CN112142828B

CN112142828B - 一种gE基因及表达该基因的载体

Info

Publication number: CN112142828B
Application number: CN201910574557.9A
Authority: CN
Inventors: 周晨亮; 何强; 沈巧英; 周凌云; 江元翔; 刘革; 曾宪放; 史力; 莫呈钧; 张智
Original assignee: Immune Path Biotechnology Suzhou Co Ltd
Current assignee: Immune Path Biotechnology Suzhou Co Ltd
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: WO2020259558A1; CN112142828A

Abstract

本发明涉及一种gE基因及表达该基因的载体。本发明公开了一种具有免疫原性的蛋白及其编码基因。本发明还公开了所述具有免疫原性的蛋白的制备方法。

Description

一种gE基因及表达该基因的载体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种gE基因及表达该基因的载体。本发明公开了一种具有免疫原性的蛋白及其编码基因。本发明还公开了所述具有免疫原性的蛋白的制备方法。

背景技术

水痘带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）是八种人类疱疹病毒之一，即3型人疱疹病毒。水痘-带状疱疹病毒全球流行，具有很强的传染性，迄今只发现一种血清型，在自然界VZV仅感染人类。既可引发水痘，也可引发带状疱疹（herpes zoster，HZ），水痘通常见于儿童期，带状疱疹则在成年以后才会发病。在原发感染水痘后，病毒可潜伏在宿主的神经节中，随着年龄增长、免疫功能受损或发生免疫抑制，VZV可以被重新激活并引发带状疱疹。带状疱疹临床表现为单侧性水泡样皮疹，明显的特征是仅局限于单一皮肤节段，通常伴神经根性疼痛。患者可有明显疼痛和不适，症状可持续数周或数月，在重症患者中甚至可持续数年，导致生活质量下降，极少数情况下带状疱疹也可无皮疹出现。约25%带状疱疹患者会发生并发症，并且随着年龄的增长而增加。最常见的严重并发症是带状疱疹后神经痛（post-herpetic neuralgia, PHN ），即疱疹急性期后仍持续存在的疼痛，在带状疱疹患者中发生率为10%-30%，疼痛可持续数月甚至数年，严重影响患者生活质量。影响带状疱疹发病的因素有年龄、免疫功能缺陷、性别以及其他潜在因素。

大多数原发的VZV感染发生在童年，然后VZV潜伏在神经节中，成年后VZV可以被再激活。研究表明，约99%的40岁及以上的美国人有感染过VZV的血清学证据；90%的20-29岁的欧洲人抗VZV血清反应为阳性；在南美洲、澳大利亚和亚洲的一些国家，原发性VZV感染可能会发生得晚一些，但90%的40岁以上人群会出现VZV血清阳性反应。因此在全球范围内，绝大多数成年人都有发生带状疱疹及其相关并发症的危险。全球带状疱疹的发病率为（3~5）/1000人年，亚太地区为(3~10)/1000人年，并以2.5％~5.0％的速率逐年递增，住院率(2~25)/10万人年，死亡率(0.017~0.465)/10万人年，复发率1％~6%。目前我国属于高度老年化状态，HZ带来的社会经济负担也在逐年加重，对个体而言，HZ给患者尤其是老年患者生活质量带来了巨大的负面影响。据国家统计局公布的数据估计2017年40岁以上人口约6.5亿，若按照HZ发病率为2.5/1000人年保守估计我国每年新发HZ约160万例。

由于药物治疗只能缓解症状，接种疫苗是预防HZ及其并发症的最佳策略。目前全球仅有2款HZ疫苗上市销售（HZ减毒活疫苗Zostavax和HZ亚单位疫苗Shingrix）。默沙东的Zostavax为减毒活疫苗，所含病毒株与水痘疫苗所用的VZV Oka株相同，该疫苗配方所采用的最低效力为19400 PFU，于2006年获得FDA批准上市，迄今已在60多个国家获准可在50岁以上人群中皮下接种1剂，用于预防HZ。葛兰素史克开发的Shingrix是一种基于重组gE蛋白辅以新型佐剂AS01_B的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫苗在老年人中有着优于Zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获FDA批准上市，适用于50岁及以上人群，需接种2剂。目前Shingrix已被附条件批准在中国上市，蛋Shingrix因产能等问题而全球缺货，而中国在研疫苗多为减毒活疫苗，其保护效力和免疫持久性会低于Shingrix，因此国内急需一种自主研发的亚单位疫苗用于减少由带状疱疹及其并发症引起的疾病负担。

尽管现有技术中已经开发了一些针对VZV的疫苗，然而还存在VZV gE蛋白表达效率不佳，表达获得的蛋白活性低，免疫效果不理想等问题。因此，本领域还有必要开发改进的VZV疫苗抗原和疫苗产品。

发明内容

根据本发明的第一方面为提供一种重组带状疱疹疫苗组合物，该组合物中包含一种VZV病毒的gE蛋白，该蛋白可通过CHO细胞高效表达获得。

在一个优选的实施方式中，上述gE蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种编码VZV病毒gE蛋白的基因，所述基因为能够在CHO细胞中高效表达的gE基因，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有所述的gE基因的序列。根据本领域的常规知识，表达载体包含启动子和编码gE蛋白质的序列的克隆位点，使得启动子和序列可操作地连接。表达载体还可存在其他元件，诸如信号肽序列(有时称为前导序列）、标签序列、转录终止信号、复制起点以及编码可选产物的序列。在一优选的实施方式中，所述的表达载体通过将gE基因5’和3’端分别引入XbaI和NotI限制性内切酶酶切位点，分别克隆至携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体中来获得。

在一优选的实施方式中，所述表达载体含有前述gE基因。

VZV gE蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。常常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。在本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的表达载体，或其基因组中整合有前述gE基因。在一个优选的实施方式中，前述细胞为CHO细胞。在一优选的实施方式中，所述细胞为含有本发明的gE基因或表达载体的CHO细胞，所述细胞能够高水平地表达生产gE蛋白。

在本发明的第五方面，提供一种具有免疫原性的蛋白，所述的蛋白为VZV病毒的gE蛋白，所述的gE蛋白是由CHO细胞表达。

在一优选的实施方式中，所述的具有免疫原性的蛋白通过以下方法制备获得：

(1) 培养所述的基因工程化的细胞，从而在细胞内表达所述的VZV病毒的gE蛋白；

(2) 分离所述的VZV病毒的gE蛋白。

在本发明的第六方面，提供所述的疫苗组合物的用途，用于预防或治疗带状疱疹病毒感染相关疾病或病症。

在本发明的第七方面，提供了一种在CHO细胞中表达VZV病毒的gE蛋白的方法，包括下述步骤：

(1) 将本发明的gE基因克隆入表达载体中；

(2) 将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；

(3) 通过迷你细胞群的筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；

(4) 使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV蛋白。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(1)中所述的表达载体为携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和/或携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(2)中使用的CHO细胞为CHO-K1细胞。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

实施例1 水痘带状疱疹病毒gE蛋白的克隆构建、表达与纯化

1、gE蛋白的选择与（gE基因的）合成

通过NCBI数据库和文献检索，选择了一段保守的截短gE蛋白氨基酸序列作为进行基因优化的基础，蛋白序列如下，全长546个氨基酸（SEQ ID NO：1），具体如下，该序列中包括了信号肽和抗原主体部分，但不包括野生型gE蛋白中的C端和锚定区域。

MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDD

FHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKA

YDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSG

ERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVN

VDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLR

APIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLK

HTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEAD

QPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYL

GVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVT

PQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEA

PFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLS

HMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLG

ISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVY

FNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPA

TTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLA

为了利于gE蛋白在CHO细胞中高效表达，选择CHO细胞偏好的密码子对gE基因（如SEQ ID NO：2）进行优化，并委托外包公司合成，具体如下。需要说明的是，优化原则并非简单选择CHO细胞中频率最高的密码子，而是一个较为复杂的优化方案。整体上的优化原则有三：第一，根据密码子的简并性，用CHO细胞中各氨基酸对应的高频密码子替换原有密码子；第二，为避免转录后的mRNA中过高的GC含量对其二级结构造成影响，进而影响翻译效率，在优化过程中尽量将基因的GC%控制在40-60%；第三，避开一些常用的限制性酶切位点。

ATGGGCACCGTCAATAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTTGGCATCATTACCGGAACACTCCGGATCACCAACCCTGTCAGGGCCTCCGTGCTCCGGTATGACGACTTCCACATCGATGAGGACAAGCTGGACACAAACTCCGTCTACGAGCCCTACTACCACAGCGACCATGCCGAGAGCTCCTGGGTGAACAGGGGCGAAAGCTCCAGGAAGGCCTACGACCATAACTCCCCCTATATCTGGCCTAGGAACGACTACGACGGCTTTCTGGAGAACGCCCATGAGCATCATGGAGTCTATAACCAGGGCAGGGGCATCGACAGCGGCGAGAGGCTGATGCAACCCACCCAGATGTCCGCCCAGGAGGATCTGGGCGATGACACCGGAATCCATGTGATCCCTACCCTGAACGGCGATGACAGGCACAAGATCGTCAATGTGGACCAGCGGCAGTACGGAGATGTGTTCAAGGGCGACCTGAATCCCAAGCCCCAGGGCCAGAGGCTGATCGAGGTGAGCGTGGAGGAGAACCATCCCTTTACCCTCAGGGCCCCTATCCAGCGGATCTACGGCGTGAGGTACACCGAGACCTGGTCCTTCCTGCCCTCCCTGACATGTACAGGCGACGCCGCCCCCGCTATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTTCAGGATGTGGTCGTCGACGTGGACTGCGCCGAGAACACAAAAGAAGACCAGCTGGCCGAGATCTCCTACAGGTTCCAAGGCAAGAAGGAAGCTGACCAGCCCTGGATCGTCGTCAACACATCCACACTCTTCGACGAATTAGAACTCGATCCCCCTGAAATCGAGCCCGGAGTGCTCAAGGTGCTGCGGACCGAGAAGCAGTACCTCGGCGTGTATATCTGGAACATGCGGGGCAGCGACGGAACAAGCACATACGCTACCTTCCTGGTGACCTGGAAGGGCGACGAAAAGACCAGGAACCCTACCCCTGCCGTGACACCTCAGCCTAGGGGCGCCGAATTCCACATGTGGAACTATCATTCCCACGTGTTCAGCGTCGGCGACACCTTCAGCCTCGCCATGCACCTGCAGTACAAGATCCATGAGGCCCCCTTCGACCTGCTGCTGGAGTGGCTGTATGTCCCTATCGACCCTACCTGCCAACCCATGAGGCTGTATTCCACCTGTCTCTACCATCCCAACGCTCCTCAGTGCCTCAGCCATATGAACTCCGGCTGTACCTTCACCTCCCCTCACCTGGCCCAACGGGTGGCCTCTACCGTGTATCAGAATTGCGAGCACGCCGACAACTACACAGCCTATTGCCTGGGCATCAGCCATATGGAGCCTTCCTTTGGCCTGATTCTGCACGACGGCGGAACCACCCTGAAGTTTGTGGATACCCCCGAGTCCCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTCGTGTACTTTAACGGCCACGTGGAAGCCGTCGCCTACACCGTCGTGAGCACCGTCGACCACTTCGTGAACGCCATCGAAGAGCGGGGCTTTCCTCCTACAGCCGGCCAGCCTCCTGCCACAACCAAGCCCAAAGAGATCACACCCGTGAACCCTGGCACCAGCCCCCTCCTCAGGTATGCTGCCTGGACAGGAGGACTGGCTTGATGA

2、gE蛋白表达质粒的克隆构建

将上述合成的gE基因5’和3’端分别引入Xba I和Not I限制性内切酶酶切位点，通过PCR扩增该片段并将其分别克隆至表达载体pWX2.0和pWX1.0中。载体pWX2.0携带杀稻瘟菌素抗性基因，pWX1.0携带博来霉素抗性基因。

这两个载体均使用巨细胞病毒（CMV）启动子/增强子序列来进行目的基因的表达。CMV启动子是目前较为常用的启动真核基因表达的强启动子。经克隆构建获得相应的表达质粒，并通过酶切和测序鉴定序列无误。

需要说明的是，上述两个表达载体的构建方式为本领域的常规技术手段，作为举例，可参考的构建方式为：

2.1表达载体pWX2.0-B-gE的构建

以质粒pUC57-gE为模板，用Xba I (NEB, Cat. #: R0145S)和Not I-HF (NEB,Cat. #: R3189S)双酶切后得到1660 bp的DNA片段，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在UV灯下进行割胶并回收该1660bp的DNA片段。

利用限制性内切酶Xba I (NEB, Cat. #: R0145S)和Not I-HF (NEB, Cat. #:R3189S)双酶切载体pWX2.0，回收大小为4775bp酶切产物。将上述1660bp的回收片段连接到上述4775bp的pWX2.0载体中，连接产物转化至TOP10感受态细胞，并用含有杀稻瘟菌素的平板筛选，得到若干单克隆阳性菌落，从中挑取部分进行PCR扩增和测序验证。随后，挑取一个测序验证正确的克隆，在LB平板上划线两次，将分离得到的单克隆转接到300ml LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），37 ℃，220 rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒DNA，最终得到的质粒命名为pWX2.0-B-gE。

2.2表达载体pWX1.0-Z-gE的构建

同2.1中步骤，以质粒pUC57-gE为模板，用Xba I和Not I-HF双酶切后得到1660bp的DNA片段，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在UV灯下进行割胶并回收该1660bp的DNA片段。

使用限制性内切酶Xba I和Not I-HF对载体pWX1.0进行双酶切，使用胶纯化试剂盒回收4172bp的载体片段。将上述1660bp的回收片段连接到上述4172bp的pWX1.0载体片段中，连接产物转化至TOP10感受态细胞，挑选若干单克隆，进行PCR和测序验证。随后，挑取一个测序验证后正确的克隆，在LB平板上划线两次，将分离得到的单克隆转接到300 ml LB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素钠），37℃，220 rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒DNA，最终得到的质粒命名为pWX1.0-Z-gE。

3、gE蛋白表达质粒的表达和纯化

通过上述2中的方式，大量制备表达质粒，经线性化后稳定转染至宿主细胞CHO-K1。在本实施例中，共进行了6组转染试验。随后用分批补料培养的方式对每组转染的迷你细胞群进行筛选，选择表达量较高的细胞群进行后续有限稀释法克隆筛选。可知，在所有的6组迷你细胞群中，平均细胞表达量在1-1.5g/L之间，而最高的三组细胞群的表达量在1.5-2g/L之间，最高的一组细胞群蛋白表达量可为2.01g/L。在此基础上，选择表达量最高的三组细胞群（分别来源不同的质粒，但细胞生长情况均较好），对这三组细胞群通过有限稀释的方法挑选单克隆。将挑选后的单克隆在分批补料培养过程中扩大培养，将上述克隆细胞的上清收集，取样进行Western blot检测，根据条带确定目标蛋白，综合考虑克隆的LDC照片、生长情况、表达量、活细胞密度、活率、终末乳酸含量以及相关产品质量参数，选择出最优的3个克隆，即为优势细胞株。上述获得的细胞株，经生物反应器培养表达，即可获得含有gE蛋白的细胞培养上清，同样可对上述上清液取样进行Western blot检测，根据条带确定是否为目标蛋白。经证明，上述细胞株中gE蛋白的平均表达量可达2.5g/L。

需要说明的是，使用CHO细胞株稳定表达VZV gE重组蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献，例如Haumont M, 等人，VirusResearch 40 (1996) ，199-204 ，Purification, characterization andimmunogenicity of recombinant varicella-zoster virus glycoprotein gE secretedby Chinese hamster ovary cells。作为举例，具体的质粒转染及细胞株构建方式如下：

用CD CHO培养基M1复苏并培养1支CHO-K1宿主细胞作为工作细胞库细胞。

将通过上述2中的方式获得的质粒pWX1.0-Z-gE和pWX2.0-B-gE进行线性化处理，具体为使用限制性内切酶ScaI-HF进行酶切（50 μl酶切体系），取2 μl酶切产物并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，两个质粒经ScaI-HF酶切后均呈现出单一而清晰的条带，说明线性化结果良好。上述50 μl的线性化产物再经过酚氯仿抽提纯化和乙醇沉淀后，溶解于10 mM Tris缓冲液中。经Nano-Drop检测，质粒pWX1.0-Z-gE的浓度为1191.2 ng/μl，pWX2.0-B-gE的浓度为1075.8 ng/μl。随后，将上述宿主细胞CHO-K1以7×10⁵ cells/ml的密度接种于培养基M1中。24小时后，对宿主细胞进行计数，并用预热的培养基M1将细胞稀释至1.0×10⁶ cells/ml，随后取5ml细胞悬液放入Kuhner摇床中备用。摇床参数为：温度36.5℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225rpm。准备进行转染，具体步骤如下：

第一，质粒pWX1.0-Z-gE及质粒pWX2.0-Z-gE质粒各取12 μg（其中，取浓度为1191.2 ng/µl的pWX1.0-Z-447B质粒10 μl，取浓度为1075.8 ng /µl的pWX2.0-Z-447B质粒11.2 μl），分别加入预先加有776 µl OptiProSFM的50 ml摇管中。同时，将24 μl的FreeStyle Max Reagent加入另一个预先加有776 µL OptiProSFM的50 ml摇管中。随后，再把FreeStyle Max Reagent和OptiProSFM的混合物加入质粒和 OptiProSFM的混合物中，轻微吸打混匀并置于室温下静置孵育10分钟；

第二，取上述混合液667 µl（质粒，FreeStyle Max Reagent以及OptiProSFM）滴加至稀释好的宿主细胞悬液（5 ml）中。随后将细胞放入Kuhner摇床孵育。摇床参数为：温度36.5 ℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225 rpm；

第三，孵育6小时后，加入5 ml预热的新鲜培养基M1。随后将细胞放入Kuhner摇床中培养。摇床参数为：温度36.5 ℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225 rpm。

通过上述转染方式即可获得包含优化后gE基因的稳定CHO-K1细胞株。同时，通过迷你细胞群的培养基筛选以及通过有限稀释法挑选单克隆细胞也是公知的实验手段。经过这些手段方法，即可获得表达量较高的单克隆细胞，即优势CHO细胞株。

实施例2 重组带状疱疹疫苗的免疫原性评价

获得实施例1中所述的gE蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析、超滤和纳滤后，即可获得纯度为95%以上的抗原蛋白。

为了研究本发明所提供的基因及载体所制备得的抗原的免疫原性，将上述抗原与佐剂配制成重组带状疱疹疫苗组合物，并以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。具体方法为：以gE蛋白为抗原，以磷酸铝以及 CpG ODN为佐剂吸配制成重组带状疱疹疫苗组合物。选择6-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组10只小鼠，肌肉注射上述疫苗组合物，并设置疫苗组和佐剂组，0、3周免疫，第5周采血取脾脏。采用ELISA法检测血清中的抗VZV gE蛋白的抗体滴度（即total IgG），采用ELISPOT法检测脾细胞中的细胞免疫水平，主要为IFN-γ的表达。结果显示通过本发明提供的技术方案所获得的gE蛋白所制备得到的疫苗组合免疫原性非常好，可作为潜在的重组带状疱疹候选疫苗抗原（具体结果如表1所示）。

免疫原性的评价方法为本领域的行规技术手段，作为举例，更具体的操作方式如下：

1、重组带状疱疹疫苗的动物实验

选择6~8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组10只。肌肉注射不同剂量的疫苗（具体配比见表1），注射体积为0.05ml；0、3周免疫，第5周取血取脾脏，分离血清进行ELISA检测抗体，分离脾淋巴细胞进行ELISPOT分析。具体检测方法作为举例可为如下方式：

2、抗体滴度检测

(1) 抗原gE原液用PBS稀释至1μg/ml，ELISA板每孔加入100μl稀释好的原液。4℃过夜。洗板机清洗。

(2) 用PBS配制5%脱脂奶，ELISA板每孔加入100μl脱脂奶。37℃保温2 h。洗板机清洗。

(3) PBS配制2%脱脂奶，将待测血清梯度稀释，ELISA板每孔加入稀释血清100 μl，37℃保温1 h。洗板机清洗。

(4) 用PBS配制的2%脱脂奶将羊抗鼠二抗按1:10000比例稀释，ELISA板每孔加入100μl脱脂奶稀释的二抗。37℃保温1 h。洗板机清洗。

(5) 按显色缓冲液9 ml，TMB 1ml，3% H₂O₂ 10μl的比例配制显色液。ELISA板每孔加入100μl显色液。37℃保温10min。ELISA板每孔加入50μl终止液。

(6) 450nm/620nm读数。

3、细胞免疫检测

每组小鼠取脾，分离淋巴细胞。通过ELISPOT测定小鼠脾淋巴细胞表达IFN-γ的水平。

(1) 包被ELISPOT板（无菌操作，取脾脏前一天进行）

35%的酒精润湿ELISPOT板，按15µl/孔的量加入96孔ELISPOT板中，保留时间不超过1分钟。加入200µl/孔无菌水洗板5次。取150µl的 IFN-γ包被抗体，加入10ml PBS中，混匀，0.2μm滤膜过滤。取包被抗体稀释液，100µl/孔加入96孔ELISPOT板中，4℃过夜。

(2) ELISPOT板封闭（无菌操作）

弃掉包被抗体，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。按200µl/孔的量将1640完全培养基（含10% FBS）加入到96孔ELISPOT板中，室温封闭30min以上。弃去液体，在灭菌的纱布上尽量扣干水分，以免下步加入培养基时产生气泡。

(3)淋巴细胞准备（无菌操作）

处死小鼠，浸泡于75%乙醇中。在超净台中取出小鼠脾脏。在35mm培养皿中放入一块儿烧过的200目铜网，加入1ml淋巴细胞分离液，用1ml注射器的推杆研磨。把悬有脾细胞的分离液经烧过的200目铜网过滤后，转移到15ml离心管中，加入淋巴细胞分离液至4ml，液面上覆盖0.5ml的RPMI1640基础培养基。室温、800g、升降速3、离心30min。吸出淋巴细胞层，再加入10ml RPMI1640基础培养基，洗涤，室温、250g、离心10min。弃去上清液，加入2mlRPMI1640完全培养基重悬细胞，计数。

(4) 加样（无菌操作）

加细胞：根据细胞计数结果用完全培养基稀释细胞至6×10⁶个/ml，同时mAbCD28-A稀释1000倍加入到细胞悬液中。100µl/孔加入ELISPOT板内。阳性对照：加入ConA刺激物1µl，刺激浓度为5µg/ml。待测样品：加入用无血清培养基进行稀释的刺激物gE蛋白肽库，终浓度2µg/ml；阴性对照：不加ConA刺激物，也不加刺激物短肽。37℃ 5%CO₂培养24小时，期间不可移动培养板以免造成细胞位置的变动而使ELISPOT斑点的变模糊。

(5)斑点检测

弃掉细胞悬液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。取50μl生物素标记检测抗体加入到10ml稀释液（PBS+0.1%BSA）中，混匀，0.2μm滤膜过滤。每孔加入100μl，37℃ 孵育2h。弃掉生物素标记检测抗体稀释液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。用稀释液（PBS+0.1%BSA）稀释抗体，取50μl加稀释液10ml，混匀，0.2μm滤膜过滤。每孔加入100μl，37℃ 孵育1h。从此步骤开始避光操作。弃掉抗体稀释液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。按50µl/孔的量加入Fluorescence enhancer-II到96孔ELISPOT板中，37℃ 孵育15分钟。弃掉板内液体，将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠。取下保护层，放在电热恒温培养箱中，37℃避光将膜烘干。将ELISPOT 板置于CTL-ImmunoSpot® S5 VersC CnClyzer酶联斑点图像自动分析仪内，调节好合适的参数，进行斑点计数。

具体结果如下表1所示：

表1

。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海怡道生物科技有限公司

<120> 一种gE基因及表达该基因的载体

<130> CPCH1860999N

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> 水痘带状疱疹病毒

<400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala

545

<210> 2

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的gE基因

<400> 2

atgggcaccg tcaataagcc cgtggtgggc gtgctgatgg gctttggcat cattaccgga 60

acactccgga tcaccaaccc tgtcagggcc tccgtgctcc ggtatgacga cttccacatc 120

gatgaggaca agctggacac aaactccgtc tacgagccct actaccacag cgaccatgcc 180

gagagctcct gggtgaacag gggcgaaagc tccaggaagg cctacgacca taactccccc 240

tatatctggc ctaggaacga ctacgacggc tttctggaga acgcccatga gcatcatgga 300

gtctataacc agggcagggg catcgacagc ggcgagaggc tgatgcaacc cacccagatg 360

tccgcccagg aggatctggg cgatgacacc ggaatccatg tgatccctac cctgaacggc 420

gatgacaggc acaagatcgt caatgtggac cagcggcagt acggagatgt gttcaagggc 480

gacctgaatc ccaagcccca gggccagagg ctgatcgagg tgagcgtgga ggagaaccat 540

ccctttaccc tcagggcccc tatccagcgg atctacggcg tgaggtacac cgagacctgg 600

tccttcctgc cctccctgac atgtacaggc gacgccgccc ccgctattca gcacatctgc 660

ctgaagcaca ccacctgctt tcaggatgtg gtcgtcgacg tggactgcgc cgagaacaca 720

aaagaagacc agctggccga gatctcctac aggttccaag gcaagaagga agctgaccag 780

ccctggatcg tcgtcaacac atccacactc ttcgacgaat tagaactcga tccccctgaa 840

atcgagcccg gagtgctcaa ggtgctgcgg accgagaagc agtacctcgg cgtgtatatc 900

tggaacatgc ggggcagcga cggaacaagc acatacgcta ccttcctggt gacctggaag 960

ggcgacgaaa agaccaggaa ccctacccct gccgtgacac ctcagcctag gggcgccgaa 1020

ttccacatgt ggaactatca ttcccacgtg ttcagcgtcg gcgacacctt cagcctcgcc 1080

atgcacctgc agtacaagat ccatgaggcc cccttcgacc tgctgctgga gtggctgtat 1140

gtccctatcg accctacctg ccaacccatg aggctgtatt ccacctgtct ctaccatccc 1200

aacgctcctc agtgcctcag ccatatgaac tccggctgta ccttcacctc ccctcacctg 1260

gcccaacggg tggcctctac cgtgtatcag aattgcgagc acgccgacaa ctacacagcc 1320

tattgcctgg gcatcagcca tatggagcct tcctttggcc tgattctgca cgacggcgga 1380

accaccctga agtttgtgga tacccccgag tccctgagcg gcctgtacgt gttcgtcgtg 1440

tactttaacg gccacgtgga agccgtcgcc tacaccgtcg tgagcaccgt cgaccacttc 1500

gtgaacgcca tcgaagagcg gggctttcct cctacagccg gccagcctcc tgccacaacc 1560

aagcccaaag agatcacacc cgtgaaccct ggcaccagcc ccctcctcag gtatgctgcc 1620

tggacaggag gactggcttg atga 1644

Claims

1.一种gE基因，其编码水痘-带状疱疹病毒的gE蛋白，其特征在于，所述gE基因能够在CHO细胞中表达gE蛋白；该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求1所述的基因的序列。

3.如权利要求2所述的表达载体，所述的表达载体为携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和/或携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体。

4.一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有权利要求2或3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求1所述的gE基因。

5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述的细胞是CHO细胞。

6.一种在CHO细胞中表达VZV病毒的gE蛋白的方法，包括下述步骤:

(1)将权利要求1所述的gE基因克隆入表达载体中；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至CHO细胞中；

(3)通过迷你细胞群的筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；

(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV蛋白。