲液以1∶50混合，并以13.000×g离心10分钟。通过将右旋糖酐与PBS以1∶10的比例混合，用右旋糖酐染色遵循相同的程序。在黑暗中室温下孵育30分钟。
细胞活力的测定
通过Zombie Aqua染色测定细胞活力。Zombie Aqua是一种胺反应荧光染料，不能穿透活细胞，但可以进入细胞膜受损的细胞。因此，它可用于区分活的和死的哺乳动物细胞。对于Zombie Aqua染色，用200μl PBS洗涤细胞两次，并在黑暗中于4℃下在50μl以1：400稀释于PBS中的Zombie Aqua中重悬30分钟。
细胞外抗体染色
为了分析表面分子表达，用200μl PFEA洗涤细胞两次，重新悬浮于50μl在PFEA新鲜制备的抗体混合物中，并在4℃黑暗中孵育30分钟。
细胞内细胞因子染色
为了检测细胞内细胞因子，用10μg/ml布雷非德菌素A处理细胞以防止蛋白质分泌，并用相应的合成肽刺激12小时至14小时。在细胞内细胞因子染色之前，用200μl PFEA洗涤细胞两次，并通过在黑暗条件下与50μl Cytofix/Cytoperm一起孵育30分钟来透化细胞。接下来，将细胞重新悬浮并用200μl Permwash洗涤两次，随后用Permwash中的50μl抗体混合物在4℃黑暗中染色30分钟。
细胞的固定
为了保存超过4小时，将细胞固定。为此，用200μl PFEA洗涤细胞两次，重新悬浮在50μl PFEA+1％甲醛中，并储存在4℃的暗处。在10天内进行样品分析。
小鼠免疫
从Charles River(Charles River Laboratories，Germany)获得至少6周龄的远交CD1小鼠(N＝10)，并在德国蒂宾根大学的生物安全1级动物设施中饲养。所有动物都严格按照良好的动物实践操作，并符合当地动物实验和伦理委员会的指导方针——实验是在项目许可证(编号IM 1/20G)下进行的。用107噬菌斑形成单位(PFU)的ORFV重组体在小鼠胫骨前肌内(i.m.)免疫小鼠两次，间隔两周。加强免疫后两周通过眼眶后放血采集血样用于体液免疫分析。加强免疫后两周在动物经人道安乐死后通过标准程序分离并收集脾细胞用于细胞免疫分析。
小鼠血清酶联免疫吸附试验(ELISA)
根据制造商的说明，使用新冠肺炎N蛋白和S蛋白(S1RBD)COVID19人IgG抗体ELISA试剂盒(目录号：分别为IEQ-CoVN-IgG和IEQ-CoVS1RBD-IgG，RayBiotech，USA)评估免疫小鼠中的SARS-CoV-2核蛋白(N)特异性抗体和SARS-CoV-2刺突蛋白(S)特异性抗体。将试剂盒中生物素化的抗人IgG抗体和HRP-链霉亲和素用HRP-缀合的抗小鼠IgG二抗(ab6728，Abcam，UK)以1∶5000稀释30分钟替换。结合抗体终点滴度计算如下：log 10吸光度单位(OD)对log 10样品稀释度作图。该曲线线性部分的回归分析允许计算终点滴度，其OD高于模拟免疫小鼠的平均OD加上相同稀释度下OD的标准偏差的5倍。
4.结果
新型Del位点重组体的生成
在成功生成转移质粒后，如方法中详细描述的那样生成新的ORFV重组体。因此，通过细胞核转染将质粒pDel119-2-AcGFP转移到Vero细胞中，随后用亲代病毒V12-Cherry感染Vero细胞。由于ORFV基因组中的同源序列和转移质粒的插入侧翼区，同源重组导致ORF119被ORFV D1701-V基因组中的GFP稳定交换(图2)。下表显示了包含D1701-V(Rziha，H.-J.，未公开，图2B)DNA序列的31.805nt的右侧部分中ORF119的确切位置：
接下来，可以从感染的GFP和mCherry表达Vero细胞中分离新的ORFV重组体，通过FACS分选和有限稀释进行选择。如图3所示，DNA分离后插入和基因座特异性PCR分型允许监测纯化的ORFV重组体的遗传同质性。这里，119和d119PCR都证明了，ORF119的缺失和与GFP编码序列的交换。随后，如上所述大规模增殖新的ORFV重组体。
也可以生成重组ORFV缺失突变体，其仅导致ORF119的缺失而不会导致GFP的插入，因此，与亲代病毒相比，功能性ORF119基因产物的缺失导致免疫原性增强。相应的转移质粒和序列如图4和SEQ ID NO：8所示。
GFP稳定地插入新型Del位点
为了研究插入新型Del位点的GFP的稳定性，用新型Del位点重组VCh119GFP和参照病毒VChD12GFP感染Vero细胞，进行20次连续传代。如图5所示，在整个实验中，GFP和mCherry荧光都可以通过荧光显微镜在用新型Del位点重组体感染Vero细胞生成的单个噬菌斑中观察到。
此外，在第1代、第5代、第10代、第15代和第20代后，从感染的Vero细胞中分离病毒DNA，并进行缺失的基因特异性和基因座特异性PCR以检测缺失基因座的完整性。如图所示，在20次传代中，在119个PCR中没有检测到ORF119特异性的407bp片段(图3A)，而使用d119PCR，Del位点显示插入Del119基因座的GFP特异性的1155bp片段(图3B)。
最后，在ORFV D1701-V重组体的三个生物复制物(病毒克隆)的十次连续传代期间，检测了插入新型Del位点的转基因的稳定性。感染72小时后，使用含有100个至200个噬菌斑的孔，通过荧光显微镜测定表达GFP和mCherry荧光团，或GFP或mCherry的单个噬菌斑的数量。图6显示了在十次连续传代中仅表达一种荧光团的噬菌斑的百分比。
结果表明，使用VCh119GFP，单个GFP和mCherry表达噬菌斑噬菌斑的频率低于1％。图6B表明，在第4代和第7代中，观察到VCh119GFP的单个mCherry表达噬菌斑超过1％，然而，频率没有随时间增加，大多数重复的测量值低于1％。综上所述，结果表明GFP在用新型Del位点重组体感染的Vero细胞中稳定表达，并且可以在预测的基因组座位中检测到20代。此外，GFP和mCherry分别在新型Del位点或vegf位点的遗传稳定性在研究感染的Vero细胞的荧光的10个连续传代中得到验证。由于在10代后，感染每种新型Del-位点重组体的所有计数的裂解性噬菌斑中至少99％同时表达GFP和mCherry，这些结果表明所检测的基因组座位的遗传稳定性。
新型Del位点重组体的生长特性
为了研究与参比病毒VChD12GFP相比，引入新型Del位点重组体的缺失是否改变了ORFV许可Vero细胞的体外生长特性，进行了单步生长曲线实验。为此，用新型Del位点重组VCh119GFP感染Vero细胞，导致24小时后感染率约为20％至25％。在吸附后2小时(指定为0小时)或感染后6小时、24小时、48小时、72小时、96小时和120小时洗涤并收集感染的细胞。在Vero细胞上滴定病毒裂解物，以确定以每毫升噬菌斑形成单位(PFU/毫升)测量的感染性颗粒数。每个重组体进行三次实验，结果如图7所示。
Del位点重组VCh119GFP的生长特性类似于参照病毒VChD12GFP的生长特性，在感染120hpi后达到大约107PFU/ml的可比最终滴度。值得注意的是，VCh119GFP的生长曲线表明vch 12 GFP的生长曲线使用了较低的病毒输入，并且在整个实验中，与对照相比，仅显示出略有降低的最终病毒滴度(图7)。然而，这些结果表明VCh119GFP是复制有效的，因为它能够在允许的细胞系Vero中生成感染性子代。
使用新型Del位点分析表达强度
为了研究通过新型Del位点重组体进行转基因表达的潜力，使用整合到ORF119中的报道基因GFP和插入到vegf基因座中的mCherry来比较它们在ORFV感染Vero细胞、单核细胞细胞系THP-1和人类原代单核细胞衍生的树突细胞(moDC)后的表达强度。为此，接种细胞并感染VCh119GFP和参照病毒vchd 12 GFP 24h或48h。随后，进行FACS分析并测定细胞中表达的GFP和mCherry的几何平均荧光强度(MFI)。为了分析moDC，用来自几个供体的细胞进行实验，以估计个体之间的差异。从新型Del位点重组体感染中鉴定的MFI被标准化为相同实验的VChD12GFP衍生的MFI的平均值。从Vero细胞和THP-1细胞获得的结果分别如图8和图9所示。
对于Vero细胞，三个独立的实验重复进行。在24hpi和48hpi感染VCh119GFP后，mCherry表达与VChD12GFP相当(图8A)。值得注意的是，与VChD12GFP相比，VCh119GFP感染在两个时间点均导致GFP水平提高1.1倍至1.5倍，表明ORF119缺失对Vero细胞中vegf-和Del-119基因座的转基因表达有积极影响。
在四个独立的实验中分析了单核细胞THP-1细胞中GFP和mCherry的表达强度，分别包括感染后24h的三个至六个重复，以及在两个独立的实验中，包括感染后48h的三个重复。这里，平均mCherry水平类似于24h后VChD12GFP诱导的水平，而从用VCh119GFP感染的THP-1细胞中获得1.4倍强的MFI，如图9A所示。此外，在24h和48h后，与VChD12GFP相比，GFP在VCh119GFP感染的THP1细胞中的表达加快(图9B)。考虑到与VChD12GFP相比，这些转基因水平的提高，ORF119的缺失似乎促进整合到vegf基因座的转基因的表达，而插入到OF119的转基因比THP-1细胞中D基因座编码的转基因表达更强。
总之，对表达强度的分析表明，ORF119的缺失及其被gfp取代导致插入vegf基因座的转基因表达的改变。因此，ORF119的缺失似乎影响了插入转基因的表达动力学，因为与参照病毒感染相比，VCh119GFP感染后在Vero和THP-1细胞中可获得相当或更高的表达水平。
用新型Del位点重组体感染激活人PBMC
此前，Müller等人(2019，准备中)可以表明，摄入编码不同转基因的D1701-V ORFV重组体可以改变抗原呈递细胞(APC)的激活。因此，从8名健康供体的血液中分离PBMC，并用新型Del位点重组VCh119GFP和参照病毒VChD12GFP体外感染24小时。由于单核细胞是PBMC中唯一吸收ORFV D1701-V的细胞群，感染率由CD14+PBMC群中mCherry的表达决定。分析了同一供体中感染单核细胞最多的样本。24h后，收集PBMC，通过流式细胞术使用表面标志物特异性抗体测定CD4+T细胞和CD8+T细胞、CD14+单核细胞、CD19+B细胞和CD56+NK细胞上活化标志物CD69的表达。
图10显示了使用新型Del位点重组VCh119GFP和VChD12GFP作为参照分析感染后PBMC活化的情况。图10A所示的平均感染率范围约为20％至25％，而不同供体之间的差异较大，为10％至30％。与参照病毒VChD12GFP相比，用VCh119GFP感染的CD19+B细胞的活化被提高。相反，在用VChD12GFP和VCh119GFP感染的PBMC中，发现CD4+、CD8+和CD56+的活化有显著差异。因此，在用VCh119GFP感染的组中，表达CD69的细胞数量几乎是VChD12GFP的两倍(图10C)。对于图10B中描绘的CD4+细胞中CD69的表达，观察到类似的结果，与感染VChD12GFP的组相比，感染VCh119GFP的PBMC中激活的细胞群显著更多。这里，与用VChD12GFP处理的PBMC相比，细胞群增加了5倍。最后，与用VChD12GFP感染的PBMC相比，用VCh119GFP感染的CD56+NK细胞群显示出显著更强的活化结果(图10E)。
对通过用新型Del位点重组VCh119GFP感染对PBMC的活化进行的分析显示，与参照病毒VChD12GFP相比，表达活化标志物CD69的CD4+和CD8+T细胞以及CD19+B细胞和CD56+NK细胞群增加。
人抗原特异性记忆CD8+T细胞的体外扩增
为了进一步研究新型Del位点重组VCh119GFP的体外免疫原性，分析了其诱导抗原特异性免疫反应的能力。因此，生成了编码HLA-A*02限制性EBV(BMLF1280-288GLCTLVAML)、甲型流感(MP58-66GILGFVFTL)和HCMV(pp65495-503NLVPMVATV)表位的新型Del位点重组体。随后，用新生成的重组VHLA119GFP和参照病毒VHLAD12GFP感染从人PBMC分离的CD14+部分，或者用相应合成肽的混合物(Pepmix)刺激。使用FACS通过mCherry或GFP表达来确定感染率，并且在24hpi后，在一个供体中显示可比较百分比的单核细胞与PBMCs的CD14组分共培养。分别通过四聚体染色和细胞内细胞因子染色(ICS)在感染后12天测定抗原特异性CD8+T细胞的扩增及其功能。未刺激的CD14+部分作为阴性对照，而使用合成的GLCTLVAML、GILGFVFTL和NLVPMVATV肽的混合物的刺激代表阳性对照。此外，用D12-Cherry感染的CD14+细胞刺激CD14+部分，以研究没有抗原的ORFV D1701-V对T细胞的扩增和功能性的影响。
感染后24小时，单核细胞显示出约10％至15％的平均感染率，然而，供体之间差异很大，导致百分比为5％至25％(图11A)。12天后，通过四聚体染色测量T细胞的扩增，并通过ICS分析它们的功能。四聚体染色显示编码HLA-A*02限制性EBV、甲型流感和HCMV肽的ORFVD1701-V重组体，或者用Pepmix刺激引发抗原特异性CD8+T细胞增殖。有趣的是，CD8+T细胞的扩增可以针对供体拥有记忆T细胞的所有肽进行诱导。图11B显示了对任何肽特异的CD8+T细胞的平均频率，以及扩增12天后从每个供体获得的平均频率。可以检测到来自不同供体的T细胞反应的高度差异。因此，供体#186在刺激后显示约55％的抗原特异性CD8+T细胞频率，而供体#016仅10％的CD8+T细胞可扩增。然而，与参照病毒VHLAD12GFP相比，缺失突变体VHLA119GFP引起的T细胞反应平均增加了1.4倍，显示约35％的CD8+T细胞对任何肽具有特异性。
此外，对每种肽特异性记忆T细胞的扩增进行的分析表明，与参照病毒VHLAD12GFP的刺激相比，用VHLA119GFP感染的单核细胞的刺激可显著提高肽特异性CD8+T细胞的平均频率1.3倍(图12A)。在用GLCTLVAML、GILGFVFTL或NLVPMVATV重新刺激后，对记忆T细胞的功能性的分析表明，在用Pepmix刺激的大约5％的CD8+T细胞中生成促炎细胞因子TNFα和IFNγ(图12B)。在此，与用参比病毒VHLAD12GFP感染的单核细胞刺激的细胞相比，CD8+T细胞的功能性显著降低2倍，其显示平均多功能CD8+T细胞比例为10％。值得注意的是，用VHLA119GFP感染的单核细胞刺激的T细胞的功能性显著增强，VHLA119GFP组的T细胞显示出比参照组中的T细胞高1.4倍的功能性。
总之，编码HLA-A*02限制性EBV、甲型流感和HCMV表位的新型Del位点重组VCh119GFP的免疫原性通过其在12天后诱导功能性CD8+记忆T细胞扩增的能力进行了体外分析。综合上述结果，抗原特异性CD8+T细胞的频率可以通过用先前用Del位点重组VHLA119GFP感染的单核细胞刺激T细胞来提高。通过促炎细胞因子TNFα和IFNγ的同时表达，这些T细胞的平均功能性也表现出最高的多功能性。因此，ORF119的缺失可以表明对ORFV 1701-V重组体引发的抗原特异性细胞免疫反应的强度产生积极影响。
SARS-CoV-2 ORFV重组体的体内免疫原性
在两次肌内(i.m.)免疫后，在远交CD1小鼠中比较编码刺突蛋白(S1)和核蛋白(N)的SARS-CoV-2 ORFV重组体的免疫原性。加强免疫后，在所有疫苗组中都检测到了高滴度的N抗原和S1抗原特异性结合抗体(图13)。与对照ORFV相比，ORF119缺失的重组载体引发了显著更高的N特异性抗体反应(图13A)。对于S1特异性IgG终点滴度也观察到类似的趋势(图13B)。
5.总结
综上所述，对新型Del位点重组体进行的分析表明，通过将ORF119敲除整合到ORFVD1701-V基因组中，设计多价、单载体疫苗具有很大的潜力。ORF119的缺失和报告基因构建体GFP同时整合到相应的Del位点，不仅导致表达所需转基因的稳定载体的有效复制，而且使新生成的重组体具有显著的免疫原性。因此，已经报道ORF119与成视网膜细胞瘤蛋白pRB相互作用，从而抑制TNFα诱导的IKK活化和NF-κB信号传导(Nagendraprabhu，P.，等人，l.c.)，而更近期的报道宣称其参与细胞增殖和凋亡以促进病毒颗粒的释放(Li，W.，等人，l.c.)。该研究揭示了CD4+和CD8+T细胞以及NK细胞活化水平，以及体外增强的抗原特异性CD8+T细胞反应和多功能性的诱导的增强。有趣的是，与支持ORF119参与诱导凋亡的其他组相比，感染ORF119敲除突变体的组中活细胞的比例增加(Li，W.，等人，l.c.)。对这种有希望的突变体的免疫原性的首次体内研究进一步揭示，ORF119的缺失导致远交CD1小鼠中针对编码抗原N和S1的抗体滴度增加。因此，本研究的发现可以为制备具有有利特性的ORFVD1701-V载体疫苗变得可能，其中含有ORF119缺失的重组体同时表达几种抗原和免疫调节元件，导致诱导强烈、持久和有效的细胞以及体液免疫反应。
6.序列
SEQ ID NO：1：eP1启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：2：eP2启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：3：“优化早期”启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：4：7.5kDa启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：5：VEGF启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：6：D1701-V ORF118-119-120(nt 1至2380)
ORF118：nt 1至306
ORF119：nt 716至1324
ORF120：nt 1778至2377的核苷酸序列
SEQ ID NO：7：pDel 119-2-AcGFP(nt 1至1962)
HL(同源左臂)ORF118：nt 1至480
早期启动子eP2：nt664至700
AcGFP：nt732至1447
HR(同源右臂)ORF120：nt 1520至1962的核苷酸序列
SEQ ID NO：8：pDel 119(nt 1至1037)
HL(同源左臂)ORF111：nt 1至480
HR(同源右臂)ORF113：nt 595至1037的核苷酸序列

Claims (15)

1.一种经修饰的副痘病毒，其在编码“NF-κB抑制剂”的病毒开放阅读框(ORF)中包含至少一个功能突变，其中所述病毒与没有所述功能突变的相同载体相比具有增强的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的经修饰的副痘病毒，其中所述功能突变导致NF-κB抑制剂的活性低于未突变的NF-κB抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的副痘病毒，其是副痘病毒载体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中副痘病毒为羊传染性脓疱病毒(Orf病毒，ORFV)或副痘病毒载体为ORFV载体。
5.根据权利要求4所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中ORFV属于毒株D1701，优选属于毒株D1701-V。
6.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中NF-κB抑制剂由病毒开放阅读框119(ORF119)编码，优选地，ORF位于nt 14.344±100至nt 14.952±100的核苷酸位置。
7.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其还包含：
(1)至少一个编码转基因的核苷酸序列，和
(2)至少一个控制编码转基因的核苷酸序列表达的启动子。
8.根据权利要求6所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中编码转基因的核苷酸序列被插入到编码NF-κB抑制剂的病毒ORF中，或/和其中编码NF-κB抑制剂的病毒ORF被编码转基因的核苷酸序列取代。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的副痘病毒载体，其包含多于一个编码转基因的核苷酸序列，优选地，编码转基因的核苷酸序列的数量选自：2个、3个、4个或多于4个。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中启动子是早期ORFV启动子。
11.根据权利要求10所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中早期ORFV启动子包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1(eP1)、SEQ ID NO：2(eP2)、SEQ ID NO：3(“优化早期”)、SEQ ID NO：4(7.5kDa启动子)和SEQ ID NO：5(VEGF)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，其中转基因选自以下抗原：
-病毒抗原，优选
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)抗原，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)；
狂犬病病毒抗原，包括糖蛋白(RabG)；
甲型流感抗原，包括核蛋白(NP)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)；
-肿瘤抗原，优选病毒肿瘤抗原，包括HPV选择性病毒肿瘤抗原；
-肿瘤相关抗原，包括病毒肿瘤相关抗原，包括HPV选择性病毒肿瘤相关抗原；
-寄生虫抗原，优选疟原虫抗原；
-细胞因子；
-源自或衍生自哺乳动物的蛋白质，优选源自或衍生自哺乳动物受体的蛋白质。
13.一种生物细胞，其包含根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体，优选哺乳动物细胞，还优选Vero细胞、HEK 293细胞或抗原呈递细胞。
14.一种药物组合物，优选疫苗，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体或/和根据权利要求13所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
15.包含在编码“NF-κB抑制剂”的病毒开放阅读框(ORF)中的至少一个功能突变的经修饰的副痘病毒或副痘病毒载体用于在生物中诱导免疫反应的用途，所述生物优选哺乳动物或人类。
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