JP6294890B2 - ヒトサイトメガロウイルス感染に対する組換え粒子ベースのワクチン - Google Patents
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Description
図1は、ヘルペスウイルスまたは非ヘルペスウイルスのキャプシドのどちらかをベースとしたCMVウイルス様粒子の異なる変異体を発現させるための、またはCMV−五量体複合体および可溶性CMVタンパク質を発現させるための組換えベクターの概略図である。
(A)グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製。タウン株からのキャプシド、機能的な外被および表面タンパク質であるUL86−UL85−UL50−UL48A−UL46−UL74(gO)−UL83−UL80.5−UL75(gH)−UL115(gL)−UL128(c)−UL130−UL131A(配列番号7および配列番号14)を含むCMV−VLP変異体の様々な画分を、SDS−PAGE(4〜12%ビストリスゲル)、続いて免疫ブロッティングによって分析した。外被タンパク質の検証のためにマウス抗pUL83(ウイルシー(Virusy))抗体を使用した。左側に、タンパク質標準をkDaで示す;レーン1〜13:画分1〜13(上から下への精留)、レーン14:陽性対照。
キャプシドタンパク質であるUL86およびUL85、外被タンパク質であるUL83(UL83)および表面タンパク質であるUL75(gH)に特異的な抗体を使用したELISAアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシド(UL86、UL85)、外被(UL83)、および表面タンパク質であるUL75(gH)の存在は、選択されたタンパク質(UL86、UL85、gH1:アラバマ大学から提供された抗体、UL83:ウイルシー;gH2:サンタクルーズ)への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質gp64に対する抗体(eバイオサイエンス)を用いて検証した。x軸の番号1〜13は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号を示し(上から下へ分画される)、番号14は陽性対照を示し、番号15は陰性対照を示す。y軸では、VLPにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度(OD)として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のCMV−VLPであることが示された。
キャプシドタンパク質(UL85)、外被(UL83)、および表面(UL75(gH)、UL55(gB))タンパク質に特異的な抗体を使用したELISAアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシド(UL85)、外被(pUL83)、および表面タンパク質(gpUL75、gpUL55)の存在は、選択されたタンパク質(UL85/UL55(gB1):アラバマ大学;UL83/UL55(gB2):ウイルシー;UL75(gH):サンタクルーズ)への抗体結合により示すことができる。x軸の番号1〜7は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号画分1〜7を示し(上から下へ分画される)、番号8は陰性対照を示す。y軸では、VLPにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度(OD)として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のCMV−VLPであることが示された。配列番号3を配列番号9、10、16または19と組み合わせることによって同じ無傷の組成物が観察され、ここでOD値の検出は0.1〜0.4の範囲で異なっている。
外被(UL83)、および表面(UL75、UL55)タンパク質に特異的な抗体を使用したELISAアッセイによる免疫ブロットデータの検証。外被タンパク質(UL83)および表面タンパク質(UL75、UL55)の存在は、選択されたタンパク質(UL83/UL55(gB):ウイルシー;UL75(gH):サンタクルーズ)への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質gp64に対する抗体(eバイオサイエンス)を用いて検証した。x軸の番号1は、スクロースクッションによる予備精製のサンプルを示し、x軸のレーン2〜14は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号画分1〜13を示し(上から下へ分画される)、番号15はVLPのための陰性対照を示し、番号16はバキュロウイルスのための陰性対照を示す。y軸では、VLPにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度(OD)として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のCMV−VLPであることが示された。キャプシドおよび外被に関しては配列番号2、表面タンパク質に関しては配列番号9、10、16または19で構成されたCMV VLP変異体の場合と同様に、上述したのと同じタンパク質をOD値0.1〜0.3の範囲で検証することができた。
(A)キャプシド、機能性タンパク質、外被タンパク質、および表面タンパク質であるUL86−UL85−UL50−UL48A−UL46−UL83−UL80.5−UL74−UL75−UL115−UL128(c)−UL130−UL131A(配列番号7および配列番号10)を含む組換えヒトCMV−VLPの、蛍光体のタングステン酸を用いた陰性染色による電子顕微鏡写真。スケールバーは100nmに対応する。
図14は、配列番号59に基づく体液性免疫反応を検証するための中和アッセイを示す図である。
図15は、可溶性複合体およびreVLP(組換えVLP、配列番号18を有する配列番号22)を含有するワクチン候補の1つの構成要素(可溶性複合体、配列番号59)の品質管理を示す図である。
指定されたタンパク質の共存に関して、異なる溶出画分をテストした。コンフォメーション依存性抗体(UL130/UL131A)でサンプルを捕捉したところ、表面タンパク質であるUL130およびUL131Aは天然のコンフォメーションで存在することが示された。検出には、抗gH(UL75)、抗gpUL83(pp65)、および抗キャプシド(gag)抗体を使用した。シグナルからVLP上でのタンパク質の共存が確認され、いくつかのサンプルにおけるテストしたタンパク質の富化が解明される。
図18は、サンドイッチELISAアッセイを用いた非ヘルペスベースのCMV−VLP(配列番号18と組み合わされた配列番号22)の精製プロセスの特徴付けを示す図である。シグナルからVLP上でのタンパク質の共存が確認され、使用された膜吸着体(c2)のより優れた性能が解明される。
図19は、サンドイッチELISAアッセイを用いたヘルペスベースのCMV−VLPの特徴付けを示す図である。
非ヘルペスウイルスベースのCMV VLP(配列番号19と組み合わされた配列番号22)、ヘルペスウイルスベースのCMV VLP(配列番号19と組み合わされた配列番号48)、および可溶性複合体(配列番号59)を、CMV陽性ドナーからのヒト抗体と反応するそれらの能力に関してサンドイッチELISAアッセイでテストして、インビボでの実験を模擬した。異なるCMVタンパク質(gH、gB、UL83、UL85、UL86およびコンフォメーションベースのUL130/UL131A)、Gag、およびHisに対応する抗体でプレートをコーティングした。プレートを可溶性五量体複合体またはVLPのいずれかと共にさらにインキュベートし、その後、CMV陽性ヒト血清(HIV陰性ドナー)で処置した。HRPで標識されたヒト二次抗IgGを検出に使用した。
本発明は、抗HCMVワクチンとして使用するための、抗HCMV処置における治療抗体を開発するための、診断ツールとして、および研究開発ツールとしての新規のウイルス様粒子に関する。本発明は、体液性および細胞性免疫応答を引き起こす非感染性の組換えCMV粒子を生成するいくつかの可能性を説明している。望ましい特性を有する生成物を得るために、様々なタンパク質の組み合わせが作製される。より具体的には、本発明は、異なるタンパク質組成物の多成分VLP変異体および組み合わせ、例えばVLP、タンパク質複合体、可溶性タンパク質、ならびに/またはDNAベースの組成物、例えばベクターならびにペプチドなどに的を絞っている。
本発明は、1種またはそれより多くのキャプシドまたはキャプシド前駆タンパク質、サイトメガロウイルス(CMV)からの3種またはそれより多くの異なる表面タンパク質、および場合により1種またはそれより多くの外被タンパク質を含む組換えウイルス様粒子に関する。
本発明の他の実施態様において、VLPは、コイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合した少なくとも2種の異なるタンパク質を含み、ここでコイルドコイルモチーフは、ジッパー機能を有し、対応するモチーフを有する前記少なくとも2種のタンパク質を連結するコイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合している。コイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合した好ましいタンパク質は、キャプシドタンパク質のうち1種、好ましくはUL86、および表面タンパク質のうち1種、好ましくはgpUL75であり、それにより構築物を支持して機能的なVLPを形成し、表面上の免疫原性タンパク質の量を増加させることができる。
a.単一のCMV株または非ヘルペスウイルス株からの1種のキャプシドタンパク質;
b.単一のCMV株からの2種またはそれより多くのキャプシドタンパク質のミックス;
c.異なるCMV株からの2種またはそれより多くのキャプシドタンパク質のミックス;
d.単一のCMV株からの1種のキャプシド、1種の外被および1種の表面タンパク質の組み合わせ;
e.異なるCMV株からの1種のキャプシド、1種の外被および1種の表面タンパク質の組み合わせ;
f.単一のCMV株からの1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質;1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
g.異なるCMV株からの1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質;1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
h.追加のT細胞エピトープを含む、1種またはそれより多くのCMV株からの1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
i.免疫回避に関与するタンパク質を排除した、1種またはそれより多くのCMV株からの、1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
j.MHCIおよびMHCII発現の阻害に関与するタンパク質を排除した、1種またはそれより多くのCMV株からの1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;および
k.CD40L、CD19L、サイトカインおよび非メチル化CpGモチーフからなる群より選択される免疫反応を強化するタンパク質および/またはモチーフをさらに含む、1種またはそれより多くのCMV株からの1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
l.例えばHis−タグ、ストレプトアビジン−タグ、myc−タグ、フラグ−タグ、およびSnap−タグからなる群より選択される精製および分析を容易にするタンパク質、ならびに例えばGFP、YFPおよびレッドチェリー(Red-cherry)からなる群より選択される蛍光タンパク質を有する、1種またはそれより多くのCMV株からの、1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ;
m.化学物質および/または不活性なナノビーズとカップリングするためのさらなるタンパク質様構造または非タンパク質構造を含む、1種またはそれより多くのCMV株からの、1種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、1種またはそれより多くの外被タンパク質、および1種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ。
BEVS系のための発現コンストラクトを生成するためには、好ましくは、大腸菌(E. coli)および酵母(例えばサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisae))で増殖させるための要素、ならびに昆虫細胞でタンパク質発現させるための用途を含有するベクター主鎖pRBT136が使用される。
本明細書で説明されるCMV粒子は、超遠心分離法ベースの典型的なグリセロール−酒石酸塩およびスクロースの濃度勾配、または現代のクロマトグラフィーベースの技術、好ましくは、膜吸着体およびモノリスなどの大きい多孔質マトリックスを使用した親和性(アイマック)およびイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
BEVS系のための発現コンストラクトを生成するために、大腸菌および酵母(例えばサッカロミセス・セレビジエ)で増殖させるための要素、ならびに昆虫細胞でタンパク質発現させるための要素を含有するベクター主鎖pRBT136が使用された。様々なVLP変異体に応じて、キャプシド、外被および表面タンパク質が提供されるように異なる遺伝子を選んだ。
略語:c:コンセンサス配列;H:His−タグ;SH:ストレプトアビジン−His−タグ;V:VR1814、pcI:プレシジョンプロテアーゼ、pcII:プレシジョンおよびTEVプロテアーゼ、DT:二量体化ツール。表1に記載の遺伝子の説明については、より短いHCMV学術名(gB、gH、gL、gO、加えて接頭辞のない「UL」、および接尾辞「A」のないUL48)を使用した。
発現ベクターpRBT136CMV−1;pRBT136CMV−8、およびpRBT136CMV−20を得るために、対象の各遺伝子、すなわちUL86、UL55(gB)、およびgagを、BamHI(5’)およびHindIII(3’)での消化および同じ酵素で切断した主鎖pRBT136へのライゲーションによってpBluescriptベクターからサブクローニングした。20μlの総体積中の2μgの切断されたpRBT136、10μgのフラグメント、および1μlのT4−リガーゼ(NEB)を用いてライゲーションを行い、続いて実施例1で説明されているようにしてコンピテントXL−1ブルー細胞での形質転換を行った。
CMV−VLPを生成するためのキャプシド変異体pRBTCMV−2の発現コンストラクトを得るために、UL86を含有する発現カセットとUL83を有する別の発現カセットとを、実施例1で説明されているようにして並行して構築した。フォワードプライマーとしてRBT204(TGCTGCCCACCGCTGAGCAATAACTATCATAACCCCCGGAATATTAATAGATCATGG、配列番号65)およびリバースプライマーとしてRBT189(GTAGCGTCGTAAGCTAATACG、配列番号66)を使用して実施例2で説明されているようにしてライゲートすることにより、PCR産物をライゲートしてUL80.5発現カセットの統合を行った。
キャプシド変異体pRBTCMV−3のための発現コンストラクトを生成するために、変異体pRBTCMV−2のプラスミドを制限酵素AvrIIで切断した。遺伝子UL85を有する発現カセットをプライマーpRBT526(5’)およびpRBT189(3’)で増幅し、実施例1で説明されているような相同組換えによってプラスミドpRBTCMV−2に導入した。
系統的な最適化(実施例1)の後に規定されたタンパク質発現パラメーターに従って、UL86−UL85−UL50−UL48−UL46−UL83−UL80.5−UL74−gH−gL−UL128−UL130−UL131Aを含むウイルス様粒子(VLP)を、使い捨ての1L振盪フラスコ(培養体積300mL)中で、それぞれ複数の遺伝子を含有する2種のバキュロウイルス(配列番号5および配列番号12)の共感染によりヨトウムシ(fall army worm)であるスポドプテラ・フルギペルダの細胞(Sf9)で生産した。生産パラメーターは以下の通りであった:感染時の最初の細胞数(CCI)は2×106細胞/mlであり、各ウイルス0.2pfu/mlの場合の重複感染度(MOI)は0.4pfu/mlであり、インキュベートは27℃で100rpmであった。感染後(p.i.)の3日目に生存率約80%で回収を行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率の決定により生産を制御した。分子量カットオフ(MWCO)が100kDaであり、フィルター領域が80ml/分の流速で0.02m2であり(ザルトリウス・ステディム)、膜貫通圧力が1〜1.5barのハイドロサート・サートコン・スライス(Hydrosart Sartocon Slice)200カセットにより接線流ろ過を使用して、VLPを含有する上清を3倍濃縮した。2工程のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配超遠心分離によって保持液を精製した。第一の工程において、25mlの保持液を、6mLの30%スクロースクッション(w/v、50mMトリス、100mMのNaCl、pH7.4)上に載せ、SW28ローターを使用して、16000rpmおよび16℃で1.5時間ペレット化した。ペレットを0.5mlのTN緩衝液(50mMトリス、100mMのNaCl、pH7.4)に再懸濁した。グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配(15〜35%酒石酸塩と混合した30%グリセロール、体積12ml)を調製し、0.5mlの精製前の材料に重ね合わせ、SW41ローターを使用して24000rpmおよび16℃で16時間遠心分離した。濃度勾配を上から0.9ml量で分画し、精製したVLPを生化学的方法によって分析した。製造元のプロトコールに従って150μlの異なる濃度勾配画分を4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)にローディングし、MOPS泳動緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン(SimplyBlue SafeStain)試薬(インビトロジェン)で一晩染色し、水で脱色した。
系統的な最適化(実施例1、VLPに関して)に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターによれば、使い捨ての2L振盪フラスコ(培養体積700ml)中で、単一のバキュロウイルス(配列番号59)からの共発現により、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞(Sf9)でgpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体のCMV複合体を生産した。生産パラメーターは以下の通りであった:感染時の最初の細胞数(CCI)は2×106細胞/mlであり、重複感染度(MOI)は0.25pfu/mlであり、インキュベートは27℃で100rpmでなされた。感染後(p.i.)の3日目に生存率約80%で回収を行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率の決定によって生産を制御した。複合体を含有する上清を、2×5mlのHisTrapカラム(GEヘルスケア(GE Healthcare))にローディングした。カラム体積の50倍量(CV、500mlと等量)でゼロから500mMの直線的な濃度勾配のイミダゾールを使用して複合体を精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学的方法によって分析した。150μlの様々な画分をアセトンで沈殿させて、30μlの20mMトリス,150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)にローディングするために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPS泳動緩衝液を使用して150Vで15分および180Vで45分電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で一晩染色し、水で脱色した。濃縮しさらに精製するために、2回目のアイマッククロマトグラフィーを、1mlのHisTrapカラムを使用して、50のカラム体積にわたり0から500mMのイミダゾールの直線的な濃度勾配によって行った。1回目のアイマック工程と同様にクーマシー染色されたSDS−PAGEおよび抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって様々な画分を分析した。全ての複合体を含有する分画をプールし、濃縮して、50kDaカットオフのアミコン(Amicon)フィルターユニット(ミリポア(Millipore))を使用して5mlの最終容量にし、最終的な精製工程のためにサイズ排除カラム(XK16/69、スーパーデックス200pg)にローディングし、SDS−PAGE、続いてクーマシー染色および抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。総タンパク質を、96ウェルプレートの様式に合わせたブラッドフォードアッセイ(BCA、ピアース)によって決定した。20μlの未知のサンプルまたは標準サンプルを180μlの緩衝液で希釈した。標準サンプルで3連で(純粋なウシ血清アルブミン)または未知のサンプルで連続2倍希釈を行った。ウェルごとに100μlの2×ストックブラッドフォード試薬(ピアース)を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーで595nmで吸光度を測定した。クロマトグラフベースの精製からの様々な画分中に含有される五量体のCMV複合体をさらに、gpUL75に付加されたHis−タグ(gH、マウス抗His、AbDセロテック)およびgpUL75それ自身(gH、マウス抗gH、サンタクルーズ)に特異的な抗体の結合を調査することによって分析した。したがって異なるサンプルを、96ウェルの吸着処理済みELISAプレート中で、100μl/ウェルのコーティング緩衝液(0.1MのNa2HPO4、pH9)で1:10希釈し、4℃で一晩インキュベートした。その後プレートを195μl/ウェルの洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%トウィーン20)で3回洗浄し、続いて1×PBS溶液中の3%BSAを195μl/ウェルで用いて室温で1時間ブロックした。3回洗浄工程を行った後、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7中1μg/mlの濃度で特異的な抗体、抗His抗体(抗His)、加えて抗gpUL75(抗gH)を添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートし、続いてさらに3回の洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体(抗マウス−IgG−HRP、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7での1:1000希釈液)と共に1時間インキュベートした。五量体複合体への特異的な抗体の結合を、100μl/ウェルのTMP基質試薬(BDバイオサイエンス、米国サンディエゴ;製造元のプロトコールに従った)を使用して検出し、その後、3〜15分後に100μlの1MのHClを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで450nmでOD測定を行った。
精製されたVLPの形状を検証するために、電子顕微鏡法を行った。銅で被覆されたEMグリッド上で1滴10μlのVLPサンプルを10分インキュベートし、5μlの蛍光体のタングステン酸で5〜10分染色し、水で2回、1分脱色した。ワットマン(Whatman)ペーパーでグリッド上の液体を除去し、グリッドをJEOL3000顕微鏡に移し、粒子を調査しその写真を撮った。
結合アッセイとしてサンドイッチELISAを行い、異なるreVLP(組換えVLP)の表面タンパク質の存在および接近容易性を決定した。したがって3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7中1μg/mlの濃度で特異的な表面および/または外被抗体を、96ウェルの吸着処理済みELISAプレート中のコーティング緩衝液(0.1MのNa2HPO4、pH9)に添加し(100μl/ウェル)、4℃で一晩インキュベートした。その後プレートを195μl/ウェルの洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%トウィーン20)で3回洗浄し、続いて1×PBS溶液中の3%BSAを195μl/ウェルで用いて室温で1時間ブロックした。3回洗浄工程を行った後、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7中の1:10希釈液中の異なるVLPを添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄工程を行った後、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7中1μg/mlの濃度で特異的な抗体、抗表面抗体(抗gH、抗gB)、加えて抗外被抗体(抗UL83)を添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートし、続いてさらに3回の洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体(抗マウス−IgG−HRP、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7での1:1000希釈液)と共に1時間インキュベートした。VLPへの特異的な抗体の結合を、100μl/ウェルのTMP基質試薬(BDバイオサイエンス、米国サンディエゴ;製造元のプロトコールに従った)を使用して検出した。3〜15分後に100μlの1MのHClを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで450nmでOD測定を行った。
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでBalb/Cマウスを使用した。各グループは8匹のマウスで構成され、各マウスに注射1回あたり20μgのタンパク質を与えた。組み合わせるために(CMV−reVLP+五量体複合体)、総量40μgのタンパク質を注射した。マウス検疫(0日目)の14日後に免疫前の血清を採取した。10日後に1回目の注射を行い、続いて42日目にブースター注射を行った。49日目に第一の採血を行った。61日目に2回目のブースター注射を行い、続いて70日目にさらなる採血を行った。85日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答を調査した。
実施例9からのマウス血清の中和アッセイによって、CMV陰性およびCMV陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較して、CMV−reVLP(vRBT−20)および五量体複合体(配列番号:59)の組み合わせをベースとしたワクチン候補の体液性免疫反応を調査した。分析上の理由(fix−EGFP)のためにGFP分子を有するBAC(細菌人工染色体)で再構成されたVR1814株を、線維芽細胞(MRC−5)および上皮(ARPE−19)細胞に感染させるために使用して、実施例9からのマウス血清の中和能を可視化した。10%FCS(ウシ胎児血清)を含有するRPMI培地中の96ウェルプレートに2×104細胞/ウェルを植え付けた。8匹のマウスの血清プールを作製し、これを、100μl/ウェルのRPMI/FCS培地中で、連続2倍希釈(1:20〜1:2560)で添加した。上述したfix−EGFP VR1814ウイルスを、予備アッセイで決定された1000ウイルス分子/ウェルの感染能のある用量(TCID)で組織培養に添加した。96ウェルプレートを、CO2制御された雰囲気中で37℃で8日間インキュベートした。プレートリーダーで、以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った:フルオレセイン−フィルター[励起485/20、放出530/25)、ボトムリーディングモード、時間:0.1秒、96時間インキュベート後に測定25回/ウェル。50%のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として中和効力を決定した。以下の対照:細胞対照(細胞+PBS)、ウイルス対照(感染させた細胞のみ)、ならびにヒト血液ドナーからの5種のCMV陽性および5種のCMV陰性血清を試験した。
インビボでの研究の85日目に(実施例9)、マウスを殺し、10種の異なるサイトカインを分析するために脾細胞を調製した。脾細胞の再刺激のために、CMV−reVLP、加えて合成ペプチドのミックスを使用した。以下のタンパク質を検証した:HIVgag、pUL83、gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL128、gpUL130、およびgpUL131A。数種のバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して各タンパク質のエピトープ予測を行った。脾細胞の再刺激のために、タンパク質ごとに4種のペプチドのミックスを作製した。HIVgagについては、市販の130種のペプチドのペプチドミックス(JPT、ベルリン)を使用した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、gCMSF、およびTNFアルファ)を、インビトロジェン製の多重アッセイキットによって、製造元のプロトコールに従い調査した。
ワクチンの一部としての様々なCMV VLPおよび可溶性複合体を特徴付けるために、サンドイッチELISA様式での二重結合アッセイを行った。精製されたモノクローナル抗体とHCMV陽性血液ドナーの血清ミックス中に存在する抗体との組み合わせによって、様々なreVLPのキャプシド、外被および表面タンパク質の存在および接近容易性を調査した。したがって抗gH、抗gB、抗UL83、抗UL86、抗UL85、抗UL130/UL131A、抗gag、抗Hisなどの抗CMVモノクローナル抗体を、96ウェルの吸着処理済みELISAプレート(100μl/ウェル)中で、コーティング緩衝液(0.1、0.1MのNa2HPO4、pH9)で最終濃度1μg/mlに希釈し、4℃で一晩インキュベートした。その後プレートを195μl/ウェルの洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%トウィーン20)で3回洗浄し、続いて1×PBS溶液中の3%BSAを195μl/ウェルで用いて室温で1時間ブロックした。3回洗浄工程を行った後、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7で1:10に希釈された様々なCMV VLPおよび可溶性複合体を添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄工程を行った後、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7で1:300に希釈された4種のCMV陽性ヒト血清のミックスを添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートし、続いてさらに3回の洗浄工程を行った。
異なるCMV−reVLP変異体を実施例5で説明されているようにして生産し、スクロースクッションベースの超遠心分離法によって濃縮した。25mlの細胞培養上清を、6mLの30%スクロースクッション(w/v、50mMトリス、100mMのNaCl、pH7.4)上に載せ、SW28ローターを使用して20,000rpmおよび16℃で1.5時間ペレット化した。ペレットを0.2〜0.4mlのTN緩衝液(50mMトリス、100mMのNaCl、pH7.4)に再懸濁した。50μlの再懸濁したペレットを、製造元のプロトコールに従って4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)上にローディングし、MOPS泳動緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで60分間泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で一晩染色し、水で脱色した。
Claims (11)
- 少なくとも2種のキャプシドタンパク質pUL86およびpUL80.5、
サイトメガロウイルス(CMV)からの少なくとも5種の表面タンパク質、その中に、少なくとも表面タンパク質gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL128、gpUL130、およびgpUL131Aが存在する、および
少なくとも外被タンパク質pUL83
を含む、組換えウイルス様粒子。 - 配列番号2、3、5、7のいずれか一つと、配列番号9−18のいずれか一つの組み合わせによりコードされるタンパク質を含む、請求項1に記載のウイルス様粒子。
- 請求項1または2に記載のウイルス様粒子中に含まれるタンパク質をコードするDNA。
- 請求項3に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4に記載のバキュロウイルスベクター。
- 請求項4または5に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1または2に記載の組換えウイルス様粒子を含むワクチン。
- gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130、およびgpUL131Aからなる五量体複合体をさらに含む、請求項7に記載のワクチン。
- gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL74、gpUL100、gpUL73、gpUL128、gpUL130、およびgpUL131Aからなる群より選択される可溶性CMVタンパク質をさらに含む、請求項7または8に記載のワクチン。
- pUL83、IE−1、pUL99、pUL91、pUL82、およびpp150からなる群より選択される可溶性CMVタンパク質をさらに含む、請求項7、8または9に記載のワクチン。
- タウン(Towne)、トレド(Toledo)、AD169、マーリン(Merlin)、TB20、およびVR1814株からなる群より選択される異なるCMV株からのCMVタンパク質を含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載のワクチン。
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