CN102414313A - 多基因载体编码的重组病毒样颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了根据用于生产的重组DNA和细胞培养技术的新的病毒样颗粒，其用作疫苗、诊断工具和R&D工具。本发明的重组病毒样颗粒由多肽链组装，所述多肽链掺入了几种，特别地两种或更多种不同的表位，所述表位选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。这些表位然后被展示在颗粒表面上。
Description
发明领域
本发明涉及包含来自不同病毒毒株的重组病毒样颗粒，以及编码它们的载体。
发明背景
小的天然生物分子在生物医学、纳米技术和材料科学的不同方面中的应用越来越令人感兴趣。由于它们的规则结构、它们均匀的颗粒大小、它们的稳定性、易于生产以及操作的可能性，病毒模拟物、病毒衣壳或病毒样颗粒是非常吸引人的。病毒样颗粒具有动态的结构，它们的内部是可接近的，此外包衣是可修饰的。取决于应用，病毒样颗粒可以具有包膜或不具有包膜，可以被选择作为病毒模拟物。这些实施方式可以用作新的生物学实体或靶点，用作疫苗，用作用于抗体生产的抗原，用作研究工具，用作诊断工具，用于药物递送和生物联结物。这些病毒模拟物通过包膜或多种病毒的衣壳蛋白质自组装而形成。取决于特定病毒形态，大小在22-150 nm之间变动。病毒模拟物是非传染性，因为它们没有掺入遗传材料进行组装。取决于应用，外源的遗传材料可以被包括在在此处描述的病毒模拟物中。
这些病毒模拟物的有前景的应用是针对各种疾病的的疫苗的生产，因为它们的表位的重复、高密度的展示常常引发强的免疫反应。对于树突状细胞的摄取，小的颗粒大小是一个优点。嵌合的病毒模拟物提供了在选择性的、多表位的、多蛋白质的、多血清型的、多株系的或多物种的呈递方面的巨大的可能性。
存在着许多用于病毒模拟物的生产的表达系统，其包括杆状病毒/昆虫细胞系统、各种哺乳动物细胞系，都可被病毒表达载体稳定地或短暂地转染或转导，还有包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）的各种酵母种类，以及大肠杆菌（Escherichia coli）和其他细菌。
疫苗接种取决于足够的免疫性的产生，来保护对抗传染性疾病。最多使用的减毒病毒疫苗依靠在免疫之后病毒在宿主中的有限的复制。但是这种疫苗接种可能在某些患者中引起严重的反应。因而作为亚单位疫苗的病毒样颗粒（VLP）的开发具有优点，因为所述颗粒一般缺少DNA或RNA基因组，但是具有天然病毒的真实的构象。
疫苗接种是针对例如季节性或流行性流感暴发威胁的最为有效和低成本的对策之一。易于作为气溶胶传播以及导致对于特别是敏感人群的严重疾病是流感称为最具破坏性的病毒疾病的主要原因。当前批准的季节疫苗仅是部分保护性的，基于鸡蛋的生产是非常耗时和高成本的。这种策略对于疫苗不良匹配或根本不匹配的流行株的未预期的出现是脆弱的。由于不断出现的禽流感或其他来源的流感的毒株的危险性，新的疫苗方案是必需的。
另一个方面，几种重要的病毒如HCV、HIV、Ebola等等的领域中的研究由于生物安全问题是非常艰难的。直到现在，仅有少数的模型用于病毒进入和病毒输送的研究。由于缺乏合适的非传染性病毒模型，诊断工具基于这些病毒的基因组。
当前商业的人类流感疫苗含有血凝素作为它们的仅有的或主要的病毒抗原。它们的生产起始于在含胚的鸡蛋上生长的病毒，或更近年来，起始于组织培养中的哺乳动物细胞中生长的病毒。鸡蛋中的生产需要选择高产的、重排的病毒毒株，受限于容量，是耗时的（6-8个月）和昂贵的。除那以外，在对鸡蛋蛋白质过敏的接种人群中它可能产生问题。生产使用非致死性的禽类毒株才是可能的。基于鸡蛋的生产的最重要缺点之一是有限的容量。对于大流行来说，必需停止季节性流感疫苗的生产，以帮助大流行性流感疫苗生产，从长远来看这可能引起更多的致死事件。
针对病毒疾病的疫苗通常依靠减毒病毒毒株或传染性病毒的灭活。合适的环境是高度病原性或出血性病毒所必需的，由于生物安全水平（例如，BL3/BL4）这限制了生产可能性。对于某些病毒如人类乳头状瘤病毒，减毒将不是足够的，因为病毒不能在体外增殖。产生基于人乳头状瘤病毒（HPV）样颗粒的疫苗的能力（Gardasil, Cervarix）改变了预防妇女子宫颈癌症的前景。
由于不断出现的禽流感或其他来源的毒株的危险性，产生增强的保护的新的疫苗方案是必需的。
发明概述
本发明涉及重组病毒样颗粒，其包含两种或更多种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。这些重组病毒样颗粒作为疫苗是有用的，本发明还涉及这些疫苗。
此外，本发明涉及包含编码不同的表位或编码不同的包含表位的蛋白质的两种或更多种多核苷酸的载体，所述不同的表位或编码不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株，以及涉及包含这些载体的宿主细胞。
附图的简要描述
附图1: 表达多表位病毒样颗粒的载体构建体的示意图。
（A）（SEQ ID NO:1）含有来自H1N1病毒毒株以及H3N2（HA，NA）病毒毒株的不同表位（M1，M2）的多价的 A型流感病毒模拟物。
（B）（SEQ ID NO:2）含有来自血清型HPV16和HPV18的表位（L1）的嵌合的人类乳头状瘤病毒样颗粒
（C）（SEQ ID NO:3）具有来自B型流感/Florida分离物的包埋的表位（HA，NA，M1，M2）的表达载体构建体
（D）（SEQ ID NO:4）用于HPV16和HPV18血清型的表位（L1）的表达的载体构建体，其中两种基因都处于不同启动子的控制下。
（E）（SEQ ID NO:5）具有启动子p10的删除的与（B）相同的载体构建体
载体含有两个启动子P1和P2（ 
,），选自polh、p10 和pXIV 极晚期杆状病毒启动子，vp39杆状病毒晚期启动子，vp39polh杆状病毒晚期/极晚期杂交启动子，pca/polh，pcna，etl，p35，egt，da26杆状病毒早期启动子；CMV，SV40，UBc. EF-1 ，RSVLTR，MT，PDS47，Ac5，PGAL 和PADH 。终止子序列T1和T2（T）选自SV40、HSVtk或BGH（牛生长激素）。此外,载体含有转座子位点TnL和TnR（L,R）用于MultiBacbacmid的产生，loxP位点（LP）用于位点特异性同源重组（质粒融合），复制起点（O），氨苄西林（A）和庆大霉素（G）抗性基因和限定的限制性位点。
附图2: 表达的嵌合流感病毒样颗粒的分析。
（A）分泌的（A，泳道2）以及细胞内的VLP（从SEQ ID NO：1制备的，A，泳道1）利用针对蛋白HA（H3）、NA（H3）和M2（H1）的特异性抗体通过免疫印迹来验证。泳道3=阶梯，蛋白质大小按kDa。表位是共同定位的，这意味着它们组装到一个颗粒中。
（B）利用醋酸铀的负染色通过电子显微镜检查，嵌合的流感病毒样颗粒（从SEQ ID NO：3制备的）的可视化。呈递表位HA的刺突是可见的。颗粒的大小在50-80 nm的范围内。
附图3:从SEQ ID NO：1制备的分泌的多表位流感病毒样颗粒的层析纯化和分析。
（A）凝胶过滤纯化的层析谱。第一峰（1）含有病毒样颗粒（VLP）。其他峰（2-6）代表污染蛋白质。
（B）考马斯染色的SDS-PAGE。病毒样颗粒的多个表位通过分析来自第一峰（1）的不同级分来验证，分别代表含有VLP的峰的开始的（泳道1）、中间的（泳道2）和末尾的（泳道3）部分。阶梯[kDa]在第一泳道的左侧呈现。表位的检出用箭头标明。
（C）根据考马斯染色的凝胶使用抗HA抗体的Western印迹分析。
附图4: 天然样流感病毒样颗粒（VLP）的功能性。
纯化的VLP（从SEQ ID NO：3制备的）的两倍连续稀释系列（1:2到1:2048）通过标准的血细胞凝集分析来分析。50 μL纯化的颗粒溶液包被到用红血细胞（红血球）孵育的96孔平板上。流感VLP（1，上部）能够以剂量依赖性方式凝集红血细胞。最高的稀释度是1:1024。相比之下，用作对照的PBS（C）仅导致红血球的沉淀，在反应孔的中央显现为“圆点”。
附图5: 多表位流感病毒样颗粒的体内评估。
小鼠用50 ng（小鼠1-5）或100 ng（小鼠6-10）从SEQ ID NO：3制备的纯化的VLP免疫，作为对照用PBS（小鼠11-12）免疫。在初次注射后的抗体滴度（注射后3周）以白色框表示，在强化注射后的滴度以黑色框表示（注射后6周）。滴度表示为小鼠血清的稀释度（y-轴）。VLP有效地刺激抗体免疫反应。当用100 μl（小鼠6-10）免疫时获得最好的结果，表明剂量依赖性免疫反应。在强化之后观察到抗VLP抗体的清楚的提高。如所预计的，对照动物（小鼠11-12）没有显示免疫反应。
附图6: 通过血细胞凝集抑制分析对多表位流感VLP的特异性免疫反应的确认。
用在注射后6周采集的血清进行ELISA测试来分析特异性抗HA抗体的存在。从SEQ ID NO：3制备的多表位病毒样颗粒包被在96孔平板上，与血清混合，孵育30分钟。血清在一系列两倍的稀释物（1:2到1:1024）中测试。在孵育后，添加红血球，进一步孵育30分钟。来自不同小鼠的特异性抗流感HA抗体结合多表位病毒样颗粒，引起红血球凝集的抑制作用达到稀释度 1:128（1）和稀释度 1:256（2），在反应孔中央作为红血球沉淀（“圆点”）显现。使用对照小鼠的血清样品没有观察到血细胞凝集抑制（C）。
附图7: 使用50 mL生物反应器的最佳表达条件的筛选。
通过斑点印迹分析确定了范围1-2×106个细胞/mL（TOI，1或2）范围内的原始细胞量，病毒接种物（MOI，0.01-2）和收获时间（感染后天数，d2-d6）。
（A）用作对照的带有仅一个表位L1的表达构建体的最佳表达参数的确定。通过特异性抗HPV18抗体（Abcam）检测。
（B）携带来自不同血清型的两个表位的多表位表达构建体（SEQ ID NO：2）的最佳表达参数的确定。通过针对两个表位HPV16 L1和HPV18 L1的特异性抗HPV16-抗体（Camvir, Santa Cruz）和抗HPV18-（Abcam）抗体的检测。
附图8: 从SEQ ID NO：2制备的多表位人乳头状瘤病毒样颗粒的层析纯化和分析。
（A）利用DEAE-琼脂糖柱的阴离子交换层析的层析谱。流通（1）、洗涤（2）和洗脱峰（3-5）通过数字标明（1-5）。洗脱缓冲液的提高的离子强度由线[%]显示。3 =用300 mM NaCl洗脱，4 = 用420 mM NaCl洗脱，5 = 用680 mM NaCl洗脱。
（B）考马斯染色的SDS-PAGE。病毒样颗粒的多表位的存在通过分析层析谱的不同部分来验证。泳道1=阶梯[kDa]，泳道2=纯化前的VLP，泳道3=洗涤步骤，泳道4=用300 mM NaCl洗脱，泳道5=用420 mM NaCl洗脱，泳道6=用500 mM NaCl洗脱，泳道7=用680 mM NaCl洗脱。表位用箭头标明（L1）。
（C）利用针对箭头所标明的两个表位（L1）的特异性抗体，考马斯染色的凝胶的Western印迹分析。
发明的详细说明
本发明目的在于根据用于生产的重组DNA和细胞培养技术生产新的病毒样颗粒用作疫苗、诊断工具和R&D工具。本发明的颗粒满足了适合于对抗可能的流行性感冒暴发的疫苗的需求。本发明的重组病毒样颗粒由多肽链组装，其掺入了几种，特别地两种或更多种，例如，两种、三种、四种或五种，或三的倍数，例如，六种、九种、十二种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。这些表位然后被展示在颗粒表面上。来自不同的毒株、血清型和/或特异于不同宿主的病毒的表位选择产生了多功能的病毒样颗粒，其模拟了它们在自然中存在的病毒的天然改变，例如，在2009年4月猪流行性感冒暴发期间所观察到的。病毒样颗粒的技术现状由单一蛋白质组成，或包含来自同一病毒毒株的最高达三种不同表位。本发明的颗粒由基于病毒或质粒的单个DNA载体编码，其被用作在宿主细胞例如昆虫细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞中的生产。在优选的实施方式中，DNA载体是杆状病毒载体，宿主细胞是昆虫细胞。
本发明的表位是由4到1000个氨基酸，优选的6到100个氨基酸之间组成的免疫原性肽，优选地是中和表位。中和表位是一些表位，其在作为免疫原性应答的结果被抗体结合时引起带有这样的中和表位的病毒的中和。在此理解的表位可以是重复的，可以是更大的蛋白质的部分，特别是抗原的部分，病毒表面蛋白质的部分或病毒膜蛋白的部分。掺入在病毒表面蛋白质或病毒膜蛋白中的这样的表位是优选的。如果根据本发明的病毒样颗粒的预期用途是作为R&D工具、诊断工具或病毒模拟物，重要的是表位是提供完整病毒型表面的完整病毒蛋白质的部分。
本发明的不同的病毒毒株是，例如，流感病毒的不同毒株，例如，A性流感病毒毒株H1N1、H5N1、H9N1、H1N2、H2N2、H3N2或H9N2，或B型流感病毒或C型流感病毒。
本发明的不同的血清型有，例如，人类乳头状瘤病毒（HPV）的不同的血清型，例如血清型6、11、16、18、31、33、35、39、45、48、52、58、62、66、68、70、73和82，以及来自原癌型HPV5、8、14、17、20和47，或来自乳头瘤相关的型HPV 6、11、13、26、28、32和60。
特异于不同宿主的病毒毒株是指特别地适应了相应的宿主，例如，人类流感病毒毒株，猪流感病毒毒株以及禽流感病毒毒株。在本上下文中，特异于宿主是指，病毒易于从一个宿主传播到相同类型的另一个宿主，而不易于传播到不同类型的宿主。例如，禽类病毒毒株易于从鸟类传播到其他鸟类，而不是其他动物或人类。
在优选的实施方式中，包含来自不同毒株、血清型和/或特异于不同宿主的病毒的表位的颗粒与B细胞和/或T细胞表位组合以诱导更广泛的免疫反应。
在另一个优选的实施方式中，病毒样颗粒由形成完整的病毒样表面的蛋白质组成，任选地进一步包含衣壳和核孔蛋白质。本发明的病毒样颗粒可以进一步包含荧光蛋白质，对于颗粒的纯化目的或对于附着标签有用的蛋白质，以及运输过程和稳定性所需的蛋白质的结构。
与实际的疫苗制造过程相比，由于特定的遗传的和过程工程化工具的应用，在此描述的多肽和病毒样颗粒在更短的时间和以无限的量产生。通过现代分子生物学方法，例如，MultiBac技术（WO 2005/085456；I. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004），Polybac技术（WO 2007/054250）或基因合成来组装需要的病毒基因的能力，例如，允许编码DNA载体的快速组装。这些技术的使用不需要原始的、潜在危险的病毒在本发明的病毒样颗粒和疫苗的开发、制备或施用期间的任何物理的转移。对于本发明的颗粒的构建，足够的是使用来自感染的个体的核苷酸序列。这与用于生产疫苗的经典的基于蛋的方法形成很大的对比，其需要遗传修饰的病毒作为种子株病毒。本发明的颗粒使用现代的一次性的组织培养技术来制造，这容许高生产能力。在杆状病毒载体和昆虫细胞作为宿主细胞的优选的实施方式，制造过程可以被快速地建立，生产时间是短的，即，在数周的范围内，而不是与基于蛋的方法相比的数个月。另外，与建立基于蛋的设备相比，一次性的组织培养设备的构建是更低耗时和低成本的。结果用于整个群体的大量疫苗可以在短的时间内生产和重新生产，几种不同类型的疫苗，例如，季节的流感疫苗和流行性感冒疫苗可以容易地并行生产。由于基于蛋的疫苗制造厂的能力限制的卫生部门对该疫苗或其他种疫苗作出的困难的决定将不需要。
本发明涉及重组病毒样颗粒，其包含两种或更多种，例如，两种、三种、四种或五种，或三的倍数，例如，六种、九种或十二种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。优选的是包含三种或更多种，优选的四种或更多种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质的重组病毒样颗粒。同样地优选的是包含三的倍数，例如，六种、九种或十二种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质的重组病毒样颗粒。所述表位选自两种不同的毒株、血清型或对不同宿主特异的病毒毒株，或选自三种不同的毒株、血清型或对不同宿主特异的病毒毒株，或选自四种不同的毒株或血清型。优选的是，包含来自三种不同毒株或血清型的几种表位的病毒样颗粒。同样优选的是包含来自特异于两种或三种不同宿主的病毒毒株的几种表位的病毒样颗粒。
此外本发明涉及载体，其包含两种或更多种，例如，两种、三种、四种或五种，或三的倍数，例如，六种、九种或十二种编码表位或不同的包含表位的蛋白质的不同多核苷酸，所述表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。如在此使用的“多核苷酸”可以代表12到3,000个核苷酸的链，包括通常所指的寡核苷酸，可以是来自所提及的不同病毒来源的病毒基因或开放阅读框，特别是编码病毒表面蛋白质或病毒膜蛋白的基因或开放阅读框。
优选的是编码以上提及的优选的病毒样颗粒的载体。
最优选的是包含选自SEQ ID NO：1到5的多核苷酸序列的载体。
在优选的实施方式中，本发明的病毒样颗粒包含
（1）来自同一病毒的两种或三种不同毒株或血清型的相同类型的表面蛋白质；
（2）来自不同的病毒毒株，例如，来自流感病毒毒株H5N1和H1N1的超过两种不同的表面蛋白质的混合物；
（3）从对不同的宿主特异的病毒，例如，从对家猪、人类和/或禽类宿主特异的流感病毒组合的不同的表面蛋白质的混合物。
被认为是包含在本发明的病毒样颗粒中的表位的来源的病毒有，例如，流感病毒、HPV、HIV、CMV、登革热、HCV和新城疫病毒。表位可以衍生自其他病毒和细菌。特别优选的是流感病毒。同样地优选的是人类乳头状瘤病毒（HPV）。
考虑的载体是DNA载体，可以是质粒载体或者病毒载体。组装这样的载体的方法是分子生物学领域的标准方法。优选的方法是MultiBac，例如在WO 2005/085456和在I. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004中描述的，或Polybac方法，例如在WO 2007/054250中描述的，与CAPTM技术和基因合成技术领域的现有技术组合。这件技术容许组装多基因共表达DNA载体，其适合于在不同的宿主细胞中表达。本发明的优选的DNA载体是杆状病毒载体。
用于本发明的载体的表达的宿主细胞可以是任何原核的（例如，大肠杆菌）或真核的表达细胞系。对于优选的杆状病毒载体的表达，昆虫细胞系是优选的。昆虫细胞系的实例有，例如，SF9、SF21、Hi-5、Express Sf+和S2 Schneider细胞。对于在真核系统中的表达，哺乳动物细胞是优选的，特别是人类细胞，例如，HeLa、Huh7、HEK293、HepG2、BHK、CHO、MT-2、骨髓成纤维细胞、原代神经细胞或胚胎细胞。对于在酵母菌中表达，可以使用酿酒酵母（S. cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（S. pombe）、白色念珠菌（C. albicans）或巴斯德毕氏酵母（P. pastoris）细胞。
根据本发明的宿主细胞的培养和增殖可以在为特定宿主细胞提供合适的条件的任何容器、生物反应器或一次性单元中进行。
本发明的病毒样颗粒可以用作疫苗。此外，它们可以用作诊断工具中的抗原、用于抗体产生的抗原，以及作为用于研究和开发工具的病毒模拟物，例如，病毒进入研究和病毒-宿主相互作用研究。
根据本发明的疫苗含有水性溶液中的重组病毒样颗粒，任选地进一步含有粘稠度调节化合物、稳定化合物和/或提高免疫原性的佐剂，这是现有技术中已知的。
在具体的实施方式中，使用Berger et al.，Nature Biotechnology, 2004、WO2005/085456和WO2007/054250和CAPTM技术的方法构建H3N2流感病毒样颗粒。H1N1流感毒株A/Puerto Rico/834的M1和M2基因的至少一个通过PCR扩增与流感A/Brisbane10/2007的HA基因以及流感A/Brisbane10/2007的NA基因一起克隆到转移载体pFL（WO 2007/054250,附图1）中。构建体通过DNA测序来确认。
在另一个具体的实施方式中，相同的克隆技术用于将血清型HPV16和HPV18两者的至少一个L1基因，或来自组2、4、6、11、31、33-35、39、40-45、51-53、55-59、62、66、68、70、73和77的其它的血清型的引入，克隆到转移载体pFL中（附图1）。
实验部分
容许在大肠杆菌细胞中增殖的、称为MultiBac或YFPMultiBac（WO 2005/085456）的杆状病毒载体，和CAPTM技术用于利用常规系统（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）的重组AcNPVs（Autographa californica核多角体病病毒，杆状病毒）的产生。10 ng的多基因载体转化到DH10MultiBac和/或DH10YFPMultiBac感受态细胞中。阳性克隆通过蓝/白筛选和PCR来选择。相应的MultiBac bacmid DNA使用Birnboim & Doly方法分离。重组AcNPVs通过1 μg多基因MultiBac bacmid使用转染试剂Fugene（Roche）根据厂家方案在0.9x106个Sf21（Invitrogen）细胞中的转染来产生。病毒扩增如早先描述的进行（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）。所有重组AcNPVs的滴度通过Bac-to-Bac-Manual（Invitrogen）中描述的噬菌斑分析来测定。蛋白质生产参数如感染复数（MOI）、细胞数量（TOI）和收获时间（TOH）使用小规模表达研究来分析。
实施例1：表达载体构建体的产生
为了制造各种构建体，根据WO2005/085456中描述的方法使用转移载体pFL（WO2005/085456和CAPTM技术）中的扩增模块M。表位的DNA通过从原始病毒分离病毒RNA和随后的与PCR组合的逆转录（对于流感病毒表位），或通过基因合成（Geneart公司提供）来获得。逆转录根据厂家方案使用RevertAidTM H Minus第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas）来进行。cDNA（2 μL）用作PCR反应的模板。根据厂家的方案使用以下条件。对于50 μL总体积反应，使用0.2 mM dNTP（NEB）、1.2% DMSO、0.5 μM反向和正向引物（Microsynth）、10 μl 5x Phusion GC反应缓冲液和2U Phusion Hot Start聚合酶（Finnzyme）。对于多基因装配，合适的限制性位点（BstZ17I、SpeI、PmeI、AvrII）使用PCR引入。PCR片段用限制性内切酶切割，随后是连接和转化过程来将扩增模块整合到转移载体中。连接在4℃使用500 ng直线化转移载体（pFL）、4 μL PCR产物和1 U T4-DNA裂解酶（Fermentas）过夜进行。为了产生质粒，4 μL的连接溶液添加到50 μl感受态DH5 α细胞，在冰上孵育30分钟。在42℃热激30秒和在4℃冷激2分钟之后，添加200 μl LB培养基，然后在37℃和220 rpm孵育1 h。此后，80 μl的细胞悬浮液平铺在含有合适的抗生素的LB琼脂平板上，在此种情况下，100 μg氨苄西林和100 μg庆大霉素。重复整个操作直到所有的表位导入到转移载体中。流感表位选自基因HA和NA，两者都选自H3N2/Brisbane10/2007毒株，而来自M1和M2的表位选自H1N1/Puerto Rico/834毒株。M1表位由启动子p10控制，所有其他表位由多角体蛋白启动子polh控制。所有的表位在同一载体构建体上存在（附图1A，SEQ ID NO：1）。选择流感B/Florida/2006分离物来产生构建体，所述构建体具有来自基因HA、NA、M1和M2的基因（附图1C，SEQ ID NO：3）。人类乳头状瘤病毒表位选自来自癌症相关血清型HPV16和HPV18的基因L1，整合在一个载体构建体中。两种表位都由多角体蛋白启动子polh控制（附图1B，SEQ ID NO：2）。为了改善表达产量，在进一步的构建体中删除p10启动子（附图1C，SEQ ID NO：5）。在其他构建体中，HPV16表位由p10启动子控制，而选择多角体蛋白启动子polh用于HPV18表位（附图1D，SEQ ID NO：4）。
实施例2：重组杆状病毒的产生
这个病毒含有多个表位来产生病毒样颗粒或病毒模拟物，其在它们的表面上呈递这些表位。病毒样颗粒可以用于不同的应用，例如，作为流感领域中的疫苗。AcNPV衍生的杆状病毒含有多个不同的表位，所述表位来自WHO建议的用于2008/2009-VLP疫苗接种运动的病毒毒株。根据 WO 2005/085456的方案，转移载体的所有基因通过位点特异性同源重组移位到MultiBac细胞中。10 ng的转移载体添加到100 μl MultiBac感受态细胞中，在4℃孵育30 分钟。在42℃热激45秒和在4℃冷激2分钟之后，添加400 μl LB培养基，细胞溶液在37℃和220 rpm孵育4 h。不同的稀释物平铺在含有各种抗生素抗性的合适的LB琼脂平板上。根据蓝/白和PCR筛选，选择几个正确的MultiBac克隆。相应的MultiBac bacmid DNA使用Birnboim & Doly方法分离。选择至少四个MultiBac bacmid克隆用于昆虫细胞如Sf9或Sf21的起始转染来产生重组的AcNPV-衍生杆状病毒。这通过1 μg多基因MultiBac bacmid使用转染试剂Fugene（Roche）根据厂家方案在0.9x106个Sf21（Invitrogen）细胞中的转染来产生。病毒扩增如早先描述的进行（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006；Bac-to-Bac-Manual, Invitrogen）。扩增病毒来扩大体积和提高传染性滴度，其根据Bac-to-Bac-Manual（Invitrogen）通过噬菌斑分析来测定。最好的表达构建体通过50 mL小规模表达实验和随后的通过Bradford分析（ADV, Cytosceleton）的蛋白质产量测定来确定。最好的表达物的表达进一步通过Western印迹分析用针对多种不同表位的抗体来进一步验证（附图2A）。
实施例3：昆虫细胞中多表位流感病毒样颗粒的生产和纯化
在最好的表达构建体的确定之后，生物技术生产参数如细胞系、细胞量（TOI）、重组病毒接种物的量（感染复数，MOI）和收获时间（TOH）在50 mL生物反应器中测定。根据Eibl, Riesen和John（Bioforum 03/2009）和Friesen J.（Bachelor thesis, University of Applied Science, Esslingen, Germany），设计不同的TOI、MOI和TOH的矩阵。使用每天的样品采集，分泌的或细胞内的多表位病毒样颗粒的表达观察六到八天。对于细胞内的颗粒（例如，HPV），细胞团粒用50 mM TrisCl、pH 7.6、100 mM NaCl、0.1%TritonX100来裂解，在4℃和8000 ×g离心10分钟。上清液中存在的病毒样颗粒的表位使用Dot-印迹装置（Biometra）和随后用特异性抗体的Western印迹来验证。产生最高产量的条件参考三到四天的收获时间来定义为表达参数。根据这些限定的参数，在摇动烧瓶或波浪培养袋中，在草地粘虫Spodoptera frugiperda细胞Sf9和Sf21中生产病毒样颗粒。对于多表位流感病毒样颗粒表达，选择Sf21细胞，使用以下条件：1.5x106个细胞/mL、MOI 0.05以及感染后四天的收获时间。细胞在27℃没有二氧化碳和胎牛血清补充的情况下增殖。根据限定的收获时间，通过在4℃在500-1000×g离心20分钟采集分泌的病毒样颗粒。含有颗粒的上清液容积通过使用100 kDa的筛截、使用盒（Sartocon-Slice 200, Sartorius and CentramateOS, PALL）通过切向流动过滤来降低用于纯化。病毒样颗粒的纯化用可扩大的层析方法和蔗糖梯度超速离心来进行。层析纯化是利用阳离子交换、阴离子交换和凝胶过滤层析的多步骤的纯化。上清液在50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中加载到连接于FPLC-系统（AEKTA提纯器，GE Healthcare）的CaptoQ柱上。颗粒利用50 mM磷酸盐、1 M NaCl、pH 7.4在线性梯度中以不断提高的盐浓度来洗脱。集中含有颗粒的部分，通过凝胶过滤层析来进一步纯化（来自SEQ ID NO：1的VLP，附图3）。纯化在50 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4缓冲液中使用HighLoad Superdex 200 pg柱进行。所有的层析步骤通过SDS-PAGE和随后的考马斯染色与免疫印迹来分析。
实施例4：纯化的流感病毒样颗粒的分析
为了确认不同的表位的存在，纯化的材料通过SDS-PAGE和随后考马斯染色或Western印迹来分析。150 μl不同的层析级分加载到4-12% Bis-Tris NuPAGE凝胶（Invitrogen）上，在150 V运行15分钟，在175 V运行45分钟，使用SimplyBlueSafestain（Invitrogen）考马斯染色。
对于免疫印迹，使用半干的装置（BioRAD）在19V下40分钟，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（BioRAD）上。在用5%脱脂奶粉-TrisCl-Tween20（0.1%）溶液阻断非特异性结合位点30分钟之后，膜在4℃与针对HA、NA和基质蛋白质的抗体孵育过夜。膜用TrisCl-Tween20（0.1%）缓冲液洗涤几次。取决于初级抗体的来源，第二抗体是与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶连接的抗小鼠或抗兔抗体用于检测。这些蛋白质的共同定位显示了来自一个表达载体和一个杆状病毒的组装和产生（附图3B，来自SEQ ID NO：1）。对于含有基因HA、NA和基质蛋白质M1和M2两者，包括它们的膜锚体，的表达构建体，这种共同定位也可以显示。
实施例5：流感病毒样颗粒（VLP）的功能性
为了分析VLP是否正确地在它们的表面整合了血凝素蛋白质（HA），利用来自鸡的红血细胞（RBC）进行标准血细胞凝集分析（附图4，来自SEQ ID NO：3的VLP）。纯化的VLP的两倍连续稀释用PBS（1×）在V形的 96孔平板中进行。添加等量的红血球（1%溶液），在4℃孵育1 h。RBC聚集物在反应孔底部的出现表明没有血细胞凝集。滴度表示为凝集RBC的纯化的VLP溶液的最高稀释度的倒数。获得的结果显示，VLP能够凝集鸡红血球，间接地展现了HA在VLP表面的存在。阴性对照（PBS）没有显示凝集。
实施例6：流感VLP的体内评估
VLP（从SEQ ID NO：3制备的）的免疫原性（免疫系统的刺激）使用两组小鼠体内测试，小鼠在初免强化日程中分别在0周和3周皮下地免疫。免疫使用悬浮液中50或100 μl（50或100 ng）的VLP进行。为了测定单独的VLP的免疫反应的质量，不使用佐剂。小鼠在第3和6周放血，分析血清来寻找针对免疫的VLP的抗体反应。获得的结果显示了，VLP在刺激抗体免疫反应方面是有效的。当用100 μl进行免疫时获得了最好的结果，表明了剂量依赖性的免疫反应。在强化之后观察到抗VLP抗体的清楚的提高。如所预计的，首次用于实验的动物不显示免疫反应。
为了再证实免疫反应的特异性，在第6周进行血球凝集抑制测试来分析特异性抗HA抗体的存在。结果显示了，特异性抗流感HA抗体能够抑制红血球凝集最高达到稀释度128（小鼠6）和稀释度256（小鼠8）。使用首次用于实验的小鼠的血清样品没有观察到血细胞凝集抑制。新产生的多表位流感VLP能够以剂量依赖性方式刺激免疫系统。当免疫系统用强化来重新刺激时，免疫反应提高至至少15倍。引发的免疫反应的特异性通过ELISA和血凝测试来分析。
实施例7：带有人类乳头状瘤病毒表位的多表位病毒样颗粒在各种细胞系中的生产和纯化
生物技术生产参数如细胞系、细胞量（TOI）、重组病毒接种物的量（感染复数，MOI）和收获时间（TOH）根据Eibl et al.（Bioforum 3/2009）在50 mL生物反应器中测定（附图7）。根据这些限定的参数，在摇动烧瓶或波浪培养袋中，在草地粘虫Spodoptera frugiperda细胞Sf9和Sf21中生产病毒样颗粒。多表位乳头状瘤病毒样颗粒在Sf21细胞中使用2x106个细胞/mL、MOI 0.5和感染后三天的收获时间从SEQ ID NO：2表达。细胞在27℃、没有二氧化碳和胎牛血清补充的情况下增殖。在限定的收获时间（感染后三天）通过在4℃在500-1000×g离心20分钟来采集细胞内病毒样颗粒。细胞使用低渗的磷酸盐缓冲液和随后的超声破碎来裂解。在4℃和2000×g的离心步骤之后，采集上清液。病毒样颗粒的纯化用可扩大的层析方法和蔗糖梯度超离心来进行。层析纯化是利用阳离子交换、阴离子交换和凝胶过滤层析的多步骤的纯化。上清液在50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中加载到连接于FPLC-系统（AEKTA提纯器，GE Healthcare）的CaptoDEAE柱上。颗粒利用50 mM磷酸盐、1 M NaCl、pH 7.4在线性梯度中以不断提高的盐浓度来洗脱（附图8A）。集中含有颗粒的级分，使用羟磷灰石柱进一步纯化。在20 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中进行结合，随后用500 mM磷酸盐，150 mM NaCl，pH 7.0线性梯度洗脱。为了精炼多表位颗粒，进行凝胶过滤层析。纯化在50 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4缓冲液中使用HighLoad Superdex 200 pg柱进行。所有的层析步骤通过SDS-PAGE和随后的考马斯染色与免疫印迹来分析。
实施例8：纯化的嵌合人类乳头状瘤病毒样颗粒的分析
为了确认纯化的材料中不同的表位的存在，从SEQ ID NO：2制备的VLP通过SDS-PAGE和随后的考马斯染色（附图8B）与Western印迹（附图8C）来分析。对于免疫印迹，使用针对不同血清型的L1蛋白质的抗体。150 μl不同的层析级分加载到4-12% Bis-Tris NuPAGE凝胶（Invitrogen）上，在150 V运行15分钟，在175 V运行45分钟，使用SimplyBlueSafestain（Invitrogen）考马斯染色。对于免疫印迹，使用半干的装置（BioRAD）在19V下40分钟，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（BioRAD）上。在用5%脱脂奶粉-TrisCl-Tween20（0.1%）溶液阻断非特异性结合位点30分钟之后，膜在4℃与针对L1表位的抗体孵育过夜。Camvir抗体（SantaCruz）用于HPV16,抗HPV18ab（Abcam）用于HPV18检测。膜用TrisCl-Tween20（0.1%）缓冲液洗涤几次。膜与连接了碱性磷酸酶的抗小鼠抗体孵育1h用于检测。表位通过BCIP/NPT溶液来检测。这些蛋白质的共同定位显示了来自一个表达载体和一个杆状病毒的组装和产生。
实施例9：嵌合的人类乳头状瘤病毒样颗粒（VLP）的功能性
为了分析从SEQ ID NO：2制备的人乳头状瘤病毒样颗粒是否在它们的表面正确地整合L1蛋白质，进行标准的ELISA分析。纯化的VLP的两倍连续稀释用PBS（1×）在V形96孔平板中进行。添加等量的血清型特异性抗体（浓度 1:1000），在37℃孵育1h。抗体与L1蛋白质的合适的结合使用带有辣根过氧化物酶的第二抗体和化学荧光检测系统来检测。获得的结果显示了抗体与重组表达的表位以剂量依赖性方式的结合。阴性对照（PBS）没有显示结合。
序列表
<110> Redbiotec AG
John, Corinne
Schaub, Christian
Wellnitz, Sabine
<120> 多基因载体编码的重组病毒样颗粒
<130> P371A
<150> EP09159287.3
<151> 2009-05-01
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10482
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 多表位A型流感病毒样颗粒
<400> 1
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt cttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 420
acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 480
gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 540
ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 600
tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 660
ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 720
ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 780
aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 840
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 900
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 960
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1020
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1080
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1140
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1200
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1260
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1320
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1380
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1440
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1500
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1560
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1620
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1680
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1740
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1800
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1860
ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1920
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1980
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2040
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2100
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2160
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2220
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2280
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2340
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2400
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2460
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2520
tgtgcggtat ttcacaccgc atagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3120
ctcactacgc ggctgctcaa acttgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg cccttgcttc 3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3960
atagttctag tggttggcta cagctttgtt tgtactatca acaggttgaa ctgctgatca 4020
acagatcctc tacgcggccg cggtaccata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta 4080
tctggtttaa acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac gttggctgcg 4140
agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga aacgcgggcg 4200
tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg ggaccgaacc 4260
ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt ttattgccgt 4320
catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc tcccccatct 4380
cccggtaccg catgctatgc atgcggccgc tcacttgaac cgttgcatct gcacccccat 4440
tcgtttctga taggcctgca aattttcaag aagatcattt ttcagaccag cactggagct 4500
aggatgagtc ccaatggttc tcatcgcttg caccatttgc ctagcctgac tagcaacctc 4560
catggcctct gctgcttgct cactcgatcc agccatttgc tccatagcct tagctgtagt 4620
gctggctaaa accattctgt tctcatgtct gattagtgga ttggttgttg tcaccatttg 4680
cctatgagac cgatgctggg agtcagcaat ctgttcacag gttgcacata ccaggccaaa 4740
tgccacttca gtggtcacag cccccatcct gttgtatatg aggcccatac aactggcaag 4800
tgcaccagca gaataactga gtgagatttc tttggcccca tggaatgtta tctccctctt 4860
gagcttccta tacagtttaa ctgctttgtc catgttattt ggatccccgt tcccattaag 4920
ggcagtttgg acaaagcgtc tacgctgcag tcctcgctca ctgggcacgg tgagcgtgaa 4980
cacaaatcct aaaatcccct tagtcagagg tgacaggatt ggtcttgtct ttagccattc 5040
catgagaacc tcaagatcgg tgttcttccc tgcaaagaca tcttcaagtc tctgtgcgat 5100
ctcggctttg agggggcctg acgggatgat agagagaacg tacgtttcga cctcggttag 5160
aagactcatg gtggatccat cccgggtgat caagtcttcg tcgagtgatt gtaaataaaa 5220
tgtaatttac agtatagtat tttaattaat atacaaatga tttgataata attcttattt 5280
aactataata tattgtgttg ggttgaatta aaggtccgta tactagtatc gattcgcgac 5340
ctactccgga atattaatag atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa 5400
ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga 5460
ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccaccatg aatccaaatc aaaagataat 5520
aacgattggc tctgtttctc tcaccatttc cacaatatgc ttcttcatgc aaattgccat 5580
cttgataact actgtaacat tgcatttcaa gcaatatgaa ttcaactccc ccccaaacaa 5640
ccaagtgatg ctgtgtgaac caacaataat agaaagaaac ataacagaga tagtgtatct 5700
gaccaacacc accatagaga aggaaatatg ccccaaacta gcagaataca gaaattggtc 5760
aaagccgcaa tgtgacatta caggatttgc acctttttct aaggacaatt cgattaggct 5820
ttccgctggt ggggacatct gggtgacaag agaaccttat gtgtcatgcg atcctgacaa 5880
gtgttatcaa tttgcccttg gacagggaac aacactaaac aacgtgcatt caaatgacac 5940
agtacgtgat aggacccctt atcggaccct attgatgaat gagttaggtg ttccttttca 6000
tctggggacc aagcaagtgt gcatagcatg gtccagctca agttgtcacg atggaaaagc 6060
atggctgcat gtttgtataa cgggggatga taaaaatgca actgctagct tcatttacaa 6120
tgggaggctt gtagatagta ttgtttcatg gtccaaagaa atcctcagga cccaggagtc 6180
agaatgcgtt tgtatcaatg gaacttgtac agtagtaatg actgatggga gtgcttcagg 6240
aaaagctgat actaaaatac tattcattga ggaggggaaa atcgttcata ctagcacatt 6300
gtcaggaagt gctcagcatg tcgaggagtg ctcctgctat cctcgatatc ctggtgtcag 6360
atgtgtctgc agagacaact ggaaaggctc caataggccc atcgtagata taaacataaa 6420
ggatcatagc actgtttcca gttatgtgtg ttcaggactt gttggagaca cacccagaaa 6480
aaacgacagc tccagcagta gccattgttt ggatcctaac aatgaagaag gtggtcatgg 6540
agtgaaaggc tgggcctttg atgatggaaa tgacgtgtgg atgggaagaa cgatcagcga 6600
gaagtcgcgc ttagggtatg aaaccttcaa agtcattgaa ggctggtcca accctaagtc 6660
caaattgcag ataaataggc aagtcatagt tgacagaggt aataggtccg gttattctgg 6720
tattttctct gttgaaggca aaagctgcat caatcggtgc ttttatgtgg agttgataag 6780
gggaagaaaa gaggaaactg aagtcttgtg gacctcaaac agtattgttg tgttttgtgg 6840
cacctcaggt acatatggaa caggctcatg gcctgatggg gcggacatca atctcatgcc 6900
tatataagta ctagaggatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt 6960
taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg 7020
ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 7080
caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 7140
cttatcatgt ctggatctga tcactgcttg agcctagaag atccggctgc taacaaagcc 7200
cgaaaggaag ctgagttggc tgctgtggct agcttatcta gaaatattaa tagatcatgg 7260
agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt ttcgtaacag 7320
ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca ccatcgggcg 7380
caccatgagt cttctaaccg aggtcgaaac gcctatcaga aacgaatggg ggtgcagatg 7440
caacggttca agtgatcctc tcactattgc cgcaaatatc attgggatct tgcacttgac 7500
attgtggatt cttgatcgtc tttttttcaa atgcatttac cgtcgcttta aatacggact 7560
gaaaggaggg ccttctacgg aaggagtgcc aaagtctatg agggaagaat atcgaaagga 7620
acagcagagt gctgtggatg ctgacgatgg tcattttgtc agcatagagc tggagtaagt 7680
actagaggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 7740
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 7800
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 7860
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 7920
tctggatctg atcactgctt gagcctagaa gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa 7980
gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactatcat aaccggaata ttaatagatc 8040
atggagataa ttaaaatgat aaccatctcg caaataaata agtattttac tgttttcgta 8100
acagttttgt aataaaaaaa cctataaata ttccggatta ttcataccgt cccaccatcg 8160
ggcgcggatc caccatgaag actatcattg ctttgagcta cattctatgt ctggttttca 8220
ctcaaaaact tcccggaaat gacaacagca cggcaacgct gtgccttggg caccatgcag 8280
taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgacca aattgaagtt actaatgcta 8340
ctgagctggt tcagagttcc tcaacaggtg aaatatgcga cagtcctcat cagatccttg 8400
atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt gatggcttcc 8460
aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gcagcaaagc ctacagcaac tgttaccctt 8520
atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc acactggagt 8580
ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagc tctgcttgca 8640
taaggagatc taataacagt ttctttagta gattgaattg gttgacccac ttaaaattca 8700
aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaaa atttgacaaa ttgtacattt 8760
ggggggttca ccacccgggt acggacaatg accaaatctt cccgtatgct caagcatcag 8820
gaagaatcac agtctctacc aaaagaagcc aacaaactgt aatcccgaat atcggatcta 8880
gacccagagt aaggaatatc cccagcagaa taagcatcta ttggacaata gtaaaaccgg 8940
gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt tacttcaaaa 9000
tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa tgcaattctg 9060
aatgcatcac tccaaacgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat gtaaacagga 9120
tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaaacac tctgaaattg gcaacaggga 9180
tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatcgcg ggtttcatag 9240
aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa aattctgagg 9300
gaataggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa atcaatggga 9360
agctgaatag gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa aaagaattct 9420
cagaagtcga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacacc aaaatagatc 9480
tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca attgatctaa 9540
ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg gaaaatgctg 9600
aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc tgcataggat 9660
caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacagaga tgaagcatta aacaaccggt 9720
tccagatcaa gggcgttgag ctgaagtcag gatacaaaga ttggatccta tggatttcct 9780
ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg tgggcctgcc 9840
aaaaaggcaa cattaggtgc aacatttgca tttgagtact agaggatcat aatcagccat 9900
accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg 9960
aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac 10020
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 10080
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatctgatc actgcttgag 10140
cctagaagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc 10200
tgagcaataa ctatcataac ccctaggaga tccgaaccag ataagtgaaa tctagttcca 10260
aactattttg tcatttttaa ttttcgtatt agcttacgac gctacaccca gttcccatct 10320
attttgtcac tcttccctaa ataatcctta aaaactccat ttccacccct cccagttccc 10380
aactattttg tccgcccaca gcggggcatt tttcttcctg ttatgttttt aatcaaacat 10440
cctgccaact ccatgtgaca aaccgtcatc ttcggctact tt 10482
<210> 2
<211> 8917
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 多表位人乳头状瘤病毒样颗粒
<400> 2
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt cttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 420
acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 480
gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 540
ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 600
tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 660
ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 720
ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 780
aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 840
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 900
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 960
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1020
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1080
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1140
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1200
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1260
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1320
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1380
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1440
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1500
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1560
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1620
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1680
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1740
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1800
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1860
ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1920
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1980
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2040
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2100
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2160
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2220
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2280
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2340
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2400
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2460
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2520
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<210> 3
<211> 10595
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 多表位B型流感病毒样颗粒
<400> 3
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60
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tgtgcggtat ttcacaccgc atagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700
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cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880
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catctgcacc tccatctgca agtaccccga ctacatcaag atggtgtccg agccctacgg 4980
cgactccctg ttcttctacc tgcgtcgtga gcagatgttc gtgcgtcacc tgttcaaccg 5040
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cgctaacctg gcttccagca actacttccc taccccctcc ggttccatgg tcacctccga 5160
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tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 6000
caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctgatca ctgcttgagc ctagaagatc 6060
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tttaagaagg agatacatct agaaatatta atagatcatg gagataatta aaatgataac 6180
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cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 7920
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tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 8040
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gagcctagaa gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac 8160
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ccaaactatt ttgtcatttt taattttcgt attagcttac gacgctacac ccagttccca 8280
tctattttgt cactcttccc taaataatcc ttaaaaactc catttccacc cctcccagtt 8340
cccaactatt ttgtccgccc acagcggggc atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa 8400
catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc atcttcggct acttt 8445
Claims (16)
1.一种重组病毒样颗粒，其包含两种或更多种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。
2.根据权利要求1的重组病毒样颗粒，包含三种或更多种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质。
3.根据权利要求1的重组病毒样颗粒，包含四种或更多种不同的表位或不同的包含表位的蛋白质。
4.根据权利要求1的重组病毒样颗粒，包含六种、九种或十二种表位或不同的包含表位的蛋白质。
5.根据前述权利要求任一项的重组病毒样颗粒，其中所述表位来自三种或更多种不同的病毒毒株或血清型。
6.根据前述权利要求的任一项的重组病毒样颗粒，进一步包含B细胞和/或T细胞表位。
7.根据前述权利要求的任一项的重组病毒样颗粒，进一步包含形成完整病毒样表面的蛋白质和任选地包含衣壳和/或核孔蛋白质。
8.根据前述权利要求的任一项的重组病毒样颗粒，进一步包含荧光蛋白质、对颗粒的纯化目的或用于附着标记物有用的蛋白质、和/或运输过程所需的蛋白质的结构。
9.根据前述权利要求的任一项的重组病毒样颗粒，其中所述病毒是流感病毒。
10.根据前述权利要求的任一项的重组病毒样颗粒，其中所述病毒是人乳头状瘤病毒。
11.一种载体，其包含编码不同的表位或编码不同的包含表位的蛋白质的两种或更多种多核苷酸，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白质选自（a）同一病毒的不同病毒毒株和/或（b）同一病毒的不同血清型和/或（c）对不同宿主特异的不同病毒毒株。
12.根据权利要求11的载体，编码根据权利要求1到10的任一项的重组病毒样颗粒。
13.根据权利要求11或12的载体，其是杆状病毒载体。
14.根据权利要求11的载体，包含选自SEQ ID NO：1到5的多核苷酸序列。
15.包含根据权利要求11到14的任一项的载体的宿主细胞。
16.包含根据权利要求1到10的任一项的重组病毒样颗粒的疫苗。
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