CN114828878A - 用于癌症治疗的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种腺病毒载体或腺相关病毒载体，其包含编码单个癌症特异性CD8+T细胞表位的核苷酸序列，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+T细胞应答，其中所述载体不包含编码另外的癌症特异性T细胞表位的核酸。本发明还涉及所述载体的方法和用途。

Description

用于癌症治疗的载体
发明领域
本发明涉及能够引发膨胀记忆CD8+ T细胞应答的载体。这些引发膨胀记忆CD8+ T细胞应答的载体适用于治疗癌症。本发明还涉及制备载体的方法和诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答的方法。
背景技术
旨在激活CD8 T细胞免疫力的抗癌策略已显示出显著的疗效。针对慢性感染的良好CD8 T细胞应答的要求与针对癌症的良好CD8T细胞应答的要求之间存在相当大的重叠——它们必须是持久的、功能性的、持续的并且能够归巢到正确的部位，以及能够抵抗由于长时间的TCR刺激而导致的衰竭。
基于表位的癌症疫苗是一种已用于激活T细胞对特定肿瘤相关抗原应答的策略。最初，使用了基于肽的单个表位疫苗，但是因为这些疫苗不能充分激活先天免疫系统，所以它们提供了较差的临床应答。为了增强免疫激活，开发了多肽疫苗，其中多个表位一起施用。
这种施用多个表位的方法也已使用腺病毒载体进行。通过使用能够编码大型转基因的腺病毒载体，可以编码多个表位并将其作为多联体递送(Bei和Scardino.,J BiomedBiotechnol 2010；2010:102758)。可替代地，可以编码和递送全长抗原。然而，仍然需要改善针对癌细胞的免疫激活。
发明内容
本发明源于出人意料的发现：编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的载体(本文称为小基因载体)可以诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答。记忆膨胀描述了稳定的、扩增的CD8+ T细胞记忆池的纵向发展，其中所述细胞具有不同的表型和功能。这种膨胀记忆应答导致长期存在的表位特异性T细胞池，即使在感染的急性期之后仍保持丰度和功能(Klernerman.,Immunol Rev 2018 283(1):99-11)。据信，膨胀记忆细胞的特征可以导致增强的抗肿瘤应答。
本发明人开发了一种基于复制缺陷型AdHu5腺病毒载体骨架的疫苗平台，所述骨架中仅插入了感兴趣的CD8+ T细胞表位。以这种方式，绕过了抗原加工要求，这允许针对在其他情况下非膨胀的表位产生膨胀的应答。本文已经证明，载体的单次引发注射导致大表位特异性CD8+ T细胞应答，其中T细胞呈现膨胀记忆表型。出人意料的是，所产生的应答是长期存在的，在预防性免疫接种实验中甚至在免疫接种后>50-90天，以及在已经患有肿瘤的小鼠中施用时，它们都能够控制肿瘤。这些应答可长期检测到，PD-1低，检查点抑制剂Lag-3和Tim-3也低。相比之下，编码全长蛋白抗原的载体的施用不会导致相同幅度或相同表型的CD8+ T细胞应答。
由于去除了一个或多个病毒基因，腺病毒载体通常具有大型转基因包装能力的优势。因此，使用腺病毒载体的基于表位的疫苗的先前方法已将多个T细胞表位编码为多联体。然而，本方法已经发现，可以通过包含约70bp的相对较小的插入物和最少的增强子元件的腺病毒载体(在本文中称为小基因载体)产生长而持久的免疫应答。出人意料的是，已显示短核酸序列在体内转录并成功呈现在MHC分子上，从而产生肽特异性CD8+ T细胞。
此外，小基因产生的CD8+ T细胞应答的幅度和持久性在递送后的后期(超过50天)比以前在使用含有多个CD8+ T细胞表位的腺病毒载体诱导的应答中观察到的幅度和持久性要高得多。通过提供编码短表位肽序列的腺病毒或腺相关病毒，认为编码的肽绕过了在MHC分子上呈递的正常抗原加工要求。这导致更容易预测、更可靠、更广泛，以及更稳健和更有效的T细胞应答。
与传统的基于肽的疫苗和DNA疫苗相比，这些小基因载体具有许多优势。首先，腺病毒载体小基因能够在感染的细胞内诱导适当的引发性应答(共刺激)。这导致产生有效的抗原特异性CD8+ T细胞应答。除非与佐剂组合，否则DNA和肽疫苗不能诱导引发性应答。其次，腺病毒载体小基因能够持续感染细胞。这种特性可以使载体作为抗原的长期来源，从而保持抗原特异性T细胞池的大小。第三，肽和DNA疫苗不能产生长期存在的抗原特异性CD8+T细胞应答，除非以多种初免加强给药方案给予并且通常与佐剂组合。相比之下，通过单次注射小基因产生长期存在的抗原特异性CD8+ T细胞的大池。这些长期存在的肿瘤特异性CD8+ T细胞应答存在于血液中，因此存在于全身。因此，它们可能在抑制原发性肿瘤控制后的微转移中发挥重要作用。最后，由于载体和编码序列的简单性，腺病毒载体小基因还具有易于设计和生产的优点。
因此，本发明涉及一种包含编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列的腺病毒载体，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答。
在一个实施方案中，本发明涉及一种腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位的核苷酸序列的，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答。在一个实施方案中，载体能够诱导CD8+ T细胞的产生，所述CD8+ T细胞的特征在于选自包含CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-的组中的标志物。在一个实施方案中，载体能够诱导CD8+ T细胞的产生，所述CD8+ T细胞的特征在于选自包含CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-、CD27-(低)、CD127-(低)的组中的标志物。在一个实施方案中，编码癌症特异性CD8+或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列包含12至45个核苷酸碱基对。在一个实施方案中，编码癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列包含24至45个核苷酸碱基对。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位源自肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+T细胞表位在癌细胞中发生突变。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位在癌细胞中过表达。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位源自选自以下的肿瘤相关抗原：TRP-1、CEA、TAG-72、9D7、Ep-CAM、EphA3、端粒酶、间皮素、SAP-1Melan-A/MART-1、酪氨酸酶、CLPP、细胞周期蛋白-A1、细胞周期蛋白-B1 MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAGE1b/GAGED2a、CD45、磷脂酰肌醇聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、lengsin、meloe、MUC5AC、存活素、PRAME、SSX-2、NY-ESO-1/LAGE1、gp70、MC1R、TRP-1/-2、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、胎儿蛋白SIM1。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+或CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO:1(SPSYVYHQF)或SEQ ID NO:2(SLLMWITQC)。在一个实施方案中,癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位对以下疾病具有特异性：结直肠癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、上皮癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、爱泼斯坦巴尔驱动的癌症、人乳头瘤病毒驱动的癌症和软组织肉瘤。在一个实施方案中，载体是人血清型5(AdHu5)。在一个实施方案中，载体包含CMV启动子。在一个实施方案中，载体包含TATA盒。在一个实施方案中，载体缺乏E1和E3蛋白。在一个实施方案中，载体不包含任何编码癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的另外核苷酸序列。因此，载体具有编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位的核苷酸序列，并且可以包含所述核酸转录所必需的其他载体元件，但它不包括编码不是CD8+ T细胞表位(例如CD4+ T细胞表位)的癌症特异性表位的核酸序列。此外，它不包括多于一种癌症特异性CD8+或CD4+ T细胞表位。因此，排除了载体中存在多个抗癌T细胞表位。这不包括相同抗癌T细胞表位的多个拷贝或不同抗癌T细胞表位的拷贝。载体不具有多联体，多联体是长的连续DNA分子，其中包含相同癌症特异性T细胞表位的串联连接的多个拷贝。
在一个方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的载体。
在一个方面，本发明涉及一种免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、多达20、30、40或50个本发明的载体。
在一个方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含本发明的载体或本发明的免疫原性组合物。
在一个方面，本发明涉及本发明的载体或组合物，用于疗法中。
在一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的载体或组合物。
在一个方面，本发明涉及一种诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答的方法，其包括以下步骤：向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的载体或组合物，其中CD8+ T细胞的特征在于选自包括CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+和CD62L-的组中的标志物。
在一个方面，本发明涉及一种生产上述载体的方法，其包括以下步骤；
i)合成编码表位的核酸序列，作为有义和反义引物，
ii)将编码表位序列的核酸序列克隆到第一质粒中，
iii)将包含编码表位的核酸序列的序列克隆到包含腺病毒DNA的第二质粒中。
在一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的载体、一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂，以及任选的使用说明。
在一个方面，本发明涉及一种在动物中诱导针对癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的T细胞免疫应答的方法，所述方法包括使细胞与本发明的载体或组合物接触。
附图说明
图1.用编码AH1 CD8+ T细胞肿瘤表位的AdHu5复制缺陷型载体对Balb/c小鼠进行免疫接种可刺激外周持久的CD8+ T应答。(A)用于生产表达MHC-1结合CT26特异性癌症表位的AdHu5载体的构建体的示意图。(B)显示来自接种AH1(左)和Ad-I8V(右)的小鼠血液中的％CD8+AH1四聚体+(tet+)细胞的FAC图。(C)来自两个独立实验的第7天(左)和第50天(右)血液中的AH1-四聚体特异性CD8+ T细胞应答。(D)显示来自同一样品的血液中的CD8+AH1-tet+(左)和AH1-tet-(右)群体中存在指示标记物的FACS图。(E)来自两个独立实验的第7天(左)和第50天(右)的AH1-tet+CD8+T细胞与来自同一组的AH1-tet-CD8+ T细胞的表型比较。Geo MFI＝几何平均荧光强度。
图2.在用Ad-AH1进行预防性接种和治疗性接种后，记忆膨胀性AH1特异性T细胞在Balb/c小鼠中展示出对CT26肿瘤生长的抑制。(A)预防性接种(独立进行两次，P1和P2)和治疗性接种(T1)的实验设置。星号表示存在可触及的肿瘤。(B-D)在预防性(P1和P2)(B和C)和治疗性接种设置(T1)(D)中不同组(N＝5/组)的肿瘤生长曲线。在T1中，箭头表示接种的时间点。用Ad-AH1(1×108IU)接种的小鼠显示为绿色，用Ad-A H 1低(1×107IU)接种的小鼠显示为橙色，用Ad-AH1(1×108IU)+Ad-GSW11(1×108IU)接种的小鼠显示为红色，用Ad-GSW11(1×108IU)接种的小鼠显示为淡紫色，用Ad-I8V(1×108IU)接种的小鼠显示为灰色，初试空白小鼠显示为黑色。TF＝无肿瘤。(E、G、L)激发后第18天组间肿瘤大小的统计学显著差异。点表示单个小鼠。(F、H、J)图表显示肿瘤生长曲线的斜率，由从肿瘤显示明显肿瘤生长的当天(对照组激发后第7天，接种Ad-AH1的小鼠激发后第18天)的线性回归确定。(K)重新计算肿瘤生长速率以确定比生长速率。使用以下公式计算的比生长速率参数(SGR，％/天)量化植入和人道终点之间的肿瘤生长速率：[15]SGR＝ln(V2/V1)/(t2–t1)，其中V1和V2分别是植入后一天(V1固定在0.01mm)(t1＝第0天)和终点(t2)的肿瘤体积。
图3.肿瘤和脾之间的AH1特异性CD8+ T细胞在丰度和表型方面都不同。(A)显示来自接种Ad-AH1的小鼠的肿瘤(上子图)和脾(下子图)中的％CD8+AH1-tet+细胞的代表性FACS图。对于阴性对照，用全范围的荧光染料缀合抗体对肿瘤和脾样品染色，针对肿瘤样品使用无关的H2-Ld结合四聚体(pp89)或针对脾样品，没有四聚体(无tet)。(B)图表显示来自预防性(左子图)和治疗性(右子图)接种的小鼠的肿瘤(上子图)和脾(下子图)中的％CD8+
AH1-tet+细胞。(C)热图显示来自预防性接种的小鼠(Ad-AH1)和对照小鼠(Ad-I8V和初试空白小鼠)的肿瘤和脾中AH1特异性CD8+ T细胞的表型。单元格中的值表示两次独立实验的平均值(N＝5-10)。由几何MFI量化的标志物已归一化为0–100％标度。
图4.(A)在接种Ad-AH1的小鼠的肿瘤中，与对照小鼠相比，在预防性接种(左)和治疗性接种(右)后，调节性T细胞(CD4+FoxP3+细胞)的存在看起来更低。来自接种Ad-AH1和Ad-AH1+Ad-GSW11的小鼠的数据同样分组为接种Ad-I8V的小鼠和初试空白小鼠(分别由经接种的和对照表示)。(B)AdHu5-AH1-MG免疫接种增加肿瘤中Trm tet+细胞的百分比。与对照小鼠(初试空白或用无关AdHu5构建体免疫接种(AdHu5-I8V-MG或AdHu5-GSW11))相比，用AdHu5-AH1-MG单独或组合免疫接种的小鼠显示出肿瘤(TIL)中具有驻留记忆表型的增加的AH-1特异性CD8 T细胞百分比。
图5.AdHu5-AH1-MG免疫接种诱导脾中的AH-1+CD8 T细胞，这些细胞在肿瘤生长期间保持功能。用AH-1肽刺激脾细胞和TIL，以根据IFN-γ分泌测量它们的细胞毒性潜力。来自免疫接种动物的AH-1-肽特异性脾细胞能够对肽刺激作出应答(A和B)。相反，TIL中的CD8T细胞对肽刺激没有应答(C和D)；然而，应答于PMA-离子霉素分泌的IFN-g水平也低，表明肿瘤中CD8 T细胞下调的一般状态。
图6.(A)图中显示了每只动物的肿瘤生长曲线斜率(用点表示)与其血液(左)、脾(中)中CD8+AH-1特异性T细胞的百分比和肿瘤中CD8+AH1 tet+细胞的绝对数量(右)之间的关系。显示了两个独立的预防性实验(P1和P2)和单一治疗性实验(T1)的数据。较低的肿瘤生长速率与肿瘤激发后脾和血液中AH1特异性CD8+T细胞水平的增加相关，但与肿瘤中AH-1特异性CD8 T细胞的绝对数量相关性较弱。(B)显示了来自不同区室的抗原特异性细胞与比生长速率的比较。
图7.(A)使用编码全长gp90的AdHu5载体(AdHu5-gp90FL)进行治疗性免疫接种不提供相似水平的肿瘤控制。使用Mann Whitney检验比较每组中肿瘤的比生长速率。*p<0.05，**p<0.005(B)通过治疗性和预防性免疫接种清除肿瘤的小鼠继续在循环中携带AH-1特异性细胞。对6个月前完全清除肿瘤的小鼠的血液进行取样，并通过四聚体染色对AH1+CD8 T细胞进行染色。
图8.用AdHu5-NY-ESO-1157-165小基因构建体免疫接种的HHD小鼠产生了具有膨胀记忆表型的NY-ESO-1157-165Tet+CD8 T细胞的长期存在循环群体。(A)用1x 1108IU AdHu5-NY-ESO-1小基因或1x109I.U AdHu5-NY-ESO-1-FL免疫接种HHD小鼠组(N＝4-5/组)后，通过四聚体染色测量血液中的NY-ESO-1157-165Tet+细胞的水平。显示了所用构建体的示意图。通过用(B)CD44和CD62L进行表面染色对这些细胞进行表型分析，以确定记忆亚群、膨胀细胞标志物(C)CX3CR1和(D)KLRG-1以及衰竭标志物、(E)PD-1、(F)Tim3(G)Lag-3。显示的结果来自2个独立实验之一的4-5只小鼠/组。
图9.用单剂量AdHu5-NY-ESO-1157-165小基因初免的小鼠在肿瘤激发后产生更高百分比的循环NY-ESO-1157-165Tet+CD8 T细胞，并表现出对肿瘤生长的更好控制。(A)在用1x1108IU AdHu5-NY-ESO-1小基因1x 109I.U.AdHu5-NY-ESO-1-FL免疫接种后53天(实线)或99天(虚线)，向动物皮下注射(s.c)1x 106(实线)或5x 105(虚线)HHD-NY-ESO-1肉瘤细胞。作为阴性对照，用1x 108I.U的无关AdHu5-小基因构建体(N＝5)免疫接种小鼠组，或者保持初试空白(N＝10)。使用数字卡尺每1-2天测量肿瘤。(B)NY-ESO-1157-165Tet+细胞的循环水平通过在肿瘤激发后14天采集的血液中进行四聚体染色来测量。(C)示出了肿瘤激发前血液中检测到的NY-ESO-1157-165Tet+水平相比于早期(第14天)以及和(D)晚期(第27/28天)测量的肿瘤大小。通过T检验进行统计测量。显示的数据来自两个分开的独立实验。
图10.来自肿瘤(TIL)的NY-ESO-1157-165Tet+CD8 T细胞显示出衰竭和激活的标志物水平升高。在达到人道终点时(无论是通过未愈合的溃疡还是当它们的大小接近1300mm3时)处死小鼠，取出脾和肿瘤并进行分析。从两个区室分离出淋巴细胞，并且(A)测量CD8T细胞的百分比。(B)还确定了NY-ESO-1157-165Tet+细胞的百分比，以及确定了衰竭标志物(C)PD-1、(D)Tim-3和(E)Lag-3和凋亡标志物(F)FasL的水平。
图11.在AdHu5-NY-ESO-1157-165小基因免疫接种后，CX3CR1在脾和TIL中的NY-ESO-1157-165Tet+CD8 T细胞上优先上调。当达到人道终点时，将从TIL或脾中分离出的淋巴细胞用四聚体染色，并测定Tet+细胞上的以下分子的水平。(A)脾和(B)TIL上的膨胀标志物CX3CR1。(C)效应记忆表型标志物，CD44和CD62L和(D)驻留记忆标志物CD103和CD69。(E)两个区室中CD4+调节性T细胞(Treg)的水平也通过细胞内染色确定。
图12.CX3CR1+CD8 T细胞对氧化应激更具抵抗力，并且含有更高水平的健康极化线粒体。(A)通过CellROX Red测定法检测经Ad-lacZ或MCMV感染的小鼠感染后>50天的CX3CR1+/-gfp脾细胞中的细胞内活性氧(ROS)水平(N＝2个独立实验)。(B)将来自先前用MCMV或AdHu5重组腺病毒载体(Ad-I8V)感染>100天的C57BL/6小鼠的外周血淋巴细胞用MitoTracker绿(检测所有线粒体)和MitoTracker深红(检测仅健康的极化线粒体)染色，然后用抗小鼠CD8、抗小鼠CX3CR1、活死近红外可固定标志物进行表面染色，然后在LSRII上进行分析并在FlowJo上计算数据。抗原特异性CX3CR1+膨胀细胞含有更健康的线粒体，并显示出增强的氧化还原恢复力。(D)和(E)表明，当在无血清培养基(即应激)中孵育时，与整体CX3CR1阴性T细胞(图D)和抗原特异性群体(图E)相比，CX3CR1+群体的存活显著。(F)显示血清饥饿后的活性氧(ROS)水平，表明CX3CR1+ T细胞(整体和抗原特异性)内在地具有较低水平的活性氧，并且对氧化应激更具抵抗力。
图13.使用HPV16 E749-57小基因载体进行预防性免疫接种提供针对肿瘤激发的保护。E749-57特异性细胞能够运输到肿瘤植入部位并提供针对肿瘤激发的保护。
图14.用编码针对MCMV的CD8 T细胞表位的一组小基因以次优剂量免疫接种后的协同效应。构建了一组针对已知MCMV特异性CD8 T细胞表位(即M45(985HGIRNASFI993)、M38(316SSPPMFRV325)和m139(419TWYGFCLL426)的3个小基因。将这些作为单独的小基因或混合物静脉内注射进入C57BL/6小鼠。编码M38和M139的小基因以1x 107感染单位(I.U)的次优剂量注射，而编码M45的小基因以1x 108I.U的最优剂量注射。测量免疫接种后第6天血液中M38特异性细胞的水平。出人意料的是，与仅注射次优剂量的M38-小基因载体的组相比，接受含有次优剂量的M38-小基因和m139-小基因载体以及最优剂量的M45-小基因的组合小基因疫苗的小鼠产生了更高水平的M38特异性T细胞。这一出乎意料的结果表明，与单独使用单一载体进行免疫接种后观察到的相比，以次优剂量的小基因载体的混合物的递送可具有提高抗原特异性T细胞数量的附加效应。
图15.来自AdHu5-AH1-MG免疫接种小鼠的肿瘤的CD8 T细胞表达更高水平的颗粒酶B。图15A显示了植入后23天、免疫接种后16天的肿瘤中总CD8 T细胞中颗粒酶B的水平和分析时的肿瘤大小。图15B显示了植入后23天、免疫接种后16天的肿瘤中AH1特异性CD8 T细胞中转录因子T-bet和Eomes的水平。
图16.测试与抗PD-L1组合的作为治疗性疫苗的GP70423-431(AH1)小基因。图16A显示了在肿瘤激发后7天用指定的腺病毒载体免疫的小鼠组之后用抗PD-L1或同种型对照治疗。显示了个体小鼠的肿瘤大小。图16B显示了所有小鼠组的存活曲线。图16C显示了免疫接种后15天(肿瘤激发后22天)循环中GP70423-431(AH1)Tet+细胞的百分比。图16D显示了使用Mann-Whitney检验比较了每组中肿瘤的比生长速率。*p<0.05，**p<0.005
图17.17A、B、C、D，将来自预防性接种(A、C)或治疗性接种(B、D)的源自脾和肿瘤的单细胞用AH1-肽(4μg/ml)或PMA-离子霉素(IO)离体刺激7小时，然后针对IFNγ的细胞内细胞因子产生进行染色。对于每个样品，减去低水平的背景激活(仅限培养基)。17E-H，将来自治疗性接种与抗PD-L1组合的源自脾和肿瘤的单细胞用AH1-肽(4μg/ml)或PMA-离子霉素(IO)离体刺激7小时，然后针对IFNγ的细胞内细胞因子产生进行染色。对于每个样品，减去低水平的背景激活(仅限培养基)。显示了脾(17E)和肿瘤(17G)中的CD8 T细胞应答以及脾(17F)和肿瘤(17H)中的CD4 T细胞应答。
图18.确定编码两种肿瘤抗原的两种小基因是否会改善肿瘤控制的探索性实验。A显示使用的方案——在第0天进行肿瘤植入，第7天接种AdHu5-AH1小基因(MG)、AdHu5-e2F8-27mer MG、组合(MG-AdHu5-AH1和AdHu5-e2F8-27mer两者)、无关AdHu5-MG中之一，未接种，N＝6/治疗组。在植入后12、16和19天，每组一半用检查点抑制剂抗PD-1治疗，一半用同种型对照治疗。在第13天和第20天采血。图18B、C、D、E和F显示了肿瘤随时间的生长。
图19.显示了小基因治疗加抗PD-1组合与阴性对照和接种单一小基因的比较。
图20.通过线性回归计算组合小基因治疗、单一小基因治疗和阴性对照的肿瘤生长速率。
图21.接种后6天测量由组合小基因治疗接种和单一小基因AdHu5-AH1和AdHu5-e2F8-27mer接种产生的％CD8+AH1-tet+细胞和％CD8+ef28-tet+细胞。
图22.用两种小基因构建体/疫苗(组合AdHu5-AH1和AdHu5-e2F8)同时静脉内免疫接种诱导与接种后11天测量到的单一疫苗相似数量和表型的两种抗原特异性群体。
图23.显示用两种靶向癌细胞中CD8 T细胞表位(AdHu5-AH1和AdHu5-e2F8)的小基因进行免疫接种控制肿瘤生长。图20中的线性回归数据已重新计算为比生长速率。
图24.非常规记忆T细胞亚群——膨胀记忆T细胞的转录分析。(A)膨胀/非膨胀CD8T细胞的PCA。3D PCA显示在急性期(第7天或第21天)和后期(第50天或第100天)，膨胀样品(M38、D8V——后期阶段，即膨胀记忆，以蓝色圈出)和非膨胀样品(M45、I8V——后期阶段，即中央记忆，以棕色圈出)的两个独立模型和初始空白样品的转录谱分布。(B)衰竭/非衰竭的CD8 T细胞的PCA。3D PCA显示不同阶段的衰竭样品模型(Cl13，四面体——第30天用灰色圈出)与非衰竭样品模型(臂(Arm)，球体——第30天用蓝色圈出)和初始空白样品的转录谱分布。阶段：6天(黄色)、8天(棕色)、15天(粉色)、30天(黑色)、初始空白(绿色)。
图25.与其他T细胞记忆亚群相比，膨胀记忆亚群表达不同的基因模块。(A)膨胀样品的加权基因共表达网络分析。基因共表达网络分析检测到6个基因模块(合并距离＝0.25，软阈值β＝9)；蓝色模块(突出显示)基因富含免疫相关GO类别，并包含诸如Tbx21、Eomes、Zeb2和E2f2的相关基因。(B)基于蓝色模块基因的膨胀/衰竭样品的PCA。PCA图使用前三个主成分并基于588个基因的基因组，仅在膨胀样品的基因共表达网络分析中检测为蓝色模块。该图显示了初始空白(绿色)、非膨胀和非衰竭(蓝色)以及膨胀和衰竭(红色)样品的分布(球体：衰竭研究；四面体：膨胀研究)(膨胀记忆群体是蓝色圈中的红色四面体)。(C)基于蓝色模块基因的膨胀/衰竭样品的层次聚簇。显示在膨胀-衰竭合并集上的样品聚簇分析(欧几里得距离)的树状图，基于469个基因的基因集，在去除异常值后在膨胀样品的重复基因共表达网络分析中检测为蓝色模块(软阈值β＝20)。记忆膨胀簇包含在矩形中。
图26.(A)显示带有小基因免疫原盒的AdHu5腺病毒的示意图和小基因免疫原盒的特写视图。(B)显示带有小基因免疫原盒的AAV ITR的示意图和小基因免疫原盒的特写视图。
具体实施方式
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确相反地指出，否则如此定义的每个方面可以与其他一个或多个方面组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的特征的任何其他一个或多个特征组合。除非另有说明，否则本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术均在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释，参见例如Green和Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)。
本发明基于出人意料的发现，即编码单个癌症特异性表位的腺病毒载体导致膨胀记忆CD8+ T细胞应答。膨胀记忆应答这一术语是指持续的、功能性的、持久的CD8+ T细胞应答。由此产生的CD8+ T细胞池能够抵抗由于长时间TCR刺激而可能发生的衰竭。T细胞衰竭可以通过PD-1、Tim-3和Lag-3等标志物的上调来表征。
与其他CD8+记忆亚群相比，膨胀记忆CD8+ T细胞的特征在于独特的表型，包括标志物CX3CR1和KLRG-1的表达。这些细胞还表现出与中央记忆T细胞亚群和衰竭的记忆T细胞亚群两者不同的转录谱。这些细胞还表现出诸如增强的氧化还原恢复力的特征，这可能是由于内在较低水平的活性氧和对氧化应激的恢复力。特别地，转录谱由转录因子Tbx21驱动，而Eomes的贡献最小。这导致长期存在的CD8+ T细胞表型，并且大量存在于外周器官中，同时保留效应物功能。抗原特异性的膨胀记忆CD8+ T细胞通过一组独特的加工、呈递和共刺激条件发育。表位的加工独立于免疫蛋白酶体而发生，在后期由非造血非常规APC呈递可能有助于保持这种表型。不希望受理论的束缚，认为通过使用编码单个感兴趣的表位的本发明的载体，绕过了抗原加工要求，从而导致膨胀记忆应答。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列的腺病毒载体，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答。在一个实施方案中，腺病毒载体包含编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位(例如，单个癌症特异性CD8+ T细胞表位)的核苷酸序列，并且载体不包含任何另外的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。因此，本发明的载体编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位，例如单个癌症特异性CD8+ T细胞表位。本发明不延伸至编码多于一个或多个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的腺病毒载体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码单个癌症特异性CD8+T细胞表位的核苷酸序列的腺病毒载体，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答。在一个实施方案中，腺病毒载体包含编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位的核苷酸序列，并且载体不包含任何另外的癌症特异性CD8+ T细胞表位。因此，本发明的腺病毒载体编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位。本发明不延伸至编码多于一个或多个癌症特异性CD8+ T细胞表位的腺病毒载体。
编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位的本发明的载体能够从单次剂量产生持续的、功能性的、持久的CD8+ T细胞应答。由此产生的CD8+ T细胞池能够抵抗由于长时间TCR刺激而可能发生的衰竭。由此产生的CD8+ T细胞池也可以表现出增强的氧化还原恢复力和低水平的活性氧。
如本文所用，术语“载体”是指能够将与载体序列连接的另一种核酸转运到细胞中的核酸序列。本发明的载体是腺病毒的并且包含编码单个癌症特异性CD8+或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有适合由细胞表达的形式的基因构建体(例如，连接到转录控制元件)。
如本文所用，术语“表位”是指被免疫系统识别的抗原的一部分，其可以是短蛋白质序列。“癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位”是指可以由与MHC分子结合的抗原呈递细胞呈递然后被T细胞受体(TCR)识别的表位。CD4+ T细胞表达CD4辅助受体，其与MHC II结合并识别MHC II分子呈递的肽。CD8+ T细胞表达CD8辅助受体，其与MHC I结合并识别MHC I分子呈递的肽。
膨胀记忆T细胞可以通过特定标志物和细胞表面标志物的存在来表征。鉴定和量化这些标志物的方法是本领域众所周知的。合适方法的实例包括但不限于基于亲和力的分离方法、磁性细胞分选技术、基于荧光的细胞分选技术，例如FACS(荧光激活细胞分选术)。膨胀记忆CD8+ T细胞可以通过许多标志物的存在来表征，所述标志物的实例包括但不限于CX3CR1、KLRG-1、CD44。膨胀记忆CD8+ T细胞还可以通过许多标志物的低表达来表征，所述标志物的实例包括但不限于CD62L、CD27、CD127。术语“低表达”可以指存在标志物不表达的细胞，也可以指相对于样品中的其他细胞存在标志物低表达的细胞。
在一个实施方案中，膨胀记忆CD8+ T细胞的特征在于选自包括CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-的组中的标志物，其中标志(+)表示标志物的存在，并且标志(-)表示标志物低表达或不表达。其中(-)表示低表达，这可以进一步用“(低)”表示。膨胀记忆CD8+ T细胞的特征可以在于选自包括CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-、CD27-(低)、CD127-(低)的组中的标志物。
膨胀记忆CD8+ T细胞的特征可以在于表型CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-。膨胀记忆CD8+ T细胞的特征可以在于表型CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-、CD27-(低)、CD127-(低)。
在膨胀记忆应答中产生的CD8+ T细胞可以具有许多其他特征。例如，细胞包含由Tbx21(也称为T-bet)驱动的转录谱。这些细胞显示出Tbx21的持续表达。这些细胞还可以表现出E2f2的持续表达，E2f2是通常参与细胞生长和增殖的转录因子。这些细胞也可以缺乏转录因子Eomes的表达或具有转录因子Eomes的低表达。
在暴露于抗原后，膨胀记忆CD8+ T细胞可以不表现出典型的收缩。在暴露于抗原后的典型记忆进化过程中，细胞形成收缩的中央记忆池，占总循环CD8+ T细胞的<1％。然而，膨胀记忆细胞被维持为在血液中循环的大细胞池。因此，在一个实施方案中，所得的膨胀记忆CD8+ T细胞形成总CD8+ T细胞的约2％至约20％，优选地为总CD8+ T细胞的约8％至约20％，更优选地为总CD8+ T细胞的约12％至约20％。
在一个实施方案中，膨胀记忆CD8+ T细胞的大池保留了它们的效应记忆表型。所得的膨胀记忆CD8+ T细胞可长时间保留其记忆效应物表型，其中效应物表型的特征在于CD44+、CD62L-。膨胀记忆CD8+ T细胞在暴露于本发明的载体后可以保留其记忆效应物表型长达60天、暴露于本发明的载体后保留其记忆效应物表型长达55天、暴露于本发明的载体后保留其记忆效应物表型长达50天、暴露于本发明的载体后保留其记忆效应物表型长达40天或暴露于本发明的载体后保留其记忆效应物表型长达30天。
膨胀记忆CD8+ T细胞也可以缺乏衰竭标志物。过度的TCR(T细胞受体)刺激可能会导致T细胞衰竭。T细胞衰竭的标志可以包括诸如PD-1、Tim-3、Lag-3的标志物的上调。因此，在一个实施方案中，膨胀记忆CD8+ T细胞可以缺乏选自以下的标志物或表现出选自以下的标志物的低表达：PD-1、Tim-3、Lag-3。
编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的核苷酸序列可包含约12至约45个碱基对，在另一个实施方案中，核苷酸序列可包含约15至约45个碱基对，在另一个实施方案中，核苷酸序列可包含约18至约45个碱基对，在另一个实施方案中，核苷酸序列可包含约21至约45个碱基对，在一个优选实施方案中，核苷酸序列可包含约24至约45个碱基对。因此，载体编码包含约5至约15个氨基酸的单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位，在另一个实施方案中，载体编码包含约6至约15个氨基酸的表位，在另一个实施方案中，载体编码包含约7至约15个氨基酸的表位，在一个优选实施方案中，载体编码包含约8至约15个氨基酸的表位。
单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位是免疫原性表位，因为它引发免疫应答。T细胞表位与主要组织相容性复合体结合，以启动随后的免疫应答。因此，在一个实施方案中，表位能够结合并呈递在MHC分子上。本领域已知有多种方法来鉴定结合MHC并因此产生免疫应答的表位。这些方法包括肽-MHC结合预测模型，其中有多个公开可用的程序。
在一个实施方案中，单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位源自肿瘤相关抗原(TAA)。TAA是由癌症产生的抗原产物，它为肿瘤的靶向识别提供了生物标志物。TAA可大致分为异常表达的自身抗原、突变的自身抗原和肿瘤特异性抗原。因此，TAA可以在癌细胞中上调或过表达。TAA可以在癌细胞内发生突变。TAA可以对癌细胞具有特异性并且仅在癌细胞内表达，这也可以称为肿瘤特异性抗原。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位在癌细胞中发生突变。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位在癌细胞中过表达。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位是非编码性肿瘤特异性表位。如本文所用，术语“非编码性肿瘤特异性表位”是指在癌细胞上发现的肽，其中所述肽来源于在健康细胞中被表观遗传抑制的核苷酸序列。这些肽序列在肿瘤细胞内异常表达。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位不是隐匿表位。如本文所用，“隐匿表位”是指在具有免疫能力的个体中不具有免疫原性的表位。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位可以是与病毒驱动的癌症相关的病毒表位。病毒驱动的癌症可以是HPV(人乳头瘤病毒)、HTLV(人T淋巴细胞病毒)或EBV(爱泼斯坦巴尔病毒)。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位源自选自以下的肿瘤相关抗原：TRP-1、CEA、TAG-72、9D7、Ep-CAM、EphA3、端粒酶、间皮素、SAP-1Melan-A/MART-1、酪氨酸酶、CLPP、细胞周期蛋白-A1、细胞周期蛋白-B1 MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAGE1b/GAGED2a、CD45、磷脂酰肌醇聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、lengsin、meloe、MUC5AC、存活素、PRAME、SSX-2、NY-ESO-1/LAGE1、gp70、MC1R、TRP-1/-2、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4。
癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位可以是私有表位。如本文所用，术语“私有表位”是指仅在单个人的癌症中的单个抗原上发现的表位。癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位可以是公有表位。如本文所用，术语“公有表位”是指在两个或更多个人的癌症上发现的表位。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位可以是新表位。如本文所用，术语“新表位”是指通过肿瘤细胞内的突变产生的表位，特别是体细胞突变或乘客突变可导致新表位的产生。在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位不是新表位。
在一个实施方案中,癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位对以下疾病具有特异性：结直肠癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、上皮癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、爱泼斯坦巴尔驱动的癌症、人乳头瘤病毒驱动的癌症和软组织肉瘤。如本文所用，术语“癌症”是指具有异常细胞生长的疾病，如本文所用，该术语既指原发性肿瘤又指原发性肿瘤的转移。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位包含SEQ ID NO:1(SPSYVYHQF)或SEQ ID NO:2(SLLMWITQC)或SEQ ID NO:37(SLLMWITQV)。当癌症特异性CD8+和/或CD4+T细胞表位是与病毒驱动的癌症相关的病毒表位时，该表位可以包含SEQ ID NO:7(RAHYNIVTF)。病毒驱动的癌症可以选自EBV驱动的癌症、HTL驱动的癌症和HPV驱动的癌症。EBV驱动的癌症可以包括霍奇金淋巴瘤(HL)、伯基特淋巴瘤(BL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和两种与严重免疫损伤相关的罕见肿瘤——浆母细胞淋巴瘤(PBL)和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)、LPD和T或NK细胞的恶性淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)和上皮来源的胃癌以及平滑肌肉瘤。HPV驱动的癌症可以包括肛门-生殖器癌(anogenital cancer)、口咽癌、口腔癌、头颈鳞状细胞癌和喉癌。
在一个实施方案中，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位包含表1中的一个或多个表位。
表1
Figure BDA0003697620930000191
Figure BDA0003697620930000201
此外，癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位可以使用本领域已知的技术来确定，例如蛋白质组学方法、质谱法、基因组方法、转录组分析、生物信息学方法和计算机方法。技术人员可以选择在本发明的载体内待编码的合适的表位。
编码癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的核酸可以针对哺乳动物密码子使用进行密码子优化。适当地，核酸序列可以针对人密码子使用进行密码子优化。
载体可以包含腺相关病毒(AAV)。载体可以包含腺病毒。
腺病毒载体或AAV载体还可以具有另外特征，例如增强子和启动子区域。在一个实施方案中，载体可以包含强启动子，实例包括但不限于CMV启动子、RSV启动子、EF1α启动子。在一个优选实施方案中，载体包含CMV启动子，CMV启动子的合适序列在SEQ ID NO:18中提供。在一个实施方案中，载体可以包含TATA盒。在一个实施方案中，载体包含翻译起始序列，例如Kozak序列。Kozak序列具有共有序列(gcc)gccRccAUGG，合适的Kozak序列在SEQ IDNO:19中提供。在一个实施方案中，载体包含终止序列和/或聚腺苷酸化序列。合适的聚聚腺苷酸化序列在SEQ ID NO:34中提供。AAV载体可以包含反向末端重复(ITR)序列。合适的ITR序列在SEQ ID NO:42中提供。
在一个实施方案中，载体不包含另外的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。载体仅编码单个癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。在一个实施方案中，腺病毒载体由载体骨架、启动子区和编码单个癌症特异性CD8+ T细胞表位的核苷酸序列组成。腺病毒骨架可以包含另外特征，例如增强子区、启动子区、TATA盒、翻译起始序列。
AAV载体可以是血清型1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一个优选实施方案中，AAV载体可以是血清型2或5。AAV载体可以包含ITR序列，在一个优选实施方案中，ITR序列位于编码的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的侧翼。在癌症特异性表位的5’可以是ITR序列，并且在癌症特异性表位的3’可以是ITR序列。5’ITR序列可以包含SEQ ID NO:39。3’ITR序列可以包含SEQ ID NO:42。AAV载体可以包含癌症特异性表位5’的序列，例如SEQ ID NO:38。AAV载体可以包含癌症特异性表位3’的序列，例如SEQ ID NO:41。为了产生包含癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的AAV载体，可以使用辅助质粒。一个或多个辅助质粒可用于提供AAV复制或包装所需的基因。在一个实施方案中，辅助质粒编码E2A、E4和VA腺病毒蛋白和或编码AAV的rep和cap基因。
腺病毒载体可以是物种C血清型。物种C包括Ad1、2、5和6血清型。在一个优选实施方案中，腺病毒载体是人血清型5(AdHu5)。对腺病毒载体进行修饰可以是优选的，例如以降低载体免疫原性和提高载体的生物安全性。因此，腺病毒载体可以是无复制能力的。腺病毒载体可以缺乏E1和E3蛋白。腺病毒载体可以包含癌症特异性表位5’的序列，例如SEQ IDNO:13。腺病毒载体可以包含癌症特异性表位3’的序列，例如SEQ ID NO:14。
其他腺病毒载体也可适用于本发明的载体。在一个实施方案中，载体可以是动物(例如犬、猿，特别是恒河猴和黑猩猩)来源的腺病毒载体。在一个实施方案中，腺病毒载体可以是源自非人灵长类动物的稀有血清型载体。源自黑猩猩的载体可以适用于本发明的载体，实例包括但不限于ChAd63、ChAd3、ChAdY25。
在一个实施方案中，提供了免疫原性组合物，其包含如上定义的载体。免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂。
包含本发明的载体的免疫原性组合物可以与至少一种包含本发明的载体的其他免疫原性组合物组合使用，其中每个载体编码不同的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。包含本发明的第一载体的免疫原性组合物可以与包含本发明的第二载体的免疫原性组合物分开、顺序或同时施用。
在一个实施方案中，免疫原性组合物可以包含至少两种本发明的载体。可以优选的是至少两种载体编码不同的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。其中在组合物中存在其他另外的载体时，所述载体可以编码不同的癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂。不希望受理论的束缚，使用编码不同表位的载体的混合物可导致更强的免疫应答，进一步可以存在增强免疫应答的协同效应。
如果本发明的组合物包含至少两种如本文所述的载体，则所述载体可以作为分开的药物提供，用于同时或不同时间施用。
在一个实施方案中，如果组合物包含至少两种如本文所述的载体，则所述载体可以作为分开的药物提供，用于在不同时间施用。当分开并在不同时间施用时，可以先施用任一载体。在一些实施方案中，两者可以在同一天或不同天施用，并且它们可以在治疗周期期间使用相同的时间表或以不同的时间表施用。
可替代地，如果组合物包含至少两种如本文所述的载体，则可以同时进行载体的施用。在使用同时施用的情况下，载体可以配制成分开的药物组合物。在一个优选实施方案中，至少两种载体可以配制成单一药物组合物。
本发明的组合物可以呈液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液。本发明的液体组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，还可以包括以下中一种或多种：无菌稀释剂，例如水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油，例如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油或其他溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。组合物可以封装在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本发明的载体或组合物的静脉内制剂可以呈无菌可注射的水性或非水性(例如油质)溶液或悬浮液的形式。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇溶液)中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以使用的可接受的媒剂和溶剂是水、磷酸盐缓冲溶液、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备本发明的静脉内制剂。
免疫原性组合物可以使用制药领域众所周知的方法来制备。例如，可以通过将本发明的载体与水组合以形成溶液来制备意欲通过注射施用的组合物。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。
在一个实施方案中，本发明涉及宿主细胞，其包含如本文所述的载体或免疫原性组合物。宿主细胞可以是哺乳动物，例如人或小鼠。可以用载体转导宿主细胞。宿主细胞可用于生产腺病毒原液。
在一个实施方案中，载体或免疫原性组合物用于疗法中。在一个优选实施方案中，载体或免疫原性组合物用于治疗或预防癌症。
术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或障碍的治疗，还包括病因疗法，即旨在消除相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发展的治疗；和支持性疗法，即用于对另一种针对改善相关疾病、病理状况或障碍的特定疗法进行补充的治疗。
本发明还涉及治疗或预防癌症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的载体或组合物施用于有需要的对象。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的载体或组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的载体或组合物在治疗或预防癌症中的用途。
如本文所用，术语“治疗有效”是指所用组合物的量足以改善疾病或障碍的一种或多种原因或症状。这种改善只需要减少或改变，不一定要消除。
本发明还提供了诱导膨胀记忆CD8+ T细胞应答的方法，其包括以下步骤：向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的载体或组合物，其中CD8+ T细胞的特征在于选自包括CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+和CD62L-的组中的标志物。
优选地，CD8+ T细胞的特征在于表型CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+和CD62L-。更优选地，它们的特征在于表型CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-、CD27-(低)、CD127-(低)。
载体或免疫原性组合物可用于治疗或预防结直肠癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、上皮癌、头颈癌、皮肤癌和软组织肉瘤。
如本文所述的载体或组合物可以通过任何方便的途径施用。载体或组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼部、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、经皮、经粘膜、通过吸入。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。在一个实施方案中，载体或组合物通过静脉内或肌内施用。组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。
在具体实施方案中，可能需要将本发明的载体或组合物局部施用至需要治疗的区域，例如肿瘤部位。在另一个实施方案中，可能期望通过静脉内注射或输注来施用载体或组合物。在治疗特定障碍或病症中有效/活性的本发明载体的量将取决于障碍或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或障碍的严重程度，并且应该根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
组合物包含有效量的本发明的载体，以便获得合适的剂量。化合物的正确剂量将根据具体制剂、施用方式及其具体部位、宿主和所治疗的疾病而变化。其他因素，如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度应考虑在内。施用可以连续或定期进行。
在癌症的治疗中，本发明的载体或免疫原性组合物可以与现有疗法联合使用。在一个实施方案中，载体或组合物与现有疗法或治疗剂，例如抗癌疗法联合使用。因此，在另一方面，本发明还涉及一种联合疗法，其包括施用本发明的载体或组合物和抗癌疗法。抗癌疗法可以包括治疗剂或放射疗法，并且包括基因疗法、病毒疗法、RNA疗法骨髓移植、纳米疗法、靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其他治疗剂的实例包括检查点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性剂、减毒的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(例如用肿瘤来源的抗原或核酸脉冲的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)、靶向小分子和生物分子(例如信号转导通路的组分，例如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的药剂，包括EGFR拮抗剂)、抗炎剂、细胞毒素剂、放射性毒性剂、或免疫抑制剂和用编码免疫刺激细胞因子(例如GM-CSF)的基因转染的细胞、化学疗法。在一个实施方案中，载体或组合物与手术结合使用。本发明的载体或组合物可以与其他疗法在同时间或不同时间施用，例如同时、分开或顺序施用。
在一个实施方案中，载体或组合物与免疫调节剂组合使用。免疫调节剂可以与免疫调节剂同时、顺序或分开施用。在具体的实施方案中，免疫调节剂可以是免疫检查点抑制剂，免疫检查点抑制剂的实例包括但不限于选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-H6、A2aR、BTLA、GAL9和IDO。
先前已报道某些肿瘤类型对抗PD-1和抗PD-L1单一疗法无应答。本文出人意料地表明，当与检查点抑制剂(例如抗PD-L1疗法)联合施用时，用小基因载体免疫接种可导致增强的肿瘤控制。这已在已知对标准检查点抑制剂疗法无应答的肿瘤模型中显示有效。因此，在一个实施方案中，本发明的载体或组合物可以与检查点抑制剂组合使用以治疗检查点抑制剂无应答性肿瘤。
本发明的载体或组合物和免疫调节剂可以作为分开的药物提供，用于在相同时间或不同时间施用。
在一个实施方案中，本发明的载体或组合物和免疫调节剂作为分开的药物提供，用于在不同时间施用。当分开并在不同时间施用时，可以先施用载体或免疫调节剂。在一些实施方案中，两者可以在同一天或不同天施用，并且它们可以在治疗周期期间使用相同的时间表或以不同的时间表施用。
可替代地，免疫调节剂的施用可以与载体或免疫原性组合物的施用同时进行。在使用同时施用的情况下，载体或免疫原性组合物和免疫调节剂可以配制成分开的药物组合物。载体或免疫原性组合物和免疫调节剂可以配制成单一的药物组合物。
本发明的载体或组合物可以预防性地或治疗性地施用。术语“预防性地”是指旨在对疾病具有保护作用的施用。术语“治疗性地”是指旨在具有治愈性效果的施用。
本发明的载体或组合物可以以单次剂量施用。剂量可以在预防性情况或治疗性情况中提供。在一个实施方案中，单次剂量可以以单次剂量单位提供，所述单次剂量单位进一步包含一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂。
本发明的载体或组合物可以以多剂量施用。在施用多剂量的情况下，可以预防性施用一个或多个剂量，或者可以治疗性施用一个或多个剂量。在施用多剂量的情况下，可以预防性施用一个或多个剂量，并且可以治疗性施用一个或多个剂量。在一个实施方案中，载体可以作为“初免加强”方案施用，其中存在腺病毒载体的第一次施用(初免施用)，然后是第二次施用(加强施用)。
根据个体患者对治疗的耐受性视需要进行剂量延迟和/或剂量减少以及时间表调整。
如果免疫原性组合物包含至少两种载体并且其中载体编码如上所述的不同表位，则载体之间可以存在协同作用。因此，可以以次优剂量施用每种载体。术语“次优”剂量是指其并非旨在完全去除或根除肿瘤但仍会导致一些肿瘤细胞或组织坏死的剂量水平。技术人员将能够确定实现这一点所需的适当剂量，这取决于诸如以下因素：患者年龄、疾病状态以及肿瘤或转移灶的大小和位置
在一个实施方案中，提供了产生上述载体的方法，其包括以下步骤；
i)合成编码表位的核酸序列，作为有义和反义引物，
ii)将编码表位序列的核酸序列克隆到第一质粒中，
iii)将包含编码表位的核酸序列的序列克隆到包含腺病毒DNA的第二质粒中。
合适的克隆方法是本领域已知的，克隆方法的实例包括但不限于限制性连接方法、Gateway克隆、Gibson组装、连接非依赖性克隆。本领域技术人员将能够确定将序列克隆到质粒中的合适方法。将编码表位序列的核酸序列引入第一质粒的克隆方法可以与所用的克隆方法相同或不同。在一个实施方案中，将编码表位序列的核酸序列引入第一质粒的克隆方法选自限制性连接方法、Gateway克隆、Gibson组装、连接非依赖性克隆。在一个实施方案中，将编码表位的核酸序列引入包含腺病毒DNA的第二质粒中的克隆方法选自限制性连接方法、Gateway克隆、Gibson组装、连接非依赖性克隆。
在一个实施方案中，步骤iii)包括将包含编码表位的核酸序列的序列克隆到包含腺病毒DNA的第二质粒中，其中包含编码表位的核酸序列的序列还包含选自翻译起始序列、启动子、终止序列、聚腺苷酸化序列的另外特征。
在一个实施方案中，产生载体的方法包括以下步骤；
i)合成编码表位的核酸，作为有义和反义引物，
ii)使有义和反义引物退火，
iii)用适当的限制酶消化退火的引物以允许插入供体质粒，和
iv)将供体质粒转移到包含腺病毒DNA的第二质粒中。
合适的限制酶和位点是技术人员已知的。技术人员有能力在有义和反义引物中设计合适的限制性位点以允许插入供体质粒。
编码的表位是癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位。多个癌症特异性表位已被确定并且是本领域已知的。技术人员可以选择载体内待编码的合适的表位。本领域已知用于识别癌症特异性表位的其他方法包括生物信息学方法、转录组分析和计算机方法。
编码腺病毒载体的第二质粒可以包括以下任何特征。腺病毒载体可以包含增强子和启动子区，例如强启动子，例如CMV启动子、RSV启动子、EF1α启动子。在一个优选实施方案中，载体包含CMV启动子。载体可以包含TATA盒。在一个实施方案中，载体包含翻译起始序列，例如Kozak序列。Kozak序列具有共有序列(gcc)gccRccAUGG。在一个实施方案中，载体包含终止序列和/或聚腺苷酸化序列。腺病毒载体可以是物种C血清型，例如Ad1、2、5和6血清型。在一个优选实施方案中，腺病毒载体是人血清型5(AdHu5)。对腺病毒载体进行修饰可以是优选的，例如以降低载体的免疫原性和提高载体的生物安全性。因此，腺病毒载体可以是无复制能力的。腺病毒载体可以缺乏E1和E3蛋白。
将供体质粒转移到第二质粒中可以通过任何方法进行，例如连接方法。
在本发明的一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含本文所述的载体或免疫原性组合物、一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂，以及任选的使用说明。
另外的活性剂可以包括检查点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性剂、减毒的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(例如用肿瘤来源的抗原或核酸脉冲的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)、靶向小分子和生物分子(例如信号转导通路的组分，例如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的药剂，包括EGFR拮抗剂)、抗炎剂、细胞毒素剂、放射性毒性剂、或免疫抑制剂和用编码免疫刺激细胞因子(例如GM-CSF)的基因转染的细胞。
药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂可以包括：无菌稀释剂，例如水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油，例如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油或其他溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。
在一个实施方案中，本发明涉及在动物中诱导针对癌症特异性CD8+和/或CD4+ T细胞表位的T细胞免疫应答的方法，其包括使细胞与本文所述的载体或免疫原性组合物接触。
细胞可以以体外方式、离体方式或体内方式与载体或组合物接触。如果细胞与载体或组合物在体外或离体接触，则可以将细胞施用于对象。
T细胞免疫应答可以包括膨胀记忆CD8+ T细胞应答。
在另一方面，本发明提供了如实施例和/或附图中所述的载体。
除非本文另外定义，否则结合本公开所使用的科学及技术术语将具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。尽管上述公开内容提供了对包括在本发明范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，本发明的范围应由本公开所附的权利要求书及其等同物来理解。鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。
本说明书中描述的所有文献通过引用以其全文并入本文。
在非限制性实施例中进一步描述了本发明。
实施例
实施例1：编码在CT26结直肠癌中鉴定的CD8表位的优势AH1表位的单个AdHu5构建体是免疫原性的
在具有内源性新抗原的小鼠癌症模型中进行了一系列实验，以研究小基因接种是否能够提高针对内源性T细胞表位的T细胞应答。我们使用了CT26鼠结直肠癌模型，其中肽序列SPSYVYHQF(称为AH-1SEQ ID NO:1)来源于鼠白血病病毒的蛋白质(MuLV envgp70423-432)，鼠白血病病毒是Balbc小鼠以H2-DL限制性方式识别的内源性逆转录病毒。还测试了编码“隐匿”CD8 T细胞表位的小基因GGPESFYCASW(来自MuLV env gp90147-158，称为GSW11 SEQ ID NO:3)。这种H-2Dd限制性表位不会在健康的免疫活性BALB/c小鼠中诱导CD8T细胞应答——尽管它也源自MuLV，但它以与AH-1不同的开放阅读框编码。此外，它不能稳定地结合Dd MHC分子，因为它不符合规范的肽基序，因此在从细胞表面丢失之前具有20分钟的非常快的稳定半衰期。相比之下，AH-1的半衰期为60分钟；因此，CD8 T细胞对GSW11的特异性应答仅在调节性CD4T(Treg)细胞系统性耗减时才会产生(James等人,2010J.Immunol.185:5048-5055)，这导致抗原呈递细胞的非常高水平的激活(Shevach.,2009Immunity30(5):636-45)。这包括检查是否可以通过免疫活性动物中的小基因免疫接种而无需系统性Treg耗减来提高对这种不稳定的“隐匿”表位的应答。如前所述(图1A)，这两个表位在AdHu5骨架上构建为分开的小基因。
用小基因载体AdHu5-AH1-MG注射BALB/c小鼠(剂量为1×108或1×107个感染单位(IU)(对于Ad-AH1低))诱导血液中AH1特异性CD8+ T细胞，如在接种后第7天通过AH1-四聚体染色(图1B)检测约占总CD8+ T细胞的25％(图1C，左)。随着时间的推移，该水平在第50天逐渐下降至约5％(图1C，右)并在接种后第80天下降至约2.5％(数据未显示)。在C57BL/6小鼠中接种Ad-小基因后观察到类似的百分比，尽管处于较高水平的平台期。在初试空白小鼠或接种了编码无关表位(I8V，源自细菌酶β-半乳糖苷酶的表位)的AdHu5小基因的小鼠中均未检测到AH1特异性应答(图1C左和右)。
GSW11-四聚体染色或GSW11-肽刺激无法检测到GSW11特异性应答，表明这种“隐匿”的不稳定的表位不能在免疫活性动物中产生CD8 T细胞应答。然而，有趣的是，仅用AdHu5-AH-1免疫的组与用两种小基因AdHu5-AH-1+AdHu5-GSW11免疫的动物的AH-1+四聚体应答的幅度没有差异，(图1C，左)，表明编码非免疫原性表位的AdHu5小基因构建体的共同递送不干扰AH-1特异性应答的诱导。
虽然AH1特异性CD8+ T细胞的数量随着时间的推移而降低，但它们的表型保持稳定——类似于在C57BL/6小鼠15中观察到的，具有效应记忆表型(CD44+CD62L-，图1D和1E顶行)，与来自同一小鼠的血液中的四聚体阴性(tet-)群体相比(图1D和1E)表达更低水平的CD27(图1D和1E，中间行)和更高水平的PD-1(图1D和1E，底行)。此外，在该群体中还检测到高水平的CX3CR1和低水平的CD127。到第50天，观察到效应记忆表型的轻微丧失，以及激活标志物CD27和PD-1的一些上调(图1E，左子图，分别为上、中和下)。
实施例2：AdHu-5小基因免疫接种在预防性和治疗性免疫模型中延迟CT26肿瘤生长
为了测量这种预防性免疫方案的保护效果，经免疫接种的动物在Ad-AH1接种后5天皮下(s.c)注射CT26肿瘤细胞(图2A、B-C)。所有用Ad-AH1免疫接种的动物都显著抑制了肿瘤生长，其中一只受到激发的动物完全缓解(1/15)(图2B和C)。正如免疫原性数据所预期的那样，在仅用Ad-GSW11(图2B-P1)免疫接种、无关小基因免疫接种或未免疫接种(图2B-P1)的组中未观察到保护作用。有趣的是，在接种低剂量Ad-AH1(1×107IU)17的组中观察到了稍微更好的控制(图2C-P2)(尽管没有统计学意义)。在肿瘤激发后第18天，在接种Ad-AH1的小鼠和对照小鼠之间观察到肿瘤大小的显著差异(图2E和2G)。此外，对照小鼠相比，相对于肿瘤开始生长当天，接种Ad-AH1的小鼠的肿瘤生长速率(由拟合曲线的线性回归线的斜率确定)较低(图2F、2H和2K)。总之，在CT26肿瘤激发前后接种Ad-AH1可延迟肿瘤生长。
我们接下来在治疗性激发模型中测试了小基因构建体(图2D)。给小鼠组皮下注射肿瘤细胞，然后在6天后静脉内注射Ad-AH1(图2A和图2D)。和以前一样，免疫接种Ad-AH-1延迟肿瘤生长——在免疫接种后第18天，免疫接种Ad-AH1小鼠的肿瘤明显小于初试空白动物和无关免疫接种AdHu5的动物(图2I和2J)，其中一只动物保持无肿瘤(1/10)。
实施例3：AdHu5-AH1小基因免疫接种改变特异性CD8+ T细胞的表型
当达到人道终点时，将带瘤小鼠剔除。此时，确定了肿瘤(TIL)和脾中AH-1特异性CD8 T细胞的数量。AH1-四聚体染色(图3A，上子图)显示经接种的小鼠和对照小鼠的肿瘤中有高水平的AH1特异性CD8+ T细胞(图3B，上排，左和右)。用完整的荧光染料缀合抗体组与不同/无关的H2-Ld结合四聚体(识别MCMV pp89表位)染色，未显示任何阳性细胞(图3A)，证实高水平的AH-1四聚体细胞不是H2-Ld四聚体自发荧光或非特异性结合的结果。然而值得注意的是，在这个阶段，已经发生了肿瘤控制的丧失。
在预防性免疫接种的后期，所有组的脾中都检测到了AH-1特异性CD8 T细胞群(图3B，底行，左)，组间有少许差异。相比之下，只有在肿瘤激发后用Ad-Hu5AH-1免疫接种的动物在脾中出现了升高的AH-1四聚体阳性细胞水平(图3B，底行，右)，这表明免疫接种可以提高其他区室中四聚体阳性细胞的水平。
表型分析表明，在脾中，这些来自接种Ad-AH1小鼠的AH1特异性CD8+ T细胞主要是效应记忆细胞(CD44+CD62L-)，它们上调CX3CR1、CD127、Fas和LFA-1，并下调CD27和Trm细胞标志物(CD69+CD103+)(图3C，右子图)。相比之下，肿瘤中的AH1特异性CD8+ T细胞表达不同的表型，变得高度上调但衰竭，如高水平的PD-1所证明(图3C，左子图)。PD-1上调可能是由于广泛的TCR刺激，因为TIL中其他CD8 T细胞上的PD-1水平没有那么高(图3C，中子图)。在四聚体阳性和非四聚体阳性TIL中，除CD127下调以及CD27和CD69+CD103+保持相同之外，所有表明标志物均升高(图3C，左子图和中子图)。因此，免疫接种似乎改变了淋巴区室中四聚体阳性细胞的水平，并使表型偏向于TIL中的效应记忆之一。
实施例4：与对照小鼠相比来自接种Ad-AH1小鼠的肿瘤中调节性T细胞的百分比似乎较低，而在Ad-AH1免疫接种后TIL中的Trm增加。
为了确定免疫接种是否会导致肿瘤微环境的其他改变，测量了Treg和AH-1特异性驻留记忆T细胞(Trm)的水平。我们发现，在CD4 T细胞区室中，与对照组(初试空白的和经无关Ad免疫接种的)相比，接种Ad-AH1的肿瘤中Treg(CD4+FoxP3+)细胞的比例较低(图4A)。
最近据报道，表达Trm表型的抗原特异性CD8 T细胞发挥了优越的肿瘤控制作用。与此一致，我们发现腺病毒载体小基因免疫接种增加了TIL中AH1+CD103+CD69+ Trm的百分比。当合并免疫接种组并与阴性对照(IrrAd和初试空白)组比较时，这具有统计学显著性。在初试空白组中，尽管存在大量AH1+四聚体(图8A)，但很少显示CD103+CD69+CD62L低、CD44hi的Trm表型(图4B)。这种增加在预防性和治疗性免疫接种情况中都很明显(图4B)。总之，在这个癌症模型中，小基因免疫接种似乎改变了肿瘤微环境，有利于识别和杀伤肿瘤细胞。
实施例5：虽然TIL中的抗原特异性CD8 T细胞对同源肽没有应答，但同源动物的脾细胞保留了它们的功能
通过AH1-四聚体染色(图3A)在肿瘤中检测到的高百分比AH1特异性CD8+ T细胞表明表达AH1特异性TCR的细胞数量。然而，这并不能证明TCR信号传导和T细胞激活是否在与AH1肽相互作用后发生。因此，我们用以下刺激来自脾和肿瘤的单细胞：(1)AH1-肽，以测量TCR信号传导的效果，(2)PMA/IO，以测量非特异性激活。促炎细胞因子干扰素γ(IFNγ)的产生用作读出。来自相应小鼠的脾细胞也用同源肽和PMA/IO刺激。
如图5A和5B所示，来自小基因免疫接种组的CD8+脾细胞在用来自预防性和治疗性接种小鼠的AH1肽离体刺激时能够应答(即产生IFNγ)，并且从非AH1免疫接种的脾细胞记录到非常少的应答。相比之下，在相应免疫接种动物的TIL中观察到非常低/没有细胞因子产生。PMA/IO刺激还诱导经免疫接种的TIL产生非常少的IFN-γ，在非AH-1免疫接种动物中观察到的水平甚至更低。总之，结果表明，在晚期时间点，肿瘤中的抗原特异性CD8 T细胞是功能失调的，尽管其他区室中类似的抗原特异性CD8 T细胞保持其功能。此外，TIL中的功能障碍可能是内在的，因为细胞也不能对PMA/IO刺激作出应答，对PMA/IO刺激作出应答不需要完整的抗原呈递细胞。最后，这些结果还表明，虽然小基因免疫接种使其他区室(例如脾)中产生IFN-γ的抗原特异性细胞群增加，但是当抗原特异性细胞响应肿瘤细胞而增加时，这种情况就不会发生。
实施例6：小基因免疫接种诱导减缓肿瘤生长的外周AH1特异性CD8T细胞群
当计算肿瘤的生长速率时，发现了免疫接种的另外影响。通过计算拟合曲线的线性回归线的斜率来确定生长速率，该曲线自肿瘤显示明显肿瘤生长的那天(对于阴性对照是植入后第7天和对于AH1免疫接种动物是植入后第18天)(图6A)采集。可替代地，使用相同的原始数据计算比生长速率(图6B)。我们发现，即使发生肿瘤逃逸，与对照相比，肿瘤的生长速度也较慢，这表明膨胀细胞施加的选择压力可以导致不太适合的肿瘤群体生长。可替代地，肿瘤实际上以与对照相同的速度分裂，但其中一部分总是被膨胀的抗AH1 CD8 T细胞清除。当肿瘤的生长速率(来自图2D)相对于肿瘤激发后TIL或脾中四聚体阳性细胞的百分比作图时，从预防性和治疗性激发研究中观察到肿瘤生长速率与AH1四聚体+脾细胞百分比之间存在强烈的负相关(图3B)，表明更高水平的这些细胞致使更好地控制肿瘤生长。
实施例7：与用AdHu5-gp90FL免疫接种相比，用AdHu5-AH1-小基因构建体免疫接种可赋予更好的肿瘤控制
在治疗性免疫接种实验中比较了编码优势CD8 T细胞表位的腺病毒构建体和编码表位所来源的全长蛋白gp90的类似构建体所提供的保护。在这里，发现与AdHu5-gp90-FL相比，小基因构建体发挥更好的控制作用，这可以通过肿瘤的统计学显著较低的生长速率来证明(图7A)。在激发后约6个月对清除肿瘤的小鼠的血液(来自图2B)进行取样，并且在循环中继续检测到AH1 Tet+细胞群，表明功能性CD8 T细胞应答长期存在(图7B)。
实施例8：用AdHu5-NY-ESO-1(157-165)(SEQ ID NO:2)、HLA:A2-限制性CD8 T细胞表位免疫接种导致HLA:A2-限制性膨胀记忆应答的发展
通过在E1和E3基因缺失的复制缺陷型AduHu5骨架上插入CMV启动子控制下的表位，生成了表达来自癌症睾丸抗原NY-ESO-1的优势HLA-A2限制性表位的小基因构建体(图8A)。还构建了包含全长NY-ESO-1的对照腺病毒载体。将这些静脉内注射进入在C57BL/6背景上表达HLA-A2抗原的转基因HHD小鼠。在HHD小鼠中，H-2Db和小鼠β-2-微球蛋白(b2m)(以及HLA-A2 HHDb2m杂合分子)也被敲除。这导致仅HLA-A2作为1类MHC。通过四聚体染色在血液中跟踪它们对表位NY-ESO-1的CD8 T细胞应答。如图8A所示，免疫接种小鼠对任何一种构建体都有应答，其中在第7天可测量到四聚体特异性细胞群。在大多数用全长NY-ESO-1蛋白免疫接种的小鼠中，反应在第21天减弱并在实验期间保持在较低但可检测的水平(约2-5％)，尽管有一些小鼠即使在较晚的时间点也显示出高水平(高达20％)的这种应答。相比之下，用小基因构建体免疫接种的大多数小鼠在随后的时间点显示出持续升高的四聚体阳性CD8 T细胞水平。这与先前报道的用小基因载体免疫接种后的动力学一致。
对四聚体阳性细胞进行表型分析，发现其表现出膨胀细胞表型，主要是效应记忆(CD44+CD62L-，图8C)，终末分化，表达KLRG1-hi(图8D)和CX3CR1+(图8E)。这些细胞在后期的PD-1水平也很低，有趣的是，与用全长构建体免疫接种产生的四聚体阳性细胞相比，它们似乎表达了更低水平的PD-1(图8F)。与全长诱导的对应物相比，小基因诱导的四聚体+CD8T细胞中其他衰竭标志物(如Tim-3和Lag-3)的水平也更低(图8G和H)。综合数据显示，小基因构建体上的CD8 T细胞肽表位能够被加工并加载到人HLA-A2抗原上，然后能够引发并产生膨胀的CD8 T细胞应答。此外，即使在免疫接种后的晚期时间点，这些应答也很大且持久，其中检查点抑制剂的表达非常低/不表达。
实施例9：用AdHu5-NY-ESO-1(157-165)免疫接种控制肿瘤激发
为了确定这些应答是否能够控制肿瘤，对小鼠皮下注射(s.c.)大量的肉瘤细胞(0.5-1x 106个细胞)，这些细胞来源于用NY-ESO-1蛋白稳定转染的HHD小鼠。跟踪肿瘤生长。结果表明用AdHu5-NY-ESO-1小基因免疫接种的小鼠能够在早期和晚期时间点(图9A)延迟肿瘤生长，其中2/10的动物显示肿瘤完全清除。此外，在高(实线)和低(虚线)剂量激发中都观察到了这种控制。相比之下，用FL载体免疫接种的小鼠能够在较低的激发剂量下控制肿瘤生长，但在较高的细胞浓度(实线)下不能做到。值得注意的是，由于小鼠仅对HLA-A2是转基因的，因此作为人蛋白质的NY-ESO-1可能具有免疫原性，并在肿瘤激发后被初试空白小鼠CD4和CD8 T细胞识别。分析肿瘤激发后两周采集的血液中是否存在Tet+细胞。在肿瘤激发后14天，所有组都出现了可检测的循环tet+应答，MG免疫接种组显示出最大幅度(图9B)。在肿瘤激发之前循环中具有超过2.5％的tet+细胞的动物在早期和晚期时间点发挥了对肿瘤生长的更好控制(图9C和D)。在用FL载体免疫接种的动物中没有观察到这种相关性。这部分实验的数据表明，用小基因载体进行单次初免免疫接种能够提供针对肿瘤激发的长效保护。
实施例10：用AdHu5-NY-ESO-1(157-165)免疫接种导致脾中的抗原特异性T细胞群
当动物达到其终点时，即当肿瘤大小接近1300mm3或出现溃疡且48小时后没有改善时，动物被剔除。对于初试空白组，在第17-29天，对于MG，在第28-29天，对于FL，在第26-29天，对于无关Ad组，在第22-29天去除肿瘤。此时，从肿瘤和脾中分离出淋巴细胞，以研究免疫接种是否改变了肿瘤免疫微环境的组成和肿瘤特异性细胞的功能。分离脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，发现所有组的TILS含有相似水平的CD8 T细胞(图10A)。MG免疫接种组中脾CD8 T细胞水平略有升高，但未达到统计学显著性。在所有组的TILS中检测到NY-ESO-1tet+细胞，免疫接种组和未免疫接种组之间的Tet+ TIL百分比没有统计学差异(图10B)。然而，观察到Tet+脾细胞百分比的差异，与未免疫接种的动物相比，经MG和FL免疫接种的动物的水平更高。肿瘤被去除是因为它们已经达到了它们的终点，并且在这个时间点，检查点抑制剂PD-1的表达经发现在所有组的tet+TIL中升高(图10C)。Fas在所有组的脾细胞和TIL中上调(图10D)，表明Tet+细胞的激活。有趣的是，来自经MG和FL免疫接种的动物的CD8 Tet+脾细胞表达更高水平的PD-1，而经FL免疫接种的动物在脾细胞上表现出最高的PD-1表达。FL免疫接种还导致脾细胞和TIL上的Lag-3水平更高。Lag-3和Tim-3在其他条件下的Tet+脾细胞上没有上调；但在所有组中均以相似水平在Tet+ TIL中检测到(图10E和F)。
实施例11：用AdHu5-NY-ESO-1(-)免疫接种后CX3CR1在抗原特异性脾细胞中上调
TIL和脾细胞进一步用膨胀记忆的标志物来表征。在脾中，只有来自经小基因免疫接种的小鼠的抗原特异性CD8 T细胞显示出更多的CX3CR1表达上调(图11A)，正如假设的那样，但在肿瘤中，来自所有组的抗原特异性细胞显示出很大比例的CX3CR1hi细胞(图11B)。所有组的脾和肿瘤中的大多数抗原特异性细胞都是效应记忆细胞(图11C)。为了研究腺病毒免疫接种是否会改变肿瘤微环境，测量了肿瘤和脾中Treg的水平——在全长免疫接种组中脾中的Treg水平略有升高，尽管肿瘤中Treg的水平在组间没有差异(图11D)。同样，与在CT26肿瘤模型中观察到的不同，肿瘤中驻留记忆抗原特异性CD8 T细胞的水平没有差异(图11E)。
实施例12：CX3CR1hi CD8 T细胞对氧化应激更具抵抗力
膨胀记忆细胞上调了许多参与抗凋亡通路的分子，包括Bcl-XL。据报道，人单核细胞上的CX3CR1表达通过减少抗氧化应激来帮助细胞存活。因此，我们研究了CX3CR1表达是否对膨胀记忆细胞具有促存活作用。通过CellROX Red测定法检测经Ad-lacZ或MCMV感染的小鼠感染后>50天的CX3CR1+/-gfp脾细胞中的细胞内活性氧(ROS)水平。我们发现，在稳定状态下，与CX3CR1阴性和int CD8 T细胞群相比，CX3CR1hi CD8 T细胞含有更低水平的ROS(图12A和12C)，表明CX3CR1hi细胞内在地具有较低水平的ROS。有趣的是，来自CX3CR1gfp/gfp小鼠的CX3CR1hi细胞与CX3CR1阴性亚群相比也具有更低水平的ROS，表明这种效应不仅仅依赖于CX3CR1信号传导。此外，在血清饥饿后，整体CX3CR1+CD8 T细胞亚群(图12F，中)和抗原特异性CX3CR1+ T细胞(图12F，右)中的活性氧(ROS)水平仍然低于其CX3CR1阴性对应物，因此显示增强的氧化还原恢复力。此外，当在无血清培养基(即应激)中孵育时，与整体CX3CR1阴性T细胞(图12D)和抗原特异性群体(图12E)相比，CX3CR1+群体显著存活。
接下来，我们通过用MitoTracker绿(其作为线粒体质量的标志物)和MitoTracker深红(其仅染色极化的健康线粒体)染色来自持续感染MCMV或腺病毒载体的小鼠的外周血淋巴细胞来确定这些亚群中去极化线粒体的百分比。去极化线粒体对MitoTracker绿呈阳性，但对MitoTracker深红不呈阳性，并且可以通过流式细胞术与极化线粒体分离。与CX3CR1阴性CD8 T细胞相比，来自野生型C57BL/6小鼠的CX3CR1hi CD8 T细胞含有较低百分比的去极化线粒体(图12B)。综上所述，这些结果表明鼠CX3CR1hi CD8 T细胞比其CX3CR1阴性CD8 T细胞对应物具有促存活优势，这可能促进它们在宿主中的长期持久性和积累。
至关重要的是，癌症与主要通过肿瘤微环境中恶性细胞、粒细胞、TAM和MSDC产生的活性氧(ROS)介导的氧化应激有关。因此，一旦细胞进入肿瘤内部，这些特性也可以保护和保持它们的细胞毒性能力。
实施例13：用编码HPV中优势E7表位的AdHu5-R9F免疫接种保护水平免受TC1-HPVE6/E7宫颈癌激发影响
在预防性免疫模型中，将编码E7蛋白中优势CD8 T细胞表位的小基因构建体提供的保护与编码全长E7蛋白的类似构建体提供的保护进行比较。用任一构建体免疫接种的小鼠产生大的表位特异性应答(图13A)，其在肿瘤激发后赋予完全保护(图13B)，在完整蛋白质相比于单独的表位提供的保护水平方面没有观察到差异。
实施例14：用编码针对MCMV的CD8 T细胞表位的一组小基因以次优剂量免疫接种后的协同效应
构建了一组针对已知MCMV特异性CD8 T细胞表位(即M45(985HGIRNASFI993 SEQ IDNO:10)、M38(316SSPPMFRV325 SEQ ID NO:11)和m139(419TWYGFCLL426 SEQ ID NO:12)的3个小基因。将这些作为单独的小基因或混合在一起的混合物静脉内注射进入C57BL/6小鼠。编码M38和M139的小基因以1x 107感染单位(I.U)的次优剂量注射，而编码M45的小基因以1x108I.U的最优剂量注射。测量免疫接种后第6天血液中M38特异性细胞的水平。出人意料的是，与仅注射次优剂量的M38-小基因载体的组相比，接受含有次优剂量的M38-小基因和m139-小基因载体以及最优剂量的M45-小基因的组合小基因疫苗的小鼠产生了更高水平的M38特异性T细胞。这一出乎意料的结果表明，与单独使用次优剂量的单一载体进行免疫接种后观察到的相比，以次优剂量的小基因载体的混合物的递送可具有提高抗原特异性T细胞数量的附加效应。
实施例15：小基因免疫接种改变了肿瘤环境，导致更高水平的颗粒酶B。
进行小基因免疫接种，然后分析颗粒酶B的水平。在肿瘤植入后23天，用小基因免疫接种后16天，通过从肿瘤制备的单细胞悬浮液的细胞内细胞因子染色然后进行流式细胞术，评估肿瘤中总CD8+T细胞中颗粒酶B的水平，如图15中可见，与用全长表位载体进行免疫接种时相比，用小基因载体免疫接种的CD8+ T细胞中颗粒酶B的水平显著更高。在肿瘤植入后23天也评估了肿瘤大小，图15表明与对照相比，小基因免疫接种显著减小了肿瘤大小。
还评估了四聚体+CD8 T细胞的转录因子Eomes和Tbet的水平。与从其他组分离的四聚体+细胞相比，取自用小基因载体免疫接种的动物的四聚体+CD8 T细胞表达更高水平的Tbet和更低水平的Eomes。这与记忆膨胀表型一致。
实施例16：小基因免疫接种和抗PD-L1疗法的组合治疗增强肿瘤控制。
据报道，CT26肿瘤对抗PD-1PD-L1单一疗法无应答(Selby等人,PreclinicalDevelopment of Ipilimumab and Nivolumab Combination Immunotherapy:Mouse TumorModels,In Vitro Functional Studies,and Cynomolgus Macaque Toxicology.PLoSONE.Public Library of Science；2016年9月9日；11(9):e0161779–19)。然而，目前的数据表明，小基因和抗PD-L1的联合疗法提高肿瘤控制和存活。
如图16所示，用腺病毒载体免疫接种小鼠组。肿瘤激发后7天，然后给小鼠施用抗PD-L1或同种型对照。图16A显示当小基因与抗PD-L1疗法联合施用时观察到增强的肿瘤控制(即肿瘤大小减小)。与IrrAdHu5免疫接种的未治疗对象相比，联合疗法还导致所有治疗的动物达到人道终点的时间增加约33％。所有小鼠组的存活曲线如图16B所示。评估免疫接种后15天(肿瘤激发后22天)循环中GP70423-431 Tet+细胞的百分比。与小基因单独治疗相比，联合疗法增加了循环中四聚体+细胞的水平(图16C)，并显著降低了肿瘤的生长速率(图16D)。
实施例17.分析源自肿瘤和脾的细胞中IFNγ的产生。
从预防性和治疗性免疫接种的小鼠中获得源自脾和肿瘤的单细胞，并用AH1-肽(4μg/ml)或PMA-离子霉素(IO)离体刺激7小时，然后针对IFNγ的细胞内细胞因子产生进行染色。IFNγ分泌型细胞仅在预防性(图17A)或治疗性(图17B)免疫接种组的脾中检测到并升高，在肿瘤中检测到低/无IFNγ分泌型细胞(图17C和图17D)。与抗PD-L1实验相组合的治疗性接种用AH1-肽(4μg/ml)或PMA-离子霉素(IO)离体刺激7小时，然后针对IFNγ的细胞内细胞因子产生进行染色。与单独的小基因治疗相比，联合疗法处理的样品中脾和肿瘤中IFNγ分泌型CD8 T细胞增加(图17E和图17G)。在CD4T细胞区室中，可以在接种联合抗PD-L1组的肿瘤(图17H)中检测到IFNγ分泌型CD4 T细胞，但在脾(图17F)中未检测到。
实施例18.在治疗性免疫接种模型中，用编码两种不同肿瘤抗原的两个AdHu-5小基因(MG)的组合进行免疫接种与单一免疫接种相比提高存活。
小鼠被皮下植入CT26肿瘤细胞(5x 10^5个细胞/小鼠)。6天后，小鼠接种了单一小基因疫苗(每种编码不同的CT26肿瘤抗原，AdHu5-AH1-MG或AdHu5-e2F8-27merMG，剂量为1x10^8IU)，或两种小基因疫苗一起接种(组合，均为1x 10^8IU)。每组中的一半在植入后12、16和19天用检查点抑制剂抗PD-1治疗，一半用同种型对照治疗。监测肿瘤生长直至其接近1.3cm3。
图18B-F显示与阴性对照(未接种或用编码无关抗原的AdHu5-MG接种)相比，用组合疫苗(组合)接种减缓了肿瘤生长。图19A表明组合疫苗治疗加抗PD-1比阴性对照提高了存活，而与阴性对照或仅用单一小基因疫苗接种的组相比，用组合疫苗治疗总体上增加了中位存活，如图19B所示。
通过对肿瘤大小随时间的简单线性回归分析以计算曲线的斜率来确定肿瘤的生长速率(更陡＝更高的生长速率)(图20)。可替代地，使用相同的数据来计算生长速率作为比生长速率(图23)。显示了根据接种类型的个体小鼠的值。与阴性对照组相比，组合接种显著减慢了肿瘤生长(图20和图23)。接种后6天对血液进行取样，并用针对CD8的表面标志物和对AH-1或e2f8抗原特异的四聚体进行染色(图21)。显示了活CD8 T细胞区室中的Tet+百分比。与仅接种AdHu5-AH-1MG的组相比，用组合疫苗接种增加AH-1tet+群体的数量(图21)。图22和23表明用两种小基因构建体/疫苗(组合)同时进行静脉内免疫接种以与单一疫苗相似的数量和表型诱导抗原特异性群体，并起到控制肿瘤生长的作用。
方法
动物
小鼠实验是根据英国内政部规定(项目许可证号PBA43A2E4和PPL30/3293)进行的，并经牛津大学当地伦理审查委员会批准。雄性和雌性小鼠在单独通风的笼子中保持在无特异病原体(SPF)条件下，并喂食正常的食物。HLA-A2转基因成年HHD小鼠在该大学的BSL2设施中培育并且由incenzo Cerundolo(HIU，牛津大学，牛津)友情提供。6-8周龄的Balbc小鼠获自Charles River(Margate，UK)。
腺病毒载体
对于NY-ESO-1研究，将全长NY-ESO-1基因或优势CD8 T细胞表位SLWTQC克隆到AdHu5载体骨架中。对于CT-26研究，如上插入全长鼠白血病病毒基因gp90或优势CD8 T细胞表位SPSYVYHQF(SEQ ID NO:1)以产生构建体AdHu5-FL和AdHu5-AH1-MG。在293A细胞中通过Viral Vector Core Facility(牛津，UK)扩大、纯化和定量构建体，并通过氯化铯离心纯化并将原液储存在-80℃下的PBS中。产生第二构建体AdHu5-e2f8-27MG(其编码来自CT26肿瘤的免疫原性突变，所述肿瘤含有预测的CD8 T细胞表位VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP(SEQID NO:4))，在293A细胞中按比例扩大并通过膜纯化(Sartorious)进行纯化。
对于HPV16E7研究，将全长HPV16E7基因或优势CD8 T细胞表位RAHYNIVTF(SEQ IDNO:7)克隆到AdHu5载体骨架中。对照载体包含来自细菌酶β-半乳糖苷酶的插入AdHu5载体骨架的CD8 T细胞表位ICPMYARV(SEQ ID NO:8)。
小鼠免疫接种和肿瘤激发和抗PD-L1抗体治疗
如所示，通过尾部静脉注射1x 107-9感染单位(IU)的病毒对小鼠进行静脉内免疫接种。以0.1-1x 106个细胞/200μl之间的量在侧腹皮下注射NY-ESO-1转基因HHD-肉瘤细胞系或CT26结直肠癌或TC-1(表达HPV 16E7)细胞系。注射前对细胞系进行支原体检测，并且仅使用支原体阴性细胞。
在肿瘤激发后监测小鼠，当可触及时，使用数字卡尺每1-2天测量肿瘤直径，并使用改进的椭圆公式计算体积，体积＝(宽度)2x长度/2，以确定肿瘤的生长速率。
对于治疗性激发研究，首先在小鼠侧腹皮下植入肿瘤细胞——6-7天后，通过尾静脉以1x 107-9IU的相关腺病毒载体对动物进行静脉内免疫接种，并如前所述测量肿瘤。在一些实验中，在肿瘤植入后第14、17、20和22天通过静脉注射用0.2mg抗小鼠PD-L1(克隆10F.9G2，Biolegend)或同种型对照治疗小鼠。
从血液和组织中分离淋巴细胞
使用酶消化和机械消化处理血液、脾和肿瘤样品以获得具有高活力的淋巴细胞群。切除肿瘤，然后在37℃用胶原酶和DNA酶消化45分钟。消化的肿瘤通过100μm细胞筛，然后用完全RPMI洗涤，并通过在1500rpm离心5分钟来沉淀。将细胞沉淀重新悬浮，然后通过40μm细胞筛，然后像以前一样洗涤和沉淀。然后将分离的肿瘤细胞重新悬浮并计数。
肿瘤和疫苗特异性T细胞的检测和分析
用于检测病毒和疫苗特异性T细胞的四聚体和五聚体的详细信息如表2所示。
表2
Figure BDA0003697620930000441
Figure BDA0003697620930000451
表2中列出的试剂作为单体合成并通过添加链霉亲和素-PE(BD Bioscience)或链霉亲和素-APC(Invitrogen，Paisley，UK)进行四聚化。用于构建单体的肽获自Proimmune(牛津，UK)。使用50μl含有I类四聚体肽复合物的溶液在37℃下对约50μl全血等分试样染色20分钟，然后用mAb和可固定的NIR LIVE/DEAD染色剂染色。
抗体染色
用FcR封闭试剂(CD16/CD32，eBiosciences)封闭单细胞悬浮液(4℃，20分钟)以防止非特异性抗体结合。随后，用四聚体(如上所述)和各种荧光染料缀合抗体(4℃，20分钟)对细胞进行免疫染色。在所有抗体组中，添加了可固定活力染料(LIVE/DEADTM近红外染料(Invitrogen))以从分析中排除死细胞。以下抗体以1:100的浓度用于流式细胞术(例外情况在列表中进行了标记)：CD4-AF700(RMA4-4，Biolegend)、CD8(53-6.7eBiosciences或Biolegend)、CD11a/CD18/LFA-1(H155-78，Biolegend)、CD25(PC61.5，eBiosciences)、CD27(LF.3A10，Biolegend)、CD44(IM7，eBiosciences)、CD62L(MEL-14，Biolegend)、CD69(H1.2F3，Biolegend，1/200)、CD95/Fas(Jo2 BD)、CD103(2E7，Biolegend，1/200)、CD127(SB/199，Biolegend)、CD279/PD-1(RMP1-30，Biolegend)、CX3CR1(SA011F11，Biolegend)、FoxP3(FJK-16s，eBiosciences)、IFN-γ(XMG1.2，eBiosciences)、IL-2(JES6-5H4，eBiosciences)、KLRG1(2F1，abcam)、TNF-α(MP6-XT22，eBiosciences)。在细胞内染色所需的单细胞样品(使用FoxP3/转录因子染色缓冲液组，Invitrogen)的固定和透化之前，进行细胞外染色。对于细胞内细胞因子染色，用肽(4μg/ml)连同阳性(2μg/ml的PMA和4.4μg/ml的IO)和阴性(仅培养基)对照离体刺激源自肿瘤或脾的单细胞2.5小时，之后将细胞与GolgiPlug(BD，1μl/ml)在37℃下孵育4.5小时。
使用的抗体列于下表。除非另有说明，否则这些均以1:100稀释度使用。表3：
Figure BDA0003697620930000471
Figure BDA0003697620930000481
Figure BDA0003697620930000491
流式细胞术
使用BD LSR II流式细胞仪通过流式细胞术分析所有免疫染色的样品。使用软件FlowJo v10进行数据分析。在淋巴细胞、单细胞、活细胞和随后的相关标志物上门控细胞以进行分析。
CellROX红测定
从先前用MCMV或Ad-lacZ感染>50的CX3CR1gfp/+或gfp/gfp小鼠制备单细胞脾细胞。将脾细胞铺板(plate)到96孔板中并在完全培养基(RPMI+10％FCS)中培养48小时。将细胞快速离心并用200μl无菌DPBS(Life Technologies)洗涤。然后用无血清RPMI或RPM+10％FCS(每孔添加40μl)处理细胞。将这些在37℃孵育1-1.5小时。CellROX红试剂(LifeTechnologies)用无血清培养基按1:50稀释，然后向每个孔中添加4μl稀释的试剂，并在37℃孵育40分钟。然后用适当的表面抗体(适当的四聚体-PE、CD8-eFluor 450、CD62L-AlexaFluor 700、CD44-PerCP-Cy5.5和可固定的活死标志物)在37℃将细胞染色20分钟。用PBS洗涤细胞，然后重悬浮在PBS中，并在LSRII上分析，在FlowJo软件上计算活CD8 T细胞上的CellROX红的几何平均值。
MitoTracker测定
用抗小鼠CD8、抗小鼠CX3CR1、活死近红外可固定标志物染色来自先前用MCMV或AdHu5重组腺病毒载体(Ad-I8V)感染>100天的C57BL/6小鼠的PBL。在表面染色之前，在37℃用12.5nm MitoTracker绿和12.5nm MitoTracker深红(Fisher Scientific)染色30分钟，然后在LSRII上进行分析，并在FlowJo上计算数据。
统计分析
使用GraphPad PRISM(Graphpad software,Inc.，La Jolla，CA)计算描述性统计数据(百分比平均值、标准差、计数)。用于比较平均值的P值通过T检验、单向和双向ANOVA确定，并使用Holm-Sidak进行校正以进行多重比较。统计学显著性定义为p<0.05。
重组AAV-小基因的生产方法
通过用三种质粒转染HEK293细胞将产生编码感兴趣的小基因的重组AAV：(1)含有感兴趣的小基因的AAV-ITR质粒[AAV-ITR-小基因]，(2)编码AAV复制所需的E2A、E4和VA腺病毒蛋白的腺病毒辅助质粒和(3)编码AAV的将AAV-ITR-小基因包装在AAV病毒颗粒内所需的rep和cap基因的辅助质粒。
载体序列：
以下提供了可用于本发明载体中的示例性序列。
SEQ ID NO:13小基因免疫原盒5’的AdHu5腺病毒核苷酸序列：
SEQ ID NO:14小基因免疫原盒3’的AdHu5腺病毒核苷酸序列：
小基因免疫原盒：
SEQ ID NO:15T细胞表位5’的小基因免疫原盒核苷酸序列
T细胞表位序列5’的小基因免疫原盒核苷酸序列
SEQ ID NO:16attR1序列
SEQ ID NO:17attL1序列
SEQ ID NO:18CMV启动子序列
SEQ ID NO:19Kozak序列
SEQ ID NO:20起始密码子
T细胞表位：
SEQ ID NO:2NY-ESO-1表位
SEQ ID NO:21智人密码子优化的NY-ESO-1表位核苷酸序列
SEQ ID NO:1AH1表位
SEQ ID NO:22小家鼠密码子优化的AH1表位核苷酸序列
SEQ ID NO:3GSW11表位
SEQ ID NO:23小家鼠密码子优化的GSW11表位核苷酸序列
SEQ ID NO:4e2f8表位
SEQ ID NO:24小家鼠密码子优化的e2f8表位核苷酸序列
SEQ ID NO:5Mtch1-10mer表位
SEQ ID NO:25小家鼠密码子优化的Mtch1-10mer表位核苷酸序列
SEQ ID NO:6Mtch1-9mer表位
SEQ ID NO:26小家鼠密码子优化的Mtch1-9mer表位核苷酸序列
SEQ ID NO:8I8V表位
SEQ ID NO:27小家鼠密码子优化的I8V表位核苷酸序列
SEQ ID NO:9pp89表位
SEQ ID NO:28小家鼠密码子优化的pp89表位核苷酸序列
SEQ ID NO:10M45表位
SEQ ID NO:29小家鼠密码子优化的M45表位核苷酸序列
SEQ ID NO:11M38表位
SEQ ID NO:30小家鼠密码子优化的M38表位核苷酸序列
SEQ ID NO:12m139表位
SEQ ID NO:31小家鼠密码子优化的m139表位核苷酸序列
SEQ ID NO:7HPV16 E749-57表位
SEQ ID NO:32小家鼠密码子优化的HPV16 E749-57表位核苷酸序列
SEQ ID NO:33T细胞表位序列3’的小基因免疫原盒核苷酸序列
T细胞表位序列3’的小基因免疫原盒核苷酸序列：
终止密码子
SEQ ID NO:34BGH聚A序列
SEQ ID NO:35attL2序列
SEQ ID NO:36attR2序列
上述小基因免疫原盒可与AAV载体一起使用。例如，可以使用包含反向末端重复的AAV载体。下面提供了示例序列。
SEQ ID NO:38小基因免疫原盒5’的AAV核苷酸序列
小基因免疫原盒5’的AAV核苷酸序列的描述：
SEQ ID NO:39 5’ITR核苷酸序列
SEQ ID NO:40小基因免疫原盒5’的额外序列
SEQ ID NO:41小基因免疫原盒3’的AAV腺病毒核苷酸序列
小基因免疫原盒3’的AAV腺病毒核苷酸序列的描述：
SEQ ID NO:42 3’ITR核苷酸序列
SEQ ID NO:43小基因免疫原盒的3’的5’额外序列
序列表
<110> 癌症研究科技有限公司
<120> 载体
<130> P36539WO1
<150> GB 1914984.8
<151> 2019-10-16
<150> GB 2009420.7
<151> 2020-06-19
<160> 43
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠白血病病毒
<400> 1
Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠白血病病毒
<400> 3
Gly Gly Pro Glu Ser Phe Tyr Cys Ala Ser Trp
1 5 10
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Val Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro
20 25
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 7
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 8
Ile Cys Pro Met Tyr Ala Arg Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠巨细胞病毒
<400> 9
Tyr Pro His Phe Met Pro Thr Asn Leu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠巨细胞病毒
<400> 10
His Gly Ile Arg Asn Ala Ser Phe Ile
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠巨细胞病毒
<400> 11
Ser Ser Pro Pro Met Phe Arg Val
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠巨细胞病毒
<400> 12
Thr Trp Tyr Gly Phe Cys Leu Leu
1 5
<210> 13
<211> 511
<212> DNA
<213> 腺病毒AdHu5
<400> 13
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagtcgaag cttggatccg gtacctctag 480
aattctcgag cggccgctag cgacatcgat c 511
<210> 14
<211> 30566
<212> DNA
<213> 腺病毒AdHu5
<400> 14
gatcgattcg acagatcact gaaatgtgtg ggcgtggctt aagggtggga aagaatatat 60
aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct gttttgcagc agccgccgcc gccatgagca 120
ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct catatttgac aacgcgcatg cccccatggg 180
ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca gcattgatgg tcgccccgtc ctgcccgcaa 240
actctactac cttgacctac gagaccgtgt ctggaacgcc gttggagact gcagcctccg 300
ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc gcgggattgt gactgacttt gctttcctga 360
gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt catccgcccg cgatgacaag ttgacggctc 420
ttttggcaca attggattct ttgacccggg aacttaatgt cgtttctcag cagctgttgg 480
atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg cttcctcccc tcccaatgcg gtttaaaaca 540
taaataaaaa accagactct gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc tgtctttatt 600
taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg accagcggtc tcggtcgttg agggtcctgt 660
gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac tctggatgtt cagatacatg ggcataagcc 720
cgtctctggg gtggaggtag caccactgca gagcttcatg ctgcggggtg gtgttgtaga 780
tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt ggtgcctaaa aatgtctttc agtagcaagc 840
tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag tgtttacaaa gcggttaagc tgggatgggt 900
gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg actgtatttt taggttggct atgttcccag 960
ccatatccct ccggggattc atgttgtgca gaaccaccag cacagtgtat ccggtgcact 1020
tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa atgcgtggaa gaacttggag acgcccttgt 1080
gacctccaag attttccatg cattcgtcca taatgatggc aatgggccca cgggcggcgg 1140
cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa cgtcatagtt gtgttccagg atgagatcgt 1200
cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga gggtgccaga ctgcggtata atggttccat 1260
ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga tttgcatttc ccacgctttg agttcagatg 1320
gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga agaaaacggt ttccggggta ggggagatca 1380
gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct gcgacttacc gcagccggtg ggcccgtaaa 1440
tcacacctat taccgggtgc aactggtagt taagagagct gcagctgccg tcatccctga 1500
gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc tgactcgcat gttttccctg accaaatccg 1560
ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca gttcttgcaa ggaagcaaag tttttcaacg 1620
gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt tgagcgtttg accaagcagt tccaggcggt 1680
cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat ctcgatccag catatctcct cgtttcgcgg 1740
gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag tcggtgctcg tccagacggg ccagggtcat 1800
gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag cgtagtctgg gtcacggtga aggggtgcgc 1860
tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt gaggctggtc ctgctggtgc tgaagcgctg 1920
ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta gcatttgacc atggtgtcat agtccagccc 1980
ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt gcccttggag gaggcgccgc acgaggggca 2040
gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg cgcgagaaat accgattccg gggagtaggc 2100
atccgcgccg caggccccgc agacggtctc gcattccacg agccaggtga gctctggccg 2160
ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg ctttttgatg cgtttcttac ctctggtttc 2220
catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa aaggctgtcc gtgtccccgt atacagactt 2280
gagaggcctg tcctcgagcg gtgttccgcg gtcctcctcg tatagaaact cggaccactc 2340
tgagacaaag gctcgcgtcc aggccagcac gaaggaggct aagtgggagg ggtagcggtc 2400
gttgtccact agggggtcca ctcgctccag ggtgtgaaga cacatgtcgc cctcttcggc 2460
atcaaggaag gtgattggtt tgtaggtgta ggccacgtga ccgggtgttc ctgaaggggg 2520
gctataaaag ggggtggggg cgcgttcgtc ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag 2580
ggccagctgt tggggtgagt actccctctg aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt 2640
gtcagtttcc aaaaacgagg aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag 2700
ggtggccgca tccatctggt cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tggtggcaaa 2760
cgacccgtag agggcgttgg acagcaactt ggcgatggag cgcagggttt ggtttttgtc 2820
gcgatcggcg cgctccttgg ccgcgatgtt tagctgcacg tattcgcgcg caacgcaccg 2880
ccattcggga aagacggtgg tgcgctcgtc gggcaccagg tgcacgcgcc aaccgcggtt 2940
gtgcagggtg acaaggtcaa cgctggtggc tacctctccg cgtaggcgct cgttggtcca 3000
gcagaggcgg ccgcccttgc gcgagcagaa tggcggtagg gggtctagct gcgtctcgtc 3060
cggggggtct gcgtccacgg taaagacccc gggcagcagg cgcgcgtcga agtagtctat 3120
cttgcatcct tgcaagtcta gcgcctgctg ccatgcgcgg gcggcaagcg cgcgctcgta 3180
tgggttgagt gggggacccc atggcatggg gtgggtgagc gcggaggcgt acatgccgca 3240
aatgtcgtaa acgtagaggg gctctctgag tattccaaga tatgtagggt agcatcttcc 3300
accgcggatg ctggcgcgca cgtaatcgta tagttcgtgc gagggagcga ggaggtcggg 3360
accgaggttg ctacgggcgg gctgctctgc tcggaagact atctgcctga agatggcatg 3420
tgagttggat gatatggttg gacgctggaa gacgttgaag ctggcgtctg tgagacctac 3480
cgcgtcacgc acgaaggagg cgtaggagtc gcgcagcttg ttgaccagct cggcggtgac 3540
ctgcacgtct agggcgcagt agtccagggt ttccttgatg atgtcatact tatcctgtcc 3600
cttttttttc cacagctcgc ggttgaggac aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg 3660
gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta agagcctagc atgtagaact ggttgacggc 3720
ctggtaggcg cagcatccct tttctacggg tagcgcgtat gcctgcgcgg ccttccggag 3780
cgaggtgtgg gtgagcgcaa aggtgtccct gaccatgact ttgaggtact ggtatttgaa 3840
gtcagtgtcg tcgcatccgc cctgctccca gagcaaaaag tccgtgcgct ttttggaacg 3900
cggatttggc agggcgaagg tgacatcgtt gaagagtatc tttcccgcgc gaggcataaa 3960
gttgcgtgtg atgcggaagg gtcccggcac ctcggaacgg ttgttaatta cctgggcggc 4020
gagcacgatc tcgtcaaagc cgttgatgtt gtggcccaca atgtaaagtt ccaagaagcg 4080
cgggatgccc ttgatggaag gcaatttttt aagttcctcg taggtgagct cttcagggga 4140
gctgagcccg tgctctgaaa gggcccagtc tgcaagatga gggttggaag cgacgaatga 4200
gctccacagg tcacgggcca ttagcatttg caggtggtcg cgaaaggtcc taaactggcg 4260
acctatggcc attttttctg gggtgatgca gtagaaggta agcgggtctt gttcccagcg 4320
gtcccatcca aggttcgcgg ctaggtctcg cgcggcagtc actagaggct catctccgcc 4380
gaacttcatg accagcatga agggcacgag ctgcttccca aaggccccca tccaagtata 4440
ggtctctaca tcgtaggtga caaagagacg ctcggtgcga ggatgcgagc cgatcgggaa 4500
gaactggatc tcccgccacc aattggagga gtggctattg atgtggtgaa agtagaagtc 4560
cctgcgacgg gccgaacact cgtgctggct tttgtaaaaa cgtgcgcagt actggcagcg 4620
gtgcacgggc tgtacatcct gcacgaggtt gacctgacga ccgcgcacaa ggaagcagag 4680
tgggaatttg agcccctcgc ctggcgggtt tggctggtgg tcttctactt cggctgcttg 4740
tccttgaccg tctggctgct cgaggggagt tacggtggat cggaccacca cgccgcgcga 4800
gcccaaagtc cagatgtccg cgcgcggcgg tcggagcttg atgacaacat cgcgcagatg 4860
ggagctgtcc atggtctgga gctcccgcgg cgtcaggtca ggcgggagct cctgcaggtt 4920
tacctcgcat agacgggtca gggcgcgggc tagatccagg tgatacctaa tttccagggg 4980
ctggttggtg gcggcgtcga tggcttgcaa gaggccgcat ccccgcggcg cgactacggt 5040
accgcgcggc gggcggtggg ccgcgggggt gtccttggat gatgcatcta aaagcggtga 5100
cgcgggcgag cccccggagg tagggggggc tccggacccg ccgggagagg gggcaggggc 5160
acgtcggcgc cgcgcgcggg caggagctgg tgctgcgcgc gtaggttgct ggcgaacgcg 5220
acgacgcggc ggttgatctc ctgaatctgg cgcctctgcg tgaagacgac gggcccggtg 5280
agcttgagcc tgaaagagag ttcgacagaa tcaatttcgg tgtcgttgac ggcggcctgg 5340
cgcaaaatct cctgcacgtc tcctgagttg tcttgatagg cgatctcggc catgaactgc 5400
tcgatctctt cctcctggag atctccgcgt ccggctcgct ccacggtggc ggcgaggtcg 5460
ttggaaatgc gggccatgag ctgcgagaag gcgttgaggc ctccctcgtt ccagacgcgg 5520
ctgtagacca cgcccccttc ggcatcgcgg gcgcgcatga ccacctgcgc gagattgagc 5580
tccacgtgcc gggcgaagac ggcgtagttt cgcaggcgct gaaagaggta gttgagggtg 5640
gtggcggtgt gttctgccac gaagaagtac ataacccagc gtcgcaacgt ggattcgttg 5700
atatccccca aggcctcaag gcgctccatg gcctcgtaga agtccacggc gaagttgaaa 5760
aactgggagt tgcgcgccga cacggttaac tcctcctcca gaagacggat gagctcggcg 5820
acagtgtcgc gcacctcgcg ctcaaaggct acaggggcct cttcttcttc ttcaatctcc 5880
tcttccataa gggcctcccc ttcttcttct tctggcggcg gtgggggagg ggggacacgg 5940
cggcgacgac ggcgcaccgg gaggcggtcg acaaagcgct cgatcatctc cccgcggcga 6000
cggcgcatgg tctcggtgac ggcgcggccg ttctcgcggg ggcgcagttg gaagacgccg 6060
cccgtcatgt cccggttatg ggttggcggg gggctgccat gcggcaggga tacggcgcta 6120
acgatgcatc tcaacaattg ttgtgtaggt actccgccgc cgagggacct gagcgagtcc 6180
gcatcgaccg gatcggaaaa cctctcgaga aaggcgtcta accagtcaca gtcgcaaggt 6240
aggctgagca ccgtggcggg cggcagcggg cggcggtcgg ggttgtttct ggcggaggtg 6300
ctgctgatga tgtaattaaa gtaggcggtc ttgagacggc ggatggtcga cagaagcacc 6360
atgtccttgg gtccggcctg ctgaatgcgc aggcggtcgg ccatgcccca ggcttcgttt 6420
tgacatcggc gcaggtcttt gtagtagtct tgcatgagcc tttctaccgg cacttcttct 6480
tctccttcct cttgtcctgc atctcttgca tctatcgctg cggcggcggc ggagtttggc 6540
cgtaggtggc gccctcttcc tcccatgcgt gtgaccccga agcccctcat cggctgaagc 6600
agggctaggt cggcgacaac gcgctcggct aatatggcct gctgcacctg cgtgagggta 6660
gactggaagt catccatgtc cacaaagcgg tggtatgcgc ccgtgttgat ggtgtaagtg 6720
cagttggcca taacggacca gttaacggtc tggtgacccg gctgcgagag ctcggtgtac 6780
ctgagacgcg agtaagccct cgagtcaaat acgtagtcgt tgcaagtccg caccaggtac 6840
tggtatccca ccaaaaagtg cggcggcggc tggcggtaga ggggccagcg tagggtggcc 6900
ggggctccgg gggcgagatc ttccaacata aggcgatgat atccgtagat gtacctggac 6960
atccaggtga tgccggcggc ggtggtggag gcgcgcggaa agtcgcggac gcggttccag 7020
atgttgcgca gcggcaaaaa gtgctccatg gtcgggacgc tctggccggt caggcgcgcg 7080
caatcgttga cgctctagac cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg 7140
tctggtggat aaattcgcaa gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgag ccccgtatcc 7200
ggccgtccgc cgtgatccat gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc 7260
agacaacggg ggagtgctcc ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct 7320
tttttggcca ctggccgcgc gcagcgtaag cggttaggct ggaaagcgaa agcattaagt 7380
ggctcgctcc ctgtagccgg agggttattt tccaagggtt gagtcgcggg acccccggtt 7440
cgagtctcgg accggccgga ctgcggcgaa cgggggtttg cctccccgtc atgcaagacc 7500
ccgcttgcaa attcctccgg aaacagggac gagccccttt tttgcttttc ccagatgcat 7560
ccggtgctgc ggcagatgcg cccccctcct cagcagcggc aagagcaaga gcagcggcag 7620
acatgcaggg caccctcccc tcctcctacc gcgtcaggag gggcgacatc cgcggttgac 7680
gcggcagcag atggtgatta cgaacccccg cggcgccggg cccggcacta cctggacttg 7740
gaggagggcg agggcctggc gcggctagga gcgccctctc ctgagcggta cccaagggtg 7800
cagctgaagc gtgatacgcg tgaggcgtac gtgccgcggc agaacctgtt tcgcgaccgc 7860
gagggagagg agcccgagga gatgcgggat cgaaagttcc acgcagggcg cgagctgcgg 7920
catggcctga atcgcgagcg gttgctgcgc gaggaggact ttgagcccga cgcgcgaacc 7980
gggattagtc ccgcgcgcgc acacgtggcg gccgccgacc tggtaaccgc atacgagcag 8040
acggtgaacc aggagattaa ctttcaaaaa agctttaaca accacgtgcg tacgcttgtg 8100
gcgcgcgagg aggtggctat aggactgatg catctgtggg actttgtaag cgcgctggag 8160
caaaacccaa atagcaagcc gctcatggcg cagctgttcc ttatagtgca gcacagcagg 8220
gacaacgagg cattcaggga tgcgctgcta aacatagtag agcccgaggg ccgctggctg 8280
ctcgatttga taaacatcct gcagagcata gtggtgcagg agcgcagctt gagcctggct 8340
gacaaggtgg ccgccatcaa ctattccatg cttagcctgg gcaagtttta cgcccgcaag 8400
atataccata ccccttacgt tcccatagac aaggaggtaa agatcgaggg gttctacatg 8460
cgcatggcgc tgaaggtgct taccttgagc gacgacctgg gcgtttatcg caacgagcgc 8520
atccacaagg ccgtgagcgt gagccggcgg cgcgagctca gcgaccgcga gctgatgcac 8580
agcctgcaaa gggccctggc tggcacgggc agcggcgata gagaggccga gtcctacttt 8640
gacgcgggcg ctgacctgcg ctgggcccca agccgacgcg ccctggaggc agctggggcc 8700
ggacctgggc tggcggtggc acccgcgcgc gctggcaacg tcggcggcgt ggaggaatat 8760
gacgaggacg atgagtacga gccagaggac ggcgagtact aagcggtgat gtttctgatc 8820
agatgatgca agacgcaacg gacccggcgg tgcgggcggc gctgcagagc cagccgtccg 8880
gccttaactc cacggacgac tggcgccagg tcatggaccg catcatgtcg ctgactgcgc 8940
gcaatcctga cgcgttccgg cagcagccgc aggccaaccg gctctccgca attctggaag 9000
cggtggtccc ggcgcgcgca aaccccacgc acgagaaggt gctggcgatc gtaaacgcgc 9060
tggccgaaaa cagggccatc cggcccgacg aggccggcct ggtctacgac gcgctgcttc 9120
agcgcgtggc tcgttacaac agcggcaacg tgcagaccaa cctggaccgg ctggtggggg 9180
atgtgcgcga ggccgtggcg cagcgtgagc gcgcgcagca gcagggcaac ctgggctcca 9240
tggttgcact aaacgccttc ctgagtacac agcccgccaa cgtgccgcgg ggacaggagg 9300
actacaccaa ctttgtgagc gcactgcggc taatggtgac tgagacaccg caaagtgagg 9360
tgtaccagtc tgggccagac tattttttcc agaccagtag acaaggcctg cagaccgtaa 9420
acctgagcca ggctttcaaa aacttgcagg ggctgtgggg ggtgcgggct cccacaggcg 9480
accgcgcgac cgtgtctagc ttgctgacgc ccaactcgcg cctgttgctg ctgctaatag 9540
cgcccttcac ggacagtggc agcgtgtccc gggacacata cctaggtcac ttgctgacac 9600
tgtaccgcga ggccataggt caggcgcatg tggacgagca tactttccag gagattacaa 9660
gtgtcagccg cgcgctgggg caggaggaca cgggcagcct ggaggcaacc ctaaactacc 9720
tgctgaccaa ccggcggcag aagatcccct cgttgcacag tttaaacagc gaggaggagc 9780
gcattttgcg ctacgtgcag cagagcgtga gccttaacct gatgcgcgac ggggtaacgc 9840
ccagcgtggc gctggacatg accgcgcgca acatggaacc gggcatgtat gcctcaaacc 9900
ggccgtttat caaccgccta atggactact tgcatcgcgc ggccgccgtg aaccccgagt 9960
atttcaccaa tgccatcttg aacccgcact ggctaccgcc ccctggtttc tacaccgggg 10020
gattcgaggt gcccgagggt aacgatggat tcctctggga cgacatagac gacagcgtgt 10080
tttccccgca accgcagacc ctgctagagt tgcaacagcg cgagcaggca gaggcggcgc 10140
tgcgaaagga aagcttccgc aggccaagca gcttgtccga tctaggcgct gcggccccgc 10200
ggtcagatgc tagtagccca tttccaagct tgatagggtc tcttaccagc actcgcacca 10260
cccgcccgcg cctgctgggc gaggaggagt acctaaacaa ctcgctgctg cagccgcagc 10320
gcgaaaaaaa cctgcctccg gcatttccca acaacgggat agagagccta gtggacaaga 10380
tgagtagatg gaagacgtac gcgcaggagc acagggacgt gccaggcccg cgcccgccca 10440
cccgtcgtca aaggcacgac cgtcagcggg gtctggtgtg ggaggacgat gactcggcag 10500
acgacagcag cgtcctggat ttgggaggga gtggcaaccc gtttgcgcac cttcgcccca 10560
ggctggggag aatgttttaa aaaaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa ctcaccaagg 10620
ccatggcacc gagcgttggt tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg cggcgatgta 10680
tgaggaaggt cctcctccct cctacgagag tgtggtgagc gcggcgccag tggcggcggc 10740
gctgggttct cccttcgatg ctcccctgga cccgccgttt gtgcctccgc ggtacctgcg 10800
gcctaccggg gggagaaaca gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat tcgacaccac 10860
ccgtgtgtac ctggtggaca acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact accagaacga 10920
ccacagcaac tttctgacca cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg gggaggcaag 10980
cacacagacc atcaatcttg acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga aaaccatcct 11040
gcataccaac atgccaaatg tgaacgagtt catgtttacc aataagttta aggcgcgggt 11100
gatggtgtcg cgcttgccta ctaaggacaa tcaggtggag ctgaaatacg agtgggtgga 11160
gttcacgctg cccgagggca actactccga gaccatgacc atagacctta tgaacaacgc 11220
gatcgtggag cactacttga aagtgggcag acagaacggg gttctggaaa gcgacatcgg 11280
ggtaaagttt gacacccgca acttcagact ggggtttgac cccgtcactg gtcttgtcat 11340
gcctggggta tatacaaacg aagccttcca tccagacatc attttgctgc caggatgcgg 11400
ggtggacttc acccacagcc gcctgagcaa cttgttgggc atccgcaagc ggcaaccctt 11460
ccaggagggc tttaggatca cctacgatga tctggagggt ggtaacattc ccgcactgtt 11520
ggatgtggac gcctaccagg cgagcttgaa agatgacacc gaacagggcg ggggtggcgc 11580
aggcggcagc aacagcagtg gcagcggcgc ggaagagaac tccaacgcgg cagccgcggc 11640
aatgcagccg gtggaggaca tgaacgatca tgccattcgc ggcgacacct ttgccacacg 11700
ggctgaggag aagcgcgctg aggccgaagc agcggccgaa gctgccgccc ccgctgcgca 11760
acccgaggtc gagaagcctc agaagaaacc ggtgatcaaa cccctgacag aggacagcaa 11820
gaaacgcagt tacaacctaa taagcaatga cagcaccttc acccagtacc gcagctggta 11880
ccttgcatac aactacggcg accctcagac cggaatccgc tcatggaccc tgctttgcac 11940
tcctgacgta acctgcggct cggagcaggt ctactggtcg ttgccagaca tgatgcaaga 12000
ccccgtgacc ttccgctcca cgcgccagat cagcaacttt ccggtggtgg gcgccgagct 12060
gttgcccgtg cactccaaga gcttctacaa cgaccaggcc gtctactccc aactcatccg 12120
ccagtttacc tctctgaccc acgtgttcaa tcgctttccc gagaaccaga ttttggcgcg 12180
cccgccagcc cccaccatca ccaccgtcag tgaaaacgtt cctgctctca cagatcacgg 12240
gacgctaccg ctgcgcaaca gcatcggagg agtccagcga gtgaccatta ctgacgccag 12300
acgccgcacc tgcccctacg tttacaaggc cctgggcata gtctcgccgc gcgtcctatc 12360
gagccgcact ttttgagcaa gcatgtccat ccttatatcg cccagcaata acacaggctg 12420
gggcctgcgc ttcccaagca agatgtttgg cggggccaag aagcgctccg accaacaccc 12480
agtgcgcgtg cgcgggcact accgcgcgcc ctggggcgcg cacaaacgcg gccgcactgg 12540
gcgcaccacc gtcgatgacg ccatcgacgc ggtggtggag gaggcgcgca actacacgcc 12600
cacgccgcca ccagtgtcca cagtggacgc ggccattcag accgtggtgc gcggagcccg 12660
gcgctatgct aaaatgaaga gacggcggag gcgcgtagca cgtcgccacc gccgccgacc 12720
cggcactgcc gcccaacgcg cggcggcggc cctgcttaac cgcgcacgtc gcaccggccg 12780
acgggcggcc atgcgggccg ctcgaaggct ggccgcgggt attgtcactg tgccccccag 12840
gtccaggcga cgagcggccg ccgcagcagc cgcggccatt agtgctatga ctcagggtcg 12900
caggggcaac gtgtattggg tgcgcgactc ggttagcggc ctgcgcgtgc ccgtgcgcac 12960
ccgccccccg cgcaactaga ttgcaagaaa aaactactta gactcgtact gttgtatgta 13020
tccagcggcg gcggcgcgca acgaagctat gtccaagcgc aaaatcaaag aagagatgct 13080
ccaggtcatc gcgccggaga tctatggccc cccgaagaag gaagagcagg attacaagcc 13140
ccgaaagcta aagcgggtca aaaagaaaaa gaaagatgat gatgatgaac ttgacgacga 13200
ggtggaactg ctgcacgcta ccgcgcccag gcgacgggta cagtggaaag gtcgacgcgt 13260
aaaacgtgtt ttgcgacccg gcaccaccgt agtctttacg cccggtgagc gctccacccg 13320
cacctacaag cgcgtgtatg atgaggtgta cggcgacgag gacctgcttg agcaggccaa 13380
cgagcgcctc ggggagtttg cctacggaaa gcggcataag gacatgctgg cgttgccgct 13440
ggacgagggc aacccaacac ctagcctaaa gcccgtaaca ctgcagcagg tgctgcccgc 13500
gcttgcaccg tccgaagaaa agcgcggcct aaagcgcgag tctggtgact tggcacccac 13560
cgtgcagctg atggtaccca agcgccagcg actggaagat gtcttggaaa aaatgaccgt 13620
ggaacctggg ctggagcccg aggtccgcgt gcggccaatc aagcaggtgg cgccgggact 13680
gggcgtgcag accgtggacg ttcagatacc cactaccagt agcaccagta ttgccaccgc 13740
cacagagggc atggagacac aaacgtcccc ggttgcctca gcggtggcgg atgccgcggt 13800
gcaggcggtc gctgcggccg cgtccaagac ctctacggag gtgcaaacgg acccgtggat 13860
gtttcgcgtt tcagcccccc ggcgcccgcg cggttcgagg aagtacggcg ccgccagcgc 13920
gctactgccc gaatatgccc tacatccttc cattgcgcct acccccggct atcgtggcta 13980
cacctaccgc cccagaagac gagcaactac ccgacgccga accaccactg gaacccgccg 14040
ccgccgtcgc cgtcgccagc ccgtgctggc cccgatttcc gtgcgcaggg tggctcgcga 14100
aggaggcagg accctggtgc tgccaacagc gcgctaccac cccagcatcg tttaaaagcc 14160
ggtctttgtg gttcttgcag atatggccct cacctgccgc ctccgtttcc cggtgccggg 14220
attccgagga agaatgcacc gtaggagggg catggccggc cacggcctga cgggcggcat 14280
gcgtcgtgcg caccaccggc ggcggcgcgc gtcgcaccgt cgcatgcgcg gcggtatcct 14340
gcccctcctt attccactga tcgccgcggc gattggcgcc gtgcccggaa ttgcatccgt 14400
ggccttgcag gcgcagagac actgattaaa aacaagttgc atgtggaaaa atcaaaataa 14460
aaagtctgga ctctcacgct cgcttggtcc tgtaactatt ttgtagaatg gaagacatca 14520
actttgcgtc tctggccccg cgacacggct cgcgcccgtt catgggaaac tggcaagata 14580
tcggcaccag caatatgagc ggtggcgcct tcagctgggg ctcgctgtgg agcggcatta 14640
aaaatttcgg ttccaccgtt aagaactatg gcagcaaggc ctggaacagc agcacaggcc 14700
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cctctggcat tagcggggtg gtggacctgg ccaaccaggc agtgcaaaat aagattaaca 14820
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gtcctagccg cgcgtccctg cgccgcgccg ccagcggtcc gcgatcgttg cggcccgtag 15180
ccagtggcaa ctggcaaagc acactgaaca gcatcgtggg tctgggggtg caatccctga 15240
agcgccgacg atgcttctga atagctaacg tgtcgtatgt gtgtcatgta tgcgtccatg 15300
tcgccgccag aggagctgct gagccgccgc gcgcccgctt tccaagatgg ctaccccttc 15360
gatgatgccg cagtggtctt acatgcacat ctcgggccag gacgcctcgg agtacctgag 15420
ccccgggctg gtgcagtttg cccgcgccac cgagacgtac ttcagcctga ataacaagtt 15480
tagaaacccc acggtggcgc ctacgcacga cgtgaccaca gaccggtccc agcgtttgac 15540
gctgcggttc atccctgtgg accgtgagga tactgcgtac tcgtacaagg cgcggttcac 15600
cctagctgtg ggtgataacc gtgtgctgga catggcttcc acgtactttg acatccgcgg 15660
cgtgctggac aggggcccta cttttaagcc ctactctggc actgcctaca acgccctggc 15720
tcccaagggt gccccaaatc cttgcgaatg ggatgaagct gctactgctc ttgaaataaa 15780
cctagaagaa gaggacgatg acaacgaaga cgaagtagac gagcaagctg agcagcaaaa 15840
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aataggtgtc gaaggtcaaa cacctaaata tgccgataaa acatttcaac ctgaacctca 15960
aataggagaa tctcagtggt acgaaactga aattaatcat gcagctggga gagtccttaa 16020
aaagactacc ccaatgaaac catgttacgg ttcatatgca aaacccacaa atgaaaatgg 16080
agggcaaggc attcttgtaa agcaacaaaa tggaaagcta gaaagtcaag tggaaatgca 16140
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attgtacagt gaagatgtag atatagaaac cccagacact catatttctt acatgcccac 16260
tattaaggaa ggtaactcac gagaactaat gggccaacaa tctatgccca acaggcctaa 16320
ttacattgct tttagggaca attttattgg tctaatgtat tacaacagca cgggtaatat 16380
gggtgttctg gcgggccaag catcgcagtt gaatgctgtt gtagatttgc aagacagaaa 16440
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tatgtggaat caggctgttg acagctatga tccagatgtt agaattattg aaaatcatgg 16560
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tcttaccaag gtaaaaccta aaacaggtca ggaaaatgga tgggaaaaag atgctacaga 16680
attttcagat aaaaatgaaa taagagttgg aaataatttt gccatggaaa tcaatctaaa 16740
tgccaacctg tggagaaatt tcctgtactc caacatagcg ctgtatttgc ccgacaagct 16800
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ccgctcaatg ttgctgggca atggtcgcta tgtgcccttc cacatccagg tgcctcagaa 17040
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tcctcgttca gccaggtctt gcatacggcc gccagagctt ccacttggtc aggcagtagt 19920
ttgaagttcg cctttagatc gttatccacg tggtacttgt ccatcagcgc gcgcgcagcc 19980
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gggtcgtctt cattcagccg ccgcactgtg cgcttacctc ctttgccatg cttgattagc 20160
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aacgcgccta ccaccttccc cgtcgaggca cccccgcttg aggaggagga agtgattatc 20700
gagcaggacc caggttttgt aagcgaagac gacgaggacc gctcagtacc aacagaggat 20760
aaaaagcaag accaggacaa cgcagaggca aacgaggaac aagtcgggcg gggggacgaa 20820
aggcatggcg actacctaga tgtgggagac gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag 20880
tgcgccatta tctgcgacgc gttgcaagag cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat 20940
gtcagccttg cctacgaacg ccacctattc tcaccgcgcg taccccccaa acgccaagaa 21000
aacggcacat gcgagcccaa cccgcgcctc aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag 21060
gtgcttgcca cctatcacat ctttttccaa aactgcaaga tacccctatc ctgccgtgcc 21120
aaccgcagcc gagcggacaa gcagctggcc ttgcggcagg gcgctgtcat acctgatatc 21180
gcctcgctca acgaagtgcc aaaaatcttt gagggtcttg gacgcgacga gaagcgcgcg 21240
gcaaacgctc tgcaacagga aaacagcgaa aatgaaagtc actctggagt gttggtggaa 21300
ctcgagggtg acaacgcgcg cctagccgta ctaaaacgca gcatcgaggt cacccacttt 21360
gcctacccgg cacttaacct accccccaag gtcatgagca cagtcatgag tgagctgatc 21420
gtgcgccgtg cgcagcccct ggagagggat gcaaatttgc aagaacaaac agaggagggc 21480
ctacccgcag ttggcgacga gcagctagcg cgctggcttc aaacgcgcga gcctgccgac 21540
ttggaggagc gacgcaaact aatgatggcc gcagtgctcg ttaccgtgga gcttgagtgc 21600
atgcagcggt tctttgctga cccggagatg cagcgcaagc tagaggaaac attgcactac 21660
acctttcgac agggctacgt acgccaggcc tgcaagatct ccaacgtgga gctctgcaac 21720
ctggtctcct accttggaat tttgcacgaa aaccgccttg ggcaaaacgt gcttcattcc 21780
acgctcaagg gcgaggcgcg ccgcgactac gtccgcgact gcgtttactt atttctatgc 21840
tacacctggc agacggccat gggcgtttgg cagcagtgct tggaggagtg caacctcaag 21900
gagctgcaga aactgctaaa gcaaaacttg aaggacctat ggacggcctt caacgagcgc 21960
tccgtggccg cgcacctggc ggacatcatt ttccccgaac gcctgcttaa aaccctgcaa 22020
cagggtctgc cagacttcac cagtcaaagc atgttgcaga actttaggaa ctttatccta 22080
gagcgctcag gaatcttgcc cgccacctgc tgtgcacttc ctagcgactt tgtgcccatt 22140
aagtaccgcg aatgccctcc gccgctttgg ggccactgct accttctgca gctagccaac 22200
taccttgcct accactctga cataatggaa gacgtgagcg gtgacggtct actggagtgt 22260
cactgtcgct gcaacctatg caccccgcac cgctccctgg tttgcaattc gcagctgctt 22320
aacgaaagtc aaattatcgg tacctttgag ctgcagggtc cctcgcctga cgaaaagtcc 22380
gcggctccgg ggttgaaact cactccgggg ctgtggacgt cggcttacct tcgcaaattt 22440
gtacctgagg actaccacgc ccacgagatt aggttctacg aagaccaatc ccgcccgcca 22500
aatgcggagc ttaccgcctg cgtcattacc cagggccaca ttcttggcca attgcaagcc 22560
atcaacaaag cccgccaaga gtttctgcta cgaaagggac ggggggttta cttggacccc 22620
cagtccggcg aggagctcaa cccaatcccc ccgccgccgc agccctatca gcagcagccg 22680
cgggcccttg cttcccagga tggcacccaa aaagaagctg cagctgccgc cgccacccac 22740
ggacgaggag gaatactggg acagtcaggc agaggaggtt ttggacgagg aggaggagga 22800
catgatggaa gactgggaga gcctagacga ggaagcttcc gaggtcgaag aggtgtcaga 22860
cgaaacaccg tcaccctcgg tcgcattccc ctcgccggcg ccccagaaat cggcaaccgg 22920
ttccagcatg gctacaacct ccgctcctca ggcgccgccg gcactgcccg ttcgccgacc 22980
caaccgtaga tgggacacca ctggaaccag ggccggtaag tccaagcagc cgccgccgtt 23040
agcccaagag caacaacagc gccaaggcta ccgctcatgg cgcgggcaca agaacgccat 23100
agttgcttgc ttgcaagact gtgggggcaa catctccttc gcccgccgct ttcttctcta 23160
ccatcacggc gtggccttcc cccgtaacat cctgcattac taccgtcatc tctacagccc 23220
atactgcacc ggcggcagcg gcagcggcag caacagcagc ggccacacag aagcaaaggc 23280
gaccggatag caagactctg acaaagccca agaaatccac agcggcggca gcagcaggag 23340
gaggagcgct gcgtctggcg cccaacgaac ccgtatcgac ccgcgagctt agaaacagga 23400
tttttcccac tctgtatgct atatttcaac agagcagggg ccaagaacaa gagctgaaaa 23460
taaaaaacag gtctctgcga tccctcaccc gcagctgcct gtatcacaaa agcgaagatc 23520
agcttcggcg cacgctggaa gacgcggagg ctctcttcag taaatactgc gcgctgactc 23580
ttaaggacta gtttcgcgcc ctttctcaaa tttaagcgcg aaaactacgt catctccagc 23640
ggccacaccc ggcgccagca cctgtcgtca gcgccattat gagcaaggaa attcccacgc 23700
cctacatgtg gagttaccag ccacaaatgg gacttgcggc tggagctgcc caagactact 23760
caacccgaat aaactacatg agcgcgggac cccacatgat atcccgggtc aacggaatcc 23820
gcgcccaccg aaaccgaatt ctcttggaac aggcggctat taccaccaca cctcgtaata 23880
accttaatcc ccgtagttgg cccgctgccc tggtgtacca ggaaagtccc gctcccacca 23940
ctgtggtact tcccagagac gcccaggccg aagttcagat gactaactca ggggcgcagc 24000
ttgcgggcgg ctttcgtcac agggtgcggt cgcccgggca gggtataact cacctgacaa 24060
tcagagggcg aggtattcag ctcaacgacg agtcggtgag ctcctcgctt ggtctccgtc 24120
cggacgggac atttcagatc ggcggcgccg gccgtccttc attcacgcct cgtcaggcaa 24180
tcctaactct gcagacctcg tcctctgagc cgcgctctgg aggcattgga actctgcaat 24240
ttattgagga gtttgtgcca tcggtctact ttaacccctt ctcgggacct cccggccact 24300
atccggatca atttattcct aactttgacg cggtaaagga ctcggcggac ggctacgact 24360
gaatgttaag tggagaggca gagcaactgc gcctgaaaca cctggtccac tgtcgccgcc 24420
acaagtgctt tgcccgcgac tccggtgagt tttgctactt tgaattgccc gaggatcata 24480
tcgagggccc ggcgcacggc gtccggctta ccgcccaggg agagcttgcc cgtagcctga 24540
ttcgggagtt tacccagcgc cccctgctag ttgagcggga caggggaccc tgtgttctca 24600
ctgtgatttg caactgtcct aaccttggat tacatcaaga tctttgttgc catctctgtg 24660
ctgagtataa taaatacaga aattaaaata tactggggct cctatcgcca tcctgtaaac 24720
gccaccgtct tcacccgccc aagcaaacca aggcgaacct tacctggtac ttttaacatc 24780
tctccctctg tgatttacaa cagtttcaac ccagacggag tgagtctacg agagaacctc 24840
tccgagctca gctactccat cagaaaaaac accaccctcc ttacctgccg ggaacgtacg 24900
agtgcgtcac cggccgctgc accacaccta ccgcctgacc gtaaaccaga ctttttccgg 24960
acagacctca ataactctgt ttaccagaac aggaggtgag cttagaaaac ccttagggta 25020
ttaggccaaa ggcgcagcta ctgtggggtt tatgaacaat tcaagcaact ctacgggcta 25080
ttctaattca ggtttctcta gaaatggacg gaattattac agagcagcgc ctgctagaaa 25140
gacgcagggc agcggccgag caacagcgca tgaatcaaga gctccaagac atggttaact 25200
tgcaccagtg caaaaggggt atcttttgtc tggtaaagca ggccaaagtc acctacgaca 25260
gtaataccac cggacaccgc cttagctaca agttgccaac caagcgtcag aaattggtgg 25320
tcatggtggg agaaaagccc attaccataa ctcagcactc ggtagaaacc gaaggctgca 25380
ttcactcacc ttgtcaagga cctgaggatc tctgcaccct tattaagacc ctgtgcggtc 25440
tcaaagatct tattcccttt aactaataaa aaaaaataat aaagcatcac ttacttaaaa 25500
tcagttagca aatttctgtc cagtttattc agcagcacct ccttgccctc ctcccagctc 25560
tggtattgca gcttcctcct ggctgcaaac tttctccaca atctaaatgg aatgtcagtt 25620
tcctcctgtt cctgtccatc cgcacccact atcttcatgt tgttgcagat gaagcgcgca 25680
agaccgtctg aagatacctt caaccccgtg tatccatatg acacggaaac cggtcctcca 25740
actgtgcctt ttcttactcc tccctttgta tcccccaatg ggtttcaaga gagtccccct 25800
ggggtactct ctttgcgcct atccgaacct ctagttacct ccaatggcat gcttgcgctc 25860
aaaatgggca acggcctctc tctggacgag gccggcaacc ttacctccca aaatgtaacc 25920
actgtgagcc cacctctcaa aaaaaccaag tcaaacataa acctggaaat atctgcaccc 25980
ctcacagtta cctcagaagc cctaactgtg gctgccgccg cacctctaat ggtcgcgggc 26040
aacacactca ccatgcaatc acaggccccg ctaaccgtgc acgactccaa acttagcatt 26100
gccacccaag gacccctcac agtgtcagaa ggaaagctag ccctgcaaac atcaggcccc 26160
ctcaccacca ccgatagcag tacccttact atcactgcct caccccctct aactactgcc 26220
actggtagct tgggcattga cttgaaagag cccatttata cacaaaatgg aaaactagga 26280
ctaaagtacg gggctccttt gcatgtaaca gacgacctaa acactttgac cgtagcaact 26340
ggtccaggtg tgactattaa taatacttcc ttgcaaacta aagttactgg agccttgggt 26400
tttgattcac aaggcaatat gcaacttaat gtagcaggag gactaaggat tgattctcaa 26460
aacagacgcc ttatacttga tgttagttat ccgtttgatg ctcaaaacca actaaatcta 26520
agactaggac agggccctct ttttataaac tcagcccaca acttggatat taactacaac 26580
aaaggccttt acttgtttac agcttcaaac aattccaaaa agcttgaggt taacctaagc 26640
actgccaagg ggttgatgtt tgacgctaca gccatagcca ttaatgcagg agatgggctt 26700
gaatttggtt cacctaatgc accaaacaca aatcccctca aaacaaaaat tggccatggc 26760
ctagaatttg attcaaacaa ggctatggtt cctaaactag gaactggcct tagttttgac 26820
agcacaggtg ccattacagt aggaaacaaa aataatgata agctaacttt gtggaccaca 26880
ccagctccat ctcctaactg tagactaaat gcagagaaag atgctaaact cactttggtc 26940
ttaacaaaat gtggcagtca aatacttgct acagtttcag ttttggctgt taaaggcagt 27000
ttggctccaa tatctggaac agttcaaagt gctcatctta ttataagatt tgacgaaaat 27060
ggagtgctac taaacaattc cttcctggac ccagaatatt ggaactttag aaatggagat 27120
cttactgaag gcacagccta tacaaacgct gttggattta tgcctaacct atcagcttat 27180
ccaaaatctc acggtaaaac tgccaaaagt aacattgtca gtcaagttta cttaaacgga 27240
gacaaaacta aacctgtaac actaaccatt acactaaacg gtacacagga aacaggagac 27300
acaactccaa gtgcatactc tatgtcattt tcatgggact ggtctggcca caactacatt 27360
aatgaaatat ttgccacatc ctcttacact ttttcataca ttgcccaaga ataaagaatc 27420
gtttgtgtta tgtttcaacg tgtttatttt tcaattgcag aaaatttcga atcatttttc 27480
attcagtagt atagccccac caccacatag cttatacaga tcaccgtacc ttaatcaaac 27540
tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 27600
ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 27660
tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 27720
gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 27780
ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 27840
atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 27900
ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 27960
ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 28020
agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 28080
gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 28140
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gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 28440
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atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 28680
aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa 28740
cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc 28800
actctctcaa agcatccagg cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact ccttcatgcg 28860
ccgctgccct gataacatcc accaccgcag aataagccac acccagccaa cctacacatt 28920
cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg tttttttttt 28980
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tctcgccacc ttctcaatat atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta 29280
aaaatctgct ccagagcgcc ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa 29340
attcaggttc ctcacagacc tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc 29400
gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca 29460
gcgcggccac ttccccgcca ggaaccttga caaaagaacc cacactgatt atgacacgca 29520
tactcggagc tatgctaacc agcgtagccc cgatgtaagc tttgttgcat gggcggcgat 29580
ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca 29640
tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac 29700
accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa 29760
aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa 29820
gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca 29880
ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag 29940
gttgattcac atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga atacataccc 30000
gcaggcgtag agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta ataggagaga 30060
aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca 30120
gaacaacata cagcgcttcc acagcggcag ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag 30180
aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa 30240
aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc 30300
acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc 30360
cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtcacttcc cattttaaga 30420
aaactacaat tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg 30480
ttcccacgcc ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc 30540
caaaataagg tatattattg atgatg 30566
<210> 15
<211> 2191
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工的
<400> 15
acaagtttgt acaaaaaagc aggctccacc atgggaaccc gcgttttgag atttctgtcg 60
ccgactaaat tcatgtcgcg cgatagtggt gtttatcgcc gatagagatg gcgatattgg 120
aaaaatcgat atttgaaaat atggcatatt gaaaatgtcg ccgatgtgag tttctgtgta 180
actgatatcg ccatttttcc aaaagtgatt tttgggcata cgcgatatct ggcgatagcg 240
cttatatcgt ttacggggga tggcgataga cgactttggt gacttgggcg attctgtgtg 300
tcgcaaatat cgcagtttcg atataggtga cagacgatat gaggctatat cgccgataga 360
ggcgacatca agctggcaca tggccaatgc atatcgatct atacattgaa tcaatattgg 420
ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta ttggccattg 480
catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc aacattaccg 540
ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 600
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 660
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tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 960
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 1020
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 1080
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agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt agtgaaccgt 1200
cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga 1260
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gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acccccttgg cttcttatgc atgctatact 1380
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agcctatagg tgtgggttat tgaccattat tgaccactcc cctattggtg acgatacttt 1500
ccattactaa tccataacat ggctctttgc cacaactctc tttattggct atatgccaat 1560
acactgtcct tcagagactg acacggactc tgtattttta caggatgggg tctcatttat 1620
tatttacaaa ttcacatata caacaccacc gtccccagtg cccgcagttt ttattaaaca 1680
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cgggcttgca ccgctgacgc atttggaaga cttaaggcag cggcagaaga agatgcaggc 1980
agctgagttg ttgtgttctg ataagagtca gaggtaactc ccgttgcggt gctgttaacg 2040
gtggagggca gtgtagtctg agcagtactc gttgctgccg cgcgcgccac cagacataat 2100
agctgacaga ctaacagact gttcctttcc atgggtcttt tctgcagtca ccgtccttga 2160
cacgaagctt ggtacccccg ccgccaccat g 2191
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> attR1序列
<400> 16
acaagttt 8
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> attL1序列
<400> 17
gtacaaaaaa gcaggct 17
<210> 18
<211> 2100
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> CMV启动子
<400> 18
tgagatttct gtcgccgact aaattcatgt cgcgcgatag tggtgtttat cgccgataga 60
gatggcgata ttggaaaaat cgatatttga aaatatggca tattgaaaat gtcgccgatg 120
tgagtttctg tgtaactgat atcgccattt ttccaaaagt gatttttggg catacgcgat 180
atctggcgat agcgcttata tcgtttacgg gggatggcga tagacgactt tggtgacttg 240
ggcgattctg tgtgtcgcaa atatcgcagt ttcgatatag gtgacagacg atatgaggct 300
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tgaatcaata ttggccatta gccatattat tcattggtta tatagcataa atcaatattg 420
gctattggcc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat attggctcat 480
gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 540
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 600
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 660
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 720
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 780
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 840
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 900
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 960
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 1020
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1080
gagctctccc tatcagtgat agagatctcc ctatcagtga tagagatcgt cgacgagctc 1140
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 1200
gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 1260
gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt 1320
atgcatgcta tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg 1380
tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt 1440
ggtgacgata ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt 1500
ggctatatgc caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat 1560
ggggtctcat ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca 1620
gtttttatta aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg 1680
ggctcttctc cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg 1740
actcatggtc gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca 1800
cgatgcccac caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa 1860
atgagctcgg ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag 1920
aagaagatgc aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg 1980
cggtgctgtt aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg 2040
ccaccagaca taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca 2100
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Kozak序列
<400> 19
cccgccgcca cc 12
<210> 20
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 起始密码子
<400> 20
atg 3
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
tctctgctga tgtggatcac ccagtgctga 30
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠白血病病毒
<400> 22
tctccatctt atgtgtacca ccagttc 27
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 鼠白血病病毒
<400> 23
ggaggccctg agtctttcta ctgtgcctct tgg 33
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 24
gttatcttgc ctcaagctcc tagcggcccc agctacgcca catatctgca acctgctcag 60
gcccagatgc tgacccctcc a 81
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 25
aagtatctgt ctgtgcagag ccagctgttc 30
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 26
aagtatctgt ctgtgcagag ccagctg 27
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 27
atctgcccta tgtacgccag agtg 24
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 28
tatcctcact tcatgcccac caacctc 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 29
cacggcatca gaaacgccag cttcatc 27
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 30
agcagccctc ctatgttcag agtg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 31
acttggtacg gcttttgcct gctg 24
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 32
agagcccact acaacatcgt gaccttc 27
<210> 33
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> T细胞表位序列3'的小基因免疫原盒核苷酸序列
<400> 33
tgagcggccg ctcgagcatg catctagagg gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta 60
gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 120
cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 180
aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 240
aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 300
ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctcgag gggggatcga tccgtcgaga 360
tatctagacc cagctttctt gtacaaagtg gt 392
<210> 34
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> BGH聚A序列
<400> 34
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 35
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> attL2序列
<400> 35
acccagcttt 10
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> attR2序列
<400> 36
cttgtacaaa gtggt 15
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 38
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 小基因免疫原盒5'的AAV核苷酸序列
<400> 38
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 240
attagttcat agcccatata tggagttccg 270
<210> 39
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 5' ITR核苷酸序列
<400> 39
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 40
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 小基因免疫原盒5'的额外序列
<400> 40
tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct aggaagatcg 60
gaattcgccc ttaagctagc tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 120
agcccatata tggagttccg 140
<210> 41
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 小基因免疫原盒3'的AAV腺病毒核苷酸序列
<400> 41
ctcgagttaa gggcgaattc ccgataagga tcttcctaga gcatggctac gtagataagt 60
agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 120
ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 180
ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 217
<210> 42
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 3' ITR核苷酸序列
<400> 42
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgca 129
<210> 43
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 小基因免疫原盒的3'的5'额外序列
<400> 43
ctcgagttaa gggcgaattc ccgataagga tcttcctaga gcatggctac gtagataagt 60
agcatggcgg gttaatcatt aactaca 87

Claims (35)

1.一种腺病毒载体或腺相关病毒载体，其包含编码单个癌症特异性CD8+T细胞表位的核苷酸序列，其中所述载体能够诱导膨胀记忆CD8+T细胞应答，其中所述载体不包含编码另外的癌症特异性T细胞表位的核酸。
2.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体能够诱导CD8+T细胞的产生，所述CD8+T细胞的特征在于选自包含CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-的组中的标志物。
3.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体能够诱导CD8+T细胞的产生，所述CD8+T细胞的特征在于选自包含CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+、CD62L-、CD27-(低)、CD127-(低)的组中的标志物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中编码所述癌症特异性CD8+T细胞表位的所述核苷酸序列包含12至45个核苷酸碱基对。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的载体，其中编码所述癌症特异性CD8+T细胞表位的所述核苷酸序列包含24至45个核苷酸碱基对。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的载体，其中所述癌症特异性CD8+T细胞表位源自肿瘤相关抗原。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的载体，其中所述T细胞表位在癌细胞中发生突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的载体，其中所述T细胞表位在癌细胞中过表达。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的载体，其中所述T细胞表位源自选自以下的肿瘤相关抗原：TRP-1、CEA、TAG-72、9D7、Ep-CAM、EphA3、端粒酶、间皮素、SAP-1 Melan-A/MART-1、酪氨酸酶、CLPP、细胞周期蛋白-A1、细胞周期蛋白-B1 MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAGE1b/GAGED2a、CD45、磷脂酰肌醇聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、lengsin、meloe、MUC5AC、存活素、PRAME、SSX-2、NY-ESO-1/LAGE1、gp70、MC1R、TRP-1/-2、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、胎儿蛋白SIM1。
10.根据权利要求9所述的载体，其中所述T细胞表位包含SEQ ID NO:2(SLLMWITQC)。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的载体，其中所述癌症特异性CD8+T细胞表位对以下疾病具有特异性：结直肠癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、上皮癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、爱泼斯坦巴尔驱动的癌症、人乳头瘤病毒驱动的癌症和软组织肉瘤。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的载体，其中所述载体是人血清型5(AdHu5)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的载体，其中所述载体包含CMV启动子。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的载体，其中所述载体包含TATA盒。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的载体，其中所述载体缺乏E1和E3蛋白。
16.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的载体。
17.一种免疫原性组合物，其包含至少两种根据权利要求1至15中任一项所述的载体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中每种载体编码不同的癌症特异性CD8+T细胞表位。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，其包含一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂。
20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的载体，或根据权利要求16至19中任一项所述的免疫原性组合物。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的载体或组合物，用于疗法中。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的载体或组合物，用于治疗或预防癌症。
23.一种治疗或预防癌症的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求1至15所述的载体或根据权利要求16至19所述的组合物。
24.一种诱导膨胀记忆CD8+T细胞应答的方法，其包括以下步骤：向有需要的对象施用治疗有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的载体或根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述CD8+T细胞的特征在于选自包括CX3CR1+、KLRG-1+、CD44+和CD62L-的组中的标志物。
25.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或组合物通过静脉内或肌内施用。
26.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或组合物作为单剂量施用。
27.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或组合物作为多剂量施用。
28.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或免疫原性组合物预防性地施用于所述对象。
29.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或免疫原性组合物治疗性地施用于所述对象。
30.根据权利要求21或22所述的载体或组合物，根据权利要求23或24所述的方法，其中所述载体或组合物与免疫调节分子分开地、顺序地或同时地联合施用。
31.根据权利要求30所述的方法、载体或组合物，其中所述免疫调节分子是免疫检查点抑制剂。
32.根据权利要求31所述的方法、载体或组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-H6、A2aR、BTLA、GAL9和IDO。
33.一种生产根据权利要求1至15中任一项所述的载体的方法，其包括以下步骤：
i)合成编码所述表位的核酸序列，作为有义和反义引物，
ii)将所述编码表位序列的核酸序列克隆到第一质粒中，
iii)将包含所述编码表位的核酸序列的序列克隆到包含腺病毒DNA的第二载体中。
34.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的载体或根据权利要求16至19所述的组合物、一种或多种另外的活性成分、药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂，以及任选的使用说明。
35.一种在动物中诱导针对癌症特异性CD8+T细胞表位的T细胞免疫应答的方法，其包括使细胞与根据权利要求1至15所述的载体或根据权利要求16至19所述的组合物接触。
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