KR20230026980A - 항-gucy2c 백신 및 백신접종 - Google Patents

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KR20230026980A
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애덤 이. 스눅
스콧 에이 왈드먼
트레버 알. 베이벗
존 씨. 플리킹거
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토마스 제퍼슨 유니버시티
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Abstract

가용성 GUCY2C 세포외 도메인 서열의 코딩 서열을 포함하는 변형된 아데노바이러스 AD5.F35를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 가용성 GUCY2C 세포외 도메인 서열의 코딩 서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토게네스 벡터를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. GUCY2C를 발현하는 암/종양으로 진단된 개체를 치료하는 방법, 미세전이를 예방하는 방법이 개시되어 있다.

Description

항-GUCY2C 백신 및 백신접종
정부 권리의 진술
본 발명은 미국 국방부에 의해 수여된 W81XWH-17-1-0299 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 R01 CA170533 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리를 갖는다.
치료법의 개선과 성공에도 불구하고, 암은 전 세계적으로 수많은 사람들의 생명을 계속 빼앗고 있다. 스크리닝의 개선은 초기 단계의 암을 가지는 많은 개체뿐만 아니라 암에 걸리지는 않았지만 유전적으로 암이 발병하기 쉬운 경향이 있어 암 발병 위험이 높은 많은 개체를 확인할 수 있는 기회를 제공한다. 더욱이, 치료의 개선으로 인해, 암을 제거했거나 관해 상태에 있는 사람들이 많이 있다. 이와 같은 사람들은 재발 또는 재발생의 위험이 있으므로 암 발병 위험도 또한 높다.
GUCY2C 발현 종양/암을 앓고 있는 개체를 치료하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다. GUCY2C 발현 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 데 유용한 조성물에 대한 요구가 있다. 이와 같은 암에 대해 치료를 받은 개체에서 GUCY2C 발현 암의 재발을 예방하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다. 이와 같은 암에 대해 치료받은 개체에서 GUCY2C 발현 암의 재발을 예방하는 데 유용한 조성물에 대한 요구가 있다. 개체, 특히 이와 같은 암에 대한 유전적 소인이 있는 것으로 확인된 개체에서 GUCY2C 발현 암을 예방하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다. 개체에서 GUCY2C 발현 암을 예방하는 데 유용한 조성물에 대한 요구가 있다. 개체에서 GUCY2C 발현 암을 치료 및 예방하는 데 유용한 조성물을 확인하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다.
도 1은 Ad5.F35-hGCC-PADRE 및 야생형 Ad5의 정렬을 나타내는 도면. Ad5.F35-hGCC-PADRE의 게놈은 1) E1 영역(E1A 및 E1B)의 hGCC-PADRE 발현 카세트로의 대체, 2) 대부분의 E3 영역의 결실, 및 3) Ad5 섬유의 Ad35 섬유로의 대체에 의해 Ad5의 게놈과 상이하다.
도 2는 Ad5F35-hGUCY2C-PADRE 맵을 나타내는 도면.
도 3 패널 A 내지 E는 Ad5 중화 Ab가 인간에서 GUCY2C 반응을 제한함을 나타내는 도면. 시험관내 Ad5-GFP 리포터 바이러스 저해 분석을 이용하여 Ad5 중화 항체(NAb)에 대해 분석한 백신접종(제0일) 전에 환자 혈청 샘플을 수집하였다(A). GFP 리포터 발현의 50% 저해를 생성한 혈청의 희석액으로 Ad5 NAb 역가를 계산하였다. (B) Ad5 NAb 역가에 의해 환자의 순위를 매겼고 역가가 200 미만인 환자는 Ad5 NAb 저(Low)로 지정된 반면, 역가가 200 초과인 환자는 Ab5 NAb 고(High)로 지정되었다(점선은 200의 역가를 나타냄). (C 내지 E) GUCY2C(C), PADRE(D) 및 Ad5(E)에 대한 항원-특이적 반응을 IFNγ-ELISpot에 의해 Ad5 NAb 저 및 고 환자 집단에서 비교하였다.
도 4 패널 A 내지 D는 Ad5 중화 항체가 마우스에서 GUCY2C 반응을 제한함을 나타내는 도면. BALB/c 마우스는 미경험이거나 108 IFU대조군 Ad5로 2회 면역화시킴으로써 전처리되어 높은 Ad5 중화 항체(NAb) 역가를 유도하였다(n = 10마리 마우스/그룹). (A 및 B) 전처리 2주 후, 혈청을 수집하고 시험관내 분석을 사용하여 Ad5 NAb 역가(B)를 결정하여 혈청 적정(A)의 존재 하에 Ad5-GFP 리포터 바이러스에 의한 A549 세포 감염의 저해를 정량화하였다. GFP 리포터 발현의 50% 저해를 생성한 혈청의 희석액으로 Ad5 NAb 역가를 계산하였다. (C 및 D) 그 다음 마우스를 CD4+ T-헬퍼 세포 에피토프 S1에 융합된 마우스 GUCY2C를 발현하는 Ad5-mGUCY2C-S1의 108 IFU로 면역화시켰다. GUCY2C-특이적 항체(C)와 CD8+ T-세포 반응(D)을 각각 2주 후 ELISA와 IFNγ-ELISpot에 의해 정량화하였다. NS = 유의하지 않음, * P <0.05, *** P <0.001, **** P <0.0001 양방향 ANOVA.
도 5는 1상 대상체의 Ad5 및 Ad5.F35 NAb 역가를 나타내는 도면. 1상 연구 대상체의 백신접종 전 혈청 샘플을 Ad5-GFP 또는 Ad5.F35-GFP 리포터 바이러스 저해 생물검정을 사용하여 Ad5 또는 Ad5.F35 중화 항체(NAb) 역가에 대해 테스트하였다. 비-선형 회귀에 의해 50% 저해를 생성한 혈청의 희석액으로 역가를 계산하였다. 값은 각각의 대상체에 대해 계산된 역가 및 표준 편차를 나타낸다. 점선은 "높은" 중화 역가에 대한 표준 임계값인 200의 역가를 나타낸다. 모든 대상체는 Ad5보다 Ad5.F35에 대한 중화 면역을 더 적게 보유하였다. 중요하게는, 5명/10명 대상체가 "높은" Ad5 NAb 역가를 보유한 반면, 1명의 대상체만이 "높은" Ad5.F35 NAb 역가를 보유하였다.
도 6 패널 A 내지 D. Ad5.F35-GUCY2C-S1 및 항원 발현의 구축을 나타내는 도면. (A) Ad5 및 Ad35.12의 보고된 국제 혈청학적 유병률 (B) Ad5의 섬유 단백질을 인코딩하는 L5 유전자를 Ad35의 L5 유전자로 대체하여, 키메라 아데노바이러스 벡터 Ad5.F35를 생성하였다. 마우스 GUCY2C-S1을 E1/E3이 결실된 Ad5.F35의 E1 영역에 삽입함으로써 재조합 Ad5.F35-GUCY2C-S1을 생성하였다. (C 및 D) 인간 폐포 기저 상피 세포주인 A549를 48시간 동안 0에서 10,000까지의 감염다중도(MOI)로(C) 또는 0, 24, 48 및 72시간 동안 10,000의 MOI로(D) Ad5.F35-GUCY2C-S1을 이용하여 이중으로 형질도입하였다. 감염된 세포 유래의 상청액을 면역블롯에 의해 GUCY2C-S1 단백질 발현에 대해 분석하였다. 단백질 발현을 농도계에 의해 정량화하고 감염되지 않은 세포에 대해 플롯팅하였다. 오차 막대는 평균±SEM을 나타낸다. Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5.
도 7 패널 A 내지 D. Ad5.F35-GUCY2C-S1의 구축 및 항원 발현을 나타내는 도면. (A) Ad5 및 Ad35.12의 보고된 국제 혈청유병률 (B) Ad5의 섬유 단백질을 인코딩하는 L5 유전자를 Ad35의 L5 유전자로 대체하여, 키메라 아데노바이러스 벡터 Ad5.F35를 생성하였다. 마우스 GUCY2C-S1을 E1/E3이 결실된 Ad5.F35의 E1 영역에 삽입함으로써 재조합 Ad5.F35-GUCY2C-S1을 생성하였다. (C 및 D) 인간 폐포 기저 상피 세포주인 A549를 48시간 동안 0에서 10,000까지의 감염다중도(MOI)로(C) 또는 0, 24, 48, 및 72시간 동안 10,000의 MOI로(D) Ad5.F35-GUCY2C-S1을 이용하여 이중으로 형질도입하였다. 감염된 세포 유래의 상청액을 면역블롯에 의해 GUCY2C-S1 단백질 발현에 대해 분석하였다. 단백질 발현을 농도계에 의해 정량화하고 감염되지 않은 세포에 대해 플롯팅하였다. 오차 막대는 평균±SEM을 나타낸다. Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5.
도 8 패널 A 내지 D. Ad5-GUCY2C-S1 및 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 항종양 효능을 나타내는 도면. (A 내지 D) BALB/c 마우스(n=10마리 마우스/그룹)를 Ad5-GUCY2C-S1 또는 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 대조군 또는 1010 vp를 이용하여 근육내로 면역화시키고 7일 후 GUCY2C 및 루시페라제를 발현하는 마우스 결장직장암 세포주인 CT26을 시험투여하였다. 시험투여 후 제7일 및 제14일에 마우스에 D-루시페린을 주사하고 영상화하여(A) 종양 부담을 정량화하였다(제14일; B). 마우스의 체중을 매주 2회 측정하고(C) 생존에 대해 모니터링하였다(D). 종양 부담(B)을 일원 분산 분석에 의해 분석하였고 생존 비교(D)를 만텔-콕스(Mantel-Cox) 로그 순위 테스트에 의해 분석하였다. (B) 및 (D)에서, 별표(*)는 GUCY2C 백신과 대조군의 비교를 나타내고 괄호(])는 Ad5와 Ad5.F35 백신 간의 비교를 나타낸다. ns, 유의하지 않음; Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5.
도 9 패널 A 내지 E. Ad5.F35는 마우스와 인간의 기존 항-Ad5 면역과 연관된 중화에 저항함을 나타내는 도면. (A 내지 C) Ad5에 대한 기존 면역성을 생성하기 위해, BALB/c 마우스(n=10마리 마우스/그룹)를 4주 간격으로 1010 vp의 Ad5-GFP에 비강 내로 1 또는 2회 노출하였다. 최종 Ad5-GFP 노출 4주 후, Ad5-노출 및 미경험 마우스를 1011 vp의 Ad5-GUCY2C-S1 또는 Ad5.F35-GUCY2C-S1로 근육내로 면역화시켰다. (B), 면역화 2주 후, 각각의 그룹의 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포 반응을 인터페론 감마(IFN-γ) ELISpot에 의해 정량화하고 미경험 마우스에서 평균 반응의 %로 계산하였다. 값은 개별 동물을 나타내고 막대는 평균을 나타낸다. Ad5 및 Ad5.F35를 이원 분산 분석에 의해 비교하였다. (C) 미경험, 1× 및 2× Ad5-노출 마우스에서 검출 가능한 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포 반응(채워진 영역)을 생성하는 동물의 분율을 (B)에서 결정하였다. (D 및 E) Ad5.GUCY2C-PADRE 백신접종 전에 수집한 10명의 결장직장암 환자 유래의 혈청을 Ad5 및 Ad5.F35 벡터를 중화시키는 능력에 대해 테스트하고 역가를 정량화하였다(D; 대응표본 t-검정(paired t-test)에 의해 분석함). 점선은 높은 중화 항체(Nab) 역가에 대한 임계값인 200의 역가를 나타낸다.21 (E) 5명/10명 대상체가 Ad5에 대해 높은 NAb 역가(200 초과)를 가진 반면, 1명/10명만이 Ad5.F35 벡터에 대한 높은 역가를 가졌다(채워진 영역; 이항 검정). Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5.
도 10 패널 A 내지 G. 다중 Ad5.F35-GUCY2C-S1 투여의 안전성 및 면역원성을 나타내는 도면. (A 내지 G) BALB/c 마우스(n=10마리 마우스/그룹)를 4주 간격으로 1011 vp Ad5.F35-GUCY2C-S1 또는 대조군의 1 또는 3회 투여로 근육내로 면역화시켰다. 면역화 후, 체중((B) 암컷 및 (C) 수컷))을 매주 기록하고 마우스를 생존(D)에 대해 모니터링하였다. 첫 번째 면역화 후 제14일과 제90일에, 마우스를 안락사시켜 체중에 의한 장기 병리, 정량적 PCR에 의한 생체분포, 및 인터페론 감마(IFN-γ) ELISpot에 의한 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응(E 내지 G)을 정량화하였다. (G) 파이 차트는 반응하는 동물의 비율을 나타낸다. Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5.
도 11. 재조합 Lm-GUCY2C는 감염된 J774.A1 대식세포 내에서 GUCY2C를 분비함을 나타내는 도면. J774A.1 세포를 6웰 플레이트에 도말하고 단층을 형성하도록 하였다. 그 다음 대식세포를 4×107 CFU의 대조군 Lm 또는 Lm-GUCY2C로 감염시키고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 1시간 후, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 10 ug/㎖ 겐타마이신을 함유하는 새로운 배지를 첨가하여 세포외 Lm을 제거하였다. 감염된 대식세포를 37℃에서 추가 7시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 감염된 세포 유래의 용해물을 준비하고 GUCY2C 또는 Lm 항원 p60에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 레인 1: 감염되지 않은 J774A.1 세포. 레인 2: 대조군 Lm으로 감염된 J77A.1. 레인 3: Lm-ActA-GUCY2C로 감염된 J774A.1. 레인 4: Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C로 감염된 J774A.1.
도 12. 재조합 Lm-GUCY2C는 Ad5-GUCY2C-S1 백신접종 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응을 향상시킴을 나타내는 도면. BALB/c 마우스를 제0일에 1×108 플라크 형성 단위(PFU)의 Ad5-GUCY2C-S1로 근육내로 면역화시켰다. 제21일에 마우스를 1×107 콜로니 형성 단위(CFU)의 대조군 Lm 또는 GUCY2C를 발현하는 재조합 Lm[Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C("Lm-GUCY2C")]으로 면역화시켰다. 제27일에 GUCY2C-특이적 T 세포를 IFNγ ELISpot에 의해 정량화하였으며, DMSO는 음성 대조군의 역할을 하였다.
도 13. 재조합 Lm-GUCY2C는 DNA-GUCY2C 백신접종 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응을 증강시킴을 나타내는 도면. BALB/c 마우스를 제0일에 DNA 또는 Lm-GUCY2C(Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C) 백신접종에 의해 프라이밍하고 제21일에 DNA 또는 Lm-GUCY2C(Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C) 백신접종으로 추가접종하였다. DNA 백신접종의 경우, GUCY2C 단백질을 인코딩하는 50 ug의 DNA 플라스미드를 각각의 다리에 근육내로 주사하고 10 펄스(전계 강도 = 100 v/㎝, 펄스 길이 = 20㎳, 펄스 간격 = 1s)에 의해 전기천공하였다. Lm 백신접종의 경우, 1×107 CFU의 Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C의 복강내로 투여하였다. 제27일에, GUCY2C-특이적 T 세포를 IFNγ ELISpot에 의해 정량화하였으며, DMSO는 음성 대조군의 역할을 하였다.
도 14. 1세대 Lm-GCC 백신을 나타내는 도면. 3개의 백신을 생성하였다: GCC 없이 전달 플라스미드만을 함유하는 대조군 Lm; LLO-GCC 융합 단백질; 및 LLO-GCC-S1 융합 단백질.
도 15. 1세대 Lm 백신 품질 관리를 나타내는 도면. 리스테리아 배양물을 37℃에서 성장시켰다. 0.5를 초과하는 OD600에서, 배양물을 4,000×G에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 트리클로로아세트산을 사용하여 상청액으로부터 단백질을 침전시켰다. 단백질(30 ㎍)을 4 내지 12% 비스-트리스 겔의 각각의 레인에 로딩하였다. 겔을 GCC 단클론성 항체(클론 MS20) 또는 다클론성 항-LLO로 염색하였다. LLO-GCC 및 LLOGCC-S1 융합 단백질 둘 모두의 예측된 중량은 약 89 kDa로 추정된다.
도 16. 1세대 Lm 백신 면역원성을 나타내는 도면. 대조군(Lm-LLO), Lm-LLO-GCC, 및 Lm-LLO-GCC-S1 백신을 야생형 BALB/c 마우스에 107 CFU/마우스로 투여하였다. Ad5-GCC-S1을 양성 대조군으로서 109 IFU로 투여하였다. GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 IFNγ-ELISpot에 의해 측정하였다. 대조군, LmLLO-GCC 또는 Lm-LLO-GCC-S1-면역화 마우스에서 GCC에 대한 반응은 검출되지 않았지만 Ad5-GCC-S1-면역화 마우스에서는 용이하게 검출되었다(좌측). Lm 및 Ad5 백신은 각각 LLO 또는 DBP에 대해 강력한 벡터-특이적 T-세포 반응을 유도하여(우측), 적절한 Lm-LLO-GCC 백신 노출 및 면역원성을 확인하였다.
도 17. 2세대 Lm-GCC 백신 설계를 나타내는 도면. 1세대 백신은 GCC의 전체 세포외 도메인(잔기 23 내지 429)을 이용하였지만, 2세대 설계는 GCC의 더 짧은 단편을 이용하였다. 각각의 단편은 각각의 작제물 아래에 나타낸 별개의 CD4+ 및 CD8+ 에피토프 프로파일을 가지는 GCC의 대략 1/3을 함유하였다.
도 18. 2세대 Lm 백신 품질 관리를 나타내는 도면. 리스테리아 배양물은 37℃에서 성장시켰다. OD600 > 0.5일 때, 배양물을 4,000×G에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 트리클로로아세트산을 사용하여 상청액으로부터 단백질을 침전시켰다. 단백질(30 ㎍)을 4 내지 12% 비스-트리스 겔의 각각의 레인에 로딩하였다. 겔을 GCC 단클론성 항체인 MS7, MS20, MS24로 염색하고 HRP-접합된 염소 항-마우스 이차 항체 및 발광 기질로 검출하였다.
도 19, 패널 A 및 B. 2세대 백신 면역원성을 나타내는 도면. GCC 단편을 함유하는 2세대 Lm-LLO-GCC 백신을 Gcc-/-(A) 또는 Gcc+/+(B) 마우스에 투여하였다. Gcc-/- 마우스는 CD4+ T-세포 에피토프-함유 단편 1 및 2(A)로 면역화시켰을 때 GCC에 대해 강력한 CD4+ T-세포 반응을 생성하였다. 그러나 Gcc+/+ 마우스는 CD8+ T-세포 에피토프-함유 단편 2 및 3으로 면역화시켰을 때 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 생성하지 못하였다(B).
도 20 패널 A, B 및 C. Lm-LLO-GCC 항종양 면역을 나타내는 도면. A 내지 C) 야생형 BALB/c 마우스를 LmLLO-GCC 단편 1, 2 및 3의 혼합물로 면역화시켰다(도 9 내지 11). 마우스는 GCC가 없는 Lm-LLO를 음성 대조군으로, 또는 Ad5-GCCS1을 양성 대조군으로 받았다. 그 다음 마우스(그룹당 n=8마리)에게 GCC 및 루시페라제를 발현하는 CT26 결장직장암 세포를 시험투여하였다. 종양 부담을 영상화하고 전신 생물발광 영상화(BLI)에 의해 정량화하였다. B 내지 C) Lm-LLOGCC 면역화는 항종양 활성을 나타내지 않은 반면, Ad5-GCC-S1은 완전한 보호를 나타내었다. C) 제14일의 대표 이미지.
도 21 패널 A, B, C 및 D. Lm-ActA-GCC 백신을 나타내는 도면. A) Lm-ActA-GCC-A 및 Lm-ActA-GCC-B라고 하는 2가지 ActA-기반 GCC 백신을 생성하였다. 이들은 전장 GCC 세포외 도메인(잔기 23 내지 429)에 융합된 ActA를 함유한다. 추가적으로, 백신 "B"는 Acta-GCC 융합 단백질 생성을 향상시키는 합성 서열(Syn18)을 함유한다. B) 실제로, Syn18의 존재는 시험관 내에서 다양한 Lm 백신으로 감염된 대식세포에서 Acta-GCC 생성을 상당히 개선시킨다. 항-P60은 Lm 단백질을 검출하여, Lm-감염된 대식세포에서 GCC 발현 수준의 정규화를 가능하게 한다. 야생형 BALB/c 마우스를 백신 "A"(C) 또는 "B"(D)로 면역화시키거나 양성 대조군 Ad5-GCC-S1 및 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 IFNγ-ELISpot에 의해 측정하였다. Lm-면역화된 그룹에서는 반응이 검출되지 않았다. C 및 D에서 개별 마우스는 백신 "A" 및 "B"에 대해 나타나 있다.
도 22. Lm-ActA-GCC 다중-에피토프 백신을 나타내는 도면. 우성 GCC CD8+ T-세포 에피토프의 5개 복사체에 탠덤으로 융합된 ActA를 함유하는 재조합 Lm을 이 생성하였지만(백신 "C"), 이 백신으로 마우스를 면역화시키면 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응이 생성되지 않았다. 개별 마우스는 백신 "C"에 대해 나타나 있다.
도 23. Lm-ActA-다중-에피토프 백신을 나타내는 도면. 이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다제(LacZ), GCC, Her2의 마우스 동족체, 및 Ad5(백신 "D")의 우세한 CD8+ T-세포 에피토프에 해당하는 4개의 탠덤 에피토프에 융합된 ActA를 함유하는 재조합 Lm을 생성하였다. 야생형 BALB/c 마우스를 면역화시키고, 반응을 IFNγ-ELISpot에 의해 정량화하였다.
도 24 패널 A 내지 C: Lm-GUCY2C의 구성을 나타내는 도면. A) Lm-GUCY2C는 acta 프로모터의 제어 하에 ActAN100, 인핸서 서열, 및 마우스 GUCY2C23-429로 구성된 융합 단백질을 분비한다. B 내지 C) J774A.1 대식세포주를 37℃에서 6시간 동안 10:1 MOI로 Lm-GUCY2C 또는 Lm-LacZ로 감염시켰다. GUCY2C 융합 단백질을 (B) 웨스턴 블롯 및 (C) 면역형광에 의해 검출하였다.
도 25 패널 A 내지 D: 이종 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화는 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응 및 항종양 면역을 향상시킴을 나타내는 도면. (A 내지 D) BALB/cJ 마우스(n = 3 내지 9마리/그룹)를 GUCY2C-발현 및 대조군 백신의 상동성 또는 이종성 조합을 사용하여 제0일에 '프라이밍' 면역화 및 제21일에 '부스팅' 면역화로 면역화시켰다. 아데노바이러스 백신을 1010 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1 또는 대조군 Ad5.F35로서 근육내로(i.m.) 투여하고 Lm 백신을 5×106 CFU의 Lm-GUCY2C 또는 대조군 Lm으로서 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 최종 면역화 6일 후, 마우스를 수확하고 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포를 IFN-γ ELISpot(A)에 의해 정량화하거나 GUCY2C 및 반딧불이 루시페라제를 발현하는 5×105 CT26 결장직장암 세포를 i.v. 시험투여하였다. 시험투여 후 제7일과 제14일에, 마우스에 D-루시페린 기질을 주사하고 영상화하였다(B). 제7일에 ELISpot에서 영상화 시 발광(광자/초)에 의해 정량화된 종양 부담을 기록하였다(C). 실험 전반에 걸쳐 생존을 모니터링하였다(D). GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응 및 종양-부담을 1원 ANOVA에 의해 대조군 면역화와 비교하여 분석하였고 생존 비교를 만텔-콕스 로그 순위 테스트에 의해 분석하였다.
도 26 패널 A 내지 C: 기존 Ad5 면역은 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역에 영향을 미치지 않음을 나타내는 도면. (A) BALB/cJ(n=4마리/그룹) 마우스를 제0일에 감소 용량(1011 vp 내지 107 vp)의 Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신으로 면역화시키고 제21일에 5×106 CFU의 Lm-GUCY2C로 추가접종하였다. 최종 백신접종 6일 후, GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응은 IFN-γ ELISpot에 의해 정량화된 세포이었다. (B 내지 E) BALB/cJ 마우스(n=15마리/그룹)를 제0일에 대조군으로서 1010 vp의 Ad5-GFP 또는 PBS를 이용하여 비강내로 감염시켰다. 백신접종 28일 후에 마우스를 출혈시키고 Ad5-특이적 NAb의 존재를 1011 vp로 Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신접종 전에 확인하였다(B). Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신접종 21일 후, 마우스를 5×106 CFU의 Lm-GUCY2C 또는 대조군 Lm으로 추가접종하였다. 최종 백신접종 6일 후, 각각의 그룹의 5마리 마우스를 희생시켜 GUCY2C-특이적 CD8+T 세포 반응을 평가하고(C) 나머지 10마리 마우스에 GUCY2C 및 반딧불이 루시페라제를 발현하는 5×105 CT26 결장직장암 세포로 시험투여하였다.
도 27 패널 A 내지 E: 프라임-부스트는 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 결합력 및 다작용성을 향상시킴을 나타내는 도면. BALB/cJ 마우스(n=5 내지 8마리/그룹)를 Ad5.F35-GUCY2C-S1(프라임) 또는 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C(프라임-부스트) 백신접종 요법을 사용하여 면역화시켰다. 최고 이펙터 반응에서, 프라임 후 14일 및 프라임-부스트 백신접종 후 6일에, IFN-γ ELISpot에 의해 정량화된 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 결합력(A) 및 유세포 분석법(B 내지 E)에 의해 정량화된 다작용성을 가지는 비장세포를 수집하였다. (A) GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 결합력의 비-선형 회귀(실선)는 95% 신뢰 구간(점선)으로 표시된다. (B 내지 E) 모든 CD8+ T 세포의 백분율로 나타낸 (B) 단일-양성, 및 (C) 이중-양성 이벤트와 함께 IFN-γ, MIP1α 및 CD107a에 의한 살아있는 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포의 이펙터 기능. (D 내지 E) 사이토카인+ CD8+ T 세포의 백분율로 나타낸 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포의 전반적인 다작용성이 도시되어 있다.
도 28 패널 A 내지 D: 이종 프라임-부스트 면역화는 독성을 유도하지 않는다. (A) BALB/cJ 마우스(n=10마리/그룹)를 제0일에 Ad5.F35-GUCY2C-S1 및 제21일 및 제42일에 Lm-GUCY2C 또는 모든 일에 대조군으로서 PBS로 면역화시켰다. (B 내지 D) 생존 및 체중을 실험 전반에 걸쳐 모니터링하였다.
서열목록의 간단한 설명
서열번호 1: 본 명세서에 참조에 의해 원용된 인간 GUCY2C의 DNA 서열(Genbank 수탁 번호 BC136544).
서열번호 2: 인간 GUCY2C의 예측된 아미노산 서열.
서열번호 3: 인간 GUCY2C의 코돈 최적화된 DNA 서열.
서열번호 4: 인간 GUCY2C의 예측된 아미노산 서열.
서열번호 5: 가용성 인간 GUCY2C의 코돈 최적화된 DNA 서열.
서열번호 6: 가용성 인간 GUCY2C의 예측된 아미노산 서열.
서열번호 7: PADRE를 암호화하는 DNA 서열.
서열번호 8: 서열번호 6의 PADRE의 예측된 아미노산 서열.
서열번호 9: PADRE(C 말단 융합)를 인코딩하는 DNA 서열과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C의 코돈 최적화된 DNA 서열.
서열번호 10: PADRE(N 말단 융합)를 인코딩하는 DNA 서열과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C의 코돈 최적화된 DNA 서열의 예측된 아미노산 서열.
서열번호 11: Ad5.F35-hGUCY2C-PADRE 벡터 서열.
서열번호 12: 피. 비박스(P. vivax) MSP1의 33 kDa C-말단 영역에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 13: 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 포자소체 단백질(circumsporozoite protin)에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 14: 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 15: 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 16: 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 17: 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 18: 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프.
서열번호 19: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT830-844.
서열번호 20: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT947-967.
서열번호 21: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT590-603.
서열번호 22: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT615-629.
서열번호 23: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT639-652.
서열번호 24: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT830-843.
서열번호 25: T 세포 에피토프 파상풍 톡소이드 TT947-967.
서열번호 26: T 세포 에피토프 인플루엔자 혈구응집소 잔기 306 내지 318.
서열번호 27: T 세포 에피토프 엔테로바이러스 71 VP1 캡시드 단백질 잔기 66 내지 77.
서열번호 28: T 세포 에피토프 엔테로바이러스 71 VP1 캡시드 단백질 잔기 145 내지 159.
서열번호29: T 세포 에피토프 엔테로바이러스 71 VP1 캡시드 단백질 잔기 247 내지 261
서열번호 30: T 세포 에피토프 EBV LMP1159-175.
서열번호 31: T 세포 에피토프 HIV Gag131-15.
서열번호 32: T 세포 에피토프 HIV Gag 211-230.
서열번호 33: T 세포 에피토프 HIV Gag 241-260.
서열번호 34: T 세포 에피토프 HIV Gag 263-277.
서열번호 35: T 세포 에피토프 HIV Gag 271-290.
서열번호 36: T 세포 에피토프 HIV Gag 291-310.
서열번호 37: T 세포 에피토프 HIV Gag 301-320.
서열번호 38: T 세포 에피토프 HIV Gag 321-340.
서열번호 39: T 세포 에피토프 HIV Gag 331-350.
서열번호 40: T 세포 에피토프 Ad5 헥손 단백질 잔기 556 내지 580.
서열번호 41: T 세포 에피토프 Ad5 헥손 단백질 잔기 56 내지 80.
서열번호 42: T 세포 에피토프 Ad5 헥손 단백질 잔기 316 내지 335.
서열번호 43: T 세포 에피토프 Ad5 헥손 단백질 잔기 906 내지 930.
1.0 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "GUCYC2", "GCC", "인간 GUCYC2", "인간 GCC", "GUCYC2 단백질", "GCC 단백질", "인간 GUCYC2 단백질" 및 "인간 GCC 단백질"은 인간 구아닐릴 사이클라제 C 단백질을 지칭하는 데 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 인간 GUCYC2를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(Genbank 수탁 번호 BC136544)에 제시되어 있다. 서열번호 1의 가장 긴 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 인간 GUCYC2 단백질은 서열번호 2(Genbank 수탁 번호 AAB19934)에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 인간 GUCYC2를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열은 Magee 등(Magee MS et al. (2018) Cancer Immunol Res 6:509-516, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기재되었고 서열번호 3에 제시되어 있다.
GUCYC2 단백질은 세포-표면 또는 막-결합 수용체 단백질이다. GUCYC2 단백질은 일반적으로 허용되는 일부 도메인을 가지며, 각각의 도메인은 GUCYC2 분자에 분리 가능한 기능을 제공한다. 이들 도메인은 신호 서열(또한 신호 펩타이드로 호환 가능하게 지칭됨), 세포외 도메인, 막관통 도메인, 키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인(키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 함께 때때로 세포내 또는 세포질 도메인으로 호환 가능하게 지칭함)을 포함한다. 도메인은 단백질이 세포에서 생성될 때 발생하는 N-말단에서 C-말단까지 본 명세서에 기재되어 있다.
GUCYC2 신호 서열은 N-말단에 새로 합성된 GUCYC2 단백질에 존재한다. GUCYC2 신호 서열은 단백질이 세포에서 처음 생성되는 위치에서 단백질을 전위하는 기능을 한다. GUCYC2 신호 펩타이드는 전형적으로 성숙을 위해 절단되어 단백질 수송의 일부로 또는 단백질 수송 후에 기능적인 성숙한 단백질을 생성한다.
GUCYC2 세포외 도메인은 세포 외부에서 외부로 노출되는 GUCYC2 단백질의 부분이다. GUCYC2 세포외 도메인은 GUCYC2 단백질의 자연 발생 작용제 리간드, 구아닐린 및 유로구아닐린뿐만 아니라, 자연 발생 및 합성 작용제 및 길항제 리간드, 예를 들어, 이. 콜라이 열 안정성 엔테로톡신 ST에 결합하는 GUCYC2, GUCYC2 단백질의 부분을 포함한다. GUCYC2 세포외 도메인은 GUCYC2 신호 서열과 GUCYC2 막관통 도메인 사이 서열의 모든 아미노산 잔기를 포함한다. 즉, GUCYC2 세포외 도메인은 GUCYC2 신호 서열 뒤의 첫 번째 잔기부터 GUCYC2 막관통 도메인 앞의 마지막 잔기까지의 모든 아미노산 잔기를 포함한다.
이러한 도메인은 신호 서열, 세포외 도메인, 막관통 도메인(이중 또는 단일-통과 막관통 단백질로서, 단일 막관통 도메인만 있음), 키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인(키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 함께 때때로 세포내 또는 세포질 도메인으로 호환 가능하게 지칭함)을 포함한다. 도메인은 단백질이 세포에서 생성될 때 발생하는 N-말단에서 C-말단까지 본 명세서에 기재되어 있다.
막관통 도메인은 세포막 내에 위치하며 세포막에 걸쳐 있다. 막관통 도메인은 세포막에 GCC 단백질을 고정한다.
키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인은 세포 내부에 위치하며 수용체가 작용제 리간드에 결합함으로써 활성화될 때 신호를 전달하는 기능을 한다. 키나제 상동성 도메인은 티로신 키나제 활성을 가지는 것으로 예측되며; 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인은 구아닐릴 사이클라제 활성을 가질 것으로 예측된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Ad5.Fib35 아데노바이러스 벡터" 및 "Ad5.F35 아데노바이러스 벡터"는 호환 가능하게 사용되며, 천연 Ad5 섬유 또는 섬유의 샤프트 및 노브(knob) 부분을 인코딩하는 DNA가 혈청형 B 아데노바이러스 Ad35에서 유래된 것으로 대체된 아데노바이러스 벡터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "복제 결함 아데노바이러스 벡터"는 바이러스 복제에 필수적인 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역(예를 들어, E1, E2 또는 E4 또는 이들의 조합)이 결핍되어, 트랜스-보완(예를 들어, 보완 세포 또는 헬퍼 바이러스에 의해 제공됨)의 부재 시 증식할 수 없는 아데노바이러스 벡터를 의미한다. 또한 "복제 결함 아데노바이러스 벡터"의 정의에는 시스-작용 서열을 제외하고 초기(E1, E2, E3 및 E4) 및 후기 유전자(L1, L2, L3, L4 및 L5)를 포함한 모든 기능적 유전자가 없는 최소(또는 거틀리스(gutless)) 아데노바이러스 벡터가 포함된다(예를 들어, 문헌[Kovesdi et al., Current Opinion in Biotechnology 8 (1997), 583-589; Yeh and Perricaudet, FASEB 11 (1997), 615-623]; WO 제94/12649호; WO 제94/28152호 참조). 복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 필요한 최소 서열을 고려하여 당업자에 의해 용이하게 조작될 수 있으며, 이들 예시적인 실시형태에 제한되지 않는다. E1, 또는 E1 및 E2, 또는 E1 및 E3, 또는 E1 및 E4, 또는 E1 및 E2 및 E3, 또는 E1 및 E2 및 E4, 또는 E1 및 E3 및 E4, 또는 E1 및 E2 및 E3 및 E4가 결여된 아데노바이러스 벡터는 모두 이 정의에 의해 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 발현 카세트"는 보편적인 CD4+ 에피토프에 프레임 내에서 융합된 가용성 GUCYC2 또는 가용성 GUCYC2의 발현을 구동시킬 수 있는 아데노바이러스 백본이거나 삽입될 수 있는 DNA 작제물을 의미한다. 유전자 발현 카세트는 일반적으로 주어진 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 관심이 있는 외래 항원을 발현하도록 구축되며 폴리아데닐화 신호, 예를 들어, BGH 폴리아데닐화 신호 또는 SV40으로부터 유래된 것, 및/또는 기타 요소, 예컨대, 코작(Kozak) 영역 및/또는 숙주 벡터에 의해 이미 제공되지 않은 추가적인 종결 신호 또는 발현될 코딩 영역을 포함할 수 있다. 크기, 조성, 또는 복잡성 및 선택된 프로모터의 발현 패턴과 같은 수많은 인자에 따라 상이한 프로모터가 이용될 수 있다. CMV IE 프로모터는 많은 조직 유형에서 효율적으로 발현되기 때문에 유전자 발현 카세트에서 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 인간 헤모글로빈 프로모터, 수지상 세포 특이적 프로모터, 예컨대, 프로모터 CD11c(Masood, R, et al, 2001 Int J MoI Med 8: 335-343, Somia, N.V, et al, 1995 Proc Acad Sci USA 92: 7570-7574, 이들은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)뿐만 아니라, 미오신 프로모터, 근육 크레아티닌 키나제(MCK) 프로모터, 데스민 프로모터 및 포유동물 트로포닌 1 프로모터를 포함한 근육 특이적 프로모터를 포함한 다른 프로모터가 유전자 발현 카세트에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "가용성 GUCYC2", "가용성 GCC", "가용성 인간 GUCYC2", "가용성 인간 GCC", "가용성 GUCYC2 도메인", "가용성 GCC 도메인", "가용성 인간 GUCYC2 도메인" 및 "가용성 인간 GCC 도메인"은 호환 가능하게 사용되며 GUCY2C 세포외 도메인을 포함하는 인간 GUCY2C의 단편, 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 54 내지 아미노산 잔기 384의 서열을 포함하고, 선택적으로 여전히 세포막에 고정되지 않은 가용성 GUCYC2의 세포외 분비를 허용하면서 GUCYC2 막관통 도메인의 일부에 융합된 적어도 330 내지 423개 아미노산 잔기인 인간 GUCY2C의 서열을 포함하는 이의 단편을 지칭한다. 즉, GUCYC2 막관통 도메인 유래의 임의의 서열이 포함되는 정도로는, 앵커로서의 기능을 하기에 불충분하다. 따라서, 세포에서 발현될 때, 가용성 GUCYC2가 세포에 의해 분비될 수 있다. 가용성 GCC의 분비는 신호 서열에 의해 촉진되고 가용성 GCC를 인코딩하는 핵산은 내인성 또는 외인성 신호 서열을 코딩하는 것으로 이해된다. 가용성 GUCYC2는 GUCYC2 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드에 연결될 수 있으며 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "분비 신호", "분비 펩타이드", "신호 펩타이드" 및 "신호 서열"은 호환 가능하게 사용되며, 존재하는 경우 세포 외부로 단백질의 수송 및 분비를 초래하는 단백질의 아미노산 서열을 지칭하는 것을 의미한다. 분비 신호는 전형적으로 전구체 단백질의 N 말단에서 또는 근처에서 전구체 단백질의 절단 가능한 소수성 절편이다. 분비 과정에서 이와 같은 분비 신호는 효소에 의해 제거되어 단백질의 성숙한 형태, 즉 분비 신호가 결여된 단백질 형태의 분비를 초래한다. 일부 실시형태에서, 분비 신호는 GCC 단백질로부터 유래된 GCC 분비 신호이다. GCC 분비 신호는 GUCYC2의 잔기 1 내지 약 잔기 21, 22 또는 23을 포함하는 N-말단 신호 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 분비 신호는 GUCYC2와 상이한 공급원("외인성 신호 서열")에 대해 유도되고 내인성 신호 서열을 대체한다. 전자의 경우, 신호 서열을 포함하는 GCC 항원의 코딩 서열은 그대로 사용된다. 후자의 경우에, 다른 공급원 유래의 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 신호 서열 대신에 코딩 서열 GCC에 연결되고 나머지 단백질과 프레임 내에서 연결된다. 이와 같은 경우에, 신호 서열은 유전자 작제물이 투여되는 개체의 세포에서 기능하는 임의의 이와 같은 서열일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프"는 여러 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 2 인간 백혈구 항원(HLA)과 복합체를 형성하는 펩타이드 서열이며, 그 다음 상기 복합체는 CD4+ T 세포의 T 세포 수용체에 의해 인식되고 하기에서 상세히 논의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "GUCY2C-발현 종양"은 구아닐릴 사이클라제 C 또는 "GCC"를 발현하는 종양을 지칭한다. 이와 같은 종양/암 세포는 일반적으로 위장관 내에서 유래되며, 식도, 위, 췌장, 또는 결장직장 기원의 종양/암 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 종양은 원발성 또는 전이성일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결장직장 종양" 또는 "결장직장관 내에서 발생하는 암"은 결장직장암을 소장 아래 장관(즉, 맹장, 상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장 및 직장을 포함하는 대장(결장)) 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 병태로 정의하는 널리 수용되는 의학적 정의를 포함하는 것을 의미한다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결장직장암" 또는 "결장직장관 내에서 발생하는 암"은 십이지장 및 소장(공장 및 회장) 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 병태를 추가로 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 결장직장암의 정의는 일반적인 의학적 정의보다 더 광범위하지만 십이지장 및 소장의 세포도 또한 GCC를 함유하기 때문에 이와 같이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "위암(stomach cancer 또는 gastric cancer)"은 위암을 위 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 병태로 정의하는 널리 수용되는 의학적 정의를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식도암"은 식도암을 식도 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 병태로서 정의하는 널리 수용되는 의학적 정의를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "췌장암"은 췌장암을 췌장 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 병태로 정의하는 널리 수용되는 의학적 정의를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "원발성 종양"은 원래 기원 조직에 국한된 종양이다. 이는 원발성 기원 조직에서 다른 장기로 퍼진 전이성 종양과 반대이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결장직장관 외부"는 결장직장관 내에 있지 않은 기관을 지칭한다.
결실된 아데노바이러스 유전자는 외래 이식유전자의 발현을 구동하는 유전자 발현 카세트로 대체된다. 이러한 결실된 벡터는 통상 유전자 변형 Ad 게놈을 함유하는 플라스미드 또는 Ad DNA로부터 구축되며, 벡터는 필요한 필수 유전자를 유지하고 발현하는 HEK293, PER.C6 또는 N52.E6과 같은 보완 세포주에서 성장한다.
기능적인 성숙한 GCC 단백질은 신호 서열이 절단될 때 생성된다. 기능적인 성숙한 GCC 단백질은 전형적으로 서열번호 2의 아미노산 잔기 22 내지 1073, 서열번호 2의 아미노산 잔기 23 내지 1073 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 24 내지 1073을 포함한다. 성숙한 GCC 단백질은 세포외 도메인, 막관통 도메인, 키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 포함한다.
기능적인 성숙한 GCC 단백질의 세포외 도메인은 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 54 내지 아미노산 잔기 384의 서열을 포함하는 약 330 내지 423개의 아미노산 잔기를 포함한다. 세포외 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22, 23 또는 24에서 아미노산 잔기 420 내지 435까지의 서열을 포함할 수 있다. 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 세포외 도메인의 서열은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 54 내지 약 아미노산 잔기 384의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22, 23 또는 24에서 아미노산 잔기 420 내지 435까지의 서열을 포함하는, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22 내지 아미노산 잔기 435의 서열, 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22 내지 아미노산 잔기 435의 서열의 330 내지 422개 아미노산 잔기 단편을 포함할 수 있다. GCC의 세포외 도메인은 광범위한 조직 분포 및 상이한 리간드 특이성을 가지는 구아닐릴 사이클라제 A, B 및 G와 상동성을 가지지 않는다.
기능적인 성숙한 GCC 단백질의 막관통 도메인은 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 436 내지 약 아미노산 잔기 452의 서열을 포함하는 약 16 내지 23개의 아미노산 잔기를 포함한다. 막관통 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 436 내지 약 아미노산 잔기 452의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열의 16 내지 22개의 아미노산 단편을 포함할 수 있다.
기능적인 성숙한 GCC 단백질의 키나제 상동성 도메인은 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 508 내지 약 아미노산 잔기 745의 서열을 포함하는 약 237 내지 260개의 아미노산 잔기를 포함한다. 키나제 상동성 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 489 내지 약 아미노산 잔기 749의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 489 내지 약 아미노산 잔기 749의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 508 내지 약 아미노산 잔기 745의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 489 내지 약 아미노산 잔기 749의 서열의 237 내지 259개 아미노산 단편을 포함할 수 있다.
기능적인 성숙한 GCC 단백질의 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인은 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 816 내지 약 아미노산 잔기 1002의 서열을 포함하는 약 186 내지 257개의 아미노산 잔기를 포함한다. 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 750 내지 약 아미노산 잔기 1007의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 750 내지 약 아미노산 잔기 1007의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 816 내지 약 아미노산 잔기 1002의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 750 내지 약 아미노산 잔기 1007의 서열의 186 내지 256개 아미노산 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 가용성 GCC는 바람직하게는 가용성 GCC와 보편적인 CD4+ T 에피토프가 단일 폴리펩타이드로 발현되는 융합 단백질로 발현된다. 따라서, 가용성 GCC를 인코딩하는 서열은 바람직하게는 보편적인 CD4+ T 에피토프를 인코딩하는 서열에 연결되어 두 영역의 프레임 내 번역 융합이 초래될 것이다. 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프는 가용성 GCC의 N 또는 C 말단에 부착될 수 있다. N 말단에 부착된 경우, 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프는 내인성 또는 외인성 신호 서열의 하류에 삽입된다.
GCC 신호 서열 및 응집체에서 C 말단에서 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프(PADRE)에 융합된 GCC의 처음 약 429개 아미노산 잔기로 이루어진 분자의 세포외 도메인을 포함하는 절단된 GUCYC2가 본 명세서에서 예시된다.
GCC와 같은 종양 마커를 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 발현은 단백질 수준 또는 mRNA 수준으로 검출될 수 있다. qRT-PCR 분지형 올리고뉴클레오타이드 기술, Panomics QuantiGene® 2.0(Affymetrix, Inc. 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재) 정량적 유전자 발현 시약 및 분석, 검출 가능한 프로브(예컨대, FISH), 도트 블롯 분석, 및 기타 RNA 정량적 증폭 기법을 사용하는 MassARRAY®(Sequenom, Inc. 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 정량적 유전자 발현 시스템 동일계내 혼성화 및 노던 블롯과 같은 기법은 mRNA 수준을 측정하는 데 유용하고, 질량 분석법과 커플링된 단백질 및 펩타이드 분획을 포함한 단백질 질량 분석법, 검출 가능한 결합제를 사용하는 면역조직화학, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 면역분석, QProteome FFPE(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재), 역상 단백질 마이크로어레이는 단백질 마커의 존재 및 수준을 검출하는 데 유용하다. 미국 특허 공개 제20170049869A1호는 GCC에 적용 가능한 RT-PCT 검출 방법을 기재한다. 미국 특허 공개 제20180355062호는 항-GCC 항체 분자를 기재한다.
2.0 개괄
원발성 및/또는 전이성 GUCY2C-발현 종양에 대해 개체를 보호하거나 치료하기 위한 예방 및 치료 백신이 제공된다. 이와 같은 백신을 제조하는 데 유용한 조성물 및 백신의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
암 면역 요법에 대한 가장 큰 장애물 중 하나는 종양-특이적이고, 충분히 면역원성이며, 환자 간에 공유되는 항원의 부족이다. 이상적인 표적 대신에, 항종양 면역 반응은 일반적으로 종양-특이적 단백질보다는 조직-특이적 단백질로 유도된다. 자가-항원 사용에 대한 장벽은 면역 치료 효능을 제한하는 수반되는 자가면역 및 내성의 잠재적 발달을 포함한다. 이러한 제한을 우회하려는 시도는 면역학적으로 특권이 있는 구획에서 발현되는 자가-단백질의 사용을 포함하였다. 제한된 구획 외부의 종양에서 이들의 이소성 발현은 표적화된 구아닐릴 사이클라제 C(GCC)에 대한 기회를 제공하고, 설사성(diarrheagenic) 박테리아의 열-안정성 엔테로톡신 및 내인성 주변분비 호르몬인 구아닐린 및 유로구아닐린에 대한 수용체는 장 상피 세포의 정단막에서 발현되어, 상기 수용체를 점막 면역 구획으로 제한한다. 본 발명의 백신은 자가면역을 유도하지 않으면서 식도, 위, 췌장, 및 결장직장암을 포함하는 GUCY2C-발현 암이 있는 인간 환자의 예방적 또는 치료적 면역화에 유용하다.
일부 실시형태는 암, 특히 결장직장암에 대한 변형된 아데노바이러스 벡터- 기반 백신, 및 면역요법뿐만 아니라 일반 집단에 영향을 미치는 암 예방, 스크리닝, 조기 검출, 진단, 치료 및/또는 생존을 제공한다. 백신은 아데노바이러스 5의 해당 아데노바이러스 단백질을 대체하기 위해 바이러스 단백질 F35가 포함된 재조합 아데노바이러스 벡터의 변형된 버전을 사용한다. 변형된 아데노바이러스 벡터는 Ad5.F35로 지칭될 수 있으며 암 연관 단백질 서열, 예컨대, T 세포 에피토프에 연결된 암 연관 단백질 GUCY2C 세포외 도메인 서열의 일부를 포함하는 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 변형된 아데노바이러스 벡터-기반 항-GUCY2C 백신은 결장직장암 단백질을 체내 면역 세포에 전달해 이들 세포를 결장직장암에 대해 교육시키는 데 사용된다. 그 다음 이렇게 교육받은 면역 세포 중 일부는 신체에 숨어 있는 결장직장암을 찾아 살해할 수 있다. 이러한 교육받은 면역 세포 중 일부는 결장직장암 단백질을 발현하는 세포를 표적으로 하는 항체를 생산하거나 항체의 생산을 유도할 수 있다. 이러한 교육받은 면역 세포 중 일부는 결장직장암 단백질을 발현하는 세포를 표적으로 하는 항체 및 면역 세포의 생산을 유도할 수 있다.
일부 실시형태는 암, 특히 결장직장암, 및 면역요법뿐만 아니라 일반 집단에 영향을 미치는 암 예방, 스크리닝, 조기 검출, 진단, 치료, 및/또는 생존을 위한 리스테리아 백신을 제공한다. 상기 백신은 결장직장암 단백질을 신체 내 면역 세포에 전달해 이들 세포를 결장직장암 연관 단백질을 발현하는 세포에 대해 교육시키는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 "무능력(crippled)" 버전을 사용한다. 그 다음 이렇게 교육받은 면역 세포는 상기 단백질을 발현하고 신체에 숨어 있는 암을 찾아 살해할 수 있다.
일부 실시형태는 암, 특히 결장직장암 연관 단백질 GUCY2C와 같은 암 연관 단백질을 발현하는 결장직장암 세포에 대한 백신접종의 프라임 부스트 방법을 제공한다. 아데노바이러스 기반 GUCY2C 백신과 변형된 리스테리아 모노사이토게네의 조합은 두 백신 중 하나만 단독으로 사용하는 것보다 우수한 면역 반응을 생성한다.
GUCY2C에 대한 효과적인 면역 반응은 췌장, 위 및 식도와 같이 단백질 GUCY2C를 발현하는 다른 여러 암뿐만 아니라 전형적으로 치명적인 질환인 전이성 결장직장암과 같은 이와 같은 단백질을 발현하는 임의의 암을 치료하는 데 유용하다.
3.0 아데노바이러스 기반 항-GUCY2C 백신(Ad5-GUCY2C ECD T-세포 에피토프)
아데노바이러스는 백신 설계를 위해 널리 사용되는 바이러스-벡터 플랫폼을 나타낸다. 본 발명자들은 이전에 GUCY2C에 대한 아데노바이러스(Ad5) 및 DNA 기반 백신이 항종양 면역을 생성하는 GUCY2C-특이적 T 세포 반응을 생성한다는 것을 입증한 바 있다. CD4+ 헬퍼 에피토프에 연결된 GCCECD를 포함하는 키메라 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 입자는 동시-계류 중인 출원 일련 번호 제13/120,144호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 기재된 다양한 GUCY2CECDT-세포 에피토프 작제물은 항-GUCY2C 백신을 생산하기 위해 아데노바이러스 Ad5 벡터와 함께 사용될 수 있다.
인간에서 유전자 발현을 위해 현재 사용되는 대부분의 아데노바이러스 벡터는 혈청형 5 Ad 벡터에 의존한다. 아데노바이러스 감염은 섬유 단백질을 통해 세포 표면에 Ad 5를 부착함으로써 개시된다(Shenk, T. 1996 Fields Virology, Volume 2, Fields, BN et al. (Eds), Volume 2, Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 2111-2148). 삼량체 섬유 분자의 원위 C-말단 도메인은 Ad5의 경우 콕사키 아데노바이러스 수용체(CAR)인 특정 세포 수용체에 결합하는 "노브"로 끝난다(Bergelson, JM et al. Science, 275, 1320-1323). 결합 후 세포 내재화는 바이러스 부착과 무관한 사건에서 펜톤 염기의 Arg-Gly-Asp(RGD-모티프)와 세포 인테그린을 상호작용시킨다.
Ad5는 자연적인 인간 병원체로서 거의 전체 인간 집단에서 가벼운 감염을 일으킨다(Yu, B., et al. (2012) J Med Virol 84(9): 1408-1414). 이러한 자연 노출은 표적 항원 발현 및 면역 반응 유도에 필요한 단계인 숙주 세포의 감염을 방지함으로써 재감염 또는 Ad5-기반 백신접종을 제한하는 Ad5-특이적 중화 항체(NAb)를 유도한다(Priddy, F. H., et al. (2008) Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781; Schirmbeck, R., et al. (2008) Mol Ther 16(9): 1609-1616; Small, J. C., et al. (2014) J Leukoc Biol 96(5): 821-831).
본 발명자들은 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C) 백신(Ad5-GUCY2C)을 발현하는 인간 아데노바이러스 5형(Ad5)으로 마우스를 면역화시키면 GUCY2C에 대한 면역 반응과 결장직장암에 대한 면역이 유도된다는 것을 보여주었다. (Snook AE, et al. J Natl Cancer Inst. 2008;100(13):950-6). 본 발명자들은 I상 임상 시험에서 해당 관찰을 인간에게 확장하였다. 실시예 1은 Ad5 중화 항체 GUCY2C-특이적 T-세포 반응 사이의 상관관계를 보고하며, 여기서 반응은 Ad5 NAb 저 환자에서 유의하게 더 컸다. GUCY2C에 대한 1회 면역은 일부 개체에서 제한된 항종양 면역을 생성할 수 있으며 Ad5-GUCY2C를 이용한 반복 면역은 투여 후 백신-유도 Ad5 중화 항체로 인해 효과가 없게 될 수 있다.
4.0 변형된-아데노바이러스 기반 백신
4.1 Ad5F35 벡터
자연-발생 Ad5 NAb는 Ad5 표면의 섬유 분자를 표적으로 한다(Cheng, C., et al. (2010) J Virol 84(1): 630-638). 이는 Ad5의 섬유 분자를 B 그룹 아데노바이러스 Ad35의 섬유 분자(이에 대해 자연 면역을 가진 사람이 거의 없음)로 대체하면 자연-발생 Ad5 면역에 의해 영향을 받지 않는 키메라 Ad5 바이러스 벡터(Ad5.F35로 알려짐)를 생성할 수 있음을 시사할 수 있다. Sumida 등은 기능적으로 중요한 Ad5-특이적 NAb가 주로 Ad5 헥손 단백질에 대해 유도된다는 것을 발견하였다. (Sumida et al, Journal of Immunology (2005) 174 (11) 7179-7185) Hong 등은 펜톤 염기에 대한 항체와 관련하여 상당한 중화 효과를 보고하였다. (Hong S.S. et al. J. Virol. 2003; 77: 10366-10375)
Ad5.F35 벡터를 포함하여 B군 Ad 섬유를 포함하는 벡터는 초기 세포 부착을 위해 CD46을 사용한다(Gaggar, A., et al. (2003). Nat. Med. 9: 1408 - 1412). 인간에서 CD46은 모든 유핵 세포에서 낮은 수준으로 발현된다. Ad5.F35 벡터가 시험관내 및 잠재적으로 생체내에서 수지상 세포를 효율적으로 형질도입하지만, 많은 발견이 생체내 백신접종을 위한 이러한 벡터의 유용성에 반대 의견을 보일 수 있다. (i) CD46 신호전달(CD46 단클론성 항체, 재조합 보체 인자 C3b, 또는 홍역 바이러스 혈구응집소의 결합 시)은 면역억제를 유도할 수 있다(Schneider-Schaulies, S., and ter Meulen, V. (2002). Springer Semin. Immunopathol. 24: 127 - 148). (ii) 폐렴 및 패혈증으로 이어지는 Ad35 발병에 대한 연구는 일시적인 호중구감소증을 보였으며, 이는 Ad35 감염에 의해 직접적으로 유발될 수 있었다(Sanchez, M. P., et al. (1997). J. Infect. Dis. 176: 760 - 763). (iii) 또한 CD46을 수용체로서 사용하는 홍역 바이러스 및 HHV6은 수지상 세포 전구체, 골수 기질 세포, 또는 CD34+ 골수 전구체 수준에서 일시적인 면역억제를 유발할 수 있다(Manchester, M., et al. (2002). J. Virol. 76: 6636 - 6642). 이러한 고려 사항은 결과가 혼합된 연구를 초래하였다. 상기 요인에 주목한 한 연구에서는 테스트 항원(B형 간염 코어 항원)에 대한 AD5.F35 백신접종이 CD46 형질전환 마우스에서 면역 억제를 유도하지 않은 것으로 밝혀졌으며, 그 결과가 항원 특이적일 수 있음에 주목하였다(DiPaolo N, et al. Mol Ther. 2006;13(4):756-765). 그러나 영장류에서의 연구에서는 홍역 혈구응집소 백신 삽입물이 있는 Ad5.Fib35에서 Ad5로 유사하게 면역된 동물보다 삽입물 특이적 체액 및 세포 면역 반응의 감소가 있는 것이 감소한 것으로 밝혀졌다(Ophorst, O. J., et al. (2004). Vaccine 22: 3035 - 3044).
본 발명은 a) Ad5.F35 벡터; 및 i) 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산; ii) 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터; 및 iii) 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 백신 벡터 Ad5.F35뿐만 아니라, 이에 의존하는 백신 및 방법을 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 복제 능력이 있을 수 있다. 그러나, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포에서 복제-결핍이다.
EP 제1 693 459 A1호, WO 제2000/073478 A9호 및 EP 제1 322 774 A2호(이들은 각각 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)는 Ad5의 친화성(바이러스에 의해 표적화된 세포/조직)을 변형시키기 위한 키메라 Ad5.F35 벡터를 기재한다. 어느 것도 Ad5 중화 면역에 대한 무감각을 기재하지 않는다.
키메라 Ad5.Fib35 바이러스 벡터의 구축은 3개의 단편, 즉 (i) 섬유 꼬리 도메인의 Ad5 섬유 비-번역 영역 및 처음 132 bp; (ii) Ad35 샤프트 및 노브 도메인; 및; (iii) Ad5 섬유 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Ad5E4 영역이 증폭되는 2 단계 PCR 접근법을 통해 Shayakhmetov 등에 의해 설명되었다. 생성된 단편의 정제 후, 이들 단편은 결합되고 키메라 섬유의 정확한 말단을 지시하는 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 프라이밍된 추가적인 PCR 반응을 거친다. 그 다음 생성된 증폭된 단편은 결찰에 의해 공여체 플라스미드로 치환되고 키메라 섬유의 치환은 Rec+ 이. 콜라이 균주 BJ5183의 플라스미드 내에 함유된 벡터 게놈과의 재조합에 의해 수행된다. 상응하는 바이러스를 생성하기 위해, 올바른 것으로 검증된 클론을 제한 효소 PacI로 분해하여 바이러스 게놈을 방출하고 293 세포에 형질감염시켰다(Shayakhmetov DM et al. J Virol 2000; 74: 2567-2583). EP 제1550722B1호는 공여체 벡터에서 Ad5 섬유 서열의 직접 교체 및 후속적인 재조합 및 증폭의 유사한 절차를 기재한다.
외래 유전자 삽입물을 운반하는 Ad 벡터를 구축하기 위해 수많은 전략이 개발되었다. 전통적으로, Ad 벡터는 2가지 표준 방법을 사용하여 구축되었다. 첫 번째 방법은 Ad 게놈의 나머지 부분을 나타내는 DNA 단편과 Ad 서열이 측접된 외래 유전자 삽입물을 운반하는 플라스미드의 제한 소화에 의해 얻은 DNA 단편의 결찰을 포함하는 시험관내 결찰 방법이다(Stow ND. J Virol.　1981; 37:171-80). 두 번째 방법은 2개의 플라스미드, 즉 부위-특이적 삽입을 위한 Ad 서열이 측접한 외래 유전자 삽입물을 운반하는 셔틀 플라스미드와 거의 전체 Ad 게놈을 운반하는 게놈 플라스미드 사이의 허용 세포주에서 상동 재조합으로 이루어졌다. (Bett AJ, et al. Proc Natl Acad Sci U S A.　1994; 91:8802-6. 이러한 고전적인 벡터 구축 방법은 보통 효율성이 낮고 때때로 부모 바이러스로 오염될 수 있다.
전통적인 방법의 한계를 우회하기 위해 대체 접근법이 개발되었다. 이와 같은 전략 중 하나는 Ad 벡터를 생성하기 위해 이. 콜라이(BJ5183)의 고효율 상동성 재조합 기구를 기반으로 한다[16-19]. 거의 전체 Ad 게놈을 함유하는 선형화되거나 온전한 플라스미드와 Ad 게놈의 삽입 부위로부터 상동 서열이 측접된 외인성 발현 카세트를 함유하는 셔틀 플라스미드 사이의 상동성 재조합은 원하는 영역에 변형 및/또는 삽입이 있는 감염성 클론을 생성한다. 효모에서 상동성 재조합을 이용하는 유사한 전략이 보고된 바 있다[20]. 이 전략은 Ad DNA와, Ad 게놈의 좌측 및 우측 말단의 서열을 함유하는 효모 인공 염색체(YAC) 벡터 간의 상동성 재조합을 포함하여, Ad 게놈의 감염성 복사체를 함유하는 효모 인공 염색체를 생성을 초래한다. 절제된 Ad 게놈을 적절한 세포로 형질감염시키면 감염성 비리온의 생성이 초래된다.
포유동물 세포에서 상동성 재조합의 낮은 효율을 극복하기 위해, 박테리오파지 P1 Cre/LoxP 재조합 시스템에 기반한 접근법이 개발되었다. (Aoki K, et al. 　Mol Med.　1999; 5:224-31; Hardy S, et al.　J Virol.　1997; 71:1842-9; Ng et al. Hum Gene Ther.　1999; 10:2667-72; Ng et al. 　Hum Gene Ther.　2000; 11:693-9; Ng et al. J Virol.　2002; 76:4181-9.
Ad 벡터는 Cre 재조합효소를 발현하는 적합한 세포주로 공동-형질감염된 후 두 플라스미드 사이의 Cre-매개 부위-특이적 재조합의 결과로 생성된다. Cre/LoxP-기반 시스템을 사용하는 벡터 생성 빈도는 전통적인 상동성 재조합 방법과 비교하여 30 내지 100배 더 높은 것으로 밝혀졌다.
4.2 GUCY2C ECD
기능적인 성숙한 GCC 단백질 신호 서열이 절단될 때 생성된다. 기능적인 성숙한 GCC 단백질은 전형적으로 서열번호 2의 아미노산 잔기 22 내지 1073, 서열번호 2의 아미노산 잔기 23 내지 1073 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 24 내지 1073을 포함한다. 성숙한 GCC 단백질은 세포외 도메인, 막관통 도메인, 키나제 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 포함한다.
백신은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 절단된 형태의 GCC 단백질을 포함하며, 이는 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 54 내지 아미노산 잔기 384의 서열을 포함하는 약 330 내지 423개의 아미노산 잔기를 포함한다. 세포외 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22, 23 또는 24 내지 아미노산 잔기 420 내지 435의 서열을 포함할 수 있다. 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 세포외 도메인의 서열은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22 내지 아미노산 잔기 435의 서열, 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 54 내지 약 아미노산 잔기 384의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22, 23 또는 24 내지 아미노산 잔기 420 내지 435의 서열을 포함하는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 아미노산 잔기 22 내지 아미노산 잔기 435의 서열의 330 내지 422개의 아미노산 잔기 단편을 포함할 수 있다. 작제물은 또한 가용성 GCC 작제물이 세포막에 고정되는 것을 방지하는 기능을 하기에 충분하지 않다면 막관통 도메인의 서열을 포함할 수 있다. 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 막관통 도메인은 전형적으로 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 436 내지 약 아미노산 잔기 452의 서열을 포함하는 약 16 내지 23개의 아미노산 잔기를 포함한다. 막관통 도메인은 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열, 예를 들어, 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 436 내지 약 아미노산 잔기 452의 서열 또는 기능적인 성숙한 GCC 단백질의 약 아미노산 잔기 431 내지 약 아미노산 잔기 454의 서열의 16 내지 22개의 아미노산 단편을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 막관통 서열은 포함되지 않는다.
4.3 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프
개선된 항-GUCY2C 면역 반응을 유도하기 위해, 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 GUCY2C 서열에 연결하여 융합 단백질을 생성할 수 있다. 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프는 다수 HLA 유형에 대해 일치하고 따라서 다수 HLA 유형에 의해 인식되는 펩타이드 서열이다. 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프의 예는 PADRE(Pan DR 에피토프 펩타이드)이다.
PADRE 펩타이드는 HLA-DR의 가장 일반적인 16가지 유형 중 적어도 15가지와 복합체를 형성한다. 인간은 적어도 하나의 DR을 가지고 PADRE는 많은 유형에 결합하기 때문에, PADRE는 대부분의 인간에게 효과적일 가능성이 높다. PADRE 및 기타와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프는 1998년 4월 7일자로 Sette 등에게 허여된 미국 특허 제5,736,142호; 2002년 7월 2일자로 Sette 등에게 허여된 미국 특허 제6,413,935호; 및 2007년 4월 10일자로 Sette 등에게 허여된 미국 특허 제7,202,351호 및 WO 제1995007707A1호에 기재되어 있다.
보편적인 HLA-DR 에피토프 PADRE(KXVAAWTLKA)이 기재되었다.
(Alexander, J, et al. J. Immunol, 2000 Feb 1, 164(3):1625-33; Agadjanyan et al. J Immunol 2005; 174:1580-6).
PADRE가 단백질 항원에 융합될 때, 여러 연구자들은 관심이 있는 항원과 함께 프레임 내에서 발현되는 펩타이드 서열 AKFVAAWTLKAAA를 사용하였다.
Wei J, et al. Cancer Biother Radiopharm 2008, 23:121-8;
Bargieri D Y et al. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007, 102:313-7;
피. 비박스 MSP1 DYDVVYLKPLAGMYK(서열번호 12)의 33 kDa C-말단 영역에 존재하는 T 세포 에피토프는 또한 상이한 클래스 II HLA 일배체형을 가지는 비-인간 영장류에서 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Rosa et. al. Microbes Infect 2006, 8:2130-7;
문헌[Sinigaglia et al., Nature 336, 778-780 (1988)]은 마우스 및 인간의 다양한 여러 가지 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 T 세포에 의해 인식되는 포자소체 단백질로부터 유래된 플라스모듐 팔시파룸 펩타이드를 기재한다. 잔기 위치 378 내지 398의 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(서열번호 13), 및 이의 N 및 C 결실, 예를 들어, IEKKIAKMEKASSVFNVVNS(서열번호 14), EKKIAKMEKASSVFNVVNS(서열번호 15), DIEKKIAKMEKASSVFNVVN(서열번호 16), DIEKKIAKMEKASSVFNVV(서열번호 17), DIEKKIAKMEKASSVFNV(서열번호 18)로부터 유래된 펩타이드는 강력한 반응을 유도하였다.
이와 같은 CD4+ T 세포 에피토프를 함유하는 단백질의 예인 상이한 단백질 및 상이한 펩타이드의 예가 본 명세서에서 제공된다. 이들 단백질 및 펩타이드는 CD4+ T 세포 에피토프의 비-제한적인 예인 것으로 의도된다.
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 파상풍 독소, 예를 들어 TT830-844 QYIKANSKFIGITEL(서열번호 19), 및 TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(서열번호 20)로부터 유래될 수 있다.
Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19, 2237-2242 (1989); Renard V, J Immunol 2003; 171:1588-95; TT590-603 TKIYSYFPSVISKV(서열번호 21), TT615-629 VRDIIDDFTNESSQK(서열번호 22), TT639-652 VSTIVPYIGPALNI(서열번호 23), TT830-843 QYIKANSKFIGITE(서열번호24) 및 TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(서열번호 25)
BenMohamed et al. Hum Immunol 2000; 61:764-79;
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 인플루엔자 혈구응집소, 예를 들어, 인플루엔자 혈구응집소 잔기 306 내지 318 PKYVKQNTLKLAT(서열번호 26)로부터 유래될 수 있다. (Busch et al., Int. Immunol. 2, 443-451 (1990); Mom et al. BMC Immunol 2005; 6:24).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)으로부터 유래될 수 있다(Litjens et al,. J Immunol Methods 2008; 330:1-11).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 박테리아 병원체(예컨대, 아나플라스마 마르지날스(Anaplasma marginals))의 외막 단백질(OMP)로부터 유래될 수 있다(Macmillan H, Norimine J, Brayton K A, Palmer G H, Brown W C. Physical linkage of naturally complexed bacterial outer membrane proteins enhances immunogenicity. Infect Immun 2008; 76:1223-9).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 엔테로바이러스 71(EV71) 균주 41의 VP1 캡시드 단백질, 예를 들어 잔기 66 내지 77 IETRCVLNSHSTAET(서열번호 27), 잔기 145 내지 159 EVVPQLLQYMFVPPG(서열번호 28), 및 잔기 247 내지 261 LVVRIYMRMKHVRAW(서열번호 29)로부터 유래될 수 있다. (Wei Foo et al. Viral Immunol 2008).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 EBV BMLF1로부터 유래될 수 있다(Schlienger K, Craighead N, Lee K P, Levine B L, June C H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4(+) T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood 2000; 96:3490-8; Neidhart J, Allen K O, Barlow D L, Carpenter M, Shaw D R, Triozzi PL, Conry R M. Immunization of colorectal cancer patients with recombinant baculovirus-derived KSA (Ep-CAM) formulated with monophosphoryl lipid A in liposomal emulsion, with and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Vaccine 2004; 22:773-80; Piriou E R, van Dort K, Nanlohy N M, van Oers M H, Miedema F, van Baarle D. Novel method for detection of virus-specific CD4+ T cells indicates a decreased EBV-specific CD4+ T cell response in untreated HIV-infected subjects. Eur J Immunol 2005; 35:796-805; Heller K N, Upshaw J, Seyoum B, Zebroski H, Munz C. Distinct memory CD4+ T-cell subsets mediate immune recognition of Epstein Barr virus nuclear antigen 1 in healthy virus carriers. Blood 2007; 109:1138-46).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 EBV LMPI, 예를 들어, LMP1159-175 YLQQNWWTLLVDLLWLL(서열번호 30)로부터 유래될 수 있다(Kobayashi et al. Cancer Res 2008; 68:901-8).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 HIV Gag p24, 예를 들어, Gag131-15 NYPIVQNIQGQMVHQAISPR(서열번호 31),
Gag 211-230 EWDRVHPVHAGPIAPGQMRE(서열번호 32),
Gag 241-260 STLQEQIGWMTNNPPIPVGE(서열번호 33),
Gag 263-277 KRWIILGLNKIVRMY(서열번호 34),
Gag 271-290 NKIVRMYSPTSILDIRQGPK(서열번호 35),
Gag 291-310 EPFRDYVDRFYKTLRAEQAS(서열번호 36),
Gag 301-320YKTLRAEQASQEVKNWMTET(서열번호 37),
Gag 321-340 LLVQNANPDCKTILKALGPA(서열번호 38),
Gag 331-350 KTILKALGPAATLEEMMTAC(서열번호 39)로부터 유래될 수 있다(Pajot et al. Eur J Immunol 2007; 37:2635-44).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 아데노바이러스 5 헥손 단백질, 예를 들어, 위치 556 내지 580 VPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYT(서열번호 40),
잔기 56 내지 80 VTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSY(서열번호 41),
잔기 316 내지 335 GQQSMPNRPNYIAFRDNFIG(서열번호 42) 및
잔기 906 내지 930 EVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHR(서열번호 43)에서 발견되는 잔기로부터 유래될 수 있다(Leen et al. J Virol 2008; 82:546-54). 전체적으로 다중 MHC-II 일배체형에 대해 30개 초과의 확인된 CD4+ T 세포 에피토프가 있다.
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 백시니아 바이러스 단백질, 예를 들어, 잔기 21 내지 29(YLVLKAVKV)의 F17R 단백질 잔기 및 잔기 20 내지 28 FRIVSTVLP의 A10L 단백질 잔기로부터 유래될 수 있다. (Calvo-Calle et al. PLoS Pathog 2007; 3:1511-29) Calvo-Calle은 24개의 상이한 백시니아 단백질로부터 다중 MHC-II 일배체형에 대해 25개 초과의 CD4+ T 세포 에피토프를 확인하였다.
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 열 충격 단백질로부터 유래된다(Liu D W, Tsao Y P, Kung J T, Ding Y A, Sytwu H K, Xiao X, Chen S L. Recombinant adeno-associated virus expressing human papillomavirus type 16 E7 peptide DNA fused with heat shock protein DNA as a potential vaccine for cervical cancer. J Virol 2000; 74:2888-94.)
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 IgG의 Fc 부분으로부터 유래된다(You Z, Huang X F, Hester J, Rollins L, Rooney C, Chen S Y. Induction of vigorous helper and cytotoxic T cell as well as B cell responses by dendritic cells expressing a modified antigen targeting receptor-mediated internalization pathway. J Immunol 2000; 165:4581-91).
일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 에피토프는 인간 LAMP-1 단백질의 리소좀 표적화 신호로부터 유래된다(Su Z, Vieweg J, Weizer A Z, Dahm P, Yancey D, Turaga V, Higgins J, Boczkowski D, Gilboa E, Dannull J. Enhanced induction of telomerase-specific CD4(+) T cells using dendritic cells transfected with RNA encoding a chimeric gene product. Cancer Res 2002; 62:5041-8).
표시된 HLA 분자에 대한 대표적인 CD4+ T 세포 에피토프뿐만 아니라 HLA 일배체형의 샘플은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
HLA-DR*1101 - 파상풍 톡소이드 펩타이드 잔기 829 내지 844, 헤마글루티닌 펩타이드 잔기 306 내지 318(Moro M, Cecconi V, Martinoli C, Dallegno E, Giabbai B, Degano M, Glaichenhaus N, Protti M P, Dellabona P, Casorati G. Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides. BMC Immunol 2005; 6:24.)
HLA-DRB1*0101(DR1) - 파상풍 톡소이드 펩타이드 잔기 639 내지 652, 830 내지 843 또는 947 내지 967 및 14가지의 기타 파상풍 톡소이드 펩타이드(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond D J. Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response. Hum Immunol 2000; 61:764-79; 및 James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W Long mate. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
HLA-DRB1*0301 - EV71 VP1 잔기 145 내지 159 또는 247 내지 261 및 5가지의 상이한 파상풍 톡소이드 펩타이드(Wei Foo D G, Macary P A, Alonso S, Poh C L. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008; 및 James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W Pooh. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
HLA-DRB1*0405 - EV71 VP1 잔기 145 내지 159 또는 247 내지 261(Wei Foo D G, Macary P A, Alonso S, Poh C L. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008).
HLA-DRB1*1301 - EV71 VPI 잔기 145 내지 159 또는 247 내지 261(Wei Foo D G, Macary P A, Alonso S, Poh C L. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP 1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008).
HLA-DR9 - 엡스타인 바 바이러스(EBV) 잠복성 막 단백질 1(LMP1) 잔기 159 내지 175(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8).
HLA-DR53 EBV LMP1 잔기 159 내지 175(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8).
HLA-DR15 EBV LMP1 잔기 159 내지 175(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8).
HLA-DRB1*0401 - 15가지의 상이한 파상풍 톡소이드 펩타이드(James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W W. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
HLA-DRB1*0701 - 9가지의 상이한 파상풍 톡소이드 펩타이드(James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W W. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
HLA-DRB1*1501 - 7가지의 상이한 파상풍 톡소이드 펩타이드(James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W W. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
HLA-DRB5*0101 - 8가지의 상이한 파상풍 톡소이드 펩타이드(James E A, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok W W. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301).
4.4 AD5.F35-GUCY2C 백신 작제물
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, AD5.F35-GUCY2C, AD5.F35-GUCY2CECD, AD5.F35-GUCY2C-보편적인 T 세포 에피토프, AD5.F35-GUCY2CECD-보편적인 T 세포 에피토프는, 백신에 의한 감염이 보편적인 T 세포 에피토프 융합 단백질에 연결된 GUCY2CECD가 감염된 세포에 의해 발현되고 분비되도록 보편적인 T 세포 에피토프에 연결된 GUCY2CECD를 인코딩하는 유전자 삽입물이 있는 Ad5.F35 아데노바이러스를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용된다. 바람직한 실시형태에서 AD5.F35-GUCY2C 백신의 보편적인 T 세포 에피토프는 보편적인 T 세포 에피토프 PADRE이다. 따라서, 바람직한 실시형태는 AD5.F35-GUCY2C-PADRE 및 AD5.F35-GUCY2CECD-PADRE로 호환 가능하게 지칭될 수 있다. AD5.F35-GUCY2C 백신 사용 방법에 대한 모든 언급은 일반적인 AD5.F35-GUCY2C 백신과 특히 AD5.F35-GUCY2CECD-PADRE 백신을 기재하는 것으로 의도된다.
4.5 AD5.F35-GUCY2C 백신을 사용하는 치료 방법
본 발명의 양태는 GUCY2C를 발현하는 암/종양을 가지는 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 치료는 전신으로 제공된다. 이와 같은 개체를 본 명세서에 제시된 바와 같은 백신으로 치료함으로써, GUCY2C를 발현하는 암 세포를 특이적으로 표적으로 하는 면역 반응이 개체의 면역계의 말초 구획에서 유도될 수 있다. 백신은 확인된 전이성 질환을 포함한 원발성 또는 전이성 질환뿐만 아니라, 미세전이와 같은 미검출 전이를 치료한다.
백신은 점막 조직과 관련된 암 진단 시 제공되는 일반적인 치료와 함께 보조 치료적 치료를 제공한다. 상기 출원에서 논의된 바와 같이, 당업자는 GUCY2C를 발현하는 것으로서 암 또는 종양을 진단할 수 있다. 전이성 질환의 검출은 일상적인 방법론을 사용하여 수행될 수 있지만 암의 초기 진단 시에는 약간의 미소한 암 수준이 검출되지 않을 수 있다. 전형적인 치료 방식은 수술, 화학요법 또는 방사선 요법, 또는 다양한 조합을 포함한다. GUCY2C를 표적으로 하는 백신은 정상 조직을 공격하지 않고 GUCY2C를 발현하는 면역학적으로 보호된 구획에서 유래하는 암 세포를 선택적으로 검출하고 제거하는 이점을 가지는 추가적인 무기를 제공한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 개체는 암을 가지는 것으로 진단되고 암은 GUCY2C를 발현하는 것으로 확인된다. CD4+ 헬퍼 에피토프에 연결된 가용성 GUCY2C를 발현하는 AD5.F35-GUCY2C 백신은 환자에게 단독으로 또는 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는 치료 요법의 일부로 투여된다.
4.6 AD5.F35-GUCY2C 백신을 사용한 예방적 방법
백신은 또한 GUCY2C 암/종양으로 발전할 위험이 있는 개체에게 예방적으로 사용될 수 있다. 제거되었거나 관해 상태에 있는 원발성 질환에 대한 이전 진단은 개체를 더 높은 위험에 처하게 한다.
점막 조직 암으로 발전할 위험이 있는 개체는 개체가 검출 가능한 질환을 가지기 전에 암 세포를 제거하는 면역 반응을 유도하기 위해 백신을 투여받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 이와 같은 개체는 또한 CD4+ 헬퍼 에피토프 유형에 대해 확인될 수 있다. 개체에게 투여되는 백신은 점막으로 제한된 항원에 대한 단백질 또는 유전자 코드와 개체에 의해 인식되는 하나 이상의 CD4+ 헬퍼 에피토프를 함유한다. 그러나 PADRE와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 이용하는 것이 더 실용적일 수 있다.
4.7 백신 조성물, 제형, 용량 및 요법
일부 실시형태에 따른 백신은 핵산 분자, 바이러스, 단백질 또는 세포와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터일 수 있는 활성제와 조합하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약제학적 제형은 잘 알려져 있고 이와 같은 활성제를 포함하는 약제학적 조성물은 당업자에 의해 일상적으로 제형화될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 이 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다. 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 활성제를 포함하는 주사 가능한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 멸균되고 발열원이 없다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성제는 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 이와 같은 비히클의 예에는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 있다. 리포솜 및 고정유와 같은 비수성 비히클도 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기법에 의해 멸균된다.
주사 가능한 조성물은 희석제, 예를 들어 멸균수, 전해질/덱스트로스, 식물 기원의 지방 오일, 지방 에스터, 또는 폴리올, 예컨대, 프로필렌 글라이콜 및 폴리에틸렌 글라이콜에 면역원을 포함할 수 있다. 주사제는 멸균되어야 하고 발열원이 없어야 한다.
백신은 면역원성 반응의 인식 및 유도를 위해 면역원성 작용제가 신체의 면역계에 제시될 수 있게 하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 비경구로, 즉 정맥내, 피하, 근육내로 투여될 수 있다.
투약량은 활성제의 특성 및 특정 작용제의 약력학적 특징, 투여 방식 및 경로와 같은 알려진 요인; 수용체의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 특성 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 다르다. 면역원의 양은 보호적이거나 치료적으로 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 전달된다. 당업자는 일상적인 방법에 의해 범위 및 최적 투약량을 용이하게 결정할 수 있다.
다음 실시예는 예시적인 실시형태로서만 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
5.0 리스테리아 모노사이토게네스 벡터-기반 백신
본 발명자들은 GUCY2C(Lm-GUCY2C)를 발현하는 리스테리아 모노사이토게네스(Lm)의 재조합 균주를 개발하였으며 감염된 대식세포 내에서 GUCY2C를 분비하고(도 11), Ad5(도 12) 또는 DNA 백신접종(도 13) 후 GUCY2C-특이적 T 세포 반응을 증강시키는 능력을 입증하였다. 이러한 Lm-GUCY2C-기반 백신접종 요법은 결장직장암, 위암, 식도암, 췌장암 및 타액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 GUCY2C-발현 암 환자에서 강력한 항종양 효능을 유도할 것으로 예상된다. "Lm-GUCY2C"의 여러 상이한 변형이 개시된다.
1. Lm-LLO-GUCY2C:
a. 강력한 Lm 프로모터, 예컨대, hly[리스테리오리신 O; (LLO)]; iap[p60; p60], 액타[액틴-어셈블리 유도 단백질; (액트A)]; 또는 다른 PrfA-의존성 프로모터를 이용한다.
b. LLO의 C-말단(아미노산 약 1 내지 약 420)에 융합된 GUCY2C 세포외 도메인(아미노산 약 23 내지 약 429)을 이용하여 세포질 분비를 촉진시킨다.
2. Lm-ActA-GUCY2C:
a. 강력한 Lm 프로모터, 예컨대, hly[리스테리오리신 O; (LLO)]; iap[p60; p60], 액타[액틴-어셈블리 유도 단백질; (액트A)]; 또는 다른 PrfA-의존성 프로모터를 이용한다.
b. ActAN100*로 알려진 ActA의 변형된 형태(본 명세서에 참조에 의해 원용된 미국 특허 US 제20180030457A1에 기재됨)의 C-말단에 융합된 GUCY2C 세포외 도메인(아미노산 약 23 내지 약 429)을 이용한다.
3. Lm-ActA-Syn18x5-GUCY2C:
a. 강력한 Lm 프로모터, 예컨대, hly[리스테리오리신 O; (LLO)]; iap[p60; p60], 액타[액틴-어셈블리 유도 단백질; (액트A)]; 또는 다른 PrfA-의존성 프로모터를 이용한다.
b. 융합 단백질 발현을 향상시키는 Syn18x5 서열(미국 특허 US 제20180030457A1호)에 연결된 C-말단의 GUCY2C 세포외 도메인(아미노산 약 23 내지 약 429) 및 세포질 분비를 촉진시키는 N-말단의 ActAN100*(미국 특허 US 제20180030457A1호)로 알려진 ActA의 변형된 형태로 이루어진 융합 단백질을 이용한다.
4. 단독으로 또는 다른 단백질에 융합된 GUCY2C 단백질/펩타이드의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 Lm-GUCY2C의 다른 변이가 또한 가능하고 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 이들은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 Lm 균주 "백본"을 이용할 수 있다.
1. 야생형 10403S 리스테리아 모노사이토게네스 균주의 ΔactA/ΔinLB 버전(미국 특허 제7,691,393호; 제7,695,725호, 이들은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)
2. 상기 ΔactA/ΔinLB 버전에서 유래하지만 또한 uvrA 및 uvrB 유전자 결실도 함유하는 사멸되었지만 대사는 활성인(killed but metabolically active; KBMA) 버전.
3. 야생형 10403S 리스테리아 모노사이토게네스 균주의 dal dat ΔactA 버전.
4. prfA-결핍 리스테리아 모노사이토게네스 균주 XFL-7.
일부 실시형태에서, Lm 벡터는 상기 섹션 4.2에 기재된 것과 같은 여러 상이한 GUCY2C 삽입물 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 그에 연결된 보편적인 에피토프가 없는 GUCY2CECD에 대한 코딩 서열이 Lm 벡터에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 섹션 4.2에 기재된 것과 같은 GUCY2C 삽입체는 섹션 4.3에 기재된 보편적인 T 세포 에피토프에 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 Lm-GUCY2C, Lm-GUCY2CECD, Lm-GUCY2C-보편적인 T 세포 에피토프 및 Lm-GUCY2CECD-보편적인 T 세포 에피토프는, 백신에 의한 감염이 보편적인 T 세포 에피토프 융합 단백질에 연결된 GUCY2CECD가 감염된 세포에 의해 발현되고 분비되도록 보편적인 T 세포 에피토프에 연결된 GUCY2CECD를 인코딩하는 유전자 삽입물이 있는 Lm 벡터를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용된다. 보편적인 T 세포 에피토프를 함유하는 일부 실시형태에서, 보편적인 T 세포 에피토프는 PADRE이다. Lm-GUCY2C-PADRE 및 Lm-GUCY2CECD-PADRE는 PADRE를 포함하는 이와 같은 실시형태를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용된다.
6.0 AD5.F35-GUCY2C 백신, Lm-GUCY2C 백신 또는 AD5.F35-GUCY2C 백신과 Lm-GUCY2C 백신의 조합물을 사용하는 치료 방법
본 발명의 양태는 GUCY2C를 발현하는 암/종양을 가지는 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 치료는 전신으로 제공된다. 이와 같은 개체를 본 명세서에 제시된 바와 같은 백신으로 치료함으로써, GUCY2C를 발현하는 암 세포를 특이적으로 표적으로 하는 면역 반응이 개체의 면역계의 말초 구획에서 유도될 수 있다. 백신은 확인된 전이성 질환을 포함한 원발성 또는 전이성 질환뿐만 아니라, 미세전이와 같은 미검출 전이를 치료한다.
백신은 점막 조직과 관련된 암 진단 시 제공되는 일반적인 치료와 함께 보조 치료적 치료를 제공한다. 상기 출원에서 논의된 바와 같이, 당업자는 GUCY2C를 발현하는 것으로서 암 또는 종양을 진단할 수 있다. 전이성 질환의 검출은 일상적인 방법론을 사용하여 수행될 수 있지만 암의 초기 진단 시에는 약간의 미소한 암 수준이 검출되지 않을 수 있다. 전형적인 치료 방식은 수술, 화학요법 또는 방사선 요법, 또는 다양한 조합을 포함한다. GUCY2C를 표적으로 하는 백신은 정상 조직을 공격하지 않고 GUCY2C를 발현하는 면역학적으로 보호된 구획에서 유래하는 암 세포를 선택적으로 검출하고 제거하는 이점을 가지는 추가적인 무기를 제공한다.
일부 실시형태에서, 개체는 암을 가지는 것으로 진단되고 암은 GUCY2C를 발현하는 것으로 확인된다. CD4+ 헬퍼 에피토프에 연결된 가용성 GUCY2C를 발현하는 AD5.F35-GUCY2C 백신은 환자에게 단독으로 또는 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는 치료 요법의 일부로 투여된다.
일부 실시형태에서, 개체는 암을 가지는 것으로 진단되고 암은 GUCY2C를 발현하는 것으로 확인된다. 가용성 GUCY2C를 발현하는 Lm-GUCY2C 백신은 환자에게 단독으로 또는 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는 치료 요법의 일부로 투여된다.
일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖는 것으로 진단되고 암은 GUCY2C를 발현하는 것으로 확인된다. 프라임-부스트 방법은 아데노바이러스 벡터-기반 항-GUCY2C 백신과 Lm 벡터-기반 항GUCY2C 백신을 순차적으로 조합하여 시행된다. 일부 실시형태에서, 개체는 먼저 GUCY2C의 가용성을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 투여받고, 이어서 Lm 벡터-기반 항-GUCY2C 백신을 투여받는다. 이와 같은 일부 실시형태에서, 개체는 바람직하게는 먼저 AD5.F35-GUCY2C 백신을 투여받고, 이어서 Lm GUCY2C 백신을 투여받지만, 백신은 역순으로 전달될 수 있다. 1차 백신접종과 2차 백신접종 사이의 가장 짧은 간격은 약 2 내지 4주이다. 선호하는 간격은 약 4 내지 6주이다. 간격은 최대 12개월일 수 있다. 백신 병용 요법은 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여와 함께 투여될 수 있다.
7.0 AD5.F35-GUCY2C 백신, Lm-GUCY2C 백신 또는 AD5.F35-GUCY2C 백신과 Lm-GUCY2C 백신의 조합을 사용하는 예방 방법
백신은 또한 GUCY2C 암/종양으로 발전할 위험이 있는 개체에게 예방적으로 사용될 수 있다. 제거되었거나 관해 상태에 있는 원발성 질환에 대한 이전 진단은 개체를 더 높은 위험에 처하게 한다.
GUCY2C를 발현하는 암이 발병할 위험이 있는 개체는 개체가 검출 가능한 질환을 가지기 전에 암 세포를 제거하는 면역 반응을 유도하기 위해 백신을 투여받을 수 있다.
8.0 백신 조성물, 제형, 용량 및 요법
일부 실시양태에 따른 백신은 아데노바이러스 벡터 또는 Lm 벡터일 수 있는 활성제와 조합하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약제학적 제형은 잘 알려져 있고 이와 같은 활성제를 포함하는 약제학적 조성물은 당업자에 의해 일상적으로 제형화될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 이 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다. 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 활성제를 포함하는 주사 가능한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 멸균되고 발열원이 없다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성제는 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 이와 같은 비히클의 예에는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 있다. 리포솜 및 고정유와 같은 비수성 비히클도 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기법에 의해 멸균된다.
주사 가능한 조성물은 희석제, 예를 들어 멸균수, 전해질/덱스트로스, 식물 기원의 지방 오일, 지방 에스터, 또는 폴리올, 예컨대, 프로필렌 글라이콜 및 폴리에틸렌 글라이콜에 면역원을 포함할 수 있다. 주사제는 멸균되어야 하고 발열원이 없어야 한다.
백신은 면역원성 반응의 인식 및 유도를 위해 면역원성 작용제가 신체의 면역계에 제시될 수 있게 하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 비경구로, 즉 정맥내, 피하, 근육내로 투여될 수 있다.
투약량은 활성제의 특성 및 특정 작용제의 약력학적 특징, 투여 방식 및 경로와 같은 알려진 요인; 수용체의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 특성 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 다르다. 면역원의 양은 보호적이거나 치료적으로 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 전달된다. 당업자는 일상적인 방법에 의해 범위 및 최적 투약량을 용이하게 결정할 수 있다.
다음 실시예는 예시적인 실시형태로서만 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다음 실시예는 예시적인 실시형태로서만 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
Ad5-GUCY2C-PADRE를 받은 1상 임상 시험 환자는 Ad5 중화 항체(NAb) 역가가 10 미만에서 10,000 초과의 범위였다. 환자의 절반은 역가가 200보다 훨씬 낮고(Ad5 NAb 저) 나머지 절반은 역가가 200보다 훨씬 높은(Ad5 NAb 고) 명백한 패턴이 나타났다. Ad5 NAb 저 및 고 코호트로 환자를 분리하여 Ad5 NAb 역가와 GUCY2C-특이적 T-세포 반응 사이의 관계가 밝혀졌으며, 여기서 Ad5 NAb 저 환자에서 반응이 유의하게 더 컸다. (도 3). 이와 함께, 이들 데이터는 고용량 투여에도 불구하고 다른 백신과 대조적으로 기존 Ad5 NAb가 Ad5-GUCY2C-PADRE의 효능을 제거함을 입증하는(Priddy, F. H., et al. (2008). Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781) 본 발명자들의 동물 데이터와 일치한다(도 4). 추가적인 결과는 표 1에 나타나 있다:
Figure pct00001
Ad5 NAb는 미국의 약 40%를 포함하여 대부분의 인간 집단에서 일반적이며(Nwanegbo, E., et al. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2): 351-357; Barouch, D. H., et al. (2011) Vaccine 29(32): 5203-5209), Ad5-기반 백신의 면역원성을 감소시킨다(Priddy, F. H., et al. (2008). Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781). 중요하게도, 대부분의 자연-발생 Ad5 NAb는 Ad5 표면의 섬유 분자를 표적으로 한다(Cheng, C., et al. (2010) J Virol 84(1): 630-638). Ad5와 대조적으로, 대부분의 국가에서 Ad35-특이적 항체의 혈청학적 유병률은 매우 낮다(10% 미만; Nwanegbo, E., et al. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2): 351-357.; Barouch, D. H., et al. (2011) Vaccine 29(32): 5203-5209). 이와 함께, 이러한 관찰은 Ad5의 섬유 분자를 Ad35의 섬유 분자로 대체하면 자연-발생 Ad5 면역에 의해 영향을 받지 않는 키메라 Ad5 바이러스 벡터(Ad5.F35로 알려짐)를 생성할 것임을 시사한다. 실제로, Ad5-GUCY2C-PADRE 1상 연구에서 대상체의 50%가 높은 Ad5 NAb(역가 > 200)를 보유하는 반면, 1명/10명의 대상체만이 높은 Ad5.F35 NAb를 보유한다(도 5). 따라서, Ad5.F35-GUCY2C-PADRE는 공개된 문헌에 의해 예측된 바와 같이 용량 증량에 의해 달성되지 않은 Ad5-특이적 기존 면역을 극복할 것으로 예상된다(Priddy, F. H., et al. (2008). Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781).
실시예 2
Ad5.F35-hGCC-PADRE를 생성하기 위해, hGCC-PADRE 코딩 서열을 합성하여 서열번호 3에 제시된 포유동물 코돈-최적화된 서열을 생성하여 단백질로 hGCC-PADRE mRNA 번역 효율을 증가시켰다. 이 작제물은 Ad5.F35 벡터로 서브클로닝되어 Ad5.F35-hGCC-PADRE를 생성하였다.
전반적으로, Ad5.F35-hGCC-PADRE의 구조는 3가지 예외를 제외하고 야생형 Ad5(GenBank: AY339865.1)와 동일하다. 먼저, hGCC-PADRE 발현 카세트가 Ad5의 E1A 및 E1B 영역(뉴클레오타이드 455 내지 3512)을 대체하여 Ad5.F35-hGCC-PADRE 복제를 무능하게 만들었다. 둘째, Ad5.F35-hGCC-PADRE는 E3 영역(뉴클레오타이드 28586 내지 30464)의 큰 결실을 보유한다. E3 영역은 면역억제 기능을 가진 여러 단백질을 보유한다. 이 모든 E3 단백질은 Ad5.F35-hGCC-PADRE에서 결실된다.
마지막으로, Ad5 섬유는 Ad35 섬유로 대체되어 환자의 Ad5에 대한 기존 항체에 의해 벡터의 중화를 최소화한다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE DNA 작제물 생성
개시 ATG의 바로 5'에 코작 서열(GCCGCCACC)과 PADRE 서열 직후에 2개의 정지 코돈을 보유하도록 hGCC-PADRE 코딩 서열을 합성하였다. hGCC-PADRE 작제물을 pShuttle 벡터로 서브클로닝한 다음 Ad5.F35 벡터로 재조합하였다. Ad5.F35는 좌측 및 우측 역전 말단 반복부(ITR), 패키징을 위한 캡슐화 신호, E2 및 E4 영역 및 후기 유전자를 포함하여 복제-불능 아데노바이러스를 생성하는 데 필요한 모든 요소를 인코딩하는 인간 Ad5 서열을 보유한다. 플라스미드는 E1 및 E3 단백질이 결여되어 있고 섬유를 Ad35 섬유로 대체한다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE의 제조, 구조 및 조성
미국 텍사스주 휴스턴에 있는 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)의 세포 및 유전자 치료 센터(Center for Cell and Gene Therapy; CAGT)의 벡터 생산 시설(Vector Production Facility; VPF)에서 GMP 조건 하에 아데노바이러스 벡터 Ad5.F35-hGCC-PADRE의 마스터 바이러스 뱅크를 생성하였다.
바이러스 복제에 필요한 E1 유전자를 보유한 HEK293 세포에서 재조합 아데노바이러스 벡터를 생성하였다. 생존 가능한 Ad5.F35-hGCC-PADRE 바이러스를 형성하고 수집하였다. 이 바이러스는 HEK293 세포에서 두 차례의 플라크 정제를 거쳤다. 개별 플라크를 hGCC-PADRE DNA의 존재에 대해 테스트하였고, hGCC-PADRE 카세트 정확도에 대해 시퀀싱하였으며, 시험관 내 세포 감염 시 hGCC-PADRE 단백질을 생성하는 능력에 대해 테스트하였다. 그 다음 플라크-정제된 벡터를 조직 배양 플라스크의 HEK293 세포에서 확장하고 사용된 10층 세포 배양 챔버(세포 공장)를 추가로 증폭시켰다. 대규모 증폭 후, Ad5.F35-hGCC-PADRE를 CsCl에서 밴딩하여 정제하였다. Ad5.F35-hGCC-PADRE 마스터 바이러스 뱅크(MVB)를 완전히 서열결정하였다. MVB의 일부는 이 시험의 일부로 대상체 투여를 위해 바이알에 넣었다.
실시예 3
백신접종 프로토콜
사용되는 Ad5.F35-hGCC-PADRE 백신은 GCC-PADRE 발현 카세트를 보유하고 있는 재조합, 복제-결핍 E1/E3-결실 Ad5.F35 바이러스로 구성된다. 이 백신 벡터는 재조합 인간 5형 아데노바이러스(rAd5)를 이용하며, rAd5는 벡터의 초기 E1 및 E3 영역이 결실되어 GCC-PADRE 카세트를 삽입할 수 있다. E1/E3 결실은 바이러스 복제를 무능하게 만들고 임상 사용과 연관된 안전성을 증가시킨다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE: TG 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 25mM NaCl, 2.5% 글리세롤)에 제형화된 1011, 1012, 또는 5 × 1012 바이러스 입자를, 최종 수술 및 표준 보조 요법 후 재발 위험이 있는, 선택된 고형 종양(결장직장, 췌장, 위 또는 식도)이 있는 인간 환자에게 근육내로 투여한다. 투약량은 삼(3)회 투여된다. 투약 간격은 사(4)주이다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE에 대한 대상체의 세포(T-세포) 반응 및 GCC에 대한 체액성 면역 반응을 첫 번째 백신접종 5, 9 및 14주 후에 평가한다. Ad5에 대한 기존 중화 항체의 효과는 이전에 관찰된 것보다 감소된다.
실시예 4
최종 수술 및 표준 요법 후 재발 위험이 있는 위장 선암종이 있는 성인을 대상으로 한 Ad5.F35-hGCC-PADRE 백신의 2A상, 용량-결정 연구
이는 외과적 절제 및 표준 보조 요법을 받은 위장(GI) 악성종양(췌장, 결장직장, 식도 및 위 선암종)에 대한 백신으로서 Ad5.F35-hGCC-PADRE의 공개, 용량-결정, 2A상 연구이다. 환자는 3가지 용량 수준 중 1가지로 Ad5.F35-hGCC-PADRE의 근육내 다중 투여가 제공받을 것이다. 치료-관련 독성 및 GCC에 대한 면역 반응의 발달을 초기 백신접종(제1주) 후 제5주, 제9주 및 제13주에 평가할 것이다. 1차 안전성 평가변수는 이상 반응(AE), 주사-부위 반응 및 안전성 실험실 테스트에서 임상적으로 유의한 변화를 조사할 것이다. 1차 효능 평가변수는 다양한 용량 수준(1011, 1012 및 5×1012 바이러스 입자 또는 vp)에서 GCC-특이적 T-세포 반응의 발달을 포함한다.
목적
연구의 주요 목적은 다음과 같다.
1) 수술 및 표준 요법 후 질환의 증거가 없고 결장직장, 췌장, 위, 또는 식도 선암종의 위험이 높은 대상체에서 4주 간격으로 3가지 용량 수준(1011, 1012 및 5×1012 vp)으로 근육내(IM) 전달되는, 순차적 Ad5.F35-hGCC-PADRE 백신 투여의 안전성 및 내약성을 평가한다.
2) 수술 및 표준 요법 후 질환의 증거가 없고 결장직장, 췌장, 위, 또는 식도 선암종의 위험이 높은 대상체에서 3회의 순차적 용량으로서 4주 간격으로 근육내(IM) 투여된 3가지 상이한 용량 수준(1011, 1012 및 5×1012 vp)에서 Ad5.F35-hGCC-PADRE에 대한 세포(T-세포) 반응을 평가한다.
관찰에서. 목적은 다음을 포함한다:
1) 수술 및 표준 요법 후 질환의 증거가 없고 결장직장, 췌장, 위, 또는 식도 선암종의 위험이 높은 대상체에서 3회의 순차적 용량으로서 4주 간격으로 IM 투여된 3가지 상이한 용량 수준(1011, 1012 및 5×1012 vp)에서 Ad5.F35-hGCC-PADRE에 대한 체액성(항체) 반응을 평가한다.
2) 면역 반응과 Ad5에 대한 중화 항체의 연관성 평가을 평가한다
3) 면역 관용을 평가하기 위해 종양에서 GCC 단백질 발현에 대한 면역 반응의 상관 관계를 평가한다
4) 무병생존기간(DFS)을 평가한다
5) 가능한 경우 전체생존기간(OS)을 평가한다.
집단
목표 최종 표본 크기는 평가 가능한 응답 데이터가 있는 72명의 대상체이다. 모든 적격 기준을 충족하는 GI 선암종이 있는 최대 81명의 대상체를 등록할 것이다. 본 발명자들은 한 달에 대략 3명의 환자를 등록할 것으로 예상한다. 15명의 환자가 치료를 완료한 후 각각의 군에서 무용성 분석을 수행하고 해당 시점에서 군을 중단할 수 있다. 따라서 최소 표본 크기는 45이다.
프로토콜
Ad5.F35-hGCC-PADRE: TG 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 25mM NaCl, 2.5% 글리세롤)에 제형화된 1011, 1012 또는 5 × 1012 바이러스 입자를 근육내로 투여한다.
최소 45명 및 최대 81명의 대상체를 이 연구에 등록할 것이다. 종양 유형 및 외과적 절제면(R0 또는 음성 절제면 대 R1 또는 양성 절제면)에 따라 계층화되어 3가지 치료 부문 중 하나로 대상체를 무작위화할 것이다. 치료군 A는 4주 간격으로 1011 vp 백신을 3회 받을 것이다. 치료군 B는 4주 간격으로 1012 vp 백신을 3회 받을 것이다. 치료군 C는 4주 간격으로 5×1012 vp 백신을 3회 받을 것이다. 각각의 치료 군에 대상체를 무작위화하고 이상 반응의 지속적인 모니터링과 동시에 치료를 개시할 것이다.
면역 반응 및 안전성에 대한 13주 연구 평가 완료 후, 대상체는 후속 암-관련 요법, 적어도 24개월의 추적 동안의 DFS 비율, 재발 또는 사망 중 먼저 발생하는 것에 대해 전화 또는 선택적 진료소 방문에 의해 대상체를 추적할 것이다.
치료 주기(즉, 3회 투약)의 기간은 9주가 될 것이다. 대상체는 최종 연구 용량 후 4주까지의 치료 기간에서 고려되며, 그 후 사망, 조기 중단, 또는 추적 완료까지 추적될 것이다. 모든 대상체가 적어도 24개월의 추적 또는 사망에 도달할 때까지 연구 기간 동안 대상체를 추적할 것이다. 연구의 결론에서, 나머지 모든 대상체에게 장기 추적 프로토콜에의 등록을 제공할 것이다.
서론
배경 정보
이 연구는 최종 수술 및/또는 표준 요법 후 재발의 위험이 높은 위장(GI) 관의 고형 종양이 있는 대상체에게 공개된다. 대상체 집단은 연구 적격성 기준을 충족하는 결장직장, 췌장, 위 또는 식도 선암종이 있는 개체를 포함한다.
췌장암, 결장직장암, 식도암, 위암의 역학 및 현재 치료
췌장암, 결장직장암, 위암, 식도암은 각각 검출 및 치료의 개선에도 불구하고 미국에서 암의 지속적인 주요 부담을 나타낸다. 각각의 경우, 상당한 수의 환자가 치료를 위해 외과적 절제 및 표준 요법을 받지만, 일부(질환 조직학, 병기 및 기타 요인에 따라 다름)만 관해 상태로 남아 있다. 이러한 경우 화학요법 및/또는 방사선 요법 형태의 보조 요법은 전반적인 임상 결과를 개선시키지만; 특히 고위험 특성이 있는 환자의 경우 추가 개선의 상당한 여지가 있다.
GI 악성종양은 2016년 미국에서 암-관련 사망의 26%를 차지하였다. 결장직장 암종은 네 번째로 흔한 암이고 두 번째로 치명적인 암인 반면 췌장암, 식도암 및 위암은 2016년 미국의 암 관련 사망률 추정치가 세 번째, 10번째 및 16번째로 높았다. GI 악성종양의 5년 상대 생존율은 질환 병기에 따라 다르다. 일반적으로, 췌장 선암종은 모든 병기에서 최악의 5년 생존율(7%)을 보인 반면, 4기 질환(원격 전이)에 대해서는 2%, 국부적으로 퍼진 질환에 대해서는 11%, 국소 질환에 대해서는 27%이다. 대부분의 외분비성 췌장 선암종(80% 초과)은 국소 또는 원격 전이가 진행될 때까지 진단되지 않으며, 이 때 더 이상 외과적 절제가 불가능하고 추정되는 평균 생존 기간은 3 내지 6개월이다.2 외과적으로 절제된 췌장 선암종은 추정되는 평균 생존 기간이 18개월인 반면, 환자의 20%만이 5년 동안 생존한다.
그럼에도 불구하고 재발 위험이 높은 것으로 고려되는 국소 췌장암, 결장직장암, 위암, 식도암 환자의 경우, 치료의 기본은 수술, 화학요법 및 방사선 요법일 수 있다. 단클론성 항체를 이용한 보조 요법은 결장직장암과 식도암에서 또한 사용된다. 흑색종, 전립선암, 비소세포폐암 환자에서 유용성을 확립한 면역 요법은 재발 위험을 감소시키기 위한 수단으로 다양한 환경에서 점점 더 조사되고 있다.
이 연구는 내약성이 좋고 세포 면역 반응을 유도하는 데 가장 적합한 용량을 확인하기 위해 3가지 용량 수준에서 순차적으로 근육내로(IM) 전달되는 새로운 백신 면역 요법을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 백신의 궁극적인 치료 목표는 임상 개발의 후기 단계에서 GI 선암종이 있는 대상체에서 재발 위험을 감소시키는 것이다.
췌장 선암종 및 이용 가능한 치료법
2014년에 췌장 선암종으로 진단된 추정된 46,000명의 미국인 중5, 대략 20%가 절제 가능한 것으로 간주된다. 수술에서 회복된 후, 보조 요법의 일차 양식은 젬시타빈과 카페시타빈 또는 5-플루오로우라실과 이리노테칸 및 옥살리플라틴(변형된 FOLFIRINOX)와 같은 화학요법이다8. 화학요법은 위험 비율이 약 0.60이고 사망률이 약 1/3로 감소하여 최상의 지지 요법보다 우수하다는 것이 잘 확립되어 있다.9 젬시타빈 단독 그룹의 3년 무병생존율 21.4%와 비교하여, 변형된 FOLFIRINOX 요법은 3년 무병생존율을 39.7%로 개선시킨 한편 전체생존율도 젬시타빈 단독 그룹의 48.6%와 비교하여 63.4%로 개선되었다8. 그러나 수술과 보조 요법에 관계없이, 환자의 적어도 80%는 재발하여 결국 사망한다. 생존은 병리학적 특성, 수술 전 기능 상태, 수술 결과, 및 보조 요법과 관련이 있다. 미국 암 학회(American Cancer Society)에 따르면, 모든 병기의 췌장암을 합친 경우, 1년 상대 생존율은 20%, 5년 생존율은 6%이다. 수술적 절제를 수행할 수 있는 경우, 평균 생존율은 18 내지 20개월이다. 전체 5년 생존율은 약 10%이지만 종양이 완전히 제거되고 암이 림프절로 확산되지 않은 경우 20 내지 25%에 이를 수 있다.
결장직장암 및 이용 가능한 치료법
매년 결장직장암(CRC) 진단을 받는 추정된 132,000명의 미국인 중, 대략 2/3이 외과적 절제술을 받을 것이다. 5년 생존율은 암의 성격과 병기에 따라 다르지만, 25 내지 70% 범위이다.
CRC가 초기 단계에서 진단되면, 많은 경우 수술만으로도 치유될 수 있다. 후기 단계에서는, 여전히 수술로 치료가 가능한 것으로 간주되며 종종 플루오로우라실, 플루오로피리미딘, 카페시타빈, 또는 옥살리플라틴 형태의 화학 요법이 보조 요법으로 사용된다. 두 연구에서는 수술 후 보조 요법을 받았을 때 3년 생존율이 10 내지 15% 증가하는 것으로 밝혀진 한편, 다른 연구에서도 또한 보조 치료로부터 일부 유익한 효과를 발견하였다.
최근 외과적 및 보조적 치료의 개선뿐만 아니라 조기 진단으로 외과적 절제술을 받은 환자의 3년 DFS가 증가하였다. VEGF 및 EGFR에 대한 단클론성 항체 형태의 표적 치료제도 또한 진행성 질환이 있는 환자에 대해 이용 가능하지만4, 치료율은 여전히 낮고 재발률이 높다. 니볼루맙(Opdivo®)과 펨브롤리주맙(Keytruda®)의 2가지 항-PD-1 체크포인트 면역요법도 또한 높은 미세부수체 불안정성(MSI-hi)을 특징으로 하는 진행성 재발 종양이 있는 결장직장암 환자에 대해 승인되었지만, 전반적으로 이러한 치료법에 대한 반응률은 여전히 낮다.
위암 및 이용 가능한 치료법
매년 추정된 25,000명의 미국인이 위암 진단을 받는다. 초기 암 환자의 대부분은 수술로 절제 가능한 질환을 가지고 있으며, 국소 원위 위암의 경우 환자의 50% 초과가 치유될 수 있다. 그러나 초기 단계 질환은 미국에서 진단된 모든 사례의 10 내지 20%만 차지한다. 5년 OS 비율은 파종성 질환이 있는 환자의 생존이 거의 없는 것부터 절제 가능한 국소 질환이 있는 국소 원위 위암 환자의 대략 50% 생존에 이르기까지 다양하다. 보조 요법의 임상적 이점이 논의되었지만, 최근 연구에서는 잠재적인 이점이 있음을 나타낸다. 한 연구에서, 보조-치료를 받은 환자는 카페시타빈과 옥살리플라틴을 받았으며, 위험비는 0.58이었고 5년 DFS가 개선되었다. 보조제 플루오로피리미딘을 사용한 또 다른 연구에서는 치료군이 처음 1년 이내에 수술만 한 경우와 비교하여 생존율이 10% 증가한 것으로 나타났다. 보조 요법의 유무에 관계없이 현재의 치료는 근위 위암 환자에서 평균 5년 생존율이 10 내지 15%이고 절제된 환자에서 암 재발이 50% 초과로 현재 치료 요법의 부적절한 효과를 시사한다. 추가적으로, 항PD-1 체크포인트 면역요법인 펨브롤리주맙(Keytruda®)이 최근 진행성 PD-L1-양성 위암 환자에게 승인되었지만 반응률은 미미하였다.
식도암 및 이용 가능한 치료법
국립 암 연구소(Cancer.gov)에 따르면, 2017년에 추정된 16,940명이 식도암 진단을 받고 15,690명이 식도암으로 사망할 것이다. 대략 절반은 절제 가능한 종양을 가진다. 평균적으로 환자의 18.8%가 진단 후 5년 동안 생존하지만, 5년 생존율은 원위 질환이 있는 환자의 경우 4.6%로 급격히 감소한다. 식도 절제술은 임상적으로 국소화된 식도 암종의 초석 치료로 남아 있지만, 질환의 특성은 수술의 실패에만 기인한다. 식도의 편평 세포 암종에서, 신보조제 시스플라틴은 생존율 개선을 제공하지 않는 반면, 신보조제 시스플라틴과 플루오로우라실은 5년 DFS를 10% 증가시켰다. 대조적으로, 식도 선암종에 대한 선행 화학요법(카보플라틴 및 파클리탁셀) 및 방사선요법은 OS 중앙값이 수술 단독군의 24개월과 비교하여, 49.4개월이었다. 다른 연구에서도 또한 위 또는 위식도 접합부의 선암종 환자에서 에피루비신, 5-플루오로우라실 및/또는 시스플라틴을 이용한 선행 화학요법의 유익한 효과를 발견하였다. 추가적으로, HER2를 과발현하고 VEGF 경로를 표적으로 하여 혈관신생을 저해하는 소수의 식도암에서 HER2를 표적으로 하는 항체 요법이 식도암 치료에 등장하였다4. 수술 단독과 비교하여 선행 화학방사선요법의 13건의 무작위 대조 시험에 대한 최근 메타 분석은 0.78의 통합 위험 비율을 보여주었으며; 이는 2년에 8.7%의 절대 생존 이익과 11명의 치료에 필요한 수에 해당한다. 식도암에서 선행 요법의 효과는 최상의 지지 치료와 비교하여 일반적으로 유익하지만, 재발이 여전히 높고 많은 환자가 결국 사망한다. 위암과 마찬가지로, 항-PD-1 체크포인트 면역요법인 펨브롤리주맙(Keytruda®)이 최근 위식도 접합부의 PD-L1-양성 암 환자에게 승인되었지만 반응률은 미미하다. 이 질환의 발병률과 예후를 감안할 때, 질환 결과를 개선하려면 부작용이 최소화된 효과적인 보조제가 필요하다
제안된 연구의 근거
결장암에서 종양-연관 항원으로서의 구아닐릴 사이클라제 C(GCC)
사이클릭 GMP(cGMP)를 합성하는 상동성 단백질 패밀리 중 하나인 구아닐릴 사이클라제 C(GCC 또는 GUCY2C)는 장 상피 세포에 의해 특이적으로 발현된다. GCC는 주변분비 호르몬인 구아닐린 및 유로구아닐린에 대한 수용체이면서 설사성 박테리아의 열-안정성 엔테로톡신(ST)이며, 세포외 도메인과의 상호작용은 세포질 촉매 도메인을 활성화하여 cGMP 축적을 유도한다. 패밀리 구성원에 걸친 촉매 도메인은 약 50% 상동성을 공유하지만, GCC의 세포외 도메인은 20% 미만의 상동성을 나타내어 항원 고유의 구조를 형성한다. GCC는 정상 장의 500개 초과의 샘플에서 검출되었지만 1,000개 초과의 위장 외 조직에서는 검출되지 않았다. 더욱이, 장 상피 세포에서 GCC는 점막 장벽 "외부"인 정점 브러시 경계 막에 특히 국한되어 있다. 이러한 해부학적 및 기능적 구획화는 일반적으로 GCC가 점막으로 제한되어 있으며 방사선리간드 영상화 및 생체분포 및 면역학적 연구에 의해 확인되었음을 시사한다. 중요한 것은 GCC 단백질(200개 초과의 표본) 및/또는 mRNA(900개 초과의 표본)를 거의 모든 원발성 및 전이성 인간 결장직장 종양에서 검출하였으며, 해부학적 위치 또는 등급에 관계없이 종양 세포에 의해 균일하게 발현되었지만, 임의의 추가적-GI 종양(200개 초과)에서는 그렇지 않았다. 또한, GCC는 결장직장 종양의 80% 초과에서 과발현된다. 장 세포에 의한 발현의 엄격성과 전이에 의한 보편적인 과발현은 pN0 환자의 병기를 결정하기 위한 마커로서의 GCC의 유용성에 의해 강조된다.
췌장암, 위암 및 식도암에서의 GCC
GCC는 일반적으로 장 상피 세포에서 발현되고 발현은 국소 및 전이 환경 둘 모두에서 결장직장의 신생물 형질전환 동안 유지된다. 추가적으로, GCC는 췌장암, 위암, 및 식도암의 대략 60%에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. GCC의 상피 밀착 연접, 세포 극성 및 정점 국소화의 파괴는 정상 조직은 영향을 받지 않은 채 종양 조직의 전신 작용제에 대한 바람직한 표적이 된다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE 백신
Ad5-hGCC-PADRE를 사용하는 전임상 연구
전임상 연구에서, 본 발명자들은 마우스 GCC를 포함하는 Ad5 벡터 백신이 마우스에서 GCC-특이적 면역 반응(항체 및 세포독성 T 세포)을 생성한다는 것을 입증하였다. 이러한 반응은 오래가고, 면역화 후 몇 달 동안 지속된다. 추가적으로, 백신에 의해 유도된 GCC-특이적 세포독성 T 세포는 시험관내에서 GCC-발현 CRC 세포를 살해할 수 있다. 폐 또는 간에서 성장하는 GCC-발현 전이성 결장직장 종양이 있는 마우스는 GCC 백신접종으로 보호되며: GCC 백신접종은 검출 가능한 전이성 종양의 수를 감소(또는 제거)하고 동물 생존을 크게 개선시킨다. 중요하게도, 이러한 면역 반응은 전이성 CRC를 선택적으로 표적으로 하지만, GCC를 발현하는 정상적인 장 조직을 표적으로 하지 않으며, 장 병리를 유발하지도 않는다. 따라서 GCC-표적화 백신접종은 뮤린 모델에서 전이성 CRC를 예방/치료할 수 있는 GCC-특이적 면역 반응을 유도하지만, 부작용을 유발하지 않으면서 GCC 특이적 면역 반응을 유도한다. 이러한 표적화 치료는 확립된 암 요법과 비교하여 임상적으로 매우 유리할 것으로 예상되며, 이는 효능이 낮고 상당한 표적외 독성을 유발한다.
현재까지의 Ad5-hGCC-PADRE 백신 임상 데이터
초기에 초기 결장직장암 환자에서 Ad5-hGCC-PADRE의 안전성과 면역원성을 결정하기 위한 공개, 단일군, 단일 용량 타당성 연구로 인간에서 Ad5-hGCC-PADRE 백신을 평가하였다(ClinicalTrials.gov NCT01972737). 대상체는 Ad5-hGCC-PADRE 10개 입자의 단일 근육 주사를 받았다.
안전성 데이터
연구 대상체를 주사 후 30분 동안 10분마다 병원에서 그리고 백신 접종 후 제3일 및 제8일에 전화로 급성 사건에 대해 평가하였다. 환자들은 또한 안전성 평가를 위해 백신접종 30일, 90일, 및 180일 후에 병원으로 돌아왔다. CTCAE 버전 5.0에 따라 이상 반응의 등급을 매겼다. Ad5-hGCC-PADRE를 받은 10명의 대상체 중 10명(100%)이 AE를 경험하였다. 가장 빈번하게 보고된 백신-관련 AE는 오한/한기(20%), 주사-부위 통증/종창(20%), 현기증(10%), 발한(10%), 통증(10%) 및 발열(10%)이었다. 심각한 이상 반응(SAE)은 없었고 연구 동안 사망한 대상체는 없었다.
모든 AE는 1 등급이었고 3/4 등급 독성은 백신접종 후 6개월의 추적 동안 어느 때에도 발생하지 않았다. 더욱이, 차별적인 종합적 화학 패널이 있는 CBC, 및 항핵 항체(ANA) 역가를 포함하여 제30일, 제90일, 및 제180일에 수행된 실험실 평가에서는 임상적으로 관련된 변화가 나타나지 않았다. 유사한 요법으로 보고된 임상 경험을 기반으로 하여, 주사-부위 통증 및 발열과 같은 경미한 1/2 등급 독성이 바이러스 벡터 면역화 후 예상되고 몇몇 환자에서 관찰되었다. 중요한 것은, GCC-발현 조직에서 독성과 관련된 이상 반응이 관찰되지 않았다는 것이다. GCC는 소장 및 대장 상피의 내강 표면 및 식욕부진 유발 시상하부 뉴런에서 발현되는 자가-단백질이다. 그러나, 면역 구획화를 제어하는 기전 및 GCC 백신접종의 전임상 연구와 일치하여 GCC-발현 장 또는 뇌 조직에서 Ad5-hGCC-PADRE 유도 자가면역의 증거는 없었다.
면역원성 데이터
전임상 연구에서, Ad5-hGCC-PADRE로의 면역은 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 시간- 및 용량-의존적 GCC-특이적 T-세포 및 B-세포 반응과 항종양 면역을 유도하였다. 임상 연구에서, Ad5-hGCC-PADRE 투여 후 ELISA 및 IFNγ-ELISpot에 의해 GCC-특이적 면역 반응을 정량화하여 항체 및 T-세포 반응을 각각 정량화하였다. PADRE 및 Ad5에 대한 T-세포 반응을 또한 IFNγ-ELISpot에 의해 정량화하였다. 환자의 면역 반응은 전형적으로 4가지 패턴 중 하나를 따랐다:
1) GCC, PADRE 또는 Ad5에 대한 GCC 또는 T-세포 면역에 대한 백신 전 항체 반응이 없고 Ad5-hGCC-PADRE 백신접종이 임의의 항원에 대해 표적화된 반응을 유도하지 않았음
2) 백신 접종 전 반응이 없는 반면, 백신 접종은 Ad5-특이적 T-세포 반응을 유도하였지만 GCC-특이적 또는 PADRE-특이적 반응은 유도하지 않았음
3) Ad5-hGCC-PADRE 백신접종은 GCC-특이적 T-세포 반응을 유도하였다. GCC-특이적 항체 반응이, GCC-특이적 CD4+ T-세포 내성을 반영하는, 외인성 CD4+ "헬퍼" T-세포 에피토프에 대한 반응을 요구하는 동물 연구와 유사한 PADRE-특이적 T-세포 반응 또는 GCC-특이적 항체 반응 없음.
4) 적응 면역의 3가지 모든 군, 즉 PADRE-특이적 CD4+ T-세포 반응, GCC-특이적 항체 반응, 및 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응에 의한 백신-유도 반응
Ad5 nAb는 Ad5-hGCC-PADRE 면역원성을 제한한다
Ad5는 자연적인 인간 병원체로서 거의 전체 인간 집단에서 가벼운 감염을 일으킨다. 이러한 자연 노출은 표적 항원 발현 및 면역 반응 유도에 필요한 단계인 숙주 세포의 감염을 방지함으로써 재감염 또는 Ad5-기반 백신접종을 방지하는 Ad5-특이적 중화 항체(NAb)를 유도한다. Ad5-GFP 리포터 바이러스 저해 생물검정을 사용하여 Ad5-hGCC-PADRE 백신접종(제0일) 전에 수집된 환자 혈청에서 Ad5 nAb를 정량화하였다. 역가의 범위는 10 미만에서 10,000 초과였으며 환자의 절반은 역가가 200보다 훨씬 낮고(Ad5 NAb 저) 나머지 역가가 200보다 훨씬 높은(Ad5 NAb 고) 명백한 패턴이 나타났다. Ad5 NAb 저 및 고 코호트로 환자를 분리하여 Ad5 NAb 역가와 GCC-특이적 T-세포 반응 사이의 관계가 밝혀졌으며, 여기서 Ad5 NAb Low 환자에서 반응이 유의하게 더 컸다. 일반적으로 낮았던 PADRE-특이적 T-세포 반응은 전처리 Ad5 nAb 역가와 관련성을 보이지 않았다. GCC-특이적 T-세포 반응과 유사하게, Ad5-특이적 T-세포 반응은 또한 Ad5 nAb 고 그룹의 Ad5 nAb에 의해 제한되었다. 이와 함께, 이들 데이터는 기존 Ad5 nAb 면역이 숙주 세포에 진입하기 전에 생체내에서 Ad5-hGCC-PADRE 바이러스 입자를 제거하여, 후속 유전자 발현 및 숙주 면역 반응의 유도를 방지함을 입증하는 비임상 데이터77와 일치한다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE 근거.
Ad5 NAb는 미국의 약 40%를 포함하여 대부분의 인간 집단에서 일반적이며(Nwanegbo, E., et al. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2): 351-357.; Barouch, D. H., et al. (2011) Vaccine 29(32): 5203-5209), Ad5-기반 백신의 면역원성을 감소시킨다(Priddy, F. H., et al. (2008). Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781). 중요하게도, 대부분의 자연-발생 Ad5 NAb는 Ad5 표면의 섬유 분자를 표적으로 한다(Cheng, C., et al. (2010) J Virol 84(1): 630-638). Ad5와 대조적으로, 대부분의 국가에서 Ad35-특이적 항체의 혈청학적 유병률은 매우 낮다(10% 미만; Nwanegbo, E., et al. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2): 351-357; Barouch, D. H., et al. (2011) Vaccine 29(32): 5203-5209). 이와 함께, 이러한 관찰은 Ad5의 섬유 분자를 Ad35의 섬유 분자로 대체하면 자연-발생 Ad5 면역에 의해 영향을 받지 않는 키메라 Ad5 바이러스 벡터(Ad5.F35로 알려짐)를 생성할 것임을 시사한다. 실제로, 기존 Ad5 nAb가 있는 12명의 환자 코호트에서, 8명의 환자(67%) 유래의 혈청은 시험관내에서 키메라 Ad5.F35를 중화시킬 수 없었다. 더욱이, Ad5-hGCC-PADRE 1상 연구에서 대상체의 50%가 높은 Ad5 NAb(역가 > 200)를 보유하는 반면, 1명/10명의 대상체만이 높은 Ad5.F35 NAb를 보유한다(도 5). 따라서, Ad5.F35는 추가적인 안정성 위험 없이 Ad5.F35 nAb의 예상되는 혈청학적 유병률을 25% 미만으로 감소시킴으로써 Ad5에 비해 유리하다. Ad5.F35-GUCY2C-PADRE는 공개된 문헌에 의해 예측된 바와 같이 용량 증량에 의해 달성되지 않은 Ad5-특이적 기존 면역을 극복할 것으로 예상된다(Priddy, F. H., et al. (2008). Clin Infect Dis 46(11): 1769-1781).
면역원성, 안전성, 및 생체분포 프로파일에서 Ad5와 Ad5.F35 벡터 간의 유사성은 공개된 비임상 연구에 의해 뒷받침된다. 실제로, 안전성 프로파일이 Ad5.F35에서 더 좋을 수 있다는 일부 암시가 있다. 근육(백신접종 부위)의 Ad5.F35 형질도입은 Ad5와 비슷하지만, 간(1000×), 비장(3×), 신장(100×), 심장(10×) 및 폐(100×)는 Ad5.F35를 이용하여 Ad5보다 상당히 더 낮은 형질도입 효율을 나타낸다. 간에 대한 Ad5.F35의 더 낮은 친화성과 관련하여, Ad5.F35는 혈청 전염증성 사이토카인 및 간 효소에서 유의하게 더 낮은 상승을 생성하였으며, 이는 Ad5.F35 바이러스가 Ad5 벡터보다 더 나은 안전성 프로파일을 가진다는 것을 시사한다. 더욱이, Ad5.F35 벡터는 Ad5 벡터보다 Ad5 nAb에 상당히 덜 민감하여, 높은 Ad5 nAb 역가(200 초과)를 가지는 동물에서 표적 항원-특이적 면역 반응의 크기를 증가시킨다. 따라서 Ad5.F35 벡터는 Ad5 벡터보다 Ad5 nAb의 맥락에서 더 나은 생체분포, 안전성, 및 효능을 나타낸다. 이와 함께, 이들 데이터는 Ad5.F35-hGCC-PADRE에 대한 면역을 중화시키는 것이 환자에서 상당히 더 낮아질 것이고, 인간 대상체에서 GCC-특이적 T-세포 반응의 속도와 크기를 증가시킬 것임을 시사한다. 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 Ad5 섬유 분자를 Ad35 섬유 분자로 대체함으로써 백신을 변형시켜 키메라 바이러스 벡터 Ad5.F35를 생성하였다. 이 연구는 GI 악성종양이 있는 환자에서 Ad5.F35-hGCC-PADRE의 안전성, 면역원성, 및 기존 nAbs 내성을 조사할 것이다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE 설계
Ad5.F35-hGCC-PADRE 백신은 GCC-PADRE 발현 카세트를 보유하고 있는 재조합 복제-결핍 E1/E3-결실 Ad5.F35 바이러스로 구성된다. 이 백신 벡터는 30개 이상의 단백질을 인코딩하는, 선형 이중-가닥 DNA 게놈이 약 38 kb인 안정적인 비-외피 이십면체 바이러스인 재조합 인간 5형 아데노바이러스(rAd5)를 이용한다. rAd5는 벡터의 초기 E1 및 E3 영역이 결실되어 GCC-PADRE 카세트를 삽입할 수 있다. E1/E3 결실은 바이러스 복제를 불가능하게 하여, 임상 사용과 연관된 안전성을 증가시킨다.
GCC-PADRE 카세트는 인간 GCC의 세포외 도메인(잔기 1 내지 430)과 CD4+ T-세포 에피토프 PADRE로 이루어진 융합 산물의 발현을 유도하는 인간 거대세포바이러스(HCMV) 즉시 초기 프로모터로 구성된다. 생체 내에서 Ad5.F35-hGCC-PADRE 벡터는 감염된 세포에 의한 GCC-PADRE 면역원의 발현을 유도하여, GCC 및 PADRE에 대한 면역 반응을 유도한다. PADRE는 GCC-특이적 B 및 CD8+ T 세포에 CD4+ T-세포 "도움"을 제공하기 위해 백신에 포함되어, PADRE가 없는 GCC 백신접종과 비교하여 전임상 모델에서 우수한 면역 및 항종양 효능을 생성한다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE 용량 근거
본 발명자들의 1상 연구 결과로 Ad5-hGCC-PADRE 백신에 대한 면역학적 반응을 확인했지만, 이는 Ad5 중화 항체에 의해 억제되었다. 인간 집단에서 자연 Ad5 노출의 높은 유병률과 약 40%의 많은 환자에서 발견되는 중화 항체의 결과적인 발생을 감안할 때, 현재 연구는 순차 용량 투여, 더 높은 용량 수준, 및/또는 Ad5 백본의 변형(Ad5에서 Ad5.F35로)이 이러한 장벽을 극복하는지의 여부를 결정할 것이다. 이 접근법은 더 높은 용량 수준이 높은 기존 Ad5 nAb 역가를 극복하여 세포 면역 반응을 생성할 수 있는 다른 Ad5 백신의 결과에 의해 뒷받침된다.
이 연구를 위해 선택된 용량은 Ad5-hGCC-PADRE 백신뿐만 아니라, 기타 Ad5-기반 백신 임상 시험에 의한 이전 인간 경험을 기반으로 한다. 1×1011 바이러스 입자(vp) 용량은 이전 1상 임상 시험에서 단일 투여로 테스트되었으며 안전하고 견딜 수 있었다. 현재 연구는 총 3회의 주사에 대해 4주 간격으로 근육내(IM) 투여된 1×1011 vp Ad5.F35-hGCC-PADRE의 반복 투여를 조사한다. 더욱이, 이 연구는 또한 4주 간격으로 3회 투여되는 2가지 추가적인 용량 수준을 조사한다. 이와 함께, 용량은 1×1011 vp, 1×1012 vp, 및 5×1012 vp이다. 5×1012 vp의 최대 용량은 백신 용해도에 대한 제한을 감안할 때 대략적으로 달성 가능한 가장 높은 용량이다.
이 2A상 연구에 이용된 Ad5.F35-hGCC-PADRE의 고용량 요법(1×1012 및 5×1012)을 이전에 인간에서 테스트하지 않았지만, 다른 아데노바이러스 기반-백신을 유사한 용량 수준에서 투여하였으며 내약성이 우수하였다. 유사하게, GCC-PADRE 벡터의 반복 투여를 임상적으로 평가하지 않았지만, 다른 연구에서는 비슷한 용량 수준을 사용하여 아데노바이러스-기반 백신의 반복 투여를 이용하였으며 내약성이 우수하였다.
연구 설명
연구용 제품은 테스트 중인 활성 성분의 약제학적 형태 또는 연구에서 참조로 사용되는 것으로 정의된다. 이 연구에서 사용되는 활성 연구용 제품인 Ad5.F35-hGCC-PADRE는 근육 주사용으로 TG 완충액에서 제형화된 인간 GCC 단백질에 대한 복제-결핍 아데노바이러스 백신이다.
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Ad5.F35-hGCC-PADRE의 특징
바이러스: 아데노바이러스과; 비-외피, 이십면체 비리온, 70 내지 90㎚ 직경, 이중-가닥, 선형 DNA 게놈. 야생형 바이러스는 용해성인 반면, 백신의 E1/E3-결실 버전은 복제되지 않는다.
병원성: Ad5.F35-hGCC-PADRE는 복제가 결핍된 아데노바이러스이므로, 생산적인 감염의 위험이 낮다. 야생형 아데노바이러스 감염의 증상은 발열, 비염, 인후염, 기침, 결막염이다. 아데노바이러스는 강력한 면역 반응을 생성할 수 있다. 아데노바이러스는 숙주-세포 게놈에 통합되지 않으며, Ad5.F35-hGCC-PADRE에는 통합을 촉진하는 임의의 추가적인 특성이 없다. Ad5.F35-hGCC-PADRE에 의해 발현된 이식유전자는 면역 반응이 생성되는 분비된 GCC-PADRE 융합 단백질을 생성한다. 이러한 반응은 환자에서 항종양 활성을 가질 것으로 예상된다.
Ad5.F35-hGCC-PADRE는 TG 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 25mM NaCl, 2.5% 글리세롤)에서 제형화된 Ad5.F35-hGCC-PADRE 바이러스 입자로 구성된 액체에 단백질 기원의 눈에 띄는 미립자를 함유할 수 있는 재조합 아데노바이러스 5형 입자의 유백색 현탁액이다. 백신은 1.2 ㎖의 투명한 무색 멸균 용액이 들어 있는 바이알에 필요한 농도로 공급된다. Ad5.F35-hGCC-PADRE는 빛으로부터 보호된 상태로, -70℃ 미만에서 보관되어야 한다. 바이알은 분배되지 않는 한 해동해서는 안 된다. 동결-해동 주기는 백신 효능을 감소시키므로 피해야 한다.
실시예 5
유전자 전달을 매개하고 강력한 면역 반응을 유도하는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)의 능력은 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)를 암 및 감염성 질환에 대한 실험적 백신을 위한 인기 있는 벡터로 만들었다. 실제로, Ad5 벡터를 사용한 400건 초과의 임상 시험이 있었으며, 대부분의 시험은 암 치료제 개발에 중점을 두고 있다. 그러나, 자연 감염 시 숙주 면역계는 Ad5 캡시드에 대한 중화 항체(NAb)를 발달시켜 바이러스 확산을 제한하고 재감염을 차단한다. Ad5 감염은 많은 인간 집단에서 풍토병이기 때문에, 전 세계 인구의 70% 초과에 존재하는 기존 NAb는 Ad5-기반 백신 전략을 제한한다. 이러한 고려 사항은 많은 수의 환자에서 치료 면역 반응을 생성할 수 있는 암 및 병원체-연관 항원을 표적으로 하는 백신에 사용하기 위한 개선된 벡터의 필요성을 강조한다. 중요하게도, 아데노바이러스 캡시드는 헥손, 펜톤, 및 섬유 단백질로 구성되어 있지만, 인간의 자연 Ad5 감염에 의해 유도된 NAb는 주로 Ad5 섬유로 향하며, 이는 이 요소에 대한 기존 면역을 우회하는 전략이 Ad5-기반 백신을 개선시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 Ad5 섬유를 희귀 아데노바이러스 혈청형인 Ad35(국제 혈청학적 유병률 약 10%)의 섬유로 대체하여, 위장(GI) 암 항원 구아날릴 사이클라제 C(GUCY2C)를 발현하는 마우스 모델에서 항종양 면역을 개선시킴으로써 기존 Ad5 NAb를 극복하고자 하였다. 전임상 모델은 Ad5-기반 GUCY2C-유도 백신(Ad5-GUCY2C-S1)이 자가면역 없이 CD8+ T-세포 및 항체 반응을 유도한다는 것을 입증하였다. 또한, 마우스의 Ad5-GUCY2C-S1 백신접종은 폐와 간에서 전이성 결장직장암에 대한 장기 T-세포 매개 보호를 유도하였다. 더욱이, 이러한 결과는 백신(Ad5-GUCY2C-PADRE)의 인간화 버전이 종래 치료법에 따른 결장직장염 환자에서 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포 반응을 안전하게 유도했음을 보여주는 최근의 인간 최초 I상 임상 시험(NCT01972737)에서 반복되었다. 그러나 Ad5에 대한 NAb의 기존 역가가 높은 환자는 Ad5-GUCY2C-PADRE 백신접종 후 GUCY2C-특이적 면역을 생성하지 못하였다. Ad5 NAb를 극복하기 위해, 본 발명자들은 마우스 및 인간에서 Ad5와 동등한 안전성 및 항종양 활성 및 Ad5 NAb에 대한 내성을 가지는 Ad35의 섬유(Ad5.F35)를 보유하는 키메라 Ad5 벡터를 생성하였다. 이 키메라 백신은 GI암 환자에게 번역되어 Ad5 면역이 낮은 환자뿐만 아니라 기존 Ad5 NAb가 높은 환자에게도 GUCY2C-특이적 면역을 안전하게 유도할 수 있다.
재료 및 방법
아데노바이러스 벡터
부위 1(S1)로 알려진 인플루엔자 HA107-119 CD4+ T-세포 에피토프가 있는 마우스 세포외 도메인(GUCY2C1-429)을 함유하는 아데노바이러스는 이전에 설명되었다(Ad5-GUCY2C-S1). 여기에서, GUCY2C-S1을 pShuttle에 클로닝하고 Ad5 섬유를 Ad35 섬유로 대체하여 Ad5.F35-GUCY2C-S1을 생성한, 이전에 생성된 복제-결핍 키메라 아데노바이러스(Ad5.F35)의 E1 영역에 서브클로닝하였다. 이 연구에 사용된 모든 아데노바이러스 백신을 HEK293 세포에서 생성하였으며 세포 및 유전자 요법 벡터 개발 연구소(Cell and Gene Therapy Vector Development Lab)에서 베일러 의과대학에 의한 우수 실험실 관리기준(Good Laboratory Practices)에 따라 염화세슘 초원심분리에 의해 정제하고 복제-가능 아데노바이러스, 마이코플라즈마, 및 숙주 세포 DNA 오염에 대해 음성임을 증명하였다. 시험관내 GUCY2C-발현 실험(용량-반응 및 시간-경과)을 A549(미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection; ATCC) 세포에서 수행하였다. 바이러스를 표시된 용량으로 배양물에 첨가하고 배양 상청액을 표시된 시점에서 수집하였다. 상대적인 GUCY2C 수준을 2 ㎍/㎖ MS7 마우스 항-GUCY2C 단클론성 항체 및 0.1 ㎍/㎖ 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 염소 항마우스 2차 항체(Jackson Immuno)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 상청액에서 정량화하였다.
마우스와 면역화
실험을 위해 8주령의 수컷 및 암컷 BALB/cJ 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 동물 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학교 동물 실험 윤리 위원회(Thomas Jefferson University Institutional Animal Care and Use Committee)(프로토콜 02092)의 승인을 받았다. 면역화를 위해, 마우스는 0.5 ㎖ 인슐린 주사기를 사용하여, 각각의 뒷다리에 1회씩 2회의 50㎕ 근육 주사로 투여되는 1010 또는 1011 vp의 Ad5-GUCY2C-S1, Ad5.F35-GUCY2C-S1 또는 Ad5.F35-GFP(대조군)를 받았다.
ELISpot에 의한 T-세포 반응의 정량화
제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 인터페론-γ(IFN-γ) 단색 ELISpot 키트(Cellular Technology)를 사용하여 ELISpot 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 IFN-γ 포획 항체로 코팅하였다. 다음 날, 플레이트를 인산염-완충 식염수(PBS)로 세척하고 면역화된 마우스 유래의 비장세포를 펩타이드 없이 또는 CTL-TEST 배지(Cellular Technology) 중 0.1% 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 중 10 ㎍/㎖ GUCY2C254-262 펩타이드와 함께 500,000개 세포/웰로 37℃에서 24시간 동안 도말하였다. T-세포 결합력 연구를 위해, 비장세포를 106개 세포/웰로 정규화된 GUCY2C254-262 펩타이드(10 ㎍/㎖에서 56 pg/㎖)의 농도를 감소시키면서 600,000 내지 800,000개 세포/웰로 도말하였다. 인큐베이션 후, 세포를 제거하고, IFN-γ-생성 스팟-형성 세포를 검출하기 위해 발색 시약을 첨가하였다. ImmunoSpot S6 Universal Analyzer(Cellular Technology)의 SmartCount 및 Autogate 기능을 사용하여 웰당 스팟-형성 세포의 수를 결정하였다. 펩타이드-자극 웰에서 0.1% DMSO 웰의 평균 스팟 수를 차감함으로써 GUCY2C-특이적 반응을 계산하였다.
종양 연구
GUCY2C-발현 마우스(BALB/c) CT26 결장직장암 세포를 생체내 종양 연구에 사용하였다. pLenti4-V5-GW-루시페라제를 이용하여 293FT 세포(Invitrogen)에 의해 생성된 렌티바이러스 상청액으로 형질도입하여 루시페라제-발현 세포를 생성하였다. 종양 실험을 위해, 꼬리 정맥으로 5×105 CT26 세포를 전달하기 7일 전에 1010 vp의 Ad5-GUCY2C-S1, Ad5.F35-GUCY2C-S1 또는 PBS(대조군)으로 BALB/cJ 마우스를 면역화시켰다. PBS 중 3.75㎎의 D-루시페린 칼륨염(Gold Biotechnologies)을 피하 주사한 후 8분 인큐베이션하고 Caliper IVIS Lumina XR 이미징 스테이션(PerkinElmer)을 사용하여 10초 노출로 영상화하여 종양 부담을 매주 정량화하였다. Living Image In Vivo Imaging Software(PerkinElmer)를 사용하여 총 광휘(광자/초)를 측정하였다.
항체 중화 분석
토마스 제퍼슨 대학교 기관 검토 위원회(Thomas Jefferson University Institutional Review Board)에서 승인한 Ad5-GUCY2C-PADRE(NCT01972737)로 면역화시키기 전에 환자로부터 혈청 샘플을 이전에 얻었다. Ad5 및 Ad5.F35 벡터에 대한 중화 항체 역가를 정량화하였다. 간단히 말해서, 가열-불활성화된 혈청 샘플의 희석액을 105 A549 세포(ATCC)를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하고 108 vp의 GFP-발현 Ad5 또는 Ad5.F35 바이러스(각각 Ad5-CMV-eGFP 또는 Ad5.F35-CMV-eGFP; 베일러 벡터 개발 연구소(Baylor Vector Development Lab))로 감염시켰다. 37℃에서 41시간 인큐베이션 후, eGFP 형광(490㎚ 여기, 510㎚ 방출)을 POLARstar Optimate 플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 정량화하였다. 샘플 형광을 세포 및 바이러스를 함유하는 대조군 웰(0% 중화) 또는 세포만을 함유하는 웰(100% 중화)로 정규화하였다. 역가는 50% 중화를 생성하는 혈청 희석액으로서 비-선형 회귀를 사용하여 정량화하였다(Prism v8, GraphPad Software).
Ad5 중화 면역 연구
항-Ad5 면역을 유도하기 위해, 마우스를 4주 간격으로 1회 또는 2회 1010 Ad5-GFP에 비강내로 노출시켰다. 마지막 노출 30일 후에, Ad5 NAb를 상기에서 기재된 바와 같이 혈청에서 정량화하고 마우스를 1011 vp의 Ad5-GUCY2C-S1 또는 Ad5.F35-GUCY2C-S1로 근육내로 면역화시켰다.
생물분포 및 독성학 연구
BALB/cJ 마우스를 1011 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 단일 용량, 28일 간격으로 1011 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 3회 용량, 또는 PBS(대조군)로 근육내로 면역화시켰다. 투약 당일(투약 후 5분, 1시간 및 3시간) 추가적인 평가와 함께 매일 1회 이상 반응에 대해 동물을 모니터링하였다. 제14일과 제90일에 지정된 동물을 희생시키고 뇌, 침샘, 위, 소장, 결장, 심장, 폐, 신장, 간 및 주사 부위를 적출하고 칭량하여 맹검 병리학자의 조직병리학적 분석을 수행하고(병리학적 평가는 IDEXX BioAnalytics에 의해 수행됨) GUCY2C 이식유전자에 대해 이전에 기재된 분석을 사용하여 정량적 PCR(qPCR)에 의한 바이러스 DNA를 검출하였다. 또한, 조직병리학적 분석 및 상기 기재된 바와 같은 바이러스 DNA의 검출뿐만 아니라, 상기 기재된 바와 같은 IFN-γ ELISpot에 의한 GUCY2C-특이적 T-세포 반응의 정량화를 위해 비장을 수집하였다.
통계 분석
GraphPad Prism Software v8을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계적 유의성은 ns=p>0.05, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001로 고려하였다. β=0.2 및 α=0.05인 이전 연구를 기반으로 하여 코호트 크기를 강화하였다. 생존 결과의 다중 비교를 위해, 본페로니(Bonferroni) 방법을 사용하여 유의 임계값을 보정하였다. 백신-유도 T-세포 반응자 및 비반응자를 확인하기 위해, 변형된 분포 없는 재샘플링 접근법을 이용하였으며, 양성 T-세포 반응을 DMSO 및 20개 초과의 특이적인 스팟/106개 세포와 비교하여 2배로 정의하였다. 반응에 대한 성별 및 백신접종 횟수의 영향을 결정하기 위해, R 패키지 MASS를 사용하는 아카이케 정보 기준(Akaike information criterion)에 의한 단계적 역방향 변수 선택과 함께, 최대 3방향 상호작용에 대해 상이한 성별, 코호트 및 치료 요법의 로그-변환된 백신 반응 크기를 마우스에서 비교하였다.
결과
Ad5-GUCY2C-S1 및 Ad5.F35-GUCY2C-S1 벡터
전 세계적으로 Ad5 혈청 유병률이 70%를 초과하는 동안(일부 지역에서는 90% 초과임), Ad35는 약 10%이고 더 낮은 역가와 연관이 있다. 도 6 패널 A. 따라서, 본 발명자들은 섬유를 Ad35 섬유로 대체한 Ad5로 구성된 키메라 아데노바이러스(Ad5.F35)를 구축하고 이의 인간과 마우스에서 GUCY2C-특이적 면역을 유도하고 Ad5-특이적 면역에 저항하는 능력을 평가하였다. Ad5-GUCY2C-S1은 C-말단에서 부위 1로 알려진 I-Ed-제한된 CD4+ 에피토프에 융합된 마우스 GUCY2C 세포외 도메인을 발현하는 복제-결핍 인간 Ad5이다. Ad5.F35-GUCY2C-S1을 생성하기 위해, Ad5 섬유(L5)를 Ad35 섬유로 대체하였다(도 6 패널 B). HEK293 세포에서 생성된 복제-결핍 Ad5-GUCY2C-S1 및 Ad5.F35-GUCY2C-S1은 시험관내 A549 인간 폐포에서 기저 상피 세포에서 GUCY2C-S1 단백질의 용량-의존적(도 6 패널 C) 및 시간-의존적(도 6 패널 D) 발현을 생성하였다.
Ad5.F35-GUCY2C-S1은 GUCY2C-특이적 항종양 면역을 유도한다
Ad5.F35-GUCY2C-S1에 의한 GUCY2C 발현의 시험관 내 검증에 따라, 본 발명자들은 생체내 백신접종 후 GUCY2C-특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 확인하였다. 1010 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1로 근육내로 면역화된 BALB/c 마우스는 Ad5-GUCY2C-S1과 비교하여, 54% 더 낮은 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포 반응을 생성하였고(도 7 패널 A), GUCY2C-특이적 항체 반응은 없었다(도 7 패널 B). 중요하게도, Ad5 및 Ad5.F35 백신은 GUCY2C-표적화 백신의 항종양 효능의 중요한 결정인자인 비슷한 결합력(도 7 패널 C)의 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포를 생성하였다. 대조적으로, GUCY2C-특이적 항체 반응은 검출 가능한 항종양 활성이 없다. 유사하게, Ad5 및 Ad5.F35 백신은 비슷한 S1-특이적 CD4+ T-세포 반응을 생성하였다(도 7 패널 D).
이전 연구는 Ad5-GUCY2C 백신이 전이성 결장직장암의 뮤린 모델에서 보호적인 항종양 CD8+ T-세포 반응을 유도한 것을 밝혔다. 따라서, BALB/c 마우스를 GUCY2C-S1을 발현하는 Ad5 또는 Ad5.F35로 면역화시키고, 7일 후에 GUCY2C 및 반딧불이 루시페라제를 발현하는 CT26 결장직장암 세포로 시험투여하였다. 이 모델은 구체적으로 GUCY2C 백신이 개발되고 있는 임상 환경인 전이성 질환의 2차 예방을 모방한다. 이전에 입증된 바와 같이, Ad5 백신접종은 전이성 종양 부담을 거의 제거하고(도 8 패널 A 및 B) 질환 진행을 지연시켰으며(도 8 패널 C) 생존을 개선시켰다(도 8 패널 D) @@. 유사하게, Ad5.F35는 또한 종양 부담(도 8 패널 A 및 B), 질환 진행(도 8 패널 C)을 감소시키고, 생존을 연장시켰다(도 8 패널 D). 중요하게도, 종양 부담 감소, 질환 진행 반대 및 생존 촉진에 있어서 Ad5-기반 및 Ad5.F35-기반 GUCY2C 백신의 효능은 동일하였다(도 8 패널 A 내지 D).
Ad5.F35는 마우스와 인간의 Ad5 유도 면역에 저항한다.
Ad5에 대한 NAb는 Ad5-GUCY2C-PADRE 백신접종을 받은 환자의 불량한 GUCY2C-특이적 면역 반응과 관련이 있었고, Ad5에 대한 마우스의 사전 노출은 유사하게 백신-유도 면역을 약화시켰다. 기존 Ad5 면역에 대한 Ad5.F35-기반 백신 내성을 환자의 자연 감염 경로인 Ad5에 대한 호흡기 사전 노출 모델에서 정량화한 다음, 백신접종 및 GUCY2C-특이적 T-세포 반응의 정량화를 수행하였다. 대조군 마우스(Ad5에 사전 노출되지 않음; 미경험) 및 비강내 Ad5에 1회(1×) 또는 2회(2×) 사전 노출된 마우스에는 GUCY2C-S1을 발현하는 근육내 Ad5 또는 Ad5.F35로 4주 후에 백신을 접종하고. 면역 반응을 2주 후에 정량화하였다(도 9 패널 A). 예상대로, Ad5에 사전 노출된 1마리는 보통(1:200 미만)의 Ad5 NAb를 유도하고 GUCY2C-특이적 T-세포 반응을 ~약 75% 감소시켰지만, 사전 노출된 2마리는 Ad5 NAb를 높게(1:200 초과) 유도하고 Ad5 백신접종 후 GUCY2C-특이적 T-세포 반응을 90% 초과로 감소시켰다(도 9 패널 B). 대조적으로, GUCY2C-특이적 T-세포 반응은 Ad5.F35 백신접종 후 단지 60%(1× 사전 노출) 및 80%(2× 사전 노출) 감소하였다(도 9 패널 B). 중요하게도, Ad5.F35는 Ad5에 대한 연속 사전 노출 후 Ad5(30% 코호트 반응)와 비교하여 상당히 더 많은 집단 분율(80% 코호트 반응)에서 T-세포 반응을 생성하였다(도 9 패널 C).
마우스에서의 이러한 관찰은 Ad5-GUCY2C-PADRE I상 시험(NCT01972737)에서 결장직장암 환자의 혈청을 사용하여 반복되었다. 여기에서 Ad5-GUCY2C-PADRE로 백신 접종하기 전에 수집된 혈청 샘플에서 확립된 Ad5/Ad5.F35 리포터 바이러스 저해 생물검정을 사용하여 Ad5 및 Ad5.F35에 대한 NAb 역가를 정량화하였다. 이러한 환자에서, Ad5.F35-특이적 NAb 역가는 Ad5-특이적 역가보다 실질적으로 더 낮았다(도 9 패널 D). 가장 중요한 것은, 환자의 50%가 낮은(1:200 미만) Ad5 NAb 역가를 보유하였으며(도 9 패널 D 및 E), 이는 40% GUCY2C-특이적 반응률과 밀접한 상관관계가 있다는 것이다. 대조적으로, 90%는 Ad5.F35 NAb 역가가 낮았으며, 이는 Ad5.F35-기반 백신으로 면역화된 대다수의 환자가 GUCY2C-특이적 반응을 생성할 수 있음을 시사한다(도 9 패널 E). 종합적으로, 이러한 관찰은 Ad5 전달 플랫폼을 중화하는 반복적인 환경 노출에 의해 유도된 기존의 바이러스 면역이 키메라 Ad5.F35 벡터에 의해 극복되어 약간의 집단 백신 반응을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
Ad5.F35-GUCY2C-S1의 안전성, 생체분포 및 독성
미국 식품의약국(Food and Drug Administration) IND(Investigational New Drug; 시험용 신약)-가능 연구로 급성 및 만성 효과를 조사하기 위해 3가지 계획을 이용하여 BALB/c 마우스에서 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 독성, 생체분포 및 면역원성을 정량화하였다(도 10 패널 A). 성별에 따라 균형을 이룬 코호트는 1011 Ad5.F35-GUCY2C-S1을 단일 근육 주사 또는 4주 간격으로 3회의 근육 주사로 받고, 매일 모니터링하고, 표시된 바와 같이 분석을 위해 제14일 또는 제90일에 희생되었다(도 10 패널 A). 관찰, 체중 변화, 또는 생존에 의한 생활기 단계에서 급성 또는 만성 독성의 징후는 없었다(도 10 패널 A 내지 D). 유사하게, 부검 시 장기 중량 또는 조직병리학(미도시)에서 임상적으로 유의한 차이가 없었다. 장기 무게의 작은 통계적 차이는 임상적으로 중요하지 않은 것으로 간주되었으며 백신 노출(용량, 시간)과 관련이 없었다. qPCR로 정량화된 생체분포로 주사 부위와 비장에서 Ad5.F35-GUCY2C-S1을 검출하였지만, 급성 및 만성 노출 후 다른 기관에서는 감지할 수 없었다. 더욱이, 강력한 CD8+ T-세포 반응은 단일 투여 후 70%의 마우스에서 제14일에 정량화되었으며, 이는 제90일까지 지속되었다(도 10 패널 E 내지 G). 예상대로 CD8+ T-세포 반응은 3회 백신접종 후 제90일에 더 컸으며, 더 많은 마우스(100%)에서 지속되었다(도 10 패널 E 내지 G).
논의
수십 년간의 유전자 치료 시험을 통해, Ad5는 인기 있는 벡터로 남아 있는 반면, 높은 Ad5 혈청학적 유병률은 보편적 백신접종의 장벽으로 남아 있다. 자연 호흡기 감염은 Ad5-기반 백신을 중화하는 수명이 긴 항체를 생성하여, 이식유전자 전달 및 잠재적인 치료 이점을 제거할 수 있다. 이러한 맥락에서, Ad5 혈청학적 유병률은 여러 국가에서 70% 초과로, 대안적인 벡터에 대한 충족되지 않은 필요성을 강조한다. 여기에서, 본 발명자들은 키메라 Ad5.F35가 기존 Ad5 면역에 저항하고 이식유전자-특이적 항종양 면역을 유도한다는 것을 입증한다. 실제로, Ad5.F35는 마우스 및 인간에서 Ad5 노출과 연관된 중화에 덜 민감하고 Ad5에 사전 노출된 마우스에서 상당히 더 높은 비율의 백신 반응자를 생성한다. 이러한 관찰은 Ad5.F35가 환자 집단에서 더 높은 비율의 백신 반응자를 생성할 것이라는 제안을 뒷받침한다.
Ad5 섬유에 대한 NAb가 재감염을 제한하는 정도는 논란의 여지가 있다. 일부 연구에서 Ad5 섬유를 다른 혈청형의 섬유로 대체하면 기존 Ad5 면역을 우회한다. 대조적으로, 다른 연구는 이러한 키메라 아데노바이러스는 기존 Ad5 NAb를 회피하지 않으며, 이는 헥손이 항체 중화의 주요 표적임을 시사함을 제안한다. 근육내 또는 정맥내 투여에 의해 기존 Ad5 면역을 생성한 이전 연구와 대조적으로, 여기에서 Ad5 면역은 마우스의 비강내 노출에 의해 유도되어, 자연적인 인간 호흡기 감염을 반복한다. 더욱이, 반복되는 호흡기 감염에 의해 균일하게 생성되는 결장직장암 환자의 자연적인 기존 Ad5 NAb는 유사하게 Ad5.F35 벡터에 의해 극복되었다. 중요하게는, 아데노바이러스 감염 후 항체 반응의 품질은 노출 경로에 따라 다르다. 실제로, 호흡기 감염은 섬유-특이적 NAb를 유도하는 반면, 근육내 노출은 캡시드-특이적 NAb를 유도한다. 다양한 면역화 경로를 반영하는 NAb 반응의 이러한 질적 차이는 실험실 간의 관찰 불일치에 기여할 수 있다. 환자 샘플로 확인 및 검증된 관련 동물 모델을 사용하는 현재의 연구는 Ad5.F35-기반 백신이 상당한(약 90%) 비율의 환자에서 임상적으로 관련된 면역 반응을 생성해야 한다는 제안을 뒷받침한다.
전 세계 인구에서 풍토성 Ad5 면역에 의해 부과되는 만연한 제한을 인식하여 백신 개발에서 다루기 쉬운 전략으로서 대안적인 혈청형 및 키메라 작제물에 대한 관심이 부상하고 있다. Ad26, Ad35, 및 Ad48 벡터는 I상 임상 시험으로 진행되었다. 이와 관련하여, 건강한 환자들 사이의 Ad5, Ad26, Ad35 및 Ad48 면역의 비교는 풍토성 Ad35 혈청 양성이 전 세계 인구에 걸쳐 가장 낮은 것으로 밝혀져, 본 명세서에서 이용된 키메라 전략을 강화시킨다. 유사하게, Ad5 및 Ad48 성분을 포함하는 첫 번째 헥손-키메라 아데노바이러스는 환자에서 안전하고 면역원성이었다. 흥미롭게도 Ad5-Ad35 키메라 벡터는 모 벡터와 비교하여 시험관 내에서 다양한 인간 세포 유형을 보다 효율적으로 형질도입한다.
항종양 효능은 동등했지만, Ad5-GUCY2C-S1과 비교하여, Ad5.F35-GUCY2C-S1의 경우 CD8+ T-세포 반응이 더 낮았고 항체 반응이 없었다. 그러나, GUCY2C-유도 면역요법의 항종양 효능은 이펙터 T-세포의 양이 아니라 주로 T-세포 결합력에 의해 좌우된다. 이러한 맥락에서, Ad5 및 Ad5.F35 면역화 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포의 기능적 결합력은 동등했으며, 비슷한 항종양 효능과 일치하였다. 벡터 간의 이식유전자-특이적 면역의 양적 차이는 다양한 요인을 반영할 수 있다. 따라서, Ad5.F35 면역화 후 GUCY2C-S1 이식유전자의 양 및 지속성은 Ad5와 비교하여 더 낮으며, 생체내 Ad5 형질도입 효율이 Ad5.F35보다 몇 배 더 높을 수 있다는 이전 관찰과 일치한다. 더욱이, Ad5 섬유는 CXADR(콕사키바이러스 및 아데노바이러스 수용체)에 결합하는 반면, Ad35 섬유는 CD46에 결합하여, 두 바이러스가 별개의 세포 유형을 감염시킬 수 있음을 시사한다.
체크포인트 저해제가 임상에서 관행을 바꾸는 결과를 생성하고 면역요법을 여러 악성종양의 치료를 위한 효과적인 전략으로 정의했지만, 보편적으로 성공하지는 못하였다. 이러한 맥락에서, 미세부수체 안정적 결장직장암 및 췌장암(각각 암 사망률의 두 번째 및 세 번째 주요 원인)을 포함한 많은 암 유형에서 네오에피토프의 부족은 이들을 체크포인트 차단에 둔감하게 만든다. 실제로, 5개의 결장직장암 표본의 표면에 제시된 네오에피토프의 조사로, 총 3개의 네오에피토프가 밝혀졌다. 따라서, 암-연관 자가-항원을 표적으로 하는 백신은 이러한 저온 종양의 전이를 예방 및 치료하기 위한 전략으로 단독으로 그리고 체크포인트 저해제와 함께 다시 등장하였다.
체크포인트 저해제는 일부 암의 전이 환경에서 1차 치료법이 되었으며, T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR-T 세포)는 전이성 및 불응성 질환 환자에게 사용된다. 대조적으로, 질환 재발의 상당한 위험이 있는 종래 수술적/방사선/화학 요법 후 "질병의 증거가 없는"(NED) 초기 단계 암 환자를 위해 개발된 암 면역 요법은 거의 없다. 실제로, II기의 약 25%, III기의 약 50%의 결장직장암 환자는 수술과 화학요법 후에 재발하는 반면, 절제 가능한 췌장암 환자의 70%는 재발을 경험한다. Ad5.F35-GUCY2C-PADRE와 같은 종양-연관 항원을 표적으로 하는 백신은 다른 방법으로는 체크포인트 저해제 또는 CAR-T 세포를 받을 수 없는 NED 환자의 전이성 질환의 이차 예방을 위한 안전하고 효과적인 면역요법을 제공할 수 있다.
현재 연구는 키메라 아데노바이러스 벡터 Ad5.F35가 널리 사용되는 Ad5 벡터보다 바람직할 수 있으며 추가 조사가 필요함을 시사한다. 실제로, 이들 연구는 결장직장암, 췌장암, 위암, 식도암을 포함한 GUCY2C-발현 암 환자에서 GUCY2C-유도 면역요법의 진행 중인 임상 조사가 Ad5 벡터보다 Ad5.F35를 사용하는 것이 도움이 될 수 있다고 제안한다. 이러한 맥락에서, 다가오는 임상 시험은 GI암(NCT04111172) 환자에서 Ad5.F35-GUCY2C-PADRE의 기존 면역에 대한 안전성, 면역원성, 및 내성을 조사할 것이다. 높은 비율의 환자에서 GUCY2C-표적화 면역의 안전한 생성은 Ad5.F35-GUCY2C-PADRE가 모든 암 사망의 25%를 차지하고51 확립된 면역요법이 효과적이지 않는 GI암 환자에서 표준 요법 후 재발을 예방하는 능력을 확립하기 위한 효능 시험으로 이어질 것이다.
실시예 6
배경: 재조합 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스(Lm)는 암 면역요법을 위한 새로운 플랫폼으로, 많은 바이러스 벡터의 한계인 벡터-특이적 중화 면역에 대한 무감각을 부분적으로 반영한다. 더욱이, Lm은 항원-제시 세포(APC)에 대한 친화성을 가지는 세포내 박테리아로서, CD4+ T-헬퍼 세포(Th 세포) 및 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL)를 활성화시킴으로써 면역 반응을 개시하는 것을 담당하는 면역 세포로 백신을 유도한다. 이러한 이점은 최근 결장직장암(CRC) 환자에 대한 I상 임상 시험에서 테스트된 Ad5-GUCY2C-PADRE 백신의 한계와 일치한다. Ad5-GUCY2C-PADRE 면역원성은 Ad5 바이러스 벡터를 표적으로 하는 기존의 중화 항체(NAb)에 의해 인간 집단에서 제한된다. 더욱이, GUCY2C-특이적 면역 반응은 CD8+ T-세포 및 B-세포 반응의 유도에 필수적인 CD4+ T-세포 반응의 부재를 특징으로 한다. 대조적으로, GUCY2C를 포함하는 Lm 백신(Lm-LLO-GUCY2C)은 벡터-특이적 면역에 내성이 있어야 하고, APC에 대한 친화성을 반영하여, GUCY2C-특이적 CD8+ T 및 B 세포에 CD4+ T 세포 도움을 제공하여 CRC 제거를 야기하는 Lm-특이적 CD4+ T-세포 반응을 유도하여야 한다.
목적/가설: Lm-LLO-GUCY2C는 현재의 GUCY2C 백신보다 우수하여, 중화항체와 GUCY2C-특이적 CD4+ T-세포 내성을 극복하여 안전하고 효과적인 CRC 면역요법을 생성한다.
구체적인 목표: 이 제안은 (1) 면역원성, (2) 전이성 CRC 모델에서의 항종양 활성, 및 (3) Lm-LLO-GUCY2C의 안전성을 정의할 것이다.
연구 설계: Lm-LLO-GUCY2C를 생산할 것이고, GUCY2C-특이적 면역 반응(CD4+ 및 CD8+ T 및 B 세포)을 정량화함으로써 마우스에서 이의 면역원성을 테스트할 것이다. 또한, Lm-특이적 CD4+ T-세포 반응을 정량화할 것이고, GUCY2C-특이적 반응을 유도하는 역할을 CD4-고갈 연구에 의해 결정할 것이다. Lm-LLO-GUCY2C의 항종양 효능을 전이성 CRC의 마우스 모델에서 테스트하고 벤치마크 GUCY2C 백신(Ad5-GUCY2C-S1)과 비교할 것이다. 마지막으로, Lm-LLOGUCY2C 독성을, 특히 정상적인 GUCY2C-발현 조직에서 조사할 것이다. 제안된 연구에 대한 양성 및 음성 대조군은 각각 Ad5-GUCY2C-S1 및 Lm-LLO(GUCY2C가 결여됨)를 포함한다.
혁신: GUCY2C 백신 개발이 시작에서 임상 테스트에 이르기까지 진행됨에 따라, GUCY2C 면역생물학 및 백신 플랫폼에 대한 본 발명자들의 이해가 충분히 발전하여 더 많은 정보에 입각한 GUCY2C 백신 설계가 가능하였다. 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 Lm(벡터 면역에 대한 저항성; APC 친화성) 및 GUCY2C(장-특이적; CRC에서 보편적인 발현; 선택적 CD4+ T-세포 내성)의 특성이 상호 유리할 수 있고, CRC에 대한 효과적인 면역 요법을 생성할 수 있다고 가정한다. Lm 백신의 확립된 안전성 및 효능 및 환자의 GUCY2C 면역원성의 맥락에서, 여기 결과는 I상 임상 시험으로 신속하게 번역될 수 있으며, 이 가설을 동물에서 인간으로 확장하여 궁극적으로 민간 및 군대 CRC 집단에서 효과적인 면역 요법으로 이어질 수 있다.
잠재적인 CRC 면역요법으로서 GUCY2C(Lm-LLO-GUCY2C)를 표적으로 하는 리스테리아-기반 암 백신의 면역원성, 효능, 및 안전성. CRC는 매년 약 150,000건의 새로운 사례가 있는 네 번째로 흔한 신생물이며, 민간인 및 군대에서 암 사망률의 두 번째 주요 원인으로 약 50%의 사망률을 보인다.
실시예 7
GUCY2C=발현 암을 치료하기 위한 백신. 이 백신은 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스를 사용하여 결장직장암 항원인 GUCY2C를 "항원-제시 세포"(APC)에 전달하여 GUCY2C-발현 암을 찾아 제거할 수 있는 GUCY2C에 대한 GUCY2C-특이적 T 세포 반응을 유도한다. 활성, 효능 및 안전성을 결정하기 위해 새로운 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 백신을 결장직장암 마우스 모델에서 먼저 테스트하였다.
주요 과제 1: Lm-LLO-GCC 및 대조군 Lm 백신을 생성한다.
주요 과제 2: WT 마우스에서 내성을 극복하는 Lm-LLO-GCC의 능력을 결정한다. WT 및 KO 마우스에서 Lm-LLO-GCC-유도 면역 반응을 정량화한다.
주요 과제 3: GCC-특이적 반응이 CD4+ T-세포 의존적인지의 여부 결정한다.
전이성 CRC 모델에서 Lm-LLOGCC의 항종양 활성을 정량화한다.
LmLLO-GCC와 Ad5-GCC-S1의 항종양 효능을 비교한다.
주요 과제 5: Lm-LLO-GCC 및 Ad5-GCC-S1에 대한 면역 반응에 대한 벡터-특이적 면역의 영향을 비교한다. 기존 벡터 특이적 면역이 있는 Lm-LLOGCC 또는 Ad5-GCC-S1-면역 마우스에서 면역 반응을 정량화한다.
주요 과제 6: Lm-LLO-GCC 및 Ad5-GCC-S1 항종양 효능에 대한 벡터-특이적 면역의 영향을 비교한다. 기존 벡터-특이적 면역이 있는 마우스에서 Lm-LLOGCC 또는 Ad5-GCC-S1의 항종양 효능을 정량화한다.
Lm-LLO-GCC의 안전성을 입증한다.
주요 과제 7: 독성 징후에 대해 Lm-LLO-GCC-면역화된 마우스를 검사한다. GCC 발현 및 비-발현 조직에서 Lm-LLO-GCC 병리를 확립한다.
1세대 재조합 Lm-LLO-GCC 백신
통합 플라스미드 pPL2를 사용하여 절단된 리스테리오리신 O(LLO) 발현 카세트 및 LLO 프로모터의 약독화(ΔactA/ΔinLB) 리스테리아 모노사이토게네스(Lm)의 게놈으로 재조합 GCC 또는 GCC-S1 통합을 유도하여 Lm-감염 세포의 세포질로 분비될 LLO-GCC 융합 단백질을 생성하였다(도 14). 이러한 작제물은 이전의 바이러스 벡터-기반 백신에 사용된 GCC의 전체 세포외 도메인(잔기 23 내지 429)을 함유한다.
1세대 Lm-GCC 및 대조군 백신을 Lm 배양물의 상청액에서 GCC 발현을 확인함으로써 품질을 제어하였다(도 15). LLO-GCC 또는 LLO-GCC-S1 융합 단백질을 항-GCC 또는 항-LLO 항체를 사용하여 상등액에서 검출하였다.
1세대 Lm-GCC 백신의 면역원성을 BALB/c 마우스에서 테스트하였다(도 16). 잘 확립된 아데노바이러스-기반 백신(Ad5-GCC-S1)을 양성 대조군으로 사용하였다. 면역화 후, GCC에 대한 CD8+ T-세포 반응을 IFNγ-ELISpot에 의해 정량화하였다. 예상대로, 대조군 Lm-LLO는 GCC-특이적 반응을 유도하지 않았지만; Lm-LLO-GCC 및 Lm-LLO-GCC-S1도 또한 반응을 유도하지 못하였다. 반응은 양성 대조군 Ad5-GCC-S1 백신에 의해 유도되었고 반응은 각각 Lm 및 Ad5 벡터에서 항원 LLO 및 DBP에 대해 생성되었다. 이와 함께, 이러한 데이터는 Lm-LLOGCC 백신이 GCC-특이적 반응의 열악한 유도인자임을 시사하였다.
2세대 재조합 Lm-LLO-GCC 백신
낮은 LLO-GCC 융합 단백질 발현의 맥락에서(도 15), 본 발명자들은 LLO-GCC 융합 단백질의 큰 크기가 면역의 단백질의 발현과 면역의 유도를 방해할 수 있다는 가설을 세웠다. 실제로, LLO에 융합된 큰 종양 항원에 대한 유사한 연구는 융합 단백질을 생성하는 데 있어 유사한 어려움을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 각각 GCC의 약 1/3을 함유하는 3가지의 상이한 2세대 백신을 생성하였다(도 17). 설계는 상이한 GCC CD4+ T-세포 및 CD8+ T-세포 에피토프를 함유하여 2개의 상이한 단편으로 각각의 에피토프에 대한 반응을 테스트할 수 있다.
2세대 Lm-LLO-GCC 백신에서 웨스턴 블롯에 의해 LLO-GCC 융합 단백질의 발현을 확인하였다. 각각의 2세대 백신은 상이한 GCC 단편을 함유하기 때문에, 여러 GCC-특이적 단클론성 항체를 사용하여 Lm 상청액에서 GCC-LLO 융합 단백질을 검출하였다(도 18). 이들 데이터는 각각의 재조합 Lm 백신에 의한 LLO-GCC 융합 단백질 발현을 확인시켜준다. 예상대로, 더 짧은 융합 단백질은 1세대 백신에서 생성된 전장 LLOGCC 제품보다 더 높은 수준으로 발현되었다.
GCC 단편을 함유하는 2세대 Lm-LLO-GCC 백신을 Gcc-/-(도 19 패널 A) 또는 Gcc+/+(도 19 패널 B) 마우스에 투여하였다. Gcc-/- 마우스는 CD4+ T-세포 반응만을 생성하고 Gcc+/+는 CD8+ T-세포 반응만을 생성하기 때문에, 마우스는 이러한 에피토프를 함유하는 백신 단편만을 받았다. Gcc-/- 마우스는 단편 1과 2를 함유하는 CD4+ T-세포 에피토프로 면역화되었을 때 GCC에 대한 강력한 CD4+ T-세포 반응을 생성하였다(도 19 패널 A). 그러나 Gcc++ 마우스는 CD8+ T-세포 에피토프를 함유한 단편 2와 3으로 면역화했을 때 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 생성하지 못하였다(도 19 패널 B). Gcc+/+ 마우스에서 GCC에 대한 CD8+ T-세포 반응의 부족을 확인하기 위해, 본 발명자들은 항-종양 면역 실험을 수행하였다(도 20 패널 A 내지 C). IFNγ-ELISpot 데이터(도 19, 패널 A 및 B)와 일치하여, Gcc+/+ 마우스에서 Lm-LLO-GCC 단편 면역화는 100% 효과적인 Ad5-GCC-S1과 비교하여 항종양 효능을 나타내지 않았다(도 20 패널 A, B 및 C).
2세대 재조합 Lm-LLO-GCC 백신
전장 GCC 또는 GCC의 단편(도 14 내지 20)을 함유하는 백신을 받은 마우스에서 낮은 Lm-LLO-GCC 백신 면역원성과 관련하여, 본 발명자들은 GCC가 LLO 융합 단백질의 맥락에서 적절하게 처리되고 제시되지 않을 수 있다는 가설을 세웠다. 따라서, 본 발명자들은 Lm-감염 세포의 세포질에서 고도로 발현되는 또 다른 Lm 단백질인 ActA에 융합된 GCC를 함유하는 재조합 Lm 백신을 생성하였다(도 21 패널 A). 이들 백신은 Lm 감염된 대식세포에서 GCC 융합 단백질 생성을 유도하였고 발현은 Syn18 인핸서 서열의 포함에 의해 유의하게 향상되었다(도 21 패널 B). 그러나 LmActA-GCC 백신은 Gcc+/+ 마우스에서 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 유도하지 못하였다(도 21 패널 C 내지 D).
다음으로, 본 발명자들은 GCC CD8+ T-세포 에피토프의 5개 탠덤 반복부를 함휴하지만 GCC의 다른 도메인이 없는 새로운 작제물을 형성함으로써 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응을 향상시키고자 하였다(도 22). 이 에피토프를 ActA 및 Syn18에 융합시켜 본 발명자들은 CD8+ T-세포 반응을 유도할 수 있는 고도의 면역원성 작제물이 될 것으로 예상되는 것을 생성하였다. 그러나, 이 백신으로 야생형 BALB/c 마우스의 면역화는 어떠한 반응도 생성하지 못하였다(도 22).
마지막으로, 본 발명자들은 본 발명자들의 작제물 설계에 근본적으로 결함이 있는 무언가가 있을 수 있으며 임의의 항원에 대한 CD8+ T-세포 반응을 생성할 수 없다는 가설을 세웠다. 그 가설을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 GCC의 우세한 CD8+ T-세포 에피토프뿐만 아니라, 이. 콜라이 β갈락토시다제(LacZ), 마우스 Her2 및 Ad5 DNA-결합 단백질(DBP)로부터의 CD8+ T-세포 에피토프에 융합된 ActA-Syn18을 함유하는 새로운 작제물을 생성하였다(도 23). 해당 백신은 LacZ 및 Ad5에 대해 강력한 반응을 생성하였지만, GCC 및 Her2에 대해 의미 있는 반응을 생성하지 못하였다(도 23). 현재, 본 발명자들은 항원 처리 및 GCC CD8+ T-세포 에피토프의 제시를 향상시키도록 설계된 새로운 Lm 작제물을 생성하고 있다.
본 발명자들은 증가된 GCC 에피토프 제시 및 GCC-특이적 CD8+ T-세포 반응의 생성을 초래할 것으로 예상되는 몇 가지 새로운 Lm 작제물을 설계하였으며 현재 생성하고 있다. 남은 프로젝트 기간 동안, 본 발명자들은 이러한 백신의 생성을 완료하고 면역원성을 테스트할 것이다. 이와 함께, 이러한 연구와 완성된 작업은 결장직장암 면역요법을 위한 GCC를 표적으로 하는 리스테리아-기반 백신의 잠재적 유용성을 확립할 것이다.
실시예 8
결장직장암(CRC)은 암 사망의 두 번째 주요 원인이며 미국에서 네 번째로 많이 진단되는 암이다. 더욱이, 전이성 CRC 환자의 5년 생존율은 현재 14%이고 수십 년 동안 상대적으로 정체되어 있어, 전이성 CRC를 예방하고 치료하기 위한 효과적인 치료법의 부족을 강조한다. 이러한 맥락에서 장 수용체 및 종양 연관 항원인 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C)는 개발 중인 면역치료 옵션으로 등장하였다. CRC 환자를 대상으로 한 최근 I상 연구는 GUCY2C(Ad-GUCY2C) 면역원성에 대한 아데노바이러스-기반 백신의 면역원성과 안전성을 입증하였다. 그러나, 백신 항원에 대한 최적의 면역은 이종성 백신 벡터와의 조합 접근법을 사용하여 일상적으로 달성되며, 이는 벡터-특이적 면역과 연관된 제한을 회피하는 데 도움이 되며 따라서 종종 동일한 벡터를 사용하는 상동성 백신접종보다 우수하다. 여기에서, 본 발명자들은 GUCY2C(Lm-GUCY2C)를 분비하는 리스테리아 모노사이토게네스의 재조합 균주를 구축하고 Ad-GUCY2C와 함께 면역원성을 탐색하여 최적의 GUCY2C 백신접종 요법을 정의하였다. 본 발명자들은 Ad-GUCY2C를 사용하여 GUCY2C 면역 반응을 '프라이밍'하고 Lm-GUCY2C를 사용하여 기억 GUCY2C 면역 반응을 증강시키는 이종성 프라임-부스트 면역화 요법을 이용하여 최적의 GUCY2C 및 항종양 면역을 달성함을 입증한다. 본 발명자들은 이 조합이 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 수의 양뿐만 아니라 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 결합력 및 다작용성을 크게 향상시킨다고 보고한다. 더욱이, 본 발명자들은 독성의 징후를 나타내지 않는 백신접종받은 마우스의 조직병리학적 평가와 함께 이러한 면역화가 안전함을 입증한다. 종합적으로, 이러한 발견은 Lm-GUCY2C가 기존 GUCY2C 면역 반응이 있는 환자에서 GUCY2C 면역을 향상시키는 데 이용될 수 있으며 향후 GUCY2C-표적화 백신 임상 시험에 정보를 제공할 수 있음을 시사한다.
재료 및 방법
백신
부위 1(S1)로 알려진 인플루엔자 HA107-119 CD4+ T-세포 에피토프에 융합된 마우스 GUCY2C1-429를 발현하는 키메라 복제-결핍 아데노바이러스는 이전에 설명되었다(Ad5.F35-GUCY2C-S1). 이 연구에 사용된 Ad5.F35-GUCY2C-S1 및 Ad5.F35-GFP 백신을 세포 및 유전자 요법 벡터 개발 연구소에서 베일러 의과대학에 의해 생성하였고 복제-가능 아데노바이러스, 마이코플라즈마, 및 숙주 세포 DNA 오염에 대해 음성임을 증명하였다.
독성 인자 인터날린 B 및 actA의 결실을 함유하는 약독화된 Lm 균주, LmΔactAΔinlB는 ATCC에서 주문하였으며 이 연구에서 이용된 모든 Lm 백신에 대한 모 균주의 역할을 한다. actA 프로모터의 제어 하에 ActA 단백질의 처음 100개 아미노산과 프레임 내에서 각각 마우스 GUCY2C 세포외 도메인23-429 또는 β-갈락토시다제618-1024를 합성함으로써 재조합 Lm-GUCY2C 및 Lm-LacZ를 생성하였다. 생성된 서열을 pPL2 통합 벡터에 클로닝하고 Lm 염색체에 통합하였다. OD600이 약 1이 될 때까지 뇌-심장 주입 브로쓰(Fisher Scientific)에서 Lm 균주를 성장시키고 분취하여 -80℃에서 보관하였다. 실험 당일 분취량을 해동하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, PBS에서 2회 세척하고, 백신접종을 위해 PBS에서 원하는 농도로 희석하였다.
시험관내 감염
마우스 대식세포주 J774A.1을 10% 소태아혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다. J774A.1 세포를 Lm-GUCY2C 또는 대조군 Lm으로 10:1 감염다중도로 감염시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 유리 세포외 박테리아를 제거하기 위해 10 ㎍/㎖ 겐타마이신을 함유하는 배지에 재현탁하고, 추가 5시간 동안 인큐베이션하였다. 면역형광 연구의 경우, Lm을 감염 전에 37℃에서 10분 동안 2mM CellTracker Red CMPTPX 염료와 함께 인큐베이션함으로써 표지하였다. 웨스턴 블롯 연구를 위해, 프로테아제 저해제가 보충된 M-PER 시약(Pierce)을 사용하여 세포에서 단백질을 추출하였다. GUCY2C 단백질은 항-GUCY2C 단클론성 항체 MS20을 사용하여 염색하였고, p60은 항-p60 단클론성 항체 p6017(AdipoGen)을 사용하여 염색하였다.
마우스 및 면역화
실험을 위해 8주령의 수컷 및 암컷 BALB/cJ 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 동물 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학교 동물 실험 윤리 위원회(프로토콜 01956)의 승인을 받았다. 아데노바이러스 면역화를 위해, 마우스는 각각의 뒷다리에 2회의 50 ul 주사로 근육내(i.m.) 투여되는 1010 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1 또는 Ad5.F35-GFP(대조군)를 받았다. Lm 면역화를 위해, Lm-GUCY2C, 빈 Lm, 또는 Lm-LacZ의 5×106 콜로니-형성 단위(CFU)를 PBS 중 100 ul 현탁액으로 정맥내(i.v.) 투여하였다. ELISpot 실험을 위해 빈 Lm을 대조군으로 사용하고 종양 실험을 위해 Lm-LacZ를 대조군으로 사용했는데, 이는 ActA 단백질이 아쥬반트의 역할을 하고 항종양 반응을 증가시킬 수 있기 때문이다. 프라임-부스트 면역화를 위해, 백신을 21일 간격으로 전달하였다.
Ad5 중화 면역 연구
1010 Ad5-GFP에 대한 비강내 노출에 의해 Ad5 면역을 BALB/cJ 마우스에서 유도하였다. 감염 28일 후, 마우스를 출혈시키고, 혈청을 수집하였으며, 1011 vp의 Ad5.F35-GUCY2C-S1에 이어 5×106 CFU의 Lm-GUCY2C 또는 대조군 Lm으로 21일 후에 면역화시켰다. 마우스에서 Ad5 중화 항체 역가를 이전에 기재된 바와 같이 정량화하였다.
IFN-γ ELISpot 분석
제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 인터페론-γ(IFN-γ) 단색 ELISpot 키트(Cellular Technology Limited)를 사용하여 ELISpot 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 4℃에서 IFN-γ 포획 항체로 코팅하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 세척하고 면역화된 마우스 유래의 비장세포를 10 ㎍/mL GUCY2C254-262 펩타이드 유무에 따라 CTL-TEST 배지(Cellular Technology Limited) 중 0.1% DMSO 용액에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. TCR 결합력 연구를 위해, 비장세포를 다양한 농도의 GUCY2C254-262(10 ㎍/㎖ 내지 3 pg/㎖)와 함께 도말하였다. 다음날, 세포를 제거하고 발색 시약을 첨가하여 IFN-γ-생성 스팟-형성 세포를 검출하였다. ImmunoSpot S6 Universal Analyzer(Cellular Technology Limited)의 SmartCount 및 Autogate 기능을 사용하여 웰당 스팟-형성 세포의 수를 계산하였다. 펩타이드-펄스 웰에서 0.1% DMSO 웰의 평균 스팟 수를 차감함으로써 GUCY2C-특이적 반응을 계산하였다.
세포내 사이토카인 염색
면역화된 마우스 유래의 106개 비장세포를 DMSO 또는 10 ug/㎖ GUCY2C 254-262 펩타이드 및 항-CD107-FITC(클론 1D4B)의 존재 하에 96-웰 플레이트에 도말하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 단백질 수송 저해제 칵테일(eBioscience)을 첨가한 다음, 비장세포를 37℃에서 추가 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Invitrogen), 항-CD8PerCP-Cy5.5(53-6.7; BD Biosciences), 항-CD19-BV510(6D5; Biolegend)으로 염색하였다. BD Cytofix/Cytoperm Kit(BD Biosciences)를 사용하여 투과시키고 항 IFN-γ(XMG1.2; BD Biosciences) 및 항-MIP1α-APC(39624; R&D Systems)를 사용하여 세포내 사이토카인을 염색하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하고 BD LSR II 유세포 분석기에서 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 분석을 수행하였다.
종양 연구
GUCY2C 및 루시페라제-발현 마우스(BALB/c) CT26 결장직장암 세포주를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였고 생체내 종양 연구에 사용하였다. 최종 면역화 6일 후, 마우스는 정맥 꼬리 정맥을 통해 5×105 CT26 세포를 받았다. PBS 중 3.75㎎의 D-루시페린 칼륨염(Gold Biotechnologies)을 피하 주사한 후 8분 인큐베이션하고 Caliper IVIS Lumina XR 이미징 스테이션(PerkinElmer)을 사용하여 10초 노출로 영상화여 종양 부담을 매주 정량화하였다. Living Image In Vivo Imaging Software(PerkinElmer)를 사용하여 총 광휘(광자/초)를 측정하였다.
결과
Lm-GUCY2C 백신 설계
Java Codon Adaptation Tool을 사용하여 마우스 GUCY2C23-429의 세포외 도메인을 리스테리아 모노사이토게네스에 대해 코돈 최적화하였고 도 24 패널 A에 도시된 바와 같이 actA 프로모터, ActAN100, 및 인핸서 서열의 하류를 합성하였다. 생성된 서열을 pPL2 통합 벡터에 클로닝하고 살아있는 약독화된 이중-결실 균주인 Lm ΔactA ΔinlB의 게놈에 안정적으로 통합하였다. ActA-GUCY2C 융합 단백질의 분비를 확인하기 위해 J774A.1 대식세포 세포주를 Lm-GUCY2C 또는 대조군 Lm 균주로 감염시켰다. 6시간 인큐베이션 후, 대식세포를 웨스턴 블롯(도 24 패널 B) 및 면역형광(도 24 패널 C)에 의해 GUCY2C 단백질 발현에 대해 염색하였다.
이종 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화 요법은 GUCY2C-특이적 CD8 + T 세포 반응과 항종양 면역을 향상시킨다
Lm-GUCY2C에 의한 GUCY2C 융합 단백질 발현의 시험관 내 확인 후 본 발명자들은 최적의 GUCY2C 면역 요법을 확인하고자 하였다. 따라서, Lm-GUCY2C 백신을 현재 II상 테스트(NCT04111172) 중인 GUCY2C(Ad5.F35-GUCY2C-S1)에 대한 키메라 아데노바이러스-기반 백신과 조합하여 테스트하였다. Lm-GUCY2C 및 Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신을 동종 또는 이종 백신접종으로 21일 간격으로 투여하는 프라임-부스트 전략을 이용하여 GUCY2C 면역원성 및 항종양 면역성을 평가하였다. 특히, Ad5.F35-GUCY2C-S1을 이용하여 GUCY2C 면역 반응을 '프라이밍'한 후 Lm-GUCY2C를 '부스팅'하도록 이용하는 이종 면역화 요법은 IFN-γ ELISpot에 의해 정량화될 때 모든 다른 면역화 요법과 비교하여 유의하게 더 높은 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응을 생성하였다(도 25 패널 A). 유사하게, 결장직장 종양 시험투여의 맥락에서, Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화는 다른 백신접종과 비교하여 전이성 종양 부담을 유의하게 감소시켰고(도 25 패널 B 및 C), 중앙 생존을 증가시켰다(도 25 패널 D). 중요하게는, 면역화 순서가 최적의 GUCY2C 면역에 필수적이었으며, Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C는 Lm-GUCY2C + Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신접종과 비교하여 GUCY2C-특이적 CD8+ T-세포의 15배 초과의 증가를 유도하고(p<0.0001) 중앙 생존을 상당히 (71일 대 38일, p <0.05). 더욱이, 본 발명자들은 Ad5.F35-GUCY2C-S1 프라이밍 100일 후에 Lm-GUCY2C가 GUCY2C 면역 반응을 증강시킨다는 것을 발견하였으며, 이는 Lm-GUCY2C가 초기 프라이밍 백신접종 후 오랫동안 GUCY2C 기억 반응을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화에 대한 벡터-특이적 면역의 영향
바이러스-기반 백신의 알려진 한계는 표적 백신 항원의 면역원성을 방해하는 벡터-특이적 면역에 대한 능력이다. 구체적으로, 일반적인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)에 대한 중화 항체(NAb)는 건강한 공여체의 70% 초과에서 검출 가능하며 아데노바이러스-기반 백신의 효능을 약화시키는 것으로 입증되었다. Ad5.F35와 같은 키메라 아데노바이러스는 Ad5 NAb와 연관된 중화에 덜 민감하지만, 효과는 미미하므로 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 GUCY2C-특이적 면역 반응은 사전 Ad5 노출의 존재 하에 부분적으로 감소하였다. 대조적으로, 인간의 Lm 감염은 Lm에 대한 NAb를 생성하지 않으며 사전 노출은 표적 백신 항원의 면역원성을 제한하지 않는다. 이러한 관찰과 일관되게, 본 발명자들은 사전 Lm 노출이 Lm-GUCY2C의 GUCY2C 면역원성을 제한하지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 사전 Ad5 노출이 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 백신접종 접근법을 제한할 수 있다는 영향에 초점을 맞췄다. 먼저, 본 발명자들은 Lm-GUCY2C가 항체 중화와 연관될 수 있는 Ad5.F35-GUCY2C-S1 백신의 낮은 프라이밍 용량에서 증강시키는 능력을 정의하고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 Ad5.F35-GUCY2C-S1의 감소된 용량으로 마우스를 면역화시켰고 Lm-GUCY2C가 1011 vp 내지 109 vp 범위의 용량에서 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포를 유사하게 증강시킨다는 것을 발견하였다(도 26 패널 A). 다음으로, 본 발명자들은 생체 내에서 Ad5의 기존 면역을 모방하고자 하였다. Ad5-특이적 면역을 유도하기 위해, 마우스를 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 백신접종 요법 시작 28일 전에 1010 vp의 Ad5-GFP 또는 PBS에 비강내로 노출시켰다. 예상대로, Ad5-GFP 노출은 백신접종 당시 마우스에서 NAb를 유도하였다(도 26 패널 B). 그러나, Lm-GUCY2C는 미경험 마우스와 Ad5-GFP에 사전 노출된 마우스에서 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 반응을 증강시켰다(도 26 패널 C). 유사하게, 미경험 및 Ad5-GFP 노출 마우스의 Lm-GUCY2C 백신접종은 감소된 전이성 종양 부담(도 26 패널 D) 및 연장된 중앙 생존(도 26 패널 E)에 의해 정량화된 바와 같이 유사하게 항종양 면역을 향상시켰다. 따라서 Lm-GUCY2C는 열악한 GUCY2C 프라이밍 백신접종과 연관된 상황에서 GUCY2C-특이적 면역을 증강시키는 데 효과적일 수 있다.
프라임-부스트 백신접종 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 질적 변화
백신-특이적 T 세포의 양을 확장하는 것에 추가적으로, 이전 연구는 프라임-부스트 면역화가 백신-특이적 T 세포의 품질에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 Ad5.F35-GUCY2C-S1 프라이밍 및 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 프라임-부스트 백신접종 후 최대 이펙터 반응에서 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포의 결합력과 다작용성을 비교함으로써 GUCY2C-특이적 CD8+T 세포 풀에 대한 영향을 확인하고자 하였다. GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 결합력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 GUCY2C254-262 펩타이드 농도를 감소시키면서 면역화된 마우스의 비장세포를 펄스하고 IFN-γ 반응을 정량화하였다. 프라이밍 면역화 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여, 프라임-부스트로 면역화된 마우스의 EC50은 약 2.5배(0.0046 ㎍/㎖ 대 0018 ㎍/㎖, p <0.0001) 이동하였으며, 이는 프라임-부스트 후 마우스에서 높은 결합력 GUCY2C-특이적 T 세포의 농축을 시사한다(도 27 패널 A). 다음으로, 본 발명자들은 프라임 및 프라임-부스트 백신접종 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포의 다작용성을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용하였다. ELISpot 실험과 일치하게, 프라임-부스트는 프라이밍 면역 단독(도 27 패널 B)과 비교하여 IFN-γ 반응을 유의하게 향상시켰을 뿐만 아니라, 이펙터 사이토카인 MIP1α 및 탈과립의 표면 마커 CD107a를 향상시켰다. 더욱이, IFN-γ, MIP1α 및 CD107a 염색에 의한 이중-양성(도 27 패널 C 및 E) 및 삼중-양성(도 27 패널 D 및 E) CD8+ T 세포의 백분율은 프라임-부스트 백신접종 후 유의하게 상승되었으며, 이는 프라임-부스트 면역화는 다중 이펙터 기능을 가지는 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포를 생성함을 시사한다. 따라서, GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 수를 크게 증폭시키는 것에 추가적으로, Lm-GUCY2C 부스팅 후 향상된 항종양 면역은 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 결합력 및 다작용성의 질적 변화를 통해 부여될 수 있는 가능성이 있다.
이종 프라임-부스트 면역화는 독성을 유발하지 않는다
이전에 본 발명자들은 내인성 GUCY2C-발현 조직에 대한 자가면역을 유발하지 않고 전신 항-종양 면역을 유도하는 GUCY2C 백신의 능력을 입증하였다. Lm-GUCY2C-부스팅 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀의 양, 결합력 및 다작용성의 변화를 감안할 때, 본 발명자들은 이 면역 요법의 안전성을 특성화하고 싶었다. 따라서, 본 발명자들은 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화로 인한 잠재적 독성을 규명하기 위해 2가지 백신 접종 및 평가 일정을 이용하였다. 도 28 패널 A에 도시된 바와 같이, 마우스를 제0일에 1010 vp Ad5.F35-GUCY2C-S1로 면역화시킨 다음, 제21일 및 제42일에 5×106 CFU Lm-GUCY2C의 2회의 추가적인 면역화를 수행하였다. 최종 면역화 7일 및 30일 후에, 각각 급성 및/또는 만성 독성 평가를 위해 마우스를 희생시키고 장기를 수거하였다. 추가적인 코호트는 모든 면역화 일에 PBS를 받았다. 평생 관찰 또는 생존 기간 동안 급성 또는 만성 코호트에서 독성 징후가 관찰되지 않았다(도 28 패널 B). 특히, 급성 및 만성 코호트에서 암컷이 아닌 수컷 마우스는 대조군 코호트와 비교하여 연구 전반에 걸쳐 체중이 감소하였다(도 28 패널 C 및 D). 유사하게, 뇌 및 소장 기관 중량의 통계적으로 유의한 감소는 급성 및/또는 만성 코호트의 수컷 마우스에서만 나타났으며, 이는 아마도 일반적인 신체 크기의 차이 때문일 수 있다. 흥미롭게도, 암컷 마우스는 급성 및 만성 코호트에 속해 있었고 위 중량의 감소를 나타내었다. 추가적으로, 가장 최근에 Lm-GUCY2C로 면역화된 급성 코호트의 마우스는 이전 연구와 일치하고 아마도 비장에 대한 Lm 친화성으로 인해 비장종대를 나타냈다. 종합적으로, 비장 비대를 제외하고, 성별에 따른 그룹에서 기관 중량의 차이는 유지되지 않았다. 장기 크기의 약간의 차이에도 불구하고, 맹검 병리학자에 의한 조직병리학적 점수는 알려진 GUCY2C-발현 조직(소장, 결장, 뇌)과 GUCY2C-결핍 조직(침샘, 위, 심장, 폐, 신장 및 간) 사이에서 염증 차이를 보이지 않았다. 급성 코호트에서 비장의 염증 증가가 관찰되었으며, 이는 비장 비대 소견과 일치한다. 이와 함께, 이러한 데이터는 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C 면역화가 내인성 GUCY2C-발현 조직에 대한 자가면역을 생성하지 않고 GUCY2C 면역을 향상시킨다는 것을 시사하며, 이는 이전 연구와 일치한다.
논의
CRC 관리의 주요 한계는, 특히 미세부수체-안정 및 불일치 복구 능력 종양이 있는 환자에 있어서, 외과적 절제 후 질환 재발의 가능성과 전이성 질환을 치료하기 위한 현재 치료법의 비효율성으로 남아 있다. 이러한 환경에서, 백신접종은 종래 치료에서 벗어난 CRC 세포를 제거할 뿐만 아니라 장기 면역을 부여하여 향후 재발을 방지함으로써 이상적인 치료법이 될 수 있다. 여기에서, 본 발명자들은 면역원성이며 자가면역을 일으키지 않으면서 강력한 항종양 면역을 유도하는 백신 벡터의 이종성 조합을 이용하는 최적의 GUCY2C 면역화 요법을 정의한다.
이전 연구와 일관되게, 본 발명자들은 프라임-부스트 백신접종이 백신-특이적 T 세포의 양을 증가시킬 뿐만 아니라, 백신-특이적 T 세포 풀의 품질에도 상당한 영향을 미친다는 것을 발견한다. 본 발명자들은 Lm-GUCY2C 부스트 후 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 풀이 더 높은 결합력을 가지고 증가된 이펙터 기능을 나타낸다고 보고한다. 특히, 여러 연구는 더 높은 결합력 TCR뿐만 아니라 다기능 T 세포가 암 세포를 제거하고 가능하게는 바이러스 감염을 제거하는 데 더 효과적일 수 있음을 입증하였다. 따라서, Lm-GUCY2C 부스트에 의해 부여되는 추가적인 항종양 면역은 3가지 모든 요인의 조합을 통해서일 수 있다는 것이다.
아데노바이러스-기반 암 백신은 재감염을 차단하여 면역화 시 백신 효능을 제한하는 Ad5-특이적 NAb를 가지는 개체의 비율이 높기 때문에 부분적으로 방해를 받았다. Ad5.F35와 같은 희귀 혈청형 및 키메라 아데노바이러스 벡터의 사용은 Ad5 기존 면역과 연관된 중화에 덜 민감하지만, 백신접종 시 벡터-특이적 NAb의 유도는 추가적인 면역화의 유용성을 제한한다. 따라서 2가지 상이한 벡터를 이용하는 이종성 면역화는 이러한 환경에서 상동성 면역보다 바람직할 수 있다. 더욱이, 바이러스 벡터와 달리 Lm과 같은 박테리아 벡터는 백신접종 시 NAb를 유도하지 않는다. 따라서, 시간이 지남에 따라 GUCY2C 면역이 약해짐에 따라, Lm-GUCY2C를 이용한 반복 백신접종이 허용되며 환자에서 GUCY2C 면역을 치료 수준으로 지속적으로 상승시키는 데 필요할 수 있다.
Lm-GUCY2C가 Ad5.F35-GUCY2C-S1 프라이밍 후 기억 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포 세포의 강력한 확장을 유도한 반면, Lm-GUCY2C 단독은 단일-작용제 요법으로서 효과적이지 않았다. 실제로, 상동성 Lm-GUCY2C 백신접종은 ELISpot에 의해 GUCY2C-특이적 CD8+ T 세포의 현저한 부재를 생성하고 CRC 시험투여에 대한 보호를 부여하지 않았다. 흥미롭게도, Lm 백신을 단일-작용제 요법으로 탐구하는 연구는 혼합된 성공을 보고하였다. 종양 항원 HER2 및 PSA에 대한 Lm 백신은 단일요법으로서 강력한 항종양 면역을 생성하는 반면, PAP 및 메소텔린을 포함한 다른 종양 항원에 대한 Lm 백신은 유사하게 단독으로 제한된 면역원성을 나타내었고 이종성 프라임-부스트 면역화로 이용되었다. 추가적으로, Lm 백신을 항-GITR 및 항-PD-1 항체와 같은 면역 조절제와 결합하여 항종양 면역을 향상시킨 것으로 보고되었다. 따라서, Lm-GUCY2C가 단독으로 검출 가능한 GUCY2C 면역 반응을 프라이밍하지 않는 이유와 Lm-GUCY2C와 면역 조절제를 쌍형성하는 이유에 대한 추가적인 조사는 Lm-GUCY2C 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 GUCY2C 면역의 추가 향상으로 이어질 수 있다.
위장암에서 Ad5.F35-GUCY2C-PADRE 백신을 테스트하는 진행 중인 임상 시험(NCT04111172)의 맥락에서, 이러한 연구는 이 시험에 등록한 환자가 Lm-GUCY2C를 이용한 추가적인 백신접종으로부터 이점을 얻을 수 있음을 시사한다. 본 발명자들의 연구는 Ad5.F35-GUCY2C-S1 + Lm-GUCY2C가 두 벡터를 이용한 상동성 면역화와 비교하여 우수한 GUCY2C 항종양 면역 및 CD8+ T 세포 확장을 유도한다는 것을 입증한다. 더욱이, 본 발명자들의 연구는 Lm-GUCY2C 부스팅이 Ad5.F35-GUCY2C-S1 면역화로 초기 프라이밍 후 오랫동안 효과적일 수 있음을 시사하며, 이는 환자가 초기 프라이밍 면역화 사이의 긴 간격에도 불구하고 Lm-GUCY2C 부스팅으로부터 이점을 얻을 수 있음을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> Thomas Jefferson University <120> CHIMERIC AD5.F35-GUCY2C VACCINES AND VACCINATION <130> WO2022098372 <140> PCT/US2020/059752 <141> 2020-11-09 <150> US 62/932,499 <151> 2019-11-07 <150> US 62/933,361 <151> 2019-11-08 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3787 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (118)..(3339) <400> 1 tggagtgggc tgagggactc cactagaggc tgtccatctg gattccctgc ctccctagga 60 gcccaacaga gcaaagcaag tgggcacaag gagtatggtt ctaacgtgat tggggtc 117 atg aag acg ttg ctg ttg gac ttg gct ttg tgg tca ctg ctc ttc cag 165 Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gln 1 5 10 15 ccc ggg tgg ctg tcc ttt agt tcc cag gtg agt cag aac tgc cac aat 213 Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn 20 25 30 ggc agc tat gaa atc agc gtc ctg atg atg ggc aac tca gcc ttt gca 261 Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala 35 40 45 gag ccc ctg aaa aac ttg gaa gat gcg gtg aat gag ggg ctg gaa ata 309 Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile 50 55 60 gtg aga gga cgt ctg caa aat gct ggc cta aat gtg act gtg aac gct 357 Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala 65 70 75 80 act ttc atg tat tcg gat ggt ctg att cat aac tca ggc gac tgc cgg 405 Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg 85 90 95 agt agc acc tgt gaa ggc ctc gac cta ctc agg aaa att tca aat gca 453 Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala 100 105 110 caa cgg atg ggc tgt gtc ctc ata ggg ccc tca tgt aca tac tcc acc 501 Gln Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr 115 120 125 ttc cag atg tac ctt gac aca gaa ttg agc tac ccc atg atc tca gct 549 Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala 130 135 140 gga agt ttt gga ttg tca tgt gac tat aaa gaa acc tta acc agg ctg 597 Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu 145 150 155 160 atg tct cca gct aga aag ttg atg tac ttc ttg gtt aac ttt tgg aaa 645 Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys 165 170 175 acc aac gat ctg ccc ttc aaa act tat tcc tgg agc act tcg tat gtt 693 Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val 180 185 190 tac aag aat ggt aca gaa act gag gac tgt ttc tgg tac ctt aat gct 741 Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala 195 200 205 ctg gag gct agc gtt tcc tat ttc tcc cac gaa ctc ggc ttt aag gtg 789 Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val 210 215 220 gtg tta aga caa gat aag gag ttt cag gat atc tta atg gac cac aac 837 Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn 225 230 235 240 agg aaa agc aat gtg att att atg tgt ggt ggt cca gag ttc ctc tac 885 Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr 245 250 255 aag ctg aag ggt gac cga gca gtg gct gaa gac att gtc att att cta 933 Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu 260 265 270 gtg gat ctt ttc aat gac cag tac ttg gag gac aat gtc 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tacgactgaa tgttaagtgg agaggcagag caactgcgcc tgaaacacct ggtccactgt 27420 cgccgccaca agtgctttgc ccgcgactcc ggtgagtttt gctactttga attgcccgag 27480 gatcatatcg agggcccggc gcacggcgtc cggcttaccg cccagggaga gcttgcccgt 27540 agcctgattc gggagtttac ccagcgcccc ctgctagttg agcgggacag gggaccctgt 27600 gttctcactg tgatttgcaa ctgtcctaac cttggattac atcaagatct ttgttgccat 27660 ctctgtgctg agtataataa atacagaaat taaaatatac tggggctcct atcgccatcc 27720 tgtaaacgcc accgtcttca cccgcccaag caaaccaagg cgaaccttac ctggtacttt 27780 taacatctct ccctctgtga tttacaacag tttcaaccca gacggagtga gtctacgaga 27840 gaacctctcc gagctcagct actccatcag aaaaaacacc accctcctta cctgccggga 27900 acgtacgagt gcgtcaccgg ccgctgcacc acacctaccg cctgaccgta aaccagactt 27960 tttccggaca gacctcaata actctgttta ccagaacagg aggtgagctt agaaaaccct 28020 tagggtatta ggccaaaggc gcagctactg tggggtttat gaacaattca agcaactcta 28080 cgggctattc taattcaggt ttctctagaa atggacggaa ttattacaga gcagcgcctg 28140 ctagaaagac gcagggcagc ggccgagcaa cagcgcatga atcaagagct ccaagacatg 28200 gttaacttgc accagtgcaa aaggggtatc ttttgtctgg taaagcaggc caaagtcacc 28260 tacgacagta ataccaccgg acaccgcctt agctacaagt tgccaaccaa gcgtcagaaa 28320 ttggtggtca tggtgggaga aaagcccatt accataactc agcactcggt agaaaccgaa 28380 ggctgcattc actcaccttg tcaaggacct gaggatctct gcacccttat taagaccctg 28440 tgcggtctca aagatcttat tccctttaac taataaaaaa aaataataaa gcatcactta 28500 cttaaaatca gttagcaaat ttctgtccag tttattcagc agcacctcct tgccctcctc 28560 ccagctctgg tattgcagct tcctcctggc tgcaaacttt ctccacaatc taaatggaat 28620 gtcagtttcc tcctgttcct gtccatccgc acccactatc ttcatgaagc gcgcaagacc 28680 gtctgaagat accttcaacc ccgtgtatcc atatgacacg gaaaccggtc ctccaactgt 28740 gccttttctt actcctccct ttgtatcccc caatgggttt caagagagtc cccctggagt 28800 tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28860 gggaggggga cttacagtgg atgacactga tggtacctta caagaaaaca tacgtgctac 28920 agcacccatt actaaaaata atcactctgt agaactatcc attggaaatg gattagaaac 28980 tcaaaacaat aaactatgtg ccaaattggg aaatgggtta aaatttaaca acggtgacat 29040 ttgtataaag gatagtatta acaccttatg gactggaata aaccctccac ctaactgtca 29100 aattgtggaa aacactaata caaatgatgg caaacttact ttagtattag taaaaaacgg 29160 agggcttgtt aatggctacg tgtctctagt tggtgtatca gacactgtga accaaatgtt 29220 cacacaaaag acagcaaaca tccaattaag attatatttt gactcttctg gaaatctatt 29280 aactgatgaa tcagacttaa aaattccact taaaaataaa tcttctacag cgaccagtga 29340 aactgtagcc agcagcaaag cctttatgcc aagtactaca gcttatccct tcaacaccac 29400 tactagggat agtgaaaact acattcatgg aatatgttac tacatgacta gttatgatag 29460 aagtctattt cccttgaaca tttctataat gctaaacagc cgtatgattt cttccaatgt 29520 tgcctatgcc atacaatttg aatggaatct aaatgcaagt gaatctccag aaagcaacat 29580 agctacgctg accacatccc cctttttctt ttcttacatt acagaagacg acaactaaaa 29640 tgcccaagaa taaagaatcg tttgtgttat gtttcaacgt gtttattttt caattgcaga 29700 aaatttcaag tcatttttca ttcagtagta tagccccacc accacatagc ttatacagat 29760 caccgtacct taatcaaact cacagaaccc tagtattcaa cctgccacct ccctcccaac 29820 acacagagta cacagtcctt tctccccggc tggccttaaa aagcatcata tcatgggtaa 29880 cagacatatt cttaggtgtt atattccaca cggtttcctg tcgagccaaa cgctcatcag 29940 tgatattaat aaactccccg ggcagctcac ttaagttcat gtcgctgtcc agctgctgag 30000 ccacaggctg ctgtccaact tgcggttgct taacgggcgg cgaaggagaa gtccacgcct 30060 acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg gtggtgctgc agcagcgcgc 30120 gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata caacatggca gtggtctcct 30180 cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt cctccgggca cagcagcgca 30240 ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag caccacaata ttgttcaaaa 30300 tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg gaccacagaa cccacgtggc 30360 catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct cataaacacg ctggacataa 30420 acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg gtaccatata aacctctgat 30480 taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc caaaacctgc ccgccggcta 30540 tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag agcccaggac tcgtaaccat 30600 ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca caggcacacg tgcatacact 30660 tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc ccagggaaca acccattcct 30720 gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac gtaactcacg ttgtgcattg 30780 tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag tatggtagcg cgggtttctg 30840 tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg ccgagacaac cgagatcgtg 30900 ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt catatttcct gaagcaaaac 30960 caggtgcggg cgtgacaaac agatctgcgt ctccggtctc gccgcttaga tcgctctgtg 31020 tagtagttgt agtatatcca ctctctcaaa gcatccaggc gccccctggc ttcgggttct 31080 atgtaaactc cttcatgcgc cgctgccctg ataacatcca ccaccgcaga ataagccaca 31140 cccagccaac ctacacattc gttctgcgag tcacacacgg gaggagcggg aagagctgga 31200 agaaccatgt tttttttttt attccaaaag attatccaaa acctcaaaat gaagatctat 31260 taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg gtcaaactct acagccaaag aacagataat 31320 ggcatttgta agatgttgca caatggcttc caaaaggcaa acggccctca cgtccaagtg 31380 gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat ctcctctata aacattccag caccttcaac 31440 catgcccaaa taattctcat ctcgccacct tctcaatata tctctaagca aatcccgaat 31500 attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca 31560 gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc tcacagacct gtataagatt caaaagcgga 31620 acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg tcccttcgca gggccagctg aacataatcg 31680 tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact tccccgccag gaaccttgac aaaagaaccc 31740 acactgatta tgacacgcat actcggagct atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct 31800 ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc 31860 gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg 31920 aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa 31980 cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa 32040 acaaccctta taagcataag acggactacg gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg 32100 tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc tcctcggtca tgtccggagt cataatgtaa 32160 gactcggtaa acacatcagg ttgattcatc ggtcagtgct aaaaagcgac cgaaatagcc 32220 cgggggaata catacccgca ggcgtagaga caacattaca gcccccatag gaggtataac 32280 aaaattaata ggagagaaaa acacataaac acctgaaaaa ccctcctgcc taggcaaaat 32340 agcaccctcc cgctccagaa caacatacag cgcttcacag cggcagccta acagtcagcc 32400 ttaccagtaa aaaagaaaac ctattaaaaa aacaccactc gacacggcac cagctcaatc 32460 agtcacagtg taaaaaaggg ccaagtgcag agcgagtata tataggacta aaaaatgacg 32520 taacggttaa agtccacaaa aaacacccag aaaaccgcac gcgaacctac gcccagaaac 32580 gaaagccaaa aaacccacaa cttcctcaaa tcgtcacttc cgttttccca cgttacgtaa 32640 cttcccattt taagaaaact acaattccca acacatacaa gttactccgc cctaaaacct 32700 acgtcacccg ccccgttccc acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc cctcattatc 32760 atattggctt caatccaaaa taaggtatat tattgatgat gttaat 32806 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 12 Asp Tyr Asp Val Val Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Gly Met Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 13 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 14 Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 15 Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 1 5 10 15 Val Asn Ser <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 16 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 17 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 18 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 19 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 20 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 21 Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 22 Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 23 Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 24 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 25 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 26 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Enterovirus 71 <400> 27 Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Enterovirus 71 <400> 28 Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Enterovirus 71 <400> 29 Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp 1 5 10 15 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> EBV <400> 30 Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu 1 5 10 15 Leu <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 31 Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala 1 5 10 15 Ile Ser Pro Arg 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 32 Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly 1 5 10 15 Gln Met Arg Glu 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 33 Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile 1 5 10 15 Pro Val Gly Glu 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 34 Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 35 Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg 1 5 10 15 Gln Gly Pro Lys 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 36 Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala 1 5 10 15 Glu Gln Ala Ser 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 37 Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp 1 5 10 15 Met Thr Glu Thr 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 38 Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala 1 5 10 15 Leu Gly Pro Ala 20 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 39 Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met 1 5 10 15 Met Thr Ala Cys 20 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 40 Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr 20 25 <210> 41 <211> 25 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 41 Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val 1 5 10 15 Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 20 25 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 42 Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp 1 5 10 15 Asn Phe Ile Gly 20 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 43 Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu 1 5 10 15 Val Phe Asp Val Val Arg Val His Arg Pro His Arg 20 25

Claims (52)

  1. 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스로서,
    a) 아데노바이러스 Ad5.F35 벡터를 포함하되, 상기 벡터는,
    b) 유전자 발현 카세트를 포함하고, 상기 카세트는,
    iii) 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산,
    ii) 상기 핵산과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산
    i) 상기 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터
    를 포함하는, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 복제 결함인, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PADRE는 서열번호 7에 의해 인코딩되는, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  6. 제3항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 융합 서열을 형성하는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 이종성 프로모터는 CMV IE인, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  8. 제6항에 있어서, 상기 융합 서열은 가용성 인간 GUCY2C 도메인의 C 말단에 융합된 PADRE를 인코딩하고 서열번호 9에 제시된 서열인, 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스.
  9. 제8항의 아데노바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 주사 가능한 약제학적 조성물.
  10. 암으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제9항의 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 암의 세포는 GUCY2C를 발현하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 투여하는 단계 전에, 암 조직이 GUCY2C를 발현하는지의 여부를 결정하기 위해 상기 암 조직의 샘플을 분석하는 단계가 선행되는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 치료 요법은 또한 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 GUCY2C를 발현하는 암은 식도암, 위암, 췌장암 또는 결장직장암인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암은 원발성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 암은 전이성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  16. 암으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, GUCY2C는 상기 암의 세포에 의해 발현되고, 상기 방법은,
    (i) 수술, 화학요법 또는 방사선 요법으로 치료하는 단계; 그 다음
    (ii) 유효량의 제9항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 암은 제1 치료 단계의 완료 후 검출 가능하지 않되, 상기 환자는 미세전이를 겪는 것으로 의심되는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  18. 재조합 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로서, 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스.
  20. 제18항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스.
  21. 제20항에 있어서, 상기 PADRE는 서열번호 7에 의해 인코딩되는 재조합 Ad5. 리스테리아 모노사이토게네스.
  22. 제18항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 융합 서열을 형성하는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스.
  23. 제18항에 있어서, 상기 융합 서열은 가용성 인간 GUCY2C 도메인의 C 말단에 융합된 PADRE를 인코딩하고 서열번호 9에 제시된 서열인, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스.
  24. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 리스테리아 모노사이토게네스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 주사 가능한 약제학적 조성물.
  25. 암으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제8항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 암의 세포는 GUCY2C를 발현하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 투여하는 단계 전에, 암 조직이 GUCY2C를 발현하는지의 여부를 결정하기 위해 상기 암 조직의 샘플을 분석하는 단계가 선행되는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 치료 요법은 또한 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 GUCY2C를 발현하는 암은 식도암, 위암, 췌장암, 또는 결장직장암인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 암은 원발성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 암은 전이성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  31. 암으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, GUCY2C는 상기 암의 세포에 의해 발현되고,
    (i) 수술, 화학요법 또는 방사선 요법으로 치료하는 단계; 그 다음
    (ii) 유효량의 제8항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암은 제1 치료 단계의 완료 후 검출 가능하지 않되, 상기 환자는 미세전이를 겪는 것으로 의심되는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  33. 암으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 암의 세포는 GUCY2C를 발현하고, 상기 방법은,
    a) 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 약제학적 조성물은,
    i) 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스를 포함하고, 상기 아데노바이러스는,
    아데노바이러스 Ad5.F35 벡터를 포함하되, 상기 벡터는,
    유전자 발현 카세트를 더 포함하되, 상기 유전자 발현 카세트는,
    보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산,
    상기 핵산과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산,
    상기 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터
    를 포함하는, 상기 투여하는 단계; 및
    b) 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 약제학적 조성물은,
    i) 재조합 리스테리아 모노사이토게네스를 포함하되, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는,
    유전자 발현 카세트를 포함하고, 상기 카세트는,
    보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산,
    상기 핵산과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산,
    상기 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터
    를 포함하는, 상기 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 복제 결함인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 서열번호 7에 의해 인코딩되는 PADRE를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 융합 서열을 형성하는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스 이종성 프로모터는 CMV IE 프로모터인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 Ad5.F35 아데노바이러스는 가용성 인간 GUCY2C 도메인의 C 말단에 융합된 PADRE를 인코딩하고 서열번호 9에 제시된 서열인 융합 서열을 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트의 재조합 리스테리아 모노사이토게네스를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 서열번호 7에 의해 인코딩되는 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트의 재조합 리스테리아 모노사이토게네스를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  45. 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 융합 서열을 형성하는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 보편적인 CD4+ 헬퍼 에피토프를 인코딩하는 핵산과 프레임 내 융합된 서열번호 5에 제시된 바와 같은 가용성 인간 GUCY2C 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  46. 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 모노사이토게네스는 가용성 인간 GUCY2C 도메인의 C 말단에 융합된 PADRE를 인코딩하는 핵산을 포함하고 서열번호 9에 제시된 서열인 유전자 발현 카세트를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  47. 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 전에, 암 조직이 GUCY2C를 발현하는지의 여부를 결정하기 위해 상기 암 조직의 샘플을 분석하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  48. 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 요법은 또한 수술, 및/또는 방사선 치료 및/또는 기타 항암제의 투여를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법.
  49. 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GUCY2C를 발현하는 암은 식도암, 위암, 췌장암 또는 결장직장암인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  50. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 원발성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  51. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 전이성인, 인간 환자를 치료하는 방법.
  52. 제33항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 제1 치료 단계의 완료 후 검출 가능하지 않되, 상기 환자는 미세전이를 겪는 것으로 의심되는, 인간 환자를 치료하는 방법.
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