CN116375820A - 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116375820A
CN116375820A CN202310245555.1A CN202310245555A CN116375820A CN 116375820 A CN116375820 A CN 116375820A CN 202310245555 A CN202310245555 A CN 202310245555A CN 116375820 A CN116375820 A CN 116375820A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
recombinant
novel coronavirus
recombinant protein
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310245555.1A
Other languages
English (en)
Inventor
高玉伟
任志广
王铁成
孙伟洋
刘夏薇
赵永坤
冯娜
李元果
朱梦涵
杨松涛
夏咸柱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Original Assignee
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences filed Critical Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority to CN202310245555.1A priority Critical patent/CN116375820A/zh
Publication of CN116375820A publication Critical patent/CN116375820A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用，参考不同SARS‑CoV‑2变异株RBD蛋白的变异位点，选取417、452、478、484、501这5个高频变异位点，设计了RBD‑RBD串联表达重组蛋白，以构建不同的新型冠状病毒重组蛋白，根据位点突变不同，共构建三种重组蛋白，分别命名为NNR、TTR、NTR，该重组蛋白相比于单独表达一个RBD蛋白具有更好的免疫原性，更能刺激机体产生特异性免疫反应。本发明的重组蛋白具有产量高、生产成本低、蛋白纯度高等优点，得到的新型冠状病毒重组蛋白免疫原性好，交叉保护性好，且无生物安全风险等问题，能够激发针对新型冠状病毒原始株及变异株的免疫保护，适用于大规模制备新冠疫苗。

Description

新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2通过其刺突蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)结合进入细胞后，宿主跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)切割刺突蛋白，从而实现细胞膜融合。SARS-CoV-2拥有一个大的RNA基因组，包含约30,000个核苷酸，其复制由RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)和相关的校对酶核糖核酸外切酶(ExoN)介导，与冠状病毒转录的不连续性相结合，导致冠状病毒具有高重组率、插入和缺失率以及点突变率。在新冠大流行期间，SARS-CoV-2的新变种和突变体不时出现，最近出现的Omicron变种RBD中有11种常见的突变变化，这些变异株具有较高的免疫逃逸能力和部分疫苗逃逸能力，使得SARS-CoV-2冠状病毒还在持续流行中。
SARS-CoV-2感染后人并不能建立起防止再次感染的抗体反应，疫苗保护仍是保护人类对抗新冠的有效举措，对SARS-CoV-2感染提供了保护性免疫。迄今为止，十多种疫苗已被世界卫生组织批准使用。
全球疫苗策略共有两种疫苗组选择，经典的疫苗组包括亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗和病毒样颗粒疫苗；新方法包括基于RNA的疫苗，它将编码靶病毒蛋白的RNA输送到人细胞中。与其他类型的疫苗相比，重组蛋白疫苗具有某些优势，主要是安全性高，也可以作为两阶段(初免-加强)疫苗接种的有用补充；使用合适的佐剂在重组蛋白疫苗中可以解决疫苗免疫原性低的问题；与mRNA和病毒载体疫苗不同，重组蛋白疫苗对生产、储存和运输过程的要求较低。
为了应对SARS-CoV-2病毒的不断变异，研发安全有效的SARS-CoV-2疫苗是当今最优先、最紧迫的问题。本发明利用昆虫杆状表达系统，结合高频SARS-CoV-2RBD突变位点表达新的重组蛋白，并进行免疫保护实验，验证了其保护新型冠状病毒的攻击以及对不同变异株之间的交叉保护效果。
发明内容
本发明的目的是提出新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用，通过合理的选取蛋白片段，提高重组蛋白的免疫原性和交叉保护作用，能够用于制备预防新型冠状原始株及变异株病毒的疫苗开发和生产。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供了新型冠状病毒重组蛋白，所述重组蛋白为NNR、TTR、NTR蛋白中的任一种，分别记作NNR、TTR、NTR，其中，NNR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，TTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，NTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，NNR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，TTR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，NTR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明还提供了上述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：通过基因合成技术获得重组蛋白的编码基因，将编码基因与pFastBac1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBac1质粒提供而目的蛋白上没有的两个限制性酶切位点，双酶切后回收线性化载体片段和目的蛋白的基因片段，将目的片段采用酶连的方式插入至pFastBac1质粒PH启动子之后的多克隆位点中，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白；
步骤2：将重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白转化至DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状质粒Bacmid，使用重组杆状质粒Bacmid转染贴壁Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80％以上；
步骤3：将重组杆状病毒按照MOI＝2接种贴壁Sf9昆虫细胞，三天后收获上清并纯化得到新型冠状病毒重组蛋白。
进一步地，上述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，步骤1中两个限制性酶切位点选择为EcoRI和NotI。
进一步地，上述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，步骤2中获得重组杆状质粒的具体步骤如下：将10ng pFastBac1-目的蛋白穿梭质粒加入到DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃下热激45s，然后冰浴3min，加入600ul SOC在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，5500rpm离心2min，弃去多余上清，留100μl重悬菌体，取50μl溶液均匀涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，37℃下培养48h-72h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid。
进一步地，上述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，步骤3中接种重组杆状质粒时贴壁sf9昆虫细胞浓度为2×106/mL以上。
进一步地，上述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，步骤3中新型冠状病毒重组蛋白的纯化方式选用镍柱亲和层析纯化法，具体过程如下：收取贴壁sf9昆虫细胞P3代病毒上清液，按照MOI＝2接种于High Five悬浮细胞中大量扩增培养72h后，收取悬浮细胞培养液在4℃、5000rpm转速下离心20min获得细胞上清，将收取的细胞上清用0.45um滤膜进行过滤，然后与镍柱重力柱进行结合、纯化，收取蛋白洗脱液，经过超滤离心管，PBS透析后获得重组蛋白。
第三方面，本发明还提供了上述的新型冠状病毒重组蛋白在制备预防新型冠状病毒原始株或变异株的疫苗中的应用。。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的新型冠状病毒重组蛋白，参考不同SARS-CoV-2变异株RBD蛋白的变异位点，选取417、452、478、484、501这5个高频变异位点，设计一种RBD-RBD串联表达重组蛋白，以构建不同的新型冠状病毒重组蛋白，根据位点突变不同，共构建三种重组蛋白，分别命名为NNR、TTR、NTR，该重组蛋白相比于单独表达一个RBD蛋白具有更好的免疫原性，更能刺激机体产生特异性免疫反应。
本发明的重组蛋白的工艺方法，利用昆虫杆状表达系统作为表达载体，同时利用细胞作为生物反应器生产新型冠状病毒重组蛋白，具有产量高、生产成本低、蛋白纯度高等优点。
此外，由于本发明的新型冠状病毒重组蛋白免疫原性好，交叉保护性好，且无生物安全风险等问题，能够激发针对新型冠状病毒原始株及变异株的免疫保护，适用于大规模制备新冠疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的NNR、TTR、NTR的基因构成示意图。
图2为本发明实施例提供的重组蛋白免疫荧光图。图中，A是以SARS-CoV-2SpikeRBD兔多抗为一抗获得的重组蛋白NNR免疫荧光图，B是以SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗获得的重组蛋白TTR免疫荧光图，C是以SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗获得的重组蛋白NTR免疫荧光图，D-F是未感染杆状病毒的贴壁sf9细胞以SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗获得的阴性对照图。
图3为本发明实施例提供的重组蛋白表达鉴定结果。图中，A是以SARS-CoV-2RBD单抗鉴定NNR-rBV蛋白表达，B是以SARS-CoV-2RBD单抗鉴定TTR-rBV蛋白表达，C是以SARS-CoV-2RBD单抗鉴定NTR-rBV蛋白表达，D是以his-tag单抗鉴定NNR-rBV蛋白表达，E是以his-tag单抗鉴定TTR-rBV蛋白表达，F是以his-tag单抗鉴定NTR-rBV蛋白表达。
图4为本发明实施例提供的重组蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定结果。图中，A是NNR重组蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液，B是TTR重组蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液，C是NTR重组蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液，D是NNR重组蛋白纯化后以SARS-CoV-2RBD单抗的Western blot鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液，E是TTR重组蛋白纯化后以SARS-CoV-2RBD单抗的Western blot鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液，F是NTR重组蛋白纯化后以SARS-CoV-2RBD单抗的Western blot鉴定：1、Maker；2、细胞原液；3、流穿液；4、洗杂缓冲液；5-10、250mM洗脱液。
图5A为本发明实施例提供的检测免疫针对
SARS-CoV-2(2019-nCov)RBD蛋白的特异性抗体水平。
图5B为本发明实施例提供的检测免疫针对SARS-CoV-2BA.2RBD蛋白的特异性抗体水平。
图5C为本发明实施例提供的检测免疫针对
SARS-CoV-2(2019-nCov)RBD蛋白的IgG1和IgG2a的抗体水平。
图5D为本发明实施例提供的检测免疫针对SARS-CoV-2BA.2RBD蛋白的IgG1和IgG2a的抗体水平。
图5E为本发明实施例提供的检测免疫针对SARS-CoV-2(2019-nCov)RBD蛋白或SARS-CoV-2BA.2RBD蛋白刺激后IgG2a/IgG1的比值。
图6为本发明实施例提供的检测免疫针对SARS-CoV-2的中和抗体效价。
图7为本发明实施例提供的SARS-CoV-2BA.2攻毒后的小鼠体重变化率。
图8A为本发明实施例提供的攻毒后小鼠鼻甲骨中病毒载量检测结果。
图8B为本发明实施例提供的攻毒后小鼠气管中病毒载量检测结果。
图8C为本发明实施例提供的攻毒后小鼠肺中病毒载量检测结果。
具体实施方式
为了更好地理解本技术方案，下面结合附图对本发明的方法做详细的说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的新型冠状病毒重组蛋白，根据新型冠状病毒Spike RBD基因组参考序列(NC_045512.2)，设计位点突变，选取417、452、478、484、501这5个高频变异位点，将两个含有以上位点突变的RBD蛋白连接，构建成为一个新的RBD-RBD重组蛋白，根据位点突变不同，两个蛋白的串联组合不同，共构建3种不同的重组蛋白，分别记作NNR、TTR、NTR。重组蛋白NNR、TTR及NTR的基因构成如图1所示。
重组蛋白NNR从N端到C端的序列构成为：蜜蜂蜂毒素信号肽+SARS-CoV-2RBD蛋白1+SARS-CoV-2RBD蛋白1+10His标签蛋白，SARS-CoV-2RBD蛋白1包含的位点突变分别是：K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y，序列间用连接肽连接，NNR蛋白的基因序列如SEQ IDNO.1所示，所述NNR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
NNR蛋白的基因序列(如SEQ ID NO.1所示)为：
atgaagttcc tggttaacgt ggctctggtg ttcatggtgg tgtacatctc ctacatctacgcccgcgttcagcccacaga atccatcgtg cgcttcccta acatcaccaa cctgtgtccc ttcggtgaggtgttcaacgccacccgtttc gcttcagtgt acgcctggaa ccgtaagcgt atcagcaact gtgttgctgactacagcgtcctctacaact ccgctagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgttagccc caccaagctgaacgacctgtgtttcactaa cgtgtacgct gactccttcg tgatccgtgg tgacgaagtg cgccagatcgccccaggccagactggcaac atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gttgcgtgatcgcttggaacagcaacaacc tggacagcaa ggtgggtggt aactacaact accgctaccg cctgttccgcaagagcaacctgaagccatt cgagcgcgac atcagcactg agatctacca ggccggcagc aagccttgtaacggagtgaagggattcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggtttc caaccaacat acggcgtgggctaccagccttaccgcgtcg tggtgctgag cttcgaactc ctgcacgctc ctgccaccgt ttgtggtcccaagaagagcaccaacctcgt taagaacaag ggcggcggcg gtagcggcgg tggcggctctggtggcggaggcagccgcgt gcaaccaacc gagtccatcg tgcgcttccc caacatcacc aacctgtgccccttcggtgaagtctttaac gccacccgtt tcgctagcgt gtacgcctgg aaccgtaagc gcatcagcaactgcgtcgccgactactcag tgctgtacaa ctccgccagc ttctccacat tcaagtgtta cggtgtttctcctactaagctgaacgacct ctgtttcacc aacgtctacg ctgactcctt cgtgatccgt ggcgacgaggtgcgccaaatcgctcctggc cagactggaa acatcgctga ctacaactac aagctgcctg acgacttcacaggctgcgtgatcgcctgga acagcaacaa cctcgacagc aaggtcggcg gcaactacaa ctaccgttacaggctgttccgtaagagcaa cctgaagcct ttcgaacgtg acatctccac tgaaatctac caggccggttccaagccctgtaacggcgtg aagggtttca actgctactt cccactgcag tcctacggct tccagccaacctacggcgttggttaccagc cataccgcgt tgtggtcctc tccttcgagc tgctccacgc tcctgccaccgtctgcggtcctaagaagtc cacaaacctc gtgaagaaca aggctcatca tcaccatcac catcaccaccaccat
NNR蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.4所示)为：
MKFLVNVALV FMVVYISYIY ARVQPTESIV RFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSV LYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYA DSFVIRGDEV
RQIAPGQTGNIADYNYKLPD DFTGCVIAWN SNNLDSKVGGNYNYRYRLFR KSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGF QPTYGVGYQP YRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKGGGGSGGGGS GGGGSRVQPT ESIVRFPNITNLCPFGEVFN ATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYRYRLFRKSNLKP FERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGV GYQPYRVVVL SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKAHHHHHHHHHH
重组蛋白TTR从N端到C端的序列构成为：蜜蜂蜂毒素信号肽+SARS-CoV-2RBD蛋白2+SARS-CoV-2RBD蛋白2+10His标签蛋白，SARS-CoV-2RBD蛋白2包含的位点突变分别是：K417T、L452R、T478K、E484K、N501Y，序列间用连接肽连接，TTR蛋白的基因序列如SEQ IDNO.2所示，所述TTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
TTR蛋白的基因序列(如SEQ ID NO.2所示)为：
atgaagttcc tggtgaacgt ggccctggtg ttcatggtgg tgtacatcagctacatctacgctcgcgttc agcctactga atccatcgtt cgcttcccta acatcaccaa cctgtgtccattcggcgaagtgttcaacgc tacccgcttc gctagcgtgt acgcttggaa ccgcaagagg atctcaaactgtgtggctgactactccgtg ctgtacaact cagctagctt ctccacattc aagtgctacg gtgtgagccctactaagctgaacgacctgt gtttcaccaa cgtctacgct gactctttcg tgatccgtgg tgacgaagtgcgccagatcgctcctggtca gacaggtacc atcgctgact acaactacaa gctgcctgac gacttcactggttgtgtgatcgcctggaac agcaacaact tggatagcaa ggtcggtggc aactacaact accgctaccgtctgttccgtaagtctaacc tgaagccctt cgagcgtgat atctcaaccg aaatctacca ggctggttctaagccctgtaacggtgtcaa gggtttcaac tgctacttcc cactgcaatc ctacggcttc cagccaacatacggtgtgggctaccagcct taccgcgttg tggttctgag cttcgagctg ctccatgccc ctgctactgtgtgtggtcctaagaagtcca ccaacctcgt taagaacaag ggtggtggtg gttccggtgg tggcggttctggtggtggtggatctcgtgt gcagcctact gaatcaatcg tgcgtttccc taacatcaca aacctgtgtcccttcggtgaagtgttcaac gccactcgtt tcgcttccgt gtacgcctgg aacaggaagc gcatcagcaactgcgttgccgactacagcg ttctgtacaa ctccgcttca ttcagcacct tcaagtgtta cggcgtgagccctactaagctcaacgacct ctgtttcacc aacgtttacg ctgactcttt cgtgatccgt ggcgacgaagtccgccagatcgctcctggt cagactggaa caatcgccga ctacaactac aagctgccag acgacttcaccggctgcgtgatcgcttgga actcaaacaa cctggacagc aaggtgggcg gcaactacaa ctaccgttacaggctgttccgcaagagcaa cctgaagcct ttcgagcgtg acatcagcac cgagatctac caggccggtagcaagccctgcaacggagtg aagggcttca actgctactt ccctctccaa tcctacggct tccaacctacatacggtgtgggctaccagc cctaccgtgt ggtggttctg agcttcgagc tgctgcacgc cccagctactgtgtgtggtcctaagaagtc aactaacctg gttaagaaca aggctcatca tcaccatcac catcaccaccaccat
TTR蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.5所示)为：
MKFLVNVALV FMVVYISYIY ARVQPTESIV RFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSV LYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYA DSFVIRGDEV
RQIAPGQTGTIADYNYKLPD DFTGCVIAWN SNNLDSKVGGNYNYRYRLFR KSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGF QPTYGVGYQP YRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKGGGGSGGGGS GGGGSRVQPT ESIVRFPNITNLCPFGEVFN ATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYRYRLFRKSNLKP FERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGV GYQPYRVVVL SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKAHHHHHHHHHH
重组蛋白NTR从N端到C端的序列构成为：蜜蜂蜂毒素信号肽+SARS-CoV-2RBD蛋白1+SARS-CoV-2RBD蛋白2+10His标签蛋白，SARS-CoV-2RBD蛋白1包含的位点突变分别是：K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y；SARS-CoV-2RBD蛋白2包含的位点突变分别是：K417T、L452R、T478K、E484K、N501Y，序列间用连接肽连接，NTR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述NTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
NTR蛋白的基因序列(如SEQ ID NO.3所示)为：
atgaagttcc tggtgaacgt ggccctggtt ttcatggttg tgtacatcag ctacatctacgcccgcgttcagccaactga atcaatcgtg cgcttcccaa acatcactaa cctgtgtcct ttcggcgaagtgttcaacgccactcgcttc gcttctgtgt acgcttggaa caggaagcgc atctccaact gcgttgccgactacagcgttctgtacaact ccgcttcctt ctcaactttc aagtgttacg gagtctcccc aactaagctgaacgacctgtgtttcactaa cgtctacgct gacagcttcg tgatccgcgg cgacgaggtc cgtcagatcgctccaggtcagacaggaaac atcgctgact acaactacaa gctgccagac gacttcacag gctgcgtgatcgcttggaacagcaacaact tggactctaa ggttggtggc aactacaact accgttaccg tttgttccgtaagagcaacctgaagccttt cgagcgtgac atctccacag agatctacca ggctggttcc aagccttgtaacggagtcaagggcttcaac tgctacttcc ctctgcagag ctacggcttc cagcccacat acggtgtgggttaccagccttaccgtgtgg tcgtgctctc cttcgaactg ctgcacgctc ctgccacagt gtgcggtcctaagaagagcaccaacctggt taagaacaag ggtggtggcg gttctggtgg tggcggttct ggcggcggtggtagccgtgtgcagcctaca gagtccatcg tgcgcttccc taacatcacc aacctctgcc cattcggtgaggtgttcaacgctactcgct tcgcttccgt gtacgcctgg aaccgtaagc gtatctccaa ctgcgtcgctgactactccgtgctgtacaa ctctgcttcc ttctctacct tcaagtgtta cggcgtgagc cctaccaagctgaacgacttgtgtttcaca aacgtctacg ccgactcttt cgtgatccgt ggtgacgaag tccgtcagatcgcccctggtcagacaggaa ccatcgctga ttacaactac aagctgcctg acgacttcac aggttgcgtgatcgcctggaactccaacaa cctcgactcc aaggtgggtg gcaactacaa ctaccgttac cgcctgttccgtaagtctaacctgaagcct ttcgaacgtg acatcagcac cgaaatctac caagccggtt caaagccttgtaacggcgtgaagggtttca actgctactt ccctctccag agctacggtt tccagcccac atacggtgttggctaccagccttaccgtgt ggtggtgctc tccttcgaac tgctgcacgc tcctgctaca gtgtgtggacctaagaagagcaccaacctg gtgaagaaca aggctcatca tcaccatcac catcaccacc accat
NTR蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.6所示)为：
MKFLVNVALVFMVVYISYIYARVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKGGGGSGGGGSGGGGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKAHHHHHHHHHH
本发明参考不同SARS-CoV-2变异株RBD蛋白的变异位点，选取417、452、478、484、501这5个高频变异位点，设计了RBD-RBD串联表达重组蛋白，以构建不同的新型冠状病毒重组蛋白，根据位点突变不同，共构建三种重组蛋白，分别命名为NNR、TTR、NTR，该重组蛋白相比于单独表达一个RBD蛋白具有更好的免疫原性，更能刺激机体产生特异性免疫反应。
新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，通过基因合成技术获得NNR蛋白，TTR蛋白以及NTR蛋白，将三种蛋白的编码基因与pFastBac1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBac1质粒提供而目的蛋白上没有的两个限制性酶切位点，双酶切后回收线性化载体片段和目的蛋白的基因片段，将目的片段采用酶连的方式插入至pFastBac1质粒PH启动子之后的多克隆位点中，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白。
本发明步骤1中重组蛋白NNR、TTR及NTR的编码基因与pFastBac1载体的酶切位点为EcoRI和NotI。
步骤2，将重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白转化至DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状质粒Bacmid，使用重组杆状质粒Bacmid转染贴壁Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80％以上。
本发明步骤2中重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白的分子克隆由常规转化DH5α感受态细胞克隆得到；获得重组杆状病毒质粒的具体操作步骤如下：10ng pFastBac1-目的蛋白穿梭质粒加入到DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃下热激45s，然后冰浴3min，加入600ul SOC在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，5500rpm离心2min，弃去多余上清，留100μl重悬菌体，取50μl溶液均匀涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，37℃下培养48h-72h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid，通过DNA转座实现DH10Bac感受态细胞中空白杆粒与pFastBac1-目的蛋白穿梭质粒间的DNA同源重组。
步骤3，将重组杆状病毒按照MOI＝2接种贴壁Sf9昆虫细胞，三天后收获上清得到新型冠状病毒重组蛋白。接种重组杆状质粒时贴壁sf9昆虫细胞浓度为2×106/mL以上。
本发明步骤3重组蛋白选取镍柱亲和层析纯化法，具体过程如下：收取贴壁sf9昆虫细胞P3代病毒上清液，按照MOI＝2接种于High Five悬浮细胞中大量扩增培养72h后，收取悬浮细胞培养液在4。C、5000rpm转速下离心20min获得细胞上清，将收取的细胞上清用0.45um滤膜进行过滤，然后与镍柱重力柱进行结合、纯化，收取蛋白洗脱液，经过超滤离心管，PBS透析后获得NNR目的蛋白纯度约为93.93％；TTR目的蛋白纯度约为94.52％；NTR目的蛋白纯度约为93.77％的高纯度重组蛋白。
实施例1
选用以下材料对本发明的重组蛋白制备方法和应用进行验证。
供体质粒pFastBac1由军事医学科学院军事医学研究院军事兽医研究所病毒室提供；主要试剂E.coli DH5α和E.coli DH10Bac抗生素等购自索莱宝公司，蛋白基因合成由通用生物公司提供，重组质粒基因测序和引物合成等技术服务由上海生工生物工程有限公司生物提供，昆虫细胞转染试剂盒购自Invitrogen公司，核酸内切酶、Grace贴壁培养基购自Thermo公司，基因组提取试剂盒购自AXYGEN公司，SIM SF、SIM HF购自北京义翘神州公司，SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗购自GeneTex公司。
实验方法如下：
S1，使用基因合成得到的重组蛋白NNR、TTR、NTR的基因片段，利用EcoRI和NotI酶切位点将得到的目的基因克隆到pFastBac1质粒中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板过夜培养，筛选阳性菌，测序、PCR和酶切鉴定，得到正确的pFastBac1-目的蛋白质粒。SEQID NO.7、SEQ ID NO.8分别为鉴定目的基因NNR、TTR、NTR片段的PCR上下游引物。
上游引物序列为：5’-GCTATAGTTC TAGTGGTTGG CTACGT-3’。
下游引物序列为：5’-ATGATCCTCT AGTACTTCTC GACAAGCT-3’。
S2，构建重组杆状质粒
使用pFastBac1-NNR质粒转化DH10Bac感受态细胞，从细菌中生长产生的蓝白斑菌落中挑选白斑，提取质粒进行PCR鉴定正确，得到重组杆状质粒NNR-Bacmid，用相同的方法得到TTR-Bacmid、NTR-Bacmid。
S3，拯救重组杆状病毒
将鉴定阳性的3种Bacmid质粒用Cellreagent转染试剂盒转入贴壁Sf9细胞，27℃培养三天后，收集细胞培养上清P1，将P1按2％的体积比接种到新的Sf9细胞中，继续培养以扩增病毒毒力，培养三天收集P2代上清，将P2按2％的体积比接种到新的Sf9细胞中，继续培养三天后收集P3代上清，提取P3代上清中的DNA进行PCR验证，并观察记录P3代细胞形态变化，用间接免疫荧光对P3代细胞进行表达鉴定，图2A～图2C分别为以SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗使用间接免疫荧光法获得的3种杆状病毒感染的Sf9细胞的检验图，由图2A～图2C发现3种杆状病毒感染的P3代Sf9细胞均有强烈的绿色荧光表达，说明Sf9细胞成功表达3种重组蛋白。
S4，大量表达与纯化重组蛋白
用Takara公司的快速杆状病毒滴度检测试剂盒测定P3代杆状病毒滴度，用P3代杆状病毒按MOI＝2接种大量培养的悬浮High Five细胞，72h后收取细胞上清培养，经镍柱亲和层析纯化后得到重组蛋白。
(1)使用Western bolt验证实施例制备的3种重组蛋白
用SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗进行Western bolt验证，发现3个重组蛋白均在55-70KDa有条带如图3A-C所示，说明3种重组蛋白表达正确；
用his tag鼠单抗作为一抗进行Western bolt验证，发现3个重组蛋白均在55-70KDa有条带如图3D-F所示，说明his标签蛋白表达正确。
(2)使用SDS-PAGE及Western bolt验证镍柱纯化的3种重组蛋白；
SDS-PAGE验证蛋白镍柱纯化过程中，细胞原液、流传液、洗脱液各组分的蛋白情况，结果如图4A-C所示，可以看到使用咪唑洗脱后可以得到重组蛋白。
用SARS-CoV-2Spike RBD兔多抗为一抗进行Western bolt验证白镍柱纯化过程中，细胞原液、流传液、洗脱液各组分的蛋白情况，发现3个重组蛋白均在55-70KDa有条带结果如图4D-F所示，说明本发明的3种重组蛋白纯化成功。
实施例2
选用以下材料研究发明新型冠状病毒重组蛋白的免疫性能，BCA蛋白定量检测试剂盒购自碧云天生物技术公司，HPR标记山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a购自abcam公司，小鼠IFN-γ和IL-4的ELISApot检测试剂盒购自Mabtech公司，AddaVax佐剂购自Invivogen公司，6-8周龄和9月龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华公司。
1、实验具体过程如下：
S1，免疫和攻毒
用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度，在0周和3周给6-8周龄青年鼠肌肉注射0.1mL含有1ug/10ug重组蛋白及AddaVax佐剂的疫苗，另设AddaVax佐剂对照组，PBS对照组。在0周和3周给9月龄青年鼠肌肉注射0.1mL含有10ug重组蛋白及AddaVax佐剂的疫苗，另设AddaVax佐剂对照组，PBS组对照组。第二次免疫后14天进行老龄鼠攻毒保护实验，在生物安全三级实验室中，以104PFU SARS-CoV-2BA.2采用鼻腔滴入的方式进行攻毒，每只小鼠接种50ul病毒液，所有的试验条件和试验程序都遵从国际疼痛研究协会的的道德准则。
S2，特异性IgG抗体检测
在小鼠免疫后3周、5周眼眶采血，采取的血液于室温放置2h后经4000rpm离心10min，分离出上层血清于-20℃储存；用ELISA试验检测血清中的新冠病毒特定的IgG、IgG1和IgG2a，用SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD蛋白，SARS-CoV-2BA.2(Omicron)Spike RBD蛋白以2μg/mL在4℃过夜包被96孔板、用5％的BSA室温封闭2h，在96孔板中加入稀释好的血清样品37℃孵育1.5h，用PBST清洗后再用HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a在37℃孵育1h，用PBST清洗后加入TMB在25℃作用30min，之后加入50μL ELISA终止液终止反应，用分光光度计在450nm处检测结果。
S3，中和抗体效价测定
在小鼠免疫后3周、5周眼眶采血，采取的血液于室温放置2h后经4000rpm离心10min，分离出上层血清于-20℃储存；在生物安全三级实验中，应用
野生型病毒中和试验。56℃热灭活处理30min。用含1％青霉素-链霉素和2％胎牛血清白蛋白组分2倍稀释血清(1：10～1：20480)与100个TCID50的SARS-CoV-2在37℃孵育1h，然后转移到预先铺好的Vero E6细胞的96孔板中，37℃培养60h。孵育结束后在电子显微镜下观察每孔细胞病变状态，按Reed-Menuch方法计算小鼠免疫组血清的中和效价。
S4，攻毒保护实验：攻毒后15天内观察各组小鼠体重变化，实验各组小鼠的体重变化如图7所示。
S5，肺脏病毒载量测定
取解剖后的小鼠肺脏研磨匀浆上清，经磁珠法提取病毒RNA，采用一步法实时荧光PCR技术，以新型冠状病毒ORF1ab特异性基因为靶区域，设计特异性引物探针，通过检测荧光信号的变化，对样品中的新型冠状病毒核酸进行定量检测。
2、实验结果
(1)新型冠状病毒重组蛋白在小鼠体内激发的特异性IgG抗体检测结果
分别检测免疫的3、5周的小鼠血清中的针对SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD蛋白或SARS-CoV-2BA.2(Omicron)Spike RBD蛋白的检测结果如图5A-B所示，两种蛋白刺激下都产生强烈的特异性抗体反应，一次免疫组和两次免疫组小鼠均显著高于对照组小鼠IgG抗体效价。两次免疫组小鼠IgG抗体效价明显高于一次免疫组小鼠，且抗体效价与免疫剂量成正相关递增趋势。其中加强免疫后高剂量组血清最高稀释比1:1024000仍为阳性。总的来说，三种重组蛋白NNR、TTR、NTR免疫小鼠后可引起强烈的体液免疫，并且TTR低、高剂量组在一次免疫中显示更高的抗体水平。对所有免疫组的第五周血清的IgG1和IgG2a抗体亚型进行检测，如图5C-E所示，所有免疫组针对Wuhan SARS-CoV-2Spike RBD及Omicron SARS-CoV-2Spike RBD抗原的IgG1的滴度比IgG2a的滴度高，说明病毒产生特异性免疫反应的抗体以IgG1为主。在免疫效果评估中，IgG2a/IgG1水平低说明比起细胞免疫，重组蛋白免疫小鼠后主要诱导体液免疫的产生来起到保护作用。
(2)新型冠状病毒重组蛋白在小鼠体内激发的中和抗体检测结果
检测免疫后第3、5周小鼠血清中针对SARS-CoV-2的中和抗体效价，检测结果如图6所示，第一次免疫后中和抗体效价与对照组无明显差别，第二次免疫后中和抗体效价显著高于对照组，且两次免疫后效价整体显著高于一次免疫后效价。其中TTR组高免疫剂量两次免疫实验组最高稀释1280倍仍可检测到中和抗体，TTR组低免疫剂量两次免疫实验组最高稀释320倍仍可检测到中和抗体。
(3)新型冠状病毒重组蛋白的攻毒保护研究
SARS-CoV-2BA.2攻毒组小鼠的体重变化率曲线如图7所示，攻毒对照组小鼠体重呈缓慢下降趋势，各攻毒实验组组间的小鼠图中变化率区别较小，体重基本保持稳定。通过体重率检测结果可知，本发明的3种重组蛋白针对新冠变异株都具有良好的保护效果。
(4)新型冠状病毒重组蛋白能抑制SARS-CoV-2病毒的复制
对攻毒后第四天小鼠解剖后的鼻甲骨、气管、肺脏进行研磨，使用针对ORF1a/b基因的引物，用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏中病毒载量变化。结果如图8A-C所示，在对照组小鼠器官中检测到了高表达的SARS-CoV-2病毒RNA拷贝数；免疫组小鼠器官中SARS-CoV-2病毒RNA拷贝数均低于病毒对照组。实验结果表明，本发明的3种新型冠状病毒重组蛋白能有效抑制SARS-CoV-2病毒的复制。此外，在3种新型冠状病毒重组蛋白中，TTR组的综合免疫保护作用最好，TTR组能针对SARS-CoV-2病毒产生高水平的攻毒保护率、特异性IgG抗体和中和抗体，抑制新冠病毒的复制，重组蛋白的免疫保护作用以体液免疫为主。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置实施例、电子设备实施例、计算机可读存储介质实施例和计算机程序产品实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为NNR、TTR、NTR蛋白中的一种，其中，NNR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，TTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，NTR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，NNR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，TTR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，NTR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：通过基因合成技术获得重组蛋白的编码基因，将编码基因与pFastBac1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBac1质粒提供而目的蛋白上没有的两个限制性酶切位点，双酶切后回收线性化载体片段和目的蛋白的基因片段，将目的片段采用酶连的方式插入至pFastBac1质粒PH启动子之后的多克隆位点中，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白；
步骤2：将重组穿梭质粒pFastBac1-目的蛋白转化至DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状质粒Bacmid，使用重组杆状质粒Bacmid转染贴壁Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80％以上；
步骤3：将重组杆状病毒按照MOI＝2接种贴壁Sf9昆虫细胞，三天后收获上清并纯化得到新型冠状病毒重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1中两个限制性酶切位点选择为EcoRI和NotI。
7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2中获得重组杆状质粒的具体步骤如下：将10ng pFastBac1-目的蛋白穿梭质粒加入到DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃下热激45s，然后冰浴3min，加入600ul SOC在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，5500rpm离心2min，弃去多余上清，留100μl重悬菌体，取50μl溶液均匀涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，37℃下培养48h-72h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid。
8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3中接种重组杆状质粒时贴壁sf9昆虫细胞浓度为2×106/mL以上。
9.根据权利要求5所述的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3中新型冠状病毒重组蛋白的纯化方式选用镍柱亲和层析纯化法，具体过程如下：收取贴壁sf9昆虫细胞P3代病毒上清液，按照MOI＝2接种于High Five悬浮细胞中大量扩增培养72h后，收取悬浮细胞培养液在4℃、5000rpm转速下离心20min获得细胞上清，将收取的细胞上清用0.45um滤膜进行过滤，然后与镍柱重力柱进行结合、纯化，收取蛋白洗脱液，经过超滤离心管，PBS透析后获得重组蛋白。
10.根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒重组蛋白在制备预防新型冠状病毒原始株或变异株的疫苗中的应用。
CN202310245555.1A 2023-06-05 2023-06-05 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用 Pending CN116375820A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310245555.1A CN116375820A (zh) 2023-06-05 2023-06-05 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310245555.1A CN116375820A (zh) 2023-06-05 2023-06-05 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116375820A true CN116375820A (zh) 2023-07-04

Family

ID=86974142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310245555.1A Pending CN116375820A (zh) 2023-06-05 2023-06-05 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116375820A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113185613B (zh) 新型冠状病毒s蛋白及其亚单位疫苗
WO2021184560A1 (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
WO2021254327A1 (zh) 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN116333161B (zh) 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN105669838B (zh) 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体
CN112076315A (zh) 新冠病毒s蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用
CN110272473B (zh) 甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN110951699B (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN114437185A (zh) 冠状病毒三聚体亚单位疫苗及其应用
CN110951778B (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
CN113817753B (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN112142828B (zh) 一种gE基因及表达该基因的载体
CN113373179A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白（S）或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用
KR100224331B1 (ko) 조환수두 대상포진바이러스 및 그 제작방법
CN116376850A (zh) B3基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途
CN116375820A (zh) 新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法和应用
CN115044562A (zh) 一种嵌合表达分子佐剂的重组狂犬病病毒及其制备方法与应用
CN116549627A (zh) 基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用
CN115322247A (zh) 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用
US20080069830A1 (en) Dna Sequences, Peptides, Antibodies and Vaccines for Prevention and Treatment of Sars
CN116284265B (zh) 一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDV H蛋白、突变CDV病毒及应用
CN114107230B (zh) 一种牛疱疹病毒1型ul41缺失毒株及其获取方法
CN103740736B (zh) 化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用
CN114957411B (zh) 一种正戊型肝病毒属基因c1型病毒orf2重组蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination