JP2024500167A - 増加した免疫原性を有する改変パラポックスウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、増加した免疫原性を有する、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクター、前記改変パラポックスウイルスを含む生物学的細胞、前記改変パラポックスウイルスベクターおよび/または前記細胞を含む、医薬組成物、好ましくはワクチン、ならびに前記改変パラポックスウイルスの新規使用に関する。
Description
増加した免疫原性を有する改変パラポックスウイルス 本発明は、増加した免疫原性を有する、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクター、前記改変パラポックスウイルスを含む生物学的細胞、前記改変パラポックスウイルスベクターおよび/または前記細胞を含む、医薬組成物、好ましくはワクチン、ならびに前記改変パラポックスウイルスの新規使用に関する。
改変ウイルス、例えばウイルスベクターは、バイオサイエンス、医学およびプロセス工学において複数の用途を有する。例えば、ウイルスベクターベースのワクチンは、任意の種類の抗原ペプチドに対する細胞性および体液性の免疫応答を引き起こすことが期待されている。ポックスウイルス科のパラポックスウイルス属において、Parapoxvirus ovis(Orfウイルス;ORFV)D1701-V株は、ベクタープラットフォーム技術の開発に特に好ましい様々な特性を含み、様々なワクチン接種アプローチを促進することが示された。
しかしながら、改変ウイルスまたはウイルスベクターの技術分野において見出すことができる1つの問題は、低い免疫原性である。低い免疫原性は、ウイルスベクターベースのワクチンの有効性を低下させる。この問題に対処するための現在の戦略は、ワクチンの免疫応答を改善する薬理学的または免疫学的薬剤と併せて、免疫調節エレメントの実施またはウイルスベクターの製剤化を使用する。しかしながら、これらのアプローチは、完全には成功していない。いくつかのウイルスベクターは、パッケージング能力が限られており、免疫調節エレメントの発現は、ウイルスを操作不能にすることが非常に多い。さらに、アジュバントは、ワクチン接種された生物に対してしばしば毒性であり、そのため、ウイルスベクターベースのワクチン接種は、副作用を伴うことが多い。
この背景に対して、当技術分野で知られている問題が低減されるか、または回避さえされる、ウイルスベクターベースのワクチンおよび他の適用の有効な製造のために使用することができる、新規の改変ウイルス、特にウイルスベクターを提供することが当技術分野で必要とされている。
したがって、本発明の根底にある目的は、免疫調節エレメントの包含またはアジュバントを有するベクターの製剤化を必要としない、増加した免疫原性を特徴とする、そのような改変ウイルスまたはウイルスベクターをそれぞれ提供することである。
本発明は、「NF-κBインヒビター」をコードするウイルスオープンリーディングフレーム(ORF)中に少なくとも1つの機能的変異を含む、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクターであって、前記ベクターは、前記機能的変異を有さない同一のベクターと比較して増加した免疫原性を含む、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクターを提供することによって、これらおよび他のニーズを満たす。
本発明によれば、「パラポックスウイルス」は、ポックスウイルス科およびコルドポックスウイルス亜科のウイルスの属である。ポックスウイルス科の全てのメンバーと同様に、それらは、楕円形の比較的大きな二本鎖DNAウイルスである。パラポックスウイルスは、それらを他のポックスウイルスと区別する特有の螺旋コートを有する。パラポックスウイルスは、哺乳動物の広い選択を含む脊椎動物、およびヒトに感染する。本発明によれば、全ての種類のパラポックスウイルスが適しているが、Orfウイルスが好ましい。
本発明によれば、「改変」パラポックスウイルスは、野生型のカウンターパートに対して技術的に改変されたパラポックスウイルス由来ウイルスを指す。
本発明によれば、「パラポックスウイルスベクター」は、パラポックスウイルスゲノムベースであるか、またはパラポックスウイルスゲノムからなり、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞およびヒト細胞のトランスフェクションのために形成され、さらに好ましくは生物学的細胞における(への)導入遺伝子または外来遺伝子の輸送および/または発現のためにも形成された、ベクターまたはプラスミドを指す。
本発明によれば、「NF-κBインヒビター」は、転写因子NF-κB(活性化B細胞の核因子カッパ-軽鎖エンハンサー)の活性を、低減するかまたは引き起こすことができるタンパク質の群を指す。NF-κBは、DNAの転写、サイトカイン産生および細胞生存を制御するタンパク質複合体である。NF-κBは、ほとんど全ての動物細胞型において見出され、ストレス、サイトカイン、フリーラジカル、重金属、紫外線照射、酸化LDL、および細菌またはウイルス抗原などの刺激に対する細胞応答に関与する。NF-κBは、感染に対する免疫応答の調節において重要な役割を果たす。NF-κB転写因子ファミリーは、DNA配列特異的DNA結合に関与するN端末Rel相同性ドメイン、およびホモ-またはヘテロ二量体化、が異なる5つのメンバーからなる。これらの二量体の核への移行は、細胞増殖および生存、組織および臓器の発達から免疫応答および炎症までの範囲の生物学的プロセスに関与する遺伝子の転写をもたらし、パターン認識受容体(PRRs)、TNF受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー、ならびにTCRおよびBCRのリガンドを含む多様な刺激に応答する、2つの主要なシグナル伝達経路の活性化に依存する。標準経路における移行はマルチサブユニットIκBキナーゼ(IKK)複合体によるIκBαのリン酸化に依存するが、非標準経路はNF-κB前駆体タンパク質p100のプロセシングを含む。ポックスウイルス感染は他の多くのものに加えて、TLRsまたはレチノイン酸誘導性遺伝子(RIG-I)様受容体などのPRRsによって感知されるので、これらのウイルスはNF-κB経路を妨害する戦略を進化させてきた。それゆえ、ORFVはまた、少なくとも5つのNF-κBインヒビターをコードすることが記載されている。その他に、NF-κBインヒビターをコードするウイルスオープンリーディングフレーム119(ORF119)は、その腫瘍サプレッサー活性について知られている網膜芽細胞腫タンパク質pRBとの強い相互作用を可能にするC末端LxCxEモチーフを有することが記載された。TNF受容体関連因子2(TRAF2)の動員を防止することによって、ORF119/pRBは、TNFα誘導性IKK活性化およびNF-κBシグナル伝達を阻害する。それにもかかわらず、またNF-κBシグナル伝達におけるその機能にもかかわらず、ORF119はまた、細胞増殖を阻害し、ウイルス粒子の放出を促進するためにアポトーシスを誘導することが、最近、示されている。したがって、NF-κBとアポトーシス調節との間の相互作用は、なおさらなる研究を必要とする。
本発明によれば、「機能的変異」は、非変異野生型と比較して、活性および/または機能の変化をもたらす、遺伝子およびコードされたタンパク質の遺伝子変化を指す。機能的変異には、ノックアウト、ポイント、欠失、フレームシフト、および置換変異などが含まれるが、これらに限定されず、これらは全て、NF-κBインヒビター機能の変化をもたらし、それぞれ、機能不全のNF-κBインヒビターが結果となるか、またはNF-κBインヒビターの発現が抑制、低減、または回避され得る。
本発明によれば、「免疫原性」は、パラポックスウイルスベクターがヒトの動物の体内で免疫応答を引き起こす能力、すなわち、体液性および/または細胞媒介性の免疫応答を誘導する能力である。免疫原性は、当業者に周知の様々な方法によって測定することができる。そのような方法の概要は、Madhwa et al. (2015), Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An over-view of assays and their utility, Biologicals Vol. 43, Is. 5, pp. 298-306に見られる。
本発明者らは、機能的に変異した、好ましくは不活性化したNF-κBインヒビターを有するパラポックスウイルスベクターが、非変異カウンターパートベクターまたは野生型ウイルスのそれぞれと比較して、特定の固体および上昇した免疫原性を特徴とすることを認識することができた。増加した免疫原性は、末梢血単核細胞を活性化するか、またはインビトロで抗原特異的免疫応答を誘導するベクターの能力によって実証された。同時に、本発明者らは、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターが依然として優れた増殖挙動を示し、誘導遺伝子または外来遺伝子を発現する能力を有することを見出した。本発明者らによって行われた分析は、ベクターベースのワクチンの設計のための高い可能性を実証する。
同定された増加した免疫原性により、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、腫瘍溶解性ウイルスまたはベクター、免疫刺激剤、遺伝子治療のためのツール、または不活性化ウイルスなどの他のアプリケーションにも、それぞれ十分に適格である。
本発明者らの知見は驚くべきものであり、当業者によって予想することができなかった。NF-κBインヒビターをコードするORFは、機能性および複製可能性またはパラポックスウイルスゲノムにとって、結果として、パラポックスウイルスベースのベクターにとって必須であるか、または少なくとも好ましいと想定することができた。言い換えれば、パラポックスウイルスベクターにおいて、NF-κBインヒビターをコードするORF無しですますことができないことを想定することができた。さらに、ウイルスORFにおける機能的変異は、典型的には免疫原性の欠失をもたらし、それは、パラポックスウイルスにおいてNF-κBインヒビターをコードするORFを変異させる場合、同一の効果を予想することができた。したがって、当該技術分野は、本発明が指し示す方向とは反対の方向を指す。
本発明の根底にある問題は、これによって完全に達成される。
本発明の一実施形態では、機能的変異は、非変異NF-κBインヒビターよりもNF-κBインヒビターの活性の低下をもたらす。
本実施形態は、それぞれ、NF-κBインヒビターの機能の欠失(機能の欠失の変異)をもたらすか、または野生型カウンターパートと比較して、NF-κBインヒビターの発現または活性の有意な低下をもたらす、NF-κBインヒビターをコードするORFにおける任意の種類の遺伝子変化を含む。したがって、本実施形態は、完全な不活性化である必要がないNF-κBインヒビター機能の下方制御を包含する。しかしながら、NF-κBインヒビターの完全な不活性化またはゼロまでの活性の減少が、本発明の一実施形態において好ましい。変異には、ノックアウト、ポイント、欠失、フレームシフト、および置換変異などが含まれるが、これらに限定されず、これらは全て、NF-κBインヒビター機能の不活性化をもたらし、それぞれ、機能不全のNF-κBインヒビターが結果となるか、またはNF-κBインヒビターの発現が抑制、低減、または回避され得る。
本発明の一実施形態では、改変パラポックスウイルスは、Parapoxvirus ovis(Orfウイルス、ORFV)であるか、またはパラポックスウイルスベクターはParapoxvirus ovis(Orfウイルス、ORFV)ベクターである。
Parapoxvirus ovisまたはOrfウイルス(ORFV)は、パラポックスウイルスの属のプロトタイプであり、ポックスウイルス科に属する。ORFVは、エンベロープを有し、かつ、羊毛の球を思い出させる形態であって、約260×160nmの平均サイズを有する形態を有している複合体dsDNAウイルスである。それらは高いGC含量および約130~150kbpのサイズを有する直鎖状DNAゲノムを含み、その中央領域はITR領域(「逆方向末端反復」)によって両側が区切られ、両DNA一本鎖を互いに共有結合的に連結するヘアピン構造で終わる。ゲノムの中央領域には、主にウイルスの複製および形態形成に必須であり、かつポックスウイルスの間で高度に保存されている遺伝子が、主に存在する。対照的に、ITR領域には、宿主範囲、病原性および免疫調節を大きく決定し、したがってウイルスを特徴付ける、いわゆる非保存毒性遺伝子が存在する。
ORFVは、組換えワクチンの産生にとって興味深いものとなり、他の技術よりもそれを好む様々な特徴を有する。オルソポックスウイルスに比べて、ORFVは、ヒツジおよびヤギを含む非常に狭い天然の宿主指向性を特徴とする。結果として、ワクシニアおよびアデノウイルスの最も一般的なウイルスベクターにおいて観察され得るような、自然感染によって引き起こされる、ヒトにおけるベクターに対する「前免疫」の阻害は、ほとんど除外され得る。さらに、例外的に弱く短寿命のORFV特異的ベクター免疫は、さらなる病原体を標的としたORFVベースのワクチンによる非常に効果的なブースターおよび/またはリフレッシュワクチン接種または免疫化を可能にする。
本発明の別の実施形態では、前記ORFVは、D1701株、好ましくはD1701-V株のものである。
この手法は、弱毒化され、宿主において漸近感染のみを引き起こすそのようなウイルスまたはベクターが使用されるという利点を有する。本発明によれば、D1701-BおよびD1701-Vを含む、D1701の全ての変異体がカバーされるが、後者が好ましい。D1701-V株の特徴は、Rziha et al. (2019), Genomic Characterization of Orf Virus Strain D1701-V (Parapoxvirus) and Development of Novel Sites for Multiple Transgene Expression. Viruses 11(2), p. 127に開示されている。
別の実施形態では、前記NF-κBインヒビターは、ウイルスオープンリーディングフレーム119(ORF119)によってコードされ、好ましくは、前記オープンリーディングフレーム(ORF)は、ヌクレオチド位置nt14.344±100~nt14.952±100に位置している。
この手法で、ORFV D1701においてNF-κBインヒビターをコードする不活性化の標的として特定のオープンリーディングフレームが提供される。したがって、当業者は、変異の場所の詳細な情報を受け取る。この文脈において、示されたヌクレオチド位置は、図2bに示されるように、Rziha, H.-J.の公開されていないデータによって決定されるように、ORFV D1701-Vゲノムの右側部分によってコードされるDNA配列を含む、31.805ntを指す。
さらなる実施形態では、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、以下をさらに含む:
(1)導入遺伝子をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、および
(2)導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも1つのプロモーター。
(1)導入遺伝子をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、および
(2)導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも1つのプロモーター。
本発明によれば、「導入遺伝子」、または同義的に外来遺伝子は、パラポックスウイルスゲノムに由来しない遺伝子またはオープンリーディングフレーム(ORF)を指す。
本発明によれば、「プロモーター」は、本発明のパラポックスウイルスベクターにおける導入遺伝子の調節された発現を可能にするそのような核酸部分を指す。好ましくは、それはORFVプロモーター、すなわち、野生型ORFVゲノムに存在するプロモーターもしくはそれに由来するプロモーター、または、ポックスウイルスプロモーター、CMVプロモーターなどの人工プロモーターを指す。
この手法は、本発明に係るウイルスまたはベクターが、抗原などの任意の外来タンパク質の産生のための遺伝的ツールとして使用されるという利点を有する。ベクターの優れた免疫原性特性と共に、そのような実施形態は、ワクチン組成物の活性物質または構成要素としての本発明に係るウイルスまたはベクターの適性を改善する。
本発明のなおさらなる実施形態では、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、前記NF-κBインヒビターをコードするウイルスORFに挿入されており、および/または、代替的に、前記NF-κBインヒビターをコードするウイルスORFは、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている。
本発明によれば、「前記NF-κBインヒビターをコードするウイルスORFに挿入されている」は、NF-κBインヒビターをコードする配列またはオープンリーディングフレームが、それぞれ、任意の位置で欠失または開かれ、そのプロモーターと共に導入遺伝子をコードする配列が挿入されていることを意味する。NF-κBインヒビターコード配列の部分は、前記手順によって除去されてもよいし、除去されなくてもよい。本発明によれば、「前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている」は、NF-κBインヒビターをコードするウイルスORF全体がウイルスまたはベクターから除去され、配列ギャップがそのプロモーターと共に導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を受け取ることを意味する。本実施形態は、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の挿入がNF-κBインヒビターの機能的変異または不活性化を提供するという利点を有する。
別の実施形態では、本発明に係る前記改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を2つ以上含み、好ましくは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の数は、2、3、4、またはそれ以上からなる群から選択される。
本実施形態では、それぞれの導入遺伝子または導入遺伝子をコードする配列はすべて、NF-κBインヒビターをコードするウイルスORF中に位置することができる。しかしながら、代替的に、様々な導入遺伝子をコードする配列は、ウイルスまたはベクターゲノムまたはコンストラクト中の同一のまたは異なる位置の他の場所にそれぞれ位置することもできる。挿入遺伝子座毎において、複数の外来遺伝子、好ましくは、2、3、4、またはそれ以上の外来遺伝子を発現させることができる。例えば、ORFV D1701またはD1701-Vにおいて、導入遺伝子をコードする配列は、好ましくは、ウイルスORFs112、119、126などのいずれかに位置することができる。
この手法は、本発明に係る単一の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターによって、複数の外来または導入遺伝子を発現させることができるという利点を有する。本実施形態は、同時に多数の抗原性構造体に対して向けられた、多価ワクチンの製造に特に適している。
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの別の実施形態では、プロモーターは、初期ORFプロモーターであり、好ましくは、配列番号1(eP1)、配列番号2(eP2)、配列番号3(最適化された「初期」)、配列番号4(7.5kDaのプロモーター)、および配列番号5(VEGF)から選択される、ヌクレオチド配列を含む。
この手法は、導入遺伝子の高発現レベルおよび発現の標的制御を可能にするそのようなプロモーターが使用されるという利点を有する。プロモーターeP1およびeP2は、本発明者らによって開発され、Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)に公開されている。残りのプロモーターは、ワクシニアウイルスに由来し、他の繋がりにおいて、Davidson and Moss (1989), Structure of Vacciniavirus late promoters, J. Mol. Biol., Vol. 210, pp- 771-784、およびYang et al. (2011), Genome-wide analysis of the 5′ and 3′ ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts, J. Virology, Vol. 85, No. 12, pp. 5897-5909、Broyles (2003), Vaccinia virus transcription, J. Gene. Virol., Vol. 84, No. 9, pp. 2293-2303に記載されている。本発明者らの知見によれば、P2は、eP1と比較して発現強度の有意な増加を引き起こす。これは、プロモーターeP1がワクシニアウイルスからのコンセンサス配列に100%対応するが、eP2は対応しないため、驚くべきことであった。ORFV(パラポックス)における「最適である」ワクシニアウイルスプロモーター(オルソポックス)の低発現は矛盾しており、驚くべきことである。eP2プロモーターが強い発現をもたらすことも驚くべきことである。
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの別の実施形態では、導入遺伝子は以下の抗原の群から選択される:
-ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク(S)、エンベロープ(E)、およびヌクレオカプシド(N)タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)抗原;
糖タンパク質(RabG)を含む、狂犬病ウイルス抗原;
核タンパク質(NP)、血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)を含む、A型インフルエンザ抗原;
-腫瘍抗原、好ましくはHPV選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原;
-HPV選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原;
-寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原;
-サイトカイン;
-哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する(originated)か、または由来する(derived)、タンパク質。
-ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク(S)、エンベロープ(E)、およびヌクレオカプシド(N)タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)抗原;
糖タンパク質(RabG)を含む、狂犬病ウイルス抗原;
核タンパク質(NP)、血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)を含む、A型インフルエンザ抗原;
-腫瘍抗原、好ましくはHPV選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原;
-HPV選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原;
-寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原;
-サイトカイン;
-哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する(originated)か、または由来する(derived)、タンパク質。
この手法は、特にワクチンの製造のための特に重要な抗原が、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを介して発現可能であるという利点を有する。
本発明の別の主題は、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを含む、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはVero細胞、HEK293細胞、または抗原提示細胞に関する。
Vero細胞およびHEK293細胞は、現在、本発明に係る改変ウイルスまたはベクターの産生のために使用されている。しかしながら、宿主では、ウイルスは抗原提示細胞として取り込まれる。
本発明の別の主題は、本発明の改変パラポックスウイルスもしくはパラポックスウイルスベクター、および/または、本発明の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物、好ましくは医薬組成物に関する。医薬組成物は、好ましくはワクチン、さらに好ましくは多価ワクチン、免疫刺激剤、遺伝子治療のためのツールなどであり得る。
薬学的に許容可能な担体は、当技術分野において周知である。薬学的に許容可能な担体には、安定剤、結合剤、希釈剤、塩、アジュバント、緩衝剤、脂質などが含まれるが、これらに限定されない。概要は、Rowe (2020), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 9thedition, Pharmaceutical Pressに見出すことができる。
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの特性、利点、特徴、およびさらなる発展は、本発明の細胞および本発明の組成物に、対応する方法で適用される。
本発明の別の主題は、生物、好ましくは哺乳動物またはヒトにおける免疫応答の誘導のための、「NF-κBインヒビター」をコードするウイルスオープンリーディングフレーム(ORF)における少なくとも1つの不活性化変異を含む改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの、使用に関する。
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの特性、利点、特徴、およびさらなる発展は、対応する方法で本発明の使用に適用される。
前述の特徴および以下に説明される特徴は、それぞれの場合に示される組み合わせにおいてのみ使用されるのではなく、本発明の範囲から逸脱しない、他の組み合わせにおいて、または単離された位置においても使用されることができることが理解されるべきである。
〔実施形態〕
ここで、本発明を、本発明の追加の特徴、特性、および利点をもたらす実施形態の方法によってさらに説明する。実施形態は純粋な例示的性質のものであり、本発明の範囲(scope)または範囲(range)を限定するものではない。特定の実施形態において言及された特徴は、本発明の特徴であり、特定の実施形態において適用可能ではないが、本発明の任意の実施形態の文脈において単離された方法でもある一般的な特徴として見られてもよい。添付の図面を参照すると、以下が示される。
ここで、本発明を、本発明の追加の特徴、特性、および利点をもたらす実施形態の方法によってさらに説明する。実施形態は純粋な例示的性質のものであり、本発明の範囲(scope)または範囲(range)を限定するものではない。特定の実施形態において言及された特徴は、本発明の特徴であり、特定の実施形態において適用可能ではないが、本発明の任意の実施形態の文脈において単離された方法でもある一般的な特徴として見られてもよい。添付の図面を参照すると、以下が示される。
図1:pDel119-2-AcGFPのプラスミドチャート。
図2:D1701-VゲノムにおけるORF119欠失の図画による説明。A)Rziha et al. (2019; l.c.)によって最近公開されたORFV D1701-V株のゲノムマップを示す。B)ゲノムの右側部分によってコードされるオープンリーディングフレーム(ORF);DNA配列を含む31.805ntを、Rziha, H.-J.の公開されていないデータによって決定した。C)各遺伝子欠失によって影響を受けるゲノム部位の拡大。対応する配列を配列番号6に示す。
図3:GFPは、Del119に安定的に組み込まれている。Vero細胞におけるVCh119GFPの継代1回、5回、10回、15回、および20回後の119PCRは、遺伝子119の定常的な欠失を示し(A)、一方、d119PCRは、Del119遺伝子座に挿入されたGFPに特異的な1155bpの断片をもたらす(B)。1%アガロースゲル;ni=非感染Vero細胞からのDNA;M=使用準備済み 1kb Ladder、Nippon Genetics。
図4:pDel119のプラスミドチャート。
図5:新たなDel部位組換え体VCh119GFPは、Vero細胞においてGFPおよびmCherryの発現を誘導する。新たなDel部位組換え体および参照ウイルスVChD12GFPによる感染の5日後に、単一プラークの蛍光顕微鏡検査を行った。明視野顕微鏡、単一GFPおよびmCherryチャネルから得られた画像、ならびにマージされた画像が示され、スケールバーは500μmを表す。
図6:Del部位組換え体VCh119GFPにおける導入遺伝子gfpおよびmcherryの遺伝的安定性。10回の連続継代(P1~P10)の間、感染したVero細胞によるフルオロフォアの発現を、感染後72時間後の単一プラーク計数によって決定した。単一のGFPの発現プラークの頻度(A)および単一のmCherryの発現プラークの頻度(B)、ならびに単一の蛍光を示すプラークの全頻度(C)を、96ウェル限界希釈から得られたDel部位組換え体当たり3つのウイルスクローンについて示す。単一の蛍光プラークの平均の全頻度を計算し、(D)にプロットした。
図7:Del部位組換え体VCh119GFPの単一段階増殖曲線。感染細胞(MOI1)を洗浄し、吸着の2時間後(0hpi)、および、示された感染後の時間(hours post infection;hpi)に回収し、一方、全細胞ライセートをVero細胞上に滴定してウイルス力価(PFU/ml)を決定した。組換え体VCh119GFPのウイルス増殖曲線は、120時間後にコントロールのVChD12GFPと同等のウイルス力価に達する。
図8:Vero細胞におけるGFPおよびmCherry発現の比較。Vero細胞を新たなDel部位組換え体VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPに感染させ、24hpiおよび48hpiに回収した。mCherry(A)およびGFP(B)の幾何平均蛍光強度(MFI)をFACS分析によって決定し、VChD12GFPのそれに対して正規化した。3つの独立した実験の2回の繰り返しを示す。統計解析は、95%の信頼区間を持つ対応なしt検定を用いて行った:ns=p≧0.05、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
図9:単球性THP-1細胞におけるGFPおよびmCherry発現の比較。THP-1細胞を新たなDel部位組換え体VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPに感染させ、24hpiおよび48hpiに回収した。mCherry(A)およびGFP(B)の幾何平均蛍光強度(MFI)をFACS分析によって決定し、VChD12GFPのそれに対して正規化した。それぞれの独立した試験の平均値を計算し、95%の信頼区間を持つ対応なしt検定を用いて統計解析を行った:ns=p≧0.05、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
図10:新たなDel部位組換え体VCh119GFPによるヒトPBMCsの活性化。8人の異なるドナーのPBMCsをVCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPで24時間感染させた。感染細胞のパーセンテージを、CD14+細胞集団のmCherry発現(A)によって決定し、一方、CD4+(B)およびCD8+(C)T細胞、CD19+B細胞(D)およびCD56+NK細胞(E)集団の活性化を、活性化マーカーとしてCD69を用いて決定した。8人それぞれの独立に実施された実験のそれぞれについての異なるPBMC集団のCD69+画分およびそれらの平均を示す。統計解析は、95%の信頼区間をもつ対応ありt検定を用いて行った:ns=p≧0.05、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
図11:新たなDel部位組換え体VHLA119GFPによる感染後の6人の異なるドナーの感染率およびメモリーT細胞の増殖。CD14-PBMC集団を、Pepmix、または、VHLA119GFPおよび参照ウイルスVHLAD12GFPに感染させたCD14+単球で刺激した。D12-Cherry感染細胞ならびに非刺激細胞をコントロールとして供した。A)FACSを用いて、CD14+単球におけるmCherryまたはGFPの発現によって24hpiの感染率を決定した。B)12日後、メモリーT細胞の増殖を、テトラマー+CD8+T細胞(抗原特異的CD8+T細胞)の割合によって決定した。色は、異なるドナーが有するメモリーT細胞の特異性を示す:黒:GLCTLVAMLおよびGILGFVFTL;青:GILGFVFTLおよびNLVPMVATV;緑:GLCTLVAML、GILGFVFTLおよびNLVPMVATV。6つの独立した実験の結果および計算された平均値が示されている。統計解析は、95%の信頼区間をもつ対応ありt検定を用いて行った:ns=p≧0.05、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
図12:新たなDel部位組換え体VHLA119GFPによる感染後の6人の異なるドナーのメモリーT細胞の増殖および機能性。CD14-PBMC集団を、Pepmix、または、VHLA119GFPおよび参照ウイルスVHLAD12GFPに感染させたCD14+単球で刺激した。D12-Cherry感染細胞ならびに非刺激細胞をコントロールとして供した。A)12日後、メモリーT細胞の増殖を、GILGFVFTL、GLCTLVAML、またはNLVPMVATVテトラマー+CD8+T細胞の割合で決定し、これを異なるシンボルで示す。B)増殖したCD8+T細胞の機能性を、GILGFVFTL、GLCTLVAML、またはNLVPMVATVで再刺激した後に、TNFαおよびIFNγの細胞内染色によって分析し、TNFα+IFNγ+CD8+T細胞の割合を決定した。6つの独立した実験の結果および計算された平均値が示されている。統計解析は、95%の信頼区間をもつ対応ありt検定を用いて行った:ns=p≧0.05、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
図13:SARS-CoV-2 ORFV組換え体によって刺激された体液性および細胞性免疫応答。N-またはS1-SARS-CoV-2タンパク質を発現する107PFUのコントロールのORFV組換え体、またはORF119欠失を含むORFVベクターにより、2週間の間隔で2回、CD1マウスを免疫した。A)-B)ORFVベクターによって誘導されたN-およびS1-特異的結合総IgGを、2回目の免疫化後に、ELISAによって評価した。Dunnettの多重比較試験による一元配置ANOVAを用いて、コントロールのORFV群と比較した結合抗体エンドポイント力価間の差を評価した。
〔1.緒言〕
本発明は、生物における増加した免疫応答の誘導のためのツール、およびさらなる開発において誘導遺伝子または外来遺伝子の発現のためのツール、としての改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの使用に関する。単一のパラポックスウイルスベクターへの複数の導入遺伝子の挿入を可能にするために、本発明はまた、導入遺伝子発現のための挿入部位としての、Parapoxvirus ovis(Orfウイルス、ORFV)D1701株およびD1701-V株におけるORF119などの「NF-κBインヒビター」をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の適合性に関する。新規な欠失変異体を、挿入されたAcGFP(GFP)レポーターコンストラクトの遺伝的安定性、それらの増殖挙動、およびインビトロで異なる標的細胞において導入遺伝子発現を誘導する能力の詳細な特徴付けに供した。さらに、変異体の免疫原性を、末梢血単核細胞および抗原提示細胞を活性化する、またはインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するその能力によって分析した。まとめると、実施された分析は、NF-κBインヒビターをコードするORFのノックアウトをパラポックスウイルスゲノムに組み込むことによって、多価単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。したがって、レポーター遺伝子GFPとのオープンリーディングフレームの交換は、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に顕著な免疫原性特性をももたらした。
本発明は、生物における増加した免疫応答の誘導のためのツール、およびさらなる開発において誘導遺伝子または外来遺伝子の発現のためのツール、としての改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの使用に関する。単一のパラポックスウイルスベクターへの複数の導入遺伝子の挿入を可能にするために、本発明はまた、導入遺伝子発現のための挿入部位としての、Parapoxvirus ovis(Orfウイルス、ORFV)D1701株およびD1701-V株におけるORF119などの「NF-κBインヒビター」をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の適合性に関する。新規な欠失変異体を、挿入されたAcGFP(GFP)レポーターコンストラクトの遺伝的安定性、それらの増殖挙動、およびインビトロで異なる標的細胞において導入遺伝子発現を誘導する能力の詳細な特徴付けに供した。さらに、変異体の免疫原性を、末梢血単核細胞および抗原提示細胞を活性化する、またはインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するその能力によって分析した。まとめると、実施された分析は、NF-κBインヒビターをコードするORFのノックアウトをパラポックスウイルスゲノムに組み込むことによって、多価単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。したがって、レポーター遺伝子GFPとのオープンリーディングフレームの交換は、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に顕著な免疫原性特性をももたらした。
〔2.導入〕
ORFV D1701-V株は、D1701-B株を適用したウシ腎臓細胞株BK-KL3Aから得られ、アフリカ緑色サル細胞株Veroでの成長のための適応後に、いくつかのゲノム再編成が示された;Cottone, R., et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research 56(1), p. 53-67;Rziha, H.J., et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal of Biotechnology 83(1), p. 137-145。これらのゲノム再構成は、株の複製に必須ではなく、欠失領域D(D遺伝子座)などの導入遺伝子発現に適していることが示された遺伝子の欠失を含む;Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)。さらに、血管新生因子VEGF-Eは、ヒツジにおける血性病変の誘導に関与する主要な病原性決定因子であると予測されRziha, H.J., et al. (2000; l.c.)、したがって、異なる宿主においていくつかのウイルス性疾患に対する高い予防効果を有する長期持続性免疫を誘発するORFV組換え体を作製するために、挿入部位として使用された。これらの成功裏に使用された挿入部位に加えて、導入遺伝子発現に潜在的に適した他の遺伝子が、D1701-Vゲノムの末端において同定されていた。ポックスウイルスの中心領域は一般に、位置、間隔、および配向において保存された必須遺伝子をコードするので、これらの領域は、病原性、病因、または宿主範囲に影響を及ぼす因子をコードし、インビトロ増殖には不可欠であると考えられる。これらの因子は、宿主によって誘発される細胞性および体液性の免疫応答の最適な誘導を妨害すると予測されるが、これらの免疫調節遺伝子の欠失は、D1701-Vベクターの免疫原性をさらに増強し得る。したがって、本研究は、「NF-κBインヒビター」をコードする遺伝子の欠失、および導入遺伝子発現のための挿入部位としてのその使用に焦点を当てる。
ORFV D1701-V株は、D1701-B株を適用したウシ腎臓細胞株BK-KL3Aから得られ、アフリカ緑色サル細胞株Veroでの成長のための適応後に、いくつかのゲノム再編成が示された;Cottone, R., et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research 56(1), p. 53-67;Rziha, H.J., et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal of Biotechnology 83(1), p. 137-145。これらのゲノム再構成は、株の複製に必須ではなく、欠失領域D(D遺伝子座)などの導入遺伝子発現に適していることが示された遺伝子の欠失を含む;Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)。さらに、血管新生因子VEGF-Eは、ヒツジにおける血性病変の誘導に関与する主要な病原性決定因子であると予測されRziha, H.J., et al. (2000; l.c.)、したがって、異なる宿主においていくつかのウイルス性疾患に対する高い予防効果を有する長期持続性免疫を誘発するORFV組換え体を作製するために、挿入部位として使用された。これらの成功裏に使用された挿入部位に加えて、導入遺伝子発現に潜在的に適した他の遺伝子が、D1701-Vゲノムの末端において同定されていた。ポックスウイルスの中心領域は一般に、位置、間隔、および配向において保存された必須遺伝子をコードするので、これらの領域は、病原性、病因、または宿主範囲に影響を及ぼす因子をコードし、インビトロ増殖には不可欠であると考えられる。これらの因子は、宿主によって誘発される細胞性および体液性の免疫応答の最適な誘導を妨害すると予測されるが、これらの免疫調節遺伝子の欠失は、D1701-Vベクターの免疫原性をさらに増強し得る。したがって、本研究は、「NF-κBインヒビター」をコードする遺伝子の欠失、および導入遺伝子発現のための挿入部位としてのその使用に焦点を当てる。
(NF-κBインヒビター-ORF119)
NF-κB転写因子ファミリーは、DNA配列特異的DNA結合に関与するN端末Rel相同性ドメイン、およびホモ-またはヘテロ二量体化、が異なる5つのメンバーからなる。これらの二量体の核への移行は、細胞増殖および生存、組織および臓器の発達から免疫応答および炎症までの範囲の生物学的プロセスに関与する遺伝子の転写をもたらし、パターン認識受容体(PRRs)、TNF受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー、ならびにTCRおよびBCRのリガンドを含む多様な刺激に応答する2つの主要なシグナル伝達経路の活性化に依存する。標準経路における移行はマルチサブユニットIκBキナーゼ(IKK)複合体によるIκBαのリン酸化に依存するが、非標準経路はNF-κB前駆体タンパク質p100のプロセシングを含む。
NF-κB転写因子ファミリーは、DNA配列特異的DNA結合に関与するN端末Rel相同性ドメイン、およびホモ-またはヘテロ二量体化、が異なる5つのメンバーからなる。これらの二量体の核への移行は、細胞増殖および生存、組織および臓器の発達から免疫応答および炎症までの範囲の生物学的プロセスに関与する遺伝子の転写をもたらし、パターン認識受容体(PRRs)、TNF受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー、ならびにTCRおよびBCRのリガンドを含む多様な刺激に応答する2つの主要なシグナル伝達経路の活性化に依存する。標準経路における移行はマルチサブユニットIκBキナーゼ(IKK)複合体によるIκBαのリン酸化に依存するが、非標準経路はNF-κB前駆体タンパク質p100のプロセシングを含む。
ポックスウイルス感染は他の多くのものに加えて、TLRsまたはレチノイン酸誘導性遺伝子(RIG-I)様受容体などのPRRsによって感知されるので、これらのウイルスはNF-κB経路を妨害する戦略を進化させてきた。したがって、ORFVはまた、少なくとも5つのNF-κBインヒビターをコードすることが記載されている。その他に、ORF119は、その腫瘍サプレッサー活性について知られている網膜芽細胞腫タンパク質pRBとの強い相互作用を可能にするC末端LxCxEモチーフを有することが記載された。TNF受容体関連因子2(TRAF2)の動員を防止することによって、ORF119/pRBは、TNFα誘導性IKK活性化およびNF-κBシグナル伝達を阻害する;Nagendraprabhu, P., et al. (2017), A parapoxviral virion protein targets the retinoblastoma protein to inhibit NF-kappaB signaling. PLoS Pathog. 13(12): p. e1006779を参照されたし。それにもかかわらず、またNF-κBシグナル伝達におけるその機能にもかかわらず、ORF119はまた、細胞増殖を阻害し、ウイルス粒子の放出を促進するためにアポトーシスを誘導することが、最近、示されている;Li, W., et al. (2018), Orf Virus Encoded Protein ORFV119 Induces Cell Apoptosis Through the Extrinsic and Intrinsic Pathways. Front. Microbiol. 9: p. 1056を参照されたし。したがって、NF-κBとアポトーシス調節との間の相互作用は、なおさらなる研究を必要とする。
〔3.材料および方法〕
(新たなDel部位組換え体の作製および特性評価)
本研究で使用されるORFV組換え体を作製するために、Invitrogenから合成され得られた導入遺伝子をトランスファープラスミドにクローニングした。ORFVゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みは、ヌクレオフェクションによるトランスフェクションおよびその後のVero細胞の感染後に、トランスファープラスミドと親ウイルスのゲノムDNAとの間の相同組換えによって達成された。
(新たなDel部位組換え体の作製および特性評価)
本研究で使用されるORFV組換え体を作製するために、Invitrogenから合成され得られた導入遺伝子をトランスファープラスミドにクローニングした。ORFVゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みは、ヌクレオフェクションによるトランスフェクションおよびその後のVero細胞の感染後に、トランスファープラスミドと親ウイルスのゲノムDNAとの間の相同組換えによって達成された。
(トランスファープラスミドの作製)
DNAインサートならびにプラスミドベクターを同一の制限酵素を用いて消化し、目的の断片を精製し、ライゲーションした。続いて、細菌を、ライゲーションしたプラスミドで形質転換し、コロニーを選択してトランスファープラスミドを作製した。検証のために、制限酵素を用いたコントロール消化の後にアガロースゲル電気泳動を行い、一方、挿入特異的プライマーを用いたDNA配列決定により、プラスミドベクターへの導入遺伝子の正しい挿入が確認された。以下の表は、作製されたトランスファープラスミドをまとめたものであり、一方、プラスミドチャートおよび対応する配列(配列番号7)を図1に示す。
DNAインサートならびにプラスミドベクターを同一の制限酵素を用いて消化し、目的の断片を精製し、ライゲーションした。続いて、細菌を、ライゲーションしたプラスミドで形質転換し、コロニーを選択してトランスファープラスミドを作製した。検証のために、制限酵素を用いたコントロール消化の後にアガロースゲル電気泳動を行い、一方、挿入特異的プライマーを用いたDNA配列決定により、プラスミドベクターへの導入遺伝子の正しい挿入が確認された。以下の表は、作製されたトランスファープラスミドをまとめたものであり、一方、プラスミドチャートおよび対応する配列(配列番号7)を図1に示す。
(ORFV感染Vero細胞のトランスフェクション)
組換え体ORFVの作製は、Vero細胞を、ORFVによる感染の前にトランスファープラスミドでトランスフェクトする2つのステップに従った。トランスフェクションは、ヌクレオフェクションと呼ばれるエレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法によって行った。トランスファープラスミドおよびORFVゲノム上の相同配列に起因して、インサートは、相同組換えを介してORFVゲノムに組み込まれ得る。この目的のために、Vero細胞を、トリプシンを用いて分離し、5mlのNF停止溶液中に再懸濁し、計数した。それぞれのトランスフェクションバッチについて、2.5×106細胞を1.5mlエッペンドルフカップに移し、63rcfで10分間遠心分離した。細胞ペレットを100μlのトランスフェクション溶液(1:4.5の比率で混合された、AmaxaトランスフェクションキットのトランスフェクションサプリメントおよびCLBトランスフェクションバッファー)に再懸濁し、2μgのプラスミドDNAを補充し、トランスフェクションキュベットに移した。トランスフェクションのために、CLBトランスフェクションデバイスを使用した。続いて、ヌクレオフェクションされた細胞をNF停止溶液中に再懸濁し、パスツールピペットを用いて6mlの予熱したVero細胞培地を含むT25細胞培養フラスコに移した。細胞を直ちに親ウイルス(MOI1)に37℃および5%CO2で4時間感染させ、6mlの予熱したPBSを用いて洗浄し、新鮮なVero細胞培地中、37℃および5%CO2で72時間インキュベートした。ウイルスプラークまたは細胞変性効果(CPE)を観察することができた場合、細胞を、-80℃および水浴中37℃で、それぞれ、3回凍結および解凍し、細胞を破壊し、ウイルスの子孫を放出させた。
組換え体ORFVの作製は、Vero細胞を、ORFVによる感染の前にトランスファープラスミドでトランスフェクトする2つのステップに従った。トランスフェクションは、ヌクレオフェクションと呼ばれるエレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法によって行った。トランスファープラスミドおよびORFVゲノム上の相同配列に起因して、インサートは、相同組換えを介してORFVゲノムに組み込まれ得る。この目的のために、Vero細胞を、トリプシンを用いて分離し、5mlのNF停止溶液中に再懸濁し、計数した。それぞれのトランスフェクションバッチについて、2.5×106細胞を1.5mlエッペンドルフカップに移し、63rcfで10分間遠心分離した。細胞ペレットを100μlのトランスフェクション溶液(1:4.5の比率で混合された、AmaxaトランスフェクションキットのトランスフェクションサプリメントおよびCLBトランスフェクションバッファー)に再懸濁し、2μgのプラスミドDNAを補充し、トランスフェクションキュベットに移した。トランスフェクションのために、CLBトランスフェクションデバイスを使用した。続いて、ヌクレオフェクションされた細胞をNF停止溶液中に再懸濁し、パスツールピペットを用いて6mlの予熱したVero細胞培地を含むT25細胞培養フラスコに移した。細胞を直ちに親ウイルス(MOI1)に37℃および5%CO2で4時間感染させ、6mlの予熱したPBSを用いて洗浄し、新鮮なVero細胞培地中、37℃および5%CO2で72時間インキュベートした。ウイルスプラークまたは細胞変性効果(CPE)を観察することができた場合、細胞を、-80℃および水浴中37℃で、それぞれ、3回凍結および解凍し、細胞を破壊し、ウイルスの子孫を放出させた。
(ORFV組換え体の選択)
相同組換えは、トランスファープラスミドの挿入とORFVゲノム中の標的領域との間で約1:10000の比率で起こる事象である。このまれな事象を選択し、組換え体ORFVを親ウイルスから分離するために、異なる選択方法を使用することができる。
相同組換えは、トランスファープラスミドの挿入とORFVゲノム中の標的領域との間で約1:10000の比率で起こる事象である。このまれな事象を選択し、組換え体ORFVを親ウイルスから分離するために、異なる選択方法を使用することができる。
(ORFV組換え体のFACSに基づく選択)
蛍光活性化細胞選別(FACS)による選択は、GFPまたはmCherryなどの蛍光標識の損失または獲得に基づく。この目的のために、3×105Vero細胞を、3mlのVero細胞培地を含む6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションのライセートを連続希釈の感染に使用し、37℃および5%CO2で20~24時間行った。最適な選択方法を確実にするために、約1~5%の低い感染率を有する細胞を回収し、400rcfで5分間遠心分離した。続いて、細胞を1mlのPBEを有するスライス(thrice)で洗浄し、最終的には500μlのPBEに再懸濁した。BD FACSjazz(Biosciences)を用いて、150μlのVero細胞培地中で、ウェル当たり104Vero細胞を含む96ウェルプレート中で、単一細胞FACS選別を行った。37℃および5%CO2で72時間インキュベートした後、組換え体ORFVの単一ウイルスプラークを示すウェルを、さらなる増殖および分析のために採取することができた。
蛍光活性化細胞選別(FACS)による選択は、GFPまたはmCherryなどの蛍光標識の損失または獲得に基づく。この目的のために、3×105Vero細胞を、3mlのVero細胞培地を含む6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションのライセートを連続希釈の感染に使用し、37℃および5%CO2で20~24時間行った。最適な選択方法を確実にするために、約1~5%の低い感染率を有する細胞を回収し、400rcfで5分間遠心分離した。続いて、細胞を1mlのPBEを有するスライス(thrice)で洗浄し、最終的には500μlのPBEに再懸濁した。BD FACSjazz(Biosciences)を用いて、150μlのVero細胞培地中で、ウェル当たり104Vero細胞を含む96ウェルプレート中で、単一細胞FACS選別を行った。37℃および5%CO2で72時間インキュベートした後、組換え体ORFVの単一ウイルスプラークを示すウェルを、さらなる増殖および分析のために採取することができた。
(限界希釈によるORFV組換え体の選択)
FACSに基づく選別またはMACS選択後の組換えウイルスのさらなる選択および精製を、限界希釈によって行った。この目的のために、25mlのVero細胞培地中の2×106Vero細胞を、12ウェルピペッティングリザーバーに分割し、ここで、最初のウェルおよび残りのウェルは、それぞれ、3mlまたは2mlの細胞液のいずれかを含んでいた。最初のウェルに、MACS選択の3×105細胞または50~100μlのウイルスライセートのいずれかを補充し、最初のウェルから最後のウェルまでそれぞれ1:3に希釈した。それぞれの希釈液の150μlを96ウェルプレートの対応するウェルに移し、37℃および5%CO2で72時間インキュベートした。72時間後、単一ウイルスプラークを含むウェルを、(蛍光)顕微鏡法によるさらなる処理のために選択することができた。
FACSに基づく選別またはMACS選択後の組換えウイルスのさらなる選択および精製を、限界希釈によって行った。この目的のために、25mlのVero細胞培地中の2×106Vero細胞を、12ウェルピペッティングリザーバーに分割し、ここで、最初のウェルおよび残りのウェルは、それぞれ、3mlまたは2mlの細胞液のいずれかを含んでいた。最初のウェルに、MACS選択の3×105細胞または50~100μlのウイルスライセートのいずれかを補充し、最初のウェルから最後のウェルまでそれぞれ1:3に希釈した。それぞれの希釈液の150μlを96ウェルプレートの対応するウェルに移し、37℃および5%CO2で72時間インキュベートした。72時間後、単一ウイルスプラークを含むウェルを、(蛍光)顕微鏡法によるさらなる処理のために選択することができた。
(連続継代による遺伝的安定性の決定)
フルオロフォアコード部位の遺伝的安定性を調べるために、それぞれのORFV組換え体の10回の連続継代を行った。このために、5×105Vero細胞を、3mlのVero細胞培地を含む6ウェルプレートに播種した。最初に、限界希釈で1つの単一のプラークを示すウイルスライセートを連続希釈での感染に使用し、37℃および5%CO2で2時間行った。細胞をPBSで2回洗浄し、続いて37℃および5%CO2で72時間、3mlのVero細胞培地中でインキュベートした。Eclipse Ti2顕微鏡(Nikon)を用いて、100~200個のプラークを示すウェルについて、蛍光プラーク数を決定した。次に、細胞を-80℃で凍結し、RTで解凍し、50μlのウイルスライセートを使用して、上記のように新しく播種されたVero細胞を感染させた。
フルオロフォアコード部位の遺伝的安定性を調べるために、それぞれのORFV組換え体の10回の連続継代を行った。このために、5×105Vero細胞を、3mlのVero細胞培地を含む6ウェルプレートに播種した。最初に、限界希釈で1つの単一のプラークを示すウイルスライセートを連続希釈での感染に使用し、37℃および5%CO2で2時間行った。細胞をPBSで2回洗浄し、続いて37℃および5%CO2で72時間、3mlのVero細胞培地中でインキュベートした。Eclipse Ti2顕微鏡(Nikon)を用いて、100~200個のプラークを示すウェルについて、蛍光プラーク数を決定した。次に、細胞を-80℃で凍結し、RTで解凍し、50μlのウイルスライセートを使用して、上記のように新しく播種されたVero細胞を感染させた。
(ドナー血液からのPBMCsの単離)
末梢血単核細胞(PBMCs)は、テュービンゲンの献血センターから得られた献血から単離することができた。まず、血液をPBSで総体積100mlに希釈した。次に、50mlチューブ中の4×15mlのFicollを、それぞれ25mlの希釈血液で重ね合わせ、700×gおよびRTで20分間遠心分離した。密度勾配遠心分離後の白色層の形成によって同定することができる白血球を2つの50mlチューブに移し、それぞれに50mlの体積までPBSを補充した。400×gおよびRTで10分間遠心分離した後、細胞ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、300×gおよびRTで10分間遠心分離した。PBMCsをマージし、50mlの体積までPBSを補充し、細胞数を決定した。
末梢血単核細胞(PBMCs)は、テュービンゲンの献血センターから得られた献血から単離することができた。まず、血液をPBSで総体積100mlに希釈した。次に、50mlチューブ中の4×15mlのFicollを、それぞれ25mlの希釈血液で重ね合わせ、700×gおよびRTで20分間遠心分離した。密度勾配遠心分離後の白色層の形成によって同定することができる白血球を2つの50mlチューブに移し、それぞれに50mlの体積までPBSを補充した。400×gおよびRTで10分間遠心分離した後、細胞ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、300×gおよびRTで10分間遠心分離した。PBMCsをマージし、50mlの体積までPBSを補充し、細胞数を決定した。
(PBMCsからの単球の単離)
PBMCsから単球を単離する原理は、単球によるCD14の発現に依存する。したがって、PBMCsを300×gおよびRTで10分間遠心分離し、ペレットを4mlのPBEおよび100μlのα-CD14マイクロビーズに再懸濁した。懸濁液を4℃で15分間インキュベートし、PBEで平衡化したLSカラムにロードした。カラムを3mlのPBEで3回洗浄した後、CD14+単球を5mlのPBEでカラムから溶出し、計数することができた。
PBMCsから単球を単離する原理は、単球によるCD14の発現に依存する。したがって、PBMCsを300×gおよびRTで10分間遠心分離し、ペレットを4mlのPBEおよび100μlのα-CD14マイクロビーズに再懸濁した。懸濁液を4℃で15分間インキュベートし、PBEで平衡化したLSカラムにロードした。カラムを3mlのPBEで3回洗浄した後、CD14+単球を5mlのPBEでカラムから溶出し、計数することができた。
(単球およびPBMsCの培養)
単球およびPBMCsを、IMDM完全培地中、37℃および5%CO2で培養した。実験方法のために、3×105の単球および5×105のPBMCsを、96ウェル丸底プレート中のウェル当たり200μl中に播種し、一方、1×105の単球を播種して、樹状細胞に分化させた。
単球およびPBMCsを、IMDM完全培地中、37℃および5%CO2で培養した。実験方法のために、3×105の単球および5×105のPBMCsを、96ウェル丸底プレート中のウェル当たり200μl中に播種し、一方、1×105の単球を播種して、樹状細胞に分化させた。
(ヒト抗原特異的メモリーCD8+T細胞の増殖(12日間刺激))
抗原特異的メモリーCD8+T細胞の増殖は、12日間にわたる、HLA-A*02拘束性エプスタイン-バーウイルス(EBV)BMLF1280-288 GLCTLVAML、インフルエンザA MP58-66 GILGFVFTL、およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)pp65495-503 NLVPMVATVエピトープを提示する単球によるそれらの刺激に基づく。したがって、HLA*A02陽性ドナーからの血液を上記のように処理し、単球を培養して、それぞれ、異なるORFV組換え体の様々な希釈物に感染させるか、または1μM合成ペプチドで刺激した。さらに、CD14-画分について生細胞計数を行い、96ウェル丸底プレート中のウェル当たり100μlのT細胞培地に5×105細胞を播種し、37℃および5%CO2でインキュベートした。20~24時間後、各感染単球群20μlを新たな96ウェルプレートに移し、700×gおよびRTでの遠心分離によりPFEAで3回洗浄した。FACS分析を行って感染率を決定し、一方、約20%の感染率を示す単球を、全体積200μlのT細胞培地中でCD14-画分と共培養した。2~3日毎に、50μlの培地を、20U/mlのIL-2を含む新鮮なT細胞培地で置き換えた。刺激の12日後、CD8+T細胞の増殖をテトラマー染色によって分析し、抗原特異的CD8+T細胞の機能性を細胞内サイトカイン染色によって評価した。
抗原特異的メモリーCD8+T細胞の増殖は、12日間にわたる、HLA-A*02拘束性エプスタイン-バーウイルス(EBV)BMLF1280-288 GLCTLVAML、インフルエンザA MP58-66 GILGFVFTL、およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)pp65495-503 NLVPMVATVエピトープを提示する単球によるそれらの刺激に基づく。したがって、HLA*A02陽性ドナーからの血液を上記のように処理し、単球を培養して、それぞれ、異なるORFV組換え体の様々な希釈物に感染させるか、または1μM合成ペプチドで刺激した。さらに、CD14-画分について生細胞計数を行い、96ウェル丸底プレート中のウェル当たり100μlのT細胞培地に5×105細胞を播種し、37℃および5%CO2でインキュベートした。20~24時間後、各感染単球群20μlを新たな96ウェルプレートに移し、700×gおよびRTでの遠心分離によりPFEAで3回洗浄した。FACS分析を行って感染率を決定し、一方、約20%の感染率を示す単球を、全体積200μlのT細胞培地中でCD14-画分と共培養した。2~3日毎に、50μlの培地を、20U/mlのIL-2を含む新鮮なT細胞培地で置き換えた。刺激の12日後、CD8+T細胞の増殖をテトラマー染色によって分析し、抗原特異的CD8+T細胞の機能性を細胞内サイトカイン染色によって評価した。
(フローサイトメトリー)
生存率および感染率、ならびに、表面および細胞内分子の発現を、BD LSRFortessaフローサイトメトリーシステム(BD Biosciences)を用いて分析した。試料の調製および蛍光標識抗体による細胞の染色を、96ウェルU底プレート中で行い、一方、遠心分離を4℃および400×gで5分間行った。感染率を決定するために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのPFEAに再懸濁させるか、または任意にFACS分析のために固定した。
生存率および感染率、ならびに、表面および細胞内分子の発現を、BD LSRFortessaフローサイトメトリーシステム(BD Biosciences)を用いて分析した。試料の調製および蛍光標識抗体による細胞の染色を、96ウェルU底プレート中で行い、一方、遠心分離を4℃および400×gで5分間行った。感染率を決定するために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのPFEAに再懸濁させるか、または任意にFACS分析のために固定した。
(Fc受容体の阻害)
非特異的抗体結合を防止するために、Fc受容体を発現する細胞を、染色手順の前に、製造業者の説明書に従ってFcブロックで処理した。
非特異的抗体結合を防止するために、Fc受容体を発現する細胞を、染色手順の前に、製造業者の説明書に従ってFcブロックで処理した。
(マルチマーによる染色)
マルチマーは、抗原特異的T細胞を同定および定量するために頻繁に使用される。テトラマーは、蛍光標識されたストレプトアビジン複合体に結合した4つの組換えMHC分子からなる。対照的に、デキストラマーは、いくつかのフルオロフォアおよびMHC分子を保有するデキストラン骨格からなる。マルチマーは、特定のT細胞によって認識されるペプチド-MHC複合体を形成するために、目的のペプチドがロードされ、したがって、フローサイトメトリーによって検出することができる。このために、細胞を200μlのPBSで2回洗浄し、50μlのテトラマー溶液またはPBSにそれぞれ再懸濁した。50μlのテトラマー溶液で染色する前に、PE結合HLAテトラマーをテトラマーバッファーと1:50で混合し、13.000×gで10分間遠心分離した。デキストラマーによる染色は、デキストラマーをPBSと1:10の比で混合することによる同一の手順に従った。インキュベートは、RTで30分間、暗所で行った。
マルチマーは、抗原特異的T細胞を同定および定量するために頻繁に使用される。テトラマーは、蛍光標識されたストレプトアビジン複合体に結合した4つの組換えMHC分子からなる。対照的に、デキストラマーは、いくつかのフルオロフォアおよびMHC分子を保有するデキストラン骨格からなる。マルチマーは、特定のT細胞によって認識されるペプチド-MHC複合体を形成するために、目的のペプチドがロードされ、したがって、フローサイトメトリーによって検出することができる。このために、細胞を200μlのPBSで2回洗浄し、50μlのテトラマー溶液またはPBSにそれぞれ再懸濁した。50μlのテトラマー溶液で染色する前に、PE結合HLAテトラマーをテトラマーバッファーと1:50で混合し、13.000×gで10分間遠心分離した。デキストラマーによる染色は、デキストラマーをPBSと1:10の比で混合することによる同一の手順に従った。インキュベートは、RTで30分間、暗所で行った。
(細胞生存率の測定)
細胞生存率は、Zombie Aqua染色によって決定した。Zombie Aquaは、生細胞に浸透することはできないが、損なわれた膜を有する細胞に入るアミン反応性蛍光色素である。したがって、それは、生存哺乳類細胞と死滅哺乳類細胞とを区別するために使用することができる。Zombie Aqua染色のために、細胞を200μlのPBSで2回洗浄し、50μlのZombie Aqua(PBSで1:400に希釈)に、30分間4℃で、暗所で再懸濁した。
細胞生存率は、Zombie Aqua染色によって決定した。Zombie Aquaは、生細胞に浸透することはできないが、損なわれた膜を有する細胞に入るアミン反応性蛍光色素である。したがって、それは、生存哺乳類細胞と死滅哺乳類細胞とを区別するために使用することができる。Zombie Aqua染色のために、細胞を200μlのPBSで2回洗浄し、50μlのZombie Aqua(PBSで1:400に希釈)に、30分間4℃で、暗所で再懸濁した。
(細胞外抗体染色)
表面分子発現の分析のために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、PFEA中の50μlの新しく調製された抗体混合物に再懸濁し、30分間4℃で、暗所でインキュベートした。
表面分子発現の分析のために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、PFEA中の50μlの新しく調製された抗体混合物に再懸濁し、30分間4℃で、暗所でインキュベートした。
(細胞内サイトカイン染色)
細胞内サイトカインの検出のために、細胞を10μg/mlのブレフェルジンAで処理して、タンパク質の分泌を防ぎ、それぞれの合成ペプチドで12~14時間刺激した。細胞内サイトカイン染色の前に、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのCytofix/Cytopermで30分間、4℃で、暗所でインキュベートすることによって透過処理した。次に、細胞を再懸濁し、200μlのPermwashで2回洗浄し、その後、30分間4℃で、暗所で、Permwash中の50μlの抗体混合物で染色した。
細胞内サイトカインの検出のために、細胞を10μg/mlのブレフェルジンAで処理して、タンパク質の分泌を防ぎ、それぞれの合成ペプチドで12~14時間刺激した。細胞内サイトカイン染色の前に、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのCytofix/Cytopermで30分間、4℃で、暗所でインキュベートすることによって透過処理した。次に、細胞を再懸濁し、200μlのPermwashで2回洗浄し、その後、30分間4℃で、暗所で、Permwash中の50μlの抗体混合物で染色した。
(細胞の固定)
4時間を超える保存のために、細胞を固定した。このために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのPFEA+1%ホルムアルデヒドに再懸濁し、4℃で暗所に保存した。試料の分析は10日以内に行った。
4時間を超える保存のために、細胞を固定した。このために、細胞を200μlのPFEAで2回洗浄し、50μlのPFEA+1%ホルムアルデヒドに再懸濁し、4℃で暗所に保存した。試料の分析は10日以内に行った。
(マウス免疫)
少なくとも6週齢の非近交系CD1マウス(N=10)をCharles River(Charles River Laboratories、Germany)から入手し、ドイツのテュービンゲン大学のバイオセーフティレベル1の動物施設に収容した。すべての動物は、良い動物操作、並びに、地方の動物実験および倫理委員会の指針に従い、厳密に従い取り扱われた-実験はプロジェクトライセンス(Nr.IM1/20G)に基づいて実施された。マウスは、107プラーク形成単位(PFU)のORFV組換え体で、2週間の間隔で2回、前脛骨の筋肉内(i.m.)に免疫化された。体液性免疫分析のための血液試料を、ブースター免疫の2週間後に後眼窩の出血によって収集した。動物を人道的に安楽死させた後、細胞性免疫分析のための脾細胞を、ブースター免疫の2週間後に収集し、標準的な手順によって単離した。
少なくとも6週齢の非近交系CD1マウス(N=10)をCharles River(Charles River Laboratories、Germany)から入手し、ドイツのテュービンゲン大学のバイオセーフティレベル1の動物施設に収容した。すべての動物は、良い動物操作、並びに、地方の動物実験および倫理委員会の指針に従い、厳密に従い取り扱われた-実験はプロジェクトライセンス(Nr.IM1/20G)に基づいて実施された。マウスは、107プラーク形成単位(PFU)のORFV組換え体で、2週間の間隔で2回、前脛骨の筋肉内(i.m.)に免疫化された。体液性免疫分析のための血液試料を、ブースター免疫の2週間後に後眼窩の出血によって収集した。動物を人道的に安楽死させた後、細胞性免疫分析のための脾細胞を、ブースター免疫の2週間後に収集し、標準的な手順によって単離した。
(マウス血清に対する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA))
免疫化マウスにおけるSARS-CoV-2核タンパク質(N)特異的抗体およびスパイク(S)特異的抗体を、COVID-19 N-タンパク質およびS-タンパク質(S1RBD)COVID19ヒトIgG抗体ELISAキット(カタログ番号:それぞれ、IEQ-CoVN-IgGおよびIEQ-CoVS1RBD-IgG、RayBiotech、USA)を製造業者の指示に従って用いて評価した。キットからのビオチン化抗ヒトIgG抗体およびHRP-ストレプトアビジンを、HRP結合抗マウスIgG二次抗体(ab6728、Abcam、UK)で、1:5000希釈で30分間で、置き換えた。結合抗体エンドポイント力価を次のように算出した:log10吸光度単位(OD)をlog10試料希釈に対してプロットした。この曲線の直線部分の回帰分析は、同じ希釈において、モック(Mock)免疫化マウスにおける平均ODプラスODの標準偏差の5倍、よりも高いODを有するエンドポイント力価の算出を可能にした。
免疫化マウスにおけるSARS-CoV-2核タンパク質(N)特異的抗体およびスパイク(S)特異的抗体を、COVID-19 N-タンパク質およびS-タンパク質(S1RBD)COVID19ヒトIgG抗体ELISAキット(カタログ番号:それぞれ、IEQ-CoVN-IgGおよびIEQ-CoVS1RBD-IgG、RayBiotech、USA)を製造業者の指示に従って用いて評価した。キットからのビオチン化抗ヒトIgG抗体およびHRP-ストレプトアビジンを、HRP結合抗マウスIgG二次抗体(ab6728、Abcam、UK)で、1:5000希釈で30分間で、置き換えた。結合抗体エンドポイント力価を次のように算出した:log10吸光度単位(OD)をlog10試料希釈に対してプロットした。この曲線の直線部分の回帰分析は、同じ希釈において、モック(Mock)免疫化マウスにおける平均ODプラスODの標準偏差の5倍、よりも高いODを有するエンドポイント力価の算出を可能にした。
〔4.結果〕
(新たなDel部位組換え体の作製)
トランスファープラスミドの作製に成功した後、新たなORFV組換え体を、方法に詳細に記載されるように作製した。したがって、プラスミドpDel119-2-AcGFPをヌクレオフェクションによってVero細胞に移入し、その後、親ウイルスV12-Cherryに感染させた。ORFVゲノム中の相同配列およびトランスファープラスミドの挿入隣接領域のため、相同組換えは、ORFV D1701-Vゲノム中のGFPによるORF119の安定な交換をもたらした(図2)。D1701-V(Rziha, H.-J.、公開されていない、図2B)のDNA配列を含む31.805ntの右側部分におけるORF119の正確な位置を以下の表に示す:
(新たなDel部位組換え体の作製)
トランスファープラスミドの作製に成功した後、新たなORFV組換え体を、方法に詳細に記載されるように作製した。したがって、プラスミドpDel119-2-AcGFPをヌクレオフェクションによってVero細胞に移入し、その後、親ウイルスV12-Cherryに感染させた。ORFVゲノム中の相同配列およびトランスファープラスミドの挿入隣接領域のため、相同組換えは、ORFV D1701-Vゲノム中のGFPによるORF119の安定な交換をもたらした(図2)。D1701-V(Rziha, H.-J.、公開されていない、図2B)のDNA配列を含む31.805ntの右側部分におけるORF119の正確な位置を以下の表に示す:
次に、新たなORFV組換え体を、FACS選別および限界希釈によって選択された感染GFPおよびmCherry発現Vero細胞から単離することができた。DNA単離、続いて挿入および遺伝子座特異的PCRタイピングにより、図3に示すように、精製されたORFV組換え体の遺伝的均一性をモニタリングすることができた。ここで、119およびd119PCRにより、ORF119の欠失およびGFPコード配列との交換の両方が証明された。その後、新たなORFV組換え体を、上記のようにラージスケールで増殖させた。
組換えORFV欠失変異体も作製することができ、これは、GFPの挿入を伴わないORF119の欠失、したがって、親ウイルスと比較して増強された免疫原性をもたらす機能欠失変異のORF119遺伝子産物のみをもたらした。対応するトランスファープラスミドおよび配列は、図4および配列番号8に見出すことができる。
GFPは新たなDel部位に安定的に挿入されている 新たなDel部位へ挿入されたGFPの安定性を調べるために、Vero細胞を新たなDel部位組換え体VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPに感染させ、20回の連続継代を行った。GFPおよびmCherry蛍光は両方とも、図5に示されるように、この実験を通して新たなDel部位組換え体によるVero細胞感染に起因する単一プラーク中で蛍光顕微鏡によって観察することができた。
さらに、ウイルスDNAを、継代1回、5回、10回、15回、および20回後に感染したVero細胞から単離し、欠失した遺伝子特異的ならびに遺伝子座特異的PCRを行って、Del遺伝子座の完全性を調べた。示されるように、20回の継代の間に119PCRにおいてORF119特異的407bp断片を検出することはできなかったが(図3A)、欠失部位は、d119PCRを用いてDel119遺伝子座に挿入されたGFPに特異的な1155bp断片を示した(図3B)。
最後に、新たなDel部位に挿入された導入遺伝子の安定性を、ORFV D1701-V組換え体の3つの生物学的反復(ウイルスクローン)の10回の連続継代の間に調べた。72時間の感染後、100~200個のプラークを含むウェルを使用して、GFPおよびmCherryフルオロフォアの両方、またはGFPもしくはmCherryのいずれかを発現する単一プラークの量を蛍光顕微鏡によって決定した。10回の連続継代の間に1つのフルオロフォアのみを発現するプラークのパーセンテージを図6に示す。
結果は、VCh119GFPを用いて、1%未満の単一GFPおよびmCherry発現プラークの頻度を実証している。図6Bは、1%超の単一mCherry発現プラークが継代4回および7回でVCh119GFPについて観察されたが、頻度は経時的に増加せず、1%未満のほとんどの反復について測定されたことを示す。まとめると、提示された結果は、GFPが新たなDel部位組換え体に感染したVero細胞において安定に発現し、予測されるゲノム遺伝子座において20回の継代にわたって検出することができることを示唆している。さらに、新たなDel部位またはvegf遺伝子座におけるGFPおよびmCherryの両方の遺伝的安定性は、それぞれ、感染したVero細胞の蛍光を研究する10回の連続継代において検証された。それぞれの新たなDel部位組換え体に感染したすべての計数された溶解性プラークの少なくとも99%は10回の継代後に同時にGFPおよびmCherryを発現したので、これらの結果は試験されたゲノム遺伝子座の遺伝的安定性を示している。
(新たなDel部位組換え体の増殖挙動の特性評価)
新たなDel部位組換え体に導入された欠失が参照ウイルスVChD12GFPと比較してORFV許容性Vero細胞におけるインビトロ増殖特性を変化させるかどうかを調べるために、単一工程の増殖曲線実験を行った。このために、Vero細胞を新たなDel部位組換え体VCh119GFPに感染させ、24時間後に約20~25%の感染率をもたらした。感染細胞を洗浄し、吸着の2時間後(0時間と指定)、または感染の6時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および120時間後に回収した。ウイルスライセートをVero細胞上に滴定して、1ml当たりのプラーク形成単位(PFU/ml)で測定した感染性粒子の数を決定した。各組換え体について3回実験を行った。結果を図7に示す。
新たなDel部位組換え体に導入された欠失が参照ウイルスVChD12GFPと比較してORFV許容性Vero細胞におけるインビトロ増殖特性を変化させるかどうかを調べるために、単一工程の増殖曲線実験を行った。このために、Vero細胞を新たなDel部位組換え体VCh119GFPに感染させ、24時間後に約20~25%の感染率をもたらした。感染細胞を洗浄し、吸着の2時間後(0時間と指定)、または感染の6時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および120時間後に回収した。ウイルスライセートをVero細胞上に滴定して、1ml当たりのプラーク形成単位(PFU/ml)で測定した感染性粒子の数を決定した。各組換え体について3回実験を行った。結果を図7に示す。
Del部位組換え体VCh119GFPの増殖特性は、120hpi後に約107PFU/mlの最終力価と同等に達する参照ウイルスVChD12GFPについて得られたものに似ている。特に、VCh119GFPの増殖曲線は、VChD12GFPの増殖曲線について使用されるように、より低いウイルス入力を示し、実験を通してコントロールと比較して、わずかに減少した最終ウイルス力価のみを示した(図7)。それにもかかわらず、これらの結果は、VCh119GFPが、許容性細胞株Veroにおいて感染性子孫を産生することができるような複製効率であることを示唆している。
(新たなDel部位を用いた発現強度の分析)
新たなDel部位組換え体による導入遺伝子発現の可能性を調べるために、ORF119に組み込まれたレポーター遺伝子GFP、およびvegf遺伝子座に挿入されたmCherryを使用し、Vero細胞、単球性細胞株THP-1およびヒト初代単球由来樹状細胞(moDCs)のORFV感染後のそれらの発現強度を比較した。このために、細胞を播種し、VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPに24時間または48時間感染させた。続いて、FACS分析を行い、細胞において発現されたGFPおよびmCherryの幾何平均蛍光強度(MFI)を決定した。moDCsの分析のために、いくつかのドナーからの細胞を用いて実験を行い、個体間の差を推定した。新たなDel部位組換え体の感染から同定されたMFIを、同じ実験のVChD12GFP由来MFIの平均に対して正規化した。Vero細胞およびTHP-1細胞から得られた結果を、それぞれ図8および図9に示す。
新たなDel部位組換え体による導入遺伝子発現の可能性を調べるために、ORF119に組み込まれたレポーター遺伝子GFP、およびvegf遺伝子座に挿入されたmCherryを使用し、Vero細胞、単球性細胞株THP-1およびヒト初代単球由来樹状細胞(moDCs)のORFV感染後のそれらの発現強度を比較した。このために、細胞を播種し、VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPに24時間または48時間感染させた。続いて、FACS分析を行い、細胞において発現されたGFPおよびmCherryの幾何平均蛍光強度(MFI)を決定した。moDCsの分析のために、いくつかのドナーからの細胞を用いて実験を行い、個体間の差を推定した。新たなDel部位組換え体の感染から同定されたMFIを、同じ実験のVChD12GFP由来MFIの平均に対して正規化した。Vero細胞およびTHP-1細胞から得られた結果を、それぞれ図8および図9に示す。
Vero細胞について、3つの独立した実験を2回繰り返して行った。mCherry発現は、VCh119GFP感染の24hpi後および48hpi後でのVChD12GFPと同等であった(図8A)。特に、VCh119GFP感染は、両方の時点で1.1倍~1.5倍増強されたGFPレベルをもたらし、VChD12GFPと比較して、Vero細胞におけるvegf遺伝子座およびDel-119遺伝子座からの導入遺伝子発現に対するORF119欠失のポジティブな影響を示唆する。
単球性THP-1細胞におけるGFPおよびmCherryの発現強度を、感染24時間後の3~6回の反復を含む4回の独立した実験、および感染48時間後の3回の反復を含む2回の独立した実験、のそれぞれにおいて分析した。ここで、平均mCherryレベルは、24時間後のVChD12GFP誘導レベルに類似し、一方、図9Aに示されるように、VCh119GFPに感染したTHP-1細胞から1.4倍強いMFIが得られた。さらに、GFP発現は、VChD12GFPと比較して、VCh119GFP感染THP1細胞において、24時間後および48時間後に加速された(図9B)。VChD12GFPと比較してこれらの上昇した導入遺伝子レベルを考慮すると、OF119に挿入された導入遺伝子はTHP-1細胞においてD遺伝子座によってコードされるものよりも強く発現されるのに対して、ORF119の欠失はvegf遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子の発現を促進するように思われた。
結論として、発現強度の分析は、ORF119の欠失およびgfpによるその置換が、vegf遺伝子座に挿入された導入遺伝子の発現の変化を引き起こすことを示す。したがって、参照ウイルスによる感染と比較して、VCh119GFP感染時にVeroおよびTHP-1細胞において同等またはより高い発現レベルが達成され得るので、ORF119の欠失は、挿入された導入遺伝子の発現動態に影響を及ぼすように思われた。
(新たなDel部位組換え体による感染によるヒトPBMCsの活性化)
以前に、Muellerら(2019年、準備中)は異なる導入遺伝子をコードするD1701-V ORFV組換え体の取り込みが、抗原提示細胞(APCs)の活性化を変化させることができることを示すことができた。したがって、PBMCsを8人の健康なドナーの血液から単離し、新たなDel部位組換え体VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPで24時間インビトロ感染させた。単球は、ORFV D1701-Vを取り込むためのPBMCs内の唯一の細胞集団であるので、CD14+PBMC集団におけるmCherry発現によって感染率を決定した。1人のドナー内で最も同等に感染した単球を示す試料を分析した。24時間後、PBMCsを回収し、表面マーカー特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって、CD4+およびCD8+T細胞、CD14+単球、CD19+B細胞およびCD56+NK上で活性化マーカーCD69の発現を決定した。
以前に、Muellerら(2019年、準備中)は異なる導入遺伝子をコードするD1701-V ORFV組換え体の取り込みが、抗原提示細胞(APCs)の活性化を変化させることができることを示すことができた。したがって、PBMCsを8人の健康なドナーの血液から単離し、新たなDel部位組換え体VCh119GFPおよび参照ウイルスVChD12GFPで24時間インビトロ感染させた。単球は、ORFV D1701-Vを取り込むためのPBMCs内の唯一の細胞集団であるので、CD14+PBMC集団におけるmCherry発現によって感染率を決定した。1人のドナー内で最も同等に感染した単球を示す試料を分析した。24時間後、PBMCsを回収し、表面マーカー特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって、CD4+およびCD8+T細胞、CD14+単球、CD19+B細胞およびCD56+NK上で活性化マーカーCD69の発現を決定した。
新たなDel部位組換え体VCh119GFPと、参照としてVChD12GFPと、を用いた感染時のPBMC活性化に関する分析を図10に示す。図10Aに図示する平均感染率は約20%~25%の範囲であるが、一方、異なるドナー間では10%~30%の範囲で高い変動が観察された。VCh119GFPに感染したCD19+B細胞の活性化は、参照ウイルスVChD12GFPと比較して上昇した。対照的に、CD4+、CD8+およびCD56+の活性化についての有意な差が、VChD12GFPおよびVCh119GFPに感染したPBMCsと比較して見出された。したがって、VChD12GFPと比較して、VCh119GFPに感染した群において、ほぼ2倍の量の細胞が、CD69を発現した(図10C)。図10Bに図示されるCD4+細胞におけるCD69の発現について、同様の結果が観察された。また、図10Bにおいて、VChD12GFPに感染した群と比較して、VCh119GFPに感染したPBMCsにおいて、有意に大きな集団が活性化された。ここで、集団は、VChD12GFPで処理したPBMCsと比較して5倍増加した。最後に、CD56+NK細胞集団もまた、VChD12GFPに感染したPMBCsと比較して、VCh119GFPによる感染時に、有意に強い活性化を明らかにした(図10E)。
新たなDel部位組換え体VCh119GFPの感染によるPBMCsの活性化について行った分析は、参照ウイルスVChD12GFPと比較して、活性化マーカーCD69を発現するCD4+およびCD8+T細胞ならびにCD19+B細胞およびCD56+NK細胞集団の拡大を明らかにした。
(ヒト抗原特異的メモリーCD8+T細胞のインビトロ増殖)
新たなDel部位組換え体VCh119GFPの免疫原性をインビトロでさらに研究するために、抗原特異的免疫応答を誘導するその能力を分析した。したがって、HLA-A*02拘束性EBV(BMLF1280-288GLCTLVAML)、インフルエンザA(MP58-66GILGFVFTL)、およびHCMV(pp65495-503NLVPMVATV)エピトープをコードする新たなDel部位組換え体を作製した。続いて、ヒトPBMCsから単離されたCD14+画分を、新たに作製された組換え体VHLA119GFPおよび参照ウイルスVHLAD12GFPに感染させるか、または対応する合成ペプチドの混合物(Pepmix)で刺激した。FACSを用いてmCherryまたはGFP発現によって感染率を決定し、1人のドナー内で同等のパーセンテージを示す単球を、24hpi後にPBMCsのCD14-画分と共培養した。抗原特異的CD8+T細胞の増殖ならびにそれらの機能性を、それぞれ、テトラマー染色および細胞内サイトカイン染色(ICS)を介して感染の12日後に決定した。非刺激CD14-画分をネガティブコントロールとして供し、合成の、GLCTLVAML、GILGFVFTL、およびNLVPMVATVペプチドの混合物を用いた刺激をポジティブコントロールとした。さらに、CD14-画分をD12-Cherry感染CD14+細胞で刺激して、抗原を有さないORFV D1701-VがT細胞の増殖および機能性に及ぼす影響を研究した。
新たなDel部位組換え体VCh119GFPの免疫原性をインビトロでさらに研究するために、抗原特異的免疫応答を誘導するその能力を分析した。したがって、HLA-A*02拘束性EBV(BMLF1280-288GLCTLVAML)、インフルエンザA(MP58-66GILGFVFTL)、およびHCMV(pp65495-503NLVPMVATV)エピトープをコードする新たなDel部位組換え体を作製した。続いて、ヒトPBMCsから単離されたCD14+画分を、新たに作製された組換え体VHLA119GFPおよび参照ウイルスVHLAD12GFPに感染させるか、または対応する合成ペプチドの混合物(Pepmix)で刺激した。FACSを用いてmCherryまたはGFP発現によって感染率を決定し、1人のドナー内で同等のパーセンテージを示す単球を、24hpi後にPBMCsのCD14-画分と共培養した。抗原特異的CD8+T細胞の増殖ならびにそれらの機能性を、それぞれ、テトラマー染色および細胞内サイトカイン染色(ICS)を介して感染の12日後に決定した。非刺激CD14-画分をネガティブコントロールとして供し、合成の、GLCTLVAML、GILGFVFTL、およびNLVPMVATVペプチドの混合物を用いた刺激をポジティブコントロールとした。さらに、CD14-画分をD12-Cherry感染CD14+細胞で刺激して、抗原を有さないORFV D1701-VがT細胞の増殖および機能性に及ぼす影響を研究した。
感染の24時間後、単球の平均感染率は約10%~15%であったが、ドナー間で高い変動が見られ、5%~25%の範囲のパーセンテージとなった(図11A)。12日後、T細胞の増殖をテトラマー染色によって測定し、それらの機能性をICSによって分析した。テトラマー染色は、HLA-A*02拘束性EBV、インフルエンザA、およびHCMVペプチドをコードするORFV D1701-V組換え体、またはPepmixによる刺激が、抗原特異的CD8+T細胞増殖を引き起こすことを明らかにした。ドナーは全てのペプチドに対してメモリーT細胞を有しており、興味深いことに、CD8+T細胞の増殖は、当該全てのペプチドに対して誘導することができた。いずれかのペプチドに特異的なCD8+T細胞の平均頻度、ならびに12日間の増殖後に各ドナーについて得られた平均頻度を図11Bに示す。異なるドナーからのT細胞応答の高い変動を検出することができた。したがって、ドナー#186は刺激後に約55%の抗原特異的CD8+T細胞頻度を示したが、ドナー#016については10%のCD8+T細胞のみを増殖させることができた。それにもかかわらず、欠失変異体VHLA119GFPによって引き起こされたT細胞応答は、参照ウイルスVHLAD12GFPと比較して平均1.4倍増加し、いずれかのペプチドに特異的なCD8+T細胞の約35%を示した。
さらに、各ペプチドに特異的なメモリーT細胞の増殖について行われた分析は、ペプチド特異的CD8+T細胞の平均頻度が、参照ウイルスVHLAD12GFPによる刺激と比較して、VHLA119GFP感染単球による刺激によって1.3倍有意に上昇し得ることを示した(図12A)。GLCTLVAML、GILGFVFTL、またはNLVPMVATVによる再刺激後のメモリーT細胞の機能性に関する分析は、Pepmixで刺激されたCD8+T細胞の約5%における炎症誘発性サイトカインTNFαおよびIFNγの産生を示す(図12B)。ここで、CD8+T細胞の機能性は、参照ウイルスVHLAD12GFPに感染した単球によって刺激されたものと比較して2倍有意に低下し、これは、10%の平均の多機能CD8+T細胞の割合を示した。注目すべきことに、VHLA119GFP感染単球で刺激されたT細胞の機能性は、VHLA119GFP群のT細胞で有意に増強され、参照群のT細胞より1.4倍高い機能性を示した。
結論として、HLA-A*02拘束性EBV、インフルエンザA、およびHCMVエピトープをコードするDel部位組換え体VHLA119GFPの免疫原性を、12日後に機能性CD8+メモリーT細胞の増殖を誘導するその能力によってインビトロで分析した。以上の結果を総合すると、抗原特異的CD8+T細胞の頻度は、Del部位組換え体VHLA119GFPに予め感染させた単球によるT細胞の刺激によって上昇させることができた。一貫して、これらのT細胞の機能性も、平均で、炎症誘発性サイトカインTNFαおよびIFNγの同時発現によって測定される最も高い多機能性を示した。したがって、ORF119の欠失は、ORFV1701-V組換え体によって引き起こされる抗原特異的細胞性免疫応答の強度にポジティブな影響を示し得る。
(SARS-CoV-2 ORFV組換え体のインビボ免疫原性)
スパイク(S1)および核タンパク質(N)をコードするSARS-CoV-2 ORFV組換え体の免疫原性を、2回の筋肉内(i.m.)免疫後の非近交系CD1マウスにおいて比較した。ブースター免疫後、すべてのワクチン群で高力価のN-およびS1-抗原特異的結合抗体が検出された(図13)。ORF119欠失を有する組換え体ベクターは、コントロールのORFVと比較して、有意に高いN-特異的抗体応答を引き起こした(図13A)。S1-特異的IgGエンドポイント力価についても同様の傾向が観察された(図13B)。
スパイク(S1)および核タンパク質(N)をコードするSARS-CoV-2 ORFV組換え体の免疫原性を、2回の筋肉内(i.m.)免疫後の非近交系CD1マウスにおいて比較した。ブースター免疫後、すべてのワクチン群で高力価のN-およびS1-抗原特異的結合抗体が検出された(図13)。ORF119欠失を有する組換え体ベクターは、コントロールのORFVと比較して、有意に高いN-特異的抗体応答を引き起こした(図13A)。S1-特異的IgGエンドポイント力価についても同様の傾向が観察された(図13B)。
〔5.概要〕
まとめると、新たなDel部位組換え体について実施された分析は、ORF119ノックアウトをORFV D1701-Vゲノムに組み込むことによって、多価、単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。ORF119の欠失およびそれぞれのDel部位へのレポーターコンストラクトGFPの同時組み込みは、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に対する顕著な免疫原性特性にも起因した。したがって、ORF119は、網膜芽細胞腫タンパク質pRBと相互作用し、それゆえ、TNFα誘導性IKK活性化およびNF-κBシグナル伝達を阻害することが報告されているが(Nagendraprabhu, P., et al, l.c.)、一方、より最近の報告は、細胞増殖およびウイルス粒子の放出を促進するためのアポトーシスにおけるその関与を公表している(Li, W., et al., l.c.)この研究は、インビトロにおける、CD4+およびCD8+T細胞並びにNK細胞活性レベルの上昇、並びに、抗原特異的CD8+T細胞応答の増強と多機能性との誘導を、明らかにした。興味深いことに、ORF119ノックアウト変異体に感染した群における生存細胞の割合が、アポトーシスの誘導におけるORF119の関与を支持する他の群と比較して、上昇した(Li, W., et al., l.c.)。この有望な変異体の免疫原性に関する最初のインビボ研究は、さらに、ORF119の欠失が、非近交系CD1マウスにおいて、コードされた抗原NおよびS1に対する抗体力価の増強をもたらすことを明らかにした。したがって、本研究の知見は、いくつかの抗原および免疫調節エレメントを同時に発現するORF119欠失を有する組換え体が強力で、持続的かつ効率的な細胞性および体液性免疫応答の誘導をもたらす、好ましい特性を有するORFV D1701-Vベクターワクチンの作製のための道を開き得る。
まとめると、新たなDel部位組換え体について実施された分析は、ORF119ノックアウトをORFV D1701-Vゲノムに組み込むことによって、多価、単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。ORF119の欠失およびそれぞれのDel部位へのレポーターコンストラクトGFPの同時組み込みは、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に対する顕著な免疫原性特性にも起因した。したがって、ORF119は、網膜芽細胞腫タンパク質pRBと相互作用し、それゆえ、TNFα誘導性IKK活性化およびNF-κBシグナル伝達を阻害することが報告されているが(Nagendraprabhu, P., et al, l.c.)、一方、より最近の報告は、細胞増殖およびウイルス粒子の放出を促進するためのアポトーシスにおけるその関与を公表している(Li, W., et al., l.c.)この研究は、インビトロにおける、CD4+およびCD8+T細胞並びにNK細胞活性レベルの上昇、並びに、抗原特異的CD8+T細胞応答の増強と多機能性との誘導を、明らかにした。興味深いことに、ORF119ノックアウト変異体に感染した群における生存細胞の割合が、アポトーシスの誘導におけるORF119の関与を支持する他の群と比較して、上昇した(Li, W., et al., l.c.)。この有望な変異体の免疫原性に関する最初のインビボ研究は、さらに、ORF119の欠失が、非近交系CD1マウスにおいて、コードされた抗原NおよびS1に対する抗体力価の増強をもたらすことを明らかにした。したがって、本研究の知見は、いくつかの抗原および免疫調節エレメントを同時に発現するORF119欠失を有する組換え体が強力で、持続的かつ効率的な細胞性および体液性免疫応答の誘導をもたらす、好ましい特性を有するORFV D1701-Vベクターワクチンの作製のための道を開き得る。
〔6.配列〕
配列番号1:eP1プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号2:eP2プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号3:「最適化された初期」プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号4:7.5kDaのプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号5:VEGFプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号6:D1701-V ORF118-119-120(nt1-2380)のヌクレオチド配列
ORF118:nt1-306
ORF119:nt716-1324
ORF120:nt1778-2377
配列番号7:ヌクレオチド配列pDel119-2-AcGFP(nt1-1962)
HL(ホモログの左腕)ORF118:nt1-480
初期プロモーターeP2:nt664-700
AcGFP:nt732-1447
HR(ホモログの右腕)ORF120:nt1520-1962
配列番号8:ヌクレオチド配列pDel119(nt1-1037)
HL(ホモログの左腕)ORF111:nt1-480
HR(ホモログの右腕)ORF113:nt595-1037
配列番号1:eP1プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号2:eP2プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号3:「最適化された初期」プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号4:7.5kDaのプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号5:VEGFプロモーターのヌクレオチド配列
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ORF118:nt1-306
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HR(ホモログの右腕)ORF113:nt595-1037
Claims (15)
- 「NF-κBインヒビター」をコードするウイルスオープンリーディングフレーム(ORF)中に少なくとも1つの機能的変異を含む改変パラポックスウイルスであって、前記ウイルスは、前記機能的変異を有さない同一のベクターと比較して増加した免疫原性を含む、改変パラポックスウイルス。
- 前記機能的変異は、非変異NF-κBインヒビターよりもNF-κBインヒビターの活性の低下をもたらす、請求項1に記載の改変パラポックスウイルス。
- パラポックスウイルスベクターである、請求項1または2に記載の改変パラポックスウイルス。
- 前記パラポックスウイルスはParapoxvirus ovis(Orfウイルス、ORFV)であるか、または前記パラポックスウイルスベクターはORFVベクターである、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
- 前記ORFVは、D1701株、好ましくはD1701-V株のものである、請求項4に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
- 前記NF-κBインヒビターは、ウイルスオープンリーディングフレーム119(ORF119)によってコードされ、好ましくは、前記ORFは、ヌクレオチド位置nt14.344±100~nt14.952±100に位置している、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
- 以下をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター:
(1)導入遺伝子をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、および
(2)前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも1つのプロモーター。 - 前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、前記NF-κBインヒビターをコードするウイルスORFに挿入されており、または/および、前記NF-κBインヒビターをコードするウイルスORFは、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている、請求項6に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルス。
- 導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を2つ以上含み、好ましくは導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の数は、2、3、4、またはそれ以上からなる群から選択される、請求項6~8のいずれか一項に記載のパラポックスウイルスベクター。
- 前記プロモーターは、初期ORFVプロモーターである、請求項6~9のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
- 前記初期ORFVプロモーターは、配列番号1(eP1)、配列番号2(eP2)、配列番号3(「最適化された初期」)、配列番号4(7.5kDaプロモーター)、および配列番号5(VEGF)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
- 前記導入遺伝子は、以下の抗原の群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター:
-ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク(S)、エンベロープ(E)、およびヌクレオカプシド(N)タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)抗原;
糖タンパク質(RabG)を含む、狂犬病ウイルス抗原;
核タンパク質(NP)、血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)を含む、A型インフルエンザ抗原;
-腫瘍抗原、好ましくはHPV選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原;
-HPV選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原;
-寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原;
-サイトカイン;
-哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する(originated)か、または由来する(derived)、タンパク質。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを含む、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはVero細胞、HEK293細胞、または抗原提示細胞。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスもしくはパラポックスウイルスベクター、または/および、請求項13に記載の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物、好ましくはワクチン。
- 生物、好ましくは哺乳動物またはヒトにおける免疫応答の誘導のための、「NF-κBインヒビター」をコードするウイルスオープンリーディングフレーム(ORF)中に少なくとも1つの機能的変異を含む改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの、使用。
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