JP2023548255A - 抗gucy2cワクチンとワクチン接種 - Google Patents
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Abstract
可溶性GUCY2C細胞外ドメイン配列のコード配列を含む改変アデノウイルスAD5.F35を含む組成物が開示されている。可溶性GUCY2C細胞外ドメイン配列のコード配列を含むリステリア・モノサイトゲネスベクターを含む組成物が開示されている。GUCY2Cを発現する癌/腫瘍と診断された個人の治療方法、微小転移の予防方法が開示されている。【選択図】なし
Description
政府の権利に関する声明
この発明は、米国国防総省によって授与されたW81XWH-17-1-0299の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
この発明は、米国国防総省によって授与されたW81XWH-17-1-0299の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
この発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたR01 CA170533の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
治療の改善と成功にもかかわらず、癌は世界中で多くの人々の命を奪い続けている。スクリーニングの改善は、初期ステージの癌を有する多くの個人、並びに癌を有していないが遺伝的に癌を発症する素因があるため、癌を発症するリスクが高い多くの個人を特定する機会を提供する。さらに、治療の改善により、癌を切除したり寛解したりした人が多数いる。そのような人々は再発(relapse)又は再発(recurrence)のリスクがあり、したがって癌を発症するリスクも高い。
治療の改善と成功にもかかわらず、癌は世界中で多くの人々の命を奪い続けている。スクリーニングの改善は、初期ステージの癌を有する多くの個人、並びに癌を有していないが遺伝的に癌を発症する素因があるため、癌を発症するリスクが高い多くの個人を特定する機会を提供する。さらに、治療の改善により、癌を切除したり寛解したりした人が多数いる。そのような人々は再発(relapse)又は再発(recurrence)のリスクがあり、したがって癌を発症するリスクも高い。
GUCY2C発現腫瘍/癌に罹患している個人を治療するための改善された方法が必要である。GUCY2C発現癌に罹患している個人を治療するのに有用な組成物が必要である。このような癌の治療を受けた個人におけるGUCY2C発現癌の再発を予防するための改善された方法が必要である。このような癌について治療された個人におけるGUCY2C発現癌の再発を予防するのに有用な組成物が必要である。個人、特にそのような癌の遺伝的素因を有すると特定された者におけるGUCY2C発現癌を予防する改善された方法が必要である。個人においてGUCY2C発現癌を予防するのに有用な組成物が必要である。個人におけるGUCY2C発現癌を治療及び予防するのに有用な組成物を特定する改善された方法が必要である。
配列表の簡単な説明
配列番号1:参照により本明細書に組み込まれるヒトGUCY2C(Genbank受託番号BC136544)のDNA配列。
配列番号2:ヒトGUCY2Cの予測アミノ酸配列。
配列番号3:ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号4:ヒトGUCY2Cの予測アミノ酸配列。
配列番号5:可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号6:可溶性ヒトGUCY2C予測アミノ酸配列。
配列番号7:PADREをコードするDNA配列。
配列番号8:配列番号6のPADREの予測アミノ酸配列。
配列番号9:PADREをコードするDNA配列とインフレームで融合させた(C末端融合)可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号10:PADREをコードするDNA配列とインフレームで融合させた(N末端融合)可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列の予測アミノ酸配列。
配列番号11:Ad5.F35-hGUCY2C-PADREベクター配列。
配列番号12:三日熱マラリア原虫MSP1の33kDaのC末端領域に存在するT細胞エピトープ。
配列番号13:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号14:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号15:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号16:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号17:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号18:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号19:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT830~844。
配列番号20:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT947~967。
配列番号21:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT590~603。
配列番号22:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT615~629。
配列番号23:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT639~652。
配列番号24:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT830~843。
配列番号25:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT947~967。
配列番号26:T細胞エピトープインフルエンザヘマグルチニン残基306~318。
配列番号27:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基66~77。
配列番号28:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基145~159。
配列番号29:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基247~261。
配列番号30:T細胞エピトープEBV LMP1159~175。
配列番号31:T細胞エピトープHIV Gag131~15。
配列番号32:T細胞エピトープHIV Gag 211~230。
配列番号33:T細胞エピトープHIV Gag 241~260。
配列番号34:T細胞エピトープHIV Gag 263~277。
配列番号35:T細胞エピトープHIV Gag 271~290。
配列番号36:T細胞エピトープHIV Gag 291~310。
配列番号37:T細胞エピトープHIV Gag 301~320。
配列番号38:T細胞エピトープHIV Gag 321~340。
配列番号39:T細胞エピトープHIV Gag 331~350。
配列番号40:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基556~580。
配列番号41:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基56~80。
配列番号42:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基316~335。
配列番号43:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基906~930。
配列番号1:参照により本明細書に組み込まれるヒトGUCY2C(Genbank受託番号BC136544)のDNA配列。
配列番号2:ヒトGUCY2Cの予測アミノ酸配列。
配列番号3:ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号4:ヒトGUCY2Cの予測アミノ酸配列。
配列番号5:可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号6:可溶性ヒトGUCY2C予測アミノ酸配列。
配列番号7:PADREをコードするDNA配列。
配列番号8:配列番号6のPADREの予測アミノ酸配列。
配列番号9:PADREをコードするDNA配列とインフレームで融合させた(C末端融合)可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列。
配列番号10:PADREをコードするDNA配列とインフレームで融合させた(N末端融合)可溶性ヒトGUCY2Cのコドン最適化DNA配列の予測アミノ酸配列。
配列番号11:Ad5.F35-hGUCY2C-PADREベクター配列。
配列番号12:三日熱マラリア原虫MSP1の33kDaのC末端領域に存在するT細胞エピトープ。
配列番号13:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号14:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号15:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号16:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号17:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号18:熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するT細胞エピトープ。
配列番号19:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT830~844。
配列番号20:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT947~967。
配列番号21:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT590~603。
配列番号22:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT615~629。
配列番号23:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT639~652。
配列番号24:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT830~843。
配列番号25:T細胞エピトープ破傷風トキソイドTT947~967。
配列番号26:T細胞エピトープインフルエンザヘマグルチニン残基306~318。
配列番号27:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基66~77。
配列番号28:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基145~159。
配列番号29:T細胞エピトープエンテロウイルス71 VP1カプシドタンパク質残基247~261。
配列番号30:T細胞エピトープEBV LMP1159~175。
配列番号31:T細胞エピトープHIV Gag131~15。
配列番号32:T細胞エピトープHIV Gag 211~230。
配列番号33:T細胞エピトープHIV Gag 241~260。
配列番号34:T細胞エピトープHIV Gag 263~277。
配列番号35:T細胞エピトープHIV Gag 271~290。
配列番号36:T細胞エピトープHIV Gag 291~310。
配列番号37:T細胞エピトープHIV Gag 301~320。
配列番号38:T細胞エピトープHIV Gag 321~340。
配列番号39:T細胞エピトープHIV Gag 331~350。
配列番号40:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基556~580。
配列番号41:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基56~80。
配列番号42:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基316~335。
配列番号43:T細胞エピトープAd5ヘキソンタンパク質残基906~930。
発明の詳細な説明
1.0 定義
本明細書で使用する「GUCYC2」、「GCC」、「ヒトGUCYC2」、「ヒトGCC」、「GUCYC2タンパク質」、「GCCタンパク質」、「ヒトGUCYC2タンパク質」及び「ヒトGCCタンパク質」は、ヒトグアニリルシクラーゼCタンパク質を指すために本明細書で互換的に使用される。ヒトGUCYC2をコードする核酸配列は、配列番号1(Genbank受託番号BC136544)に記載される。配列番号1の最も長いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトGUCYC2タンパク質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列(Genbank受託番号AAB19934)を有する。ヒトGUCYC2をコードするコドン最適化配列は、Mageeら(参照により本明細書に組み込まれるMagee MSら(2018) Cancer Immunol Res 6:509-516)によって説明され、配列番号3に記載されている。
1.0 定義
本明細書で使用する「GUCYC2」、「GCC」、「ヒトGUCYC2」、「ヒトGCC」、「GUCYC2タンパク質」、「GCCタンパク質」、「ヒトGUCYC2タンパク質」及び「ヒトGCCタンパク質」は、ヒトグアニリルシクラーゼCタンパク質を指すために本明細書で互換的に使用される。ヒトGUCYC2をコードする核酸配列は、配列番号1(Genbank受託番号BC136544)に記載される。配列番号1の最も長いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトGUCYC2タンパク質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列(Genbank受託番号AAB19934)を有する。ヒトGUCYC2をコードするコドン最適化配列は、Mageeら(参照により本明細書に組み込まれるMagee MSら(2018) Cancer Immunol Res 6:509-516)によって説明され、配列番号3に記載されている。
GUCYC2タンパク質は、細胞表面又は膜結合受容体タンパク質である。GUCYC2タンパク質は、いくつかの一般的に許容されるドメインを有し、その各々は、GUCYC2分子への分離可能な機能に寄与する。これらのドメインは、シグナル配列(互換的にシグナルペプチドとも呼ばれる)、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメイン(キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを一緒に、互換的に細胞内ドメイン又は細胞質ドメインと呼ぶことがある)を含む。これらのドメインは、タンパク質が細胞内で生成されるときに生じるので、N末端からC末端まで本明細書に記載されている。
GUCYC2シグナル配列は、新たに合成されたGUCYC2タンパク質のN末端に存在する。GUCYC2シグナル配列は、タンパク質が細胞内で最初に生成される場所からのタンパク質の転座において機能する。GUCYC2シグナルペプチドを典型的には成熟のために切除すると、タンパク質輸送の一部として、又はタンパク質輸送を伴う機能的な成熟タンパク質が生じる。
GUCYC2細胞外ドメインは、細胞外上で外部に露出しているGUCYC2タンパク質の部分である。GUCYC2細胞外ドメインは、GUCYC2タンパク質の天然に存在するアゴニストリガンド、グアニリン及びウログアニリン、並びに例えば大腸菌の熱安定性エンテロトキシンSTなどの天然に存在するアゴニスト及びアンタゴニストリガンド並びに合成のアゴニスト及びアンタゴニストリガンドに結合するGUCYC2タンパク質の部分を含む。GUCYC2細胞外ドメインは、GUCYC2シグナル配列とGUCYC2膜貫通ドメインとの間の配列の全てのアミノ酸残基を含む。すなわち、GUCYC2細胞外ドメインは、GUCYC2シグナル配列の後の最初の残基からGUCYC2膜貫通ドメインの前の最後の残基までの全てのアミノ酸残基を含む。
これらのドメインは、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン(バイトピック又はシングルパス膜貫通タンパク質として、単一の膜貫通ドメインのみが存在する)、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメイン(キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを一緒に、互換的に細胞内ドメイン又は細胞質ドメインと呼ばれることがある)を含む。これらのドメインは、タンパク質が細胞内で生成されるときに生じるので、N末端からC末端まで本明細書に記載されている。
膜貫通ドメインは細胞膜内に配置され、細胞膜にまたがる。膜貫通ドメインは、GCCタンパク質を細胞膜内に固定する。
キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、細胞の内部に位置し、受容体がアゴニストリガンドへの結合によって活性化されるときにシグナルを中継するように機能する。キナーゼ相同性ドメインは、チロシンキナーゼ活性を有すると予測される;グアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、グアニリルシクラーゼ活性を有すると予測される。
本明細書で使用する「Ad5.Fib35アデノウイルスベクター」及び「Ad5.F35アデノウイルスベクター」は、互換的に使用され、天然Ad5繊維又は繊維のシャフト及びノブ部分をコードするDNAが血清型BアデノウイルスAd35に由来するものに置換されたアデノウイルスベクターを指す。
本明細書で使用する「複製欠損アデノウイルスベクター」は、ウイルス複製に必須のアデノウイルスゲノムの1以上の領域(例えば、E1、E2若しくはE4又はそれらの組み合わせ)を欠損しているアデノウイルスベクターを意味し、そのため、トランス補完(例えば、補完細胞又はヘルパーウイルスのいずれかによって提供される)の非存在下で増殖することができない。シス作用配列を除いて初期(E1、E2、E3及びE4)並びに後期遺伝子(L1、L2、L3、L4及びL5)を含む全ての機能的遺伝子を欠く最小(すなわちgutless)アデノウイルスベクターも「複製欠損アデノウイルスベクター」の定義に含まれる(例えば、Kovesdiら,Current Opinion in Biotechnology 8(1997),583-589;Yeh及びPerricaudet,FASEB 11(1997),615-623;WO94/12649;WO94/28152も参照されたい)。複製欠損型アデノウイルスベクターは、必要な最小配列を考慮に入れて容易に当業者によって操作され得、これらの例示的な実施形態に限定されない。E1、又はE1とE2、又はE1とE3、又はE1とE4、又はE1とE2とE3、又はE1とE2とE4、又はE1とE3とE4、又はE1とE2とE3とE4を欠くアデノウイルスベクターは、全てこの定義によって企図される。
本明細書で使用する用語「遺伝子発現カセット」は、ユニバーサルCD4+エピトープにインフレームで融合された可溶性GUCYC2又は可溶性GUCYC2の発現を促進することができるアデノウイルス骨格に挿入されるか又は挿入され得るDNAコンストラクトを意味する。遺伝子発現カセットは、一般に、所与のプロモーターの制御下で、関心のある1以上の外来抗原を発現するように構築され、例えば、BGHポリアデニル化シグナル若しくはSV40由来のものなどのポリアデニル化シグナル、及び/又は宿主ベクターによってまだ提供されていないコザック領域及び/若しくは追加の終結シグナルなどの他のエレメント又は発現されるコード領域を含み得る。選択されたプロモーターのサイズ、組成、又は複雑さ及び発現パターンなどの多数の要因に応じて、異なるプロモーターが利用され得る。CMV IEプロモーターは、多くの組織の種類で効率的に発現されるため、遺伝子発現カセットで一般的に使用される。例えば、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、プロモーターCD11cなどの樹状細胞特異的(参照により本明細書に組み込まれるMasood,R,ら,2001 Int J MoI Med 8:335-343,Somia,N.V,ら,1995 Proc Acad Sci USA 92:7570-7574)並びにミオシンプロモーター、筋クレアチニンキナーゼ(MCK)プロモーター、デスミンプロモーター及び哺乳動物トロポニン1プロモーターを含む筋肉特異的プロモーターなどを含む他のプロモーターが、遺伝子発現カセットにおいて使用され得る。
本明細書で使用する用語「可溶性GUCYC2」、「可溶性GCC」、「可溶性ヒトGUCYC2」、「可溶性ヒトGCC」、「可溶性GUCYC2ドメイン」、「可溶性GCCドメイン」、「可溶性ヒトGUCYC2ドメイン」及び「可溶性ヒトGCCドメイン」は、互換的に使用され、GUCY2C細胞外ドメインを含むヒトGUCY2Cの断片、又は機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基54からアミノ酸酸残基384までの配列を含む少なくとも330~423アミノ酸残基であり、必要に応じて、細胞膜に固定されていない可溶性GUCYC2の細胞外分泌を依然として許容しながら、GUCYC2膜貫通ドメインの一部と融合されたヒトGUCY2Cからの配列を含むその断片を指す。すなわち、GUCYC2膜貫通ドメインからの任意の配列が含まれる限りにおいて、それはアンカーとして機能するには不十分である。したがって、細胞内で発現すると、可溶性GUCYC2は細胞によって分泌され得る。可溶性GCCの分泌はシグナル配列によって促進され、可溶性GCCをコードする核酸は内因性又は外因性のシグナル配列のいずれかをコードすることが理解される。可溶性GUCYC2は、GUCYC2シグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結されていてもよく、追加のアミノ酸を含んでよい。
本明細書で使用する「分泌シグナル」、「分泌ペプチド」、「シグナルペプチド」及び「シグナル配列」は、互換的に使用され、存在する場合に、細胞の外側へのタンパク質の輸送及び分泌をもたらすタンパク質のアミノ酸配列を指すことを意味する。分泌シグナルは、典型的には、前駆体タンパク質のN末端又はその近傍における前駆体タンパク質の切断可能な疎水性セグメントである。分泌過程において、そのような分泌シグナルは酵素的に除去され、成熟した形態のタンパク質、すなわち分泌シグナルを欠くタンパク質の形態の分泌をもたらす。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、GCCタンパク質に由来するGCC分泌シグナルである。GCC分泌シグナルとは、GUCYC2の残基1~約残基21、22又は23を含むN末端シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、GUCYC2とは異なる供給源(「外因性シグナル配列」)に由来し、内因性シグナル配列を置き換える。前者の場合、シグナル配列を含むGCC抗原のコード配列はそのまま用いられる。後者の場合、別の供給源からのシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するシグナル配列の代わりに、タンパク質の残りの部分とインフレームでコード配列GCCに連結される。そのような場合、シグナル配列は、遺伝子コンストラクトが投与される個人の細胞内で機能的である任意のそのような配列であり得る。
本明細書で使用する「ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープ」は、いくつかの主要組織適合性複合体(MHC)クラス2ヒト白血球抗原(HLA)との複合体を形成するペプチド配列であり、この複合体は、次いでCD4+T細胞上のT細胞受容体によって認識され、以下で詳細に論じられる。
本明細書で使用する「GUCY2C発現腫瘍」は、グアニリルシクラーゼC又は「GCC」を発現する腫瘍を指す。このような腫瘍/癌細胞は、一般に胃腸管内で生じ、食道、胃、膵臓、又は結腸直腸起源の腫瘍/癌細胞を含むがこれらに限定されない。このような腫瘍は、原発性又は転移性であり得る。
本明細書で使用する用語「結腸直腸腫瘍」又は「結腸直腸管内に生じる癌」は、小腸(すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、及びシグモイド結腸、及び直腸を含む大きい腸(大腸))の下の腸管の細胞の癌によって特徴付けられる病状として結腸直腸癌を定義する十分に許容される医学的定義を含むことを意味する。さらに、本明細書で使用する用語「結腸直腸癌」又は「結腸直腸管内に生じる癌」は、十二指腸及び小腸(空腸及び回腸)の細胞の癌によって特徴付けられる病状をさらに含むことを意味する。本明細書で使用される結腸直腸癌の定義は、一般的な医学的定義よりも広範であるが、十二指腸及び小腸の細胞もGCCを含むので、そのように提供される。
本明細書で使用する用語「胃癌(stomach cancer)」又は「胃癌(gastric cancer)」は、胃の細胞の癌によって特徴付けられる病状として胃癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する用語「食道癌」は、食道の細胞の癌によって特徴付けられる病状として食道癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する用語「膵臓癌」は、膵臓の細胞の癌によって特徴付けられる病状として膵臓癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する「原発腫瘍」は、起源の元の組織に限定されるものである。これは、元の原発組織から他の臓器に播種した転移性腫瘍とは対照的である。
本明細書で使用する「結腸直腸管の外側」は、結腸直腸管内にない臓器を指す。
欠損アデノウイルス遺伝子は、外来導入遺伝子の発現を促進する遺伝子発現カセットによって置換される。これらの欠損ベクターは、通常、遺伝子改変Adゲノムを含むプラスミド又はAd DNAから構築され、該ベクターは、必要な必須遺伝子を保持し、発現するHEK293、PER.C6、又はN52.E6などの相補細胞株で増殖される。
機能的な成熟GCCタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟GCCタンパク質は、典型的には、配列番号2のアミノ酸残基22~1073、配列番号2のアミノ酸残基23~1073、又は配列番号2のアミノ酸残基24~1073を含む。成熟GCCタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
機能的成熟GCCタンパク質の細胞外ドメインは、典型的には、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基54からアミノ酸残基384までの配列を含む約330~423アミノ酸残基を含む。細胞外ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22、23又は24からアミノ酸残基420~435までの配列を含み得る。機能的成熟GCCタンパク質の細胞外ドメインの配列は、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22からアミノ酸残基435までの配列、又は例えば、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22、23又は24からアミノ酸残基420~435までの配列などの機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基54からアミノ酸残基384までの配列を含む機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22からアミノ酸残基435までの配列の330~422アミノ酸残基断片を含み得る。GCCの細胞外ドメインは、広い組織分布及び異なるリガンド特異性を有するグアニリルシクラーゼA、B及びGとの相同性を有していない。
機能的成熟GCCタンパク質の膜貫通ドメインは、典型的には、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基436から約アミノ酸残基452までの配列を含む約16~23アミノ酸残基を含む。膜貫通ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基431~約アミノ酸残基454の配列、又は例えば、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基436からアミノ酸残基452までの配列又は機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基431からアミノ酸残基454までの配列などの機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基431からアミノ酸残基454までの配列の16~22アミノ酸断片を含み得る。
機能的成熟GCCタンパク質のキナーゼ相同性ドメインは、典型的には、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基508から約アミノ酸残基745までの配列を含む約237~260アミノ酸残基を含む。キナーゼ相同性ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基489~約アミノ酸残基749までの配列、又は例えば、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基508からアミノ酸残基745までの配列又は機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基489からアミノ酸残基749までの配列などの機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基489からアミノ酸残基749までの配列の237~259アミノ酸断片を含み得る。
機能的成熟GCCタンパク質のグアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、典型的には、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基816から約アミノ酸残基1002までの配列を含む約186~257アミノ酸残基を含む。グアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基750~約アミノ酸残基1007までの配列、又は例えば、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基816からアミノ酸残基1002までの配列又は機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基750からアミノ酸残基1007までの配列などの機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基750からアミノ酸残基1007までの配列の186~256アミノ酸断片を含み得る。
本発明の可溶性GCCは、好ましくは、可溶性GCC及びユニバーサルCD4+Tエピトープが単一のポリペプチドとして発現する融合タンパク質として発現する。そのため、可溶性GCCをコードする配列は、好ましくは、2つの領域のインフレーム翻訳融合が生じるようにユニバーサルCD4+Tエピトープをコードする配列に連結される。ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープは、可溶性GCCのN末端又はC末端のいずれかに結合してよい。N末端に結合している場合、それは内因性又は外因性のシグナル配列の下流に挿入される。
凝集体中に、C末端でユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープ(PADRE)に融合されたGCCの最初の約429アミノ酸残基約からなる分子のGCCシグナル配列及び細胞外ドメインを含む切断型GUCYC2が本明細書に例示される。
GCCなどの腫瘍マーカーを検出する方法は、当技術分野で周知である。例えば、発現は、タンパク質レベルとして、又はmRNAレベルとして検出され得る。qRT-PCR分岐オリゴヌクレオチド技術、Panomics QuantiGene(登録商標)2.0(Affymetrix,Inc.Santa Clara,Calif.)、定量的遺伝子発現試薬及びアッセイ、MassARRAY(登録商標)(Sequenom,Inc.San Diego,Calif.)、検出可能なプローブ(FISHなどの)を用いた定量的遺伝子発現系インサイツハイブリダイゼーション、ドットブロットアッセイ、及び他のRNA定量増幅技術及びノーザンブロットなどの技術は、mRNAレベルの測定に有用であり、質量分析と組み合わせたタンパク質及びペプチド分画を含むタンパク質質量分析、検出可能な結合剤を用いた免疫組織化学、ELISA又はウェスタンブロットなどの免疫アッセイ、QProteome FFPE Qiagen Valencia Calif.、逆相タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マーカーの存在及びレベルを検出するのに有用である。米国特許公開第20170049869A1号は、GCCに適用可能なRT-PCT検出方法について記載している。米国特許公開第20180355062号は、抗GCC抗体分子について記載している。
2.0 概要
原発性及び/又は転移性GUCY2C発現腫瘍に対して個人を保護又は治療するための予防的及び治療的ワクチンが提供される。このようなワクチンを製造するのに有用な組成物、並びにワクチンを製造及び使用する方法が提供される。
原発性及び/又は転移性GUCY2C発現腫瘍に対して個人を保護又は治療するための予防的及び治療的ワクチンが提供される。このようなワクチンを製造するのに有用な組成物、並びにワクチンを製造及び使用する方法が提供される。
癌免疫療法に対する最大の障害の1つは、腫瘍特異的で、十分に免疫原性があり、患者間で共有される抗原の不足である。理想的な標的の代わりに、抗腫瘍免疫応答は、一般的に、腫瘍特異的タンパク質ではなく組織特異的タンパク質に向けられる。自己抗原を使用する際の障壁には、付随する自己免疫及び耐性の潜在的な発達が含まれ、これは免疫療法の有効性を制限する。これらの制限を回避する試みには、免疫特権区画で発現する自己タンパク質の使用が含まれる。制限された区画外の腫瘍におけるそれらの異所性発現は、下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン及び内因性傍分泌ホルモンのグアニリン及びウログアニリンの受容体である標的化グアニリルシクラーゼC(GCC)が腸上皮細胞の頂端膜に発現し、粘膜免疫区画に制限される機会を提供する。本発明のワクチンは、自己免疫を誘導することなく、食道癌、胃癌、膵臓癌、及び結腸直腸癌を含むGUCY2C発現癌のヒト患者の予防的又は治療的免疫に有用である。
いくつかの実施形態は、一般集団に影響を及ぼす癌、特に結腸直腸癌、及び免疫療法並びに癌の予防、スクリーニング、早期発見、診断、治療、及び/又はサバイバーシップのための改変アデノウイルスベクターベースのワクチンを提供する。該ワクチンは、ウイルスタンパク質F35が含まれる組換えアデノウイルスベクターの改変バージョンを用いて、対応するアデノウイルス5のアデノウイルスタンパク質を置き換える。改変アデノウイルスベクターは、Ad5.F35と呼ばれることがあり、T細胞エピトープと結合した癌関連タンパク質GUCY2C細胞外ドメイン配列の一部などの癌関連タンパク質配列を含む融合タンパク質のコード配列を含む。改変アデノウイルスベクターベースの抗GUCY2Cワクチンは、結腸直腸癌タンパク質を体内の免疫細胞に送達し、結腸直腸癌に対してそれらを教育するために使用される。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、体内に隠れている結腸直腸癌を探して殺すことが可能になり得る。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、次いで、結腸直腸癌タンパク質を発現する細胞を標的とする抗体を生成するか又は生成を誘導することが可能になり得る。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、次いで、結腸直腸癌タンパク質を発現する細胞を標的とする抗体及び免疫細胞の生成を誘導することが可能になり得る。
いくつかの実施形態は、一般集団に影響を及ぼす癌、特に結腸直腸癌にリステリアワクチン、並びに免疫療法並びに癌の予防、スクリーニング、早期発見、診断、治療、及び/又はサバイバーシップを提供する。このワクチンは、リステリア・モノサイトゲネスの「無能」バージョンを用いて、結腸直腸癌タンパク質を体内の免疫細胞に送達し、結腸直腸癌関連タンパク質を発現する細胞に対してそれらを教育する。これらの教育を受けた免疫細胞は、タンパク質を発現し、体内に隠れている癌を探して殺すことが可能になり得る。
いくつかの実施形態は、癌、特に結腸直腸癌関連タンパク質GUCY2Cなどの癌関連タンパク質を発現する結腸直腸癌細胞に対してワクチン接種する初回刺激-追加免疫方法を提供する。アデノウイルスベースのGUCY2Cワクチンと改変リステリア・モノサイトゲネスとの組み合わせは、どちらかのワクチンを単独で使用した場合よりも優れた免疫応答をもたらす。
GUCY2Cに対する有効な免疫応答は、転移性結腸直腸癌、典型的には致命的である疾患、並びに膵臓、胃、及び食道などのGUCY2Cタンパク質を発現するいくつかの他の癌などの、そのようなタンパク質を発現する任意の癌を治療するのに有用である。
3.0 アデノウイルスベースの抗GUCY2Cワクチン(Ad5-GUCY2C)ECDT細胞エピトープ)
アデノウイルスは、ワクチン設計のために広く使用されているウイルスベクタープラットフォームを表す。本発明者らは以前に、GUCY2Cに対するアデノウイルス(Ad5)及びDNAベースのワクチンがGUCY2C特異的T細胞応答を生じさせ、抗腫瘍免疫をもたらすことを実証した。CD4+ヘルパーエピトープと結合したGCCECDを含むキメラタンパク質を発現する組換えアデノウイルス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属出願第13/120,144号に開示されている。本明細書に記載の様々なGUCY2CECDT細胞エピトープコンストラクトは、抗GUCY2Cワクチンを生成するためにアデノウイルスAd5ベクターと共に使用され得る。
アデノウイルスは、ワクチン設計のために広く使用されているウイルスベクタープラットフォームを表す。本発明者らは以前に、GUCY2Cに対するアデノウイルス(Ad5)及びDNAベースのワクチンがGUCY2C特異的T細胞応答を生じさせ、抗腫瘍免疫をもたらすことを実証した。CD4+ヘルパーエピトープと結合したGCCECDを含むキメラタンパク質を発現する組換えアデノウイルス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属出願第13/120,144号に開示されている。本明細書に記載の様々なGUCY2CECDT細胞エピトープコンストラクトは、抗GUCY2Cワクチンを生成するためにアデノウイルスAd5ベクターと共に使用され得る。
ヒトにおける遺伝子発現のために現在使用されているアデノウイルスベクターのほとんどは、血清型5 Adベクターに依存している。アデノウイルス感染は、繊維タンパク質を介した細胞表面へのAd5の付着によって開始される(Shenk,T.1996 Fields Virology,2巻,Fields,BNら(編),2巻,Lippincott-Raven,Philadelphia,PA,2111-2148)。三量体線維分子の遠位C末端ドメインは、Ad5の場合、コクサッキーアデノウイルス受容体(CAR)である特異的細胞受容体に結合する「ノブ(Knob)」で終わる(Bergelson,JMら Science,275,1320-1323)。結合後、細胞内部移行により、ウイルス付着とは無関係な事象において、ペントン塩基中のArg-Gly-Asp(RGD-モチーフ)と細胞インテグリンが相互作用する。
Ad5は天然のヒト病原体であり、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症をもたらす(Yu,B.ら(2012) J Med Virol 84(9):1408-1414)。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を予防することによって再感染又はAd5ベースのワクチン接種を制限するAd5特異的中和抗体(NAb)を誘導する(Priddy,F.H.ら(2008) Clin Infect Dis 46(11):1769-1781;Schirmbeck,R.ら(2008) Mol Ther 16(9):1609-1616;Small,J.C.ら(2014) J Leukoc Biol 96(5):821-831)。
本発明者らは、グアニリルシクラーゼC(GUCY2C)を発現するヒトアデノウイルス5型(Ad5)ワクチン(Ad5-GUCY2C)によるマウスの免疫が、GUCY2Cに対する免疫応答及び結腸直腸癌に対する免疫を惹起することを示した(Snook AE,ら J Natl Cancer Inst. 2008;100(13):950-6)。本発明者らは、第I相臨床試験でその観察をヒトに拡大した。実施例1は、Ad5中和抗体GUCY2C特異的T細胞応答間の相関を報告し、その中で、応答はAd5 NAb低患者において有意に大きかった。GUCY2Cに対する1回限りの免疫は、一部の個人では限られた抗腫瘍免疫を生成することができ、Ad5-GUCY2Cによる反復ワクチン接種は、投与後のワクチン誘発Ad5中和抗体により無効になり得る。
4.0 改変型アデノウイルスベースのワクチン
4.1 Ad5F35ベクター
天然に存在するAd5 NAbは、Ad5の表面上の繊維分子を標的とする(Cheng,C.ら(2010) J Virol 84(1):630-638)。このことは、Ad5の繊維分子をBグループアデノウイルスAd35(自然免疫を有するヒト対象はほとんどいない)からの繊維分子で置換すると、天然に存在するAd5免疫の影響を受けないキメラAd5ウイルスベクター(Ad5.F35として知られる)が生成され得ることを示唆し得る。Sumidaらは、機能的に有意なAd5特異的NAbが主にAd5ヘキソンタンパク質に向けられることを見出した(Sumidaら Journal of Immunology(2005) 174(11)7179-7185)。Hongらは、ペントン塩基に向けられた抗体に関して有意な中和効果を報告している(Hong S.S.ら J.Virol.2003;77:10366-10375)。
4.1 Ad5F35ベクター
天然に存在するAd5 NAbは、Ad5の表面上の繊維分子を標的とする(Cheng,C.ら(2010) J Virol 84(1):630-638)。このことは、Ad5の繊維分子をBグループアデノウイルスAd35(自然免疫を有するヒト対象はほとんどいない)からの繊維分子で置換すると、天然に存在するAd5免疫の影響を受けないキメラAd5ウイルスベクター(Ad5.F35として知られる)が生成され得ることを示唆し得る。Sumidaらは、機能的に有意なAd5特異的NAbが主にAd5ヘキソンタンパク質に向けられることを見出した(Sumidaら Journal of Immunology(2005) 174(11)7179-7185)。Hongらは、ペントン塩基に向けられた抗体に関して有意な中和効果を報告している(Hong S.S.ら J.Virol.2003;77:10366-10375)。
Ad5.F35ベクターを含むBグループAd繊維を含むベクターは、初期細胞付着のためにCD46を使用する(Gaggar,A.ら(2003).Nat.Med.9:1408-1412)。ヒトでは、CD46は、全ての有核細胞上で、低レベルで発現する。Ad5.F35ベクターはインビトロ及び潜在的にインビボで樹状細胞を効率的に形質導入するが、いくつかの知見は、インビボワクチン接種のためのこれらのベクターの有用性に反論する可能性がある。(i)CD46シグナル伝達(CD46モノクローナル抗体、組換え補体因子C3b、又は麻疹ウイルスヘマグルチニンの結合時)は、免疫抑制を誘導することができる(Schneider-Schaulies,S.及びter Meulen,V.(2002).Springer Semin.Immunopathol.24:127-148)。(ii)肺炎及び敗血症につながるAd35アウトブレイクの研究は、Ad35感染によって直接引き起こされた可能性のある一過性の好中球減少症を明らかにした(Sanchez,M.P.ら(1997).J.Infect.Dis.176:760-763)。(iii)はしかウイルス及びHHV6は、CD46を受容体としても使用し、樹状細胞前駆体、骨髄間質細胞、又はCD34+骨髄系前駆細胞のレベルで一過性の免疫抑制を引き起こし得る(Manchester,M.ら(2002).J.Virol.76:6636-6642)。これらの考慮事項は、様々な結果を有する研究をもたらした。上記の要因に注目したある研究は、試験抗原(B型肝炎コア抗原)に対するAD5.F35ワクチン接種がCD46トランスジェニックマウスにおいて免疫抑制を誘導しないことを発見し、その結果が抗原特異的である可能性に留意した(DiPaolo N,ら Mol Ther.2006;13(4):756-765)。しかし、霊長類の研究では、麻疹ヘマグルチニンワクチンインサートを有するAd5.Fib35が、同様にAd5で免疫した動物よりもインサート特異的体液性及び細胞性免疫応答を低下させたことが判明した(Ophorst,O.J.ら(2004).Vaccine 22:3035-3044)。
本発明は、a)Ad5.F35ベクター;並びにi)可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸;ii)可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーター;及びiii)ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープを含む遺伝子発現カセットを含むキメラアデノウイルスワクチンベクターAd5.F35並びにそれに依存するワクチン及び方法を含む。
本発明のアデノウイルスベクターは、複製能があり得る。しかし好ましくは、アデノウイルスベクターは宿主細胞において複製欠損である。
それぞれ参照により本明細書に組み込まれるEP 1 693 459 A1、WO2000/073478 A9及びEP 1 322 774 A2は、Ad5の指向性(ウイルスによって標的とされる細胞/組織)を変更するためのキメラAd5.F35ベクターについて記載している。Ad5中和免疫に対する非感受性を記載するものはない。
キメラAd5.Fib35ウイルスベクターの構築は、3つの断片:(i)Ad5繊維非翻訳領域及び繊維テールドメインの最初の132bp;(ii)Ad35シャフト及びノブドメイン;並びに(iii)Ad5繊維ポリアデニル化シグナルを含むAd5E4領域が、2段階PCRアプローチを介して増幅されるとShayakhmetovらによって記載されている。得られた断片を精製した後、それらを組み合わせ、キメラ繊維の正しい末端に対して作られたフォワードプライマー及びリバースプライマーによって追加のPCR反応に供する。次いで、得られた増幅断片をライゲーションによってドナープラスミドに置換し、キメラ繊維の置換を、Rec+大腸菌株BJ5183内のプラスミド内に含まれるベクターゲノムとの組換えによって行う。対応するウイルスを生成するために、正しいことが検証されたクローンを制限酵素PacIで消化してウイルスゲノムを放出し、293細胞にトランスフェクトした(Shayakhmetov DMら J Virol 2000;74:2567-2583)。EP1550722B1は、ドナーベクターにおけるAd5繊維配列の直接置換及びその後の組換え及び増幅の同様の手順を記載している。
外来遺伝子インサートを担持するAdベクターを構築するために多数の計画が開発されている。伝統的に、Adベクターは、2つの標準的な方法を用いて構築された。第1の方法は、Adゲノムの残りの部分を表すDNA断片と、Ad配列に隣接する外来遺伝子インサートを担持するプラスミドを制限消化することによって得られるDNA断片のライゲーションを含むインビトロライゲーション法である(Stow ND.J Virol.1981;37:171-80)。第2の方法は、部位特異的挿入のためのAd配列に隣接する外来遺伝子インサートを担持するシャトルプラスミドと、Adゲノムのほぼ全部を担持するゲノムプラスミドの2つのプラスミド間の、許容細胞株における相同組換えからなっていた(Bett AJ,ら Proc Natl Acad Sci USA.1994;91:8802-6)。これらの古典的なベクター構築法は、通常、効率が低く、時には親ウイルスが混入する可能性がある。
従来の方法の限界を回避するために、代替アプローチが開発されている。そのような計画の1つは、Adベクターを作製するための大腸菌(BJ5183)の非常に効率的な相同組換え機構に基づいている[16~19]。Adゲノムのほぼ全体を含む線状化又はインタクトなプラスミドと、Adゲノム中の挿入部位からの相同配列に隣接する外因性発現カセットを含むシャトルプラスミドとの間の相同組換えにより、所望の領域における改変及び/又は挿入により感染性クローンが作製される。酵母における相同組換えを採用する同様の計画が報告されている[20]。この計画は、Adゲノムの左末端及び右末端からの配列を含むAd DNAと酵母人工染色体(YAC)ベクターとの間の相同組換えを含み、その結果、Adゲノムの感染コピーを含む酵母人工染色体が作製される。切り出したAdゲノムを適切な細胞にトランスフェクションすると、感染性ビリオンが作製される。
哺乳動物細胞における相同組換えの低効率を克服するために、バクテリオファージP1 Cre/LoxP組換えシステムに基づく手法が開発されている(Aoki K,ら Mol Med.1999;5:224-31;Hardy S,ら J Virol.1997;71:1842-9;Ngら Hum gene Ther. 1999;10:2667-72;Ngら Hum Gene Ther.2000;11:693-9;Ngら J Virol.2002;76:4181-9)。Adベクターは、Creリコンビナーゼを発現する適切な細胞株へのそれらの同時トランスフェクション後の2つのプラスミド間のCre媒介部位特異的組換えの結果として作製される。Cre/LoxPベースのシステムを用いたベクター作製の頻度は、従来の相同組換え法に比べて30~100倍高いことが判明している。
4.2 GUCY2CECD
機能的成熟GCCタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟GCCタンパク質は、典型的には、配列番号2のアミノ酸残基22~1073、配列番号2のアミノ酸残基23~1073又は配列番号2のアミノ酸残基24~1073を含む。成熟GCCタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
機能的成熟GCCタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟GCCタンパク質は、典型的には、配列番号2のアミノ酸残基22~1073、配列番号2のアミノ酸残基23~1073又は配列番号2のアミノ酸残基24~1073を含む。成熟GCCタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
ワクチンは、機能的成熟GCCタンパク質の細胞外ドメインを含むGCCタンパク質の可溶性切断型を含み、これは典型的には、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基54からアミノ酸残基384までの配列を含む約330~423アミノ酸残基を含む。細胞外ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22、23又は24からアミノ酸残基420~435までの配列を含み得る。機能的成熟GCCタンパク質の細胞外ドメインの配列は、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22からアミノ酸残基435までの配列、又は例えば、機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22、23又は24からアミノ酸残基420~435までの配列などの機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基54から約アミノ酸残基384までの配列を含む機能的成熟GCCタンパク質のアミノ酸残基22からアミノ酸残基435までの配列の330~422アミノ酸残基断片を含み得る。コンストラクトはまた、膜貫通ドメインからの配列を含み得、但し、可溶性GCCコンストラクトが細胞膜に固定されるのを防ぐために機能するのに十分不十分である。機能的成熟GCCタンパク質の膜貫通ドメインは、典型的には、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基436から約アミノ酸残基452までの配列を含む約16~23アミノ酸残基を含む。膜貫通ドメインは、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基431から約アミノ酸残基454の配列、又は例えば、機能的成熟GCCの約アミノ酸残基436から約アミノ酸残基452までの配列又は機能的成熟GCCの約アミノ酸残基431から約アミノ酸残基454のまで配列などの、機能的成熟GCCタンパク質の約アミノ酸残基431~約アミノ酸残基454までの配列の16~22アミノ酸断片を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、膜貫通配列を含まない。
4.3 ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープ
改善された抗GUCY2C免疫応答を誘導するために、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをGUCY2C配列に連結して融合タンパク質を生成してもよい。ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープは、複数のHLAタイプに一致し、したがって複数のHLAタイプによって認識されるペプチド配列である。ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープの一例は、PADRE(汎DRエピトープペプチド)である。
改善された抗GUCY2C免疫応答を誘導するために、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをGUCY2C配列に連結して融合タンパク質を生成してもよい。ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープは、複数のHLAタイプに一致し、したがって複数のHLAタイプによって認識されるペプチド配列である。ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープの一例は、PADRE(汎DRエピトープペプチド)である。
PADREペプチドは、最も一般的な16種類のHLA-DRのうち少なくとも15種類と複合体を形成する。ヒトは少なくとも1つのDRを有し、PADREはその種類の多くに結合するので、PADREはほとんどのヒトにおいて有効である可能性が高い。PADRE及び他のものなどのユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープは、1998年4月7日に発行されたSetteらの米国特許第5,736,142号;同第2002年7月2日に発行されたSetteらの同第6,413,935号;及び2007年4月10日に発行された同第7,202,351号及びWO1995007707A1に開示されている。
ユニバーサルHLA-DRエピトープPADRE(KXVAAWTLKA)について記載されている(Alexander,J,ら J. Immunol,2000 Feb 1,164(3):1625-33;Agadjanyanら J Immunol 2005;174:1580-6)。
PADREをタンパク質抗原に融合させる場合、何人かの研究者は、目的抗原とインフレームで発現させるペプチド配列AKFVAAWTLKAAAを使用した。
Wei J,ら Cancer Biother Radiopharm 2008,23:121-8;
Bargieri D Yら Mem Inst Oswaldo Cruz 2007,102:313-7;
P.vivax MSP1 DYDVVYLKPLAGMYK(配列番号12)の33kDaのC末端領域に存在するT細胞エピトープも、異なるクラスII HLAハプロタイプを有する非ヒト霊長類において強い免疫応答を惹起することが見出されている(Rosaら Microbes Infect 2006,8:2130-7;
Sinigagliaら,Nature 336,778-780(1988)は、マウス及びヒトにおける多くの異なるMHCクラスII分子と会合してT細胞によって認識されるサーカムスポロゾイトタンパク質に由来する熱帯熱マラリア原虫ペプチドについて記載している。残基位置378~398のDIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号13)由来のペプチド、並びにそのN及びC欠損、例えば、IEKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号14)、EKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号15)、DIEKKIAKMEKASSVFNVVN(配列番号16)、DIEKKIAKMEKASSVFNVV(配列番号17)、DIEKKIAKMEKASSVFNV(配列番号18)は、強い応答を惹起した。
Wei J,ら Cancer Biother Radiopharm 2008,23:121-8;
Bargieri D Yら Mem Inst Oswaldo Cruz 2007,102:313-7;
P.vivax MSP1 DYDVVYLKPLAGMYK(配列番号12)の33kDaのC末端領域に存在するT細胞エピトープも、異なるクラスII HLAハプロタイプを有する非ヒト霊長類において強い免疫応答を惹起することが見出されている(Rosaら Microbes Infect 2006,8:2130-7;
Sinigagliaら,Nature 336,778-780(1988)は、マウス及びヒトにおける多くの異なるMHCクラスII分子と会合してT細胞によって認識されるサーカムスポロゾイトタンパク質に由来する熱帯熱マラリア原虫ペプチドについて記載している。残基位置378~398のDIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号13)由来のペプチド、並びにそのN及びC欠損、例えば、IEKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号14)、EKKIAKMEKASSVFNVVNS(配列番号15)、DIEKKIAKMEKASSVFNVVN(配列番号16)、DIEKKIAKMEKASSVFNVV(配列番号17)、DIEKKIAKMEKASSVFNV(配列番号18)は、強い応答を惹起した。
本明細書に提供されるのは、そのようなCD4+T細胞エピトープを含むタンパク質の例である異なるタンパク質及び異なるペプチドの例である。これらのタンパク質及びペプチドは、CD4+T細胞エピトープの非限定的な例であることを意図する。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、破傷風毒素、例えば、TT830-844 QYIKANSKFIGITEL(配列番号19)、及びTT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号20)Panina-Bordignonら,Eur.J.Immunol.19,2237-2242(1989);Renard V,J Immunol 2003;171:1588-95;TT590-603TKIYSYFPSVISKV(配列番号21)、TT615-629VRDIIDDFTNESSQK(配列番号22)、TT639-652VSTIVPYIGPALNI(配列番号23)、TT830-843QYIKANSKFIGITE(配列番号24)及びTT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号25)BenMohamedら Hum Immunol 2000;61:764-79由来であり得る。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、インフルエンザヘマグルチニン、例えば、インフルエンザヘマグルチニン残基306~318PKYVKQNTLKLAT(配列番号26)に由来し得る(Buschら,Int.Immunol.2,443-451(1990);Momら BMC Immunol 2005;6:24)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、B型肝炎表面抗原(HBsAg)に由来し得る(Litjensら J Immunol Methods 2008;330:1-11)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、細菌性病原体(アナプラズマ・マージナーレなど)の外膜タンパク質(OMP)に由来し得る(Macmillan H,Norimine J,Brayton K A,Palmer G H,Brown W C。天然に複合体化された細菌外膜タンパク質の物理的結合は、免疫原性を高める(Physical linkage of naturally complexed bacterial outer membrane proteins enhances immunogenicity) Infect Immun 2008;76:1223-9)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、エンテロウイルス71(EV71)株41由来のVP1カプシドタンパク質、例えば残基66~77 IETRCVLNSHSTAET(配列番号27)、残基145~159 EVVPQLLQYMFVPPG(配列番号28)、及び残基247~261のLVVRIYMRMKHVRAW(配列番号29)に由来し得る(Wei Fooら Viral Immunol 2008)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、EBV BMLF1(Schlienger K,Craighead N,Lee K P,Levine B L,June C H.単球由来樹状細胞によるタンパク質抗原特異的ヒトCD4(+)T細胞の効率的な初回刺激(Efficient priming of protein antigen-specific human CD4(+) T cells by monocyte-derived dendritic cells) Blood 2000; 96:3490-8;Neidhart J,Allen K O,Barlow D L,Carpenter M,Shaw D R,Triozzi PL,Conry R M)に由来し得る。顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子の有無にかかわらず、リポソームエマルジョン中のモノホスホリルリピッドAを配合した組換えバキュロウイルス由来KSA(Ep-CAM)による結腸直腸癌患者の免疫化。Vaccine 2004;22:773-80;Piriou E R,van Dort K,Nanlohy N M,van Oers M H,Miedema F,van Baarle D。ウイルス特異的CD4+T細胞の検出のための新規方法は、未治療のHIV感染対象におけるEBV特異的CD4+T細胞応答の低下を示す(Novel method for detection of virus-specific CD4+ T cells indicates a decreased EBV-specific CD4+ T cell response in untreated HIV-infected subjects) Eur J Immunol 2005;35:796-805;Heller K N,Upshaw J,Seyoum B,Zebroski H,Munz C。別々のメモリーCD4+T細胞サブセットは、健康なウイルスキャリアにおけるエプスタイン・バーウイルス核抗原1の免疫認識を媒介する(Distinct memory CD4+T-cell subsets mediate immune recognition of Epstein Barr virus nuclear antigen 1 in healthy virus carriers) Blood 2007;109:1138-46)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、EBV LMPI、例えば、LMP1159-175YLQQNWWTLLVDLLWLL(配列番号30)に由来し得る。Kobayashiら Cancer Res 2008;68:901-8)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、HIV Gag p24、例えば、Gag131-15NYPIVQNIQGQMVHQAISPR(配列番号31)、
Gag211-230EWDRVHPVHAGPIAPGQMRE(配列番号32)、
Gag241-260STLQEQIGWMTNNPPIPVGE(配列番号33)、
Gag263-277KRWIILGLNKIVRMY(配列番号34)、
Gag271-290NKIVRMYSPTSILDIRQGPK(配列番号35)、
Gag291-310EPFRDYVDRFYKTLRAEQAS(配列番号36)、
Gag301-320YKTLRAEQASQEVKNWMTET(配列番号37)、
Gag321-340LLVQNANPDCKTILKALGPA(配列番号38)、
Gag331-350KTILKALGPAATLEEMMTAC(配列番号39)に由来し得る(Pajotら Eur J Immunol 2007;37:2635-44)。
Gag211-230EWDRVHPVHAGPIAPGQMRE(配列番号32)、
Gag241-260STLQEQIGWMTNNPPIPVGE(配列番号33)、
Gag263-277KRWIILGLNKIVRMY(配列番号34)、
Gag271-290NKIVRMYSPTSILDIRQGPK(配列番号35)、
Gag291-310EPFRDYVDRFYKTLRAEQAS(配列番号36)、
Gag301-320YKTLRAEQASQEVKNWMTET(配列番号37)、
Gag321-340LLVQNANPDCKTILKALGPA(配列番号38)、
Gag331-350KTILKALGPAATLEEMMTAC(配列番号39)に由来し得る(Pajotら Eur J Immunol 2007;37:2635-44)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、例えば、556~580位のVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYT(配列番号40)、残基56~80 VTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSY(配列番号41)、残基316~335 GQQSMPNRPNYIAFRDNFIG(配列番号42)及び残基906~930 EVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHR(配列番号43)(Leenら J Virol 2008;82:546-54)で見出される残基のアデノウイルス5ヘキソンタンパク質に由来し得る。全部で、複数のMHC-IIハプロタイプについて30個超のCD4+T細胞エピトープが同定されている。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、ワクシニアウイルスタンパク質、例えば、残基21~29のF17Rタンパク質残基(YLVLKAVKV)及び残基20~28のA10Lタンパク質残基FRIVSTVLPに由来し得る(Calvo-Calleら PLoS Pathog 2007;3:1511-29)。Calvo-Calleは、24種の異なるワクシニアタンパク質からの複数のMHC-IIハプロタイプについて25超のCD4+T細胞エピトープを同定した。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、結核菌ヒートショックタンパク質に由来する(Liu D W,Tsao Y P,Kung J T,Ding Y A,Sytwu H K,Xiao X,Chen S L)。子宮頸癌の潜在的なワクチンとしてヒートショックタンパク質DNAと融合されたヒトパピローマウイルス16型E7ペプチドDNAを発現する組換えアデノ随伴ウイルス(Recombinant adeno-associated virus expressing human papillomavirus type 16 E7 peptide DNA fused with heat shock protein DNA as a potential vaccine for cervical cancer. J Virol 2000; 74:2888-94。)
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、IgGのFc部分に由来する(You Z,Huang X F,Hester J,Rollins L,Rooney C,Chen S Y)。受容体媒介内部移行経路を標的とする改変抗原を発現する樹状細胞による活発なヘルパーT細胞及び細胞傷害性T細胞の誘導並びにB細胞応答(Induction of vigorous helper and cytotoxic T cell as well as B cell responses by dendritic cells expressing a modified antigen targeting receptor-mediated internalization pathway) J Immunol 2000; 165:4581-91)。
いくつかの実施形態では、CD4+T細胞エピトープは、ヒトLAMP-1タンパク質のリソソーム標的化シグナルに由来する(Su Z,Vieweg J,Weizer A Z,Dahm P,Yancey D,Turaga V,Higgins J,Boczkowski D,Gilboa E,Dannull J)。キメラ遺伝子産物をコードするRNAでトランスフェクトした樹状細胞を用いたテロメラーゼ特異的CD4(+)T細胞の誘導の増強(Enhanced induction of telomerase-specific CD4(+) T cells using dendritic cells transfected with RNA encoding a chimeric gene product. Cancer Res 2002;62:5041-8)。
示されたHLA分子のHLAハプロタイプの試料及び代表的なCD4+T細胞エピトープには、以下のもの:
HLADR*1101-破傷風トキソイドペプチド残基829-844、ヘマグルチニンペプチド残基306-318(Moro M,Cecconi V,Martinoli C,Dallegno E,Giabbai B,Degano M,Glaichenhaus N,Protti M P,Dellabona P,Casorati G。病原体又は腫瘍由来の合成ペプチドでの負荷を受容できる機能的HLA-DR*1101テトラマーの作製(Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides.BMC Immunol 2005; 6:24。)
HLA-DRB1*0101(DR1)-破傷風トキソイドペプチド残基639-652、830-843又は947-967及び14の他の破傷風トキソイドペプチド(BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond D J。HLA A*0201/DR1トランスジェニックマウスにおける最小エピトープワクチンによるCTL応答の誘導:HLAクラスII制限T(H)応答への依存性(Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice:dependence on HLA class II restricted T(H) response) Hum Immunol 2000;61:764-79;及びJames E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W Long mate。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping Reveals broad,individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition) Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0301-EV71 VP1残基145-159又は247-261及び5つの異なる破傷風トキソイドペプチド(Wei Foo D G,Macary P A,Alonso S,Poh C L.エンテロウイルス71のVP1カプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71) Viral Immunol 2008;及びJames E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W Pooh。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping reveals broad,individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition.Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0405-EV71 VP1残基145-159又は247-261(Wei Foo D G,Macary P A,Alonso S,Poh C L.エンテロウイルス71のVP1キャプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71.Viral Immunol 2008)。
HLA-DRB1* 1301-EV71 VPI 残基 145-159又は247-261(Wei Foo D G, Macary P A, Alonso S, Poh C L.エンテロウイルス71のVP1 カプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008)。
HLA-DR9-エプスタイン・バーウイルス(EBV)潜伏性膜タンパク質1(LMP1)残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜伏膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。
HLA-DR53 EBV LMP1残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜在性膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8)。
HLA-DR15 EBV LMP1残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜在性膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8)。
HLA-DRB1*0401-15種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0701-9種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*1501-7種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB5*0101-8種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
が含まれるが、これらに限定されない。
HLADR*1101-破傷風トキソイドペプチド残基829-844、ヘマグルチニンペプチド残基306-318(Moro M,Cecconi V,Martinoli C,Dallegno E,Giabbai B,Degano M,Glaichenhaus N,Protti M P,Dellabona P,Casorati G。病原体又は腫瘍由来の合成ペプチドでの負荷を受容できる機能的HLA-DR*1101テトラマーの作製(Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides.BMC Immunol 2005; 6:24。)
HLA-DRB1*0101(DR1)-破傷風トキソイドペプチド残基639-652、830-843又は947-967及び14の他の破傷風トキソイドペプチド(BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond D J。HLA A*0201/DR1トランスジェニックマウスにおける最小エピトープワクチンによるCTL応答の誘導:HLAクラスII制限T(H)応答への依存性(Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice:dependence on HLA class II restricted T(H) response) Hum Immunol 2000;61:764-79;及びJames E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W Long mate。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping Reveals broad,individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition) Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0301-EV71 VP1残基145-159又は247-261及び5つの異なる破傷風トキソイドペプチド(Wei Foo D G,Macary P A,Alonso S,Poh C L.エンテロウイルス71のVP1カプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71) Viral Immunol 2008;及びJames E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W Pooh。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping reveals broad,individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition.Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0405-EV71 VP1残基145-159又は247-261(Wei Foo D G,Macary P A,Alonso S,Poh C L.エンテロウイルス71のVP1キャプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71.Viral Immunol 2008)。
HLA-DRB1* 1301-EV71 VPI 残基 145-159又は247-261(Wei Foo D G, Macary P A, Alonso S, Poh C L.エンテロウイルス71のVP1 カプシドタンパク質上のヒトCD4(+)T細胞エピトープの同定(Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008)。
HLA-DR9-エプスタイン・バーウイルス(EBV)潜伏性膜タンパク質1(LMP1)残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜伏膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。
HLA-DR53 EBV LMP1残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜在性膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8)。
HLA-DR15 EBV LMP1残基159-175(Kobayashi H,Nagato T,Takahara M,Sato K,Kimura S,Aoki N,Azumi M,Tateno M,Harabuchi Y,Celis E.ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するEBV潜在性膜タンパク質1特異的MHCクラスII制限T細胞応答の誘導(Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008; 68:901-8)。
HLA-DRB1*0401-15種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*0701-9種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB1*1501-7種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
HLA-DRB5*0101-8種類の破傷風トキソイドペプチド(James E A,Bui J,Berger D,Huston L,Roti M,Kwok W W.テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的CD4+T細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるHLAベースの違いを示唆している(Tetramer-guided epitope mapping rEVeals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007; 19:1291-301)。
が含まれるが、これらに限定されない。
4.4 AD5.F35-GUCY2Cワクチンコンストラクト
本明細書で使用するAD5.F35-GUCY2C、AD5.F35-GUCY2CECD、AD5.F35-GUCY2CユニバーサルT細胞エピトープ、AD5.F35-GUCY2CECDユニバーサルT細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルT細胞エピトープ融合タンパク質に結合したGUCY2CECDがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルT細胞エピトープに結合したGUCY2CECDをコードする遺伝子挿入物を有するAd5.F35アデノウイルスベクターを指すために互換的に使用される。好ましい実施形態では、AD5.F35-GUCY2CワクチンのユニバーサルT細胞エピトープが、ユニバーサルT細胞エピトープPADREである。そのため、好ましい実施形態は、互換的にAD5.F35-GUCY2C-PADRE及びAD5.F35-GUCY2CECDPADREと呼ばれることがある。AD5.F35-GUCY2Cワクチンを使用する方法への全ての言及は、特に一般的なAD5.F35-GUCY2Cワクチン及びAD5.F35-GUCY2CECD-PADREワクチンを説明することを意図している。
本明細書で使用するAD5.F35-GUCY2C、AD5.F35-GUCY2CECD、AD5.F35-GUCY2CユニバーサルT細胞エピトープ、AD5.F35-GUCY2CECDユニバーサルT細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルT細胞エピトープ融合タンパク質に結合したGUCY2CECDがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルT細胞エピトープに結合したGUCY2CECDをコードする遺伝子挿入物を有するAd5.F35アデノウイルスベクターを指すために互換的に使用される。好ましい実施形態では、AD5.F35-GUCY2CワクチンのユニバーサルT細胞エピトープが、ユニバーサルT細胞エピトープPADREである。そのため、好ましい実施形態は、互換的にAD5.F35-GUCY2C-PADRE及びAD5.F35-GUCY2CECDPADREと呼ばれることがある。AD5.F35-GUCY2Cワクチンを使用する方法への全ての言及は、特に一般的なAD5.F35-GUCY2Cワクチン及びAD5.F35-GUCY2CECD-PADREワクチンを説明することを意図している。
4.5 AD5.F35-GUCY2Cワクチンを使用する治療法
本発明の態様は、GUCY2Cを発現する癌/腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、GUCY2Cを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、同定された転移性疾患及び微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
本発明の態様は、GUCY2Cを発現する癌/腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、GUCY2Cを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、同定された転移性疾患及び微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
該ワクチンは、粘膜組織を含む癌の診断時に提供される通常の治療と共にアジュバント治療的処置を提供する。上述の本出願で論じたように、当業者は、GUCY2Cを発現しているとして癌又は腫瘍を診断することができる。転移性疾患の検出は、日常的な方法論を用いて行うことができるが、癌の初期診断時には、ある程度の微小レベルの癌が検出できない場合がある。治療の典型的な様式には、手術、化学療法若しくは放射線療法、又は様々な組み合わせが含まれる。GUCY2Cを標的とするワクチンは、正常組織を攻撃するのではなく、GUCY2Cを発現する免疫学的に保護された区画から派生する癌細胞を選択的に検出及び排除するという利点を備えた追加の対抗手段を提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、個人が癌を有すると診断され、癌がGUCY2Cを発現していると特定される。CD4+ヘルパーエピトープと結合した可溶性GUCY2Cを発現するAD5.F35-GUCY2Cワクチンは、単独で、又は手術、及び/若しくは放射線治療及び/若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
4.6 AD5.F35-GUCY2Cワクチンを使用する予防的方法
該ワクチンは、GUCY2C癌/腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用してもよい。摘出されたか又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
該ワクチンは、GUCY2C癌/腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用してもよい。摘出されたか又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
粘膜組織癌として発症するリスクがある個人は、検出可能な疾患を有する個人に先立って、癌細胞を排除する免疫応答を誘導するためにワクチンを投与され得る。いくつかの実施形態では、そのような個人はまた、CD4+ヘルパーエピトープ型について特定され得る。個人に投与されるワクチンは、個人によって認識される粘膜制限抗原及び1以上のCD4+ヘルパーエピトープのタンパク質又は遺伝子コードを含む。しかし、PADREなどのユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープを利用する方がより実用的であり得る。
4.7 ワクチンの組成物、製剤、用量及び投与計画
いくつかの実施形態によるワクチンは、核酸分子、ウイルスなどの核酸分子を含むベクター、タンパク質又は細胞であり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態によるワクチンは、核酸分子、ウイルスなどの核酸分子を含むベクター、タンパク質又は細胞であり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態では、例えば、活性剤は、医薬として許容されるビヒクルと会合した溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を維持する添加剤を含んでもよい。該製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
注射用組成物は、例えば、滅菌水などの希釈剤、電解質/デキストロース、植物起源の脂肪油、脂肪酸エステル、又はプロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのポリオール中に免疫原を含み得る。注射剤は無菌で、発熱物質を含まないものでなければならない。
該ワクチンは、免疫原性応答の認識及び誘導のために免疫原性物質を身体の免疫系に提示することを可能にする任意の手段によって投与され得る。医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内に投与され得る。
投与量は、活性剤の性質及び特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその様式及び投与経路;レシピエントの年齢、健康、体重;症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果などの既知の要因に応じて変化する。ある量の免疫原が、保護的又は治療的に有効な免疫応答を誘導するために送達される。当業者は、日常的な方法によって範囲及び最適な投与量を容易に決定することができる。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
5.0 リステリア・モノサイトゲネスベクターベースのワクチン
本発明者らは、GUCY2C(Lm-GUCY2C)を発現するリステリア・モノサイトゲネス(Lm)の組換え株を開発し、感染したマクロファージ内でGUCY2Cを分泌する能力(図11)、Ad5(図12)又はDNAワクチン接種(図13)後のGUCY2C特異的T細胞応答を増強する能力を実証した。これらのLm-GUCY2Cベースのワクチン接種投与計画は、結腸直腸、胃、食道、膵臓、及び唾液を含むが、これらに限定されないGUCY2C発現癌の患者において堅牢な抗腫瘍効果を誘導することが期待される。「Lm-GUCY2C」のいくつかの異なるバリエーションが開示されている:
1.Lm-LLO-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.サイトゾル分泌を促進するために、LLOのC末端(アミノ酸約1~約420)に融合されたGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)を使用する。
2.Lm-ActA-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.ActAN100*として知られるActAの改変型のC末端に融合されたGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)を使用する(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第20180030457A1号に記載)
3.Lm-ActA-Syn18×5-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.融合タンパク質の発現を増強するためのSyn18×5配列に結合されたC末端のGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)(米国特許公開第20180030457A1号)とサイトゾル分泌を促進するためのN末端のActAN100*として知られるActAの改変型(米国特許公開第20180030457A1号に記載)からなる融合タンパク質を使用する。
4.単独で、又は他のタンパク質に融合させたGUCY2Cタンパク質/ペプチドの発現を促進するプロモーターを含むLm-GUCY2Cの他のバリエーションも可能であり、開示されている。
本発明者らは、GUCY2C(Lm-GUCY2C)を発現するリステリア・モノサイトゲネス(Lm)の組換え株を開発し、感染したマクロファージ内でGUCY2Cを分泌する能力(図11)、Ad5(図12)又はDNAワクチン接種(図13)後のGUCY2C特異的T細胞応答を増強する能力を実証した。これらのLm-GUCY2Cベースのワクチン接種投与計画は、結腸直腸、胃、食道、膵臓、及び唾液を含むが、これらに限定されないGUCY2C発現癌の患者において堅牢な抗腫瘍効果を誘導することが期待される。「Lm-GUCY2C」のいくつかの異なるバリエーションが開示されている:
1.Lm-LLO-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.サイトゾル分泌を促進するために、LLOのC末端(アミノ酸約1~約420)に融合されたGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)を使用する。
2.Lm-ActA-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.ActAN100*として知られるActAの改変型のC末端に融合されたGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)を使用する(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第20180030457A1号に記載)
3.Lm-ActA-Syn18×5-GUCY2C:
a.hly[リステリオリシンO;(LLO)];iap[p60;p60],acta[アクチン集合誘導タンパク質;(actA)]などの強力なLmプロモーター;又は他のPrfA依存性プロモーターを使用する。
b.融合タンパク質の発現を増強するためのSyn18×5配列に結合されたC末端のGUCY2C細胞外ドメイン(アミノ酸約23~約429)(米国特許公開第20180030457A1号)とサイトゾル分泌を促進するためのN末端のActAN100*として知られるActAの改変型(米国特許公開第20180030457A1号に記載)からなる融合タンパク質を使用する。
4.単独で、又は他のタンパク質に融合させたGUCY2Cタンパク質/ペプチドの発現を促進するプロモーターを含むLm-GUCY2Cの他のバリエーションも可能であり、開示されている。
いくつかの実施形態では、これらは、
1.野生型10403Sリステリア・モノサイトゲネス株のΔactA/ΔinLBバージョン(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,691,393号;同第7,695,725号)
2.上記のΔactA/ΔinLBバージョンに由来し、uvrA及びuvrB遺伝子欠損も含む死滅しているが代謝活性のある(KBMA)バージョン
3.野生型10403Sリステリア・モノサイトゲネス株のdal dat ΔactAバージョン
4.prfA欠損リステリア・モノサイトゲネス株XFL-7
を含むが、これらに限定されない様々なLm株の「骨格」を使用し得る。
1.野生型10403Sリステリア・モノサイトゲネス株のΔactA/ΔinLBバージョン(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,691,393号;同第7,695,725号)
2.上記のΔactA/ΔinLBバージョンに由来し、uvrA及びuvrB遺伝子欠損も含む死滅しているが代謝活性のある(KBMA)バージョン
3.野生型10403Sリステリア・モノサイトゲネス株のdal dat ΔactAバージョン
4.prfA欠損リステリア・モノサイトゲネス株XFL-7
を含むが、これらに限定されない様々なLm株の「骨格」を使用し得る。
いくつかの実施形態では、Lmベクターは、上記の節4.2に記載したものなどのいくつかの異なるGUCY2Cインサートのいずれか1つを含む。いくつかの好ましい実施形態では、それと結合したユニバーサルエピトープを含まないGUCY2CECDのコード配列はLmベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、節4.2に記載されるものなどのGUCY2Cインサートは、節4.3に記載のユニバーサルT細胞エピトープに連結され得る。本明細書で使用するLm-GUCY2C、Lm-GUCY2CECD、Lm-GUCY2CユニバーサルT細胞エピトープ及びLm-GUCY2CECDユニバーサルT細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルT細胞エピトープ融合タンパク質に結合されたGUCY2CECDがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルT細胞エピトープに結合したGUCY2CECDをコードする遺伝子インサートを有するLmベクターを指すために互換的に使用される。ユニバーサルT細胞エピトープを含有するいくつかの実施形態では、ユニバーサルT細胞エピトープPADRE.Lm-GUCY2C-PADRE及びLm-GUCY2CECD-PADREは、PADREを含むそのような実施形態を指すために互換的に使用される。
6.0 AD5.F35-GUCY2Cワクチン、Lm-GUCY2Cワクチン又はAD5.F35-GUCY2CワクチンとLm-GUCY2Cワクチンの組み合わせを用いた治療法
本発明の態様は、GUCY2Cを発現する癌/腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、GUCY2Cを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、特定された転移性疾患並びに微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
本発明の態様は、GUCY2Cを発現する癌/腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、GUCY2Cを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、特定された転移性疾患並びに微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
該ワクチンは、粘膜組織を含む癌の診断時に提供される通常の治療と共にアジュバント治療的処置を提供する。上述の本出願で論じたように、当業者は、GUCY2Cを発現しているとして癌又は腫瘍を診断することができる。転移性疾患の検出は、日常的な方法論を用いて行うことができるが、癌の初期診断時には、ある程度の微小レベルの癌が検出できない場合がある。治療の典型的な様式は、手術、化学療法若しくは放射線療法、又は様々な組み合わせを含む。GUCY2Cを標的とするワクチンは、正常組織を攻撃するのではなく、GUCY2Cを発現する免疫学的に保護された区画に由来する癌細胞を選択的に検出及び排除するという利点を備えた追加の対抗手段を提供する。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はGUCY2Cを発現していると特定される。CD4+ヘルパーエピトープと結合した可溶性GUCY2Cを発現するAD5.F35-GUCY2Cワクチンは、単独で、又は手術、及び/若しくは放射線治療及び/若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はGUCY2Cを発現していると特定される。可溶性GUCY2Cを発現するLm-GUCY2Cワクチンは、単独で、又は手術、及び/若しくは放射線治療及び/若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はGUCY2Cを発現していると特定される。アデノウイルスベクター系の抗GUCY2CワクチンとLmベクター系の抗GUCY2Cワクチンの両方を順次組み合わせて初回刺激-追加免疫法を行う。いくつかの実施形態では、個人に、まずGUCY2Cの可溶型を発現するアデノウイルスベクターを投与し、続いてLmベクター系の抗GUCY2Cワクチンを投与する。いくつかのそのような実施形態では、個人は、好ましくは、最初にAD5.F35-GUCY2Cワクチン、続いてLm-GUCY2Cワクチンを投与されるが、該ワクチンは逆の順序で送達され得る。最初のワクチン接種と2回目のワクチン接種の間の最短間隔は約2~4週間である。好ましい間隔は約4~6週間である。間隔は最大12ヶ月間であり得る。ワクチン併用療法は、手術、及び/又は放射線治療及び/又は他の抗癌剤の投与と組み合わせて投与され得る。
7.0 AD5.F35-GUCY2Cワクチン、Lm-GUCY2Cワクチン、又はAD5.F35-GUCY2CワクチンとLm-GUCY2Cワクチンの組み合わせを用いた予防的方法
該ワクチンは、GUCY2C癌/腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用されてもよい。摘出した又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
該ワクチンは、GUCY2C癌/腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用されてもよい。摘出した又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
GUCY2Cを発現する癌を発症するリスクのある個人は、検出可能な疾患を有する個人に先立って、癌細胞を排除する免疫応答を誘導するためにワクチンを投与され得る。
8.0 ワクチンの組成物、製剤、用量及び投与計画
いくつかの実施形態によるワクチンは、アデノウイルスベクター又はLmベクターであり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態によるワクチンは、アデノウイルスベクター又はLmベクターであり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態では、例えば、活性剤は、医薬として許容されるビヒクルと会合した溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を維持する添加剤を含んでもよい。該製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
注射用組成物は、例えば、滅菌水などの希釈剤、電解質/デキストロース、植物起源の脂肪油、脂肪酸エステル、又はプロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのポリオール中に免疫原を含み得る。注射剤は無菌で、発熱物質を含まないものでなければならない。
該ワクチンは、免疫原性応答の認識及び誘導のために免疫原性物質を身体の免疫系に提示することを可能にする任意の手段によって投与され得る。該医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内に投与され得る。
投与量は、活性剤の性質及び特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその様式及び投与経路;レシピエントの年齢、健康、及び体重;症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果などの既知の要因に応じて変化する。ある量の免疫原が、保護的又は治療的に有効な免疫応答を誘導するために送達される。当業者は、日常的な方法によって範囲及び最適な投与量を容易に決定することができる。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例1
Ad5-GUCY2C-PADREを投与された第1相臨床試験患者は、10未満から10,000超の範囲のAd5中和抗体(NAb)価を有していた。患者の半数が200をはるかに下回る力価(Ad5 NAb低)を有し、残りの半数が200をはるかに超える力価を有する(Ad5 NAb高い)という明らかなパターンが現れた。患者をAd5 NAb低コホートと高コホートに分けると、Ad5 NAb力価とGUCY2C特異的T細胞応答との関係が明らかになり、Ad5 NAb低患者では応答が顕著に大きかった(図3)。まとめると、これらのデータは、既存のAd5 NAbが高用量の投与にもかかわらず、かつ他のワクチンとは対照的に、Ad5-GUCY2C-PADREの有効性を排除することを実証する本発明者らの動物データ(図4)と一致している(Priddy,F.H.ら(2008).Clin Infect Dis 46(11):1769-1781)。追加の結果を表1に示す:
表1.Ad5-hGCC-PADREは、Ad5 nAbによって制限される。
実施例1
Ad5-GUCY2C-PADREを投与された第1相臨床試験患者は、10未満から10,000超の範囲のAd5中和抗体(NAb)価を有していた。患者の半数が200をはるかに下回る力価(Ad5 NAb低)を有し、残りの半数が200をはるかに超える力価を有する(Ad5 NAb高い)という明らかなパターンが現れた。患者をAd5 NAb低コホートと高コホートに分けると、Ad5 NAb力価とGUCY2C特異的T細胞応答との関係が明らかになり、Ad5 NAb低患者では応答が顕著に大きかった(図3)。まとめると、これらのデータは、既存のAd5 NAbが高用量の投与にもかかわらず、かつ他のワクチンとは対照的に、Ad5-GUCY2C-PADREの有効性を排除することを実証する本発明者らの動物データ(図4)と一致している(Priddy,F.H.ら(2008).Clin Infect Dis 46(11):1769-1781)。追加の結果を表1に示す:
表1.Ad5-hGCC-PADREは、Ad5 nAbによって制限される。
Ad5 NAbは、米国において約40%を含むほとんどのヒト集団において一般的であり(Nwanegbo,E.ら(2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)、Ad5ベースのワクチンの免疫原性を低下させる(Priddy,F.H.ら(2008).Clin Infect Dis 46(11):1769-1781)。重要なことに、ほとんどの天然に存在するAd5 NAbは、Ad5の表面上の繊維分子を標的としている(Cheng,C.ら(2010) J Virol 84(1):630-638)。Ad5とは対照的に、ほとんどの国におけるAd35特異的抗体の血清有病率は非常に低い(<10%;Nwanegbo,E.ら(2004)Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)。まとめると、これらの観察結果は、Ad5の繊維分子をAd35の繊維分子で置き換えると、天然に存在するAd5免疫の影響を受けないキメラAd5ウイルスベクター(Ad5.F35として知られる)が生成されることを示唆している。実際、Ad5-GUCY2C-PADRE第1相試験の対象の50%が高いAd5 NAb(力価>200)を有していたのに対し、高いAd5.F35NAbを保有している対象は1/10に過ぎない(図5)。そのため、Ad5.F35-GUCY2C-PADREは、公開された文献によって予測されるように、用量漸増によって達成されなかったAd5特異的な既存の免疫を克服すると予想される(Priddy,F.H.ら(2008)。Clin Infect Dis 46(11):1769-1781)。
実施例2
Ad5.F35-hGCC-PADREを生成するために、hGCC-PADREコード配列を合成し、hGCC-PADRE mRNAのタンパク質への翻訳効率を高めるために、配列番号3に記載の哺乳動物コドン最適化配列を生成した。このコンストラクトをAd5.F35ベクターにサブクローニングし、Ad5.F35-hGCC-PADREを生成した。
Ad5.F35-hGCC-PADREを生成するために、hGCC-PADREコード配列を合成し、hGCC-PADRE mRNAのタンパク質への翻訳効率を高めるために、配列番号3に記載の哺乳動物コドン最適化配列を生成した。このコンストラクトをAd5.F35ベクターにサブクローニングし、Ad5.F35-hGCC-PADREを生成した。
全体として、Ad5.F35-hGCC-PADREの構造は、3つの例外を除いて、野生型Ad5(Genbank:AY339865.1)と同一である。最初に、hGCC-PADRE発現カセットは、Ad5のE1A領域とE1B領域(ヌクレオチド455-3512)を置換し、Ad5.F35-hGCC-PADRE複製を無能にした。第2に、Ad5.F35-hGCC-PADREはE3領域(ヌクレオチド28586-30464)の大きな欠失を有する。E3領域は、免疫抑制機能を有するいくつかのタンパク質を有する。これらのE3タンパク質は全て、Ad5.F35-hGCC-PADREにおいて欠失している。
最後に、Ad5繊維をAd35繊維に置換し、患者におけるAd5に対する既存の抗体によるベクターの中和を最小化する。
Ad5.F35-hGCC-PADRE DNAコンストラクト作製
hGCC-PADREコード配列を合成し、開始ATGのすぐ5'側のコザック配列(GCCGCCACC)とPADRE配列の直後の2つの終止コドンを保有するように合成した。hGCC-PADREコンストラクトをpShuttleベクターにサブクローニングし、次いでAd5.F35ベクターに再結合した。Ad5.F35は、左右の逆末端反復(ITR)、パッケージングのためのカプセル化シグナル、E2及びE4領域及び後期遺伝子を含む、複製不能なアデノウイルスを生成するのに必要な全ての要素をコードするヒトAd5配列を保有する。該プラスミドはE1及びE3タンパク質を欠いており、繊維をAd35繊維で置き換える。
hGCC-PADREコード配列を合成し、開始ATGのすぐ5'側のコザック配列(GCCGCCACC)とPADRE配列の直後の2つの終止コドンを保有するように合成した。hGCC-PADREコンストラクトをpShuttleベクターにサブクローニングし、次いでAd5.F35ベクターに再結合した。Ad5.F35は、左右の逆末端反復(ITR)、パッケージングのためのカプセル化シグナル、E2及びE4領域及び後期遺伝子を含む、複製不能なアデノウイルスを生成するのに必要な全ての要素をコードするヒトAd5配列を保有する。該プラスミドはE1及びE3タンパク質を欠いており、繊維をAd35繊維で置き換える。
Ad5.F35-hGCC-PADREの調製、構造、及び組成
アデノウイルスベクターAd5.F35-hGCC-PADREのマスターウイルスバンクは、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学細胞遺伝子治療センター(CAGT)のベクター生成施設(VPF)で、GMP条件下で生成された。
アデノウイルスベクターAd5.F35-hGCC-PADREのマスターウイルスバンクは、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学細胞遺伝子治療センター(CAGT)のベクター生成施設(VPF)で、GMP条件下で生成された。
組換えアデノウイルスベクターを、ウイルス複製に必要なE1遺伝子を保有するHEK293細胞内で生成した。生存可能なAd5.F35-hGCC-PADREウイルスが形成され、収集した。該ウイルスを、HEK293細胞において2回プラーク精製した。個々のプラークをhGCC-PADRE DNAの存在について試験し、hGCC-PADREカセット精度について配列決定し、インビトロで細胞に感染させたときにhGCC-PADREタンパク質を生成する能力について試験した。次いで、プラーク精製ベクターを組織培養フラスコ内のHEK293細胞で増殖させ、さらに10層の細胞培養室(cell factories)を用いて増幅した。大規模増幅後、Ad5.F35-hGCC-PADREをCsClのバンディングにより精製した。Ad5.F35-hGCC-PADREマスターウイルスバンク(MVB)を完全に配列決定した。MVBの一部は、この試験の一環として対象投与のために小分けした。
実施例3
ワクチン接種プロトコル
使用されるべきAd5.F35-hGCC-PADREワクチンは、GCC-PADRE発現カセットを保有する組換え複製欠損E1/E3欠失Ad5.F35ウイルスで構成されている。このワクチンベクターは、組換えヒト5型アデノウイルス(rAd5)を使用し、rAd5はベクターの初期E1及びE3領域の欠失を保有し、GCC-PADREカセットの挿入を可能にする。E1/E3の欠失は、ウイルス複製を無能にし、その臨床使用に関連する安全性を高める。
ワクチン接種プロトコル
使用されるべきAd5.F35-hGCC-PADREワクチンは、GCC-PADRE発現カセットを保有する組換え複製欠損E1/E3欠失Ad5.F35ウイルスで構成されている。このワクチンベクターは、組換えヒト5型アデノウイルス(rAd5)を使用し、rAd5はベクターの初期E1及びE3領域の欠失を保有し、GCC-PADREカセットの挿入を可能にする。E1/E3の欠失は、ウイルス複製を無能にし、その臨床使用に関連する安全性を高める。
TG緩衝液(20mM Tris-HCl、pH8.0、25mMのNaCl、2.5%グリセロール)に配合したAd5.F35-hGCC-PADRE:1011、1012、又は5×1012ウイルス粒子を、根治手術及び標準的なアジュバント療法後に再発の危険性がある選択された固形腫瘍(結腸直腸、膵臓、胃、又は食道)を有するヒト患者に筋肉内投与する。投与を3回施す。投与間隔は4週間隔である。
Ad5.F35-hGCC-PADREに対する対象の細胞(T細胞)応答及びGCCに対する体液性免疫応答を、最初のワクチン接種後5、9及び14週目に評価する。Ad5に対する既存の中和抗体の効果は、以前に観察されたものよりも低下する。
実施例4
根治手術及び標準療法後の再発リスクがある胃腸腺癌の成人におけるAd5.F35-hGCC-PADREワクチンの第2A相用量発見試験
これは、外科的切除及び標準的なアジュバント療法を受けた胃腸(GI)悪性腫瘍(膵臓、結腸直腸、食道、及び胃の腺癌)に対するワクチンとしてのAd5.F35-hGCC-PADREの非盲検用量発見第2A相試験である。患者は、Ad5.F35-hGCC-PADREの3用量レベルのうちの1用量で筋肉内に複数回投与される。GCCに対する治療関連の毒性及び免疫応答の発達は、最初(1週目)のワクチン接種後の5週目、9週目、及び13週目に評価される。主要安全性評価項目は、有害事象(AE)、注射部位反応及び安全性実験室試験における臨床的に有意な変化を検査する。主要な有効性エンドポイントには、異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012ウイルス粒子すなわちvp)でのGCC特異的T細胞応答の発達が含まれる。
根治手術及び標準療法後の再発リスクがある胃腸腺癌の成人におけるAd5.F35-hGCC-PADREワクチンの第2A相用量発見試験
これは、外科的切除及び標準的なアジュバント療法を受けた胃腸(GI)悪性腫瘍(膵臓、結腸直腸、食道、及び胃の腺癌)に対するワクチンとしてのAd5.F35-hGCC-PADREの非盲検用量発見第2A相試験である。患者は、Ad5.F35-hGCC-PADREの3用量レベルのうちの1用量で筋肉内に複数回投与される。GCCに対する治療関連の毒性及び免疫応答の発達は、最初(1週目)のワクチン接種後の5週目、9週目、及び13週目に評価される。主要安全性評価項目は、有害事象(AE)、注射部位反応及び安全性実験室試験における臨床的に有意な変化を検査する。主要な有効性エンドポイントには、異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012ウイルス粒子すなわちvp)でのGCC特異的T細胞応答の発達が含まれる。
目的
本研究の主な目的は以下のとおりである。
1)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、4週間隔で3用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)で筋肉内(IM)に送達される逐次Ad5.F35-hGCC-PADREワクチン投与の安全性及び忍容性を評価する。
2)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスクの結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、筋肉内(IM)投与を4週間隔で3回連続投与として、3つの異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)でAd5.F35-hGCC-PADREに対する細胞(T細胞)応答を評価する。
本研究の主な目的は以下のとおりである。
1)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、4週間隔で3用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)で筋肉内(IM)に送達される逐次Ad5.F35-hGCC-PADREワクチン投与の安全性及び忍容性を評価する。
2)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスクの結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、筋肉内(IM)投与を4週間隔で3回連続投与として、3つの異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)でAd5.F35-hGCC-PADREに対する細胞(T細胞)応答を評価する。
観察された目標には、以下のものが含まれる:
1)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、又は食道の腺癌を有する対象において、4週間隔で3つの連続用量としてIM投与される3つの異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)でのAd5.F35-hGCC-PADREに対する体液性(抗体)応答を評価する。
2)Ad5に対する中和抗体と免疫学的応答との関連を評価する。
3)腫瘍におけるGCCタンパク質発現に対する免疫応答の相関を評価し、免疫寛容を評価する。
4)無病生存期間(DFS)を評価する。
5)可能な場合は、全生存期間(OS)を評価する。
1)手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、又は食道の腺癌を有する対象において、4週間隔で3つの連続用量としてIM投与される3つの異なる用量レベル(1011、1012、及び5×1012vp)でのAd5.F35-hGCC-PADREに対する体液性(抗体)応答を評価する。
2)Ad5に対する中和抗体と免疫学的応答との関連を評価する。
3)腫瘍におけるGCCタンパク質発現に対する免疫応答の相関を評価し、免疫寛容を評価する。
4)無病生存期間(DFS)を評価する。
5)可能な場合は、全生存期間(OS)を評価する。
集団
標的の最終試料サイズは、評価可能な応答データを有する72人の対象である。全ての適格基準を満たすGI腺癌を有する最大81人の対象が登録される。1ヶ月あたり約3名の患者の登録を期待する。15人の患者が治療を完了した後に各アームで無益な分析が行われると、その時点でアームを中止する可能性がある。そのため、最小試料サイズは45である。
標的の最終試料サイズは、評価可能な応答データを有する72人の対象である。全ての適格基準を満たすGI腺癌を有する最大81人の対象が登録される。1ヶ月あたり約3名の患者の登録を期待する。15人の患者が治療を完了した後に各アームで無益な分析が行われると、その時点でアームを中止する可能性がある。そのため、最小試料サイズは45である。
プロトコル
TG緩衝液(20mM Tris-HCl、pH8.0、25mMのNaCl、2.5%グリセロール)で製剤化され、筋肉内投与されるAd5.F35-hGCC-PADRE:1011、1012、又は5×1012ウイルス粒子。
TG緩衝液(20mM Tris-HCl、pH8.0、25mMのNaCl、2.5%グリセロール)で製剤化され、筋肉内投与されるAd5.F35-hGCC-PADRE:1011、1012、又は5×1012ウイルス粒子。
この研究には、最低45人、最大81人の対象が登録される。対象は、腫瘍の種類及び外科的切除マージン(R0すなわち陰性切除マージン対R1すなわち陽性切除マージン)に従って層別化された3つの治療アームのうちの1つに無作為化される。治療アームAは、4週間隔で3回の1011vpワクチン投与を受ける。治療アームBは、4週間隔で3回の1012vpワクチン投与を受ける。治療アームCは、4週間隔で3回の5×1012vpワクチン投与を受ける。対象は各治療アームに無作為化され、有害事象の継続的な監視と同時に治療を開始する。
免疫応答及び安全性に関する13週間の試験評価の完了後、対象は、その後の癌関連療法、少なくとも24ヶ月間の経過観察のDFS率、再発又は死亡のどちらが最初に生じるかについて電話又は任意選択の診療所訪問によって経過観察される。
治療サイクル(すなわち、3回の投与)期間は9週間である。対象は、最終試験投与後4週目まで治療期間中に検討され、その後、死亡、早期中止、又は経過観察の完了まで経過観察される。対象は、全ての対象が少なくとも24ヶ月の経過観察又は死亡に達するまで、研究期間中経過観察される。研究の終了時に、残りの全ての対象は、長期経過観察プロトコルへの登録を申し出される。
序論
背景情報
本研究は、胃腸(GI)管の固形腫瘍を有し、根治手術及び/又は標準療法後に再発のリスクが高い対象に行われる。対象集団には、研究適格基準を満たす結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する個人が含まれる。
背景情報
本研究は、胃腸(GI)管の固形腫瘍を有し、根治手術及び/又は標準療法後に再発のリスクが高い対象に行われる。対象集団には、研究適格基準を満たす結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する個人が含まれる。
膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌の疫学と現在の治療
膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌はそれぞれ、検出と治療の改善にもかかわらず、米国で引き続き癌の主な負担となっている。いずれの場合も、かなりの数の患者が治癒を試みて外科的切除及び標準療法を受けるが、ごく一部(疾患組織学、病期、及び他の要因によって異なる)が寛解中に残る。これらの場合における化学療法及び/又は放射線療法の形態のアジュバント療法は、全体的な臨床転帰を改善する。しかし、特に高リスクの特徴を有する患者にとっては、さらなる改善の余地が大きい。
膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌はそれぞれ、検出と治療の改善にもかかわらず、米国で引き続き癌の主な負担となっている。いずれの場合も、かなりの数の患者が治癒を試みて外科的切除及び標準療法を受けるが、ごく一部(疾患組織学、病期、及び他の要因によって異なる)が寛解中に残る。これらの場合における化学療法及び/又は放射線療法の形態のアジュバント療法は、全体的な臨床転帰を改善する。しかし、特に高リスクの特徴を有する患者にとっては、さらなる改善の余地が大きい。
GI悪性腫瘍は、2016年に米国における癌関連死の26%に関与した。結腸直腸癌は4番目に最も一般的で2番目に最も致死的な癌であったが、膵臓癌、食道癌及び胃癌は、2016年に米国で3番目、10番目及び16番目に高い推定癌関連死亡率を有していた。GI悪性腫瘍の5年相対生存率は疾患ステージによって異なる。一般的に、膵臓腺癌は全ステージで最悪の5年生存率(7%)を有するが、ステージ4疾患(遠隔転移)については2%、局所的に広がる疾患については11%、限局性疾患については27%である。外分泌膵臓腺癌の大部分(>80%)は、もはや外科的切除に適さず、推定生存期間中央値が3~6ヶ月である局所転移又は遠隔転移の発症まで診断されない2。外科的に切除された膵臓腺癌の推定生存期間中央値は18ヶ月であるが、患者のわずか20%のみが5年生存する。
限局性膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌を有し、それでもなお再発のリスクが高いと考えられている患者の場合、治療法の柱は、手術、化学療法、及び照射を伴い得る。モノクローナル抗体による補助療法は、結腸直腸癌及び食道癌においても使用される。黒色腫、前立腺癌、及び非小細胞肺癌の患者において有用性を確立した免疫療法は、再発のリスクを低減する手段として、異なる設定でますます研究されている。
この研究は、3つの用量レベルで筋肉内(IM)に順次送達する新規ワクチン免疫療法を評価し、忍容性が高く、細胞性免疫応答を誘導するのに最も適した用量を特定することを目的としている。このワクチンの究極の治療目標は、臨床開発の後期段階で、GI腺癌の対象における再発のリスクを低減することである。
膵臓腺癌と利用可能な治療法
2014年に膵臓腺癌と診断された推定46,000人のアメリカ人のうち、約20%が切除可能と考えられている。手術からの回復後、アジュバント療法の主なモダリティは、カペシタビンとゲムシタビン又はイリノテカン及びオキサリプラチンと5-フルオロウラシル(改変FOLFIRNOX)などの化学療法である8。化学療法が最良の支持療法よりも優れており、ハザード比が約0.60で死亡率が約3分の1低下していることは十分に確立されている9。ゲムシタビン単独グループにおける3年目の21.4%の無病生存率と比較して、改変FOLFIRNOX投与計画は、3年無病生存率を39.7%に改善する一方で、ゲムシタビン単独グループの48.6%と比較して、全生存率を63.4%に改善した8。しかし、手術やアジュバント療法にかかわらず、患者の少なくとも80%が再発し、最終的に死亡する。生存は、病理学的特徴、術前の機能状態、手術結果、及びアジュバント療法に関連する。米国癌協会によると、合わせた膵臓癌の全ステージについて、1年相対生存率は20%であり、5年生存率は6%である。外科的切除を行うことができる場合、平均生存率は18~20ヶ月である。全体の5年生存率は約10%であるが、腫瘍が完全に除去され、癌がリンパ節に転移していない場合、20~25%に達し得る。
2014年に膵臓腺癌と診断された推定46,000人のアメリカ人のうち、約20%が切除可能と考えられている。手術からの回復後、アジュバント療法の主なモダリティは、カペシタビンとゲムシタビン又はイリノテカン及びオキサリプラチンと5-フルオロウラシル(改変FOLFIRNOX)などの化学療法である8。化学療法が最良の支持療法よりも優れており、ハザード比が約0.60で死亡率が約3分の1低下していることは十分に確立されている9。ゲムシタビン単独グループにおける3年目の21.4%の無病生存率と比較して、改変FOLFIRNOX投与計画は、3年無病生存率を39.7%に改善する一方で、ゲムシタビン単独グループの48.6%と比較して、全生存率を63.4%に改善した8。しかし、手術やアジュバント療法にかかわらず、患者の少なくとも80%が再発し、最終的に死亡する。生存は、病理学的特徴、術前の機能状態、手術結果、及びアジュバント療法に関連する。米国癌協会によると、合わせた膵臓癌の全ステージについて、1年相対生存率は20%であり、5年生存率は6%である。外科的切除を行うことができる場合、平均生存率は18~20ヶ月である。全体の5年生存率は約10%であるが、腫瘍が完全に除去され、癌がリンパ節に転移していない場合、20~25%に達し得る。
結腸直腸癌と利用可能な治療法
年間、結腸直腸癌(CRC)と診断される推定132,000人のアメリカ人のうち、約3分の2が外科的切除を受ける。5年生存率は、癌の性質及びステージに依存するが、25~70%の範囲である。
年間、結腸直腸癌(CRC)と診断される推定132,000人のアメリカ人のうち、約3分の2が外科的切除を受ける。5年生存率は、癌の性質及びステージに依存するが、25~70%の範囲である。
CRCが早期ステージで診断されると、多くの場合、手術だけで治癒することができる。後期ステージでは、依然として治癒は手術により可能であると考えられており、フルオロウラシル、フルオロピリミジン、カペシタビン、又はオキサリプラチンの形態の化学療法がアジュバント療法として使用される場合が多い。2つの研究により、術後アジュバント療法を受けた場合に、10~15%の3年生存率の上昇が見出される一方で、他の研究でもアジュバント治療からある程度の有益な恩恵が得られた。
外科的治療とアジュバント治療の両方及び早期診断における最近の改善により、外科的切除を受ける患者の3年間のDFSが増加している。VEGF及びEGFRに対するモノクローナル抗体の形態の標的療法も、進行した疾患を有する患者に利用可能である4が、治癒率は低いままであり、再発率が高い。ニボルマブ(Opdivo(登録商標))及びペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))の2つの抗PD-1チェックポイント免疫療法は、高いマイクロサテライト不安定性(MSI-hi)を特徴とする進行した再発腫瘍を有する結腸直腸癌患者に対しても承認されているが、これらの療法による全体的な奏効率は依然として低いままである。
胃癌と利用可能な治療法
推定25,000人のアメリカ人が毎年胃癌と診断される。初期ステージの癌患者の大多数は外科的に切除可能な疾患を有する-限局性遠位胃癌では、患者の50%以上が治癒し得る。しかし、初期ステージの疾患は、米国で診断された全ての症例のわずか10~20%を占める。5年目のOS率の範囲は、播種性疾患患者の生存率のほとんど0から、切除可能な局所疾患を有する限局性遠位胃癌患者の生存率の約50%までである。アジュバント療法の臨床的利点は議論されてきたが、最近の研究は潜在的な利益を示す。ある研究では、アジュバント治療を受けた患者はカペシタビン及びオキサリプラチンを投与され、ハザード比が0.58で、5年DFSが改善された。アジュバントフルオロピリミジンを用いた別の研究では、治療グループは最初の1年以内に手術のみと比較して10%の生存率の増加を示すことが判明した。アジュバント療法の有無にかかわらず、現在の治療は、近位胃癌患者において平均10~15%の平均5年生存率をもたらし、切除された患者において50%以上の癌再発をもたらし、現在の治療投与計画の有効性が不十分であることが示唆される。さらに、抗PD-1チェックポイント免疫療法であるペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))が、奏効率は低いものの、進行したPD-L1陽性胃癌患者に対して最近承認された。
推定25,000人のアメリカ人が毎年胃癌と診断される。初期ステージの癌患者の大多数は外科的に切除可能な疾患を有する-限局性遠位胃癌では、患者の50%以上が治癒し得る。しかし、初期ステージの疾患は、米国で診断された全ての症例のわずか10~20%を占める。5年目のOS率の範囲は、播種性疾患患者の生存率のほとんど0から、切除可能な局所疾患を有する限局性遠位胃癌患者の生存率の約50%までである。アジュバント療法の臨床的利点は議論されてきたが、最近の研究は潜在的な利益を示す。ある研究では、アジュバント治療を受けた患者はカペシタビン及びオキサリプラチンを投与され、ハザード比が0.58で、5年DFSが改善された。アジュバントフルオロピリミジンを用いた別の研究では、治療グループは最初の1年以内に手術のみと比較して10%の生存率の増加を示すことが判明した。アジュバント療法の有無にかかわらず、現在の治療は、近位胃癌患者において平均10~15%の平均5年生存率をもたらし、切除された患者において50%以上の癌再発をもたらし、現在の治療投与計画の有効性が不十分であることが示唆される。さらに、抗PD-1チェックポイント免疫療法であるペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))が、奏効率は低いものの、進行したPD-L1陽性胃癌患者に対して最近承認された。
食道癌と利用可能な治療法
国立癌研究所(Cancer.gov)によると、2017年には推定16,940人が食道癌と診断され、15,690人が死亡する。およそ、半分は切除可能な腫瘍を有する。平均して、患者の18.8%が診断後5年間生存するが、5年生存率は遠位疾患患者では4.6%に急激に低下する。食道切除術は依然として臨床的に局在する食道癌の礎となる治療法であるが、この疾患の性質は手術の失敗のみに起因する。食道の扁平上皮癌では、ネオアジュバントシスプラチンは生存率の改善をもたらすことは見出されなかったが、ネオアジュバントシスプラチン及びフルオロウラシルは5年DFSを10%増加させた。対照的に、食道腺癌におけるネオアジュバント化学療法(カルボプラチン&パクリタキセル)及び放射線療法は、手術単独グループでは24ヶ月であったのに対し、OSの中央値は49.4ヶ月であった。他の研究も、胃又は胃食道接合部の腺癌を有する患者におけるエピルビシン、5-フルオロウラシル及び/又はシスプラチンによるネオアジュバント化学療法の有益な効果を見出した。加えて、HER2を過剰発現する少数の食道癌のHER2を標的とし、VEGF経路を標的にして血管新生を阻害する抗体療法が食道癌の治療に登場した4。ネオアジュバント化学放射線療法の13件のランダム化比較試験の最近のメタ分析は、手術のみと比較して、0.78のプールされたハザード比を示し、8.7%の2年目での絶対生存利益及び11の治療が必要な数に対応する。食道癌におけるネオアジュバント療法の効果は、最良の支持療法と比較して一般的に有益であるが、再発は依然として高く、多くの患者が最終的に死亡する。胃癌と同様に、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))の抗PD-1チェックポイント免疫療法は、胃食道接合部のPD-L1陽性癌の患者に対して最近承認されたが、奏効率は低い。この疾患の発生率及び予後を考慮すると、疾患転帰を改善するためには、副作用を最小限に抑えた効果的なアジュバントが必要である。
国立癌研究所(Cancer.gov)によると、2017年には推定16,940人が食道癌と診断され、15,690人が死亡する。およそ、半分は切除可能な腫瘍を有する。平均して、患者の18.8%が診断後5年間生存するが、5年生存率は遠位疾患患者では4.6%に急激に低下する。食道切除術は依然として臨床的に局在する食道癌の礎となる治療法であるが、この疾患の性質は手術の失敗のみに起因する。食道の扁平上皮癌では、ネオアジュバントシスプラチンは生存率の改善をもたらすことは見出されなかったが、ネオアジュバントシスプラチン及びフルオロウラシルは5年DFSを10%増加させた。対照的に、食道腺癌におけるネオアジュバント化学療法(カルボプラチン&パクリタキセル)及び放射線療法は、手術単独グループでは24ヶ月であったのに対し、OSの中央値は49.4ヶ月であった。他の研究も、胃又は胃食道接合部の腺癌を有する患者におけるエピルビシン、5-フルオロウラシル及び/又はシスプラチンによるネオアジュバント化学療法の有益な効果を見出した。加えて、HER2を過剰発現する少数の食道癌のHER2を標的とし、VEGF経路を標的にして血管新生を阻害する抗体療法が食道癌の治療に登場した4。ネオアジュバント化学放射線療法の13件のランダム化比較試験の最近のメタ分析は、手術のみと比較して、0.78のプールされたハザード比を示し、8.7%の2年目での絶対生存利益及び11の治療が必要な数に対応する。食道癌におけるネオアジュバント療法の効果は、最良の支持療法と比較して一般的に有益であるが、再発は依然として高く、多くの患者が最終的に死亡する。胃癌と同様に、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))の抗PD-1チェックポイント免疫療法は、胃食道接合部のPD-L1陽性癌の患者に対して最近承認されたが、奏効率は低い。この疾患の発生率及び予後を考慮すると、疾患転帰を改善するためには、副作用を最小限に抑えた効果的なアジュバントが必要である。
提案された研究の理論的根拠
結腸癌における腫瘍関連抗原としてのグアニリルシクラーゼC(GCC)
環状GMP(cGMP)を合成する相同タンパク質ファミリーの1つであるグアニリルシクラーゼC(GCC又はGUCY2C)は、腸上皮細胞によって特異的に発現する。GCCは、パラクリンホルモンのグアニリン及びウログアニリン及び下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン(ST)の受容体であり、その細胞外ドメインとの相互作用は細胞質触媒ドメインを活性化し、cGMP蓄積を誘導する。触媒ドメインはファミリーメンバー間で約50%の相同性を共有しているが、GCCの細胞外ドメインは20%未満の相同性を示し、抗原的にユニークな構造を作り出している。GCCは正常な腸の500超の試料で検出されているが、1,000超の胃腸外組織では検出されていない。さらに、腸上皮細胞において、GCCは、粘膜壁の「外側」の頂端ブラシ境界膜に特異的に局在する。この解剖学的及び機能的区画化は、通常、GCCが粘膜に制限されていることを示唆しており、放射性リガンドイメージング及び生体分布及び免疫学的研究によって確認される。重要なことに、GCCタンパク質(200超の検体)及び/又はmRNA(900超の検体)は、ほぼ全ての原発性及び転移性ヒト結腸直腸腫瘍において検出され、解剖学的位置又は悪性度にかかわらず、腫瘍細胞によって均一に発現しているが、GI外腫瘍(200超)では検出されなかった。また、GCCは結腸直腸腫瘍の80%超で過剰発現している。腸細胞による発現のストリンジェンシー及び転移によるユニバーサル過剰発現は、pN0患者を病期分類するためのマーカーとしてのGCCの有用性によって強調される。
結腸癌における腫瘍関連抗原としてのグアニリルシクラーゼC(GCC)
環状GMP(cGMP)を合成する相同タンパク質ファミリーの1つであるグアニリルシクラーゼC(GCC又はGUCY2C)は、腸上皮細胞によって特異的に発現する。GCCは、パラクリンホルモンのグアニリン及びウログアニリン及び下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン(ST)の受容体であり、その細胞外ドメインとの相互作用は細胞質触媒ドメインを活性化し、cGMP蓄積を誘導する。触媒ドメインはファミリーメンバー間で約50%の相同性を共有しているが、GCCの細胞外ドメインは20%未満の相同性を示し、抗原的にユニークな構造を作り出している。GCCは正常な腸の500超の試料で検出されているが、1,000超の胃腸外組織では検出されていない。さらに、腸上皮細胞において、GCCは、粘膜壁の「外側」の頂端ブラシ境界膜に特異的に局在する。この解剖学的及び機能的区画化は、通常、GCCが粘膜に制限されていることを示唆しており、放射性リガンドイメージング及び生体分布及び免疫学的研究によって確認される。重要なことに、GCCタンパク質(200超の検体)及び/又はmRNA(900超の検体)は、ほぼ全ての原発性及び転移性ヒト結腸直腸腫瘍において検出され、解剖学的位置又は悪性度にかかわらず、腫瘍細胞によって均一に発現しているが、GI外腫瘍(200超)では検出されなかった。また、GCCは結腸直腸腫瘍の80%超で過剰発現している。腸細胞による発現のストリンジェンシー及び転移によるユニバーサル過剰発現は、pN0患者を病期分類するためのマーカーとしてのGCCの有用性によって強調される。
膵臓癌、胃癌及び食道癌におけるGCC
GCCは、通常、腸上皮細胞で発現し、発現は、局所と転移の両方の設定で結腸直腸の腫瘍性形質転換中に保持される。加えて、GCCは、膵臓癌、胃癌、及び食道癌の約60%において発現することが見出される。GCCの上皮密着結合、細胞極性及び頂端局在の破壊により、正常組織に影響を与えないまま、それは腫瘍組織における全身性薬剤の所望の標的となる。
GCCは、通常、腸上皮細胞で発現し、発現は、局所と転移の両方の設定で結腸直腸の腫瘍性形質転換中に保持される。加えて、GCCは、膵臓癌、胃癌、及び食道癌の約60%において発現することが見出される。GCCの上皮密着結合、細胞極性及び頂端局在の破壊により、正常組織に影響を与えないまま、それは腫瘍組織における全身性薬剤の所望の標的となる。
Ad5.F35-hGCC-PADREワクチン
Ad5-hGCC-PADREを用いた前臨床試験
前臨床試験では、マウスGCCを組み込んだAd5ベクターワクチンがマウスにおいてGCC特異的免疫応答(抗体及び細胞傷害性T細胞)を生成することを実証した。これらの応答は耐久性があり、予防接種後数ヶ月持続する。加えて、ワクチンによって誘導されるGCC特異的細胞傷害性T細胞は、インビトロでGCC発現CRC細胞を死滅させることができる。肺又は肝臓で増殖するGCC発現転移性結腸直腸腫瘍を有するマウスは、GCCワクチン接種によって保護される:GCCワクチン接種は、検出可能な転移性腫瘍の数を減少させ(又は排除し)、動物の生存率を大幅に改善する。重要なことに、これらの免疫応答は転移性CRCを選択的に標的とするが、GCCを発現する正常な腸組織を標的とせず、腸の病理も引き起こさない。そのため、GCC標的ワクチン接種は、マウスモデルにおける転移性CRCを予防/治療することができるGCC特異的免疫応答を誘導するが、有害作用を引き起こすことなくそうする。この標的化治療は、有効性が低く、かなりのオフターゲット毒性を引き起こす確立された癌治療法と比較して、臨床的に非常に有利であることが期待されている。
Ad5-hGCC-PADREを用いた前臨床試験
前臨床試験では、マウスGCCを組み込んだAd5ベクターワクチンがマウスにおいてGCC特異的免疫応答(抗体及び細胞傷害性T細胞)を生成することを実証した。これらの応答は耐久性があり、予防接種後数ヶ月持続する。加えて、ワクチンによって誘導されるGCC特異的細胞傷害性T細胞は、インビトロでGCC発現CRC細胞を死滅させることができる。肺又は肝臓で増殖するGCC発現転移性結腸直腸腫瘍を有するマウスは、GCCワクチン接種によって保護される:GCCワクチン接種は、検出可能な転移性腫瘍の数を減少させ(又は排除し)、動物の生存率を大幅に改善する。重要なことに、これらの免疫応答は転移性CRCを選択的に標的とするが、GCCを発現する正常な腸組織を標的とせず、腸の病理も引き起こさない。そのため、GCC標的ワクチン接種は、マウスモデルにおける転移性CRCを予防/治療することができるGCC特異的免疫応答を誘導するが、有害作用を引き起こすことなくそうする。この標的化治療は、有効性が低く、かなりのオフターゲット毒性を引き起こす確立された癌治療法と比較して、臨床的に非常に有利であることが期待されている。
Ad5-hGCC-PADREワクチンの現在までの臨床データ
Ad5-hGCC-PADREワクチンは、初期ステージの結腸直腸癌患者におけるAd5-hGCC-PADREの安全性及び免疫原性を決定するために、非盲検、単一アーム、単回投与の実現可能性試験においてヒトで最初に評価された(ClinicalTrials.gov NCT01972737)。対象に、Ad5-hGCC-PADREの10個の粒子を単回筋肉内注射した。
Ad5-hGCC-PADREワクチンは、初期ステージの結腸直腸癌患者におけるAd5-hGCC-PADREの安全性及び免疫原性を決定するために、非盲検、単一アーム、単回投与の実現可能性試験においてヒトで最初に評価された(ClinicalTrials.gov NCT01972737)。対象に、Ad5-hGCC-PADREの10個の粒子を単回筋肉内注射した。
安全性データ
本試験の対象を注射後30分間、10分ごとに診療所で、及びワクチン接種後3日目及び8日目に電話で急性事象について評価した。患者はまた、安全性評価のためにワクチン接種の30日後、90日後、及び180日後に診療所に戻った。有害事象をCTCAEバージョン5.0に従って段階分けした。Ad5-hGCC-PADREを投与された10人の対象のうち、10人(100%)がAEを経験した。最も頻繁に報告されたワクチン関連AEは、悪寒/硬直(20%)、注射部位の痛み/腫れ(20%)、めまい(10%)、発汗(10%)、痛み(10%)及び発熱(10%)であった。重篤な有害事象(SAE)はなく、試験中に死亡した対象もいなかった。
本試験の対象を注射後30分間、10分ごとに診療所で、及びワクチン接種後3日目及び8日目に電話で急性事象について評価した。患者はまた、安全性評価のためにワクチン接種の30日後、90日後、及び180日後に診療所に戻った。有害事象をCTCAEバージョン5.0に従って段階分けした。Ad5-hGCC-PADREを投与された10人の対象のうち、10人(100%)がAEを経験した。最も頻繁に報告されたワクチン関連AEは、悪寒/硬直(20%)、注射部位の痛み/腫れ(20%)、めまい(10%)、発汗(10%)、痛み(10%)及び発熱(10%)であった。重篤な有害事象(SAE)はなく、試験中に死亡した対象もいなかった。
全てのAEはグレード1であり、ワクチン接種後の6ヶ月の経過観察期間中、グレード3/4の毒性は発生しなかった。さらに、差次的、包括的化学パネル、及び抗核抗体(ANA)力価と共に、CBCを含む30日目、90日目、及び180日目に実施した実験室評価では、臨床的に関連する変化は認められなかった。同様の治療法で報告された臨床経験に基づいて、注射部位の痛み及び発熱などの軽度のグレード1/2毒性がウイルスベクター免疫後に予想され、幾人かの患者で観察された。重要なことに、GCC発現組織における毒性に関連する有害事象は観察されなかった。GCCは、小腸上皮及び大腸上皮の管腔表面並びに食欲不振誘発性視床下部ニューロンで発現する自己タンパク質である。しかし、免疫区画化を制御する機構及びGCCワクチン接種の前臨床試験と一致して、GCCを発現する腸又は脳組織においてAd5-hGCC-PADREに誘導される自己免疫の証拠はなかった。
免疫原性データ
前臨床試験では、Ad5-hGCC-PADREによる免疫は、時間及び用量依存性のGCC特異的T細胞及びB細胞応答並びにCD8+ T細胞によって媒介される抗腫瘍免疫を誘導した。臨床試験では、Ad5-hGCC-PADRE投与後のGCC特異的免疫応答をELISA及びIFNγ-ELISpotにより定量し、抗体及びT細胞応答をそれぞれ定量した。PADRE及びAd5に対するT細胞応答も、IFNγ-ELISpotにより定量した。患者の免疫応答は、典型的には、4つのパターンのうちの1つに従った:
1)GCCに対するワクチン接種前抗体応答又はGCC、PADRE、若しくはAd5及びAd5-hGCC-PADREワクチン接種に対するT細胞免疫がないと、いずれの抗原に対する標的化応答も誘導されなかった。
2)ワクチン接種前の応答はなく、ワクチン接種によりAd5特異的T細胞応答が誘導されたが、GCC特異的又はPADRE特異的応答は誘導されなかった。
3)Ad5-hGCC-PADREワクチン接種により、GCC特異的T細胞応答が誘導された。GCC特異的抗体応答が外因性CD4+「ヘルパー」T細胞エピトープに対する応答を必要とする動物試験と類似してPADRE特異的T細胞応答又はGCC特異的抗体応答がないことは、GCC特異的CD4+T細胞耐性を反映する。
4)適応免疫の3つのアーム全てによるワクチン誘発応答:PADRE特異的CD4+T細胞応答、GCC特異的抗体応答、及びGCC特異的CD8+ T細胞応答。
前臨床試験では、Ad5-hGCC-PADREによる免疫は、時間及び用量依存性のGCC特異的T細胞及びB細胞応答並びにCD8+ T細胞によって媒介される抗腫瘍免疫を誘導した。臨床試験では、Ad5-hGCC-PADRE投与後のGCC特異的免疫応答をELISA及びIFNγ-ELISpotにより定量し、抗体及びT細胞応答をそれぞれ定量した。PADRE及びAd5に対するT細胞応答も、IFNγ-ELISpotにより定量した。患者の免疫応答は、典型的には、4つのパターンのうちの1つに従った:
1)GCCに対するワクチン接種前抗体応答又はGCC、PADRE、若しくはAd5及びAd5-hGCC-PADREワクチン接種に対するT細胞免疫がないと、いずれの抗原に対する標的化応答も誘導されなかった。
2)ワクチン接種前の応答はなく、ワクチン接種によりAd5特異的T細胞応答が誘導されたが、GCC特異的又はPADRE特異的応答は誘導されなかった。
3)Ad5-hGCC-PADREワクチン接種により、GCC特異的T細胞応答が誘導された。GCC特異的抗体応答が外因性CD4+「ヘルパー」T細胞エピトープに対する応答を必要とする動物試験と類似してPADRE特異的T細胞応答又はGCC特異的抗体応答がないことは、GCC特異的CD4+T細胞耐性を反映する。
4)適応免疫の3つのアーム全てによるワクチン誘発応答:PADRE特異的CD4+T細胞応答、GCC特異的抗体応答、及びGCC特異的CD8+ T細胞応答。
Ad5 nAbはAd5-hGCC-PADRE免疫原性を制限する
Ad5は、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症を生じさせる天然のヒト病原体である。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を防止することによって再感染又はAd5ベースのワクチン接種を防止するAd5特異的中和抗体(nAb)を誘導する。Ad5 nAbを、Ad5-GFPレポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いてAd5-hGCC-PADREワクチン接種(0日目)前に採取した患者血清中で定量した。力価は10未満~10,000超の範囲であり、患者の半数が200をはるかに下回る力価(Ad5 nAb低)を有し、残りの半分が200をはるかに上回る力価(Ad5 nAb高)を有するという明らかなパターンが現れた。患者をAd5 nAb低コホートと高コホートに分けたところ、Ad5 nAb力価とGCC特異的T細胞応答との間の関係が明らかになり、応答はAd5 nAb低患者で有意に大きかった。PADRE特異的T細胞応答は一般的に低かったが、事前治療Ad5 nAb力価との関係を示さなかった。GCC特異的T細胞応答と同様に、Ad5特異的T細胞応答も、Ad5 nAb高グループにおいてAd5 nAbによって制限された。まとめると、これらのデータは、既存のAd5 nAb免疫が宿主細胞に入る前にインビボでAd5-hGCC-PADREウイルス粒子を排除し、その後の遺伝子発現及び宿主免疫応答の誘導を妨げることを実証する非臨床データ77と一致している。
Ad5は、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症を生じさせる天然のヒト病原体である。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を防止することによって再感染又はAd5ベースのワクチン接種を防止するAd5特異的中和抗体(nAb)を誘導する。Ad5 nAbを、Ad5-GFPレポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いてAd5-hGCC-PADREワクチン接種(0日目)前に採取した患者血清中で定量した。力価は10未満~10,000超の範囲であり、患者の半数が200をはるかに下回る力価(Ad5 nAb低)を有し、残りの半分が200をはるかに上回る力価(Ad5 nAb高)を有するという明らかなパターンが現れた。患者をAd5 nAb低コホートと高コホートに分けたところ、Ad5 nAb力価とGCC特異的T細胞応答との間の関係が明らかになり、応答はAd5 nAb低患者で有意に大きかった。PADRE特異的T細胞応答は一般的に低かったが、事前治療Ad5 nAb力価との関係を示さなかった。GCC特異的T細胞応答と同様に、Ad5特異的T細胞応答も、Ad5 nAb高グループにおいてAd5 nAbによって制限された。まとめると、これらのデータは、既存のAd5 nAb免疫が宿主細胞に入る前にインビボでAd5-hGCC-PADREウイルス粒子を排除し、その後の遺伝子発現及び宿主免疫応答の誘導を妨げることを実証する非臨床データ77と一致している。
Ad5.F35-hGCC-PADREの論理的根拠
Ad5 nAbは、米国において約40%を含むほとんどのヒト集団において一般的であり(Nwanegbo,E.ら(2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357.;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)、Ad5ベースのワクチンの免疫原性を低下させる(Priddy,F.H.ら(2008).Clin Infect Dis 46(11):1769-1781))。重要なことに、ほとんどの天然に存在するAd5 nAbは、Ad5の表面上の繊維分子を標的としている(Cheng,C.ら(2010) J Virol 84(1):630-638)。Ad5とは対照的に、ほとんどの国におけるAd35特異的抗体の血清有病率は非常に低い(<10%,Nwanegbo,E.ら(2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)。まとめると、これらの観察結果は、Ad5の繊維分子をAd35の繊維分子で置き換えると、天然に存在するAd5免疫の影響を受けないキメラAd5ウイルスベクター(Ad5.F35として知られる)が生成されることを示唆している。実際、既存のAd5 nAbを有する12人の患者のコホートにおいて、8人の患者(67%)の血清は、インビトロでキメラAd5.F35を中和することができなかった。さらに、Ad5-hGCC-PADREの第1相試験の対象の50%が高いAd5 nAb(力価>200)を有していたのに対し、Ad5.F35 nAbが高い対象は1/10に過ぎない(図5)。そのため、Ad5.F35は、さらなる安全リスクなしに、Ad5.F35 nAbの予想される血清有病率を25%未満に減少させることによって、Ad5と比較して有利である。Ad5.F35-GUCY2C-PADREは、公開された文献によって予測される用量漸増によって達成されなかったAd5特異的な既存免疫を克服すると予想される(Priddy,F.H.ら(2008).CL1n Infect Dis 46(11):1769-1781)。
Ad5 nAbは、米国において約40%を含むほとんどのヒト集団において一般的であり(Nwanegbo,E.ら(2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357.;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)、Ad5ベースのワクチンの免疫原性を低下させる(Priddy,F.H.ら(2008).Clin Infect Dis 46(11):1769-1781))。重要なことに、ほとんどの天然に存在するAd5 nAbは、Ad5の表面上の繊維分子を標的としている(Cheng,C.ら(2010) J Virol 84(1):630-638)。Ad5とは対照的に、ほとんどの国におけるAd35特異的抗体の血清有病率は非常に低い(<10%,Nwanegbo,E.ら(2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2):351-357;Barouch,D.H.ら(2011) Vaccine 29(32):5203-5209)。まとめると、これらの観察結果は、Ad5の繊維分子をAd35の繊維分子で置き換えると、天然に存在するAd5免疫の影響を受けないキメラAd5ウイルスベクター(Ad5.F35として知られる)が生成されることを示唆している。実際、既存のAd5 nAbを有する12人の患者のコホートにおいて、8人の患者(67%)の血清は、インビトロでキメラAd5.F35を中和することができなかった。さらに、Ad5-hGCC-PADREの第1相試験の対象の50%が高いAd5 nAb(力価>200)を有していたのに対し、Ad5.F35 nAbが高い対象は1/10に過ぎない(図5)。そのため、Ad5.F35は、さらなる安全リスクなしに、Ad5.F35 nAbの予想される血清有病率を25%未満に減少させることによって、Ad5と比較して有利である。Ad5.F35-GUCY2C-PADREは、公開された文献によって予測される用量漸増によって達成されなかったAd5特異的な既存免疫を克服すると予想される(Priddy,F.H.ら(2008).CL1n Infect Dis 46(11):1769-1781)。
免疫原性、安全性、及び生体分布プロファイルにおけるAd5ベクターとAd5.F35ベクターとの間の類似性は、公表された非臨床試験によって裏付けられている。実際、安全性プロファイルはAd5.F35の方がより良好であり得るといういくつかの兆候がある。筋肉(ワクチン接種部位)のAd5.F35導入はAd5に匹敵するが、肝臓(1000×)、脾臓(3×)、腎臓(100×)、心臓(10×)及び肺(100×)は、Ad5.F35による導入効率がAd5よりも著しく低いことを実証する。肝臓に対するAd5.F35のより低い指向性の状況では、Ad5.F35は血清炎症誘発性サイトカイン及び肝臓酵素において著しくより低い上昇をもたらし、Ad5.F35ウイルスがAd5ベクターよりも良好な安全性プロファイルを有することを示唆している。さらに、Ad5.F35ベクターは、Ad5ベクターよりもAd5 nAbに対する感受性が著しく低く、Ad5 nAb力価の高い動物における標的抗原特異的免疫応答の大きさを増加させる(200超)。そのため、Ad5.F35ベクターは、Ad5ベクターよりもAd5 nAbの状況において、より良好な生体分布、安全性、及び有効性を示す。まとめると、これらのデータは、Ad5.F35-hGCC-PADREに対する中和免疫が患者において著しく低下し、ヒト対象におけるGCC特異的T細胞応答の速度及び大きさを増加させることを示唆している。その状況において、本発明者らはAd5繊維分子をAd35繊維分子に置き換えてワクチンを改変し、キメラウイルスベクターAd5.F35を生成した。この研究では、GI悪性腫瘍患者におけるAd5.F35-hGCC-PADREの安全性、免疫原性、及び既存のnAb耐性を調べる。
Ad5.F35-hGCC-PADREの設計
Ad5.F35-hGCC-PADREワクチンは、GCC-PADRE発現カセットを保有する組換え複製欠損E1/E3欠失Ad5.F35ウイルスで構成される。このワクチンベクターは、30超のタンパク質をコードする約38kbの直鎖二本鎖DNAゲノムを有する安定な非エンベロープ正二十面体ウイルスである組換えヒト5型アデノウイルス(rAd5)を使用する。rAd5は、ベクターの初期E1領域とE3領域が欠失しており、GCC-PADREカセットの挿入を可能にする。E1/E3の欠失は、ウイルスの複製を無能にし、臨床使用に伴う安全性を高める。
Ad5.F35-hGCC-PADREワクチンは、GCC-PADRE発現カセットを保有する組換え複製欠損E1/E3欠失Ad5.F35ウイルスで構成される。このワクチンベクターは、30超のタンパク質をコードする約38kbの直鎖二本鎖DNAゲノムを有する安定な非エンベロープ正二十面体ウイルスである組換えヒト5型アデノウイルス(rAd5)を使用する。rAd5は、ベクターの初期E1領域とE3領域が欠失しており、GCC-PADREカセットの挿入を可能にする。E1/E3の欠失は、ウイルスの複製を無能にし、臨床使用に伴う安全性を高める。
GCC-PADREカセットは、ヒトGCCの細胞外ドメイン(残基1~430)とCD4+T細胞エピトープPADREからなる融合産物の発現を促進するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターで構成されている。インビボでは、Ad5.F35-hGCC-PADREベクターは、感染細胞によるGCC-PADRE免疫原の発現を誘導し、GCC及びPADREに対する免疫応答を誘導する。PADREは、GCC特異的B細胞及びCD8+ T細胞にCD4+T細胞「ヘルプ」を提供し、PADREを有していないGCCワクチン接種と比較して、前臨床モデルにおいて優れた免疫及び抗腫瘍効果をもたらすワクチンに含まれる。
Ad5.F35-hGCC-PADRE投与の論理的根拠
本発明者らの第1相試験の結果から、Ad5-hGCC-PADREワクチンに対する免疫学的応答が確認されるが、これはAd5中和抗体によって抑制された。ヒト集団における天然Ad5曝露の高い有病率と、約40%の患者に見られる結果として得られる中和抗体の発達を考慮して、本研究は、逐次用量投与、より高い用量レベル、及び/又はAd5骨格の変更(Ad5からAd5.F35)がこの障害を克服するかどうかを決定する。この手法は、より高い用量レベルが既存の高いAd5 nAb力価を克服して細胞性免疫応答をもたらすことができた他のAd5ワクチンによる結果によって支持される。
本発明者らの第1相試験の結果から、Ad5-hGCC-PADREワクチンに対する免疫学的応答が確認されるが、これはAd5中和抗体によって抑制された。ヒト集団における天然Ad5曝露の高い有病率と、約40%の患者に見られる結果として得られる中和抗体の発達を考慮して、本研究は、逐次用量投与、より高い用量レベル、及び/又はAd5骨格の変更(Ad5からAd5.F35)がこの障害を克服するかどうかを決定する。この手法は、より高い用量レベルが既存の高いAd5 nAb力価を克服して細胞性免疫応答をもたらすことができた他のAd5ワクチンによる結果によって支持される。
この研究のために選択された用量は、Ad5-hGCC-PADREワクチン及び他のAd5ベースのワクチンの臨床試験に関する以前のヒトの経験に基づいている。1×1011ウイルス粒子(vp)用量は、以前の第1相臨床試験において単回投与として試験されており、安全で忍容性があった。本研究では、計3回の注射について、4週間隔で筋肉内(IM)に投与される1×1011vp Ad5.F35-hGCC-PADREの反復投与を検討する。さらに、この研究はまた、4週間隔で3回投与される2つの追加用量レベルを調査する。まとめると、該用量は、1×1011vp、1×1012vp、及び5×1012vpである。5×1012vpの最大用量は、ワクチンの溶解性に制限があることを考慮すると、達成可能なほぼ最高用量である。
この第2A相試験で使用されたより高い用量投与計画(1×1012及び5×1012)のAd5.F35-hGCC-PADREは、ヒトにおいて以前に試験されておらず、他のアデノウイルスベースのワクチンは、同様の用量レベルで投与されており、十分に忍容性があった。同様に、GCC-PADREベクターの反復投与は臨床的に評価されていないが、他の研究では、同等の用量レベルを用いたアデノウイルスベースのワクチンの反復投与が使用されており、忍容性は十分であった。
研究内容
治験用生成物は、本研究で基準として試験又は使用されている有効成分の医薬形態として定義される。この試験で使用する活性治験用生成物であるAd5.F35-hGCC-PADREは、筋肉内注射用TG緩衝液に配合したヒトGCCタンパク質に対する複製欠損型アデノウイルスワクチンである。
治験用生成物は、本研究で基準として試験又は使用されている有効成分の医薬形態として定義される。この試験で使用する活性治験用生成物であるAd5.F35-hGCC-PADREは、筋肉内注射用TG緩衝液に配合したヒトGCCタンパク質に対する複製欠損型アデノウイルスワクチンである。
Ad5.F35-hGCC-PADREの特徴
ウイルス:アデノウイルス科;非エンベロープ、正二十面体ビリオン、直径70~90nm、二本鎖、線状DNAゲノム。野生型ウイルスは溶解性であるが、ワクチン中のE1/E3欠失バージョンは複製されない。
ウイルス:アデノウイルス科;非エンベロープ、正二十面体ビリオン、直径70~90nm、二本鎖、線状DNAゲノム。野生型ウイルスは溶解性であるが、ワクチン中のE1/E3欠失バージョンは複製されない。
病原性:Ad5.F35-hGCC-PADREは複製欠損アデノウイルスであるため、生産的な感染のリスクは低い。野生型アデノウイルス感染の症状は、発熱、鼻炎、咽頭炎、咳及び結膜炎である。アデノウイルスは、強い免疫応答をもたらすることができる。アデノウイルスは宿主細胞ゲノムに組み込まれず、Ad5.F35-hGCC-PADREは組み込みを促進する追加の特徴を持たない。Ad5.F35-hGCC-PADREによって発現する導入遺伝子は、免疫応答が生成される分泌型GCC-PADRE融合タンパク質を生成する。これらの応答は、患者において抗腫瘍活性を有することが期待される。
Ad5.F35-hGCC-PADREは、TG緩衝液(20mM Tris-HCl、pH8.0、25mMのNaCl、2.5%グリセロール)に配合されたAd5.F35-hGCC-PADREウイルス粒子で構成される液体中にタンパク質起源の可視微粒子を含み得る組換えアデノウイルス5型粒子の乳白色懸濁液である。該ワクチンは、1.2mLの透明な無色の滅菌溶液を含むバイアル中に必要な濃度で供給される。Ad5.F35-hGCC-PADREは、光から保護され、-70℃以下で保存されなければならない。調剤されない限り、バイアルは解凍してはならない。凍結融解サイクルはワクチンの効力を低下させ、避けなければならない。
実施例5
アデノウイルス血清型5(Ad5)が遺伝子導入を媒介し、強力な免疫応答を誘導する能力によって、癌及び感染症に対する実験的ワクチンのための人気のベクターとなった。実際、Ad5ベクターを用いた臨床試験は400超あり、ほとんどの試験は癌治療の開発に焦点を当てている。しかし、自然感染では、宿主免疫系はAd5カプシドに対する中和抗体(NAb)を発達させ、ウイルスの拡散を制限し、再感染を阻止する。Ad5感染は多くのヒト集団に固有であるため、世界人口の70%超に存在する既存のNAbは、Ad5ベースのワクチン計画を制限する。これらの考察は、最も多くの患者において治療的免疫応答を生じさせることができる、癌及び病原体関連抗原を標的とするワクチンに使用するための改善されたベクターの必要性を強調する。重要なことに、アデノウイルスのカプシドは、ヘキソン、ペントン、及び繊維タンパク質で構成されているが、ヒトにおいて天然Ad5感染によって誘発されるNAbは主にAd5繊維に向けられており、この要素に対する既存の免疫を回避する計画がAd5ベースのワクチンを改善し得ることを示唆している。
アデノウイルス血清型5(Ad5)が遺伝子導入を媒介し、強力な免疫応答を誘導する能力によって、癌及び感染症に対する実験的ワクチンのための人気のベクターとなった。実際、Ad5ベクターを用いた臨床試験は400超あり、ほとんどの試験は癌治療の開発に焦点を当てている。しかし、自然感染では、宿主免疫系はAd5カプシドに対する中和抗体(NAb)を発達させ、ウイルスの拡散を制限し、再感染を阻止する。Ad5感染は多くのヒト集団に固有であるため、世界人口の70%超に存在する既存のNAbは、Ad5ベースのワクチン計画を制限する。これらの考察は、最も多くの患者において治療的免疫応答を生じさせることができる、癌及び病原体関連抗原を標的とするワクチンに使用するための改善されたベクターの必要性を強調する。重要なことに、アデノウイルスのカプシドは、ヘキソン、ペントン、及び繊維タンパク質で構成されているが、ヒトにおいて天然Ad5感染によって誘発されるNAbは主にAd5繊維に向けられており、この要素に対する既存の免疫を回避する計画がAd5ベースのワクチンを改善し得ることを示唆している。
本発明者らは、胃腸(GI)癌抗原グアニリルシクラーゼC(GUCY2C)を発現するマウスモデルにおける抗腫瘍免疫を改善するために、Ad5繊維を希少なアデノウイルス血清型Ad35(国際血清有病率約10%)の繊維に置き換えることによって、既存のAd5 NAbを克服することを目指した。前臨床モデルは、Ad5ベースのGUCY2C指向性ワクチン(Ad5-GUCY2C-S1)が自己免疫を伴わずにCD8+ T細胞及び抗体応答を惹起することを実証した。さらに、マウスのAd5-GUCY2C-S1ワクチン接種は、肺及び肝臓における転移性結腸直腸癌に対する長期のT細胞媒介性保護を誘導した。さらに、それらの結果は、最近のヒトにおける最初の第I相臨床試験(NCT01972737)で再現され、ヒト化バージョンのワクチン(Ad5-GUCY2C-PADRE)が、従来の治療法に続く結腸直腸癌患者においてGUCY2C特異的CD8+ T細胞応答を安全に誘導することを実証した。しかし、Ad5に対するNAbの高い既存の力価を有する患者は、Ad5-GUCY2C-PADREワクチン接種後にGUCY2C特異的免疫を生じさせることができなかった。Ad5 NAbを克服するために、本発明者らは、マウス及びヒトにおけるAd5に対する同等の安全性及び抗腫瘍活性並びにAd5 NAbに対する耐性を有する、Ad35の繊維保有キメラAd5ベクター(Ad5.F35)を作製した。このキメラワクチンは、Ad5免疫が低い患者だけでなく、既存のAd5 NAbが高い患者でも、GI癌患者に投与して、GUCY2C特異的免疫を安全に誘導することができる。
材料と方法
アデノウイルスベクター
サイト1(S1)として知られるインフルエンザHA107-119 CD4+T細胞エピトープを有するマウス細胞外ドメイン(GUCY2C1-429)を含むアデノウイルスについては先に記載した(Ad5-GUCY2C-S1)。ここで、GUCY2C-S1をpShuttleにクローニングし、以前に作製した複製欠損キメラアデノウイルス(Ad5.F35)のE1領域にサブクローニングし、Ad5繊維をAd35繊維に置き換えてAd5.F35-GUCY2C-S1を作製した。この研究で用いた全てのアデノウイルスワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所のグッドラボラトリー・プラクティスの下で、HEK293細胞内で生成され、塩化セシウム超遠心分離によって精製され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞DNA混入について陰性であることが認定された。インビトロGUCY2C発現実験(用量反応及び経時変化)をA549(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC))細胞において行った。ウイルスを指示された用量で培養物に添加し、示された時点で培養上清を収集した。2μg/mLのMS7マウス抗GUCY2Cモノクローナル抗体及び0.1μg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno)を用いて、ウェスタンブロットにより上清中の相対的なGUCY2Cレベルを定量した。
アデノウイルスベクター
サイト1(S1)として知られるインフルエンザHA107-119 CD4+T細胞エピトープを有するマウス細胞外ドメイン(GUCY2C1-429)を含むアデノウイルスについては先に記載した(Ad5-GUCY2C-S1)。ここで、GUCY2C-S1をpShuttleにクローニングし、以前に作製した複製欠損キメラアデノウイルス(Ad5.F35)のE1領域にサブクローニングし、Ad5繊維をAd35繊維に置き換えてAd5.F35-GUCY2C-S1を作製した。この研究で用いた全てのアデノウイルスワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所のグッドラボラトリー・プラクティスの下で、HEK293細胞内で生成され、塩化セシウム超遠心分離によって精製され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞DNA混入について陰性であることが認定された。インビトロGUCY2C発現実験(用量反応及び経時変化)をA549(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC))細胞において行った。ウイルスを指示された用量で培養物に添加し、示された時点で培養上清を収集した。2μg/mLのMS7マウス抗GUCY2Cモノクローナル抗体及び0.1μg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno)を用いて、ウェスタンブロットにより上清中の相対的なGUCY2Cレベルを定量した。
マウス及び免疫化
8週齢の雄及び雌のBALB/cJマウスを、実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会(プロトコル02092)によって承認された。免疫のために、0.5mLのインスリン注射器を用いて、各後肢に1回で50μLの2回の筋肉内注射として投与される1010又は1011vpのAd5-GUCY2C-S1、Ad5.F35-GUCY2C-S1、又はAd5.F35-GFP(対照)をマウスに投与した。
8週齢の雄及び雌のBALB/cJマウスを、実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会(プロトコル02092)によって承認された。免疫のために、0.5mLのインスリン注射器を用いて、各後肢に1回で50μLの2回の筋肉内注射として投与される1010又は1011vpのAd5-GUCY2C-S1、Ad5.F35-GUCY2C-S1、又はAd5.F35-GFP(対照)をマウスに投与した。
ELISpotによるT細胞応答の定量化
ELISpotアッセイを、製造業者のプロトコルに従ってマウスインターフェロン-γ(IFN-γ)単色ELISpotキット(Cellular Technology)を用いて実施した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにIFN-γ捕捉抗体を4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、CTL-TEST培地(Cellular Technology)中0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)中ペプチドなし又は10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチドで500,000細胞/ウェルで、37℃で24時間播種した。T細胞結合力研究のために、106細胞/ウェルに正規化したGUCY2C254-262ペプチドの濃度を低下させて(10μg/mLから56pg/mL)、600,000~800,000細胞/ウェルで脾細胞を播種した。インキュベーション後、細胞を除去し、IFNγ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ImmunoSpot S6ユニバーサルアナライザー(Cellular Technology)のSmartCount及びAutogate機能を用いて決定した。GUCY2C特異的応答を、ペプチド刺激ウェルから0.1%DMSOウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
ELISpotアッセイを、製造業者のプロトコルに従ってマウスインターフェロン-γ(IFN-γ)単色ELISpotキット(Cellular Technology)を用いて実施した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにIFN-γ捕捉抗体を4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、CTL-TEST培地(Cellular Technology)中0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)中ペプチドなし又は10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチドで500,000細胞/ウェルで、37℃で24時間播種した。T細胞結合力研究のために、106細胞/ウェルに正規化したGUCY2C254-262ペプチドの濃度を低下させて(10μg/mLから56pg/mL)、600,000~800,000細胞/ウェルで脾細胞を播種した。インキュベーション後、細胞を除去し、IFNγ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ImmunoSpot S6ユニバーサルアナライザー(Cellular Technology)のSmartCount及びAutogate機能を用いて決定した。GUCY2C特異的応答を、ペプチド刺激ウェルから0.1%DMSOウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
腫瘍研究
GUCY2C発現マウス(BALB/c)CT26結腸直腸癌細胞をインビボ腫瘍研究に使用した。ルシフェラーゼ発現細胞を、293FT細胞(Invitrogen)によって生成されたレンチウイルス上清でpLenti4-V5-GW-ルシフェラーゼと共に形質導入することによって作製した。腫瘍実験のために、5×105CT26細胞を尾静脈に送達する7日前に、BALB/cJマウスを1010vpのAd5-GUCY2C-S1、Ad5.F35-GUCY2C-S1、又はPBS(対照)で免疫した。PBS中の3.75mgのD-ルシフェリンカリウム塩(Gold Biotechnologies)の皮下注射、続いて8分間のインキュベーション及びCaliper IVIS Lumina XRイメージングステーション(PerkinElmer)を用いた10秒曝露によるイメージングにより、腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度(光子/秒)を、Living Imageインビボイメージングソフトウェア(PerkinElmer)を用いて測定した。
GUCY2C発現マウス(BALB/c)CT26結腸直腸癌細胞をインビボ腫瘍研究に使用した。ルシフェラーゼ発現細胞を、293FT細胞(Invitrogen)によって生成されたレンチウイルス上清でpLenti4-V5-GW-ルシフェラーゼと共に形質導入することによって作製した。腫瘍実験のために、5×105CT26細胞を尾静脈に送達する7日前に、BALB/cJマウスを1010vpのAd5-GUCY2C-S1、Ad5.F35-GUCY2C-S1、又はPBS(対照)で免疫した。PBS中の3.75mgのD-ルシフェリンカリウム塩(Gold Biotechnologies)の皮下注射、続いて8分間のインキュベーション及びCaliper IVIS Lumina XRイメージングステーション(PerkinElmer)を用いた10秒曝露によるイメージングにより、腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度(光子/秒)を、Living Imageインビボイメージングソフトウェア(PerkinElmer)を用いて測定した。
抗体中和アッセイ
血清試料を、事前に、トーマス・ジェファーソン大学の施設内倫理委員会によって承認されたAd5-GUCY2C-PADRE(NCT01972737)による免疫前に患者から取得した。Ad5及びAd5.F35ベクターに対する中和抗体価を定量した。簡単に説明すると、熱不活化血清試料の希釈液を、105A549細胞(ATCC)を含む96ウェル組織培養プレートに添加し、108vpのGFP発現Ad5又はAd5.F35ウイルス(それぞれAd5-CMV-eGFP又はAd5.F35-CMV-eGFP;Baylor Vector Development Lab)で感染させた。37℃で41時間のインキュベーション後に、eGFP蛍光(490nm励起、510nm発光)をPOLARstar Optimateプレートリーダー(BMG Labtech)を用いて定量した。試料蛍光を、細胞及びウイルスを含む対照ウェル(0%中和)又は細胞のみを含むウェル(100%中和)に正規化した。力価を、50%中和をもたらす血清希釈液として非線形回帰を用いて定量した(Prism v8,GraphPad ソフトウェア)。
血清試料を、事前に、トーマス・ジェファーソン大学の施設内倫理委員会によって承認されたAd5-GUCY2C-PADRE(NCT01972737)による免疫前に患者から取得した。Ad5及びAd5.F35ベクターに対する中和抗体価を定量した。簡単に説明すると、熱不活化血清試料の希釈液を、105A549細胞(ATCC)を含む96ウェル組織培養プレートに添加し、108vpのGFP発現Ad5又はAd5.F35ウイルス(それぞれAd5-CMV-eGFP又はAd5.F35-CMV-eGFP;Baylor Vector Development Lab)で感染させた。37℃で41時間のインキュベーション後に、eGFP蛍光(490nm励起、510nm発光)をPOLARstar Optimateプレートリーダー(BMG Labtech)を用いて定量した。試料蛍光を、細胞及びウイルスを含む対照ウェル(0%中和)又は細胞のみを含むウェル(100%中和)に正規化した。力価を、50%中和をもたらす血清希釈液として非線形回帰を用いて定量した(Prism v8,GraphPad ソフトウェア)。
Ad5中和免疫試験
抗Ad5免疫を誘導するために、1010のAd5-GFPを4週間隔で1回又は2回マウスに鼻腔内曝露した。最後の曝露の30日後、上記のように血清中のAd5 NAbを定量し、マウスに1011vpのAd5-GUCY2C-S1又はAd5.F35-GUCY2C-S1で筋肉内に免疫した。
抗Ad5免疫を誘導するために、1010のAd5-GFPを4週間隔で1回又は2回マウスに鼻腔内曝露した。最後の曝露の30日後、上記のように血清中のAd5 NAbを定量し、マウスに1011vpのAd5-GUCY2C-S1又はAd5.F35-GUCY2C-S1で筋肉内に免疫した。
生体分布及び毒性研究
BALB/cJマウスに、28日間隔で1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1の一用量、1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1の3用量、又はPBS(対照)で筋肉内に免疫した。動物を有害事象について1日1回監視し、投薬日(投薬後5分、1時間、及び3時間)に追加評価を行った。14日目及び90日目に、指定した動物を屠殺し、盲検病理学者による病理組織学的分析のために脳、唾液腺、胃、小腸、結腸、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び注射部位を採取及び秤量し(病理学的評価はIDEXX BioAnalyticsによって実施した)、GUCY2C導入遺伝子について前述のアッセイを用いた定量的PCR(qPCR)によるウイルスDNAの検出を行った。また、上記のようなウイルスDNAの病理組織学的解析及び検出、並びに上記のようにIFNγ-ELISpotによるGUCY2C特異的T細胞応答の定量のために脾臓を採取した。
BALB/cJマウスに、28日間隔で1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1の一用量、1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1の3用量、又はPBS(対照)で筋肉内に免疫した。動物を有害事象について1日1回監視し、投薬日(投薬後5分、1時間、及び3時間)に追加評価を行った。14日目及び90日目に、指定した動物を屠殺し、盲検病理学者による病理組織学的分析のために脳、唾液腺、胃、小腸、結腸、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び注射部位を採取及び秤量し(病理学的評価はIDEXX BioAnalyticsによって実施した)、GUCY2C導入遺伝子について前述のアッセイを用いた定量的PCR(qPCR)によるウイルスDNAの検出を行った。また、上記のようなウイルスDNAの病理組織学的解析及び検出、並びに上記のようにIFNγ-ELISpotによるGUCY2C特異的T細胞応答の定量のために脾臓を採取した。
統計解析
統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアv8を用いて行った。統計的有意性は、以下:ns=p>0.05、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、及び****p<0.0001のように考慮した。コホートサイズは、β=0.2及びα=0.05の先行研究に基づいて供給された。生存転帰の多重比較の場合には、ボンフェローニ法を用いて有意性閾値を修正した。ワクチン誘発性T細胞応答者と非応答者を同定するために、修正された分布フリーリサンプリング手法を使用し、DMSO及び20超の特異的スポット/106細胞と比較して、陽性T細胞応答を2倍と定義した。性別及びワクチン接種回数が応答に及ぼす影響を決定するために、対数変換されたワクチン応答の大きさを、RパッケージMASSを用いた赤池情報量基準によるステップワイズ後方変数選択で、異なる性別、コホート、及び治療投与計画のマウスにおいて最大3者間相互作用について比較した。
統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアv8を用いて行った。統計的有意性は、以下:ns=p>0.05、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、及び****p<0.0001のように考慮した。コホートサイズは、β=0.2及びα=0.05の先行研究に基づいて供給された。生存転帰の多重比較の場合には、ボンフェローニ法を用いて有意性閾値を修正した。ワクチン誘発性T細胞応答者と非応答者を同定するために、修正された分布フリーリサンプリング手法を使用し、DMSO及び20超の特異的スポット/106細胞と比較して、陽性T細胞応答を2倍と定義した。性別及びワクチン接種回数が応答に及ぼす影響を決定するために、対数変換されたワクチン応答の大きさを、RパッケージMASSを用いた赤池情報量基準によるステップワイズ後方変数選択で、異なる性別、コホート、及び治療投与計画のマウスにおいて最大3者間相互作用について比較した。
結果
Ad5-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GUCY2C-S1ベクター
世界中のAd5血清有病率は70%を超えている(一部の地域では90%超)が、Ad35は約10%であり、より低い力価と関連している。図6パネルA。そのため、本発明者らは、繊維をAd35繊維に置換したAd5で構成されるキメラアデノウイルス(Ad5.F35)を構築し、ヒト及びマウスにおいてGUCY2C特異的免疫を誘導し、Ad5特異的免疫に抵抗する能力を評価した。Ad5-GUCY2C-S1は、C末端のサイト1として知られるI-Ed制限CD4+エピトープに融合されたマウスGUCY2C細胞外ドメインを発現する複製欠損ヒトAd5である。Ad5.F35-GUCY2C-S1を作製するために、Ad5繊維(L5)をAd35繊維に置き換えた(図6パネルB)。HEK293細胞において作製された複製欠損Ad5-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GUCY2C-S1は、A549ヒト肺胞基底上皮細胞におけるGUCY2C-S1タンパク質の用量依存的発現(図6パネルC)及び時間依存的発現(図6パネルD)をインビトロでもたらした。
Ad5-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GUCY2C-S1ベクター
世界中のAd5血清有病率は70%を超えている(一部の地域では90%超)が、Ad35は約10%であり、より低い力価と関連している。図6パネルA。そのため、本発明者らは、繊維をAd35繊維に置換したAd5で構成されるキメラアデノウイルス(Ad5.F35)を構築し、ヒト及びマウスにおいてGUCY2C特異的免疫を誘導し、Ad5特異的免疫に抵抗する能力を評価した。Ad5-GUCY2C-S1は、C末端のサイト1として知られるI-Ed制限CD4+エピトープに融合されたマウスGUCY2C細胞外ドメインを発現する複製欠損ヒトAd5である。Ad5.F35-GUCY2C-S1を作製するために、Ad5繊維(L5)をAd35繊維に置き換えた(図6パネルB)。HEK293細胞において作製された複製欠損Ad5-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GUCY2C-S1は、A549ヒト肺胞基底上皮細胞におけるGUCY2C-S1タンパク質の用量依存的発現(図6パネルC)及び時間依存的発現(図6パネルD)をインビトロでもたらした。
Ad5.F35-GUCY2C-S1はGUCY2C特異的抗腫瘍免疫を誘導する
Ad5.F35-GUCY2C-S1によるGUCY2C発現のインビトロ検証に続いて、ワクチン接種後のGUCY2C特異的免疫応答をインビボで誘導する能力を確認した。1010vpのAd5.F35-GUCY2C-S1で筋肉内免疫したBALB/cマウスは、Ad5-GUCY2C-S1と比較して54%低いGUCY2C特異的CD8+ T細胞応答(図7パネルA)を生成し、GUCY2C特異的抗体応答を有していなかった(図7パネルB)。重要なことに、Ad5及びAd5.F35ワクチンは、GUCY2C標的化ワクチンの抗腫瘍効果の重要な決定因子である同等の結合力のGUCY2C特異的CD8+ T細胞を生成した(図7パネルC)。対照的に、GUCY2C特異的抗体応答は、検出可能な抗腫瘍活性を有していない。同様に、Ad5及びAd5.F35ワクチンは、同等のS1特異的CD4+T細胞応答をもたらした(図7パネルD)。
Ad5.F35-GUCY2C-S1によるGUCY2C発現のインビトロ検証に続いて、ワクチン接種後のGUCY2C特異的免疫応答をインビボで誘導する能力を確認した。1010vpのAd5.F35-GUCY2C-S1で筋肉内免疫したBALB/cマウスは、Ad5-GUCY2C-S1と比較して54%低いGUCY2C特異的CD8+ T細胞応答(図7パネルA)を生成し、GUCY2C特異的抗体応答を有していなかった(図7パネルB)。重要なことに、Ad5及びAd5.F35ワクチンは、GUCY2C標的化ワクチンの抗腫瘍効果の重要な決定因子である同等の結合力のGUCY2C特異的CD8+ T細胞を生成した(図7パネルC)。対照的に、GUCY2C特異的抗体応答は、検出可能な抗腫瘍活性を有していない。同様に、Ad5及びAd5.F35ワクチンは、同等のS1特異的CD4+T細胞応答をもたらした(図7パネルD)。
以前の研究で、Ad5-GUCY2Cワクチンが転移性結腸直腸癌のマウスモデルにおいて防御的抗腫瘍CD8+ T細胞応答を誘導することが明らかになった。そのため、BALB/cマウスをGUCY2C-S1を発現するAd5又はAd5.F35で免疫し、7日後にGUCY2C及びホタルルシフェラーゼを発現するCT26結腸直腸癌細胞で負荷した。このモデルは、特に、GUCY2Cワクチンが開発されている臨床環境で転移性疾患の二次防御をエミュレートしている。以前に実証したように、Ad5ワクチン接種は転移性腫瘍負荷をほぼ排除し(図8パネルA及びB)、疾患進行を遅らせ(図8パネルC)、生存率を改善した(図8パネルD)。同様に、Ad5.F35は、腫瘍負荷(図8パネルA及びB)、疾患進行(図8パネルC)、及び生存期間の延長(図8パネルD)も低下させた。重要なことに、Ad5ベース及びAd5.F35ベースのGUCY2Cワクチンの有効性は、腫瘍負荷を低下させ、疾患進行を阻止し、生存を促進することにおいて同一であった(図8パネルA~D)。
Ad5.F35はマウス及びヒトにおけるAd5指向性免疫に抵抗する
Ad5に対するNAbは、Ad5-GUCY2C-PADREワクチン接種を受けた患者におけるGUCY2C特異的免疫応答の不良と相関し、Ad5へのマウスの事前曝露はワクチン誘発免疫を同様に鈍らせた。既存のAd5免疫に対するAd5.F35ベースのワクチン耐性を、患者の自然な感染経路であるAd5への呼吸器事前曝露のモデルで定量し、続いてワクチン接種及びGUCY2C特異的T細胞応答の定量化を行った。対照マウス(Ad5に事前曝露していない;未処置)及び鼻腔内にAd5に1回(1×)又は2回(2×)事前曝露したマウスに、4週間後にGUCY2C-S1を発現するAd5又はAd5.F35で筋肉内にワクチン接種し、2週間後に免疫応答を定量した(図9パネルA)。予想通り、1回のAd5事前曝露は、中等度(<1:200)Ad5 NAbを誘導し、GUCY2C特異的T細胞応答を約75%低下させるが、2回の事前曝露は、高い(>1:200)Ad5 NAb誘導し、Ad5ワクチン接種後にGUCY2C特異的T細胞応答を90%超低下させた(図9パネルB)。対照的に、GUCY2C特異的T細胞応答は、Ad5.F35ワクチン接種後、わずか60%(1回事前曝露)及び80%(2回事前曝露)低下させた(図9パネルB)。重要なことに、Ad5への連続的事前曝露後、Ad5(30%コホート応答)と比較して、Ad5.F35は集団のかなり大きな割合(80%コホート応答)でT細胞応答をもたらした(図9パネルC)。
Ad5に対するNAbは、Ad5-GUCY2C-PADREワクチン接種を受けた患者におけるGUCY2C特異的免疫応答の不良と相関し、Ad5へのマウスの事前曝露はワクチン誘発免疫を同様に鈍らせた。既存のAd5免疫に対するAd5.F35ベースのワクチン耐性を、患者の自然な感染経路であるAd5への呼吸器事前曝露のモデルで定量し、続いてワクチン接種及びGUCY2C特異的T細胞応答の定量化を行った。対照マウス(Ad5に事前曝露していない;未処置)及び鼻腔内にAd5に1回(1×)又は2回(2×)事前曝露したマウスに、4週間後にGUCY2C-S1を発現するAd5又はAd5.F35で筋肉内にワクチン接種し、2週間後に免疫応答を定量した(図9パネルA)。予想通り、1回のAd5事前曝露は、中等度(<1:200)Ad5 NAbを誘導し、GUCY2C特異的T細胞応答を約75%低下させるが、2回の事前曝露は、高い(>1:200)Ad5 NAb誘導し、Ad5ワクチン接種後にGUCY2C特異的T細胞応答を90%超低下させた(図9パネルB)。対照的に、GUCY2C特異的T細胞応答は、Ad5.F35ワクチン接種後、わずか60%(1回事前曝露)及び80%(2回事前曝露)低下させた(図9パネルB)。重要なことに、Ad5への連続的事前曝露後、Ad5(30%コホート応答)と比較して、Ad5.F35は集団のかなり大きな割合(80%コホート応答)でT細胞応答をもたらした(図9パネルC)。
マウスにおけるこれらの観察を、Ad5-GUCY2C-PADRE第I相試験(NCT01972737)において結腸直腸癌患者由来の血清を用いて再現した。Ad5及びAd5.F35に対するNAb力価を、Ad5-GUCY2C-PADREによるワクチン接種前に収集された血清試料中の確立されたAd5/Ad5.F35レポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いて定量した。これらの患者において、Ad5.F35特異的NAb力価は、Ad5特異的力価よりも実質的に低かった(図9パネルD)。最も重要なことに、患者の50%が低い(<1:200)Ad5 NAb力価を保有し(図9パネルD及びE)、これは40%のGUCY2C特異的奏効率と密接に相関した。顕著に対照的に、90%がAd5.F35 NAb力価が低く、Ad5.F35ベースのワクチンで免疫された患者の大多数がGUCY2C特異的応答を生成する可能性があることが示唆された(図9パネルE)。全体として、これらの観察は、Ad5送達プラットフォームを中和する環境曝露の反復によって誘導される既存のウイルス免疫が、キメラAd5.F35ベクターによって克服され、わずかな集団ワクチン応答を増強し得ることを示唆している。
Ad5.F35-GUCY2C-S1の安全性、生体分布、及び毒性
食品医薬品局IND(治験新薬(Investigational New Drug))対応研究は、BALB/cマウスにおけるAd5.F35-GUCY2C-S1の毒性、生体分布、及び免疫原性を定量化し、急性及び慢性の影響を調べるために3つのスキームを使用した(図10パネルA)。示すように、性別のバランスのとれたコホートに、1回の筋肉内注射又は4週間隔をあけた3回の筋肉内注射のいずれかとして1011Ad5.F35-GUCY2C-S1を投与し、毎日監視し、14日目又は90日目に分析のために屠殺した(図10パネルA)。観察、体重変化、又は生存による寿命期中の急性又は慢性毒性の徴候はなかった(図10パネルA~D)。同様に、剖検における臓器重量又は組織病理学(図示せず)に臨床的有意差はなかった。臓器重量の小さな統計的差異は臨床的に重要ではないと考えられ、ワクチン曝露(用量、時間)とは無関係であった。qPCRによって定量化した生体分布は、急性及び慢性曝露後に、注射部位及び脾臓においてAd5.F35-GUCY2C-S1を検出したが、他の臓器では顕著ではなかった。さらに、堅牢なCD8+ T細胞応答を14日目に定量し、単回投与後のマウスの70%において90日間持続した(図10パネルE~G)。予想通り、CD8+ T細胞応答は、より大きく、3回のワクチン接種後90日目により多くのマウス(100%)で持続した(図10パネルE~G)。
食品医薬品局IND(治験新薬(Investigational New Drug))対応研究は、BALB/cマウスにおけるAd5.F35-GUCY2C-S1の毒性、生体分布、及び免疫原性を定量化し、急性及び慢性の影響を調べるために3つのスキームを使用した(図10パネルA)。示すように、性別のバランスのとれたコホートに、1回の筋肉内注射又は4週間隔をあけた3回の筋肉内注射のいずれかとして1011Ad5.F35-GUCY2C-S1を投与し、毎日監視し、14日目又は90日目に分析のために屠殺した(図10パネルA)。観察、体重変化、又は生存による寿命期中の急性又は慢性毒性の徴候はなかった(図10パネルA~D)。同様に、剖検における臓器重量又は組織病理学(図示せず)に臨床的有意差はなかった。臓器重量の小さな統計的差異は臨床的に重要ではないと考えられ、ワクチン曝露(用量、時間)とは無関係であった。qPCRによって定量化した生体分布は、急性及び慢性曝露後に、注射部位及び脾臓においてAd5.F35-GUCY2C-S1を検出したが、他の臓器では顕著ではなかった。さらに、堅牢なCD8+ T細胞応答を14日目に定量し、単回投与後のマウスの70%において90日間持続した(図10パネルE~G)。予想通り、CD8+ T細胞応答は、より大きく、3回のワクチン接種後90日目により多くのマウス(100%)で持続した(図10パネルE~G)。
考察
何十年にもわたる遺伝子治療試験を通じて、Ad5は人気のベクターであり続けてきたが、高いAd5血清有病率はユニバーサルワクチン接種に対する障害のままである。自然呼吸器感染症は、Ad5ベースのワクチンを中和する長寿命の抗体を作製し、導入遺伝子の送達及び潜在的な治療上の利益を排除し得る。その状況では、Ad5血清有病率は複数の国で70%超であり、満たされていない代替ベクターの必要性を強調している。本明細書で、キメラAd5.F35が既存のAd5免疫に抵抗し、導入遺伝子特異的抗腫瘍免疫を誘導することを実証する。実際、Ad5.F35は、マウス及びヒトにおいてAd5曝露に関連付けられる中和の影響を受けにくく、Ad5に事前曝露されたマウスにおいてかなり高い割合のワクチン応答者をもたらす。これらの観察結果は、Ad5.F35が患者集団においてより高い割合のワクチン応答者をもたらすという示唆を支持する。
何十年にもわたる遺伝子治療試験を通じて、Ad5は人気のベクターであり続けてきたが、高いAd5血清有病率はユニバーサルワクチン接種に対する障害のままである。自然呼吸器感染症は、Ad5ベースのワクチンを中和する長寿命の抗体を作製し、導入遺伝子の送達及び潜在的な治療上の利益を排除し得る。その状況では、Ad5血清有病率は複数の国で70%超であり、満たされていない代替ベクターの必要性を強調している。本明細書で、キメラAd5.F35が既存のAd5免疫に抵抗し、導入遺伝子特異的抗腫瘍免疫を誘導することを実証する。実際、Ad5.F35は、マウス及びヒトにおいてAd5曝露に関連付けられる中和の影響を受けにくく、Ad5に事前曝露されたマウスにおいてかなり高い割合のワクチン応答者をもたらす。これらの観察結果は、Ad5.F35が患者集団においてより高い割合のワクチン応答者をもたらすという示唆を支持する。
Ad5繊維に対するNAbが再感染を制限する程度は議論の余地がある。いくつかの研究では、Ad5繊維を別の血清型のものに置き換えると、既存のAd5免疫が回避される。対照的に、他の研究は、これらのキメラアデノウイルスが既存のAd5 NAbを回避しないことを示唆しており、ヘキソンが抗体中和の主要な標的であることを示唆している。筋肉内又は静脈内投与によって既存のAd5免疫を生成した以前の研究とは対照的に、ここではAd5免疫がマウスの鼻腔内曝露によって誘導され、自然のヒト呼吸器感染症を再現する。さらに、結腸直腸癌患者における天然の既存のAd5 NAbは、反復呼吸感染によって均一に生成され、同様にAd5.F35ベクターによって克服された。重要なことに、アデノウイルス感染後の抗体応答の質は、曝露経路に依存する。実際、呼吸器感染症は繊維特異的NAbを誘発し、筋肉内曝露はカプシド特異的NAbを誘導する。NAb応答におけるこれらの質的差異は、免疫の様々な経路を反映し、実験室間の観察上の不一致に寄与し得る。関連する動物モデルを用いて、患者試料で確認及び検証された本研究は、Ad5.F35ベースのワクチンが実質的な(約90%)割合の患者において臨床的に関連する免疫応答をもたらすべきであるという示唆を支持する。
世界集団における固有のAd5免疫によって課せられた広範な制限を認識し、ワクチン開発における扱いやすい計画として、代替血清型及びキメラコンストラクトへの新たな関心が高まっている。Ad26、Ad35、及びAd48ベクターは、第I相臨床試験に進んでいる。その点で、健常患者間のAd5、Ad26、Ad35、及びAd48免疫の比較により、固有のAd35血清陽性率が世界集団全体で最も低いことが明らかになり、本明細書で使用したキメラ計画が強化された。同様に、Ad5及びAd48成分を含む最初のヘキソンキメラアデノウイルスは、患者において安全で免疫原性であった。興味深いことに、Ad5-Ad35キメラベクターは、いずれの親ベクターと比較してもインビトロで様々なヒト細胞型をより効率的に形質導入する。
抗腫瘍効果は同等であったが、Ad5.F35-GUCY2C-S1については、Ad5-GUCY2C-S1と比較してCD8+ T細胞応答はより低く、抗体応答はなかった。しかし、GUCY2C指向性免疫療法の抗腫瘍効果は、エフェクターT細胞量ではなく、主にT細胞結合力によって促進される。その状況において、Ad5及びAd5.F35免疫後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞の機能的結合力は同等であり、それらの同等の抗腫瘍効果と一致した。ベクター間の導入遺伝子特異的免疫の量的差異は、様々な要因を反映し得る。そのため、Ad5.F35免疫後のGUCY2C-S1導入遺伝子の量及び持続性は、Ad5と比較してより低く、インビボでのAd5形質導入効率がAd5.F35よりも数倍高い可能性があるという以前の観察結果と一致する。さらに、Ad5繊維はCXADR(コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体)に結合するが、Ad35繊維はCD46に結合し、2つのウイルスが別々の細胞型に感染し得ることを示唆している。
チェックポイント阻害剤は、診療所で実践シフトの結果及びいくつかの悪性腫瘍の治療のための効果的な計画として定義される免疫療法を生み出したが、普遍的に成功しているわけではない。その状況では、マイクロサテライトの安定した結腸直腸及び膵臓(それぞれ癌死亡率の第2及び第3の主要原因)を含む多くの癌種におけるネオエピトープの不足は、チェックポイント遮断に対して無反応にさせる。実際、5つの結腸直腸癌標本の表面に提示されたネオエピトープの検査は、合計3つのネオエピトープを明らかにした。そのため、癌関連自己抗原を標的とするワクチンは、単独で及びチェックポイント阻害剤と組み合わせて、これらのコールド腫瘍からの転移を予防及び治療するための計画として再登場した。
チェックポイント阻害剤は、一部の癌の転移性環境における第一選択療法となっているが、T細胞(CAR-T細胞)を発現するキメラ抗原受容体は、転移性及び難治性疾患の患者に展開されている。対照的に、少数の癌免疫療法は、従来の外科的/放射線/化学療法後に「疾患の証拠がない」(NED)初期ステージの癌患者で、疾患再発のリスクが非常に高い癌患者のために開発されている。実際、ステージIIの約25%、及びステージIIIの約50%の結腸直腸癌患者は、手術及び化学療法後に再発するが、切除可能な膵臓癌患者の70%が再発を経験する。Ad5.F35-GUCY2C-PADREなどの腫瘍関連抗原を標的とするワクチンは、特にチェックポイント阻害剤又はCAR-T細胞を投与される資格がないNED患者の転移性疾患の二次予防のための安全で効果的な免疫療法を提供し得る。
本研究は、キメラアデノウイルスベクターAd5.F35が広く使用されているAd5ベクターよりも好ましい可能性があることを示唆しており、さらなる調査が必要である。実際、結腸直腸、膵臓、胃、及び食道を含むGUCY2C発現癌の患者におけるGUCY2C指向性免疫療法の進行中の臨床研究は、Ad5ベクターではなくAd5.F35を使用することで恩恵を受けられることを示唆している。その状況において、今後の臨床試験では、GI癌患者におけるAd5.F35-GUCY2C-PADREの安全性、免疫原性、及び既存の免疫に対する耐性が検討される(NCT04111172)。高い割合の患者におけるGUCY2C標的化免疫の安全な生成は、全ての癌死亡の25%を占め51、確立された免疫療法は効果がないGI癌患者において、標準療法後の再発を予防するAd5.F35-GUCY2C-PADREの能力を確立する有効性試験につながる。
実施例6
背景:組換え弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lm)は、癌免疫療法の新たなプラットフォームであり、多くのウイルスベクターの限界であるベクター特異的中和免疫に対するその非感受性を部分的に反映している。さらに、Lmは抗原提示細胞(APC)に指向性を有する細胞内細菌であり、CD4+ Tヘルパー細胞(Th細胞)及びCD8+ 細胞傷害性T細胞(CTL)を活性化することによって免疫応答を開始するのに関与する免疫細胞にワクチンを導く。これらの利点は、結腸直腸癌(CRC)患者における第I相臨床試験で最近試験されたAd5-GUCY2C-PADREワクチンの限界と一致している。Ad5-GUCY2C-PADRE免疫原性は、Ad5ウイルスベクターを標的とする既存の中和抗体(NAb)によってヒト集団において制限される。さらに、GUCY2C特異的免疫応答は、CD8+ T細胞応答及びB細胞応答の誘導に必須のCD4+T細胞応答の不在によって特徴付けられる。対照的に、GUCY2Cを組み込んだLmワクチン(Lm-LLO-GUCY2C)は、ベクター特異的免疫に対して耐性であるべきであり、APCに対するその指向性を反映して、GUCY2C特異的CD8+ T細胞及びB細胞にCD4+T細胞の助けを提供するLm特異的CD4+T細胞応答を誘導し、CRC排除をもたらすべきである。
背景:組換え弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lm)は、癌免疫療法の新たなプラットフォームであり、多くのウイルスベクターの限界であるベクター特異的中和免疫に対するその非感受性を部分的に反映している。さらに、Lmは抗原提示細胞(APC)に指向性を有する細胞内細菌であり、CD4+ Tヘルパー細胞(Th細胞)及びCD8+ 細胞傷害性T細胞(CTL)を活性化することによって免疫応答を開始するのに関与する免疫細胞にワクチンを導く。これらの利点は、結腸直腸癌(CRC)患者における第I相臨床試験で最近試験されたAd5-GUCY2C-PADREワクチンの限界と一致している。Ad5-GUCY2C-PADRE免疫原性は、Ad5ウイルスベクターを標的とする既存の中和抗体(NAb)によってヒト集団において制限される。さらに、GUCY2C特異的免疫応答は、CD8+ T細胞応答及びB細胞応答の誘導に必須のCD4+T細胞応答の不在によって特徴付けられる。対照的に、GUCY2Cを組み込んだLmワクチン(Lm-LLO-GUCY2C)は、ベクター特異的免疫に対して耐性であるべきであり、APCに対するその指向性を反映して、GUCY2C特異的CD8+ T細胞及びB細胞にCD4+T細胞の助けを提供するLm特異的CD4+T細胞応答を誘導し、CRC排除をもたらすべきである。
目的/仮説:Lm-LLO-GUCY2Cは、現在のGUCY2Cワクチンよりも優れており、中和抗体及びGUCY2C特異的CD4+T細胞耐性を克服し、安全で効果的なCRC免疫療法を生成する。
具体的な目的:本提案では、(1)免疫原性、(2)転移性CRCモデルにおける抗腫瘍活性、及び(3)Lm-LLO-GUCY2Cの安全性を定義する。
研究設計:Lm-LLO-GUCY2Cを生成し、その免疫原性を、GUCY2C特異的免疫応答(CD4+T細胞並びにCD8+ T細胞及びB細胞)を定量することによってマウスで試験する。さらに、Lm特異的CD4+T細胞応答を定量化し、GUCY2C特異的応答を誘導する上でのそれらの役割をCD4枯渇研究によって決定する。Lm-LLO-GUCY2Cの抗腫瘍効果を、転移性CRCのマウスモデルで試験し、ベンチマークGUCY2Cワクチン(Ad5-GUCY2C-S1)と比較する。最後に、Lm-LLOGUCY2C毒性を、特に正常なGUCY2C発現組織において調べる。提案された研究の陽性対照及び陰性対照には、それぞれAd5-GUCY2C-S1及びLm-LLO(GUCY2Cを欠く)が含まれる。
イノベーション:GUCY2Cワクチンの開発が開始から臨床試験まで進むにつれて、GUCY2C免疫生物学とワクチンプラットフォームに関する本発明者らの理解は十分に進歩し、より多くの情報に基づいたGUCY2Cワクチン設計が可能になった。その状況において、発明者らは、Lmの性質(ベクター免疫に対する耐性;APC指向性)及びGUCY2C(腸特異的;CRCにおける普遍的発現;選択的CD4+T細胞耐性)は相互に有利であり得、CRCに対する有効な免疫療法を生じる。患者におけるLmワクチンの安全性と有効性の確立及びGUCY2C免疫原性の状況で、ここでの結果はすぐに第I相臨床試験に変換され、この仮説を動物からヒトに拡大し、最終的には民間及び軍のCRC集団における効果的な免疫療法につながる可能性がある。
潜在的なCRC免疫療法としてGUCY2Cを標的とするリステリアベースの癌ワクチン(Lm-LLO-GUCY2C)の免疫原性、有効性、及び安全性。CRCは4番目に最も一般的な新生物であり、年間約150,000人の新規症例があり、民間人及び軍人における癌死亡率の第2の主要原因であり、死亡率は約50%である。
実施例7
GUCY2C=発現癌を治療するためのワクチン。該ワクチンは、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスを用いて結腸直腸癌抗原であるGUCY2Cを「抗原提示細胞」(APC)に送達し、GUCY2C発現癌を見つけて排除し得るGUCY2Cに対するGUCY2C特異的T細胞応答を誘導する。新規組換えリステリア・モノサイトゲネスワクチンを、結腸直腸癌のマウスモデルで最初に試験し、その活性、有効性、及び安全性を決定する。
GUCY2C=発現癌を治療するためのワクチン。該ワクチンは、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスを用いて結腸直腸癌抗原であるGUCY2Cを「抗原提示細胞」(APC)に送達し、GUCY2C発現癌を見つけて排除し得るGUCY2Cに対するGUCY2C特異的T細胞応答を誘導する。新規組換えリステリア・モノサイトゲネスワクチンを、結腸直腸癌のマウスモデルで最初に試験し、その活性、有効性、及び安全性を決定する。
主要課題1:Lm-LLO-GCCと対照のLmワクチンの作製
主要課題2:WTマウスにおける耐性を克服するLm-LLO-GCCの能力の決定。WT及びKOマウスにおけるLm-LLO-GCC誘導免疫応答の定量化
主要課題3:GCC特異的応答がCD4+T細胞依存性かどうかの決定
転移性CRCモデルにおけるLmLLO-GCCの抗腫瘍活性の定量化
LmLLO-GCCとAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果の比較
主要課題5:Lm-LLO-GCC及びAd5-GCC-S1に対する免疫応答に対するベクター特異的免疫の影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するLm-LLOGCC又はAd5-GCC-S1免疫マウスの免疫応答の定量化
主要課題6:ベクター特異的免疫がLm-LLO-GCCとAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果に及ぼす影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するマウスにおけるLm-LLOGCC又はAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果の定量化
Lm-LLO-GCCの安全性の実証
主要課題7:毒性の徴候についてのLm-LLO-GCC免疫マウスの検査。GCC発現組織及び非発現組織におけるLm-LLO-GCC症状の確立
主要課題2:WTマウスにおける耐性を克服するLm-LLO-GCCの能力の決定。WT及びKOマウスにおけるLm-LLO-GCC誘導免疫応答の定量化
主要課題3:GCC特異的応答がCD4+T細胞依存性かどうかの決定
転移性CRCモデルにおけるLmLLO-GCCの抗腫瘍活性の定量化
LmLLO-GCCとAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果の比較
主要課題5:Lm-LLO-GCC及びAd5-GCC-S1に対する免疫応答に対するベクター特異的免疫の影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するLm-LLOGCC又はAd5-GCC-S1免疫マウスの免疫応答の定量化
主要課題6:ベクター特異的免疫がLm-LLO-GCCとAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果に及ぼす影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するマウスにおけるLm-LLOGCC又はAd5-GCC-S1の抗腫瘍効果の定量化
Lm-LLO-GCCの安全性の実証
主要課題7:毒性の徴候についてのLm-LLO-GCC免疫マウスの検査。GCC発現組織及び非発現組織におけるLm-LLO-GCC症状の確立
第1世代組換えLm-LLO-GCCワクチン
組み込みプラスミドpPL2を用いて、切断型リステリオリシンO(LLO)発現カセット及びLLOプロモーターの下流の弱毒化(ΔactA/ΔinLB)リステリア・モノサイトゲネス(Lm)のゲノムへの組換えGCC又はGCC-S1組み込みを誘導し、Lm感染細胞のサイトゾルに分泌されるLLO-GCC融合タンパク質を生成した(図14)。これらのコンストラクトは、以前のウイルスベクター系のワクチンで使用されたGCCの完全な細胞外ドメイン(残基23~429)を含む。
組み込みプラスミドpPL2を用いて、切断型リステリオリシンO(LLO)発現カセット及びLLOプロモーターの下流の弱毒化(ΔactA/ΔinLB)リステリア・モノサイトゲネス(Lm)のゲノムへの組換えGCC又はGCC-S1組み込みを誘導し、Lm感染細胞のサイトゾルに分泌されるLLO-GCC融合タンパク質を生成した(図14)。これらのコンストラクトは、以前のウイルスベクター系のワクチンで使用されたGCCの完全な細胞外ドメイン(残基23~429)を含む。
Lm培養物の上清中のGCC発現を確認することにより、第1世代Lm-GCC及び対照ワクチンの品質管理を行った(図15)。LLO-GCC又はLLO-GCC-S1融合タンパク質を、抗GCC抗体又は抗LLO抗体を用いて上清中で検出した。
第1世代Lm-GCCワクチンの免疫原性をBALB/cマウスで試験した(図16)。十分に確立されたアデノウイルスベースのワクチン(Ad5-GCC-S1)を陽性対照として用いた。免疫化に続いて、GCCに対するCD8+ T細胞応答をIFNγ-ELISpotにより定量した。予想通り、対照Lm-LLOはGCC特異的応答を誘導しなかった。しかし、Lm-LLO-GCC及びLm-LLO-GCC-S1も応答を誘導できなかった。応答は、陽性対照Ad5-GCC-S1ワクチンによって誘導され、それぞれLm及びAd5ベクター中の抗原LLO及びDBPに対する応答が生成された。まとめると、これらのデータから、Lm-LLOGCCワクチンはGCC特異的応答の誘導因子として不十分であることが示唆された。
第2世代組換えLm-LLO-GCCワクチン
LLO-GCC融合タンパク質の低発現の状況で(図15)、本発明者らは、LLO-GCC融合タンパク質のサイズが大きいことが、その発現及び免疫誘導を妨げている可能性があるという仮説を立てた。実際、LLOに融合した大きな腫瘍抗原を用いた同様の研究は、融合タンパク質を生成するのに同様の困難さを示す。したがって、3つの異なる第2世代ワクチンを作製し、それぞれに約1/3のGCCを含めた(図17)。これらの設計には、異なるGCC CD4+T細胞エピトープとCD8+ T細胞エピトープが含まれており、2つの異なる断片で各エピトープに対する応答を試験することができる。
LLO-GCC融合タンパク質の低発現の状況で(図15)、本発明者らは、LLO-GCC融合タンパク質のサイズが大きいことが、その発現及び免疫誘導を妨げている可能性があるという仮説を立てた。実際、LLOに融合した大きな腫瘍抗原を用いた同様の研究は、融合タンパク質を生成するのに同様の困難さを示す。したがって、3つの異なる第2世代ワクチンを作製し、それぞれに約1/3のGCCを含めた(図17)。これらの設計には、異なるGCC CD4+T細胞エピトープとCD8+ T細胞エピトープが含まれており、2つの異なる断片で各エピトープに対する応答を試験することができる。
LLO-GCC融合タンパク質の発現を、ウェスタンブロットにより第2世代Lm-LLO-GCCワクチンで確認した。各第2世代ワクチンは異なるGCC断片を含むため、複数のGCC特異的モノクローナル抗体を用いて、Lm上清中のGCC-LLO融合タンパク質を検出した(図18)。これらのデータは、各組換えLmワクチンによるLLO-GCC融合タンパク質発現を確認する。予想通り、より短い融合タンパク質は、第1世代ワクチンで生成された全長LLOGCC生成物よりも高いレベルで発現した。
GCC断片を含む第2世代Lm-LLO-GCCワクチンを、GCC-/-(図19パネルA)又はGCC+/+(図19パネルB)マウスに投与した。GCC-/-マウスはCD4+T細胞応答のみを生成し、GCC+/+はCD8+ T細胞応答のみを生成するため、マウスにこれらのエピトープを含むワクチン断片のみを投与した。GCC-/-マウスは、断片1及び2を含むCD4+T細胞エピトープで免疫した場合に、GCCに対して堅牢なCD4+T細胞応答をもたらした(図19パネルA)。しかし、GCC+/+マウスは、CD8+ T細胞エピトープ含有断片2及び3で免疫した場合に、GCC特異的CD8+ T細胞応答を生成できなかった(図19パネルB)。GCC+/+マウスにおけるGCCに対するCD8+ T細胞応答の欠如を確認するために、本発明者らは抗腫瘍免疫実験を行った(図20パネルA~C)。IFNγ-ELISpotのデータ(図19、パネルA及びB)と一致して、GCC+/+マウスにおけるLm-LLO-GCC断片免疫化は、100%有効であったAd5-GCC-S1と比較して抗腫瘍効果を示さなかった(図20パネルA、B及びC)。
第2世代組換えLm-LLO-GCCワクチン
全長GCC又はGCCの断片を含むワクチンを接種したマウスにおける不良のLm-LLO-GCCワクチン免疫原性の状況において(図14~20)、本発明者らは、GCCがLLO融合タンパク質の状況で適切に処理及び提示されない可能性があるという仮説を立てた。したがって、Lm感染細胞のサイトゾルで高発現している別のLmタンパク質であるActAに融合させたGCC含有組換えLmワクチンを生成した(図21パネルA)。これらのワクチンは、Lm感染マクロファージにおいてGCC融合タンパク質生成を誘導し、Syn18エンハンサー配列の包含によって発現が著しく増強された(図21パネルB)。しかし、LmActA-GCCワクチンは、GCC+/+マウスにおいてGCC特異的CD8+ T細胞応答を誘導できなかった(図21パネルC~D)。
全長GCC又はGCCの断片を含むワクチンを接種したマウスにおける不良のLm-LLO-GCCワクチン免疫原性の状況において(図14~20)、本発明者らは、GCCがLLO融合タンパク質の状況で適切に処理及び提示されない可能性があるという仮説を立てた。したがって、Lm感染細胞のサイトゾルで高発現している別のLmタンパク質であるActAに融合させたGCC含有組換えLmワクチンを生成した(図21パネルA)。これらのワクチンは、Lm感染マクロファージにおいてGCC融合タンパク質生成を誘導し、Syn18エンハンサー配列の包含によって発現が著しく増強された(図21パネルB)。しかし、LmActA-GCCワクチンは、GCC+/+マウスにおいてGCC特異的CD8+ T細胞応答を誘導できなかった(図21パネルC~D)。
次に、GCC CD8+ T細胞エピトープの5つのタンデムリピートを含むがGCCの他のドメインを欠く新規コンストラクトを作製することによって、GCC特異的CD8+ T細胞応答を増強することを試みた(図22)。これらのエピトープをActA及びSyn18に融合させて、CD8+ T細胞応答を誘導することができる高度に免疫原性のコンストラクトであると予想されるものを生成した。しかし、このワクチンによる野生型BALB/cマウスの免疫では、何の応答も生じなかった(図22)。
最後に、本発明者らのコンストラクト設計に根本的な欠陥がある可能性があり、それはいかなる抗原に対してもCD8+ T細胞応答をもたらすることができないという仮説を立てた。この仮説を検証するために、本発明者らは、大腸菌のβガラクトシダーゼ(LacZ)、マウスHer2、及びAd5 DNA結合タンパク質(DBP)からのCD8+ T細胞エピトープと同様に、GCCの優勢なCD8+ T細胞エピトープに融合されたActA-Syn18含有新規コンストラクトを生成した(図23)。そのワクチンはLacZとAd5に対して堅牢な応答をもたらしたが、GCCとHer2に対しては意味のある応答を生成できなかった(図23)。現在、本発明者らは、GCC CD8+ T細胞エピトープの抗原処理及び提示を増強するように設計された新規Lmコンストラクトを作製している。
本発明者らは、GCCエピトープ提示の増加及びGCC特異的CD8+ T細胞応答の生成をもたらすと期待するいくつかの新規Lmコンストラクトを設計し、現在生成している。残りのプロジェクト期間にわたって、これらのワクチンの生成を完了し、その免疫原性を試験する。まとめると、これらの研究と完了した作業は、結腸直腸癌免疫療法のためのGCCを標的とするリステリアベースのワクチンの潜在的な有用性を確立するであろう。
実施例8
結腸直腸癌(CRC)は、米国で癌死の第2の主要原因であり、4番目に一般的に診断される癌である。さらに、転移性CRC患者の5年生存率は現在14%であり、何十年もの間比較的停滞したままであり、転移性CRCを予防及び治療するための効果的な治療法の欠如が強調される。この状況において、腸管受容体及び腫瘍関連抗原グアニリルシクラーゼC(GUCY2C)は、開発中の免疫療法選択肢として浮上している。CRC患者を対象とした最近の第I相試験で、GUCY2Cに対するアデノウイルスベースのワクチン(Ad-GUCY2C)の免疫原性と安全性が実証された。しかし、ワクチン抗原に対する最適な免疫は、異種ワクチンベクターとの組み合わせ手法を用いて日常的に達成され、これはベクター特異的免疫に関連する制限を回避するのに役立ち、したがって、同じベクターを用いた相同ワクチン接種よりも優れている場合が多い。本明細書で、GUCY2Cを分泌するリステリア・モノサイトゲネスの組換え株(Lm-GUCY2C)を構築し、Ad-GUCY2Cと組み合わせてその免疫原性を調べ、最適なGUCY2Cワクチン接種投与計画を定義した。本発明者らは、Ad-GUCY2Cを用いて、GUCY2C免疫応答を「初回刺激」し、Lm-GUCY2Cを用いて、記憶GUCY2C免疫応答を「増強」する異種初回刺激-追加免疫投与計画を利用して、最適なGUCY2C及び抗腫瘍免疫が達成されることを実証する。本発明者らは、この組み合わせが、GUCY2C特異的CD8+ T細胞数の量並びにGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力及び多機能性の有意な増強につながることを報告する。さらに、本発明者らは、この免疫が安全であることを実証し、ワクチン接種マウスの病理組織学的評価が毒性の徴候を示さないことを実証する。まとめると、これらの知見から、Lm-GUCY2Cが既存のGUCY2C免疫応答を有する患者におけるGUCY2C免疫を増強するために利用され、将来のGUCY2C標的ワクチン臨床試験に情報を提供し得ることが示唆される。
結腸直腸癌(CRC)は、米国で癌死の第2の主要原因であり、4番目に一般的に診断される癌である。さらに、転移性CRC患者の5年生存率は現在14%であり、何十年もの間比較的停滞したままであり、転移性CRCを予防及び治療するための効果的な治療法の欠如が強調される。この状況において、腸管受容体及び腫瘍関連抗原グアニリルシクラーゼC(GUCY2C)は、開発中の免疫療法選択肢として浮上している。CRC患者を対象とした最近の第I相試験で、GUCY2Cに対するアデノウイルスベースのワクチン(Ad-GUCY2C)の免疫原性と安全性が実証された。しかし、ワクチン抗原に対する最適な免疫は、異種ワクチンベクターとの組み合わせ手法を用いて日常的に達成され、これはベクター特異的免疫に関連する制限を回避するのに役立ち、したがって、同じベクターを用いた相同ワクチン接種よりも優れている場合が多い。本明細書で、GUCY2Cを分泌するリステリア・モノサイトゲネスの組換え株(Lm-GUCY2C)を構築し、Ad-GUCY2Cと組み合わせてその免疫原性を調べ、最適なGUCY2Cワクチン接種投与計画を定義した。本発明者らは、Ad-GUCY2Cを用いて、GUCY2C免疫応答を「初回刺激」し、Lm-GUCY2Cを用いて、記憶GUCY2C免疫応答を「増強」する異種初回刺激-追加免疫投与計画を利用して、最適なGUCY2C及び抗腫瘍免疫が達成されることを実証する。本発明者らは、この組み合わせが、GUCY2C特異的CD8+ T細胞数の量並びにGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力及び多機能性の有意な増強につながることを報告する。さらに、本発明者らは、この免疫が安全であることを実証し、ワクチン接種マウスの病理組織学的評価が毒性の徴候を示さないことを実証する。まとめると、これらの知見から、Lm-GUCY2Cが既存のGUCY2C免疫応答を有する患者におけるGUCY2C免疫を増強するために利用され、将来のGUCY2C標的ワクチン臨床試験に情報を提供し得ることが示唆される。
材料と方法
ワクチン
サイト1(S1)として知られるインフルエンザHA107-119 CD4+T細胞エピトープに融合されたマウスGUCY2C1-429を発現するキメラ複製欠損アデノウイルスについては先に記載した(Ad5.F35-GUCY2C-S1)。本研究で用いたAd5.F35-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GFPワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所によって生成され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞DNA混入に対して陰性であることが認定された。
ワクチン
サイト1(S1)として知られるインフルエンザHA107-119 CD4+T細胞エピトープに融合されたマウスGUCY2C1-429を発現するキメラ複製欠損アデノウイルスについては先に記載した(Ad5.F35-GUCY2C-S1)。本研究で用いたAd5.F35-GUCY2C-S1及びAd5.F35-GFPワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所によって生成され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞DNA混入に対して陰性であることが認定された。
病原因子インターナリンB及びactAの欠損を含む弱毒化Lm株であるLmΔactA/ΔinlBは、ATCCから注文し、この研究で利用された全てのLmワクチンの親株として機能する。組換えLm-GUCY2C及びLm-LacZは、actAプロモーターの制御下にあるActAタンパク質の最初の100個のアミノ酸をインフレームでそれぞれ有するマウスGUCY2C細胞外ドメイン23-429又はβ-ガラクトシダーゼ618-1024を合成することによって作製した。得られた配列をpPL2組み込みベクターにクローニングし、Lm染色体に組み込んだ。Lm株をOD600が約1になるまでブレインハートインフュージョンブロス(Fisher Scientific)中で増殖させ、小分けし、-80℃で保存した。実験当日、アリコートを解凍し、37℃で60分間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、ワクチン接種のためにPBSで所望の濃度に希釈した。
インビトロ感染
マウスマクロファージ細胞株J774A.1を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM中で培養した。J774A.1細胞をLm-GUCY2C又は対照Lmで10:1の感染多重度で感染させた。1時間のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、遊離細胞外細菌を排除するために10μg/mLのゲンタマイシン含有培地に再懸濁し、さらに5時間インキュベートした。免疫蛍光試験のために、感染前に2mM CellTracker Red CMPTPX色素と37℃で10分間インキュベートすることにより、Lmを標識した。ウェスタンブロット研究のために、プロテアーゼ阻害剤を補充したM-PER試薬(Pierce)を用いて細胞からタンパク質を抽出した。GUCY2Cタンパク質を、抗GUCY2Cモノクローナル抗体MS20を用いて染色し、抗p60モノクローナル抗体p6017(AdipoGen)を用いてp60を染色した。
マウスマクロファージ細胞株J774A.1を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM中で培養した。J774A.1細胞をLm-GUCY2C又は対照Lmで10:1の感染多重度で感染させた。1時間のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、遊離細胞外細菌を排除するために10μg/mLのゲンタマイシン含有培地に再懸濁し、さらに5時間インキュベートした。免疫蛍光試験のために、感染前に2mM CellTracker Red CMPTPX色素と37℃で10分間インキュベートすることにより、Lmを標識した。ウェスタンブロット研究のために、プロテアーゼ阻害剤を補充したM-PER試薬(Pierce)を用いて細胞からタンパク質を抽出した。GUCY2Cタンパク質を、抗GUCY2Cモノクローナル抗体MS20を用いて染色し、抗p60モノクローナル抗体p6017(AdipoGen)を用いてp60を染色した。
マウスと免疫化
8週齢の雄及び雌のBALB/cJマウスを実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会(プロトコル01956)によって承認された。アデノウイルス免疫のために、各後肢に1回ずつ、50μLの2回の注射として、マウスに1010vpのAd5.F35-GUCY2C-S1又は対照としてのAd5.F35-GFPを筋肉内(i.m.)に投与した。Lm免疫のために、5×106コロニー形成単位(CFU)のLm-GUCY2C、空のLm、又はLm-LacZを、PBS中100μL懸濁液として静脈内(i.v.)投与した。ELISpot実験では、空のLmを対照として使用し、腫瘍実験では、アジュバントとして機能し、抗腫瘍応答を高めるActAタンパク質の能力によりLm-LacZを対照のために用いた。初回刺激-追加免疫のために、ワクチンを21日あけて送達した。
8週齢の雄及び雌のBALB/cJマウスを実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会(プロトコル01956)によって承認された。アデノウイルス免疫のために、各後肢に1回ずつ、50μLの2回の注射として、マウスに1010vpのAd5.F35-GUCY2C-S1又は対照としてのAd5.F35-GFPを筋肉内(i.m.)に投与した。Lm免疫のために、5×106コロニー形成単位(CFU)のLm-GUCY2C、空のLm、又はLm-LacZを、PBS中100μL懸濁液として静脈内(i.v.)投与した。ELISpot実験では、空のLmを対照として使用し、腫瘍実験では、アジュバントとして機能し、抗腫瘍応答を高めるActAタンパク質の能力によりLm-LacZを対照のために用いた。初回刺激-追加免疫のために、ワクチンを21日あけて送達した。
Ad5中和免疫研究
1010Ad5-GFPへの鼻腔内曝露によりBALB/cJマウスにおいてAd5免疫を誘導した。感染後28日目に、マウスから採血し、血清を採取し、1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1に続いて、21日後に、5×106 CFUのLm-GUCY2C又は対照Lmで免疫した。マウスにおけるAd5中和抗体価を、先に記載したように定量した。
1010Ad5-GFPへの鼻腔内曝露によりBALB/cJマウスにおいてAd5免疫を誘導した。感染後28日目に、マウスから採血し、血清を採取し、1011vpのAd5.F35-GUCY2C-S1に続いて、21日後に、5×106 CFUのLm-GUCY2C又は対照Lmで免疫した。マウスにおけるAd5中和抗体価を、先に記載したように定量した。
IFNγ-ELISpotアッセイ
ELISpotアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、マウスインターフェロン-γ(IFN-γ)単色ELISpotキット(Cellular Technology Limited)を用いて実施した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにIFN-γ捕捉抗体を4℃でコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをPBSで洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチドを含む又は含まないCTL-TEST培地(Cellular Technology Limited)中の0.1%DMSO溶液に播種し、37℃で24時間インキュベートした。TCR結合力研究のために、脾細胞を様々な濃度のGUCY2C254-262ペプチド(10μg/mLから3pg/mL)で播種した。翌日、細胞を除去し、IFN-γ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ImmunoSpot S6ユニバーサルアナライザー(Cellular Technology Limited)のSmartCount及びAutogate関数を用いて計算した。GUCY2C特異的応答を、ペプチドパルスウェルから0.1%DMSOウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
ELISpotアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、マウスインターフェロン-γ(IFN-γ)単色ELISpotキット(Cellular Technology Limited)を用いて実施した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにIFN-γ捕捉抗体を4℃でコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをPBSで洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチドを含む又は含まないCTL-TEST培地(Cellular Technology Limited)中の0.1%DMSO溶液に播種し、37℃で24時間インキュベートした。TCR結合力研究のために、脾細胞を様々な濃度のGUCY2C254-262ペプチド(10μg/mLから3pg/mL)で播種した。翌日、細胞を除去し、IFN-γ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ImmunoSpot S6ユニバーサルアナライザー(Cellular Technology Limited)のSmartCount及びAutogate関数を用いて計算した。GUCY2C特異的応答を、ペプチドパルスウェルから0.1%DMSOウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
細胞内サイトカイン染色
免疫マウスの106脾細胞をDMSO又は10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチド及び抗CD107-FITC(クローン1D4B)の存在下で96ウェルプレートに播種した。細胞を37℃で1時間インキュベートし、タンパク質輸送阻害剤カクテル(eBioscience)を加え、脾細胞を37℃でさらに5時間インキュベートした。LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead細胞染色キット(Invitrogen)、抗CD8PerCP-Cy5.5(53-6.7;BD Biosciences)、抗CD19-BV510(6D5;Biolegend)を用いて細胞を染色した。BD Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)を用いて透過処理し、細胞内サイトカインを、抗IFN-γ(XMG1.2;BD Biosciences)及び抗MIP1α-APC(39624;R&D Systems)を用いて染色した。細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、BD LSR IIフローサイトメーターで分析した。FlowJo software (TreeStar)を用いて解析を行った。
免疫マウスの106脾細胞をDMSO又は10μg/mLのGUCY2C254-262ペプチド及び抗CD107-FITC(クローン1D4B)の存在下で96ウェルプレートに播種した。細胞を37℃で1時間インキュベートし、タンパク質輸送阻害剤カクテル(eBioscience)を加え、脾細胞を37℃でさらに5時間インキュベートした。LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead細胞染色キット(Invitrogen)、抗CD8PerCP-Cy5.5(53-6.7;BD Biosciences)、抗CD19-BV510(6D5;Biolegend)を用いて細胞を染色した。BD Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)を用いて透過処理し、細胞内サイトカインを、抗IFN-γ(XMG1.2;BD Biosciences)及び抗MIP1α-APC(39624;R&D Systems)を用いて染色した。細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、BD LSR IIフローサイトメーターで分析した。FlowJo software (TreeStar)を用いて解析を行った。
腫瘍研究
GUCY2C及びルシフェラーゼ発現マウス(BALB/c)CT26結腸直腸癌細胞株を前述のように作製し、インビボ腫瘍研究に使用した。最終免疫の6日後、マウスの尾静脈に5×105CT26細胞を静脈内投与した。PBS中の3.75mgのD-ルシフェリンカリウム塩(Gold Biotechnologies)の皮下注射、続いて8分間のインキュベーション及びCaliper IVIS Lumina XRイメージングステーション(PerkinElmer)を用いて10秒間の曝露後に画像化することによって腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度(光子/秒)を、Living Image In Vivoイメージングソフトウェア(PerkinElmer)を用いて測定した。
GUCY2C及びルシフェラーゼ発現マウス(BALB/c)CT26結腸直腸癌細胞株を前述のように作製し、インビボ腫瘍研究に使用した。最終免疫の6日後、マウスの尾静脈に5×105CT26細胞を静脈内投与した。PBS中の3.75mgのD-ルシフェリンカリウム塩(Gold Biotechnologies)の皮下注射、続いて8分間のインキュベーション及びCaliper IVIS Lumina XRイメージングステーション(PerkinElmer)を用いて10秒間の曝露後に画像化することによって腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度(光子/秒)を、Living Image In Vivoイメージングソフトウェア(PerkinElmer)を用いて測定した。
結果
Lm-GUCY2Cワクチン設計
マウスGUCY2C23-429の細胞外ドメインを、Java Codon Adaptation Toolを用いてリステリア・モノサイトゲネス用にコドン最適化し、actAプロモーターのActAN100、及び図24パネルAに示すエンハンサー配列の下流で合成した。得られた配列をpPL2組み込みベクターにクローニングし、生弱毒化二重欠損株Lm ΔactAΔinlBのゲノムに安定に組み込んだ。ActA-GUCY2C融合タンパク質の分泌を確認するため、J774A.1マクロファージ細胞株をLm-GUCY2C又は対照Lm株で感染させた。6時間のインキュベーション後に、マクロファージをウェスタンブロット(図24パネルB)及び免疫蛍光(図24パネルC)によってGUCY2Cタンパク質発現について染色した。
Lm-GUCY2Cワクチン設計
マウスGUCY2C23-429の細胞外ドメインを、Java Codon Adaptation Toolを用いてリステリア・モノサイトゲネス用にコドン最適化し、actAプロモーターのActAN100、及び図24パネルAに示すエンハンサー配列の下流で合成した。得られた配列をpPL2組み込みベクターにクローニングし、生弱毒化二重欠損株Lm ΔactAΔinlBのゲノムに安定に組み込んだ。ActA-GUCY2C融合タンパク質の分泌を確認するため、J774A.1マクロファージ細胞株をLm-GUCY2C又は対照Lm株で感染させた。6時間のインキュベーション後に、マクロファージをウェスタンブロット(図24パネルB)及び免疫蛍光(図24パネルC)によってGUCY2Cタンパク質発現について染色した。
異種Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫投与計画は、GUCY2C特異的CD8+ T細胞応答及び抗腫瘍免疫を増強する
Lm-GUCY2CによるGUCY2C融合タンパク質発現のインビトロ確認後に、次に、最適なGUCY2C免疫投与計画の特定を模索した。そのため、Lm-GUCY2Cワクチンを、現在第II相試験(NCT04111172)においてGUCY2Cに対するキメラアデノウイルスベースのワクチン(Ad5.F35-GUCY2C-S1)と組み合わせて試験した。Lm-GUCY2C及びAd5.F35-GUCY2C-S1ワクチンを相同又は異種ワクチン接種として21日あけて投与する初回刺激-追加免疫計画を用いてGUCY2C免疫原性及び抗腫瘍免疫を評価した。特に、GUCY2C免疫応答を「刺激」するためにAd5.F35-GUCY2C-S1を用い、続いて「追加免疫」するためにLm-GUCY2Cを用いる異種免疫投与計画により、他の全ての免疫投与計画と比較してIFNγ-ELISpotによって定量される著しく高いGUCY2C特異的CD8+ T細胞応答が生じた(図25パネルA)。同様に、結腸直腸腫瘍負荷の状況において、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫は、他のワクチン接種方法と比較して、転移性腫瘍負荷を著しく低下させ(図25パネルB及びC)、生存期間中央値を増加させた(図25パネルD)。重要なことに、免疫の順序は最適なGUCY2C免疫に不可欠であり、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cは、Lm-GUCY2C+Ad5.F35-GUCY2C-S1ワクチン接種と比較して、GUCY2C特異的CD8+ T細胞の15倍超の増加(p<0.0001)を誘導し、生存期間中央値を著しく改善した(71d対38d、p<0.05)。さらに、本発明者らは、Lm-GUCY2CがAd5.F35-GUCY2C-S1初回刺激の100日後にGUCY2C免疫応答を増強することを見出し、Lm-GUCY2Cが最初の初回刺激ワクチン接種のずっと後にGUCY2C記憶応答を増強する可能性があることが示唆された。
Lm-GUCY2CによるGUCY2C融合タンパク質発現のインビトロ確認後に、次に、最適なGUCY2C免疫投与計画の特定を模索した。そのため、Lm-GUCY2Cワクチンを、現在第II相試験(NCT04111172)においてGUCY2Cに対するキメラアデノウイルスベースのワクチン(Ad5.F35-GUCY2C-S1)と組み合わせて試験した。Lm-GUCY2C及びAd5.F35-GUCY2C-S1ワクチンを相同又は異種ワクチン接種として21日あけて投与する初回刺激-追加免疫計画を用いてGUCY2C免疫原性及び抗腫瘍免疫を評価した。特に、GUCY2C免疫応答を「刺激」するためにAd5.F35-GUCY2C-S1を用い、続いて「追加免疫」するためにLm-GUCY2Cを用いる異種免疫投与計画により、他の全ての免疫投与計画と比較してIFNγ-ELISpotによって定量される著しく高いGUCY2C特異的CD8+ T細胞応答が生じた(図25パネルA)。同様に、結腸直腸腫瘍負荷の状況において、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫は、他のワクチン接種方法と比較して、転移性腫瘍負荷を著しく低下させ(図25パネルB及びC)、生存期間中央値を増加させた(図25パネルD)。重要なことに、免疫の順序は最適なGUCY2C免疫に不可欠であり、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cは、Lm-GUCY2C+Ad5.F35-GUCY2C-S1ワクチン接種と比較して、GUCY2C特異的CD8+ T細胞の15倍超の増加(p<0.0001)を誘導し、生存期間中央値を著しく改善した(71d対38d、p<0.05)。さらに、本発明者らは、Lm-GUCY2CがAd5.F35-GUCY2C-S1初回刺激の100日後にGUCY2C免疫応答を増強することを見出し、Lm-GUCY2Cが最初の初回刺激ワクチン接種のずっと後にGUCY2C記憶応答を増強する可能性があることが示唆された。
ベクター特異的免疫がAd5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫に及ぼす影響
ウイルスベースのワクチンの既知の限界は、ベクター特異的免疫が標的ワクチン抗原の免疫原性に干渉する能力である。具体的には、一般的なアデノウイルス血清型5(Ad5)に対する中和抗体(NAb)は、健常ドナーの70%超で検出可能であり、アデノウイルスベースのワクチンの有効性を鈍らせることが実証されている。Ad5.F35などのキメラアデノウイルスは、Ad5 NAbに関連する中和の影響を受けにくいが、その効果は控えめであるため、Ad5.F35-GUCY2C-S1のGUCY2C特異的免疫応答は、事前Ad5曝露の存在下で部分的に低下する。対照的に、ヒトにおけるLm感染は、Lmに対するNAbをもたらさず、事前曝露は、標的ワクチン抗原の免疫原性を制限しない。これらの観察と一致して、本発明者らは、事前Lm曝露がLm-GUCY2CのGUCY2C免疫原性を制限しないことを見出した。そのため、本発明者らは、事前Ad5曝露がAd5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cワクチン接種手法を制限する可能性があるという影響に焦点を当てた。まず、抗体中和に関連する可能性のあるAd5.F35-GUCY2C-S1ワクチンの低い初回刺激用量で追加免疫するLm-GUCY2Cの能力を定義することを望んだ。そのため、本発明者らは、減少用量のAd5.F35-GUCY2C-S1でマウスを免疫し、Lm-GUCY2Cが同様に1011vpから109vpの範囲の用量でGUCY2C特異的CD8+ T細胞を増強することを見出した(図26パネルA)。次に、インビボで既存のAd5免疫を模倣することを望んだ。Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cワクチン接種投与計画の開始の28日前に、Ad5特異的免疫を誘導するために、マウスを1010VPのAd5-GFP又はPBSに鼻腔内曝露した。予想通り、Ad5-GFP曝露は、ワクチン接種時にマウスにおいてNAbを誘導した(図26パネルB)。しかし、Lm-GUCY2Cは、未処置マウス及びAd5-GFPに事前曝露したマウスにおいて、GUCY2C特異的CD8+ T細胞応答を増強した(図26パネルC)。同様に、未処置及びAd5-GFP曝露マウスのLm-GUCY2Cワクチン接種は、転移性腫瘍負荷の低下(図26パネルD)及び生存期間の延長(図26パネルE)によって定量されるように同様に抗腫瘍免疫を増強した。そのため、Lm-GUCY2Cは、不十分なGUCY2C初回刺激ワクチン接種に関連する状況において、GUCY2C特異的免疫を増強するのに有効であり得る。
ウイルスベースのワクチンの既知の限界は、ベクター特異的免疫が標的ワクチン抗原の免疫原性に干渉する能力である。具体的には、一般的なアデノウイルス血清型5(Ad5)に対する中和抗体(NAb)は、健常ドナーの70%超で検出可能であり、アデノウイルスベースのワクチンの有効性を鈍らせることが実証されている。Ad5.F35などのキメラアデノウイルスは、Ad5 NAbに関連する中和の影響を受けにくいが、その効果は控えめであるため、Ad5.F35-GUCY2C-S1のGUCY2C特異的免疫応答は、事前Ad5曝露の存在下で部分的に低下する。対照的に、ヒトにおけるLm感染は、Lmに対するNAbをもたらさず、事前曝露は、標的ワクチン抗原の免疫原性を制限しない。これらの観察と一致して、本発明者らは、事前Lm曝露がLm-GUCY2CのGUCY2C免疫原性を制限しないことを見出した。そのため、本発明者らは、事前Ad5曝露がAd5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cワクチン接種手法を制限する可能性があるという影響に焦点を当てた。まず、抗体中和に関連する可能性のあるAd5.F35-GUCY2C-S1ワクチンの低い初回刺激用量で追加免疫するLm-GUCY2Cの能力を定義することを望んだ。そのため、本発明者らは、減少用量のAd5.F35-GUCY2C-S1でマウスを免疫し、Lm-GUCY2Cが同様に1011vpから109vpの範囲の用量でGUCY2C特異的CD8+ T細胞を増強することを見出した(図26パネルA)。次に、インビボで既存のAd5免疫を模倣することを望んだ。Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cワクチン接種投与計画の開始の28日前に、Ad5特異的免疫を誘導するために、マウスを1010VPのAd5-GFP又はPBSに鼻腔内曝露した。予想通り、Ad5-GFP曝露は、ワクチン接種時にマウスにおいてNAbを誘導した(図26パネルB)。しかし、Lm-GUCY2Cは、未処置マウス及びAd5-GFPに事前曝露したマウスにおいて、GUCY2C特異的CD8+ T細胞応答を増強した(図26パネルC)。同様に、未処置及びAd5-GFP曝露マウスのLm-GUCY2Cワクチン接種は、転移性腫瘍負荷の低下(図26パネルD)及び生存期間の延長(図26パネルE)によって定量されるように同様に抗腫瘍免疫を増強した。そのため、Lm-GUCY2Cは、不十分なGUCY2C初回刺激ワクチン接種に関連する状況において、GUCY2C特異的免疫を増強するのに有効であり得る。
初回刺激-追加免疫ワクチン接種後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの質的変化
ワクチン特異的T細胞の量を増やすことに加えて、以前の研究は、初回刺激-追加免疫がワクチン特異的T細胞の品質に影響を与えることを実証している。そのため、本発明者らは、Ad5.F35-GUCY2C-S1初回刺激及びAd5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C初回刺激-追加免疫ワクチン接種後のピークエフェクター応答におけるGUCY2C特異的CD8+ T細胞の結合力及び多機能性を比較することによって、GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールに対する影響を決定することを望んだ。GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力を評価するために、本発明者らは、減少濃度のGUCY2C254-262ペプチドで免疫したマウスの脾細胞をパルスし、IFN-γ応答を定量した。初回刺激免疫のみで免疫したマウスと比較して、初回刺激-追加免疫で免疫したマウスのEC50は約2.5倍シフトし(0.0046μg/mL対0018μg/mL、p<0.0001)、初回刺激-追加免疫後のマウスにおける高結合力GUCY2C特異的T細胞の富化が示唆された(図27パネルA)。次に、フローサイトメトリーを用いて、初回刺激及び初回刺激-追加免疫ワクチン接種後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞の多機能性を評価した。ELISpot実験と一致して、初回刺激-追加免疫は、初回刺激免疫単独(図27パネルB)と比較してIFN-γ応答、並びにエフェクターサイトカインMIP1α及び脱顆粒CD107aの表面マーカーを著しく増強した。さらに、IFN-γ、MIP1α、及びCD107a染色による二重陽性(図27パネルC及びE)及び三重陽性(図27パネルD及びE)CD8+ T細胞の割合は、初回刺激-追加免疫ワクチン接種後に著しく上昇し、初回刺激-追加免疫が複数のエフェクター機能を有するGUCY2C特異的CD8+ T細胞を生成することが示唆された。そのため、GUCY2C特異的CD8+ T細胞数を著しく増幅することに加えて、Lm-GUCY2C追加免疫後の抗腫瘍免疫の増強は、GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力及び多機能性の質的変化を介して付与され得る可能性が高い。
ワクチン特異的T細胞の量を増やすことに加えて、以前の研究は、初回刺激-追加免疫がワクチン特異的T細胞の品質に影響を与えることを実証している。そのため、本発明者らは、Ad5.F35-GUCY2C-S1初回刺激及びAd5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C初回刺激-追加免疫ワクチン接種後のピークエフェクター応答におけるGUCY2C特異的CD8+ T細胞の結合力及び多機能性を比較することによって、GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールに対する影響を決定することを望んだ。GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力を評価するために、本発明者らは、減少濃度のGUCY2C254-262ペプチドで免疫したマウスの脾細胞をパルスし、IFN-γ応答を定量した。初回刺激免疫のみで免疫したマウスと比較して、初回刺激-追加免疫で免疫したマウスのEC50は約2.5倍シフトし(0.0046μg/mL対0018μg/mL、p<0.0001)、初回刺激-追加免疫後のマウスにおける高結合力GUCY2C特異的T細胞の富化が示唆された(図27パネルA)。次に、フローサイトメトリーを用いて、初回刺激及び初回刺激-追加免疫ワクチン接種後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞の多機能性を評価した。ELISpot実験と一致して、初回刺激-追加免疫は、初回刺激免疫単独(図27パネルB)と比較してIFN-γ応答、並びにエフェクターサイトカインMIP1α及び脱顆粒CD107aの表面マーカーを著しく増強した。さらに、IFN-γ、MIP1α、及びCD107a染色による二重陽性(図27パネルC及びE)及び三重陽性(図27パネルD及びE)CD8+ T細胞の割合は、初回刺激-追加免疫ワクチン接種後に著しく上昇し、初回刺激-追加免疫が複数のエフェクター機能を有するGUCY2C特異的CD8+ T細胞を生成することが示唆された。そのため、GUCY2C特異的CD8+ T細胞数を著しく増幅することに加えて、Lm-GUCY2C追加免疫後の抗腫瘍免疫の増強は、GUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの結合力及び多機能性の質的変化を介して付与され得る可能性が高い。
異種初回刺激-追加免疫は毒性を誘発しない
以前に、GUCY2Cワクチンが内因性GUCY2C発現組織に対する自己免疫を呼び起こすことなく全身性抗腫瘍免疫を誘導する能力を実証した。Lm-GUCY2C追加免疫後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの量、結合力、及び多機能性の変化を考慮すると、この免疫投与計画の安全性を特徴付けることを望んだ。そのため、本発明者らは、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫による潜在的な毒性を解明するために、2つのワクチン接種及び評価スケジュールを使用した。図28パネルAに示されるように、0日目にマウスに1010vpAのd5.F35-GUCY2C-S1で免疫し、その後、21日目と42日目に5×106CFUのLm-GUCY2Cの2回の追加免疫を行った。最終免疫の7日後及び30日後に、マウスを屠殺し、臓器を摘出し、急性及び/又は慢性毒性の評価をそれぞれ行った。追加のコホートに、全ての免疫の日にPBSを投与した。急性又は慢性のコホートにおける毒性の徴候は、生活中の観察又は生存中に観察されなかった(図28パネルB)。注目すべきことに、急性及び慢性コホートにおける雌ではなく雄マウスが、対照コホートと比較して研究全体を通して体重が減少していた(図28パネルC及びD)。同様に、脳及び小腸臓器の重量の統計的に有意な減少は、おそらく一般的な体の大きさの違いのために、急性及び/又は慢性コホートの雄マウスにおいてのみ認められた。興味深いことに、急性及び慢性コホートの雌マウスは、胃重量の減少を示した。さらに、最近Lm-GUCY2Cで免疫した急性コホートのマウスは脾腫を示し、先行研究と一致し、おそらく脾臓に対するLm指向性に起因する。全体として、脾腫を除いて、性別をこえて、グループにおいて臓器重量の差は維持されなかった。臓器サイズのわずかな違いにもかかわらず、盲検病理学者による組織病理学的スコアリングは、既知のGUCY2C発現組織(小腸、結腸、脳)とGUCY2C欠損組織(唾液腺、胃、心臓、肺、腎臓、及び肝臓)との間で炎症における差異を明らかにしなかった。脾臓の炎症の増加は急性コホートで認められ、脾腫の所見と一致した。まとめると、これらのデータは、先行研究と一致して、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫が、内因性GUCY2C発現組織に対する自己免疫を生じさせることなくGUCY2C免疫を増強することを示唆している。
以前に、GUCY2Cワクチンが内因性GUCY2C発現組織に対する自己免疫を呼び起こすことなく全身性抗腫瘍免疫を誘導する能力を実証した。Lm-GUCY2C追加免疫後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールの量、結合力、及び多機能性の変化を考慮すると、この免疫投与計画の安全性を特徴付けることを望んだ。そのため、本発明者らは、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫による潜在的な毒性を解明するために、2つのワクチン接種及び評価スケジュールを使用した。図28パネルAに示されるように、0日目にマウスに1010vpAのd5.F35-GUCY2C-S1で免疫し、その後、21日目と42日目に5×106CFUのLm-GUCY2Cの2回の追加免疫を行った。最終免疫の7日後及び30日後に、マウスを屠殺し、臓器を摘出し、急性及び/又は慢性毒性の評価をそれぞれ行った。追加のコホートに、全ての免疫の日にPBSを投与した。急性又は慢性のコホートにおける毒性の徴候は、生活中の観察又は生存中に観察されなかった(図28パネルB)。注目すべきことに、急性及び慢性コホートにおける雌ではなく雄マウスが、対照コホートと比較して研究全体を通して体重が減少していた(図28パネルC及びD)。同様に、脳及び小腸臓器の重量の統計的に有意な減少は、おそらく一般的な体の大きさの違いのために、急性及び/又は慢性コホートの雄マウスにおいてのみ認められた。興味深いことに、急性及び慢性コホートの雌マウスは、胃重量の減少を示した。さらに、最近Lm-GUCY2Cで免疫した急性コホートのマウスは脾腫を示し、先行研究と一致し、おそらく脾臓に対するLm指向性に起因する。全体として、脾腫を除いて、性別をこえて、グループにおいて臓器重量の差は維持されなかった。臓器サイズのわずかな違いにもかかわらず、盲検病理学者による組織病理学的スコアリングは、既知のGUCY2C発現組織(小腸、結腸、脳)とGUCY2C欠損組織(唾液腺、胃、心臓、肺、腎臓、及び肝臓)との間で炎症における差異を明らかにしなかった。脾臓の炎症の増加は急性コホートで認められ、脾腫の所見と一致した。まとめると、これらのデータは、先行研究と一致して、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2C免疫が、内因性GUCY2C発現組織に対する自己免疫を生じさせることなくGUCY2C免疫を増強することを示唆している。
考察
特にマイクロサテライト安定なミスマッチ修復能のある腫瘍患者にとって、CRC管理における主な限界は、依然として、外科的切除後の疾患再発の可能性と、転移性疾患を治療するための現在の治療法の無効性である。これらの状況では、ワクチン接種は、従来の治療を免れたCRC細胞を排除し、長期的な免疫を与え、それによって将来の再発から保護することによって理想的な治療法であり得る。本明細書で、免疫原性であり、自己免疫を引き起こすことなく強力な抗腫瘍免疫を誘導するワクチンベクターの異種の組み合わせを利用する最適なGUCY2C免疫投与計画を定義する。
特にマイクロサテライト安定なミスマッチ修復能のある腫瘍患者にとって、CRC管理における主な限界は、依然として、外科的切除後の疾患再発の可能性と、転移性疾患を治療するための現在の治療法の無効性である。これらの状況では、ワクチン接種は、従来の治療を免れたCRC細胞を排除し、長期的な免疫を与え、それによって将来の再発から保護することによって理想的な治療法であり得る。本明細書で、免疫原性であり、自己免疫を引き起こすことなく強力な抗腫瘍免疫を誘導するワクチンベクターの異種の組み合わせを利用する最適なGUCY2C免疫投与計画を定義する。
先行研究と一致して、初回刺激-追加免疫ワクチン接種は、ワクチン特異的T細胞の量を上昇させるだけでなく、ワクチン特異的T細胞プールの品質にも大きく影響することを見出している。本発明者らは、Lm-GUCY2C追加免疫後のGUCY2C特異的CD8+ T細胞プールが、より高い結合力を有し、増加したエフェクター機能を示すことを報告する。特に、複数の研究により、より高い結合力のTCR及び多機能T細胞が、癌細胞を除去し、ウイルス感染を可能な限り排除するのにより有効であり得ることが実証されている。したがって、Lm-GUCY2C追加免疫によって付与されるさらなる抗腫瘍免疫は、全3つの因子の組み合わせを介するものであり得る。
アデノウイルスベースの癌ワクチンは、再感染を阻止し、したがって免疫時のワクチンの有効性を制限するAd5特異的NAbを有する個人の割合が高いことによって部分的に妨げられてきた。Ad5.F35などの希少な血清型及びキメラアデノウイルスベクターの使用は、Ad5の既存の免疫に関連する中和の影響を受けにくいが、ワクチン接種時のベクター特異的NAbの誘導は、追加の免疫の有用性を制限する。そのため、2つの異なるベクターを利用する異種免疫は、この設定における相同免疫よりも好ましい場合がある。さらに、ウイルスベクターとは対照的に、Lmなどの細菌ベクターはワクチン接種時にNAbを誘導しない。そのため、GUCY2C免疫が経時的に低下するにつれて、Lm-GUCY2Cによる反復ワクチン接種は許容され、患者においてGUCY2C免疫を治療レベルまで一貫して上昇させることが必要であり得る。
Lm-GUCY2Cは、Ad5.F35-GUCY2C-S1初回刺激後にGUCY2C特異的メモリーCD8+ T細胞の強力な増殖を誘導したが、Lm-GUCY2C単独では単剤療法としての効果は乏しかった。実際、相同なLm-GUCY2Cワクチン接種では、ELISpotによるとGUCY2C特異的CD8+ T細胞が明らかに存在せず、CRC負荷に対する保護が与えられなかった。興味深いことに、Lmワクチンを単剤療法として検討する研究は、さまざまな成功を報告している。腫瘍抗原HER2及びPSAに対するLmワクチンは、単剤療法として強力な抗腫瘍免疫を生成するが、PAP及びメソセリンを含む他の腫瘍抗原に対するLmワクチンは、同様に、限られた免疫原性のみを実証し、異種初回刺激-追加免疫として利用された。さらに、Lmワクチンと抗GITR抗体及び抗PD-1抗体などの免疫調節剤を組み合わせた場合の抗腫瘍免疫の増強が報告されている。そのため、Lm-GUCY2Cが単独で検出可能なGUCY2C免疫応答を刺激しない理由を理解して、免疫モジュレーターとLm-GUCY2Cを組み合わせてさらに調査すると、Lm-GUCY2C生物学に重要な洞察を生み出し、GUCY2C免疫のさらなる増強につながる可能性がある。
胃腸癌におけるAd5.F35-GUCY2C-PADREワクチンを試験する進行中の臨床試験(NCT04111172)の状況において、これらの研究は、この試験に登録された患者がLm-GUCY2Cによる追加ワクチン接種の恩恵を受ける可能性があることを示唆している。本発明者らの研究は、Ad5.F35-GUCY2C-S1+Lm-GUCY2Cが、いずれかのベクターによる相同免疫と比較して、優れたGUCY2C抗腫瘍免疫及びCD8+ T細胞増殖を誘導することを実証する。さらに、本発明者らの研究は、Lm-GUCY2C追加免疫がAd5.F35-GUCY2C-S1免疫による最初の初回刺激のずっと後に有効であり得ることを示唆しており、最初の初回刺激免疫との間隔が長いにもかかわらず、患者がLm-GUCY2C追加免疫から患者が恩恵を受ける可能性があることを示唆する。
Claims (52)
- a)アデノウイルスAd5.F35ベクター:
b)i)作動可能に連結された異種プロモーター、
ii)インフレームで融合された可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸、
iii)ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット:
を含む組換えAd5.F35アデノウイルス。 - 複製欠損である、請求項1に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、配列番号5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む、請求項2に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープPADREをコードする核酸を含む、請求項2に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記PADREが配列番号7によってコードされる、請求項4に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、融合配列を形成するための配列番号7に記載のユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む、請求項3に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記異種プロモーターがCMV IEである、請求項6に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 前記融合配列が、可溶性ヒトGUCY2CドメインのC末端に融合されたPADREをコードし、配列番号9に記載の配列である、請求項6に記載の組換えAd5.F35アデノウイルス。
- 請求項8に記載のアデノウイルス及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む注射用医薬組成物。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、請求項9に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記癌の細胞がGUCY2Cを発現する方法。
- 癌組織がGUCY2Cを発現するかを決定するために、前記投与工程が、前記癌組織の試料を分析する工程に先行する、請求項10に記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び/又は放射線治療及び/又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項10に記載のヒト患者を治療する方法。
- GUCY2Cを発現する癌が食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項10に記載のヒト患者を治療する方法。
- 前記癌が原発性である、請求項12に記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項12に記載の方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、
GUCY2Cが、
(i)手術、化学療法又は放射線療法による治療の工程;続いて
(ii)請求項9に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む前記癌の細胞によって発現される治療方法。 - 前記癌が前記第1の治療工程の完了後に検出不能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項15に記載の治療方法。
- ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合させた可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、配列番号5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む、請求項18に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープPADREをコードする核酸を含む、請求項18に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記PADREが配列番号7によってコードされる、請求項20に記載の組換えAd5.リステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、融合配列を形成するための配列番号7に記載のユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む、請求項18に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記融合配列が、可溶性ヒトGUCY2CドメインのC末端に融合されたPADREをコードし、配列番号9に記載の配列である、請求項18に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 請求項18~24のいずれかに記載のリステリア・モノサイトゲネス及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む注射用医薬組成物。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、請求項8に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記癌の細胞がGUCY2Cを発現する方法。
- 前記癌組織がGUCY2Cを発現しているかを決定するために、前記投与工程が、癌組織の試料を分析する工程に先行する、請求項25に記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び/又は放射線治療及び/又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項25に記載のヒト患者を治療する方法。
- GUCY2Cを発現する癌が食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項25に記載のヒト患者を治療する方法。
- 前記癌が原発性である、請求項25に記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項25に記載の方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、
GUCY2Cが、
(i)手術、化学療法又は放射線療法による治療の工程;続いて
(ii)請求項8に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む前記癌の細胞によって発現される治療方法。 - 前記癌が前記第1の治療工程の完了後に検出不能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項31に記載の治療方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、前記癌の細胞がGUCY2Cを発現し、
a)i)アデノウイルスAd5.F35ベクター:
作動可能に連結された異種プロモーター、
インフレームで融合された可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸、
ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット
を含む組換えAd5.F35アデノウイルス
を含む医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程;及び
b)i)作動可能に連結された異種プロモーター
インフレームで融合された可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸
ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット
を含む組換えリステリア・モノサイトゲネス
を含む医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む治療方法。 - 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが複製欠損である、請求項33に記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが、配列番号5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項33又は34に記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープPADREをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項33~35のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが配列番号7によってコードされるPADREを含む、請求項33~36のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが、融合配列を形成する配列番号7に記載のユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合される配列5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項33~37のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスの異種プロモーターが、CMV IEプロモーターである、請求項33~38のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えAd5.F35アデノウイルスが、可溶性ヒトGUCY2CドメインのC末端に融合されたPADREをコードし、配列番号9に記載の配列である融合配列を含む、請求項33~39のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む、請求項33~40のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、配列番号5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む、請求項33~41のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、ユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープPADREをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットの組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む、請求項33~42のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、配列番号7によってコードされるユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープPADREをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットの組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む、請求項33~43のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、融合配列を形成する配列番号7に記載のユニバーサルCD4+ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列5に記載の可溶性ヒトGUCY2Cドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項33~44のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、可溶性ヒトGUCY2CドメインのC末端に融合されたPADREをコードする核酸を含み、配列番号9に記載の配列である遺伝子発現カセットを含む、請求項33~45のいずれかに記載の方法。
- 工程a)に先行して、癌組織の試料を分析して、癌組織がGUCY2Cを発現しているかを決定する、請求項33~46のいずれかに記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び/又は放射線治療及び/又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項33~47のいずれかに記載の方法。
- 前記GUCY2Cを発現する癌が、食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項33~47のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が原発性である、請求項33~49のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項33~49のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が、前記第1の治療工程の完了後に検出不可能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項33~50のいずれかに記載の方法。
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