CN104853772A - 抗人巨细胞病毒感染的基于重组颗粒的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒样颗粒和蛋白复合物形式的新基因和蛋白组装体用作人巨细胞病毒(HCMV)和其他疱疹病毒的预防或治疗性疫苗以及诊断和R&D工具。所述病毒样颗粒包含一种或多种来自疱疹病毒或逆转录病毒的衣壳蛋白、3种或更多种CMV表面蛋白以及任选存在的间层蛋白。利用将重组DNA与一次性细胞培养和纯化技术相组合的技术制备所述组装体。

Description

抗人巨细胞病毒感染的基于重组颗粒的疫苗
技术领域
本发明涉及包含衣壳蛋白、巨细胞病毒表面蛋白和任选存在的间层蛋白的病毒样颗粒，以及抗人巨细胞病毒感染的疫苗。
背景技术
在世界各地和所有社会经济群体中均发现了人巨细胞病毒(HCMV)。其感染至少60％的成年人；在一些国家中，已达到100％地方性感染。通常感染在免疫正常的个体中是无症状的；有时，可以发生单核细胞增多症样疾病。感染总是导致建立终生潜伏，但可能间断重新激活。作为HCMV感染的结果，免疫缺陷的个体如治疗或医源性免疫抑制的移植/癌症患者、新生儿以及HIV患者存在显著的发病率和死亡率。
目前CMV感染的疗法是用抗病毒试剂如更昔洛韦(缬更昔洛韦)、膦甲酸、阿昔洛韦、西多福韦或来氟米特进行治疗。已批准这类抗病毒剂应用于移植受体和免疫低下的患者(例如HIV患者)，但是不可应用于孕妇。对于这些，优选高-免疫球蛋白疗法。此外，现有的抗病毒疗法在短时间内导致病毒抗性，或者在治疗期间无效(McGregor A.et al.,Expert Opin.DrugMetab.Toxicol.2011；7(10):1245-1265)。虽然已长时间研究巨细胞病毒感染，特别是先天性感染的预防，但是市场上没有得到许可的疫苗。美国医学研究所已确定预防性HCMV疫苗的开发为高优先级的目标(www.cdc.gov/cmv/overview.html,October 2011)。在先天性感染的婴儿中，关于子宫内传播，估计来自疫苗诱导的免疫的潜在益处为40倍，而关于中枢神经系统损伤的减少，估计为25-30倍(Britt W.J.et al.,Trends Microbiol.1996；4:34-38)。已努力超过30年开发疫苗。但是，到目前为止没有即将颁发的许可证出现，可能是由于丢失或不完整的临床研究数据。减毒活病毒方法或者尝试可溶性蛋白，特别是截短的gpUL55(gB)亚基疫苗与佐剂如MF59组合或不组合均未导致长期免疫应答(Zhang C.et al.,J.Clin.Virol2006；35:338-41)。正在研究达到更高效力的新方法，包括糖蛋白组合、基于DNA和肽的候选方法、致密体(WO2008/138590)以及基于病毒载体的候选方法如基于金丝雀痘病毒的可复制的Alvac-gpUL555(gB)疫苗(BernsteinD.I.et al.,J.Infect.Dis.2002；185:686-90)。Alvac疫苗(基于金丝雀痘的颗粒)联合减毒活病毒的临床试验的第一数据导致适当的免疫应答，但是长期效果仍在研究。由于它们的形状，病毒样颗粒可以具有于减毒疫苗相似的特性，因此是有希望的疫苗开发的选项，特别是因为一般接受它们作为优秀的疫苗媒介物。到目前为止，对CMV尚未开发病毒样颗粒。基于过去30年中抗HCMV疫苗开发获得的经验，应当满足以下目标：长期诱导中和抗体，诱导体液和细胞应答，特别是细胞毒性的T-细胞应答，以及最小化副作用。
目前开发的候选疫苗的失败或效力有限的原因是多方面的。宿主中保护性免疫的机制尚不明确。这个的主要原因之一是缺少能够验证负责保护的效应物的适当的动物模型。病毒进入包括上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经元和单核细胞/巨噬细胞在内的导致不同病理的不同细胞类型并复制的能力阻碍了确定有效的效应物。由于病毒的复杂性，并且缺少关于感染特定细胞类型所需的蛋白的知识，理想的HCMV疫苗的组成到目前为止尚不确定。
CMV为β-疱疹病毒，并且属于非常复杂的病毒目疱疹病毒目(Herpesvirales)。CMV病毒粒子直径为～230nm，由核壳组成，被较少结构的间层环绕，并且通过三层膜包膜分界。线性双链DNA分子(236kbp)在人疱疹病毒中是最大的，并且比单纯疱疹病毒1(HSV-1)大50％以上。除了病毒粒子，已从CMV-感染的细胞回收5种其他类型的细胞内的有包膜和无包膜的病毒颗粒。病毒成熟过程包括不同的衣壳类型，其中致密体(DB)可以在疫苗开发中起重要作用。致密体(DB)很大(～250-600nm)，并且是异质的。它们是不同蛋白的固体球状聚集体，包含间层蛋白(即pUL83)以及表面蛋白gpUL75(gH)和gpUL55(gB)(Becke S.et al.,Vaccine 2010；28:6191-6198)。HCMV蛋白的统一命名规则公开于Spaete R.et al.,1994,J.Gen.Virol.,75,3287-3308：每个鉴定的开放阅读框(ORF)的字母命名是基础，如果蛋白的磷酸化状态是未知的，通过前缀“p”来扩展，对于磷蛋白，前缀为“pp”，而对于糖蛋白，前缀为“gp”。小写字母命名用作后缀以命名编码蛋白的额外ORF。在本发明中，以前使用的命名在括号中示出，并且还在表和图中示出。
在HCMV结构糖蛋白中，到目前为止已鉴定了3个主要的复合物(命名为gCI-gCIII)。这些复合物在病毒结构中起不同作用，因此还用于疫苗的设计，作为开发治疗抗体的靶标，或者作为研究工具。糖蛋白B(gpUL55,gCI)作为单一可溶性蛋白并不导致长期的抗HCMV的免疫应答。因此，应当考虑包括gpUL55的其他蛋白组合物用于疫苗设计。正在研究gpUL100(gM)、gpUL73(gN)和形成的复合物gCII在产生中和抗体和作为疫苗的重要部分中的作用。gCIII的组分为gpUL75(gH)、gpUL115(gL)和gpUL74(gO)，形成异源三聚体的二硫键连接的复合物(Huber M.T.and Compton T.,J.Virol.1999；73(5):3886-3892)。这些蛋白在病毒进入以及与其他蛋白如gpUL128、gpUL130和gpUL131A的复合物形成中起最重要的作用。HCMV进入上皮细胞和内皮细胞包括胞吞作用以及gpUL75、gpUL115和gpUL74的复合物形成，或者gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131的组合的复合物形成(Wang D.and Shenk T.,PNAS 2005；102:18153-18158)。此外，这些蛋白负责HCMV从内皮细胞转移至白细胞，代表体内HCMV传播的主要决定因素。此外，这些蛋白看来在树突细胞(DC)的启动中起作用，因此是T-细胞介导的免疫应答的关键元素。CMV通过不同途径进入不同细胞类型。对于成纤维细胞进入，需要包含gpUL75/gpUL115(gH/gL)或gpUL75/gpUL115/gpUL74(gH/gL/gO)的复合物。这是pH依赖性的非内含体感染途径，其可以通过用基于Towne毒株或gpUL55(gB)佐剂(MF59)的疫苗免疫接种之后产生的中和抗体来阻断(Pass R.F.,J.Clin.Virol,2009；46(Suppl.4),S73-76)。第二个重要途径是上皮细胞和内皮细胞的内含体感染过程，其需要五聚体复合物gpUL75/gpUL115/gpUL128/gpUL130/gpUL131(gH/gL/UL128/UL130/UL131A)。这个感染途径可以通过靶向五聚体复合物的中和抗体来阻断(Manley K.et al.,Cell Host&Microbe 2011；10:197-209)。从目前的知识状态，需要上述蛋白的不同组合以产生刺激广泛的细胞和体液免疫应答的有效疫苗。但是，确切的组合是未知的。五聚体复合物的蛋白的重要性最近由Lilleri D.et al.,PLoS One,March 2013；8(3):e59863,1-13解决。
病毒样颗粒(VLP)是稳定的高度组织化的球，其自组装自病毒衍生的结构抗原，因此具有与亲代病毒相似的结构特征和抗原性。与减毒活病毒相反，重组VLP是安全和非感染性的，因为它们不含复制病毒DNA。因此，它们可以在生物安全1级下产生。
到目前为止，几种不同的病毒载体如腺病毒、逆转录病毒、金丝雀痘、痘苗病毒(痘病毒)和改良的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体用来表达外源抗原用于疫苗的药物开发(Wang Z.et al.,J.of Virology 2004；3965-3976；JieZhong et al.,Plos One2008；3(9):e3256)。上述载体中的大部分是可复制的，特别是基于逆转录病毒的载体(Dalba C.et al.,Mol.Ther.2007；15(3):457-466)。但是重组VLP没有如其他疫苗类型所具有的与病毒复制或灭活相关的任何风险。在它们的颗粒性质的基础上，关于免疫原性和稳定性，VLP提供优于可溶性抗原的固有优势。与亚基或单一重组蛋白相比，VLP更加免疫原性，并且能够刺激B-细胞介导的免疫应答以及CD4增殖和CTL应答(Ludwig C.and Wagner R.,Curr.Opin.Biotechnol.2007；18:537-545)。VLP的大小看来有利于树突细胞(DC)通过胞吞作用或巨胞饮作用(macropinocytosis)摄入并激活先天性和适应性免疫应答。VLP，特别是逆转录病毒VLP(gag-VLP)包含免疫原性表位，并且应当通过MHC I类和MHC II类途径刺激细胞免疫应答(Deml L.et al.,Mol.Immunol.2005；42:259-277)。因为这些免疫原性特性，VLP看来不需要使用佐剂以实现有效的免疫刺激。VLP已广泛并非常成功地用作疫苗(WO 2005/123125)和病毒血清学试剂。
对于包膜病毒，VLP需要至少一种衣壳或基质蛋白用于病毒颗粒的组装。蛋白在不同细胞室如内质网(ER)、脂膜筏或发生出芽的质膜中组装，因此包含构建病毒脂蛋白包膜的细胞脂质。VLP还可以包括宿主细胞蛋白，例如脂膜筏相关的神经节苷脂。基于单一或多组分衣壳，可以利用VLP呈递外源表位和/或靶向分子。与抗原融合的乙型肝炎病毒的核心基因提供VLP方法的早期实例(WO 1999/057289)。到目前为止，尚未产生重组CMVVLP。产生并公开的最大VLP是包含多达5种不同蛋白的流感、蓝舌病和轮状病毒VLP。尚未确切知道多少和哪些蛋白是基于CMV衣壳蛋白形成重组CMV颗粒所必需的。相反，已知许多非疱疹病毒衣壳蛋白形成VLP。最突出的实例是逆转录病毒前体蛋白gag，特别是MoMuLV(Moloney小鼠白血病病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、HTLV(人T-细胞白血病病毒)和SIV(猴免疫缺陷病毒)gag。pr55HIV前体蛋白形成大小为100-120nm的VLP，并且据显示其用作其他蛋白的载体。基于免疫印迹和ELISA测定，MoMuLV前体蛋白gag(pr65)导致高收率的大小为115-150nm的VLP。
杆状病毒表达载体系统(BEVS)非常适合共感染和共表达蛋白用于制备疫苗或其他生物制品，因为其基因组和病毒结构允许大的外源基因插入。由于狭窄的宿主范围，主要限制于鳞翅目物种(飞蛾和蝴蝶)，它是安全的。主要生产宿主为昆虫细胞，但是，杆状病毒还可以用于哺乳动物细胞中的重组共表达。杆状病毒系统是全世界研究和商业实验室中广泛使用和高效的蛋白表达系统(Roldao A.et al.,Expert Rev.Vaccines,2010；9(10):1149-1176)。GlaxoSmithKline的人乳头瘤病毒(HPV)VLP疫苗在BEVS中制备，并且批准在美国和欧盟使用(WO 2005/123125)。
WO 2010/128338公开了包含单纯疱疹病毒(HSV)或HSV病毒样颗粒(HSV VLP)的CMV疫苗，其进一步包含人巨细胞病毒(HCMV)多表位。
发明内容
本发明涉及一种重组病毒样颗粒，其包含一种或多种衣壳蛋白或衣壳前体蛋白，3、4、5或更多种不同的来自巨细胞病毒(CMV)的表面蛋白，以及任选存在的一种或多种间层蛋白。
优选地，衣壳蛋白源自疱疹病毒如巨细胞病毒，例如人巨细胞病毒(HCMV)，或者源自逆转录病毒，特别是HIV或MoMuLV。优选的衣壳蛋白为HIV和/或MoMuLV前体gag蛋白。
表面蛋白(也称作包膜蛋白)优选选自HCMV，特别是选自gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL55(gB)、gpUL74(gO)、gp100(gM)、gp73(gN)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。同样地，间层蛋白优选选自HCMV，特别是选自pUL32、pUL45、pUL47、pUL48、pUL69、pUL71、pUL72、pUL76、pUL77、pUL83(pp65)、pUL88、pUL93、pUL94、pUL95、pUL97、pUL99和pUL103。核心蛋白特别选自具有间层或包膜蛋白特征的pUL23、pUL24、pUL33、pUL36、pUL38、pUL43、pUL78、pUL82、pUL96、IRS1、US22和TRS1。同样地，调节蛋白优选选自IE-1、UL50、UL80.5、UL46和UL47。
本发明的重组病毒样颗粒可以进一步包含B-和/或T-细胞表位，选自额外的外源抗原序列、细胞因子、CpG基序、g-CMSF、CD19和CD40配体的蛋白，和/或荧光蛋白，可用于颗粒的纯化目的或连接标记的蛋白，和/或转运过程所需的蛋白质结构。
此外，本发明涉及编码本发明的病毒样颗粒中所含的蛋白的DNA，包含这样的DNA的载体，特别是杆状病毒载体，包含这样的载体的宿主细胞，以及利用杆状病毒载体制备本发明的病毒样颗粒的方法。
此外，本发明涉及包含本发明的重组病毒样颗粒的疫苗，特别是这样的疫苗，其进一步包含由gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131A组成的五聚体复合物，和/或选自gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL74、gpUL100和gpUL73；或者gpUL128、gpUL130和gpUL131A；或者pUL83、IE-1、UL99、UL91和pp150的可溶性CMV蛋白。这样的疫苗可以进一步包含选自氢氧化铝、明矾、AS01、AS02、AS03、AS04、MF59、MPL、QS21、ISCOMs、IC31、未甲基化的CpG、ADVAX、包含RNA的制剂和弗氏试剂的佐剂，还有如上文定义的本发明的DNA。
在一具体实施方案中，所述疫苗包含来自不同CMV毒株的CMV蛋白，所述CMV毒株选自Towne、Toledo、AD169、Merlin、TB20和VR1814毒株。
包含本发明的重组病毒样颗粒的疫苗可以通过用由gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131A组成的五聚体复合物初始免疫-强化免疫(prime-boost)给药，和/或用选自gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL74、gpUL100、gpUL73、pUL83和IE-1的可溶性CMV蛋白初始免疫-强化免疫给药进行二次免疫来进一步增强其诱导宿主免疫应答。
或者，包含本发明的重组病毒样颗粒的疫苗可以通过添加由gpUL73、gpUL74、gpUL75、gpUL100、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131A组成的组中的至少两种不同表面蛋白组成的可溶性复合物来进一步增强其诱导宿主细胞应答(体液和细胞应答)。
附图说明
图1：用于表达基于疱疹病毒或非疱疹病毒衣壳的CMV病毒样颗粒的不同变体或者用于表达CMV-五聚体复合物和可溶性CMV蛋白的重组载体的示意图。
将不同变体插入载体骨架pRBT136，所述载体骨架pRBT136旨在利用杆状病毒表达系统(BEVS)进行重组蛋白表达，并且包含两个启动子P1和P2以及两个终止子序列T1和T2(T)，它们是SV40和HSVtk。为了在酵母中增殖，所述载体包含复制起点(O)，例如2micron，以及标记基因(m)，例如URA3。此外，所述载体包含转座子位点左(TL)和右(TR)用于转基因从转移载体转座入杆粒，loxP位点(L)用于位点特异性同源重组(质粒融合)，复制起点(O)，氨苄西林(A)、氯霉素(C)和庆大霉素(G)抗性基因以及定义的限制性位点。为了在哺乳动物细胞中通过用杆状病毒转导或瞬时表达进行表达，载体骨架pRBT 393另外包含选自pCMV、ie1和lef2的启动子，以及选自SV40pA、BHG pA和HSVtk的终止子。
缩写：c：共有序列；H：His-标签；SH：链霉亲和素-His-标签；V：菌株VR1814，pcI：精密蛋白酶，pcII：精密和TEV蛋白酶，DT：二聚化工具，T：终止子，O：复制起点，G：庆大霉素抗性，C：氯霉素抗性，L：loxP位点，TL：左转座子侧，TR：右转座子侧。使用以前较短的HCMV命名(gB、gH、gL、gO以及没有前缀的“UL”和没有前缀“A”的UL48)。仅用它们的数字标记基因，例如“83”代替“UL83”。
图2：基于甘油-酒石酸盐梯度纯化CMV-VLP变体SEQ ID NO:7连同SEQ ID NO:14。
(A)基于甘油-酒石酸盐梯度的纯化。通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后免疫印迹分析来自Towne毒株的包含衣壳蛋白、功能蛋白、间层蛋白、表面蛋白UL86-UL85-UL50-UL48A-UL46-UL74(gO)-UL83-UL80.5-UL75(gH)-UL115(gL)-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14)的CMV-VLP变体的不同级分。小鼠抗pUL83(Virusys)抗体用于验证间层蛋白。左侧示出以kDa计的蛋白标准品；泳道1-13：级分1-13(从上至下分级)，泳道14：阳性对照。
(B)利用抗衣壳蛋白(UL86,UL85)、间层蛋白(UL83)和表面蛋白UL75(gH1,gH2)的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。两种衣壳、间层蛋白(UL83)和表面蛋白UL75(gH)的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(UL86,UL85,gH2:University of Alabama,pUL83:Virusys；gH1:Santa Cruz)。杆状病毒的存在用抗蛋白gp64的抗体(eBioscience)来验证。x-轴的数字1-13表示甘油-酒石酸盐梯度的数字(从上之下分级)，数字14表示阳性，而数字15表示阴性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。变体SEQ ID NO:7连同SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的表达和纯化获得了相似的结果。
图3：基于甘油-酒石酸盐梯度纯化CMV-VLP变体SEQ ID NO:5连同SEQ ID NO:14。
利用抗衣壳蛋白UL86和UL85，抗间层蛋白UL83(UL83)和表面蛋白UL75(gH)的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。衣壳(UL86,UL85)、间层(UL83)和表面蛋白UL75(gH)的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(UL86,UL85,gH1:University of Alabama提供的抗体,UL83:Virusys；gH2:Santa Cruz)。杆状病毒的存在用抗蛋白gp64的抗体(eBioscience)来验证。x-轴的数字1-13表示甘油-酒石酸盐梯度的数字(从上至下分级)，数字14表示阳性，而数字15表示阴性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。
由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:13组成的CMV VLP导致几乎相同的数据。为了验证表面蛋白的组成，将在SEQ ID NO:5连同SEQ ID NO:9或10的基础上产生的CMV VLP以上述方式处理，并且显示0.1-0.3范围内的相似OD值。
图4：基于甘油-酒石酸盐梯度纯化CMV-VLP变体SEQ ID NO:3连同SEQ ID NO:18。
利用抗衣壳蛋白(UL85)、间层蛋白(UL83)和表面蛋白(UL75(gH),UL55(gB))的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。衣壳(UL85)、间层(pUL83)和表面蛋白(gpUL75,gpUL55)的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(UL85/UL55(gB1):University of Alabama；UL83/UL55(gB2):Virusys；UL75(gH):Santa Cruz)。x-轴的数字1-7表示甘油-酒石酸盐梯度级分1-7的数字(从上至下分级)，数字8表示阴性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。通过结合SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:9、10、16或19观察到相同的完整组合物，其中OD值检测在0.1-0.4的范围中不同。
图5：基于甘油-酒石酸盐梯度纯化CMV-VLP变体SEQ ID NO:2连同SEQ ID NO:18。
利用抗间层蛋白(UL83)和表面蛋白(UL75,UL55)的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。间层蛋白(UL83)和表面蛋白(UL75,UL55)的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(UL83/UL55(gB):Virusys；UL75(gH):Santa Cruz)。杆状病毒的存在用抗蛋白gp64的抗体(eBioscience)来验证。x-轴的数字1表示通过蔗糖垫预纯化的样品，x-轴的泳道2-14表示甘油-酒石酸盐梯度级分1-13的数字(从上至下分级)，数字15表示VLP的阴性对照，而数字16表示杆状病毒的阴性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。如上文提到的相同蛋白也可以在衣壳和间层的SEQ ID NO:2以及表面蛋白的SEQ ID NO:9、10、16或19组成的CMV VLP变体中于0.1-0.3OD值的范围中验证。
图6：基于蔗糖梯度纯化基于非疱疹病毒衣壳的CMV-VLP变体SEQ IDNO:20连同SEQ ID NO:14。
(A)基于蔗糖梯度的纯化。通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后免疫印迹分析包含衣壳(逆转录病毒前体)蛋白gag和表面蛋白UL75(gH)-UL115(gL)-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:14)的CMV-VLP变体的不同级分。小鼠抗gag(DakoCytomation)抗体用于验证衣壳蛋白。图左示出以kDa计的蛋白标准品；泳道1-13：级分1-13，泳道14：阳性对照(gag蛋白)。
(B)利用抗衣壳蛋白(gag)和表面蛋白(UL75[gH]，链霉亲和素标记的gL)的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。衣壳蛋白(gag)和表面蛋白(gH,gL，通过链霉亲和素标签)的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(gag:DakoCytomation；UL75(gH):Santa Cruz,链霉亲和素:AbDSerotec)。x-轴的数字1-13表示蔗糖梯度级分1-13的数字(从上至下分级)，数字14表示VLP的阴性对照，数字15表示杆状病毒的阴性对照，而数字16表示阳性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。通过结合衣壳蛋白gag(SEQ ID NO:20)与SEQ ID NO:9、10、13、15、16或19的间层和表面蛋白可以观察到相同的共定位。包含SEQ ID NO:19一般显示较高的OD值，表明较好的CMV VLP稳定性。
图7：基于蔗糖梯度纯化基于非疱疹病毒衣壳的CMV-VLP变体SEQ IDNO:20连同SEQ ID NO:18。
(A)基于蔗糖梯度的纯化。通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后免疫印迹分析包含衣壳(逆转录病毒前体)蛋白gag和表面蛋白UL75-UL115-UL128-UL130-UL131A-UL55(SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:18)的CMV-VLP变体的不同级分。小鼠抗gag(DakoCytomation)抗体用于验证衣壳蛋白。左侧示出以kDa计的蛋白标准品；泳道1-13对应于梯度从上至下分级的级分1-13，而泳道14表示阳性对照。
(B)利用抗衣壳蛋白(gag)和表面蛋白(UL75[gH],UL55[gB])的特异性抗体通过ELISA测定验证免疫印迹数据。衣壳蛋白(gag)和表面蛋白(UL75[gH],UL55[gB])的存在可以通过抗体结合至所选蛋白来显示(gag:DakoCytomation；gB:Virusys；gH:Santa Cruz)。杆状病毒的存在用抗蛋白gp64的抗体(eBioscience)来验证。x-轴的数字1-13表示蔗糖梯度级分1-13的数字(从上至下分级)，数字14表示梯度的负载，数字15表示阳性对照，而数字16表示阴性对照。抗体对VLP中的蛋白的结合强度显示为y-轴处的光密度。在相同级分中检测到所选蛋白表明它们共定位，因此是完整的CMV-VLP。基于SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18的表达的另一CMV变体导致相似的结果，有利于支持通过蛋白UL83诱导细胞免疫应答。
图8：通过亲和层析纯化的His/Strep-标记的CMV-VLP变体SEQ IDNO:7连同SEQ ID NO:14的分析。
用IMAC方法纯化包含衣壳蛋白、功能蛋白、间层蛋白和表面蛋白UL86-UL85-UL50-UL48A-UL46-UL74-UL83-UL80.5-UL75-UL115(His/Strep)-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14)的CMV-VLP变体。
通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后利用小鼠抗UL83抗体(Virusys)对间层蛋白(UL83)免疫印迹来分析这种IMAC-纯化的不同步骤。左侧示出以kDa计的蛋白标准品。泳道1：纯化之前的VLP(装载)，泳道2：流过(FT)，泳道3：洗涤；泳道4-9：用增加量的咪唑(55,100,150,230,480,500mM)洗脱，泳道10：作为阴性对照的昆虫细胞(Sf9)，泳道11：阳性对照(感染的Sf9细胞)。箭头指示间层蛋白的存在(UL83)。
图9：通过亲和层析纯化的His/Strep-标记的基于非疱疹病毒衣壳的CMV-VLP变体SEQ ID NO:20连同SEQ ID NO:14的分析。
用基于IMAC的方法纯化包含衣壳(逆转录病毒前体)蛋白gag和表面蛋白UL75-UL115(His/Strep)-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:20和SEQID NO:14)的CMV-VLP变体。通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后利用小鼠抗gag抗体(DakoCytomation)对衣壳蛋白(gag,Fig.9A)免疫印迹并对链霉亲和素-His标记的表面蛋白UL115(gL,Fig.9B)免疫印迹来分析这种IMAC-纯化的不同步骤。左侧示出以kDa计的蛋白标准品，泳道1：纯化之前的VLP(装载)，泳道2：流过(FT)，泳道3：洗涤；泳道4-9：用增加量的咪唑(55,100,150,230,480,500mM)洗脱，泳道10：作为阴性对照的昆虫细胞(Sf9)，泳道11：阳性对照(感染的Sf9细胞)。箭头指示衣壳蛋白(gag)的存在以及链霉亲和素-组氨酸标记的表面蛋白gL的存在。
图10：由两个亲和层析步骤，然后His-标记的可溶性CMV-五聚体复合物的大小排阻层析组成的纯化方法的分析。
通过基于亲和力的层析(IMAC)利用His-Trap柱，然后大小排阻层析(XK16/60Superdex200pg)纯化包含表面蛋白UL75(His-标记的，gH)-UL115(gL)-UL128-UL130-UL131A(SEQ ID NO:59)的五聚体复合物。
(A)通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后考马斯染色分析2ndIMAC纯化。左侧标记蛋白标准品(泳道1)的大小(kDa)。泳道2：1st IMAC的池(2ndIMAC过程的装载)，泳道3：流过，泳道4：洗涤，泳道5-14表示多达500mM的增加的咪唑浓度的洗脱级分。
(B)通过SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)然后考马斯染色分析大小排阻层析纯化。左侧标记蛋白标准品(泳道1)的大小(kDa)。泳道1：洗脱池IV-2，沉淀的；泳道2：洗脱池IV-2，非沉淀的；泳道3：洗脱池IV-3；泳道4：洗脱池V；泳道5：洗脱池VI；泳道6：大小标记。箭头指示五聚体复合物(gH,gL,UL128,UL130,UL131A)的蛋白。
(C)利用抗gH的His-标签的抗体免疫印迹。泳道1代表洗脱池IV-2(沉淀的)；泳道2：洗脱池IV-2(非沉淀的)；泳道3：洗脱池IV-3；泳道4：洗脱池V；泳道5：洗脱池VI；泳道6：阳性对照。右侧标记His-标记的gH蛋白。
图11：HCMV-VLP变体SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10(A)以及SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:19(B)的电子显微图。
(A)用磷钨酸负染色的包含衣壳蛋白、功能蛋白、间层蛋白和表面蛋白UL86-UL85-UL50-UL48A-UL46-UL83-UL80.5-UL74-UL75-UL115-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)的重组人CMV-VLP的电子显微图。比例尺对应于100nm。
(B)用磷钨酸负染色的包含衣壳、衣壳组装支持蛋白、间层蛋白和表面蛋白UL86-UL85-UL83-UL80.5-UL74-UL75-UL115-UL128-UL130-UL131A-UL55(SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:19)的重组人CMV-VLP的电子显微图。比例尺对应于200nm。
图12：基于非疱疹病毒的CMV-VLP变体SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:10(A)以及SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:19(B)的电子显微图。
(A)用磷钨酸负染色的包含衣壳(逆转录病毒前体)蛋白gag和表面蛋白UL75-UL115-UL128(c)-UL130-UL131A(SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:10)的重组人CMV-VLP的电子显微图。比例尺对应于100nm。
(B)用磷钨酸负染色的包含衣壳(逆转录病毒前体)蛋白MoMULV gag和表面蛋白UL75-UL115-UL128-UL130-UL131A-UL55-UL83(SEQ IDNO:88和SEQ ID NO:19)的重组人CMV-VLP的电子显微图。比例尺对应于100nm。
图13：基于SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:22分别与SEQ ID NO:18的疫苗组合的体内研究的小鼠血清的病毒中和测定。
将Balb/C用hCMV抗原以初始免疫-强化免疫-强化免疫(prime-boost-boost)方案免疫。这个中和测定所选的抗原是可溶性复合物(SEQ ID NO:59)以及逆转录病毒衣壳连同间层蛋白UL83(SEQ ID NO:22)组成的VLP以及CMV蛋白UL55-UL75-UL115-UL128-UL130和UL131A的蛋白混合物。将2倍系列稀释(1:20至1:2560)的获得自8只小鼠的汇集的血清与表达CMV启动子下的EGFP的重组、BAC-重建的VR1814HCMV毒株混合。处理后96h，MRC-5成纤维细胞(2x104个细胞/孔)用来在基于细胞的荧光测定中评价这种病毒的进入。对所选的来自用非疱疹CMV-VLP和五聚体CMV复合物的混合物免疫的小鼠的血清稀释液示出相对荧光强度(RFI,％)。空杆状病毒和PBS用作对照。用可溶性五聚体复合物和基于非疱疹病毒的CMV VLP的混合物免疫诱导产生滴度范围1:160至1:320内的中和抗体，与人血液捐献者的滴度可比，对所用的EGFP-病毒使用预评价的TCID50。
1：w/o血清，2：1:320，3：1:160，4：1:80。混合物：五聚体和VLP；BV：杆状病毒。
图14：验证基于SEQ ID NO:59的体液免疫应答的中和测定
人CMV血液捐献者和小鼠血清的中和抗体滴度的比较。将2倍系列稀释(1:20至1:2560)的来自5个阳性(G2组，D6-D10)和5个阴性(G1组，D1-D5)HCMV血液捐献者的血清进行基于细胞的荧光中和测定。示出提供与获得自以前用五聚体复合物(SEQ ID NO:59)免疫的8只小鼠的汇集的血清的1:320稀释液相同的抑制效果的血清稀释液(s.d.)。作为用于免疫小鼠的抗原混合物中的一个组分的可溶性五聚体复合物的单独分析显示诱导与人血液捐献者可比的中和抗体。
PR：五聚体免疫前，PO：五聚体免疫后，G1：阴性血液捐献者，G2：阳性血液捐献者。
图15：包含可溶性复合物和reVLP(重组VLP，SEQ ID NO:22与SEQID NO:18)的疫苗候选物的一个组分(可溶性复合物，SEQ ID NO:59)的质量控制。
进行基于IMAC的纯化之后示出用不同量的咪唑洗脱的级分。测试它们的UL75(gH)和gH上的His标签的存在。信号强度的相似性表明gH的完整性，因此表明由UL75-UL115-UL128-UL30-UL131A组成的整个复合物的完整性。
1：装载，2：流过，3：洗涤，4：250mM咪唑，5-8：300mM咪唑，9-13：350mM咪唑，14：阳性对照，15：阴性对照
图16：利用构象依赖性抗体的包含可溶性复合物和reVLP(重组VLP，SEQ ID NO:22/18)的疫苗候选物的一个组分(可溶性复合物，SEQ ID NO:59)的质量控制。
用夹心ELISA测定测试不同生产批次的复合物中指定蛋白的共存在。用抗gH1(UL75)抗体捕获样品，并且用抗gH2和抗His以及抗UL130/131A和抗UL130构象依赖性(UL130/UL131A)抗体进行检测。信号证实复合物中蛋白的共存在、复合物的完整性以及其生产的可重复性。
1：批次451-池1，2：批次459-池2，3：批次459-池1(15mM EDTA)，4：批次459-池1(20mM EDTA)，5：批次458(15mM EDTA)，6：阳性对照，7：阴性对照，8：内部标准品
图17：用夹心ELISA测定验证基于非疱疹的CMV-VLP(SEQ ID NO:22连同SEQ ID NO:18)。
测试不同洗脱级分中指定蛋白的共存在。用构象依赖性抗体(UL130/UL131A)捕获样品，指示表面蛋白UL130和UL131A以天然构象存在。抗gH(UL75)、抗gpUL83(pp65)和抗衣壳(gag)抗体用于检测。信号证实VLP上蛋白的共存在，并且显示在受试蛋白中一些样品富集。
1：主体，2：级分7，3：级分8，4：级分9，5：级分8+9，6：阴性对照。nOD：归一化的OD，cap：衣壳。.
图18：用夹心ELISA测定表征基于非疱疹的CMV-VLP(SEQ ID NO:22连同SEQ ID NO:18)的纯化过程。
测试来自两种不同层析基质(整体柱：c1和膜吸附剂：c2)的洗脱级分中指定蛋白的共存在。用构象依赖性(UL130/UL131A)抗体捕获样品，并且用抗gH、抗pp65、抗gB和抗gag(衣壳)抗体检测。信号证实VLP上蛋白的共存在，并且显示所用的膜吸附剂(c2)的表现更好。
1：来自柱1(c1)的洗脱级分，2：来自柱2(c2)的洗脱级分，3：阳性对照，4：阴性对照。Cap：衣壳(前体gag蛋白)。
图19：用夹心ELISA测定表征基于疱疹的CMV-VLP。
用2种(图19A，UL86和UL80.5，SEQ ID NO:2)或3种(图19B,UL86-UL85-UL80.5，SEQ ID NO:3)不同的衣壳蛋白；相同的间层蛋白UL83(pp65)和不同的表面蛋白(gH-gL-gB-UL128-UL130-UL131A,SEQ ID NO:18)制备VLP，并且使来自随后的纯化步骤的洗脱级分进行夹心ELISA。用抗表面蛋白的构象依赖性(UL130/UL131A)抗体捕获样品，并且用抗间层蛋白和表面蛋白的抗体(抗pp65、抗gH和抗gB)检测。两种衣壳类型均导致VLP，但是具有不同收率。gB蛋白的整合看来有益于由3种以上蛋白组成的核。1：主体，2-10：级分4-12，11：阴性对照。
图20：非疱疹CMV-VLP(SEQ ID NO:22/SEQ ID NO:18)和五聚体CMV复合物(SEQ ID NO:59)的组合诱导的细胞免疫应答。
收获后24h将脾细胞用各种肽(1-7)处理，并且根据制造商的方案(Invitrogen)用多重测定测量Th1型细胞因子IFN-g(A)和IL-2(B)，Th2型细胞因子IL-4(C)、IL-5(D)和IL-10(E)以及炎性细胞因子GM-CSF(F)和TNFa(G)的释放。肽2-5为九聚体与预测的表位(SYFPEITHI程序)的混合物，而肽6和7是商购的(JPT，预先定义的肽的混合物)。空杆状病毒和PBS(模拟)用作重新刺激的对照。
1：模拟，2：gH，3：gB，4：UL128/130，5：UL131/gL，6：pp65，7：Gag衣壳。混合物：五聚体和VLP；BV：杆状病毒。
图21：利用人CMV阳性血清分析CMV VLP和单一组分(可溶性复合物，SEQ ID NO:59)用于疫苗。
在夹心ELISA测定中测试基于非疱疹病毒的CMV VLP(SEQ ID NO:22连同SEQ ID NO:19)、基于疱疹病毒的CMV VLP(SEQ ID NO:48连同SEQID NO:19)和可溶性复合物(SEQ ID NO:59)与来自CMV阳性捐献者的人抗体反应的能力以模拟体内实验。将板用对应于不同CMV蛋白(gH、gB、UL83、UL85、UL86和基于构象的UL130/UL131A)、Gag和His的抗体包被。将板用可溶性五聚体复合物或VLP进一步温育，随后用CMV阳性人血清(HIV阴性捐献者)处理。将HRP标记的人抗IgG二抗用于检测。
(A)在夹心ELISA测定中用人血清分析五聚体复合物gH-gL-UL128-UL130-UL131A(SEQ-ID NO:59)。捐献者血清(4种不同血清的混合物)中的人抗体识别复合物中的gH和UL130/UL131A。1：五聚体复合物；2：阴性对照(模拟)；(3)阳性对照(表达His的蛋白)。
(B)在夹心ELISA测定中用人血清分析基于gag的CMV VLPgag-UL83-gL-gH-UL128-UL130-UL131A-gB-UL83(SEQ-ID NO:22连同SEQ-ID NO:19)。捐献者血清中的人抗体识别这些VLP中的UL83。
1：基于Gag的CMV VLP；2：阴性对照(模拟)。对基于MoMULV gag衣壳的CMV VLP(SEQ-ID NO:88连同SEQ ID NO:19)获得了非常相似的结果。
(C)在夹心ELISA测定中用人血清分析基于CMV的VLPUL86-UL85-UL83-UL80.5-UL74-gL-gH-UL128-UL130-UL131A-gB-UL83(SEQ-ID NO:48连同SEQ-ID NO:19)。捐献者血清中的人抗体识别这些VLP中的所有蛋白，对UL83、gH、UL85、UL86有非常清楚的信号。1:基于Gag的CMV VLP；2：阴性对照(模拟)。CMV-VLP中剩余的杆状病毒和制备的可溶性复合物不结合至人血清中存在的抗体。
具体实施方式
本发明涉及新的病毒样颗粒用作抗HCMV疫苗，用于治疗抗体的开发，用于抗HCMV治疗，用作诊断工具以及R&D工具。本发明描述了制备导致体液和细胞免疫应答的重组、非感染性CMV-颗粒的几种可能性。制备各种蛋白组合以获得具有期望特性的产物。更具体地，本发明致力于多组分VLP变体以及不同蛋白组合物的组合如VLP、蛋白复合物、可溶性蛋白和/或基于DNA的组合物如载体和肽。
本发明的重组VLP是基于1-6种蛋白的CMV衣壳蛋白组合(主要衣壳、次要衣壳、最小衣壳蛋白和组装的必需蛋白)形成的衣壳或者逆转录病毒前体蛋白，特别是名为gag的慢病毒人免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒前体蛋白，和/或pr55。将选自CMV间层蛋白和表面蛋白的其他蛋白添加至这些衣壳蛋白。形成的VLP被分泌过程期间宿主细胞提供的包膜包围。为了以它们的天然构象连接和/或包埋间层和表面蛋白，它们单独的膜锚存在。
因为CMV病毒包含至少5种衣壳蛋白(UL46、UL48A、UL85、UL86、UL104的基因产物)，19种调节蛋白，17种间层蛋白(UL25、UL45、UL47、UL48、UL69、UL71、UL72、UL76、UL77、UL83、UL88、UL93、UL94、UL95、UL97、UL99、UL103的基因产物)，5种表面或包膜蛋白(UL55[gB]、UL73[gN]、U74[gO]、UL75[gH]、UL100[gM]、UL115[gL]的基因产物)，来自开放阅读框UL128，UL130，UL131A的未分类的基因产物；来自15种β-疱疹病毒特异性基因(UL23、UL24、UL32、UL33、UL35、UL36、UL38、UL43、UL74[gO]、UL78、UL82、UL96、IRS1、US22、TRS1)的蛋白以及来自目前已知的开放阅读框(ORF)UL50、UL80.5的所谓的功能蛋白，理论上多达1x1064种组合是可能的，并且最大的VLP可以包含超过40种蛋白，其中未考虑调节蛋白。到目前为止，由于这种病毒的复杂性，没有重组CMVVLP存在。
在本发明中，使用术语“表面蛋白”，但是等同于术语“包膜蛋白”。
本发明涉及一种重组病毒样颗粒，其包含一种或多种衣壳蛋白或衣壳前体蛋白，3种或更多种不同的来自巨细胞病毒(CMV)的表面蛋白，以及任选存在的一种或多种间层蛋白。
在本发明的一优选实施方案中，表面蛋白选自ofpUL83(pp65)、gpUL75(gH)、gpUL55(gB)、gpUL100(gM)、gpUL73(gN)、gpUL74(gO)、gpUL115(gL)、gpUL75(gH)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A，优选来自人CMV。然而可以使用非人CMV毒株的蛋白。这类非人CMV蛋白则可以在VLP中发挥结构功能而不是免疫功能。本发明的重组VLP可以包含来自其他疱疹病毒家族如HSV(单纯疱疹病毒)、EBV(埃巴病毒)和KSHV(卡波西肉瘤相关疱疹病毒)。
为了解决物种特异性、不同细胞向性和广泛免疫应答的诱导，本发明的VLP包含一种以上表面蛋白连同许多衣壳和间层蛋白。
在另一优选实施方案中，基于CMV衣壳蛋白的VLP由选自6种蛋白pUL86、pUL85、pUL48A、pUL46、pUL50和pUL80.5的一种蛋白或者蛋白的组合组成，例如这些蛋白中的2、3、4、5或6种。在本发明的另一方面，VLP包含蛋白pUL104。
非疱疹病毒衣壳选自逆转录病毒科(retroviral families)的逆转录病毒科(retroviridae)，α-、β-、γ-、δ和ε逆转录病毒，慢病毒科或泡沫病毒科。在慢病毒科中，鸟(SIV)、猫(FIV)、牛(BIV)和人(HIV)前体蛋白gag(群特异性抗原)用作衣壳用于制备基于非疱疹病毒的VLP，以及来自γ逆转录病毒如猫白血病病毒(FELV)、moloney小鼠白血病病毒(Mo-MuLV)、鸟白血病病毒(SLV)或小鼠肉瘤病毒(MSV)的前体蛋白gag。基于非疱疹病毒衣壳的VLP优选由HIV前体蛋白gag(pr55)组成，HIV前体蛋白gag(pr55)是由基质(MA,p17)、衣壳(CA,p24)、核衣壳(NC,p7)和连接(LI,p6)蛋白部分组成的前体蛋白。
已知来自不同逆转录病毒科成员的gag前体蛋白的组装没有巨大差异。除了HIV gag，由相同亚基组成的MoMULV gag变体适合作为基于逆转录病毒的衣壳，携带超过3种不同的CMV间层和/或表面蛋白用于形成CMVVLP，以及在疫苗的制备和监管机构批准中具有优势。基于MoMuLV gag前体蛋白的CMV VLP变体的组装与基于HIV gag的VLP的组装相似。关于基于MoMULV gag的CMV-VLP的收率、更好的形状和构象方面，没有大的优势。但是，与基于HIV的CMV VLP人疫苗相比，对于基于MoMuLVgag衣壳的CMV-VLP疫苗，预期在HIV的诊断测试中没有假阳性结果。
优选的VLP在各自的衣壳蛋白上包含选自UL83、UL25、UL32(pp150)和UL99的一种或两种间层蛋白以及5-8种表面蛋白。表面蛋白优选选自UL75(gH)、UL115、(gL)、UL74(gO)、UL55(gB)、UL128、UL130和UL131AA。在本发明的另一实施方案中，VLP还可以包含UL100(gM)和UL73(gN)。本发明的VLP中的HCMV的表面蛋白是与它们各自的膜锚一起选择的，从而它们以天然构象展示并包埋入重组衣壳结构。
在一实施方案中，CMV衣壳仅包含主要衣壳蛋白(UL86)。在所有其他实施方案中，衣壳由一种以上蛋白组成。在优选的实施方案中，VLP包含pUL86-pUL85-pUL80.5连同间层蛋白pUL83和ppUL32(pp150)以及表面蛋白gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL55(gB)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。具有相同的偏好，所提到的间层和表面蛋白在由pUL86-pUL85-pUL48A组成的衣壳上表达，改善核心，因此改善VLP形状。
在另一优选实施方案中，VLP额外地包含表面蛋白gpUL74(gO)。这增加颗粒形成，并且扩大诱导保护性免疫应答的蛋白的量。
在本发明的另一方面，衣壳和间层蛋白来自另一疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒、埃巴病毒、HHV-6(玫瑰疹病毒属)或HHV-7(玫瑰糠疹)。
在本发明的另一方面，VLP包含至少一种间层蛋白和/或一种表面蛋白，其为非人CMV来源的。
在本发明的另一实施方案中，VLP包含至少两种融合至肽的不同蛋白，所述肽包含卷曲-螺旋基序，具有拉链功能，并且连接所述携带相应基序的至少两种蛋白。融合至包含卷曲-螺旋基序的优选蛋白为衣壳蛋白之一，优选UL86，以及表面蛋白之一，优选gpUL75，以便支持组装为功能VLP并增加表面上免疫原性蛋白的量。
在本发明的一实施方案中，用于产生多组分重组VLP的蛋白选自单一CMV毒株，优选选自Towne、Toledo、AD169、Merlin、VR1814和/或临床分离株。在另一实施方案中，用于产生VLP的蛋白选自不同的CMV毒株，优选选自Towne、Toledo、AD169、Merlin、VR1814毒株和/或不同的临床分离株。
包含来自不同CMV毒株的蛋白的VLP提供抗几种毒株的保护，并且防止相似毒株重新感染和/或重新激活。考虑的不同CMV毒株为Towne、Toledo、AD169、Merlin、TB20和VR1814，但是还考虑其他临床分离株。
为了几个原因考虑这些毒株，例如利用Towne和Toledo毒株的疫苗候选物的临床II期研究的现有数据，良好表征的基于AD169的数据以及可商购的用于分析制备过程的工具。此外，临床分离株VR1814包含功能复合物，其对于进入不同细胞类型如成纤维细胞和上皮/内皮细胞很重要。对于细菌人工染色体(BAC)来源并适应实验室的Towne毒株，已知因为表面上的非功能蛋白组合物，进入上皮细胞被阻断。通过在重组CMV VLP中组合不同毒株，避免了自然故障。Merlin和TB20现在更常用作参考毒株。新技术如下一代测序允许确定来自CMV阳性捐献者的免疫原性表位。相应病毒(临床分离株)的遗传信息用来产生改良的疫苗。因此，CMV VLP由来自不同病毒毒株的蛋白组成。
优选蛋白序列的Towne和VR1814组合，特别是在由gpUL55、gpUL74、gpUL75、gpUL115、UL128、UL130和UL131A以及CMV衣壳蛋白或逆转录病毒gag衣壳蛋白组成的VLP中。
本发明的蛋白组合物包含免疫原性蛋白，因此包含许多不同表位，优选刺激体液和细胞免疫应答的种类。通过表位激活体液免疫应答导致产生抗体，所述抗体会结合至包含这类表位的蛋白。通过表位激活细胞免疫应答导致产生细胞毒性T细胞(也称为TC、CTL、T-杀伤细胞、溶细胞T细胞、CD8+T-细胞或杀伤T细胞)，其杀死在表面上呈递这类表位的细胞。如本文理解的，表位可以是重复的，并且可以是较大蛋白的部分，特别是抗原的部分。
包含本发明的表位的不同蛋白是例如gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、UL128、UL130、UL131A、gpUL55(gB)、gpUL74(gO)、gpUL100(gM)、gpUL73(gN)、pUL86、pUL85、pUL80.5、pUL82、pUL83、pUL46、pUL48A、pUL50、pUL32和立即早期蛋白IE-1。
在一优选实施方案中，VLP包含来自单一或不同HCMV毒株和/或非人CMV毒株的表位，连同B-和/或T-细胞表位以诱导更广泛的免疫应答。
包含内含物CD配体(例如CD40L、CD19L)的VLP是本发明的另一方面。这类VLP通过不同途径诱导免疫应答，导致Th1或Th2应答。
本发明的另一方面是包含CpG基序、细胞因子和/或β葡聚糖的VLP。这类VLP直接触发B-细胞激活，并且增强和扩大特异性HCMV表位引起的免疫应答。
在另一优选实施方案中，病毒样颗粒由形成完整病毒样表面的蛋白组成，任选进一步包含病毒衣壳蛋白。本发明的病毒样颗粒可以进一步包含荧光蛋白，可用于颗粒的纯化目的或连接标记的蛋白，以及转运过程所需的蛋白结构。
本发明涉及重组病毒样颗粒，其包含衣壳的多种组合，任选存在的不同量的来自非人和/或人巨细胞病毒的间层和/或表面蛋白。这些颗粒包含至少一种衣壳蛋白，优选主要衣壳蛋白UL86，选自ppUL 83、ppUL32、pUL25和IE-1蛋白的间层蛋白，以及选自gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL128、gpUL130、gpUL131A、gpUL55(gB)、gpUL74(gO)、gpUL100(gM)和gpUL73(gN)的表面蛋白。表面蛋白优选是人病毒来源的。本发明的病毒样颗粒由一种或多种如1-16种蛋白组成，所述蛋白包含各种蛋白，其选自(a)一种HCMV毒株或(b)不同HCMV毒株和/或(c)非人CMV如小鼠或豚鼠CMV。优选的重组病毒样颗粒包含一种或多种，优选两种或更多种来自单一HCMV毒株的不同蛋白或来自不同CMV毒株的不同蛋白。同样优选的重组病毒样颗粒包含一种或多种衣壳蛋白，间层蛋白pUL83和ppUL32，以及表面蛋白gpUL55(gB)、gpUL74(gO)和/或形成五聚体结构的蛋白，其选自gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。本发明的重组病毒样颗粒还可以基于非疱疹病毒衣壳，优选慢病毒前体蛋白gag，并且进一步由CMV表面蛋白和任选存在的CMV间层蛋白组成。
在优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含：
a.来自单一CMV毒株或非疱疹病毒毒株的一种衣壳蛋白；
b.来自单一CMV毒株的两种或更多种衣壳蛋白的混合物；
c.来自不同CMV毒株的两种或更多种衣壳蛋白的混合物；
d.来自单一CMV毒株的一种衣壳、一种间层和一种表面蛋白的组合；
e.来自不同CMV毒株的一种衣壳、一种间层和一种表面蛋白的组合；
f.来自单一CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白；一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合；
g.来自不同CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白；一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合；
h.具有额外的T-细胞表位的来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合；
i.来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合，除了负责免疫逃避的蛋白；
j.来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合，除了负责抑制MHCI和MHCII表达的蛋白；以及
k.来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合，其进一步包含增强免疫应答的蛋白和/或基序，选自CD40L、CD19L、细胞因子和未甲基化的CpG基序；
l.来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合，其具有促进纯化和分析的蛋白，选自例如His-标签、Strep-标签、myc-标签、Flag-标签和Snap-标签，以及荧光蛋白，选自例如GFP、YFP和樱桃红；
m.来自一种或多种CMV毒株的一种或多种衣壳蛋白，一种或多种间层蛋白以及一种或多种表面蛋白的组合，其进一步包含蛋白或非蛋白结构以偶联化学物质和/或惰性纳米珠。
本发明所述的获得大且复杂的CMV VLP的策略包括从单一载体共表达多个基因，包括CMV衣壳、间层和/或表面蛋白的基因，以及共感染这些共表达载体中的几种。
这些新的多组分病毒样颗粒、蛋白复合物和可溶性蛋白的制备是基于重组组装技术(称作rePAX)，其包括以下步骤：基因的组装，产生用于各种系统的表达构建体，蛋白表达，产物的纯化和表征。该平台的优选表达系统为杆状病毒系统(BEVS)或哺乳动物细胞系统。在本发明的另一实施方案中，使用称作BacMam的两种系统的组合。
由于使用特定遗传和过程工程化工具，本文所述的蛋白组合物如VLP、蛋白复合物和单一蛋白在较短时间内无限量产生。通过现代分子生物学方法如所述rePAX技术和基因合成组装所需基因的能力例如允许快速组装编码DNA载体。在病毒样颗粒、蛋白复合物和可溶性蛋白的开发、制备或给药期间使用这些技术不需要原始的潜在危险的感染性或致癌物质的任何物理转移。因此本发明的疫苗是安全的。对于本发明的蛋白组合物的构建，使用来自在NCBI数据库可获得的HCMV的核苷酸序列是足够的。
编码形成本发明的VLP的蛋白的DNA以及包含这类DNA的基于病毒或质粒的载体也是本发明的部分。
为了产生BEVS系统的表达构建体，优选使用载体骨架pRBT136，其包含在大肠杆菌(E.coli)和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae))中增殖以及昆虫细胞中蛋白表达的元件。
为了在哺乳动物系统中表达，优选使用载体骨架pRBT393，其包含基因组装、同源重组和在哺乳动物细胞(优选HEK293、CHO、人包皮成纤维细胞(HFF)和上皮细胞)中表达的元件。
不同基因的平行组装是通过PCR产物的同源重组来进行的，所述PCR产物具有同源侧翼区以及包含表达盒(启动子-所关注的基因-终止子)或与蛋白酶切割位点如口蹄疫病毒2A切割位点一起融合入一个开放阅读框(ORF)的那些单个基因。启动子优选选自polh、p10和pXIV极晚杆状病毒启动子、vp39杆状病毒晚期启动子、vp39polh杆状病毒晚期/极晚杂合启动子、pca/polh、pcna、etl、p35、egt、da26杆状病毒早期启动子；CMV-IE1、UBc.EF-1、RSVLTR、MT、pDS47、Ac5以及PGAL和PADH。终止子优选选自SV40、HSVtk和BGH(牛生长激素)。
优选用于本发明的载体骨架pRBT136包含大肠杆菌的复制起点，例如pBR322ori，以及酵母的复制起点，例如2微米ori，用于在昆虫细胞中表达的polh和p10启动子，终止子SV40和HSVtk，几个抗性标记(氨苄西林、庆大霉素)，酵母选择标记(URA3)，转座子位点(Tn)以及多克隆位点(MCS)。
包含启动子-所关注的基因-终止子的表达盒是在5’位点处用5’位点处的35-40nt突出并在3’位点处用另外且不同的35-40nt突出PCR扩增的。为了与具有相同组织的第二表达盒同源重组，PCR产物在5’位点处包含先前PCR产物的3’位点的35-40nt突出的互补序列。第一PCR产物的5’位点和第二PCR产物的3’位点处的剩余突出分别与线性化载体(pRBT136)的3’和5’端同源。然后在酵母中，优选在酿酒酵母中进行序列中的同源重组。用之前所述的策略平行组装的表达盒/PCR产物的数量根据需要组装的基因的数量而增加。通过这种方式，平行组装多个基因/表达盒。组装的基因侧翼为转座子位点。这些用于将基因转座入杆状病毒基因组。所得的杆状病毒共表达载体确保基因共表达自相同的单一细胞。收率和产物组成根据蛋白的数量和制备参数而变化。利用基质系统和小规模制备系统(2-20ml；Ries,C.,John C.,Eibl R.(2011),A new scale down approach for the rapid developmentof Sf21/BEVS based processes–a case study.In Eibl R.,Eibl D.(Editors):Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture,207-213,John Wiley&Sons,Hoboken,New Jersey)，就收率和早期收获确定制备参数如细胞系、在感染时的细胞计数(CCI)、重组病毒接种物的量(感染复数，MOI)和收获时间(TOH)。然后定义的参数用来大规模制备各产物。利用允许高生产能力的现代一次性组织培养技术制备本发明的颗粒。
本发明的优选生产细胞系为昆虫细胞系如Sf9、Sf21、Hi-5、Vankyrin(VE-1,VE-2,VE-3)、Express Sf+和S2Schneider细胞。为了在哺乳动物细胞，特别是人细胞中表达，使用例如HEK293、CHO、HeLa、Huh7、HepG2、BHK、MT-2、人包皮成纤维细胞(HFF)、骨髓成纤维细胞、原代神经细胞或上皮细胞。为了在酵母中表达，使用酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、白色念珠菌(C.albicans)或毕赤酵母(P.pastoris)。
本发明的宿主细胞的培养和增殖在为特定宿主细胞提供适当条件的任何容器、生物反应器或一次性单元中进行。
利用基于超速离心的经典甘油-酒石酸盐和蔗糖梯度或者基于现代层析的技术，优选利用大的多孔基质如膜吸附剂和整体柱的亲和(IMAC)和离子交换层析，纯化本文所述的CMV颗粒。
本发明的病毒样颗粒用作治疗剂和/或预防性疫苗。此外，它们用作诊断工具中的抗原以及抗体产生的抗原。
对于两种类型的疫苗，预防性或治疗性的，抗原特异性的CD8+、细胞毒性T细胞应答以及抗原特异性的CD4+、T辅助细胞应答是最重要的。因此，VLP的蛋白组合物适合通过表达例如已知的T-细胞刺激物pUL83来诱导T-细胞。为了进一步解决预防性疫苗的不同要求，本发明包含VLP、可溶性蛋白复合物和单一蛋白的组合。VLP的组合物适合包含免疫原性糖蛋白(gpUL75,gpUL55)以及形成不同复合物所必需的蛋白(gpUL115,gpUL128,gpUL130,gpUL131A)。这些组合包括可溶性五聚体复合物[gpUL75(gH),gpUL115(gL),gpUL128,gpUL130,gpUL131A]和病毒样颗粒的组合、一种或多种单一可溶性蛋白(如pUL83,gpUL55)和病毒样颗粒的组合以及病毒样颗粒、五聚体复合物和单一可溶性蛋白的组合。所述组合旨在增强总体免疫应答并诱导产生中和抗体和长期应答。对于中和抗体的诱导，糖蛋白gpUL75(gH)、gpUL115(gL)和gpUL55(gB)是重要靶标，因此在CMV-VLP，优选HCMV-VLP的表面上表达。
本发明的另一方面是CMV-VLP和可溶性五聚体复合物(gpUL75(gH),gpUL115(gL),gpUL128,gpUL130,gpUL131A)在初始免疫-强化免疫方案中的用途，优选用VLP免疫，并且用五聚体复合物加强。用五聚体复合物免疫并VLP加强是合适的免疫接种方案。在这样的初始免疫-强化免疫方案中，VLP和合适的蛋白和/或VLP和DNA的组合是本发明的另一方面。
在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的重组病毒样颗粒的疫苗，特别是这样的疫苗，其进一步包含由gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131A组成的五聚体复合物，和/或选自gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL74、gpUL100和gpUL73；或者gpUL128、gpUL130和gpUL131A；或者pUL83、IE-1、UL99、UL91和pp150的可溶性CMV蛋白。这样的疫苗可以进一步包含选自氢氧化铝、明矾、AS01、AS02、AS03、AS04、MF59、MPL、QS21、ISCOMs、IC31、未甲基化的CpG、ADVAX、包含RNA的制剂和弗氏试剂的佐剂，还有如上文定义的本发明的DNA。
为了减少先天性疾病的机会，防止母亲的第一CMV感染的预防性疫苗是可取的，而在母亲诊断为活性CMV感染的情况下，需要有效的疗法。
本发明的VLP的药物组合物用于预防方法。一种免疫接种人的方法使用本发明的药物组合物，其包含10μg-10mg/剂量的范围中的VLP。假设平均70kg的人接受至少单一免疫接种。优选在第0、8和24周施用包含3个剂量的剂量给药方案，任选地之后选择在最后一次免疫之后12-24个月进行第二轮免疫接种。优选的给药途径为皮下(sc)和肌肉内(im)给药，但是皮内和鼻内也是合适的给药。
本发明的VLP的药物组合物同样用于治疗方法。为了治疗目的免疫接种人的方法使用本发明的药物组合物，其包含10μg-10mg/剂量的范围中的VLP。假设平均70kg的人接受至少单一免疫接种。优选在第0、8和24周施用包含3个剂量的剂量给药方案，任选地之后选择在最后一次免疫之后12-24个月进行第二轮免疫接种。对于女性，本发明的药物组合物包含5μg-10mg/剂量的范围中的VLP，而对于儿童，是这个剂量的一半。
在治疗的另一方面，所述药物组合物包含VLP、五聚体复合物和/或可溶性作为初始免疫-强化免疫方案的单独或组合的药物组合物。每个组分分别以10μg-10mg/剂量的范围使用。VLP和五聚体复合物和/或可溶性蛋白的组合的药物组合物在10μg-10mg/剂量的每种组分的范围中。组分的不同比例同样是可能的。假设平均70kg的人接受至少一次单一免疫接种。优选在第0、8和24周施用包含3个剂量的剂量给药方案，任选地之后选择在最后一次免疫之后12-24个月进行第二轮免疫接种。优选的给药途径为皮下(sc)和肌肉内(im)给药，但是皮内和鼻内也是合适的给药。
本发明的治疗方法对于实体器官、骨髓和/或干细胞移植受体特别重要。对于这些患者，快速且有效的CD8+和CD4+T-细胞应答是至关重要的。为了解决这个主题，本发明的药物组合物在10μg-10mg/剂量的范围中。假设平均70kg的人接受至少一次免疫接种。优选在移植之前第0、2和4周施用包含3个剂量的剂量给药方案，任选地之后选择在移植之后1、4、8周进行第二轮免疫接种。
如现有技术中已知的，本发明的疫苗包含水性溶液中的重组病毒样颗粒、五聚体复合物和/或可溶性蛋白，以及任选存在的其他粘度调节化合物、稳定化合物和/或增加免疫原性的佐剂。
实施例
实施例1：重组表达载体RBT136-7和RBT136-9的构建
为了产生BEVS系统的表达构建体，使用载体骨架pRBT136，其包含在大肠杆菌和酵母(例如酿酒酵母)中增殖以及昆虫细胞中蛋白表达的元件。对于各种VLP变体，选择不同基因用于提供衣壳、间层和表面蛋白。
通过基因合成产生基因，对草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)特异性优化，选出以下巨细胞病毒基因的组：首先来自衣壳室，例如pUL86、pUL85、pUL46、pUL48、pUL50和pUL80.5(UL80A)；第二来自间层部分，例如pUL83、pUL25、ppUL32和pUL99，以及第三来自表面部分，例如gpUL55(gB)、gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL74(gO)、gpUL100(gM)、gpUL73(gN)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。为了建造HCMV衣壳，使用pUL86、pUL85、pUL46和pUL80a的多基因组合，任选地组合功能基因pUL48a和pUL50。所选的间层为pUL83，而表面制备自gpUL55(gB)、gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL74(gO)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。
通过代表启动子-基因-终止子类型的各种表达盒的PCR产物的同源重组来将pUL86-pUL85-pUL50-pUL48-pUL46-pUL83-pUL80.5-gpUL74(gO)平行组装入一个表达载体以及将gpUL75(gH)-gpUL115(gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A组装入第二表达载体。载体骨架pRBT136包含大肠杆菌和酵母的复制起点，用于在昆虫细胞中表达的polh和p10启动子，终止子SV40和HSVtk，几个抗性标记(氨苄西林、庆大霉素)，转座子位点(Tn)以及多克隆位点(MCS)。在5’位点用引物RBT155(tgatttgataataattcttatttaac,SEQ ID NO:63)且在3’位点用35-40nt突出(ggctagctttgtttaactttaagaaggagatacatctaga,SEQ ID NO:64)PCR扩增包含启动子-UL86-终止子的表达盒。为了用包含启动子-UL85-启动子的表达盒同源重组，在N-末端用先前PCR产物的C-末端处的35-40nt突出的互补序列PCR扩增这个部分。同源重组在酵母(酿酒酵母)中进行：将过夜培养物在25℃下以500xg离心5min，将上清吸出，并且将沉淀用水和Tris-EDTA-LiOAc缓冲液洗涤。将用EcoRI和HindIII(1μl)线性化的载体、鲑鱼精DNA(8μl)以及代表表达盒的PCR产物(1-4μl)添加至50μl已洗涤的酵母中，在30℃下温育30min，然后在42℃下热休克，平板接种在没有尿嘧啶的各氨基酸缺失的琼脂平板上，并且温育3天。通过冷冻(液氮，2min)-融解(95℃,1min)-裂解从酵母细胞分离所得的载体。添加相同体积的氯仿之后，用两倍体积的乙醇沉淀载体。将沉淀的载体(5μl)添加至50μl感受态XL-1blue(Stratagene)中，然后根据制造商的方案进行转化：在冰上温育30min，然后在42℃下热休克45sec，在4℃下2min冷休克，添加200μl的2YT培养基，并且在37℃下以220rpm温育1h。然后将培养物平板接种在包含100μg氨苄西林和100μg庆大霉素的2YT琼脂平板上。通过PCR筛选、分析消化和测序验证生长的克隆以证实所有组装的基因的存在。
将基因UL83和UL80.5组装入载体pRBT4，并且通过cre-lox重组与包含pUL86-pUL85-pUL50-pUL48-pUL46-gpUL74(gO)的pRBT136组合。将1μl的cre-重组酶添加至总体积10μl的500ng的pRBT5和pRBT136中，并且在37℃下温育30min。在70℃下热灭活10min之后，如上文所述在XL-1blue感受态细胞中进行转化。通过PCR筛选、分析消化和测序验证克隆。将测序的质粒用于产生相应的杆状病毒基因组(杆粒)。通过位点特异性同源重组通过Tn7定向的转座将所关注的基因转移入感受态DH10MB细胞。将10ng测序的质粒添加至100μl感受态DH10MB细胞中，并且在4℃下温育30min。在42℃下热休克45sec，在4℃下冷休克2min，添加400μl的2YT培养基并在37℃下于220rpm温育4h之后，将1:10稀释液平板接种在适当的2YT琼脂平板上，所述2YT琼脂平板包含根据抗性标记的抗生素以及用于蓝-白筛选的IPTG/X-gal。利用Birnboim&Doly方法(NucleicAcids Res.1979；7(6):1513-23)选择正确的克隆，扩增并分离DNA。选择4个正确的杆粒克隆(每个1μg)用于昆虫细胞(Sf9,1x106细胞/6-孔)的最初转染，使用试剂Fugene(3μl,Roche,Switzerland)，以便产生重组种子病毒(V0)。利用0.05pfu/细胞的感染复数(MOI)在200ml培养物中进行这种病毒的两个连续扩增，用于产生主种子病毒(V1)和工作种子病毒(V2)。通过经典斑块测定确定工作种子病毒的感染滴度。将病毒稀释液(在1ml的体积中105-108)添加至1x106个细胞/6-孔Sf9细胞培养物中，并且在27℃下温育1h。在吸入病毒之后，将细胞用4％琼脂糖覆盖于Sf900-1.3培养基中，然后在加湿室中于27℃下温育。不同构建体的感染滴度在1-5x107pfu/细胞的范围中。
在50ml生物反应器(Cultiflask,Sartorius Stedim)中通过感染20ml昆虫细胞培养物来确定生产参数如细胞系、在感染时的细胞计数(CCI)、重组病毒接种物的量(感染复数，MOI)以及收获时间(TOH)。进行不同CCI(0.5；1,2x106个细胞/ml)、MOI(0.1,0.4,1,2,4)和收获时间(TOH)的矩阵7天以确定关于收率的最佳生产参数(Ries,C.,John C.,Eibl R.(2011),A new scaledown approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes–acase study.In Eibl R.,Eibl D.(Editors):Single-use technology inBiopharmaceutical Manufacture,207-213,John Wiley&Sons,Hoboken,NewJersey)。通过每天采样、确定细胞计数和生存力来控制生产。通过免疫印迹和ELISA分析样品。感染后(p.i.)3天达到评价为最高强度(斑点印迹)和最高OD(ELISA)的关于收率的最佳生产参数，2x106个细胞/mL的感染的细胞计数(CCI)和每种病毒0.2的MOI用于共感染。
对于免疫印迹，通过利用斑点-印迹室(BioRAD)过滤使100μl细胞培养物样品至硝化纤维素膜(BioRAD)。用5％脱脂奶粉TrisCl-Tween20(0.1％)溶液封闭非特异性结合位点30min之后，将膜与抗间层蛋白UL83抗体在4℃下温育过夜。用碱性磷酸酶偶联的第二抗小鼠抗体(Cell signaling)温育之后用NBT/BCIP(ThermoFisher)溶液进行蛋白检测。
对于ELISA测定，在96-孔预吸附的ELISA板(Nunc)中将所有收集的细胞培养物样品1:10稀释于100μl/孔包被缓冲液(0.1M Na2HPO4,pH 9)中，并且在4℃下温育过夜。之后将板用195μl/孔洗涤缓冲液(1xPBS,0.05％Tween20)洗涤3x，然后用195μl/孔1x PBS中的3％BSA在室温下封闭1h。3个洗涤步骤之后，添加3％BSA，1x PBS，0.05％Tween 20，pH 7中的浓度1μg/ml的特异性抗体(100μl/孔)，并且在室温下温育1h。小鼠抗gH(SantaCruz)抗体用于检测表面蛋白gH，而间层蛋白UL83用小鼠抗UL83抗体(Virusys)来验证。3个洗涤步骤之后，用适当的二抗(抗小鼠IgG-HRP，在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween20，pH 7中1:1000稀释)温育1h。利用100μl/孔TMP底物试剂(BD Biosciences,San Diego,USA；根据制造商的方案)检测特异性抗体(UL83,gH)对VLP的结合，此后3-15min之后用100μl 1MHCl终止反应，然后在酶标仪中于450nm下进行OD测量。
如实施例1所述加工用于产生CMV-VLP变体的以下表达载体(pRBT136-x)。
缩写：c：共有序列；H：His-标签；SH：链霉亲和素-His-标签；V：VR1814，pcI：精密蛋白酶，pcII：精密和TEV蛋白酶，DT：二聚化工具。对于表1中基因的描述，使用以前较短的HCMV命名(gB、gH、gL、gO以及没有前缀的“UL”和没有前缀“A”的UL48)。
表1
实施例2：表达载体pRBT136CMV-1；pRBT136CMV-8和pRBT136CMV-20
为了获得表达载体pRBT136CMV-1；pRBT136CMV-8和pRBT136CMV-20，通过BamHI(5’)和HindIII(3’)消化并连接入用相同酶切割的骨架pRBT136来从pBluescript载体亚克隆每个所关注的基因，即UL86、UL55(gB)和gag。在20μl的总体积中用2μg切割的pRBT136、10μg片段和1μl T4-连接酶(NEB)进行连接，然后如实施例1所述在感受态XL-1blue细胞中进行转化。
实施例3：衣壳变体pRBTCMV-2的表达构建体
为了获得衣壳变体pRBTCMV-2的表达构建体用于产生CMV-VLP，如实施例1所述平行组装包含UL86和另一UL83的表达盒。如实施例2所述通过连接使用正向引物RBT204(TGCTGCCCACCGCTGAGCAATAACTATCATAACCCCCGGAATATTAATAGATCATGG,SEQ ID NO:65)和反向引物RBT189(GTAGCGTCGTAAGCTAATACG,SEQ ID NO:66)的PCR产物来进行UL80.5表达盒的整合。
实施例4：衣壳变体pRBTCMV-3的表达构建体
为了产生衣壳变体pRBTCMV-3的表达构建体，用限制性酶AvrII切割变体pRBTCMV-2的质粒。用引物pRBT526(5’)和pRBT189(3’)扩增具有基因UL85的表达盒，并且如实施例1所述通过同源重组将其引入质粒pRBTCMV-2。
实施例5：CMV-VLP变体5的表达、纯化和表征
根据系统优化(实施例1)之后定义的蛋白表达参数，在一次性1L摇瓶(培养体积300mL)中于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(Sf9)中通过共感染包含各个多基因的2种杆状病毒(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:12)来制备包含UL86-UL85-UL50-UL48-UL46-UL83-UL80.5-UL74-gH-gL-UL128-UL130-UL131A的病毒样颗粒(VLP)。制备参数如下：2x106个细胞/ml的初始感染时的细胞计数(CCI)，0.4pfu/ml的感染复数(MOI)，每种病毒0.2pfu/ml，在27℃下于100rpm下温育。在感染后(p.i.)第3天，在约80％的生存力下进行收获。通过每天采样、确定细胞计数和生存力来控制生产。利用切向流过滤用具有100kDa的分子量截止(MWCO)的0.02m2的滤器面积的HydrosartSartocon Slice200盒(Sartorius Stedim)以80ml/min的流速和1-1.5巴的跨膜压将包含VLP的上清浓缩3x。通过2-步甘油-酒石酸盐梯度超速离心纯化保留物。在第一步中，将25ml保留物覆盖在6mL 30％蔗糖垫(w/v在50mMTris,100mM NaCl,pH 7.4中)上，并且利用SW28转子在16000rpm和16℃下沉淀。将沉淀重悬于0.5ml TN-缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,pH 7.4)中。制备甘油-酒石酸盐(与15-35％酒石酸盐混合的30％甘油，12ml体积)，用0.5ml预纯化的材料覆盖，并且利用SW41转子在24000rpm和16℃下离心16h。梯度从上分级为0.9ml级分，并且通过生物化学方法分析纯化的VLP。根据制造商的方案将150μl的不同梯度级分上样至4-12％Bis-TrisNuPAGE凝胶(Invitrogen)上，利用MOPS电泳缓冲液在150V下跑15min，并且在180V下跑45min。将凝胶用SimplyBlue SafeStain试剂(Invitrogen)染色过夜，并且用水脱色。
为了免疫印迹，利用半干装置(BioRAD)在19V下将蛋白转移至硝化纤维素膜(BioRAD)上1h。用5％脱脂奶粉TrisHCl-Tween20(0.1％)溶液封闭非特异性结合位点30min之后，将膜与抗特异性蛋白如间层蛋白pUL83的抗体在4℃下温育过夜。用碱性磷酸酶偶联的第二抗小鼠抗体(Cell Signaling)温育之后用NBT/BCIP(ThermoFisher)溶液进行蛋白检测。
通过适合96-孔板形式的Bradford测定(BCA,Pierce)确定总蛋白。将20μl未知或标准样品在180μl缓冲液中稀释。对一式三份的标准品(纯牛血清白蛋白)或未知的样品进行系列2-倍稀释。每孔添加100μl的2x储备Bradford试剂(Pierce)。然后将板混合，并且在微量滴定板读数器中于595nm下测量吸光度。通过研究抗间层UL83(小鼠抗UL83，Virusys)和表面蛋白gH(小鼠抗gH,Santa Cruz)的特异性抗体的结合来进一步分析通过分级分离甘油-酒石酸盐梯度获得的不同级分中包含的CMV-VLP。因此，在96-孔预吸附的ELISA板中将不同梯度级分1:10稀释于100μl/孔包被缓冲液(0.1M Na2HPO4,pH 9)中，并且在4℃下温育过夜。之后将板用195μl/孔洗涤缓冲液(1xPBS,0.05％Tween20)洗涤3x，然后用195μl/孔1x PBS中的3％BSA在室温下封闭1h。3个洗涤步骤之后，添加3％BSA,1x PBS,0.05％Tween 20,pH 7中浓度为1μg/ml的特异性抗体，抗表面抗体(抗gH)以及抗间层抗体(抗UL83)(100μl/孔)，并且在室温下温育1h，然后是另外3个洗涤步骤。为了检测，用适当的二抗(抗小鼠IgG-HRP，在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween20，pH 7中1:1000稀释)温育1h。利用100μl/孔TMP底物试剂(BD Biosciences,San Diego,USA；根据制造商的方案)检测特异性抗体对VLP的结合，因此3-15min之后用100μl 1M HCl终止反应，然后在酶标仪中于450nm下进行OD测量。
以下表2是如实施例5所述表达、纯化并表征的CMV-VLP变体的概况。在它们用于进一步操作如产生相应的杆状病毒之前，通过测序质量控制表1所述的遗传构建体。通过对每个单一基因的存在的基于PCR的转基因控制，质量控制所产生的杆状病毒的完整性。制备和监管机构批准的最重要的特性如收率和蛋白的共定位，特别是这些CMV VLP的免疫原性表面蛋白的共定位在表2中说明。
表2
实施例6：五聚体CMV复合物的表达、纯化和表征
根据基于系统优化(VLP的实施例1)定义的蛋白表达参数，在一次性2L摇瓶(培养体积700ml)中于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(Sf9)中通过从单一杆状病毒共表达(SEQ ID NO:59)来制备包含gpUL75(gH-His)-gpUL115(gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A的五聚体CMV复合物。制备参数如下：2x106个细胞/ml的初始感染时的细胞计数(CCI)，0.25pfu/ml的感染复数(MOI)，在27℃下于100rpm下温育。在感染后(p.i.)第3天，在约80％的生存力下进行收获。通过每天采样、确定细胞计数和生存力来控制生产。将包含复合物的上清装载至2x 5ml HisTrap柱(GEHealthcare)上。利用50个柱体积(CV，等于500ml)中0-500mM咪唑的线性梯度纯化复合物。通过生物化学方法分析不同的层析级分。用丙酮沉淀150μl的不同级分，重悬于30μl 20mM Tris，150mM NaCl缓冲液，pH 7.4中为了上样至4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)，根据制造商的方案添加4x上样染料，然后利用MOPS电泳缓冲液在150V下电泳15min，并且在180V下电泳45min。将凝胶用SimplyBlue SafeStain试剂(Invitrogen)染色过夜，并且用水脱色。为了浓缩和进一步纯化，利用1ml HisTrap柱，通过50个柱体积中0-500mM咪唑的线性梯度进行第二次IMAC层析。如第一IMAC步骤通过考马斯染色的SDS-PAGE和使用抗His抗体的免疫印迹分析不同级分。将所有包含复合物的级分汇集，利用50kDa截止Amicon过滤单元(Millipore)浓缩至5ml的终体积，对于最后的纯化步骤，装载在大小排阻柱(XK16/69,Superdex200pg)上，并且通过SDS-PAGE然后考马斯染色和使用抗His抗体的免疫印迹进行分析。通过适合96-孔板形式的Bradford测定(BCA,Pierce)确定总蛋白。将20μl未知或标准样品在180μl缓冲液中稀释。对一式三份的标准品(纯牛血清白蛋白)或未知的样品进行系列2-倍稀释。每孔添加100μl的2x储备Bradford试剂(Pierce)。然后将板混合，并且在微量滴定板读数器中于595nm下测量吸光度。通过研究特异性抗体对添加至gpUL75的His-标签(gH，小鼠抗His，AbD Serotec)和gpUL75本身(gH，小鼠抗gH，Santa Cruz)的结合，进一步分析来自基于层析的纯化的不同级分中包含的五聚体CMV复合物。因此，在96-孔预吸附的ELISA板中将不同样品1:10稀释于100μl/孔包被缓冲液(0.1M Na2HPO4,pH 9)中，并且在4℃下温育过夜。之后将板用195μl/孔洗涤缓冲液(1xPBS,0.05％Tween20)洗涤3x，然后用195μl/孔1x PBS中的3％BSA在室温下封闭1h。3个洗涤步骤之后，添加3％BSA,1x PBS,0.05％Tween 20,pH 7中浓度为1μg/ml的特异性抗体，抗His抗体(抗His)以及抗gpUL75抗体(抗gH)(100μl/孔)，并且在室温下温育1h，然后是另外3个洗涤步骤。为了检测，用适当的二抗(抗小鼠IgG-HRP，在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween20，pH 7中1:1000稀释)温育1h。利用100μl/孔TMP底物试剂(BD Biosciences,San Diego,USA；根据制造商的方案)检测特异性抗体对五聚体复合物的结合，因此3-15min之后用100μl 1M HCl终止反应，然后在酶标仪中于450nm下进行OD测量。
实施例7：通过电子显微镜术视觉验证产生的组装物
为了验证纯化的VLP的形状，进行电子显微镜术。将一滴10μl的VLP样品在铜覆盖的EM网上温育10min，用5μl磷钨酸染色5-10min，并且用水脱色2次，每次1min。用Whatman纸去除网上的液体，并且将网转移至JEOL3000显微镜，研究并采集颗粒的图片。
实施例8：使用夹心ELISA的结合测定
进行夹心ELISA作为结合测定以确定不同reVLP(重组VLP)的表面蛋白的存在和可接近性。因此，在96-孔预吸附的ELISA板中的包被缓冲液(0.1M Na2HPO4,pH 9)中添加3％BSA，1x PBS，0.05％Tween 20，pH 7中浓度为1μg/ml的特异性表面和/或间层抗体(100μl/孔)，并且在4℃下温育过夜。之后将板用195μl/孔洗涤缓冲液(1xPBS,0.05％Tween20)洗涤3x，然后用195μl/孔1x PBS中的3％BSA在室温下封闭1h。3个洗涤步骤之后，添加在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween 20，pH 7中1:10稀释的不同VLP(100μl/孔)，并且在室温下温育1h。3个洗涤步骤之后，添加3％BSA,1x PBS,0.05％Tween 20,pH 7中浓度为1μg/ml的特异性抗体，抗表面抗体(抗gH，抗gB)以及抗间层抗体(抗UL83)(100μl/孔)，并且在室温下温育1h，然后是另外3个洗涤步骤。为了检测，用适当的二抗(抗小鼠IgG-HRP，在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween20，pH 7中1:1000稀释)温育1h。利用100μl/孔TMP底物试剂(BD Biosciences,San Diego,USA；根据制造商的方案)检测特异性抗体对VLP的结合。3-15min之后用100μl 1M HCl终止反应，然后在酶标仪中于450nm下进行OD测量。
实施例9：小鼠中的体内研究
对于体内研究，将Balb/C小鼠用于初始免疫-强化免疫-强化免疫方案。每组包含8只小鼠，并且每只小鼠每次注射接受20μg蛋白。对于组合(CMV-reVLP+五聚体复合物)，注射总量40μg蛋白。在小鼠隔离14天之后(第0天)采集免疫前血清。第一次注射在10天后进行，然后在第42天进行加强注射。在第49天进行第一次出血。在第61天进行第二次加强注射，然后在第70天进行另一次出血。最后一次出血在第85天进行，然后研究体液和细胞免疫应答。
实施例10：基于中和测定的体液免疫应答
通过来自实施例9的小鼠血清与来自CMV阴性和CMV阳性人血液捐献者的血清比较的中和测定，研究基于CMV-reVLP(vRBT-20)和五聚体复合物(SEQ ID:59)的组合的疫苗候选物的体液免疫应答。将携带用于分析原因的GFP分子(fix-EGFP)的BAC(细菌人工染色体)-重组的VR1814毒株用于感染成纤维细胞(MRC-5)和上皮(ARPE-19)细胞以使来自实施例9的小鼠血清的中和潜力可视。将2x104个细胞/孔接种入96孔板中包含10％FCS(胎牛血清)的RPMI培养基中。产生8只小鼠的血清池，并且以2倍系列稀释(1:20至1:2560)添加至100μl/孔RPMI/FCS培养基中。以预测定中确定的1000个病毒分子/孔的组织培养感染剂量(TCID)添加上述fix-EGFP VR1814病毒。将96孔板在37℃下于CO2受控气氛中温育8天。在酶标仪中用以下参数进行绿色细胞的确定：荧光素-滤镜[激发485/20，发射530/25)，底部读数模式，时间：0.1sec，96h温育之后25x测量/孔。中和潜力确定为能够表现出50％病毒感染抑制的血清的稀释度。进行以下对照：细胞对照(细胞+PBS)，病毒对照(仅感染的细胞)以及来自人血液捐献者的5个CMV阳性和5个CMV阴性血清。
实施例11：基于EliSpot数据(多重测定)的细胞免疫应答
在体内研究(实施例9)的第85天，将小鼠杀死，并且制备脾细胞用于10种不同细胞因子的分析。对于脾细胞的再刺激，使用CMV-reVLP以及合成肽的混合物。验证以下蛋白：HIVgag、pUL83、gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。利用几种生物信息学算法进行每种蛋白的表位预测。对于每种蛋白，产生4种肽的混合物用于脾细胞的再刺激。对于HIVgag，使用可商购的130种肽的肽混合物(JPT,Berlin)。通过来自Invitrogen的多重测定试剂盒根据制造商的方案研究细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、gCMSF和TNFα)。
实施例12：基于CMV阳性血清中存在的抗体反应的结合测定
为了表征作为疫苗部分的不同CMV VLP和可溶性复合物，进行夹心ELISA形式的双结合测定。通过纯化的单克隆抗体和HCMV阳性血液捐献者的血清混合物中存在的抗体的组合研究不同reVLP的衣壳、间层和表面蛋白的存在和可接近性。因此，在96孔预吸附的ELISA板中将抗CMV单克隆抗体如抗gH、抗gB、抗UL83、抗UL86、抗UL85、抗UL130/UL131A、抗gag、抗His稀释至1μg/ml包被缓冲液(0.10.1M Na2HPO4,pH 9)的终浓度(100μl/孔)，并且在4℃下温育过夜。之后将板用195μl/孔洗涤缓冲液(1xPBS,0.05％Tween20)洗涤3x，然后用195μl/孔1x PBS中的3％BSA在室温下封闭1h。3个洗涤步骤之后，添加在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween 20，pH7中1:10稀释的不同CMV VLP和可溶性复合物(100μl/孔)，并且在室温下温育1h。3个洗涤步骤之后，添加在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween 20，pH 7中1:300稀释的4个CMV阳性人血清的混合物(100μl/孔)，并且在室温下温育1h，然后是另外3个洗涤步骤。
为了检测，用适当的二抗(抗人IgG-HRP，在3％BSA，1x PBS，0.05％Tween20，pH 7中1:1000稀释)温育1h。利用100μl/孔TMP底物试剂(BDBiosciences,San Diego,USA；根据制造商的方案)检测人血清中存在的抗体对组成VLP和可溶性复合物的蛋白的结合。3-15min之后用100μl 1M HCl终止反应，然后在酶标仪中于450nm下进行OD测量选择这种类型的夹心测定，以便基于一边对单克隆抗体的结合和另一边对CMV阳性血清中存在的抗体的结合来验证CMV VLP和可溶性复合物的完整性。对血清中人抗体的结合表明CMV VLP和可溶性复合物的蛋白的可接近性。
实施例13：利用来自CMV阳性捐献者的血清表征不同CMV-reVLP和可溶性复合物
如实施例5所述制备不同CMV-reVLP变体，并且通过基于蔗糖垫的超速离心进行浓缩。将25ml细胞培养物上清覆盖在6mL 30％蔗糖垫(w/v在50mM Tris,100mM NaCl,pH 7.4中)上，并且利用SW28转子在20’000rpm和16℃下沉淀。将沉淀重悬于0.2-0.4ml TN-缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,pH 7.4)中。根据制造商的方案将50μl的重悬沉淀上样至4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，利用MOPS电泳缓冲液在150V下跑15min，并且在180V下跑45min。将凝胶用SimplyBlue SafeStain试剂(Invitrogen)染色过夜，并且用水脱色。
为了免疫印迹，利用半干装置(BioRAD)在19V下将蛋白转移至硝化纤维素膜(BioRAD)上1h。用5％脱脂奶粉TrisCl-Tween20(0.1％)溶液封闭非特异性结合位点30min之后，将膜用5％脱脂奶粉TrisCl-Tween20(0.1％)1:500稀释的来自小鼠(每组8只小鼠的池)或实施例10中提到的人血液捐献者的血清在4℃下温育过夜。用碱性磷酸酶偶联的第二抗小鼠抗体(Cellsignaling)温育之后用NBT/BCIP(ThermoFisher)溶液进行蛋白检测。

Claims (18)

1.一种重组病毒样颗粒，其包含一种或多种衣壳蛋白或衣壳前体蛋白，3种或更多种来自巨细胞病毒(CMV)的表面蛋白，以及任选存在的一种或多种间层蛋白。
2.权利要求1的重组病毒样颗粒，其包含一种或多种衣壳蛋白或衣壳前体蛋白，5种或更多种来自巨细胞病毒(CMV)的表面蛋白，以及任选存在的一种或多种间层蛋白。
3.权利要求1或2的重组病毒样颗粒，其包含一种或多种来自疱疹病毒的衣壳蛋白，以及一种或多种来自人巨细胞病毒(HCMV)的间层蛋白。
4.权利要求1或2的重组病毒样颗粒，其包含一种或多种来自逆转录病毒的衣壳蛋白或衣壳前体蛋白。
5.权利要求1或2的重组病毒样颗粒，其包含一种或多种来自疱疹病毒的衣壳蛋白，3种或更多种来自人巨细胞病毒(HCMV)的表面蛋白以及任选存在的一种或多种来自人巨细胞病毒(HCMV)的间层蛋白。
6.权利要求3的重组病毒样颗粒，其中所述疱疹病毒为人巨细胞病毒HCMV。
7.权利要求4的重组病毒样颗粒，其中所述一种或多种来自逆转录病毒的衣壳蛋白或衣壳前体蛋白为gag。
8.权利要求1-7中任一项的重组病毒样颗粒，其中所述巨细胞病毒表面蛋白选自gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL55(gB)、gpUL74(gO)、gpUL100(gM)、gpUL73(gN)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。
9.权利要求1-7中任一项的重组病毒样颗粒，其中所述间层蛋白选自pUL83和pUL32。
10.一种编码权利要求1-9中任一项的病毒样颗粒中包含的蛋白的DNA。
11.一种包含权利要求10的DNA的载体。
12.一种权利要求11的杆状病毒载体。
13.一种包含权利要求11或12的载体的宿主细胞。
14.一种包含权利要求1-9中任一项的重组病毒样颗粒的疫苗。
15.权利要求14的疫苗，其还包含由gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130和gpUL131A组成的五聚体复合物。
16.权利要求14或15的疫苗，其还包含选自gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL74、gpUL100、gpUL73、gpUL128、gpUL130和gpUL131A的可溶性CMV蛋白。
17.权利要求14、15或16的疫苗，其还包含选自pUL83、IE-1、pUL99、pUL91、pUL82和pp150的可溶性CMV蛋白。
18.权利要求14-17中任一项的疫苗，其包含来自不同CMV毒株的CMV蛋白，所述CMV毒株选自Towne、Toledo、AD169、Merlin、TB20和VR1814毒株。
CN201380057084.6A 2012-10-30 2013-10-30 抗人巨细胞病毒感染的基于重组颗粒的疫苗 Pending CN104853772A (zh)

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