EA037297B1 - Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 (варианты) - Google Patents

Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 (варианты) Download PDF

Info

Publication number
EA037297B1
EA037297B1 EA202000370A EA202000370A EA037297B1 EA 037297 B1 EA037297 B1 EA 037297B1 EA 202000370 A EA202000370 A EA 202000370A EA 202000370 A EA202000370 A EA 202000370A EA 037297 B1 EA037297 B1 EA 037297B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
component
cov2
seq
cov
cmv
Prior art date
Application number
EA202000370A
Other languages
English (en)
Other versions
EA037297B8 (ru
EA202000370A1 (ru
EA037297B9 (ru
Inventor
Ольга Вадимовна ЗУБКОВА
Татьяна Андреевна Ожаровская
Инна Ваимовна Должикова
Ольга Попова
Дмитрий Викторович ЩЕБЛЯКОВ
Дарья Михайловна Гроусова
Алина Шахмировна ДЖАРУЛЛАЕВА
Амир Ильдарович ТУХВАТУЛИН
Наталья Михайловна Тухватулина
Дмитрий Николаевич ЩЕРБИНИН
Илья Булатович Есмагамбетов
Елизавета Александровна ТОКАРСКАЯ
Андрей Геннадьевич Ботиков
Алина Сергеевна Ерохова
Фатима Магометовна Ижаева
Андрей Геннадьевич Семихин
Сергей Владимирович БОРИСЕВИЧ
Борис Савельевич НАРОДИЦКИЙ
Денис Юрьевич ЛОГУНОВ
Александр Леонидович ГИНЦБУРГ
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2020127980A external-priority patent/RU2731342C9/ru
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Publication of EA202000370A1 publication Critical patent/EA202000370A1/ru
Publication of EA037297B1 publication Critical patent/EA037297B1/ru
Publication of EA037297B8 publication Critical patent/EA037297B8/ru
Publication of EA037297B9 publication Critical patent/EA037297B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, a также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Также создано фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, a также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Создано также фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы E1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. При этом каждое фармацевтическое средство находится в жидкой или лиофилизированной форме, а компонент 1 и компонент 2 находятся в разных упаковках. Каждое фармацевтическое средство применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, при этом используют компонент 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели. Изобретение обеспечивает развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против SARS-CoV-2, при этом обеспечивается повышенный уровень иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.

Description

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники
В конце 2019 г. в г. Ухань провинции Хубэй (КНР) была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии неизвестной этиологии. Проведенные научные исследования позволили установить, что она была вызвана одноцепочечным РНК-содержащим вирусом, относящимся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV В. 11 февраля 2020 г. Всемирная Организация Здравоохранения присвоила новому вирусу официальное название SARS-CoV-2, а болезнь, возбудителем которой он является, получила название COVID-19 (Coronavirus disease 2019).
В течение нескольких месяцев SARS-CoV-2 распространился по всему миру, став причиной пандемии, затронувшей более 200 стран. К 1 августа 2020 г. количество заболевших превысило 17,5 млн человек, а количество погибших - 683 тыс. человек.
Коронавирус передается от человека к человеку воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются - боль в горле, в суставах, насморк, головная боль.
Диагностика COVID-19 осложняется тем, что симптомы данного заболевания характерны для многих вирусных инфекций. Окончательный диагноз ставится на основании результатов лабораторных исследований, для которых необходимо специализированное оборудование, высококвалифицированный персонал и дорогостоящие реактивы.
COVID-19 может протекать как в легкой, так и тяжелой форме. При этом тяжелая форма заболевания чаще развивается у пациентов старше 60 лет, имеющих хронические заболевания. Наиболее грозными осложнениями данного заболевания являются пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии и др. При этом средств этиотропного лечения в настоящее время не разработано.
Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Все исследования в данной области опираются на многолетний опыт по разработке препаратов для профилактики заболеваний, вызываемых другими представителями семейства коронавирусов.
Известно решение (патент US 7452542 B2), в котором для профилактики заболеваний, вызванных коронавирусом, используют живую аттенуированную вакцину. Данная вакцина содержит живой аттенуированный коронавирус, который характеризуется как содержащий геном, кодирующий (i) ExoN, содержащий замену на тирозин 6398MHV-A59 или аналогичной позиции, (ii) полипептид Orf2a, содержащий замену на лейцина 106MHV-A59 или аналогичной позиции и фармацевтически приемлемый разбавитель. При этом данное изобретение распространяется на ряд коронавирусов животных и птиц и коронавирус человека ОС34.
Известно решение (WO 2006136448 A2), в котором для получения вакцины против SARS-CoV используют нуклеиновую кислоту, кодирующую аттенуированный вирус SARS-CoV.
При этом максимальный титр вируса в клеточной культуре по крайней мере в 2 раза ниже, чем максимальный титр вируса SARS-CoV дикого типа в той же культуре клеток.
Известно решение (RU 2332457 С2В), в котором для профилактики коронавирусной инфекции, возбудителем которой является SARS-CoV, используют живую бактериальную вакцину, в которой на поверхности бактерии представлены антигены SARS-CoV, заякоренные с помощью синтетазы поли-гаммаглутаминовой кислоты (pgsBCA).
Известно решение (WO 2016116398 A1), где для получения вакцины против коронавируса MERSCoV используют нуклеокапсидный белок N MERS-CoV и/или его иммуногенный фрагмент или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую N-нуклеокапсидный белок MERS-CoV и/или его иммуногенный фрагмент. Также в изобретении раскрыто использование генетических векторов на основе вируса коровьей оспы, авипоксвируса, аденовируса, альфа-вируса, рабдовируса и герпесвируса для получения вакцины против коронавируса MERS-CoV
Известно решение (WO 2006071250 A2), где в качестве вакцины против SARS-CoV предложено использование векторных систем на основе поксвирусов и бакуловирусов, содержащих гены S белка SARS-CoV и его антигенных фрагментов.
Известно решение (CN 1276777 C), в котором предложена вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность S белка вируса SARS-CoV.
Филогенетические исследования позволили установить, что вирус SARS-CoV-2 более близок к коронавирусам, поражающим летучих мышей (bat-SL-CoVZC45, bat-SL-CoVZXC21), чем к коронавирусам,
- 1 037297 циркулирующим в человеческой популяции. Так, например, S белок SARS-CoV-2 гомологичен S белку
SARS-CoV не более чем на 75% (Zhou Р., Yang X.L., Wang X.G., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579(7798):270-273, doi: 10.1038/s41586-020-20127). Таким образом, кандидатные вакцины против заболеваний, вызываемых SARS-CoV, не эффективны против COVID-19.
В настоящее время не зарегистрировано ни одного препарата для индукции специфического иммунитета против коронавируса SARS-CoV-2. Известно, что несколько фармацевтических компаний ведут разработку кандидатных вакцин, часть из которых основана на технологии рекомбинантных аденовирусных векторов.
Фармацевтическая компания SanSino (Тяньцзинь, Китай) совместно с Пекинским институтом биотехнологии (Пекин, Китай) разработала кандидатную вакцину против COVID-19, которая включает вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа (с удаленными Е1 и E3 областями), содержащий оптимизированный ген S белка коронавируса SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (GenBank YP_009724390) с сигнальным пептидным геном активатора тканевого плазминогена. Вакцина представляет собой жидкую форму, содержащую 5х1010 вирусных частиц/0,5 мл. Данное решение было выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип.
Существенным недостатком данного решения является то, что вакцина может быть не эффективна у некоторых групп населения за счет наличия предсуществующего иммунитета к аденовирусу человека 5 серотипа. Так, например, согласно опубликованным данным однократного введения данной кандидатной вакцины было недостаточно, чтобы вызвать высокий уровень гуморальных иммунных реакции у людей в возрасте 55 лет или старше (Zhu F.C., Guan X.H., Li Y.H., et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, doubleblind, placebo-controlled, phase 2 trial [published online ahead of print, 2020 Jul 20]. Lancet. 2020; S01406736(20)31605-6. doi:10.1016/S0140-6736(20)31605-6). Тогда как именно люди пенсионного возраста находятся в зоне риска тяжелого течения COVID-19.
Таким образом, в области техники существует потребность в разработке фармацевтического средства, которое является безопасным и способно индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV2 у широких слоев населения.
Осуществление изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании безопасного и эффективного фармацевтического средства, которое обеспечивает развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у различных групп населения за счет использования двух различных аденовирусных векторов. Кроме того, технический результат заключается в создании фармацевтического средства, обеспечивающего повышенные уровни иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.
Указанный технический результат достигается тем, что создано фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARSCoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (вариант 1).
Также создано фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (вариант 2).
Создано также фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (вариант 3).
- 2 037297
При этом каждое фармацевтическое средство находится в жидкой или лиофилизированной форме.
Причем буферный раствор фармацевтического средства для жидкой формы содержит, мас.%:
Компонент 1 и компонент 2 находятся в разных упаковках.
Каждое фармацевтическое средство применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, при этом используют компонент 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена схема экспрессионной кассеты, где
- промотор,
- целевой ген,
- сигнал полиаденилирования.
На фиг. 2 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - сформированные группы животных:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
- 3 037297
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2);
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
31) фосфатно-солевой буфер.
• - Данные по одному животному.
> - Среднее геометрическое значение, рассчитанное для каждой группы.
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации мышей.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - сформированные группы животных:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2);
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
31) фосфатно-солевой буфер.
• - Обозначены данные по каждому животному.
- Среднее геометрическое значение, рассчитанное для каждой группы.
На фиг. 4 представлена выживаемость сирийских хомячков, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством, и контрольных групп на модели летальной инфекции вируса SARS-CoV-2.
- 4 037297
Ось ординат - выживаемость животных, %.
Ось абсцисс - дни после заражения вирусом SARS-CoV-2.
• - Обозначена выживаемость сирийских хомячков, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством, сформированные группы:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26- CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG -S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2), которая во всех группах составила 100%.
♦ - Отрицательный контроль, группа:
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2).
- Отрицательный контроль, группа:
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2).
х - Отрицательный контроль, группа:
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2).
А - Отрицательный контроль, группа:
32) фосфатно-солевой буфер.
На фиг. 5 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у приматов, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством по варианту 1.
Ось ординат - реципрокный титр IgG к RBD вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс - дни.
• - Иммунизированных разработанным фармацевтическим средством по варианту 1 (Ad26-CMV-SSARS-CoV-2; Ad5-CMV-S-SARS-CoV-2).
о - Плацебо.
На фиг. 6 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных RBD фрагментом S антигена SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации приматов.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
Черным цветом обозначена группа животных, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством по варианту 1 (Ad26-CMV-S-SARS-CoV-2; Ad5-CMV-S-SARS-CoV-2).
Серым цветом обозначена группа контрольных (не вакцинированных) животных.
Среднее арифметическое значение представлено в виде пунктирной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями вакцинированных и контрольных (невакцинированных) животных обозначена скобкой и символом * (р<0,05 по критерию Манна-Уитни).
На фиг. 7 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных RBD фрагментом S антигена SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации приматов.
- 5 037297
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
Черным цветом обозначена группа животных, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством по варианту 1 (Ad26-CMV-S-SARS-CoV-2; Ad5-CMV-S-SARS-CoV-2).
Серым цветом обозначена группа контрольных (невакцинированных) животных.
Среднее арифметическое значение представлено в виде пунктирной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями вакцинированных и контрольных (невакцинированных) животных обозначена скобкой и символом * (р<0,05 по критерию Манна-Уитни).
На фиг. 8 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
Л - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, р<0,05; **, р<0,01; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 9 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанным фармацевтическим средством по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
А - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, р<0,05; **, р<0,01; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 10 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев лиофилизированной формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
А - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, р<0,05; **, р<0,01; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 11 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев лиофилизированной формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
А - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дней обозначена скобкой и символами *, р<0,05; **, р<0,01; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 12 представлен прирост концентрации ΗΦΗγ (в разах) в культуральной среде мононуклеарных клеток периферической крови добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1, после рестимуляции их S антигеном SARS-CoV-2 до иммунизации (0 день) и через 14 и 28 дни исследования.
Ось ординат - увеличение концентрации гамма-интерферона, разы.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
А - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически
- 6 037297 достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, р<0,05; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 13 представлен прирост концентрации ИФНγ (в разах) в культуральной среде мононуклеарных клеток периферической крови добровольцев, иммунизированных лиофилизированной формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1, после рестимуляции их S антигеном SARSCoV-2 до иммунизации (0 день) и через 14 и 28 дни исследования.
Ось ординат - увеличение концентрации гамма-интерферона, разы.
Ось абсцисс - дни.
• - Обозначены значения по каждому добровольцу на 0 день,
- обозначены значения по каждому добровольцу на 14 день,
А - обозначены значения по каждому добровольцу на 28 день.
Точками обозначены значения по каждому добровольцу, участвующему в исследовании. Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, р<0,05; ****, р<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 14 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1,
Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс - дни.
А - Данные по каждому добровольцу.
На фиг. 15 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных лиофилизированной формой разработанного фармацевтического средства по варианту 1,
Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс - дни.
А - Данные по каждому добровольцу.
Реализация изобретения
Для создания безопасного и эффективного фармацевтического средства для индукции специфического иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 была выбрана векторная система на основе аденовирусов. Аденовирусные векторы обладают целым рядом преимуществ: они не способны размножаться в клетках человека, проникают как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунные ответы, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена.
Вместе с тем клиническое применение данных векторов может быть затруднено из-за наличия у части населения предсуществующего иммунного ответа к аденовирусам, который возникает в результате перенесенного заболевания. Результаты научных исследований показывают, что титры антител к аденовирусному вектору увеличиваются с возрастом, а также отличаются в различных популяциях. Так, например, высокие уровни серопревалентности к аденовирусу человека 5 серотипа наблюдаются у 40-45% населения в США и до 90% населения стран Африки к югу от Сахары (Nwanegbo E., Vardas E., Gao W., et al. Prevalence of neutralizing antibodies to adenoviral serotypes 5 and 35 in the adult populations of The Gambia, South Africa, and the United States. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004; 11(2):351-357; Dudareva M., Andrews L., Gilbert S.C., et al. Prevalence of serum neutralizing antibodies against chimpanzee adenovirus 63 and human adenovirus 5 in Kenyan children, in the context of vaccine vector efficacy. Vaccine. 2009; 27(27):35013504; Zhang S., Huang W., Zhou X., Zhao Q., Wang Q., Jia B. Seroprevalence of neutralizing antibodies to human adenoviruses type-5 and type-26 and chimpanzee adenovirus type-68 in healthy Chinese adults. J. Med. Virol., 2013; 85(6):1077-1084).
Нейтрализующие антитела к вектору значительно снижают специфический иммунный ответ против трансгена и могут отрицательно влиять на эффективность вакцинации.
Авторы изобретения на основании проведенных исследований определили серотипы аденовирусных векторов, которые настолько отличаются генетически, чтобы при последовательной иммунизации не влиять на генерацию антиген-специфических иммунных ответов против вакцинного антигена. Для дальнейшей работы было выбрано 3 вируса - аденовирус человека 26 серотипа, аденовирус человека 5 серотипа и аденовирус обезьян 25 серотипа. Затем были отобраны вирусные клоны, отличающиеся повышенными ростовыми свойствами, и на их основании, с помощью генно-инженерных подходов, были разработаны рекомбинантные аденовирусные векторы.
Таким образом, использование комбинации нескольких типов генетических векторов позволило создать арсенал фармацевтических средств, что обеспечит преодоление трудностей, связанных с наличием предсуществующего иммунного ответа к некоторым аденовирусам у людей, в частности к аденовирусам человека 5-го серотипа.
При этом появляется возможность использования изобретения, по которому вариант фармацевтического средства выбирается после оценки иммунного статуса пациента к серотипам аденовирусных векторов, входящих в состав средства (аденовирусу человека 26 серотипа, аденовирусу человека 5 серотипа,
- 7 037297 аденовирусу обезьян 25 серотипа).
С помощью методов генной инженерии в рекомбинантные аденовирусные векторы вставили экспрессионные кассеты, которые включали ген вакцинного антигена и элементы регуляции экспрессии (промотор, сигнал полиаденилирования). Схема экспрессионной кассеты представлена на фиг. 1.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет.
В качестве антигена во всех кассетах был выбран S белок (Spikeprotein) вируса SARS-CoV-2, который был оптимизирован для экспрессии в клетках млекопитающих. S белок является одним из структурных белков коронавируса. Он экспонирован на поверхности вирусной частицы и отвечает за связывание с рецептором ангиотензин-превращающего фермента II типа (Angiotensin-converting enzyme 2, АСЕ2). Результаты проведенных исследований показали, что к данному белку формируются вируснейтрализующие антитела, благодаря чему он является перспективным антигеном для создания фармацевтического средства.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор - это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia Y.L., Li Y.C., Jing C.Q., Guo X., Shang X.F., Zhao С.Р., Wang T.Y. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells// Scientific Reports. - 2017. - Vol. 8. - p. 10416].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор - синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора CAG выше, чем у промотора CMV [Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Evaluation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation// Genet. Mol. Res. - 2014. - Vol. 13. - p. 1270-1277].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 - промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1β (EF-1a). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [PMID: 28557288. The EF-1a promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells]. Ген EF-1a кодирует фактор элонгации-1а, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1a часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования.
Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта фармацевтического средства.
1. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
2. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
3. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой сред-
- 8 037297 ство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
При этом компоненты фармацевтического средства могут находиться в разных упаковках.
Также авторами изобретения были разработаны жидкая и лиофилизированная формы фармацевтического средства.
Кроме того, авторами изобретения были подобраны варианты буферного раствора, которые позволяют хранить разработанное фармацевтическое средство как в замороженном виде при температуре ниже -18°C, так и в виде лиофилизата при температуре от 2 до 8°C.
Также был разработан способ применения фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающий использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pAd26-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса человека 26 серотипа (два плеча гомологии), и ген устойчивости к ампициллину. Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 26-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pDC белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4 области до конца генома. Синтез конструкции pAd26-Ends осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса человека 26-го серотипа смешивали с pAd26-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd26-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd26-dlE1, несущая геном аденовируса человека 26-го серотипа с делетированной Е1-областью.
Затем в полученной плазмиде pAd26-dlE1 с использованием стандартных методов клонирования была заменена последовательность, содержащая открытую рамку считывания 6 (ORF6-Ad26), на аналогичную последовательность из генома аденовируса человека 5-го серотипа для того, чтобы аденовирус человека 26-го серотипа был способен эффективно размножаться в культуре клеток HEK293. В результате была получена плазмида pAd26-dlE1-ORF6-Ad5.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pAd26-dlE1-ORF6-Ad5 была удалена E3-область генома аденовируса (примерно 3321 п.о. между генами pVIII и U-exon) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате этого был получен рекомбинантный вектор pAd26-only-null на основе генома аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией Е1 и E3-областей. В качестве материнской последовательности human adenoviras 26-го серотипа была использована последовательность SEQ ID NO: 5.
Кроме того, авторами было разработано несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
эк спрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
эк спрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
На основе плазмидной конструкции pAd26-Ends генно-инженерным методом были получены конструкции pArms-26-CMV-S-CoV2, pAnns-26-CAG-S-CoV2, pArms-26-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, конструкции pArms-26-CMV-S-CoV2, pArms-26-CAG-S-CoV2, pArms-26-EF1-S-CoV2 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-only-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-only-CMV-S-CoV2, pAd26-onlyCAG-S-CoV2, pAd26-only-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией Е1 и E3областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.
На четвертом этапе плазмиды pAd26-only-CMV-S-CoV2, pAd26-only-CAG-S-CoV2, pAd26-onlyEF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293.
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма
- 9 037297 human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3.
Пример 2. Получение иммунобиологического средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 1, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5:
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad26-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad26-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad26-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad26-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 1 в варианте 1 и в варианте 2 разработанного фармацевтического средства.
Пример 3. Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pSim25-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса обезьян 25-го серотипа (два плеча гомологии). Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса обезьян 25-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность от конца Е1-области до pIVa2 белка. Второе плечо гомологии содержит последовательность конца генома аденовируса, включая правый инвертированный концевой повтор. Синтез конструкции pSim25-Ends осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса обезьян 25-го серотипа смешивали с pSim25-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pSim25-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pSim25-dlE1, несущая геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делетированной Е1-областью.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pSim25-dlE1 была удалена E3 область генома аденовируса (3921 п.о. от начала гена 12,5К до гена 14,7К) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате была получена плазмидная конструкция pSim25-null, кодирующая полный геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делецией Е1 и E3- 10 037297 областей. В качестве материнской последовательности simian adenovirus 25-го серотипа была использована последовательность SEQ ID NO: 6.
Кроме того, авторы разработали несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Далее генно-инженерным методом на основе плазмидной конструкции pSim25-Ends были получены конструкции pArms-Sim25-CMV-S-CoV2, pArms-Sim25-CAG-S-CoV2, pArms-Sim25-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно, а также несущие плечи гомологии из генома аденовируса обезьян 25-го серотипа. После этого, конструкции pArms-Sim25-CMV-S-CoV2, pArms-Sim25-CAG-S-CoV2, pArms-Sim25-EF1-S-CoV2 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены рекомбинантные плазмидные векторы pSim25-CMV-S-CoV2, pSim25-CAG-S-CoV2, pSim25-EF1-S-CoV2, содержащие полный геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делецией Е1 и E3-областей и экспрессионную кассету SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.
На третьем этапе плазмиды pSim25-CMV-S-CoV2, pSim25-CAG-S-CoV2, pSim25-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
В результате были получены рекомбинантные аденовирусы человека 25 серотипа, содержащие ген S белка вируса SARS-CoV-2: simAd25-CMV-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 4), simAd25-CAG-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 2), simAd25-EF1-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 3).
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
Пример 4. Получение иммунобиологического средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 3, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области.
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (simAd25-CMVS-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (simAd25-CMVS-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (simAd25-CAGS-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (simAd25-CAGS-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (simAd25-EF1-SCoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 про-
- 11 037297 мотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (simAd25-EF1-SCoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 2 в варианте 1 разработанного фармацевтического средства и компонентом 1 в варианте 3 разработанного фармацевтического средства.
Пример 5. Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pAd5-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса человека 5-го серотипа (два плеча гомологии). Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома. Синтез конструкции pAd5-Ends осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса человека 5-го серотипа смешивали с pAd5-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd5-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd5dlE1, несущая геном аденовируса человека 5-го серотипа с делетированной Е1-областью.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pAd5-dlE1 была удалена E3 область генома аденовируса (2685 п.о. от конца гена 12,5К до начала последовательности U-exon) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате этого был получен рекомбинантный плазмидный вектор pAd5-too-null на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа с делецией Е1 и E3 областей генома. В качестве материнской последовательности human adenovirus 5-го серотипа была использована последовательность SEQ ID NO: 7.
Кроме того, авторы разработали несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Далее генно-инженерным методом на основе плазмидной конструкции pAd5-Ends были получены конструкции pArms-Ad5-CMV-S-CoV2, pArms-Ad5-CAG-S-CoV2, pArms-Ad5-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно, а также несущие плечи гомологии из генома аденовируса 5-го серотипа.
После этого, конструкции pArms-Ad5-CMV-S-CoV2, pArms-Ad5-CAG-S-CoV2, pArms-Ad5-EF1-SCoV2 лианеризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-GAC-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецей Е1 и E3 областей и экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.
На четвертом этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-GAC-S-CoV2, pAd5-too-EF1-SCoV2 гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантного аденовируса.
В результате были получены рекомбинантные аденовирусы человека 5-го серотипа, содержащие ген S белка вируса SARS-CoV-2: Ad5-CMV-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 2), Ad5-EF1-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 3).
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SeQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
Пример 6. Получение иммунобиологического средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 5, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области.
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор,
- 12 037297 ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad5-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad5-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad5-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad5-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 1 в варианте 1 и в варианте 2 разработанного фармацевтического средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 2 в варианте 1 и в варианте 3 разработанного фармацевтического средства.
Пример 7. Получение буферного раствора.
Разработанное фармацевтическое средство по данному изобретению состоит из двух компонентов, находящихся в разных флаконах. При этом каждый компонент представляет собой иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса с экспрессионной кассетой в буферном растворе.
Авторами изобретения был подобран состав буферного раствора, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Данный раствор включает:
1) трис-(гидроксиметил)аминометан (трис), который необходим для поддержания рН раствора;
2) хлорид натрия, который добавляют для достижения необходимой ионной силы и осмолярности;
3) сахарозу, которая используется в качестве криопротектора;
4) магния хлорида гексагидрат, который необходим в качестве источника двухвалентных катионов;
5) ЭДТА, который используется в качестве ингибитора свободно-радикального окисления;
6) полисорбат-80, который используется в качестве поверхностно-активного вещества;
7) этанол 95%, который применяют в качестве ингибитора свободно-радикального окисления;
8) воду, которая используется в качестве растворителя.
Авторами изобретения было разработано 2 варианта буферного раствора: для жидкой формы фармацевтического средства и для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы фармацевтического средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (табл. 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из компонентов фармацевтического средства.
1. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1х 1011 вирусных частиц.
2. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1x1011 вирусных частиц.
3. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса обезьяны 25-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1x1011 вирусных частиц.
Таким образом, была проверена стабильность каждого из серотипов аденовирусов, входящих в состав фармацевтического средства. Полученные фармацевтические средства хранили при температуре -18 и -70°C в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титрарекомбинантных аденовирусов.
- 13 037297
Таблица 1
Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы фармацевтического средства
№ групп ы Состав буферного раствора |
Трис (мг) Хлори д Сахароз а (мг) Магния хлорида ЭДТА (мг) Полисорбат -80 (мг) Этанол 95% |Вода|
натрия । гексагидра || (мг) |
(мг) I т (мг)
0,96 8 ДО
1 1 2,!9 || 25 | | 0,102 || 0,019 | | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
1,81 5 до
2 1 2,19 || 25 | | 0,102 II 0,019 | | 0,25 1 0,0025 j 0,5
мл
до
3 | 1,21 | 1,752 || 25 | | 0,102 || 0,019 I | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
ДО
4 1 ^21 3,285 || 25 | | 0,102 || 0,019 I | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
до
5 | 1,21 | 2,19 || 20 | | 0,102 || 0,019 I | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
до
« 1 1 1 2,19 I) 37,5 | 1 0,102 || 0,019 I | 0,25 1 0,0025 | 0,5
мл
до
7 1 11?211 2,19 || 25 | | 0,0816 || 0,019 I | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
до
8 1 11?211 2,!9 || 25 | | 0,153 1 || 0,019 I | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
и ДО
9 1 1 1 2,!9 || 25 | | 0,102 | 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
| 0,028 до
10 1 1!»211 2,!9 || 25 | | 0,102 I 0,25 | 0,0025 | 0,5
мл
до
11 1 1 ^211 2,19 || 25 | 1 0,102 || 0,019 || 0,2 | 0,0025 | 0,5
мл
до
12 I 11?211 2,19 || 25 | | 0,102 I II 0,019 || 0,375 | 0,0025 | 0,5
мл
до
13 1 1 ^211 2,19 || 25 | 1 0,102 || 0,019 I | 0,25 | 0,002 | 0,5
мл
0,0037 5 до
14 II ui 1 2,10 || 25 II 0,102 | | 0,019 || 0,25 0,5
мл
до
15 II 1 Ь211 2,19 || 25 || | 0,102 | | 0,019 II 0,25 1 0,0025 I 0,5
мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы фармацевтического средства при температурах -18 и -70°C в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы фармацевтического средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного фармацевтического средства в следующем диапазоне действующих веществ: трис от 0,1831 до 0,3432 мас.%; хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212 мас.%; сахароза от 3,7821 до 7,0915 мас.%; магния хлорида гексагидрат от 0,0154 до 0,0289 мас.%; ЭДТА от 0,0029 до 0,0054 мас.%; полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709 мас.%; этанол 95% от 0,0004 до 0,0007 мас.%; растворитель - остальное.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для лиофилизированной формы фармацевтического средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (табл. 2). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из компонентов фармацевтического средства.
1. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го сероти- 14 037297 па с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1x1011 вирусных частиц.
2. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1x1011 вирусных частиц.
3. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса обезьяны 25-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1x1011 вирусных частиц.
Таким образом, была проверена стабильность каждого из серотипов аденовирусов, входящих в состав фармацевтического средства. Полученные фармацевтические средства хранили при температуре 2 и 8°C в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 2
Состав экспериментальных буферных растворов
Состав буферного раствора
№ групп ы Трис (мг) Хлори д натрия (мг) Сахароз а (мг) Магния хлорида гексагидра т (мг)
ЭДТА (мг) Полисорбат -80 (мг) Вода
0,193 6 до 1 мл
1 I | 1,403 || 73,5 || 0,0204 || 0,00381| 0,05 |
2 1 0,363 | 1,403 | 73,5 || 0,0204 | | 0,0038 | 0,05 | до 1
мл
з | 0,242 | 1,1224 1 73,5 | | 0,0204 | 10,00381| 0,05 I ДО 1 мл ДО 1 мл
* | 0,242 | 2,1045 1 73,5 | | 0,0204 | | 0,0038 1 0’05 |
5 | 0,242 | 1,403 | 58,8 | | 0,0204 | | 0,0038 | 0,05 I ДО 1 мл ДО 1 мл
6 | 0,242 | 1,403 1 110,25 I | 0,0204 | 0,0038 | 0,05 I
7 | 0,242 1 1,403 1 73,5 | 1 0,01632 || 0,00381| 0,05 I ДО 1 мл
8 | 0,242 | 1,403 1 73,5 | | 0,0306 II 0,00381| 0,05 I до 1 мл
0,0030 4
9 10,2421| 1,403 || 73,5 || 0,0204 | 1 0.05 1 до 1 мл
10 10,2421| 1,403 || 73,5 || 0,0204 || 0,00571| 0,05 | до 1 мл
ч | 0,242 | 1,403 1 73,5 || 0,0204 || 0,00381| 0,04 | ДО 1 мл
12 | 0,242 | 1,403 1 73.5 | | 0,0204 || 0,00381| 0,075 | ДО 1 мл
13 | 0,242 | 1,403 1 73,5 I 1 0,0204 | 1 0,0038 1 0,05 | ДО 1 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для лиофилизированной формы фармацевтического средства при температуре 2 и 8°C в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для лиофилизированной формы вакцины обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного фармацевтического средства в следующем диапазоне действующих веществ: трис от 0,0180 до 0,0338 мас.%; хлорид натрия от 0,1044 до 0,1957 мас.%; сахароза от 5,4688 до 10,2539 мас.%; магния хлорида гексагидрат от 0,0015 до 0,0028 мас.%; ЭДТА от 0,0003 мас.% до 0,0005 мас.%; полисорбат-80 от 0,0037 до 0,0070 мас.%; растворитель - остальное.
Пример 8. Определение эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина SARS-CoV-2 через 21 день после введения фармацевтического средства лабораторным животным.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г. Все животные
- 15 037297 были разделены на 31 группу по 5 животных, которым внутримышечно вводили компонент 1 фармацевтического средства в дозе 108 вирусных частиц/100 мкл, а затем с интервалом в 2 недели компонент 2 в дозе 108 вирусных частиц/100 мкл. Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2);
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
31) фосфатно-солевой буфер.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу.
1) Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 ч при температуре 4°C.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась забивка планшета 5% молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении 1 ч.
3) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°C.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°C.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 мин добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в табл. 3.
- 16 037297
Таблица 3
Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)
Название группы животных Титр антител
Ad26-CMV-SCoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2)
□ 33779
Ad26-CMV-S-
* CoV2 (компонент
2 1), Ad5-CAG-SCoV2 (компонент 2) 29407
Ad26-CMV-S- CoV2 (компонент
□ 1), 33779
Ad5-EFl-S-CoV2 (компонент 2)
Ad26- CAG -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2)
□ 38802
Ad26- CAG -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-SCoV2 (компонент 2)
□ 38802
6 Ad26- CAG -S- 38802
CoV2 (компонент 1), Ad5-EFl-S-CoV2
- 17 037297
(компонент 2)
Ad26- EFl -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2)
7 33779
Ad26- EFl -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-SCoV2 (компонент 2)
0 38802
Ad26- EFl -S- CoV2 (компонент 1),
□ 33779
Ad5-EFl-S-CoV2 (компонент 2)
[Г о Ad26- null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2) i !
0
[Г |ι Ad26-CMV-SCoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-SCoV2 (компонент 2)
38802
[Г 2 Ad26-CMV-SCoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-SCoV2 (компонент 2)
38802
1 ^1 Ad26-CMV-SCoV2 (компонент 1), simAd25-EFl-S -CoV2 (компонент 2)
33779
1 Ad26- CAG -S- 33779
4 CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-SCoV2 (компонент
- 18 037297
2)_________________
[Г р Ad26- CAG -SCoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S -CoV2 (компонент 2)
33779
пг 6 Ad26- CAG -SCoV2 (компонент 1), simAd25-EFl-SCoV2 (компонент 2)
33779
[Г 7 Ad26- EFl -SCoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-SCoV2 (компонент 2)
38802
[Г |8 Ad26- EFl -SCoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-SCoV2 (компонент 2)
33779
[Г 9 Ad26- EFl -SCoV2 (компонент 1), simAd25-EFl-SCoV2 (компонент 2)
33779
1—1 Ad26- null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2)
2 0 0
_ Ad25-CMV-SCoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2) i )
2 |i 33779
2 simAd25-CMV-S- 29407
|2 CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-
- 19 037297
CoV2 (компонент 2)
simAd25-CMV-SCoV2 (компонент 1), Ad5-EFl-S-CoV2 (компонент 2)
25600
simAd25- С AG -S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2)
33779
simAd25- CAG -S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-SCoV2 (компонент 2)
29407
simAd25- CAG -S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EFl-S-CoV2 (компонент 2)
29407
simAd25- EFl -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-SCoV2 (компонент 2)
33779
simAd25- EFl -SCoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-SCoV2 (компонент 2)
38802
;...............................................:
simAd25- EFl -SCoV2 (компонент 1), Ad5-EFl-S-CoV2 (компонент 2)
33779
simAd25- null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2)
0
3 1 фосфатносолевой буфер
Как видно из представленных данных, все варианты фармацевтического средства индуцируют гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2.
Пример 9. Определение эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по сравнению с контрольным препаратом, содержащим один серотип рекомбинантного аденовируса.
Целью данного эксперимента являлось сравнение титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей после их иммунизации различными вариантами разработанного фармацевтического средства, содержащей 2 различных серотипа рекомбинантного аденовируса, с титрами антител к S белку вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей после их двукратной иммунизации контрольным препаратом, содержащим один серотип рекомбинантного аденовируса.
Для данного эксперимента использовали мышей линии BalB/с, 18 г, 35 шт.
- 20 037297
Животные были иммунизированы с интервалом в 2 недели:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2), 5х106 в.ч.;
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2), 5х106 в.ч.;
3) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2), 5х106 в.ч.;
4) Ad26-CMV-S-CoV2, Ad26-CMV-S-CoV2, 5х106 в.ч.;
5) Ad5-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2, 5х106 в.ч.;
6) simAd25-CMV-S-CoV2, simAd25-CMV-S-CoV2, 5х106 в.ч.;
7) PBS.
Титр антител к S антигену вируса SARS-CoV-2 определяли методом ИФА через 1 месяц после последней иммунизации. Результаты эксперимента представлены в таблице.
Таблица 4
Титр антител к S антигену вируса SARS-CoV-2 в крови мышей через месяц после их иммунизации разработанным фармацевтическим средством и контрольными препаратами
Как видно из представленных данных иммунизация животных фармацевтическим средством приводит к эффекту потенциирования иммунных реакций. Данный эффект выражается в том, что титр антител к S белку вируса SARS-Co-2 в сыворотке крови животных, иммунизированных фармацевтическим средством, содержащим два типа вектора, значительно больше, чем сумма титров антител в группах, ко торым вводили один тип вектора.
Пример 10. Определение эффективности иммунизации разработанным фармацевтическим средством по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Напряженность клеточного иммунитета в отношении коронавируса SARS-Cov2 оценивали по количеству пролиферирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови лабораторных мышей в культуре in vitro после повторной рестимуляции клеток рекомбинантным RBD фрагментом S белка данного коронавируса. Для определения количества пролиферирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов использовали метод окраски клеток красителем CFSE. Принцип этого метода заключается в том, что флуоресцентный нетоксичный краситель CFSE способен беспрепятственно проникать в клетки. После стимуляции клеток антигеном лимфоциты начинают пролиферировать, при этом краситель, находящийся в родительской клетке, распределяется поровну между дочерними клетками. Концентрация метки, а следова- 21 037297 тельно, и интенсивность флуоресценции снижаются ровно в два раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии C57BL/6. Все животные были разделены на 31 группу (по 3 животных), которым внутримышечно вводили компонент 1 фармацевтического средства в дозе 108 вирусных частиц/100 мкл, а затем с интервалом в 2 недели компонент 2 в дозе 108 вирусных частиц/100 мкл. Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2);
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
31) фосфатно-солевой буфер.
На 8 день эксперимента животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (B.J. Quahet. al., Monitoringlymphocyteproliferationinvitroandinvivowiththeintracellularfluorescentdyecarboxyfluor esceindiacetatesuccinimidylester, NatureProtocols, 2007, № 2(9), 2049-2056) и культивировали в присутствии антигена (гликопротеин S вируса SARS-CV-2). Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на фиг. 2, 3. Таким образом, можно заключить, что все варианты разработанного фармацевтического средства индуцируют формирование антиген-специфического иммунного ответа (как CD4+, так и CD8+).
Пример 11. Исследование протективной активности разработанного фармацевтического средства против COVID-19 на лабораторных животных.
Протективную эффективность разработанного фармацевтического средства против COVID-19 оценивали на модели летальной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у сирийских хомячков с индуцированным иммунодефицитом.
Животные были разделены на 31 группу по 8 шт/группе и иммунизированы двукратно: компонентом 1 (в дозе 108 вирусных частиц/животное) и компонентом 2 разработанного фармацевтического средства (в дозе 108 вирусных частиц/животное) с интервалом в 21 день. Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
2) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
3) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
4) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
5) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
6) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
7) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
8) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
- 22 037297
9) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
10) Ad26-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
11) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
12) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
13) Ad26-CMV-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
14) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
15) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2)
16) Ad26-CAG-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
17) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
18) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
19) Ad26-EF1-S-CoV2 (компонент 1), simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
20) Ad26-null (компонент 1), simAd25-null (компонент 2)
21) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
22) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
23) simAd25-CMV-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
24) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
25) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
26) simAd25-CAG-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
27) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CMV-S-CoV2 (компонент 2);
28) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (компонент 2);
29) simAd25-EF1-S-CoV2 (компонент 1), Ad5-EF1-S-CoV2 (компонент 2);
30) simAd25-null (компонент 1), Ad5-null (компонент 2);
31) фосфатно-солевой буфер.
Введение иммуносупрессантов начинали на 7 сутки после бустирующей иммунизации, заражали животных вирусом SARS-CoV-2 на 14 сутки после бустирующей иммунизации интраназально в дозе 106 TCID50 на животное, в объеме 50 мкл.
В течение эксперимента масса тела контрольных не вакцинированных животных после заражения стремительно снижалась (на 10 день масса тела животных снизилась в среднем на 32% от исходной). В то же время масса тела животных, иммунизированных всеми вариантами фармацевтического средства, в первые дни после заражения незначительно снижалась, а затем возрастала (на 10 день масса тела животных увеличилась в среднем на 11% от исходной).
На фиг. 4 представлены данные выживаемости животных после заражения. По результатам исследования было показано, что иммунизация животных всеми вариантами фармацевтического средства позволяет защитить 100% животных с индуцированным иммунодефицитом от летальной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. В контрольной группе не вакцинированных животных наблюдается 100% летальность.
Таким образом, на модели сирийских хомяков с индуцированным иммунодефицитом было показано, что иммунизация животных разработанным фармацевтическим средством позволяет сформировать протективный иммунный ответ, который защищает 100% животных от летальной инфекции, вызванной SARS-CoV-2.
Пример 12. Исследование токсичности разработанного фармацевтического средства.
Исследование токсичности проводили на половозрелых аутбредных мышах обоего пола. Для эксперимента использовали фармацевтическое средство по варианту 1 (компонент 1: Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-S-CoV2), фармацевтическое средство по варианту 2 (компонент 1: Ad26-CMV-SCoV2, компонент 2: simAd25-CMV-S-CoV2) фармацевтическое средство по варианту 3 (компонент 1: simAd25-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-S-CoV2). Каждый из компонентов фармацевтического средства вводили внутримышечно и внутривенно в возрастающих дозах: 108 в.ч., 109 в.ч., 1010 в.ч., 1011 в.ч.
На протяжении эксперимента гибели животных не зафиксировано, симптомов интоксикации не выявлено. Влияния вакцины на массу тела и массу органов животных не выявлено. Некропсия, проведенная через 14 дней после введения векторной вакцины, не показала отклонений в структуре внутренних органов мышей. Наличия местно-раздражающего действия, в рамках проведенного эксперимента, не установлено.
Таким образом, данные исследования свидетельствуют об отсутствии токсичности разработанного фармацевтического средства.
Пример 13. Исследование иммуногенности разработанного фармацевтического средства по варианту 1 на приматах.
Задача данного эксперимента заключалась в определении напряженности гуморального и клеточного иммунного ответа у приматов после их иммунизации разработанным фармацевтическим средством.
Развитие гуморального иммунного ответа оценивали по увеличению титра антител к белку S вируса SARS-CoV-2 и титра вируснейтрализующих антител в крови приматов. Развитие клеточного иммунного ответа оценивали по количеству пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.
- 23 037297
Для данного исследования было использовано 17 обезьян макак резусов, самцов, весом 2,0-2,2 кг.
Животных вакцинировали разработанным фармацевтическим средством по варианту 1 (компонент 1:
Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-S-CoV2). В терапевтической дозе для человека 1011 вирусных частиц/дозу вводили компонент 1, затем через 21 день в терапевтической дозе для человека 1011 вирусных частиц/дозу вводили компонент 2.
Пробы крови отбирали у всех животных перед вакцинацией (0 день), а также через 7, 14 и 28 дней после вакцинации. Титры специфических антител к домену RBD белка S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови приматов после их иммунизации разработанным фармацевтическим средством определяли методом ИФА по следующей методике:
на планшеты иммобилизировали антиген RBD вируса SARS-CoV-2 в концентрации 100 нг/лунка;
готовили двукратные разведения сыворотки крови приматов в буфере для забивки (разведения 1:501:51200), инкубировали в лунках планшета (стрипа) с иммобилизованным RBD-антигеном;
после промывки образовавшийся комплекс Аг-Ат выявляли конъюгатом, специфическим к Fcфрагменту IgG антител обезьяны (Anti-MONKEY IgG (gamma chain) (GOAT) Antibody-617-101-012, ROCKLAND), меченным пероксидазой хрена;
после промывки к образовавшемуся комплексу добавляли хромогенный субстрат; затем ферментативную реакцию останавливали стоп-реагентом.
Развившуюся окраску (абсорбцию) регистрировали на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo) в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм.
Титр IgG антител к S белку вируса SARS-CoV-2 определяли как разведение сыворотки, в котором значение оптической плотности превосходит значение оптической плотности отрицательного контроля (сыворотка крови того же примата до введения препарата) в том же разведении в два раза. Результаты эксперимента представлены на фиг. 5.
Как видно из полученных данных, у всех животных, иммунизированных разработанным фармацевтическим средством, наблюдается повышение титра антител к вирусу SARS-CoV-2. При этом максимальный титр антител наблюдается через неделю после введения компонента 2 (на 28 день эксперимента).
Уровень вируснейтрализующих антител в крови макак резус определяли в реакции нейтрализации по подавлению негативных колоний, образованных вирусом SARS-CoV-2 в односуточном монослое клеток Vero С1008 под агаровым покрытием. Реакцию нейтрализации ставили в варианте: постоянная доза вируса - разведения сыворотки.
В работе использовали исследуемые иммунные сыворотки, полученные от обезьян перед вакцинацией (0 день), через 7, 14 и 28 дней после вакцинации, положительный контрольный образец (сыворотку крови переболевшего человека, заведомо содержащую специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2), отрицательный контрольный образец (фетальную телячью сыворотку (ФТС), заведомо не содержащую специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2) и культуру вируса SARS-CoV-2.
В реакции нейтрализации использовали разведение 1:5 сывороток крови. Рабочее разведение вируссодержащей суспензии на основе вируса SARS-CoV-2 (антиген) готовили на растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками (стрептомицина сульфат и бензилпенициллина натриевая соль) по 100 ЕД/мл десятикратным шагом. В приготовленном разведении концентрация вируса SARS-CoV-2 составила 200 БОЕ мл-1.
В эксперименте использовали односуточный монослой клеток Vero С1008 в пластиковых флаконах с площадью рабочей поверхности 25 см2 фирма Cellstar®, отобранных для постановки реакции нейтрализации. Смесь равных объемов сыворотки и культуры вируса SARS-CoV-2 инкубировали в течение 60 мин при температуре от 36,5 до 37,5°C, затем вносили по 0,5 мл на монослой клеток VeroC1008, предварительно удалив ростовую среду. После адсорбции комплекса антиген+антитело на клетках в течение 60 мин при температуре от 36,5 до 37,5°C инокулят декантировали, затем наносили первичное агаровое покрытие, разработанное для вируса SARS-CoV-2, и проводили дальнейшее инкубирование монослоя при температуре от 36,5 до 37,5°C в течение 2 суток.
Через 2 суток инфицированный монослой клеток с целью окрашивания 0,1% раствором нейтрального красного наносили вторичное агаровое покрытие и инкубировали в течение 24 ч при температуре от 36,5 до 37,5°C, затем проводили учет негативных колоний во флаконах. За титр антител исследуемой сыворотки принимали высшее разведение сыворотки крови, в котором выявляли подавление негативных колоний, образованных вирусом SARS-CoV-2, на 50% и более по сравнению с отрицательным контролем.
Результаты эксперимента показали, что уровень вируснейтрализующих антител более 1:5 на 14 день эксперимента наблюдался у 17,6% животных, тогда как на 28 день эксперимента - у 100% животных.
Таким образом, полученные данные показывают, что введение разработанного фармацевтического средства приводит к развитию гуморального иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у приматов.
Для оценки клеточного иммунного ответа из крови приматов перед вакцинацией (0 день), через 7, 14 и 28 дней выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности рас- 24 037297 твора фиколла.
Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Раствор полисахарида фиколла в воде имеет градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов, а также бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей, чем фиколл, плотностью, что в результате центрифугирования определяет его расположение над слоем фиколла. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки (Boyum А. Separation of leukocytes from blood and bone marrow// Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21. Suppl. 97. - p. 1-9). Тромбоциты - наименьшие клетки, остаются при правильно выбранной скорости центрифугирования в сыворотке крови, не доходя до раздела фаз вода/ фиколл.
После выделения мононуклеарной фракции клеток из периферической крови обезьян проводили окраску клеток флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и помещали в лунки планшета.
После высева мононуклеарных клеток в лунки планшета проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду RBD фрагментом S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 ч после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 6, 7.
Данные, полученные в ходе эксперимента, показали, что максимальная напряженность клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией обезьян разработанным фармацевтическим средством согласно среднему арифметическому значению процента пролиферирующих CD4+ Т-лимфоцитов и CD8+ Тлимфоцитов наблюдается на 28 день после иммунизации. Данный факт связан с проведением второй (бустирующей) иммунизацией на 21 день исследования (1,2% против 0,1% в неиммунизированной группе). В этом случае антиген-специфические CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты получают дополнительный стимул пролиферации, увеличивая долю своего присутствия в организме вакцинированного животного.
Обобщая полученные результаты, можно заключить, что иммунизация приматов разработанным фармацевтическим средством в исследуемой дозе и схеме иммунизации позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы животных) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2 и повышением титра вируснейтрализующих антител, а также сформировать клеточный иммунитет, представленный как CD4+, так и CD8+ лимфоцитами.
Пример 14. Изучение иммуногенности разработанного фармацевтического средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.
В рамках клинических исследований разработанного фармацевтического средства по варианту 1 было проведено исследование напряженности клеточного иммунитета.
В исследовании принимало участие 40 добровольцев, которые были иммунизированы:
1) компонентом 1, а затем через 21 день компонентом 2 жидкой формы разработанного фармацевтического средства по варианту 1 (компонент 1: Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-S-CoV2), доза 1х 1011 вирусных частиц (20 человек);
2) компонентом 1, а затем через 21 день компонентом 2 лиофилизированной формы разработанного фармацевтического средства по варианту 1 (компонент 1: Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-SCoV2), доза 1х 1011 вирусных частиц (20 человек).
На 0 день (до введения препарата), 14 день и 28 день у добровольцев отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла. Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки планшета. Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 ч после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т-лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на фиг. 8, 9 (для жидкой формы вакцины), на фиг. 10, 11 (для лиофилизированной формы вакцины).
- 25 037297
Количественное определение концентрации гамма-интерферона (ИФНу) в культуральной среде мононуклеарных клеток крови человека через 72 ч после рестимуляции их S белком коронавируса проводили с помощью набора гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ (ВЕКТОР-БЕСТ, Россия) по инструкции производителя. Полученные данные представлены на фиг. 12 (для жидкой формы вакцины), на фиг. 13 (для лиофилизированной формы вакцины).
Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного последовательной иммунизацией добровольцев обеими формами фармацевтического средства по варианту 1, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. В обеих группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днями исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов - р<0,001.
Из результатов, представленных на фиг. 12, 13, можно заключить, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного последовательной иммунизацией добровольцев обеими формами фармацевтического средства по варианту 1, согласно медиане прироста концентрации ИФНу отмечается с увеличением дней после иммунизации. Статистически достоверная разница в значениях прироста концентрации ИФНу до иммунизации (0 день) и через 14 дней после проведенной вакцинации составила р<0,001. Максимальный прирост концентрации ИФНу наблюдается на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днями исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях прироста концентрации ИФНу - р<0,001.
Таким образом, исходя из приведенных данных можно заключить, что иммунизация разработанным фармацевтическим средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.
Пример 15. Изучение иммуногенности разработанного фармацевтического средства путем оценки титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.
В исследовании принимало участие 40 добровольцев, которые были иммунизированы:
1) компонентом 1, а затем через 21 день компонентом 2 жидкой формы разработанного фармацевтического средства по варианту 1 (компонент 1: Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-S-CoV2), доза 1х 1011 вирусных частиц (20 человек);
2) компонентом 1, а затем через 21 день компонентом 2 лиофилизированной формы разработанного фармацевтического средства по варианту 1 (компонент 1: Ad26-CMV-S-CoV2, компонент 2: Ad5-CMV-SCoV2), доза 1х 1011 вирусных частиц (20 человек).
На 14, 21, 28 дни у добровольцев отбирали образцы крови, из которых выделяли сыворотку.
Титр антител к домену RBDS белка вируса SARS-CoV-2 определяли методом иммуноферментного анализа с помощью набора SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи. Анализ проводили согласно инструкции производителя.
Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения жидкой формы препарата представлены на фиг. 14.
Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотки крови добровольцев после введения лиофилизированной формы препарата представлены на фиг. 15.
Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев разработанным фармацевтическим средством как в жидкой форме, так и в лиофилизированной форме позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы животных) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно создание средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.
- 26 037297
Перечень последовательностей <110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации <120> Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты).
<160> 7 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 4711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор, оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования <400> 1 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540 ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600 cgacgcggcc gctcgagcct aagcttggta ccatgtttgt gttccttgtg ttattgccac 660 tagtctctag tcagtgtgtg aacctgacca caagaaccca gctgcctcca gcctacacca 720 acagctttac cagaggcgtg tactaccccg acaaggtgtt cagatccagc gtgctgcact 780 ctacccagga cctgttcctg cctttcttca gcaacgtgac ctggttccac gccatccacg 840 tgtccggcac caatggcacc aagagattcg acaaccccgt gctgcccttc aacgacgggg 900 tgtactttgc cagcaccgag aagtccaaca tcatcagagg ctggatcttc ggcaccacac 960 tggacagcaa gacccagagc ctgctgatcg tgaacaacgc caccaacgtg gtcatcaaag 1020 tgtgcgagtt ccagttctgc aacgacccct tcctgggcgt ctactatcac aagaacaaca 1080 agagctggat ggaaagcgag ttccgggtgt acagcagcgc caacaactgc accttcgagt 1140 acgtgtccca gcctttcctg atggacctgg aaggcaagca gggcaacttc aagaacctgc 1200 gcgagttcgt gttcaagaac atcgacggct acttcaagat ctacagcaag cacaccccta 1260 tcaacctcgt gcgggatctg cctcagggct tctctgctct ggaacccctg gtggatctgc 1320 ccatcggcat caacatcacc cggtttcaga cactgctggc cctgcacaga agctacctga 1380 cacctggcga tagcagcagc ggatggacag ctggtgccgc cgcttactat gtgggctacc 1440 tgcagcctag aaccttcctg ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc gacgccgtgg 1500 attgtgctct ggatcctctg agcgagacaa agtgcaccct gaagtccttc accgtggaaa 1560 agggcatcta ccagaccagc aacttccggg tgcagcccac cgaatccatc gtgcggttcc 1620 ccaatatcac caatctgtgc cccttcggcg aggtgttcaa tgccaccaga ttcgcctctg 1680 tgtacgcctg gaaccggaag cggatcagca attgcgtggc cgactactcc gtgctgtaca 1740 actccgccag cttcagcacc ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc 1800 tgtgcttcac aaacgtgtac gccgacagct tcgtgatccg gggagatgaa gtgcggcaga 1860 ttgcccctgg acagacaggc aagatcgccg actacaacta caagctgccc gacgacttca 1920 ccggctgtgt gattgcctgg aacagcaaca acctggactc caaagtcggc ggcaactaca 1980 attacctgta ccggctgttc cggaagtcca atctgaagcc cttcgagcgg gacatctcca 2040
- 27 037297 ccgagatcta tcaggccggc agcacccctt gtaacggcgt ggaaggcttc aactgctact 2100 tcccactgca gtcctacggc tttcagccca caaatggcgt gggctatcag ccctacagag 2160 tggtggtgct gagcttcgaa ctgctgcatg cccctgccac agtgtgcggc cctaagaaaa 2220 gcaccaatct cgtgaagaac aaatgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcaccg 2280 gcgtgctgac agagagcaac aagaagttcc tgccattcca gcagtttggc cgggatattg 2340 ccgataccac agacgccgta cgagatcccc agacactgga aatcctggac atcacccctt 2400 gcagcttcgg cggagtgtct gtgatcaccc ctggcaccaa caccagcaat caggtggcag 2460 tgctgtacca ggacgtgaac tgtaccgaag tgcccgtggc cattcacgcc gatcagctga 2520 cacctacatg gcgggtgtac tccaccggca gcaatgtgtt tcagaccaga gccggctgtc 2580 tgatcggagc cgagcacgtg aacaatagct acgagtgcga catccccatc ggcgctggca 2640 tctgtgccag ctaccagaca cagacaaaca gccccagacg ggccagatct gtggccagcc 2700 agagcatcat tgcctacaca atgtctctgg gcgccgagaa cagcgtggcc tactccaaca 2760 actctatcgc tatccccacc aacttcacca tcagcgtgac cacagagatc ctgcctgtgt 2820 ccatgaccaa gaccagcgtg gactgcacca tgtacatctg cggcgattcc accgagtgct 2880 ccaacctgct gctgcagtac ggcagcttct gcacccagct gaatagagcc ctgacaggga 2940 tcgccgtgga acaggacaag aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctaca 3000 agacccctcc tatcaaggac ttcggcggct tcaatttcag ccagattctg cccgatccta 3060 gcaagcccag caagcggagc ttcatcgagg acctgctgtt caacaaagtg acactggccg 3120 acgccggctt catcaagcag tatggcgatt gtctgggcga cattgccgcc agggatctga 3180 tttgcgccca gaagtttaac ggactgacag tgctgccacc actgctgacc gatgagatga 3240 tcgcccagta cacatctgcc ctgctggccg gcacaatcac aagcggctgg acatttggag 3300 ctggcgccgc tctgcagatc ccctttgcta tgcagatggc ctaccggttc aacggcatcg 3360 gagtgaccca gaatgtgctg tacgagaacc agaagctgat cgccaaccag ttcaacagcg 3420 ccatcggcaa gatccaggac agcctgagca gcacagcaag cgccctggga aagctgcagg 3480 acgtggtcaa ccagaatgcc caggcactga acaccctggt caagcagctg tcctccaact 3540 tcggcgccat cagctctgtg ctgaacgaca tcctgagcag actggacaag gtggaagccg 3600 aggtgcagat cgacagactg atcaccggaa ggctgcagtc cctgcagacc tacgttaccc 3660 agcagctgat cagagccgcc gagattagag cctctgccaa tctggccgcc accaagatgt 3720 ctgagtgtgt gctgggccag agcaagagag tggacttttg cggcaagggc taccacctga 3780 tgagcttccc tcagtctgcc cctcacggcg tggtgtttct gcacgtgaca tacgtgcccg 3840 ctcaagagaa gaatttcacc accgctccag ccatctgcca cgacggcaaa gcccactttc 3900 ctagagaagg cgtgttcgtg tccaacggca cccattggtt cgtgacccag cggaacttct 3960 acgagcccca gatcatcacc accgacaaca ccttcgtgtc tggcaactgc gacgtcgtga 4020 tcggcattgt gaacaatacc gtgtacgacc ctctgcagcc cgagctggac agcttcaaag 4080 aggaactgga taagtacttt aagaaccaca caagccccga cgtggacctg ggcgacatca 4140 gcggaatcaa tgccagcgtc gtgaacatcc agaaagagat cgaccggctg aacgaggtgg 4200 ccaagaatct gaacgagagc ctgatcgacc tgcaagaact ggggaagtac gagcagtaca 4260 tcaagtggcc ctggtacatc tggctgggct ttatcgccgg actgattgcc atcgtgatgg 4320 tcacaatcat gctgtgttgc atgaccagct gctgtagctg cctgaagggc tgttgtagct 4380 gtggcagctg ctgcaagttc gacgaggacg attctgagcc cgtgctcaaa ggagtcaaat 4440 tacattacac ataagatatc cgatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata 4500 ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 4560 aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 4620 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 4680 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt a 4711 <210>2 <211> 5984 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CAG-промотор, оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования
- 28 037297 <400> 2 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420 ccccccctcc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg 480 ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg 540 cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta 600 tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg 660 ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 720 tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 780 gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 840 aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 900 tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc 960 gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg 1020 ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg 1080 gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca cccccctccc 1140 cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg 1200 ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct 1260 cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga 1320 ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt 1380 cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 1440 gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt 1500 gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac 1560 ggctgccttc ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct 1620 ctagaaagct tggtaccatg tttgtgttcc ttgtgttatt gccactagtc tctagtcagt 1680 gtgtgaacct gaccacaaga acccagctgc ctccagccta caccaacagc tttaccagag 1740 gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcagat ccagcgtgct gcactctacc caggacctgt 1800 tcctgccttt cttcagcaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgtcc ggcaccaatg 1860 gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga cggggtgtac tttgccagca 1920 ccgagaagtc caacatcatc agaggctgga tcttcggcac cacactggac agcaagaccc 1980 agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat caaagtgtgc gagttccagt 2040 tctgcaacga ccccttcctg ggcgtctact atcacaagaa caacaagagc tggatggaaa 2100 gcgagttccg ggtgtacagc agcgccaaca actgcacctt cgagtacgtg tcccagcctt 2160 tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa cctgcgcgag ttcgtgttca 2220 agaacatcga cggctacttc aagatctaca gcaagcacac ccctatcaac ctcgtgcggg 2280 atctgcctca gggcttctct gctctggaac ccctggtgga tctgcccatc ggcatcaaca 2340 tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta cctgacacct ggcgatagca 2400 gcagcggatg gacagctggt gccgccgctt actatgtggg ctacctgcag cctagaacct 2460 tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc cgtggattgt gctctggatc 2520 ctctgagcga gacaaagtgc accctgaagt ccttcaccgt ggaaaagggc atctaccaga 2580 ccagcaactt ccgggtgcag cccaccgaat ccatcgtgcg gttccccaat atcaccaatc 2640 tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc ctctgtgtac gcctggaacc 2700 ggaagcggat cagcaattgc gtggccgact actccgtgct gtacaactcc gccagcttca 2760 gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta ccaagctgaa cgacctgtgc ttcacaaacg 2820 tgtacgccga cagcttcgtg atccggggag atgaagtgcg gcagattgcc cctggacaga 2880 caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgtgtgattg 2940 cctggaacag caacaacctg gactccaaag tcggcggcaa ctacaattac ctgtaccggc 3000 tgttccggaa gtccaatctg aagcccttcg agcgggacat ctccaccgag atctatcagg 3060
- 29 037297 ccggcagcac cccttgtaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttccca ctgcagtcct 3120 acggctttca gcccacaaat ggcgtgggct atcagcccta cagagtggtg gtgctgagct 3180 tcgaactgct gcatgcccct gccacagtgt gcggccctaa gaaaagcacc aatctcgtga 3240 agaacaaatg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg caccggcgtg ctgacagaga 3300 gcaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt ttggccggga tattgccgat accacagacg 3360 ccgtacgaga tccccagaca ctggaaatcc tggacatcac cccttgcagc ttcggcggag 3420 tgtctgtgat cacccctggc accaacacca gcaatcaggt ggcagtgctg taccaggacg 3480 tgaactgtac cgaagtgccc gtggccattc acgccgatca gctgacacct acatggcggg 3540 tgtactccac cggcagcaat gtgtttcaga ccagagccgg ctgtctgatc ggagccgagc 3600 acgtgaacaa tagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc tggcatctgt gccagctacc 3660 agacacagac aaacagcccc agacgggcca gatctgtggc cagccagagc atcattgcct 3720 acacaatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctactc caacaactct atcgctatcc 3780 ccaccaactt caccatcagc gtgaccacag agatcctgcc tgtgtccatg accaagacca 3840 gcgtggactg caccatgtac atctgcggcg attccaccga gtgctccaac ctgctgctgc 3900 agtacggcag cttctgcacc cagctgaata gagccctgac agggatcgcc gtggaacagg 3960 acaagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat ctacaagacc cctcctatca 4020 aggacttcgg cggcttcaat ttcagccaga ttctgcccga tcctagcaag cccagcaagc 4080 ggagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aagtgacact ggccgacgcc ggcttcatca 4140 agcagtatgg cgattgtctg ggcgacattg ccgccaggga tctgatttgc gcccagaagt 4200 ttaacggact gacagtgctg ccaccactgc tgaccgatga gatgatcgcc cagtacacat 4260 ctgccctgct ggccggcaca atcacaagcg gctggacatt tggagctggc gccgctctgc 4320 agatcccctt tgctatgcag atggcctacc ggttcaacgg catcggagtg acccagaatg 4380 tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa cagcgccatc ggcaagatcc 4440 aggacagcct gagcagcaca gcaagcgccc tgggaaagct gcaggacgtg gtcaaccaga 4500 atgcccaggc actgaacacc ctggtcaagc agctgtcctc caacttcggc gccatcagct 4560 ctgtgctgaa cgacatcctg agcagactgg acaaggtgga agccgaggtg cagatcgaca 4620 gactgatcac cggaaggctg cagtccctgc agacctacgt tacccagcag ctgatcagag 4680 ccgccgagat tagagcctct gccaatctgg ccgccaccaa gatgtctgag tgtgtgctgg 4740 gccagagcaa gagagtggac ttttgcggca agggctacca cctgatgagc ttccctcagt 4800 ctgcccctca cggcgtggtg tttctgcacg tgacatacgt gcccgctcaa gagaagaatt 4860 tcaccaccgc tccagccatc tgccacgacg gcaaagccca ctttcctaga gaaggcgtgt 4920 tcgtgtccaa cggcacccat tggttcgtga cccagcggaa cttctacgag ccccagatca 4980 tcaccaccga caacaccttc gtgtctggca actgcgacgt cgtgatcggc attgtgaaca 5040 ataccgtgta cgaccctctg cagcccgagc tggacagctt caaagaggaa ctggataagt 5100 actttaagaa ccacacaagc cccgacgtgg acctgggcga catcagcgga atcaatgcca 5160 gcgtcgtgaa catccagaaa gagatcgacc ggctgaacga ggtggccaag aatctgaacg 5220 agagcctgat cgacctgcaa gaactgggga agtacgagca gtacatcaag tggccctggt 5280 acatctggct gggctttatc gccggactga ttgccatcgt gatggtcaca atcatgctgt 5340 gttgcatgac cagctgctgt agctgcctga agggctgttg tagctgtggc agctgctgca 5400 agttcgacga ggacgattct gagcccgtgc tcaaaggagt caaattacat tacacataat 5460 tcactcctca ggtgcaggct gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc aatgccctgg 5520 ctcacaaata ccactgagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc 5580 cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 5640 ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc 5700 agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca tatgctggct gccatgaaca 5760 aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat 5820 tccatagaaa agccttgact tgaggttaga tttttttata ttttgttttg tgttattttt 5880 tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 5940 tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gate 5984 <210> 3 <211> 5314 < 212> DNA ·
- 30 037297 < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая EF1-промотор, оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования <400> 3 ggtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggaatt agcttggtac 1200 taatacgact cacaagcttg gtaccatgtt tgtgttcctt gtgttattgc cactagtctc 1260 tagtcagtgt gtgaacctga ccacaagaac ccagctgcct ccagcctaca ccaacagctt 1320 taccagaggc gtgtactacc ccgacaaggt gttcagatcc agcgtgctgc actctaccca 1380 ggacctgttc ctgcctttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc acgtgtccgg 1440 caccaatggc accaagagat tcgacaaccc cgtgctgccc ttcaacgacg gggtgtactt 1500 tgccagcacc gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggacag 1560 caagacccag agcctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtcatca aagtgtgcga 1620 gttccagttc tgcaacgacc ccttcctggg cgtctactat cacaagaaca acaagagctg 1680 gatggaaagc gagttccggg tgtacagcag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc 1740 ccagcctttc ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt 1800 cgtgttcaag aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct 1860 cgtgcgggat ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg 1920 catcaacatc acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg 1980 cgatagcagc agcggatgga cagctggtgc cgccgcttac tatgtgggct acctgcagcc 2040 tagaaccttc ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc 2100 tctggatcct ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat 2160 ctaccagacc agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaatat 2220 caccaatctg tgccccttcg gcgaggtgtt caatgccacc agattcgcct ctgtgtacgc 2280 ctggaaccgg aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc 2340 cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt 2400 cacaaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat ccggggagat gaagtgcggc agattgcccc 2460 tggacagaca ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg 2520 tgtgattgcc tggaacagca acaacctgga ctccaaagtc ggcggcaact acaattacct 2580 gtaccggctg ttccggaagt ccaatctgaa gcccttcgag cgggacatct ccaccgagat 2640 ctatcaggcc ggcagcaccc cttgtaacgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact 2700 gcagtcctac ggctttcagc ccacaaatgg cgtgggctat cagccctaca gagtggtggt 2760 gctgagcttc gaactgctgc atgcccctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa 2820
- 31 037297 tctcgtgaag aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct 2880 gacagagagc aacaagaagt tcctgccatt ccagcagttt ggccgggata ttgccgatac 2940 cacagacgcc gtacgagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc cttgcagctt 3000 cggcggagtg tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg cagtgctgta 3060 ccaggacgtg aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac 3120 atggcgggtg tactccaccg gcagcaatgt gtttcagacc agagccggct gtctgatcgg 3180 agccgagcac gtgaacaata gctacgagtg cgacatcccc atcggcgctg gcatctgtgc 3240 cagctaccag acacagacaa acagccccag acgggccaga tctgtggcca gccagagcat 3300 cattgcctac acaatgtctc tgggcgccga gaacagcgtg gcctactcca acaactctat 3360 cgctatcccc accaacttca ccatcagcgt gaccacagag atcctgcctg tgtccatgac 3420 caagaccagc gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat tccaccgagt gctccaacct 3480 gctgctgcag tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgacag ggatcgccgt 3540 ggaacaggac aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc 3600 tcctatcaag gacttcggcg gcttcaattt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc 3660 cagcaagcgg agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg 3720 cttcatcaag cagtatggcg attgtctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc 3780 ccagaagttt aacggactga cagtgctgcc accactgctg accgatgaga tgatcgccca 3840 gtacacatct gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc 3900 cgctctgcag atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac 3960 ccagaatgtg ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg 4020 caagatccag gacagcctga gcagcacagc aagcgccctg ggaaagctgc aggacgtggt 4080 caaccagaat gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtcctcca acttcggcgc 4140 catcagctct gtgctgaacg acatcctgag cagactggac aaggtggaag ccgaggtgca 4200 gatcgacaga ctgatcaccg gaaggctgca gtccctgcag acctacgtta cccagcagct 4260 gatcagagcc gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg 4320 tgtgctgggc cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt 4380 ccctcagtct gcccctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acatacgtgc ccgctcaaga 4440 gaagaatttc accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga 4500 aggcgtgttc gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc 4560 ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat 4620 tgtgaacaat accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact 4680 ggataagtac tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgaca tcagcggaat 4740 caatgccagc gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa 4800 tctgaacgag agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg 4860 gccctggtac atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat 4920 catgctgtgt tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggcag 4980 ctgctgcaag ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctc aaaggagtca aattacatta 5040 cacataagat ctagagtcgg ggcggccggc cgctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 5100 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 5160 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 5220 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 5280 tagcaggcat gctggggatc cgagtgtcga taag 5314 <210>4 <211> 4678 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор, оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования <400> 4 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
- 32 037297 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540 ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccat 600 gtttgtgttc cttgtgttat tgccactagt ctctagtcag tgtgtgaacc tgaccacaag 660 aacccagctg cctccagcct acaccaacag ctttaccaga ggcgtgtact accccgacaa 720 ggtgttcaga tccagcgtgc tgcactctac ccaggacctg ttcctgcctt tcttcagcaa 780 cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaaga gattcgacaa 840 ccccgtgctg cccttcaacg acggggtgta ctttgccagc accgagaagt ccaacatcat 900 cagaggctgg atcttcggca ccacactgga cagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa 960 caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaacg accccttcct 1020 gggcgtctac tatcacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gggtgtacag 1080 cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct ttcctgatgg acctggaagg 1140 caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt 1200 caagatctac agcaagcaca cccctatcaa cctcgtgcgg gatctgcctc agggcttctc 1260 tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac atcacccggt ttcagacact 1320 gctggccctg cacagaagct acctgacacc tggcgatagc agcagcggat ggacagctgg 1380 tgccgccgct tactatgtgg gctacctgca gcctagaacc ttcctgctga agtacaacga 1440 gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctggat cctctgagcg agacaaagtg 1500 caccctgaag tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca 1560 gcccaccgaa tccatcgtgc ggttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt 1620 gttcaatgcc accagattcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tcagcaattg 1680 cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg 1740 cgtgtcccct accaagctga acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagcttcgt 1800 gatccgggga gatgaagtgc ggcagattgc ccctggacag acaggcaaga tcgccgacta 1860 caactacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgtgtgatt gcctggaaca gcaacaacct 1920 ggactccaaa gtcggcggca actacaatta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaatct 1980 gaagcccttc gagcgggaca tctccaccga gatctatcag gccggcagca ccccttgtaa 2040 cggcgtggaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggctttc agcccacaaa 2100 tggcgtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgcccc 2160 tgccacagtg tgcggcccta agaaaagcac caatctcgtg aagaacaaat gcgtgaactt 2220 caacttcaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacagag agcaacaaga agttcctgcc 2280 attccagcag tttggccggg atattgccga taccacagac gccgtacgag atccccagac 2340 actggaaatc ctggacatca ccccttgcag cttcggcgga gtgtctgtga tcacccctgg 2400 caccaacacc agcaatcagg tggcagtgct gtaccaggac gtgaactgta ccgaagtgcc 2460 cgtggccatt cacgccgatc agctgacacc tacatggcgg gtgtactcca ccggcagcaa 2520 tgtgtttcag accagagccg gctgtctgat cggagccgag cacgtgaaca atagctacga 2580 gtgcgacatc cccatcggcg ctggcatctg tgccagctac cagacacaga caaacagccc 2640 cagacgggcc agatctgtgg ccagccagag catcattgcc tacacaatgt ctctgggcgc 2700 cgagaacagc gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc cccaccaact tcaccatcag 2760 cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta 2820 catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac 2880 ccagctgaat agagccctga cagggatcgc cgtggaacag gacaagaaca cccaagaggt 2940 gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc aaggacttcg gcggcttcaa 3000 tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag cggagcttca tcgaggacct 3060 gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc aagcagtatg gcgattgtct 3120 gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgacagtgct 3180 gccaccactg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca tctgccctgc tggccggcac 3240
- 33 037297 aatcacaagc ggctggacat ttggagctgg cgccgctctg cagatcccct ttgctatgca 3300 gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa 3360 gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatc caggacagcc tgagcagcac 3420 agcaagcgcc ctgggaaagc tgcaggacgt ggtcaaccag aatgcccagg cactgaacac 3480 cctggtcaag cagctgtcct ccaacttcgg cgccatcagc tctgtgctga acgacatcct 3540 gagcagactg gacaaggtgg aagccgaggt gcagatcgac agactgatca ccggaaggct 3600 gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga gccgccgaga ttagagcctc 3660 tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg ggccagagca agagagtgga 3720 cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag tctgcccctc acggcgtggt 3780 gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat 3840 ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg ttcgtgtcca acggcaccca 3900 ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt 3960 cgtgtctggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aataccgtgt acgaccctct 4020 gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag tactttaaga accacacaag 4080 ccccgacgtg gacctgggcg acatcagcgg aatcaatgcc agcgtcgtga acatccagaa 4140 agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca 4200 agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggctttat 4260 cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg tgttgcatga ccagctgctg 4320 tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgattc 4380 tgagcccgtg ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa gatatcgcgg ccgctcgagt 4440 ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4500 acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 4560 tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 4620 aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatctta 4678 <210> 5 <211> 33765 < 212> DNA < 213> Recombinant human adenovirus serotype 26 <220>
< 223> Материнская последовательность рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа, в котором делетированы Е1 и ЕЗ области, a ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 <400> 5 catcatcaat aatatacccc acaaagtaaa caaaagttaa tatgcaaatg agcttttgaa 60 ttttaacggt tttggggcgg agccaacgct gattggacga gaaacggtga tgcaaatgac 120 gtcacgacgc acggctaacg gtcgccgcgg aggcgtggcc tagcccggaa gcaagtcgcg 180 gggctgatga cgtataaaaa agcggacttt agacccggaa acggccgatt ttcccgcggc 240 cacgcccgga tatgaggtaa ttctgggcgg atgcaagtga aattaggtca ttttggcgcg 300 aaaactgaat gaggaagtga aaagcgaaaa ataccggtcc ctcccagggc ggaatattta 360 ccgagggccg agagactttg accgattacg tgggggtttc gattgcggtg tttttttcgc 420 gaatttccgc gtccgtgtca aagtccggtg tttatgtcac agatcagctg gtttccttta 480 agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 540 tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 600 aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 660 taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatcagtt atctagatcc 720 ggtggatcgg atatcttatg tgtaatgtaa tttgactcct ttgagcacgg gctcagaatc 780 gtcctcgtcg aacttgcagc agctgccaca gctacaacag cccttcaggc agctacagca 840 gctggtcatg caacacagca tgattgtgac catcacgatg gcaatcagtc cggcgataaa 900 gcccagccag atgtaccagg gccacttgat gtactgctcg tacttcccca gttcttgcag 960 gtcgatcagg ctctcgttca gattcttggc cacctcgttc agccggtcga tctctttctg 1020 gatgttcacg acgctggcat tgattccgct gatgtcgccc aggtccacgt cggggcttgt 1080 gtggttctta aagtacttat ccagttcctc tttgaagctg tccagctcgg gctgcagagg 1140 gtcgtacacg gtattgttca caatgccgat cacgacgtcg cagttgccag acacgaaggt 1200
- 34 037297 gttgtcggtg gtgatgatct ggggctcgta gaagttccgc tgggtcacga accaatgggt 1260 gccgttggac acgaacacgc cttctctagg aaagtgggct ttgccgtcgt ggcagatggc 1320 tggagcggtg gtgaaattct tctcttgagc gggcacgtat gtcacgtgca gaaacaccac 1380 gccgtgaggg gcagactgag ggaagctcat caggtggtag cccttgccgc aaaagtccac 1440 tctcttgctc tggcccagca cacactcaga catcttggtg gcggccagat tggcagaggc 1500 tctaatctcg gcggctctga tcagctgctg ggtaacgtag gtctgcaggg actgcagcct 1560 tccggtgatc agtctgtcga tctgcacctc ggcttccacc ttgtccagtc tgctcaggat 1620 gtcgttcagc acagagctga tggcgccgaa gttggaggac agctgcttga ccagggtgtt 1680 cagtgcctgg gcattctggt tgaccacgtc ctgcagcttt cccagggcgc ttgctgtgct 1740 gctcaggctg tcctggatct tgccgatggc gctgttgaac tggttggcga tcagcttctg 1800 gttctcgtac agcacattct gggtcactcc gatgccgttg aaccggtagg ccatctgcat 1860 agcaaagggg atctgcagag cggcgccagc tccaaatgtc cagccgcttg tgattgtgcc 1920 ggccagcagg gcagatgtgt actgggcgat catctcatcg gtcagcagtg gtggcagcac 1980 tgtcagtccg ttaaacttct gggcgcaaat cagatccctg gcggcaatgt cgcccagaca 2040 atcgccatac tgcttgatga agccggcgtc ggccagtgtc actttgttga acagcaggtc 2100 ctcgatgaag ctccgcttgc tgggcttgct aggatcgggc agaatctggc tgaaattgaa 2160 gccgccgaag tccttgatag gaggggtctt gtagatctgc ttcacttggg cgaacacctc 2220 ttgggtgttc ttgtcctgtt ccacggcgat ccctgtcagg gctctattca gctgggtgca 2280 gaagctgccg tactgcagca gcaggttgga gcactcggtg gaatcgccgc agatgtacat 2340 ggtgcagtcc acgctggtct tggtcatgga cacaggcagg atctctgtgg tcacgctgat 2400 ggtgaagttg gtggggatag cgatagagtt gttggagtag gccacgctgt tctcggcgcc 2460 cagagacatt gtgtaggcaa tgatgctctg gctggccaca gatctggccc gtctggggct 2520 gtttgtctgt gtctggtagc tggcacagat gccagcgccg atggggatgt cgcactcgta 2580 gctattgttc acgtgctcgg ctccgatcag acagccggct ctggtctgaa acacattgct 2640 gccggtggag tacacccgcc atgtaggtgt cagctgatcg gcgtgaatgg ccacgggcac 2700 ttcggtacag ttcacgtcct ggtacagcac tgccacctga ttgctggtgt tggtgccagg 2760 ggtgatcaca gacactccgc cgaagctgca aggggtgatg tccaggattt ccagtgtctg 2820 gggatctcgt acggcgtctg tggtatcggc aatatcccgg ccaaactgct ggaatggcag 2880 gaacttcttg ttgctctctg tcagcacgcc ggtgccggtc aggccgttga agttgaagtt 2940 cacgcatttg ttcttcacga gattggtgct tttcttaggg ccgcacactg tggcaggggc 3000 atgcagcagt tcgaagctca gcaccaccac tctgtagggc tgatagccca cgccatttgt 3060 gggctgaaag ccgtaggact gcagtgggaa gtagcagttg aagccttcca cgccgttaca 3120 aggggtgctg ccggcctgat agatctcggt ggagatgtcc cgctcgaagg gcttcagatt 3180 ggacttccgg aacagccggt acaggtaatt gtagttgccg ccgactttgg agtccaggtt 3240 gttgctgttc caggcaatca cacagccggt gaagtcgtcg ggcagcttgt agttgtagtc 3300 ggcgatcttg cctgtctgtc caggggcaat ctgccgcact tcatctcccc ggatcacgaa 3360 gctgtcggcg tacacgtttg tgaagcacag gtcgttcagc ttggtagggg acacgccgta 3420 gcacttgaag gtgctgaagc tggcggagtt gtacagcacg gagtagtcgg ccacgcaatt 3480 gctgatccgc ttccggttcc aggcgtacac agaggcgaat ctggtggcat tgaacacctc 3540 gccgaagggg cacagattgg tgatattggg gaaccgcacg atggattcgg tgggctgcac 3600 ccggaagttg ctggtctggt agatgccctt ttccacggtg aaggacttca gggtgcactt 3660 tgtctcgctc agaggatcca gagcacaatc cacggcgtcg gtgatggtgc cgttctcgtt 3720 gtacttcagc aggaaggttc taggctgcag gtagcccaca tagtaagcgg cggcaccagc 3780 tgtccatccg ctgctgctat cgccaggtgt caggtagctt ctgtgcaggg ccagcagtgt 3840 ctgaaaccgg gtgatgttga tgccgatggg cagatccacc aggggttcca gagcagagaa 3900 gccctgaggc agatcccgca cgaggttgat aggggtgtgc ttgctgtaga tcttgaagta 3960 gccgtcgatg ttcttgaaca cgaactcgcg caggttcttg aagttgccct gcttgccttc 4020 caggtccatc aggaaaggct gggacacgta ctcgaaggtg cagttgttgg cgctgctgta 4080 cacccggaac tcgctttcca tccagctctt gttgttcttg tgatagtaga cgcccaggaa 4140 ggggtcgttg cagaactgga actcgcacac tttgatgacc acgttggtgg cgttgttcac 4200 gatcagcagg ctctgggtct tgctgtccag tgtggtgccg aagatccagc ctctgatgat 4260 gttggacttc tcggtgctgg caaagtacac cccgtcgttg aagggcagca cggggttgtc 4320
- 35 037297 gaatctcttg gtgccattgg tgccggacac gtggatggcg tggaaccagg tcacgttgct 4380 gaagaaaggc aggaacaggt cctgggtaga gtgcagcacg ctggatctga acaccttgtc 4440 ggggtagtac acgcctctgg taaagctgtt ggtgtaggct ggaggcagct gggttcttgt 4500 ggtcaggttc acacactgac tagagactag tggcaataac acaaggaaca caaacatggt 4560 accaagctta ggctcgagcg gccgcgtcga cggtaccaga tctctagcgg atctgacggt 4620 tcactaaacc agctctgctt atatagacct cccaccgtac acgcctaccg cccatttgcg 4680 tcaatggggc ggagttgtta cgacattttg gaaagtcccg ttgattttgg tgccaaaaca 4740 aactcccatt gacgtcaatg gggtggagac ttggaaatcc ccgtgagtca aaccgctatc 4800 cacgcccatt gatgtactgc caaaaccgca tcaccatggt aatagcgatg actaatacgt 4860 agatgtactg ccaagtagga aagtcccata aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 4920 gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 4980 ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 5040 ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 5100 gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 5160 gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aacagtgttt aaacgtatac ctataaaggc 5220 gggtgtctta cgagggtctt tttgcttttc tgcagacatc atgaacggga ctggcggggc 5280 cttcgaaggg gggcttttta gcccttattt gacaacccgc ctgccgggat gggccggagt 5340 tcgtcagaat gtgatgggat cgacggtgga tgggcgccca gtgcttccag caaattcctc 5400 gaccatgacc tacgcgaccg tggggaactc gtcgctcgac agcaccgccg cagccgcggc 5460 agccgcagcc gccatgacag cgacgagact ggcctcgagc tacatgccca gcagcggtag 5520 tagcccctct gtgcccagtt ccatcatcgc cgaggagaaa ctgctggccc tgctggccga 5580 gctggaagcc ctgagccgcc agctggccgc cctgacccag caggtgtccg agctccgcga 5640 acagcagcag cagcaaaata aatgattcaa taaacacaga ttctgattca aacagcaaag 5700 catctttatt atttattttt tcgcgcgcgg taggccctgg tccacctctc ccgatcattg 5760 agagtgcggt ggattttttc caggacccgg tagaggtggg attggatgtt gaggtacatg 5820 ggcatgagcc cgtcccgtgg gtggaggtag caccactgca tggcctcgtg ctctggggtc 5880 gtgttgtaga tgatccagtc atagcagggg cgctgggcgt ggtgctggat gatgtccttg 5940 aggaggagac tgatggccac ggggagcccc ttggtgtagg tgttggcaaa acggttgagc 6000 tgggagggat gcatgcgggg ggagatgatg tgcagtttgg cctggatctt gaggttggcg 6060 atgttgccac ccagatcccg ccgggggttc atgttgtgca ggaccaccag aacggtgtag 6120 cccgtgcact tggggaactt gtcatgcaac ttggaaggga atgcgtggaa gaatttggag 6180 acgcccttgt gcccgcccag gttttccatg cactcatcca tgatgatggc aatgggcccg 6240 tgggctgcgg ctttggcaaa gacgtttctg gggtcagaga catcgtaatt atgctcctgg 6300 gtgagatcat cataagacat tttaatgaat ttggggcgga gggtgccaga ttgggggacg 6360 atggttccct cgggccccgg ggcgaagttc ccctcgcaga tctgcatctc ccaggctttc 6420 atctcggagg gggggatcat gtccacctgc ggggcgatga aaaaaacggt ttccggggcg 6480 ggggtgatga gctgcgagga gagcaggttt ctcaacagct gggacttgcc gcacccggtc 6540 gggccgtaga tgaccccgat gacgggttgc aggtggtagt tcaaggacat gcagctgccg 6600 tcgtcccgga ggaggggggc cacctcgttg agcttgtctc tgacttggag gttttcccgg 6660 acgagctcgc cgaggaggcg gtccccgccc agcgagagaa gctcttgcag ggaagcaaag 6720 tttttcaggg gcttgagccc gtcggccatg ggcatcttgg cgagggtctg cgagaggagc 6780 tccaggcggt cccagagctc ggtgacgtgc tctacggcat ctcgatccag cagacttcct 6840 cgtttcgggg gttgggacga ctgcgactgt agggcacgag acgatgggcg tccagcgcgg 6900 ccagcgtcat gtccttccag ggtctcaggg tccgcgtgag ggtggtctcc gtcacggtga 6960 aggggtgggc cgcgggctgg gcgcttgcaa gggtgcgctt gagactcatc ctgctggtgc 7020 tgaaacgggc acggtcttcg ccctgcgcgt cggcgagata gcagttgacc atgagctcgt 7080 agttgagggc ctcggcggcg tggcccttgg cgcggagctt gcccttggaa gagcgcccgc 7140 aggcgggaca gaggagggat tgcagggcgt agagcttggg cgcgagaaag acggactcgg 7200 gggcgaaggc gtccgctccg cagtgggcgc agacggtctc gcactcgact agccaggtga 7260 gctcgggctg ctcggggtca aaaaccagtt ttcccccgtt ctttttgatg cgcttcttac 7320 ctcgcgtctc catgagtctg tgtccgcgct cggtgacaaa caggctgtct gtgtccccgt 7380 agacggactt gatgggcctg tcctgcaggg gcgtcccgcg gtcctcctcg tagagaaact 7440
- 36 037297 cagaccactc tgagacgaag gcgcgcgtcc acgccaagac aaaggaggcc acgtgcgagg 7500 ggtagcggtc gttgtccacc agggggtcca ccttttccac ggtatgcagg cacatgtccc 7560 cctcctccgc atccaagaag gtgattggct tgtaggtgta ggccacgtga cctggggttc 7620 ccgacggggg ggtataaaag ggggcgggtc tgtgctcgtc ctcactctct tccgcgtcgc 7680 tgtccacgag cgccagctgt tggggtaggt attccctctc aagagcgggc atgacctcgg 7740 cactcaggtt gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat gtgggcctgc cctgccgcga 7800 tgctttttag gagactttca tccatctggt cagaaaagac tattttttta ttgtcaagct 7860 tggtggcgaa ggagccatag agggcgtttg agagaagctt ggcgatggat ctcatggtct 7920 gatttttgtc acggtcggcg cgctccttgg ccgcgatgtt gagctggaca tattcgcgcg 7980 cgacacactt ccattcgggg aagacggtgg tgcgctcgtc gggcacgatc ctgacgcgcc 8040 agccgcggtt atgcagggtg accaggtcca cgctggtggc cacctcgccg cgcaggggct 8100 cgttggtcca gcagagtctg ccgcccttgc gcgagcagaa cgggggcagc acatcaagca 8160 gatgctcgtc aggggggtcc gcatcgatgg tgaagatgcc cggacagagt tccttgtcaa 8220 aataatcgat ttttgaggat gcatcgtcca aggccatctg ccactcgcgg gcggccagcg 8280 ctcgctcgta ggggttgagg ggcggacccc aaggcatggg atgcgtgagg gcggaggcgt 8340 acatgccgca gatgtcatag acatagatgg gctccgagag gatgccgatg taggtgggat 8400 agcagcgccc cccgcggatg cttgcgcgca cgtagtcata caactcgtgc gagggggcca 8460 agaaggcggg gccgagattg gtgcgctggg gctgctcggc gcggaagacg atctggcgaa 8520 agatggcgtg cgagttggag gagatggtgg gccgttggaa gatgttaaag tgggcgtgag 8580 gcaggcggac cgagtcgcgg atgaagtgcg cgtaggagtc ttgcagcttg gcgacgagct 8640 cggcggtgac gaggacgtcc atggcgcagt agtccagcgt ttcgcggatg atgtcataac 8700 tcgcctctcc tttcttctcc cacagctcgc ggttgagggc gtattcctcg tcatccttcc 8760 agtactcccg gagcgggaat cctcgatcgt ccgcacggta agagcccagc atgtagaaat 8820 ggttcacggc cttgtaggga cagcagccct tctccacggg gagggcgtaa gcttgagcgg 8880 ccttgcggag cgaggtgtgc gtcagggcaa aggtgtccct gaccatgact ttcaagaact 8940 ggtacttgaa gtccgagtcg tcgcagccgc cgtgctccca gagctcgaaa tcggtgcgct 9000 tcttcgagag ggggttaggc agagcgaaag tgacgtcatt gaagagaatc ttgcctgccc 9060 gcggcatgaa attgcgggtg atgcggaaag ggcccgggac ggaggctcgg ttgttgatga 9120 cctgggcggc gaggacgatc tcgtcaaagc cgttgatgtt gtgcccgacg atgtagagtt 9180 ccatgaatcg cgggcggcct ttgatgtgcg gcagcttttt gagctcctcg taggtgaggt 9240 cctcggggca ttgcaggccg tgctgctcga gcgcccactc ctggagatgt gggttggctt 9300 gcatgaagga agcccagagc tcgcgggcca tgagggtctg gagctcgtcg cgaaagaggc 9360 ggaactgctg gcccacggcc atcttttctg gggtgacgca gtagaaggtg agggggtccc 9420 gctcccagcg atcccagcgt aaacgcacgg cgagatcgcg agcgagggcg accagctctg 9480 ggtccccgga gaatttcatg accagcatga aggggacgag ctgcttgccg aaggacccca 9540 tccaggtgta ggtttctaca tcgtaggtga caaagagccg ctccgtgcga ggatgagagc 9600 cgattgggaa gaactggatt tcctgccacc agttggacga gtggctgttg atgtgatgaa 9660 agtagaaatc ccgccggcga accgagcact cgtgctgatg cttgtaaaag cgtccgcagt 9720 actcgcagcg ctgcacgggc tgtacctcat ccacgagata cacagcgcgt cccttgagga 9780 ggaacttcag gagtggcggc cctggctggt ggttttcatg ttcgcctgcg tgggactcac 9840 cctggggctc ctcgaggacg gagaggctga cgagcccgcg cgggagccag gtccagatct 9900 cggcgcggcg ggggcggaga gcgaagacga gggcgcgcag ttgggagctg tccatggtgt 9960 cgcggagatc caggtccggg ggcagggttc tgaggttgac ctcgtagagg cgggtgaggg 10020 cgtgcttgag atgcagatgg tacttgattt ctacgggtga gttggtggtc gtgtccacgc 10080 attgcatgag cccgtagctg cgcggggcca cgaccgtgcc gcggtgcgct tttagaagcg 10140 gtgtcgcgga cgcgctcccg gcggcagcgg cggttccggc cccgcgggca ggggcggcag 10200 aggcacgtcg gcgtggcgct cgggcaggtc ccggtgctgc gccctgagag cgctggcgtg 10260 cgcgacgacg cggcggttga catcctggat ctgccgcctc tgcgtgaaga ccacgggccc 10320 cgtgactttg aacctgaaag acagttcaac agaatcaatc tctgcgtcat tgacggcggc 10380 ctgacgcagg atctcttgca cgtcgcccga gttgtcctgg taggcgatct cggacatgaa 10440 ctgttcgatc tcctcctcct ggagatcgcc gcggcccgcg cgctccacgg tggcggcgag 10500 gtcattggag atgcgaccca tgagctgcga gaaggcgccc aggccgctct cgttccagac 10560
- 37 037297 gcggctgtag accacgtccc cgtcggcgtc gcgcgcgcgc atgaccacct gcgcgaggtt 10620 gagctccacg tgccgcgcaa agacggcgta gttgcgcagg cgctggaaga ggtagttgag 10680 ggtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc cagcggcgca ggggcatctc 10740 gctgatgtcg ccgatggctt ccagcctttc catggcctcg tagaagtcca cggcgaagtt 10800 gaaaaactgg gcgttgcggg ccgagaccgt gagctcgtct tccaggagcc ggatgagttc 10860 ggcgatggtg gcgcgcacct cgcgctcgaa atccccgggg gcctcctcct cttcctcttc 10920 ttccatgacg acctcttctt ctatttcttc ctctgggggc ggtggtggtg gcgggggccg 10980 acgacgacgg cgacgcaccg ggagacggtc gacgaagcgc tcgatcatct ccccgcggcg 11040 gcgacgcatg gtttcggtga cggcgcgacc ccgttcgcga ggacgcagcg tgaagacgcc 11100 gccggtcatc tcccggtaat ggggcgggtc cccattgggc agcgataggg cgctgacgat 11160 gcatcttatc aattgcggtg taggggacgt gagcgcgtcg agatcgaccg gatcggagaa 11220 tctttcgagg aaagcgtcta gccaatcgca gtcgcaaggt aagctcaaac acgtagcagc 11280 cctgcggacg ctgttagaat tgcggttgct gatgatgtaa ttgaagtagg cgtttttgag 11340 gcggcggatg gtggcgagga ggaccaggtc cttgggtcca gcttgctgga tgcggagccg 11400 ctcggccatg ccccaggcct ggccctgaca ccggctcagg ttcttgtagt agtcatgcat 11460 gagcctctca atgtcatcac tggctgaggc ggagtcttcc atgcgggtga ccccgacgcc 11520 cctgagcggc tgcacgagcg ccaggtcggc gacgacgcgc tcggcgagga tggcctgttg 11580 cacgcgggtg agggtgtcct ggaagtcgtc catgtcgacg aagcggtgat aggccccggt 11640 gttgatggtg taggtgcagt tggccatgag cgaccagttg acggtctgca ggcctggctg 11700 cacgacctcg gagtacctga gccgcgagaa ggcgcgcgag tcgaagacgt agtcgttgca 11760 ggtgcgcacg aggtactggt atccgactag gaagtgcggc ggcggctggc ggtagagcgg 11820 ccagcgctgg gtggccggcg cgcccggggc caggtcctcg agcatgaggc ggtggtagcc 11880 gtagaggtag cgggacatcc aggtgatgcc ggcggcggtg gtggaggcgc gcgggaactc 11940 gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg caggaaatag tccatggtcg gcacggtctg 12000 gccggtgaga cgcgcgcagt cattgacgct ctagaggcaa aaacgaaagc ggttgagcgg 12060 gctcttcctc cgtagcctgg cggaacgcaa acgggttagg ccgcgtgtgt accccggttc 12120 gagtcccctc gaatcaggct ggagccgcga ctaacgtggt attggcactc ccgtctcgac 12180 ccgagcccga tagccgccag gatacggcgg agagcccttt ttgctggccg aggggggtcg 12240 ctagacttga aagcgaccga aaaccctgcc gggtagtggc tcgcgcccgt agtctggaga 12300 agcatcgcca gggttgagtc gcggcagaac ccggttcgag gacggccgcg gcgagcggga 12360 cttggtcacc ccgccgatat aaagacccac agccagccga cttctccagt tacgggagcg 12420 agcccccttt tttctttttg ccagatgcat cccgtcctgc gccaaatgcg tcccaccccc 12480 ccggcgacca ccgcgaccgc ggccgtagca ggcgccggcg ctagccagcc accacagaca 12540 gagatggact tggaagaggg cgaagggctg gcaagactgg gggcgccgtc cccggagcga 12600 catccccgcg tgcagctgca gaaggacgtg cgcccggcgt acgtgcctac gcagaacctg 12660 ttcagggacc gcagcgggga ggagcccgag gagatgcgcg actgccggtt tcgggcgggc 12720 agggagctgc gcgagggcct ggaccgccag cgcgtgctgc gcgacgagga tttcgagccg 12780 aacgagcaga cggggatcag ccccgcacgc gcgcacgtgg cggcagccaa cctggtgacg 12840 gcctacgagc agacggtgaa gcaggagcgc aacttccaaa agagtttcaa caaccacgtg 12900 cgcaccctga tcgcgcgcga ggaggtggcc ctgggcctga tgcacctgtg ggacctggcg 12960 gaggccatcg tgcagaaccc ggacagcaag cctctgacgg cgcagctgtt cctggtggtg 13020 cagcacagca gggacaacga ggcgttcagg gaggcgctgc tgaacatcgc cgagcccgag 13080 ggtcgctggc tgctggagct gattaacatc ttgcagagca tcgtagtgca ggagcgcagc 13140 ctgagcctgg ccgagaaggt ggcggcgatc aactactcgg tgctgagcct gggcaagttt 13200 tacgcgcgca agatttacaa gacgccgtac gtgcccatag acaaggaggt gaagatagac 13260 agcttttaca tgcgcatggc gctcaaggtg ctgacgctga gcgacgacct gggcgtgtac 13320 cgcaacgacc gcatccacaa ggccgtgagc acgagccggc ggcgcgagct aagcgaccgc 13380 gagctgatgc tgagtctgcg ccgggcgctg gtagggggcg ccgccggcgg cgaggagtcc 13440 tacttcgaca tgggtgcgga cctgcattgg cagccgagcc ggcgcgcctt ggaggccgcc 13500 tacggttcag aggacttgga tgaggaagag gaagaggagg aggatgcacc cgctgcgggg 13560 tactgacgcc tccgtgatgt gtttttagat gtcccagcaa gccccggacc ccgccataag 13620 ggcggcgctg caaagccagc cgtccggtct agcatcggac gactgggagg ccgcgatgca 13680
- 38 037297 acgcatcatg gccctgacga cccgcaaccc cgagtccttt agacaacagc cgcaggccaa 13740 cagactctcg gccattctgg aggcggtggt cccctctcgg accaacccca cgcacgagaa 13800 ggtgctggcg atcgtgaacg cgctggcgga gaacaaggcc atccgtcccg acgaggccgg 13860 gctggtgtac aacgccctgc tggagcgcgt gggccgctac aacagcacga acgtgcagtc 13920 caacctggat cggctggtga cggacgtgcg cgaggccgtg gcgcagcgcg agcggttcaa 13980 gaacgagggc ctgggctcgc tggtggcgct gaacgccttc ctggcaacgc agccggcgaa 14040 cgtgccgcgc gggcaggacg attacaccaa ctttatcagc gcgctgcggc tgatggtgac 14100 cgaggtgccc cagagcgagg tgtaccagtc tggcccggac tactttttcc agacgagccg 14160 gcagggcttg cagacggtga acctgagcca ggctttcaag aatctgcgcg ggctgtgggg 14220 cgtgcaggcg cccgtgggcg accggtcaac ggtgagcagc ttgctgacgc ccaactcgcg 14280 gctgctgctg ctgctgatcg cgcccttcac cgacagcggc agcgtgaacc gcaactcgta 14340 cctgggccat ctgctgacgc tgtaccgcga ggccataggc caggcgcagg tggacgagca 14400 gaccttccag gagatcacta gcgtgagccg cgcgctgggg cagaacgaca ccgacagtct 14460 gagggccacc ctgaactttt tgctgaccaa tagacagcag aagatcccgg cgcagtacgc 14520 actgtcggcc gaggaggaaa ggattctgag atatgtgcag cagagcgtag ggctgttcct 14580 gatgcaggag ggtgccaccc ccagcgccgc gctggacatg accgcgcgca acatggaacc 14640 tagcatgtac gccgccaacc ggccgttcat caataagctg atggactact tgcaccgcgc 14700 ggcggccatg aacacggact actttaccaa cgccatcctg aacccgcact ggctcccgcc 14760 gccggggttc tacacgggcg agtacgacat gcccgacccc aacgacgggt tcctgtggga 14820 cgacgtggac agcgcggtgt tctcgccgac ctttcaaaag cgccaggagg cgccgccgag 14880 cgagggcgcg gtggggagga gcccctttcc tagcttaggg agtttgcata gcttgccggg 14940 ctcggtgaac agcggcaggg tgagccggcc gcgcttgctg ggcgaggacg agtacctgaa 15000 cgactcgctg ctgcagccgc cgcgggccaa gaacgccatg gccaataacg ggatagagag 15060 tctggtggac aaactgaacc gctggaagac ctacgctcag gaccataggg acgcgcccgc 15120 gccgcggcga cagcgccacg accggcagcg gggcctggtg tgggacgacg aggactcggc 15180 cgacgatagc agcgtgttgg acttgggcgg gagcggtggg gtcaacccgt tcgcgcatct 15240 gcagcccaaa ctggggcgac ggatgttttg aatgaaataa aactcaccaa ggccatagcg 15300 tgcgttctct tccttgttag agatgaggcg cgcggtggtg tcttcctctc ctcctccctc 15360 gtacgagagc gtgatggcgc aggcgaccct ggaggttccg tttgtgcctc cgcggtatat 15420 ggctcctacg gagggcagaa acagcattcg ttactcggag ctggctccgc agtacgacac 15480 cactcgcgtg tacttggtgg acaacaagtc ggcggacatc gcttccctga actaccaaaa 15540 cgaccacagc aacttcctga ccacggtggt gcagaacaac gatttcaccc ccgccgaggc 15600 cagcacgcag acgataaatt ttgacgagcg gtcgcggtgg ggcggtgatc tgaagaccat 15660 tctgcacact aacatgccca atgtgaacga gtacatgttc accagcaagt ttaaggcgcg 15720 ggtgatggtg tctaggaagc atccagaggg ggtagttgaa acagatttga gtcaggataa 15780 gcttgaatat gagtggtttg agtttaccct gcccgaggga aacttttccg agaccatgac 15840 catagacctg atgaacaacg ccatcttgga aaactacttg caagtggggc ggcagaatgg 15900 cgtgctggag agcgatatcg gagtcaagtt tgacagcaga aatttcaagc tgggctggga 15960 cccggtgacc aagctggtga tgccaggggt ctacacctac gaggccttcc acccggacgt 16020 ggtgctgctg ccgggctgcg gggtggactt caccgagagc cgcctgagca acctcctggg 16080 cattcgcaag aagcaacctt tccaagaggg cttcagaatc atgtatgagg atctagaagg 16140 tggcaacatc cccgccctcc ttgatgtgcc caagtacttg gaaagcaaga agaaagttga 16200 agacgaaact aaaaatgcag ctgcggccac agccgataca accactaggg gtgatacatt 16260 tgcaactcca gcgcaagaga cagcagctga taagaaggta gaagtcttgc ccattgaaaa 16320 ggatgagagt ggtagaagtt acaacctgat ccaggggacc cacgacacgc tgtaccgcag 16380 ttggtacctg tcctatacct acggggaccc cgagaagggg gtgcagtcgt ggacgctgct 16440 caccaccccg gacgttacct gcggcgcgga gcaagtctac tggtcactgc cggacctcat 16500 gcaagacccc gtcaccttcc gctccaccca gcaagtcagc aactaccccg tggtcggcgc 16560 cgagctcatg cccttccgcg ccaagagctt ttacaacgac ctcgccgtct actcccagct 16620 catccgcagc tacacctccc tcacccacgt cttcaaccgc ttccccgaca accagatcct 16680 ctgccgcccg cccgcgccca ccatcaccac cgtcagtgaa aacgtgcctg ctctcacaga 16740 tcacgggacg ctaccgctgc gcagcagtat ccgcggagtc cagcgagtga ccgtcactga 16800
- 39 037297 cgcccgtcgc cgcacctgtc cctacgtcta caaggccctg ggcatagtcg cgccgcgcgt 16860 gctttccagt cgcaccttct aaaaaaatgt ctattctcat ctcgcccagc aataacaccg 16920 gctggggtct tactagaccc agcaccatgt acggaggagc caagaagcgc tcccagcagc 16980 accccgtccg cgtccgcggc cacttccgcg ctccctgggg cgcttacaag cgcgggcgga 17040 cttccaccgc cgtgcgcacc accgtcgacg acgtcatcga ctcggtggtc gccgacgcgc 17100 gcaactacac tcccgccccc tccaccgtgg acgcggtcat cgacagcgtg gtggccgacg 17160 cgcgcgacta tgccagacgc aagagccggc ggcgacggat cgccaggcgc caccggagca 17220 cgcccgccat gcgcgccgcc cgggctctgc tgcgccgcgc cagacgcacg ggccgccggg 17280 ccatgatgcg agccgcgcgc cgcgctgcca ctgcacccac ccccgcaggc aggactcgca 17340 gacgagcggc cgccgccgcc gctgcggcca tctctagcat gaccagaccc aggcgcggaa 17400 acgtgtactg ggtgcgcgac tccgtcacgg gcgtgcgcgt gcccgtgcgc acccgtcctc 17460 ctcgtccctg atctaatgct tgtgtcctcc cccgcaagcg acgatgtcaa agcgcaaaat 17520 caaggaggag atgctccagg tcgtcgcccc ggagatttac ggaccacccc aggcggacca 17580 gaaaccccgc aaaatcaagc gggttaaaaa aaaggatgag gtggacgagg gggcagtaga 17640 gtttgtgcgc gagttcgctc cgcggcggcg cgtaaattgg aaggggcgca gggtgcagcg 17700 cgtgttgcgg cccggcacgg cggtggtgtt cacgcccggc gagcggtcct cggtcaggag 17760 caagcgtagc tatgacgagg tgtacggcga cgacgacatc ctggaccagg cggcggagcg 17820 ggcgggcgag ttcgcctacg ggaagcggtc gcgcgaagag gagctgatct cgctgccgct 17880 ggacgaaagc aaccccacgc cgagcctgaa gcccgtgacc ctgcagcagg tgctgcccca 17940 ggcggtgctg ctgccgagcc gcggggtcaa gcgcgagggc gagagcatgt acccgaccat 18000 gcagatcatg gtgcccaagc gccggcgcgt ggaggacgtg ctggacaccg tgaaaatgga 18060 tgtggagccc gaggtcaagg tgcgccccat caagcaggtg gcgccgggcc tgggcgtgca 18120 aaccgtggac attcagatcc ccaccgacat ggatgtcgac aaaaaaccct cgaccagcat 18180 cgaggtgcaa accgacccct ggctcccagc ctccaccgct accgtctcca cttctaccgc 18240 cgccacggct accgagcctc ccaggaggcg aagatggggc gccgccagcc ggctgatgcc 18300 caactacgtg ttgcatcctt ccatcatccc gacgccgggc taccgcggca cccggtacta 18360 cgccagccgc cggcgcccag ccagcaaacg ccgccgccgc accgccaccc gccgccgtct 18420 ggcccccgcc cgcgtgcgcc gcgtgaccac gcgccggggc cgctcgctcg ttctgcccac 18480 cgtgcgctac caccccagca tcctttaatt cgtgtgctgt gatactgttg cagagagatg 18540 gctctcactt gccgcctgcg catccccgtc ccgaattacc gaggaagatc ccgccgcagg 18600 agaggcatgg caggcagcgg cctgaaccgc cgccggcggc gggccatgcg caggcgcctg 18660 agtggcggct ttctgcccgc gctcatcccc ataatcgccg cggccattgg cacgatcccg 18720 ggcatagctt ccgttgcgct gcaggcgtcg cagcgccgtt gatgtgcgaa taaagcctct 18780 ttagactctg acacacctgg tcctgtatat ttttagaatg gaagacatca attttgcgtc 18840 cctggctccg cggcacggca cgcggccgtt catgggcacc tggaacgaga tcggcaccag 18900 ccagctgaac gggggcgcct tcaattggag cagtgtctgg agcgggctta aaaatttcgg 18960 ctcgacgctc cggacctatg ggaacaaggc ctggaatagt agcacggggc agttgttaag 19020 ggaaaagctc aaagaccaaa acttccagca gaaggtggtg gacgggctgg cctcgggcat 19080 taacggggtg gtggacatcg cgaaccaggc cgtgcagcgc gagataaaca gccgcctgga 19140 cccgcggccg cccacggtgg tggagatgga agatgcaact cttccgccgc ccaaaggcga 19200 aaagcggccg cggcccgacg cggaggagac gatcctgcag gtggacgagc cgccctcgta 19260 cgaggaggcc gtcaaggccg gcatgcccac cacgcgcatc atcgcgccgc tggccacggg 19320 tgtaatgaaa cccgccaccc ttgacctgcc tccaccaccc gcgcccgctc caccgaaggc 19380 aactccggtt gtgcaggccc ccccggtggc gaccgccgtg cgccgcgtcc ccgcccgccg 19440 ccaggcccag aactggcaga gcacgctgca cagtatcgtg ggcctgggag tgaaaagtct 19500 gaagcgccgc cgatgctatt gagagagagg aaagaggaca ctaaagggag agcttaactt 19560 gtatgtgcct taccgccaga gaacgcgcga agatggccac cccctcgatg atgccgcagt 19620 gggcgtacat gcacatcgcc gggcaggacg cctcggagta cctgagcccg ggtctggtgc 19680 agtttgcccg cgccaccgac acgtacttca gcctgggcaa caagtttagg aaccccacgg 19740 tggccccgac ccacgatgtg accacggacc ggtcccagcg tctgacgctg cgcttcgtgc 19800 ccgtggatcg cgaggacacc acgtactcgt acaaggcgcg cttcactctg gccgtgggcg 19860 acaaccgggt gctagacatg gccagcactt actttgacat ccgcggcgtc ctggaccgcg 19920
- 40 037297 gtcccagctt caaaccctac tcgggcacgg cctacaacag cctggctccc aagggtgccc 19980 ccaatcccag tcagtgggaa acaaaagaaa agcaaggaac tactggagga gtgcagcaag 20040 aaaaagatgt cacaaaaaca tttggtgtgg ctgccaccgg cggaattaat ataacaaacc 20100 agggtctgtt actaggaact gacgaaaccg ctgagaatgg caaaaaagac atttatgcag 20160 acaagacttt ccagccagaa cctcaagttg gagaagaaaa ctggcaggaa aatgaagcct 20220 tctatggagg aagggctctt aaaaaggaca ctaaaatgaa accatgctat ggatcttttg 20280 ctagacctac taatgagaaa ggaggtcagg caaagttcaa accagttaat gaaggagaac 20340 aacctaaaga tctggatata gattttgctt actttgacgt ccctggcgga agtcctccag 20400 caggtggtag tggggaagaa tacaaagcag atataatttt gtacactgaa aatgttaatc 20460 ttgaaacacc agacactcat gtggtttaca agccaggaac ttcagataac agttcagaaa 20520 tcaatctggt tcagcagtcc atgccaaaca gacccaacta cattggcttt agggacaact 20580 ttgtaggtct catgtattac aacagcaccg gaaatatggg tgtgctggct ggtcaggctt 20640 ctcagttgaa cgctgtggtc gacttgcaag acagaaacac cgagttatct taccagctat 20700 tgctagattc tctgggtgac agaaccagat actttagcat gtggaactct gcggtggaca 20760 gttacgatcc agatgtcagg atcattgaaa atcacggtgt ggaagatgaa cttccaaact 20820 attgcttccc attgaatggc actggaacca attccactta tcaaggtgta aagattacaa 20880 atggtaatga tggtgctgaa gaaagtgagt gggagaaaga cgatgcaatt tctagacaaa 20940 accaaatctg caagggcaat gtctacgcca tggagatcaa cctgcaggcc aacctgtgga 21000 agagttttct gtactcgaac gtggccctgt acctgcccga ctcctacaag tacacgccgg 21060 ccaacgtcaa gctgcccgcc aacaccaaca cctacgagta catgaacggc cgcgtggtag 21120 ccccatccct ggtggacgcc tacatcaaca tcggcgcccg ctggtcgttg gaccccatgg 21180 acaacgtcaa ccccttcaac caccaccgca atgcgggcct gcgctaccgc tccatgctgc 21240 tgggcaacgg ccgctacgtg cccttccaca tccaagtgcc ccaaaagttc tttgccatca 21300 agaacctgct cctgctcccg ggctcctaca cctacgagtg gaacttccgc aaggacgtca 21360 acatgatcct gcagagttcc ctcggcaacg acctgcgcgt cgacggcgcc tccgtccgct 21420 tcgacagcgt caacctatac gccactttct tccccatggc gcacaacacc gcttcaacct 21480 tggaagccat gctgcgcaac gacaccaacg accagtcctt caacgactac ctctcggccg 21540 ccaacatgct ctaccccatc ccggccaagg ccaccaacgt gcccatctcc atcccatcgc 21600 gcaactgggc cgccttccgc ggctggagtt tcacccggct caagaccaag gaaactcctt 21660 ccctcggctc gggtttcgac ccctactttg tctactcggg ctccatcccc tacctcgacg 21720 ggaccttcta cctcaaccac accttcaaga aggtctccat catgttcgac tcctcggtca 21780 gctggcccgg caacgaccgg ctgctcacgc cgaacgagtt cgagatcaag cgcagcgtcg 21840 acggggaggg ctacaacgtg gcccaatgca acatgaccaa ggactggttc ctcgtccaga 21900 tgctctccca ctacaacatc ggctaccagg gcttccacgt gcccgagggc tacaaggacc 21960 gcatgtactc cttcttccgc aacttccagc ccatgagcag gcaggtggtc gatgagatca 22020 actacaagga ctacaaggcc gtcaccctgc ccttccagca caataactcg ggcttcaccg 22080 gctacctcgc acccaccatg cgccaggggc agccctaccc cgccaacttc ccctacccgc 22140 tcatcggtca gacagccgtg ccctccgtca cccagaaaaa gttcctctgc gacagggtca 22200 tgtggcgcat cccattctcc agcaacttca tgtccatggg cgccctcacc gacctgggtc 22260 agaacatgct ctacgccaac tcggcccacg cgctcgacat gaccttcgag gtggacccca 22320 tggatgagcc caccctcctc tatcttctct tcgaagtttt cgacgtggtc agagtacacc 22380 agccgcaccg cggcgtcatc gaggccgtct acctgcgcac gcccttctcc gccggcaacg 22440 ccaccaccta agcatgagcg gctccagcga acgagagctc gcggccatcg tgcgcgacct 22500 gggctgcggg ccctactttt tgggcaccca cgacaagcgc ttcccgggct ttctcgccgg 22560 cgacaagctg gcctgcgcca tcgtcaacac ggccggccgc gagaccggag gcgtgcactg 22620 gctcgccttc ggctggaacc cgcgctcgcg cacctgctac atgttcgacc cctttgggtt 22680 ctcggaccgc cggctcaagc agatttacag cttcgagtac gaggccatgc tgcgccgcag 22740 cgccctggcc tcctcgcccg accgctgtct cagcctcgag cagtccactc agaccgtgca 22800 ggggcccgac tccgccgcct gcggactctt ctgttgcatg ttcttgcatg ccttcgtgca 22860 ctggcccgac cgacccatgg acggaaaccc caccatgaac ttgctgacgg gggtgcccaa 22920 cggcatgcta caatcgccac aggtgctgcc caccctcagg cgcaaccagg aggaactcta 22980 ccgcttcctc gcgcgccact ccccttactt tcgctcccac cgcgccgcca tcgaacacgc 23040

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
  2. 2. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
    - 41 037297
  3. 3. Фармацевтическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и E3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
  4. 4. Фармацевтическое средство по пп.1-3, отличающееся тем, что оно находится в жидкой или лиофилизированной форме.
  5. 5. Фармацевтическое средство по п.4, отличающееся тем, что буферный раствор для жидкой формы содержит, мас.%: трис от 0,1831 до 0,3432, хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212, сахароза от 3,7821 до 7,0915, магния хлорида гексагидрат от 0,0154 до 0,0289, ЭДТА от 0,0029 до 0,0054, полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709, этанол 95% от 0,0004 до 0,0007, вода - остальное.
  6. 6. Фармацевтическое средство по п.4, отличающееся тем, что буферный раствор для лиофилизированной формы содержит, мас.%: трис от 0,0180 до 0,0338, хлорид натрия от 0,1044 до 0,1957, сахароза от 5,4688 до 10,2539, магния хлорида гексагидрат от 0,0015 до 0,0028, ЭДТА от 0,0003 до 0,0005, полисорбат-80 от 0,0037 до 0,0070, вода - остальное.
  7. 7. Фармацевтическое средство по пп.1-3, отличающееся тем, что компонент 1 и компонент 2 находятся в разных упаковках.
  8. 8. Применение фармацевтического средства по пп.1, 2 или 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
EA202000370A 2020-08-22 2020-11-09 Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 (варианты) EA037297B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020127980A RU2731342C9 (ru) 2020-08-22 2020-08-22 Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
PCT/RU2020/000591 WO2021076010A1 (en) 2020-08-22 2020-11-09 Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2

Publications (4)

Publication Number Publication Date
EA202000370A1 EA202000370A1 (ru) 2021-03-02
EA037297B1 true EA037297B1 (ru) 2021-03-05
EA037297B8 EA037297B8 (ru) 2021-04-26
EA037297B9 EA037297B9 (ru) 2021-11-24

Family

ID=75262227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202000370A EA037297B9 (ru) 2020-08-22 2020-11-09 Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 (варианты)

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220226466A1 (ru)
EP (1) EP4003414A4 (ru)
JP (1) JP7360544B2 (ru)
KR (1) KR20230092820A (ru)
CN (1) CN114728055A (ru)
BR (1) BR112022003611A2 (ru)
CA (1) CA3152662A1 (ru)
EA (1) EA037297B9 (ru)
IL (1) IL291025A (ru)
MX (1) MX2022002611A (ru)
ZA (1) ZA202202321B (ru)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012740A2 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Duke University ADENOVIRUSES DELETED IN THE IVa2, 100K AND/OR PRETERMINAL PROTEIN SEQUENCES
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
WO2010037027A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines
US20190134178A1 (en) * 2011-03-21 2019-05-09 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunogenic-therapeutic
KR102050616B1 (ko) * 2012-03-22 2019-12-03 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007104792A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
WO2021163536A2 (en) * 2020-02-14 2021-08-19 Altimmune, Inc. Coronavirus immunogenic compositions and uses thereof
RU2720614C9 (ru) * 2020-04-23 2021-02-09 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
WO2000012740A2 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Duke University ADENOVIRUSES DELETED IN THE IVa2, 100K AND/OR PRETERMINAL PROTEIN SEQUENCES
WO2010037027A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines
US20190134178A1 (en) * 2011-03-21 2019-05-09 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunogenic-therapeutic
KR102050616B1 (ko) * 2012-03-22 2019-12-03 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신

Also Published As

Publication number Publication date
EA037297B8 (ru) 2021-04-26
KR20230092820A (ko) 2023-06-26
CN114728055A (zh) 2022-07-08
EA202000370A1 (ru) 2021-03-02
MX2022002611A (es) 2022-06-17
JP2023502833A (ja) 2023-01-26
US20220226466A1 (en) 2022-07-21
CA3152662A1 (en) 2021-04-22
EP4003414A1 (en) 2022-06-01
IL291025A (en) 2022-05-01
ZA202202321B (en) 2023-11-29
BR112022003611A2 (pt) 2022-07-26
EP4003414A4 (en) 2023-05-10
JP7360544B2 (ja) 2023-10-12
EA037297B9 (ru) 2021-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2731342C9 (ru) Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
WO2018215766A1 (en) Compositions and methods for inducing an immune response
CN115052624A (zh) 用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的免疫生物剂
US20240123053A1 (en) Coronavirus vaccine through nasal immunization
RU2731356C1 (ru) Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
KR20220115554A (ko) 액체 형태의 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 제제(변이체)
CA2518926A1 (en) Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
CA2519207A1 (en) Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
CN117551677A (zh) 一种以5型腺病毒为载体的猴痘病毒特异性融合蛋白疫苗
RU2743962C1 (ru) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме (варианты)
EA037297B1 (ru) Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 (варианты)
RU2761904C1 (ru) Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
RU2744444C1 (ru) Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 для ревакцинации населения (варианты)
RU2744442C1 (ru) Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у лиц старше 60 лет и/или имеющих хронические заболевания (варианты)
CN116528895A (zh) 用于在儿童中诱导针对sars-cov-2的特异性免疫的药剂的用途
JP2021523185A (ja) アレルゲンを含む改善されたｌａｍｐ構築物
CN115160413B (zh) 一种新型冠状病毒疫苗
US20220265816A1 (en) Use of the agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 for revaccination of population (variants)
KR20230175091A (ko) 60세 이상 및/또는 만성 질환을 가진 대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 sars-cov-2에 대한 특이 면역을 유도하기 위한 제제(변형체)의 용도
US20230087396A1 (en) Conjugate polypeptides and vaccines for inducing immune responses
CN114828878A (zh) 用于癌症治疗的载体
CN116761811A (zh) 用于诱导免疫应答的缀合多肽和疫苗
EA043163B1 (ru) Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 для ревакцинации населения (варианты)
CN117165538A (zh) 一种水痘带状疱疹病毒疫苗及其应用
Maguire Analysis of targeting approaches intended to enhance the immunogenicity of adenovirally-vectored vaccine antigens

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent