JP2023548255A - 抗ｇｕｃｙ２ｃワクチンとワクチン接種 - Google Patents
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Abstract
可溶性ＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン配列のコード配列を含む改変アデノウイルスＡＤ５．Ｆ３５を含む組成物が開示されている。可溶性ＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン配列のコード配列を含むリステリア・モノサイトゲネスベクターを含む組成物が開示されている。ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌／腫瘍と診断された個人の治療方法、微小転移の予防方法が開示されている。【選択図】なし
Description
政府の権利に関する声明
この発明は、米国国防総省によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０２９９の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
この発明は、米国国防総省によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０２９９の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
この発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＣＡ１７０５３３の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
治療の改善と成功にもかかわらず、癌は世界中で多くの人々の命を奪い続けている。スクリーニングの改善は、初期ステージの癌を有する多くの個人、並びに癌を有していないが遺伝的に癌を発症する素因があるため、癌を発症するリスクが高い多くの個人を特定する機会を提供する。さらに、治療の改善により、癌を切除したり寛解したりした人が多数いる。そのような人々は再発（ｒｅｌａｐｓｅ）又は再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）のリスクがあり、したがって癌を発症するリスクも高い。
治療の改善と成功にもかかわらず、癌は世界中で多くの人々の命を奪い続けている。スクリーニングの改善は、初期ステージの癌を有する多くの個人、並びに癌を有していないが遺伝的に癌を発症する素因があるため、癌を発症するリスクが高い多くの個人を特定する機会を提供する。さらに、治療の改善により、癌を切除したり寛解したりした人が多数いる。そのような人々は再発（ｒｅｌａｐｓｅ）又は再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）のリスクがあり、したがって癌を発症するリスクも高い。
ＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍／癌に罹患している個人を治療するための改善された方法が必要である。ＧＵＣＹ２Ｃ発現癌に罹患している個人を治療するのに有用な組成物が必要である。このような癌の治療を受けた個人におけるＧＵＣＹ２Ｃ発現癌の再発を予防するための改善された方法が必要である。このような癌について治療された個人におけるＧＵＣＹ２Ｃ発現癌の再発を予防するのに有用な組成物が必要である。個人、特にそのような癌の遺伝的素因を有すると特定された者におけるＧＵＣＹ２Ｃ発現癌を予防する改善された方法が必要である。個人においてＧＵＣＹ２Ｃ発現癌を予防するのに有用な組成物が必要である。個人におけるＧＵＣＹ２Ｃ発現癌を治療及び予防するのに有用な組成物を特定する改善された方法が必要である。
配列表の簡単な説明
配列番号１：参照により本明細書に組み込まれるヒトＧＵＣＹ２Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１３６５４４）のＤＮＡ配列。
配列番号２：ヒトＧＵＣＹ２Ｃの予測アミノ酸配列。
配列番号３：ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号４：ヒトＧＵＣＹ２Ｃの予測アミノ酸配列。
配列番号５：可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号６：可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃ予測アミノ酸配列。
配列番号７：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列。
配列番号８：配列番号６のＰＡＤＲＥの予測アミノ酸配列。
配列番号９：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列とインフレームで融合させた（Ｃ末端融合）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号１０：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列とインフレームで融合させた（Ｎ末端融合）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列の予測アミノ酸配列。
配列番号１１：Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥベクター配列。
配列番号１２：三日熱マラリア原虫ＭＳＰ１の３３ｋＤａのＣ末端領域に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１３：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１４：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１５：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１６：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１７：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１８：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１９：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ８３０～８４４。
配列番号２０：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ９４７～９６７。
配列番号２１：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ５９０～６０３。
配列番号２２：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ６１５～６２９。
配列番号２３：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ６３９～６５２。
配列番号２４：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ８３０～８４３。
配列番号２５：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ９４７～９６７。
配列番号２６：Ｔ細胞エピトープインフルエンザヘマグルチニン残基３０６～３１８。
配列番号２７：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基６６～７７。
配列番号２８：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基１４５～１５９。
配列番号２９：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基２４７～２６１。
配列番号３０：Ｔ細胞エピトープＥＢＶ ＬＭＰ１１５９～１７５。
配列番号３１：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ１３１～１５。
配列番号３２：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２１１～２３０。
配列番号３３：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２４１～２６０。
配列番号３４：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２６３～２７７。
配列番号３５：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２７１～２９０。
配列番号３６：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２９１～３１０。
配列番号３７：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３０１～３２０。
配列番号３８：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３２１～３４０。
配列番号３９：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３３１～３５０。
配列番号４０：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基５５６～５８０。
配列番号４１：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基５６～８０。
配列番号４２：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基３１６～３３５。
配列番号４３：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基９０６～９３０。
配列番号１：参照により本明細書に組み込まれるヒトＧＵＣＹ２Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１３６５４４）のＤＮＡ配列。
配列番号２：ヒトＧＵＣＹ２Ｃの予測アミノ酸配列。
配列番号３：ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号４：ヒトＧＵＣＹ２Ｃの予測アミノ酸配列。
配列番号５：可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号６：可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃ予測アミノ酸配列。
配列番号７：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列。
配列番号８：配列番号６のＰＡＤＲＥの予測アミノ酸配列。
配列番号９：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列とインフレームで融合させた（Ｃ末端融合）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列。
配列番号１０：ＰＡＤＲＥをコードするＤＮＡ配列とインフレームで融合させた（Ｎ末端融合）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃのコドン最適化ＤＮＡ配列の予測アミノ酸配列。
配列番号１１：Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥベクター配列。
配列番号１２：三日熱マラリア原虫ＭＳＰ１の３３ｋＤａのＣ末端領域に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１３：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１４：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１５：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１６：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１７：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１８：熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質に存在するＴ細胞エピトープ。
配列番号１９：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ８３０～８４４。
配列番号２０：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ９４７～９６７。
配列番号２１：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ５９０～６０３。
配列番号２２：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ６１５～６２９。
配列番号２３：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ６３９～６５２。
配列番号２４：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ８３０～８４３。
配列番号２５：Ｔ細胞エピトープ破傷風トキソイドＴＴ９４７～９６７。
配列番号２６：Ｔ細胞エピトープインフルエンザヘマグルチニン残基３０６～３１８。
配列番号２７：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基６６～７７。
配列番号２８：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基１４５～１５９。
配列番号２９：Ｔ細胞エピトープエンテロウイルス７１ ＶＰ１カプシドタンパク質残基２４７～２６１。
配列番号３０：Ｔ細胞エピトープＥＢＶ ＬＭＰ１１５９～１７５。
配列番号３１：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ１３１～１５。
配列番号３２：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２１１～２３０。
配列番号３３：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２４１～２６０。
配列番号３４：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２６３～２７７。
配列番号３５：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２７１～２９０。
配列番号３６：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ２９１～３１０。
配列番号３７：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３０１～３２０。
配列番号３８：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３２１～３４０。
配列番号３９：Ｔ細胞エピトープＨＩＶ Ｇａｇ ３３１～３５０。
配列番号４０：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基５５６～５８０。
配列番号４１：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基５６～８０。
配列番号４２：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基３１６～３３５。
配列番号４３：Ｔ細胞エピトープＡｄ５ヘキソンタンパク質残基９０６～９３０。
発明の詳細な説明
１．０ 定義
本明細書で使用する「ＧＵＣＹＣ２」、「ＧＣＣ」、「ヒトＧＵＣＹＣ２」、「ヒトＧＣＣ」、「ＧＵＣＹＣ２タンパク質」、「ＧＣＣタンパク質」、「ヒトＧＵＣＹＣ２タンパク質」及び「ヒトＧＣＣタンパク質」は、ヒトグアニリルシクラーゼＣタンパク質を指すために本明細書で互換的に使用される。ヒトＧＵＣＹＣ２をコードする核酸配列は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１３６５４４）に記載される。配列番号１の最も長いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトＧＵＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ１９９３４）を有する。ヒトＧＵＣＹＣ２をコードするコドン最適化配列は、Ｍａｇｅｅら（参照により本明細書に組み込まれるＭａｇｅｅ ＭＳら（２０１８） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ６：５０９－５１６）によって説明され、配列番号３に記載されている。
１．０ 定義
本明細書で使用する「ＧＵＣＹＣ２」、「ＧＣＣ」、「ヒトＧＵＣＹＣ２」、「ヒトＧＣＣ」、「ＧＵＣＹＣ２タンパク質」、「ＧＣＣタンパク質」、「ヒトＧＵＣＹＣ２タンパク質」及び「ヒトＧＣＣタンパク質」は、ヒトグアニリルシクラーゼＣタンパク質を指すために本明細書で互換的に使用される。ヒトＧＵＣＹＣ２をコードする核酸配列は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１３６５４４）に記載される。配列番号１の最も長いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトＧＵＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ１９９３４）を有する。ヒトＧＵＣＹＣ２をコードするコドン最適化配列は、Ｍａｇｅｅら（参照により本明細書に組み込まれるＭａｇｅｅ ＭＳら（２０１８） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ６：５０９－５１６）によって説明され、配列番号３に記載されている。
ＧＵＣＹＣ２タンパク質は、細胞表面又は膜結合受容体タンパク質である。ＧＵＣＹＣ２タンパク質は、いくつかの一般的に許容されるドメインを有し、その各々は、ＧＵＣＹＣ２分子への分離可能な機能に寄与する。これらのドメインは、シグナル配列（互換的にシグナルペプチドとも呼ばれる）、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメイン（キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを一緒に、互換的に細胞内ドメイン又は細胞質ドメインと呼ぶことがある）を含む。これらのドメインは、タンパク質が細胞内で生成されるときに生じるので、Ｎ末端からＣ末端まで本明細書に記載されている。
ＧＵＣＹＣ２シグナル配列は、新たに合成されたＧＵＣＹＣ２タンパク質のＮ末端に存在する。ＧＵＣＹＣ２シグナル配列は、タンパク質が細胞内で最初に生成される場所からのタンパク質の転座において機能する。ＧＵＣＹＣ２シグナルペプチドを典型的には成熟のために切除すると、タンパク質輸送の一部として、又はタンパク質輸送を伴う機能的な成熟タンパク質が生じる。
ＧＵＣＹＣ２細胞外ドメインは、細胞外上で外部に露出しているＧＵＣＹＣ２タンパク質の部分である。ＧＵＣＹＣ２細胞外ドメインは、ＧＵＣＹＣ２タンパク質の天然に存在するアゴニストリガンド、グアニリン及びウログアニリン、並びに例えば大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＳＴなどの天然に存在するアゴニスト及びアンタゴニストリガンド並びに合成のアゴニスト及びアンタゴニストリガンドに結合するＧＵＣＹＣ２タンパク質の部分を含む。ＧＵＣＹＣ２細胞外ドメインは、ＧＵＣＹＣ２シグナル配列とＧＵＣＹＣ２膜貫通ドメインとの間の配列の全てのアミノ酸残基を含む。すなわち、ＧＵＣＹＣ２細胞外ドメインは、ＧＵＣＹＣ２シグナル配列の後の最初の残基からＧＵＣＹＣ２膜貫通ドメインの前の最後の残基までの全てのアミノ酸残基を含む。
これらのドメインは、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（バイトピック又はシングルパス膜貫通タンパク質として、単一の膜貫通ドメインのみが存在する）、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメイン（キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを一緒に、互換的に細胞内ドメイン又は細胞質ドメインと呼ばれることがある）を含む。これらのドメインは、タンパク質が細胞内で生成されるときに生じるので、Ｎ末端からＣ末端まで本明細書に記載されている。
膜貫通ドメインは細胞膜内に配置され、細胞膜にまたがる。膜貫通ドメインは、ＧＣＣタンパク質を細胞膜内に固定する。
キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、細胞の内部に位置し、受容体がアゴニストリガンドへの結合によって活性化されるときにシグナルを中継するように機能する。キナーゼ相同性ドメインは、チロシンキナーゼ活性を有すると予測される；グアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、グアニリルシクラーゼ活性を有すると予測される。
本明細書で使用する「Ａｄ５．Ｆｉｂ３５アデノウイルスベクター」及び「Ａｄ５．Ｆ３５アデノウイルスベクター」は、互換的に使用され、天然Ａｄ５繊維又は繊維のシャフト及びノブ部分をコードするＤＮＡが血清型ＢアデノウイルスＡｄ３５に由来するものに置換されたアデノウイルスベクターを指す。
本明細書で使用する「複製欠損アデノウイルスベクター」は、ウイルス複製に必須のアデノウイルスゲノムの１以上の領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２若しくはＥ４又はそれらの組み合わせ）を欠損しているアデノウイルスベクターを意味し、そのため、トランス補完（例えば、補完細胞又はヘルパーウイルスのいずれかによって提供される）の非存在下で増殖することができない。シス作用配列を除いて初期（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）並びに後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）を含む全ての機能的遺伝子を欠く最小（すなわちｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターも「複製欠損アデノウイルスベクター」の定義に含まれる（例えば、Ｋｏｖｅｓｄｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（１９９７），５８３－５８９；Ｙｅｈ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，ＦＡＳＥＢ １１（１９９７），６１５－６２３；ＷＯ９４／１２６４９；ＷＯ９４／２８１５２も参照されたい）。複製欠損型アデノウイルスベクターは、必要な最小配列を考慮に入れて容易に当業者によって操作され得、これらの例示的な実施形態に限定されない。Ｅ１、又はＥ１とＥ２、又はＥ１とＥ３、又はＥ１とＥ４、又はＥ１とＥ２とＥ３、又はＥ１とＥ２とＥ４、又はＥ１とＥ３とＥ４、又はＥ１とＥ２とＥ３とＥ４を欠くアデノウイルスベクターは、全てこの定義によって企図される。
本明細書で使用する用語「遺伝子発現カセット」は、ユニバーサルＣＤ４＋エピトープにインフレームで融合された可溶性ＧＵＣＹＣ２又は可溶性ＧＵＣＹＣ２の発現を促進することができるアデノウイルス骨格に挿入されるか又は挿入され得るＤＮＡコンストラクトを意味する。遺伝子発現カセットは、一般に、所与のプロモーターの制御下で、関心のある１以上の外来抗原を発現するように構築され、例えば、ＢＧＨポリアデニル化シグナル若しくはＳＶ４０由来のものなどのポリアデニル化シグナル、及び／又は宿主ベクターによってまだ提供されていないコザック領域及び／若しくは追加の終結シグナルなどの他のエレメント又は発現されるコード領域を含み得る。選択されたプロモーターのサイズ、組成、又は複雑さ及び発現パターンなどの多数の要因に応じて、異なるプロモーターが利用され得る。ＣＭＶ ＩＥプロモーターは、多くの組織の種類で効率的に発現されるため、遺伝子発現カセットで一般的に使用される。例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、プロモーターＣＤ１１ｃなどの樹状細胞特異的（参照により本明細書に組み込まれるＭａｓｏｏｄ，Ｒ，ら，２００１ Ｉｎｔ Ｊ ＭｏＩ Ｍｅｄ ８：３３５－３４３，Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ，ら，１９９５ Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７５７０－７５７４）並びにミオシンプロモーター、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、デスミンプロモーター及び哺乳動物トロポニン１プロモーターを含む筋肉特異的プロモーターなどを含む他のプロモーターが、遺伝子発現カセットにおいて使用され得る。
本明細書で使用する用語「可溶性ＧＵＣＹＣ２」、「可溶性ＧＣＣ」、「可溶性ヒトＧＵＣＹＣ２」、「可溶性ヒトＧＣＣ」、「可溶性ＧＵＣＹＣ２ドメイン」、「可溶性ＧＣＣドメイン」、「可溶性ヒトＧＵＣＹＣ２ドメイン」及び「可溶性ヒトＧＣＣドメイン」は、互換的に使用され、ＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメインを含むヒトＧＵＣＹ２Ｃの断片、又は機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５４からアミノ酸酸残基３８４までの配列を含む少なくとも３３０～４２３アミノ酸残基であり、必要に応じて、細胞膜に固定されていない可溶性ＧＵＣＹＣ２の細胞外分泌を依然として許容しながら、ＧＵＣＹＣ２膜貫通ドメインの一部と融合されたヒトＧＵＣＹ２Ｃからの配列を含むその断片を指す。すなわち、ＧＵＣＹＣ２膜貫通ドメインからの任意の配列が含まれる限りにおいて、それはアンカーとして機能するには不十分である。したがって、細胞内で発現すると、可溶性ＧＵＣＹＣ２は細胞によって分泌され得る。可溶性ＧＣＣの分泌はシグナル配列によって促進され、可溶性ＧＣＣをコードする核酸は内因性又は外因性のシグナル配列のいずれかをコードすることが理解される。可溶性ＧＵＣＹＣ２は、ＧＵＣＹＣ２シグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結されていてもよく、追加のアミノ酸を含んでよい。
本明細書で使用する「分泌シグナル」、「分泌ペプチド」、「シグナルペプチド」及び「シグナル配列」は、互換的に使用され、存在する場合に、細胞の外側へのタンパク質の輸送及び分泌をもたらすタンパク質のアミノ酸配列を指すことを意味する。分泌シグナルは、典型的には、前駆体タンパク質のＮ末端又はその近傍における前駆体タンパク質の切断可能な疎水性セグメントである。分泌過程において、そのような分泌シグナルは酵素的に除去され、成熟した形態のタンパク質、すなわち分泌シグナルを欠くタンパク質の形態の分泌をもたらす。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ＧＣＣタンパク質に由来するＧＣＣ分泌シグナルである。ＧＣＣ分泌シグナルとは、ＧＵＣＹＣ２の残基１～約残基２１、２２又は２３を含むＮ末端シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ＧＵＣＹＣ２とは異なる供給源（「外因性シグナル配列」）に由来し、内因性シグナル配列を置き換える。前者の場合、シグナル配列を含むＧＣＣ抗原のコード配列はそのまま用いられる。後者の場合、別の供給源からのシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するシグナル配列の代わりに、タンパク質の残りの部分とインフレームでコード配列ＧＣＣに連結される。そのような場合、シグナル配列は、遺伝子コンストラクトが投与される個人の細胞内で機能的である任意のそのような配列であり得る。
本明細書で使用する「ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープ」は、いくつかの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス２ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）との複合体を形成するペプチド配列であり、この複合体は、次いでＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識され、以下で詳細に論じられる。
本明細書で使用する「ＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍」は、グアニリルシクラーゼＣ又は「ＧＣＣ」を発現する腫瘍を指す。このような腫瘍／癌細胞は、一般に胃腸管内で生じ、食道、胃、膵臓、又は結腸直腸起源の腫瘍／癌細胞を含むがこれらに限定されない。このような腫瘍は、原発性又は転移性であり得る。
本明細書で使用する用語「結腸直腸腫瘍」又は「結腸直腸管内に生じる癌」は、小腸（すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、及びシグモイド結腸、及び直腸を含む大きい腸（大腸））の下の腸管の細胞の癌によって特徴付けられる病状として結腸直腸癌を定義する十分に許容される医学的定義を含むことを意味する。さらに、本明細書で使用する用語「結腸直腸癌」又は「結腸直腸管内に生じる癌」は、十二指腸及び小腸（空腸及び回腸）の細胞の癌によって特徴付けられる病状をさらに含むことを意味する。本明細書で使用される結腸直腸癌の定義は、一般的な医学的定義よりも広範であるが、十二指腸及び小腸の細胞もＧＣＣを含むので、そのように提供される。
本明細書で使用する用語「胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）」又は「胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）」は、胃の細胞の癌によって特徴付けられる病状として胃癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する用語「食道癌」は、食道の細胞の癌によって特徴付けられる病状として食道癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する用語「膵臓癌」は、膵臓の細胞の癌によって特徴付けられる病状として膵臓癌を定義する広く許容される医学的定義を含むことを意味する。
本明細書で使用する「原発腫瘍」は、起源の元の組織に限定されるものである。これは、元の原発組織から他の臓器に播種した転移性腫瘍とは対照的である。
本明細書で使用する「結腸直腸管の外側」は、結腸直腸管内にない臓器を指す。
欠損アデノウイルス遺伝子は、外来導入遺伝子の発現を促進する遺伝子発現カセットによって置換される。これらの欠損ベクターは、通常、遺伝子改変Ａｄゲノムを含むプラスミド又はＡｄ ＤＮＡから構築され、該ベクターは、必要な必須遺伝子を保持し、発現するＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＮ５２．Ｅ６などの相補細胞株で増殖される。
機能的な成熟ＧＣＣタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟ＧＣＣタンパク質は、典型的には、配列番号２のアミノ酸残基２２～１０７３、配列番号２のアミノ酸残基２３～１０７３、又は配列番号２のアミノ酸残基２４～１０７３を含む。成熟ＧＣＣタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
機能的成熟ＧＣＣタンパク質の細胞外ドメインは、典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５４からアミノ酸残基３８４までの配列を含む約３３０～４２３アミノ酸残基を含む。細胞外ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２、２３又は２４からアミノ酸残基４２０～４３５までの配列を含み得る。機能的成熟ＧＣＣタンパク質の細胞外ドメインの配列は、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２からアミノ酸残基４３５までの配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２、２３又は２４からアミノ酸残基４２０～４３５までの配列などの機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５４からアミノ酸残基３８４までの配列を含む機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２からアミノ酸残基４３５までの配列の３３０～４２２アミノ酸残基断片を含み得る。ＧＣＣの細胞外ドメインは、広い組織分布及び異なるリガンド特異性を有するグアニリルシクラーゼＡ、Ｂ及びＧとの相同性を有していない。
機能的成熟ＧＣＣタンパク質の膜貫通ドメインは、典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４３６から約アミノ酸残基４５２までの配列を含む約１６～２３アミノ酸残基を含む。膜貫通ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４３１～約アミノ酸残基４５４の配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基４３６からアミノ酸残基４５２までの配列又は機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基４３１からアミノ酸残基４５４までの配列などの機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基４３１からアミノ酸残基４５４までの配列の１６～２２アミノ酸断片を含み得る。
機能的成熟ＧＣＣタンパク質のキナーゼ相同性ドメインは、典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基５０８から約アミノ酸残基７４５までの配列を含む約２３７～２６０アミノ酸残基を含む。キナーゼ相同性ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４８９～約アミノ酸残基７４９までの配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５０８からアミノ酸残基７４５までの配列又は機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基４８９からアミノ酸残基７４９までの配列などの機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基４８９からアミノ酸残基７４９までの配列の２３７～２５９アミノ酸断片を含み得る。
機能的成熟ＧＣＣタンパク質のグアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基８１６から約アミノ酸残基１００２までの配列を含む約１８６～２５７アミノ酸残基を含む。グアニリルシクラーゼ触媒ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基７５０～約アミノ酸残基１００７までの配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基８１６からアミノ酸残基１００２までの配列又は機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基７５０からアミノ酸残基１００７までの配列などの機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基７５０からアミノ酸残基１００７までの配列の１８６～２５６アミノ酸断片を含み得る。
本発明の可溶性ＧＣＣは、好ましくは、可溶性ＧＣＣ及びユニバーサルＣＤ４＋Ｔエピトープが単一のポリペプチドとして発現する融合タンパク質として発現する。そのため、可溶性ＧＣＣをコードする配列は、好ましくは、２つの領域のインフレーム翻訳融合が生じるようにユニバーサルＣＤ４＋Ｔエピトープをコードする配列に連結される。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、可溶性ＧＣＣのＮ末端又はＣ末端のいずれかに結合してよい。Ｎ末端に結合している場合、それは内因性又は外因性のシグナル配列の下流に挿入される。
凝集体中に、Ｃ末端でユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）に融合されたＧＣＣの最初の約４２９アミノ酸残基約からなる分子のＧＣＣシグナル配列及び細胞外ドメインを含む切断型ＧＵＣＹＣ２が本明細書に例示される。
ＧＣＣなどの腫瘍マーカーを検出する方法は、当技術分野で周知である。例えば、発現は、タンパク質レベルとして、又はｍＲＮＡレベルとして検出され得る。ｑＲＴ－ＰＣＲ分岐オリゴヌクレオチド技術、Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ.）、定量的遺伝子発現試薬及びアッセイ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ.)、検出可能なプローブ（ＦＩＳＨなどの）を用いた定量的遺伝子発現系インサイツハイブリダイゼーション、ドットブロットアッセイ、及び他のＲＮＡ定量増幅技術及びノーザンブロットなどの技術は、ｍＲＮＡレベルの測定に有用であり、質量分析と組み合わせたタンパク質及びペプチド分画を含むタンパク質質量分析、検出可能な結合剤を用いた免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットなどの免疫アッセイ、ＱＰｒｏｔｅｏｍｅ ＦＦＰＥ Ｑｉａｇｅｎ Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｃａｌｉｆ．、逆相タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マーカーの存在及びレベルを検出するのに有用である。米国特許公開第２０１７００４９８６９Ａ１号は、ＧＣＣに適用可能なＲＴ－ＰＣＴ検出方法について記載している。米国特許公開第２０１８０３５５０６２号は、抗ＧＣＣ抗体分子について記載している。
２．０ 概要
原発性及び／又は転移性ＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍に対して個人を保護又は治療するための予防的及び治療的ワクチンが提供される。このようなワクチンを製造するのに有用な組成物、並びにワクチンを製造及び使用する方法が提供される。
原発性及び／又は転移性ＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍に対して個人を保護又は治療するための予防的及び治療的ワクチンが提供される。このようなワクチンを製造するのに有用な組成物、並びにワクチンを製造及び使用する方法が提供される。
癌免疫療法に対する最大の障害の１つは、腫瘍特異的で、十分に免疫原性があり、患者間で共有される抗原の不足である。理想的な標的の代わりに、抗腫瘍免疫応答は、一般的に、腫瘍特異的タンパク質ではなく組織特異的タンパク質に向けられる。自己抗原を使用する際の障壁には、付随する自己免疫及び耐性の潜在的な発達が含まれ、これは免疫療法の有効性を制限する。これらの制限を回避する試みには、免疫特権区画で発現する自己タンパク質の使用が含まれる。制限された区画外の腫瘍におけるそれらの異所性発現は、下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン及び内因性傍分泌ホルモンのグアニリン及びウログアニリンの受容体である標的化グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）が腸上皮細胞の頂端膜に発現し、粘膜免疫区画に制限される機会を提供する。本発明のワクチンは、自己免疫を誘導することなく、食道癌、胃癌、膵臓癌、及び結腸直腸癌を含むＧＵＣＹ２Ｃ発現癌のヒト患者の予防的又は治療的免疫に有用である。
いくつかの実施形態は、一般集団に影響を及ぼす癌、特に結腸直腸癌、及び免疫療法並びに癌の予防、スクリーニング、早期発見、診断、治療、及び／又はサバイバーシップのための改変アデノウイルスベクターベースのワクチンを提供する。該ワクチンは、ウイルスタンパク質Ｆ３５が含まれる組換えアデノウイルスベクターの改変バージョンを用いて、対応するアデノウイルス５のアデノウイルスタンパク質を置き換える。改変アデノウイルスベクターは、Ａｄ５．Ｆ３５と呼ばれることがあり、Ｔ細胞エピトープと結合した癌関連タンパク質ＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン配列の一部などの癌関連タンパク質配列を含む融合タンパク質のコード配列を含む。改変アデノウイルスベクターベースの抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチンは、結腸直腸癌タンパク質を体内の免疫細胞に送達し、結腸直腸癌に対してそれらを教育するために使用される。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、体内に隠れている結腸直腸癌を探して殺すことが可能になり得る。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、次いで、結腸直腸癌タンパク質を発現する細胞を標的とする抗体を生成するか又は生成を誘導することが可能になり得る。これらの教育を受けた免疫細胞のいくつかは、次いで、結腸直腸癌タンパク質を発現する細胞を標的とする抗体及び免疫細胞の生成を誘導することが可能になり得る。
いくつかの実施形態は、一般集団に影響を及ぼす癌、特に結腸直腸癌にリステリアワクチン、並びに免疫療法並びに癌の予防、スクリーニング、早期発見、診断、治療、及び／又はサバイバーシップを提供する。このワクチンは、リステリア・モノサイトゲネスの「無能」バージョンを用いて、結腸直腸癌タンパク質を体内の免疫細胞に送達し、結腸直腸癌関連タンパク質を発現する細胞に対してそれらを教育する。これらの教育を受けた免疫細胞は、タンパク質を発現し、体内に隠れている癌を探して殺すことが可能になり得る。
いくつかの実施形態は、癌、特に結腸直腸癌関連タンパク質ＧＵＣＹ２Ｃなどの癌関連タンパク質を発現する結腸直腸癌細胞に対してワクチン接種する初回刺激－追加免疫方法を提供する。アデノウイルスベースのＧＵＣＹ２Ｃワクチンと改変リステリア・モノサイトゲネスとの組み合わせは、どちらかのワクチンを単独で使用した場合よりも優れた免疫応答をもたらす。
ＧＵＣＹ２Ｃに対する有効な免疫応答は、転移性結腸直腸癌、典型的には致命的である疾患、並びに膵臓、胃、及び食道などのＧＵＣＹ２Ｃタンパク質を発現するいくつかの他の癌などの、そのようなタンパク質を発現する任意の癌を治療するのに有用である。
３．０ アデノウイルスベースの抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチン（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ）ＥＣＤＴ細胞エピトープ）
アデノウイルスは、ワクチン設計のために広く使用されているウイルスベクタープラットフォームを表す。本発明者らは以前に、ＧＵＣＹ２Ｃに対するアデノウイルス（Ａｄ５）及びＤＮＡベースのワクチンがＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を生じさせ、抗腫瘍免疫をもたらすことを実証した。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープと結合したＧＣＣＥＣＤを含むキメラタンパク質を発現する組換えアデノウイルス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属出願第１３／１２０，１４４号に開示されている。本明細書に記載の様々なＧＵＣＹ２ＣＥＣＤＴ細胞エピトープコンストラクトは、抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを生成するためにアデノウイルスＡｄ５ベクターと共に使用され得る。
アデノウイルスは、ワクチン設計のために広く使用されているウイルスベクタープラットフォームを表す。本発明者らは以前に、ＧＵＣＹ２Ｃに対するアデノウイルス（Ａｄ５）及びＤＮＡベースのワクチンがＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を生じさせ、抗腫瘍免疫をもたらすことを実証した。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープと結合したＧＣＣＥＣＤを含むキメラタンパク質を発現する組換えアデノウイルス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属出願第１３／１２０，１４４号に開示されている。本明細書に記載の様々なＧＵＣＹ２ＣＥＣＤＴ細胞エピトープコンストラクトは、抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを生成するためにアデノウイルスＡｄ５ベクターと共に使用され得る。
ヒトにおける遺伝子発現のために現在使用されているアデノウイルスベクターのほとんどは、血清型５ Ａｄベクターに依存している。アデノウイルス感染は、繊維タンパク質を介した細胞表面へのＡｄ５の付着によって開始される（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．１９９６ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２巻，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら（編），２巻，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１１１－２１４８）。三量体線維分子の遠位Ｃ末端ドメインは、Ａｄ５の場合、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）である特異的細胞受容体に結合する「ノブ（Ｋｎｏｂ）」で終わる（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，ＪＭら Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１３２０－１３２３）。結合後、細胞内部移行により、ウイルス付着とは無関係な事象において、ペントン塩基中のＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ－モチーフ）と細胞インテグリンが相互作用する。
Ａｄ５は天然のヒト病原体であり、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症をもたらす（Ｙｕ，Ｂ．ら（２０１２） Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ８４（９）：１４０８－１４１４）。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を予防することによって再感染又はＡｄ５ベースのワクチン接種を制限するＡｄ５特異的中和抗体（ＮＡｂ）を誘導する（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８） Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１；Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，Ｒ．ら（２００８） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６（９）：１６０９－１６１６；Ｓｍａｌｌ，Ｊ．Ｃ．ら（２０１４） Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ９６（５）：８２１－８３１）。
本発明者らは、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ワクチン（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ）によるマウスの免疫が、ＧＵＣＹ２Ｃに対する免疫応答及び結腸直腸癌に対する免疫を惹起することを示した（Ｓｎｏｏｋ ＡＥ，ら Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２００８；１００（１３）：９５０－６）。本発明者らは、第Ｉ相臨床試験でその観察をヒトに拡大した。実施例１は、Ａｄ５中和抗体ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答間の相関を報告し、その中で、応答はＡｄ５ ＮＡｂ低患者において有意に大きかった。ＧＵＣＹ２Ｃに対する１回限りの免疫は、一部の個人では限られた抗腫瘍免疫を生成することができ、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃによる反復ワクチン接種は、投与後のワクチン誘発Ａｄ５中和抗体により無効になり得る。
４．０ 改変型アデノウイルスベースのワクチン
４．１ Ａｄ５Ｆ３５ベクター
天然に存在するＡｄ５ ＮＡｂは、Ａｄ５の表面上の繊維分子を標的とする（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．ら（２０１０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１）：６３０－６３８）。このことは、Ａｄ５の繊維分子をＢグループアデノウイルスＡｄ３５（自然免疫を有するヒト対象はほとんどいない）からの繊維分子で置換すると、天然に存在するＡｄ５免疫の影響を受けないキメラＡｄ５ウイルスベクター（Ａｄ５．Ｆ３５として知られる）が生成され得ることを示唆し得る。Ｓｕｍｉｄａらは、機能的に有意なＡｄ５特異的ＮＡｂが主にＡｄ５ヘキソンタンパク質に向けられることを見出した（Ｓｕｍｉｄａら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５） １７４（１１）７１７９－７１８５）。Ｈｏｎｇらは、ペントン塩基に向けられた抗体に関して有意な中和効果を報告している（Ｈｏｎｇ Ｓ．Ｓ．ら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７：１０３６６－１０３７５）。
４．１ Ａｄ５Ｆ３５ベクター
天然に存在するＡｄ５ ＮＡｂは、Ａｄ５の表面上の繊維分子を標的とする（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．ら（２０１０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１）：６３０－６３８）。このことは、Ａｄ５の繊維分子をＢグループアデノウイルスＡｄ３５（自然免疫を有するヒト対象はほとんどいない）からの繊維分子で置換すると、天然に存在するＡｄ５免疫の影響を受けないキメラＡｄ５ウイルスベクター（Ａｄ５．Ｆ３５として知られる）が生成され得ることを示唆し得る。Ｓｕｍｉｄａらは、機能的に有意なＡｄ５特異的ＮＡｂが主にＡｄ５ヘキソンタンパク質に向けられることを見出した（Ｓｕｍｉｄａら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５） １７４（１１）７１７９－７１８５）。Ｈｏｎｇらは、ペントン塩基に向けられた抗体に関して有意な中和効果を報告している（Ｈｏｎｇ Ｓ．Ｓ．ら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７：１０３６６－１０３７５）。
Ａｄ５．Ｆ３５ベクターを含むＢグループＡｄ繊維を含むベクターは、初期細胞付着のためにＣＤ４６を使用する（Ｇａｇｇａｒ，Ａ．ら（２００３）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０８－１４１２）。ヒトでは、ＣＤ４６は、全ての有核細胞上で、低レベルで発現する。Ａｄ５．Ｆ３５ベクターはインビトロ及び潜在的にインビボで樹状細胞を効率的に形質導入するが、いくつかの知見は、インビボワクチン接種のためのこれらのベクターの有用性に反論する可能性がある。（ｉ）ＣＤ４６シグナル伝達（ＣＤ４６モノクローナル抗体、組換え補体因子Ｃ３ｂ、又は麻疹ウイルスヘマグルチニンの結合時）は、免疫抑制を誘導することができる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ－Ｓｃｈａｕｌｉｅｓ，Ｓ．及びｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｖ．（２００２）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２４：１２７－１４８）。（ｉｉ）肺炎及び敗血症につながるＡｄ３５アウトブレイクの研究は、Ａｄ３５感染によって直接引き起こされた可能性のある一過性の好中球減少症を明らかにした（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９７）．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：７６０－７６３）。（ｉｉｉ）はしかウイルス及びＨＨＶ６は、ＣＤ４６を受容体としても使用し、樹状細胞前駆体、骨髄間質細胞、又はＣＤ３４＋骨髄系前駆細胞のレベルで一過性の免疫抑制を引き起こし得る（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍ．ら（２００２）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：６６３６－６６４２）。これらの考慮事項は、様々な結果を有する研究をもたらした。上記の要因に注目したある研究は、試験抗原（Ｂ型肝炎コア抗原）に対するＡＤ５．Ｆ３５ワクチン接種がＣＤ４６トランスジェニックマウスにおいて免疫抑制を誘導しないことを発見し、その結果が抗原特異的である可能性に留意した（ＤｉＰａｏｌｏ Ｎ，ら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；１３（４）：７５６－７６５）。しかし、霊長類の研究では、麻疹ヘマグルチニンワクチンインサートを有するＡｄ５．Ｆｉｂ３５が、同様にＡｄ５で免疫した動物よりもインサート特異的体液性及び細胞性免疫応答を低下させたことが判明した（Ｏｐｈｏｒｓｔ，Ｏ．Ｊ．ら（２００４）．Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３０３５－３０４４）。
本発明は、ａ）Ａｄ５．Ｆ３５ベクター；並びにｉ）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸；ｉｉ）可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーター；及びｉｉｉ）ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含む遺伝子発現カセットを含むキメラアデノウイルスワクチンベクターＡｄ５．Ｆ３５並びにそれに依存するワクチン及び方法を含む。
本発明のアデノウイルスベクターは、複製能があり得る。しかし好ましくは、アデノウイルスベクターは宿主細胞において複製欠損である。
それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＥＰ １ ６９３ ４５９ Ａ１、ＷＯ２０００／０７３４７８ Ａ９及びＥＰ １ ３２２ ７７４ Ａ２は、Ａｄ５の指向性（ウイルスによって標的とされる細胞／組織）を変更するためのキメラＡｄ５．Ｆ３５ベクターについて記載している。Ａｄ５中和免疫に対する非感受性を記載するものはない。
キメラＡｄ５．Ｆｉｂ３５ウイルスベクターの構築は、３つの断片：（ｉ）Ａｄ５繊維非翻訳領域及び繊維テールドメインの最初の１３２ｂｐ；（ｉｉ）Ａｄ３５シャフト及びノブドメイン；並びに（ｉｉｉ）Ａｄ５繊維ポリアデニル化シグナルを含むＡｄ５Ｅ４領域が、２段階ＰＣＲアプローチを介して増幅されるとＳｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖらによって記載されている。得られた断片を精製した後、それらを組み合わせ、キメラ繊維の正しい末端に対して作られたフォワードプライマー及びリバースプライマーによって追加のＰＣＲ反応に供する。次いで、得られた増幅断片をライゲーションによってドナープラスミドに置換し、キメラ繊維の置換を、Ｒｅｃ＋大腸菌株ＢＪ５１８３内のプラスミド内に含まれるベクターゲノムとの組換えによって行う。対応するウイルスを生成するために、正しいことが検証されたクローンを制限酵素ＰａｃＩで消化してウイルスゲノムを放出し、２９３細胞にトランスフェクトした（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ ＤＭら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００；７４：２５６７－２５８３）。ＥＰ１５５０７２２Ｂ１は、ドナーベクターにおけるＡｄ５繊維配列の直接置換及びその後の組換え及び増幅の同様の手順を記載している。
外来遺伝子インサートを担持するＡｄベクターを構築するために多数の計画が開発されている。伝統的に、Ａｄベクターは、２つの標準的な方法を用いて構築された。第１の方法は、Ａｄゲノムの残りの部分を表すＤＮＡ断片と、Ａｄ配列に隣接する外来遺伝子インサートを担持するプラスミドを制限消化することによって得られるＤＮＡ断片のライゲーションを含むインビトロライゲーション法である（Ｓｔｏｗ ＮＤ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９８１；３７：１７１－８０）。第２の方法は、部位特異的挿入のためのＡｄ配列に隣接する外来遺伝子インサートを担持するシャトルプラスミドと、Ａｄゲノムのほぼ全部を担持するゲノムプラスミドの２つのプラスミド間の、許容細胞株における相同組換えからなっていた（Ｂｅｔｔ ＡＪ，ら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４；９１：８８０２－６）。これらの古典的なベクター構築法は、通常、効率が低く、時には親ウイルスが混入する可能性がある。
従来の方法の限界を回避するために、代替アプローチが開発されている。そのような計画の１つは、Ａｄベクターを作製するための大腸菌（ＢＪ５１８３）の非常に効率的な相同組換え機構に基づいている［１６～１９］。Ａｄゲノムのほぼ全体を含む線状化又はインタクトなプラスミドと、Ａｄゲノム中の挿入部位からの相同配列に隣接する外因性発現カセットを含むシャトルプラスミドとの間の相同組換えにより、所望の領域における改変及び／又は挿入により感染性クローンが作製される。酵母における相同組換えを採用する同様の計画が報告されている［２０］。この計画は、Ａｄゲノムの左末端及び右末端からの配列を含むＡｄ ＤＮＡと酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターとの間の相同組換えを含み、その結果、Ａｄゲノムの感染コピーを含む酵母人工染色体が作製される。切り出したＡｄゲノムを適切な細胞にトランスフェクションすると、感染性ビリオンが作製される。
哺乳動物細胞における相同組換えの低効率を克服するために、バクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ組換えシステムに基づく手法が開発されている（Ａｏｋｉ Ｋ，ら Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１９９９；５：２２４－３１；Ｈａｒｄｙ Ｓ，ら Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９７；７１：１８４２－９；Ｎｇら Ｈｕｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ. １９９９；１０：２６６７－７２；Ｎｇら Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００；１１：６９３－９；Ｎｇら Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：４１８１－９）。Ａｄベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する適切な細胞株へのそれらの同時トランスフェクション後の２つのプラスミド間のＣｒｅ媒介部位特異的組換えの結果として作製される。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰベースのシステムを用いたベクター作製の頻度は、従来の相同組換え法に比べて３０～１００倍高いことが判明している。
４．２ ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ
機能的成熟ＧＣＣタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟ＧＣＣタンパク質は、典型的には、配列番号２のアミノ酸残基２２～１０７３、配列番号２のアミノ酸残基２３～１０７３又は配列番号２のアミノ酸残基２４～１０７３を含む。成熟ＧＣＣタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
機能的成熟ＧＣＣタンパク質は、シグナル配列が切除されると生成される。機能的成熟ＧＣＣタンパク質は、典型的には、配列番号２のアミノ酸残基２２～１０７３、配列番号２のアミノ酸残基２３～１０７３又は配列番号２のアミノ酸残基２４～１０７３を含む。成熟ＧＣＣタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、キナーゼ相同性ドメイン及びグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
ワクチンは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の細胞外ドメインを含むＧＣＣタンパク質の可溶性切断型を含み、これは典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５４からアミノ酸残基３８４までの配列を含む約３３０～４２３アミノ酸残基を含む。細胞外ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２、２３又は２４からアミノ酸残基４２０～４３５までの配列を含み得る。機能的成熟ＧＣＣタンパク質の細胞外ドメインの配列は、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２からアミノ酸残基４３５までの配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２、２３又は２４からアミノ酸残基４２０～４３５までの配列などの機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基５４から約アミノ酸残基３８４までの配列を含む機能的成熟ＧＣＣタンパク質のアミノ酸残基２２からアミノ酸残基４３５までの配列の３３０～４２２アミノ酸残基断片を含み得る。コンストラクトはまた、膜貫通ドメインからの配列を含み得、但し、可溶性ＧＣＣコンストラクトが細胞膜に固定されるのを防ぐために機能するのに十分不十分である。機能的成熟ＧＣＣタンパク質の膜貫通ドメインは、典型的には、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４３６から約アミノ酸残基４５２までの配列を含む約１６～２３アミノ酸残基を含む。膜貫通ドメインは、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４３１から約アミノ酸残基４５４の配列、又は例えば、機能的成熟ＧＣＣの約アミノ酸残基４３６から約アミノ酸残基４５２までの配列又は機能的成熟ＧＣＣの約アミノ酸残基４３１から約アミノ酸残基４５４のまで配列などの、機能的成熟ＧＣＣタンパク質の約アミノ酸残基４３１～約アミノ酸残基４５４までの配列の１６～２２アミノ酸断片を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、膜貫通配列を含まない。
４．３ ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープ
改善された抗ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を誘導するために、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをＧＵＣＹ２Ｃ配列に連結して融合タンパク質を生成してもよい。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、複数のＨＬＡタイプに一致し、したがって複数のＨＬＡタイプによって認識されるペプチド配列である。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープの一例は、ＰＡＤＲＥ（汎ＤＲエピトープペプチド）である。
改善された抗ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を誘導するために、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをＧＵＣＹ２Ｃ配列に連結して融合タンパク質を生成してもよい。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、複数のＨＬＡタイプに一致し、したがって複数のＨＬＡタイプによって認識されるペプチド配列である。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープの一例は、ＰＡＤＲＥ（汎ＤＲエピトープペプチド）である。
ＰＡＤＲＥペプチドは、最も一般的な１６種類のＨＬＡ－ＤＲのうち少なくとも１５種類と複合体を形成する。ヒトは少なくとも１つのＤＲを有し、ＰＡＤＲＥはその種類の多くに結合するので、ＰＡＤＲＥはほとんどのヒトにおいて有効である可能性が高い。ＰＡＤＲＥ及び他のものなどのユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、１９９８年４月７日に発行されたＳｅｔｔｅらの米国特許第５，７３６，１４２号；同第２００２年７月２日に発行されたＳｅｔｔｅらの同第６,４１３,９３５号；及び２００７年４月１０日に発行された同第７,２０２,３５１号及びＷＯ１９９５００７７０７Ａ１に開示されている。
ユニバーサルＨＬＡ－ＤＲエピトープＰＡＤＲＥ（ＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡ）について記載されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ，ら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００ Ｆｅｂ １，１６４（３）：１６２５－３３；Ａｇａｄｊａｎｙａｎら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７４：１５８０－６）。
ＰＡＤＲＥをタンパク質抗原に融合させる場合、何人かの研究者は、目的抗原とインフレームで発現させるペプチド配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡを使用した。
Ｗｅｉ Ｊ，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２００８，２３：１２１－８；
Ｂａｒｇｉｅｒｉ Ｄ Ｙら Ｍｅｍ Ｉｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ ２００７，１０２：３１３－７；
Ｐ．ｖｉｖａｘ ＭＳＰ１ ＤＹＤＶＶＹＬＫＰＬＡＧＭＹＫ（配列番号１２）の３３ｋＤａのＣ末端領域に存在するＴ細胞エピトープも、異なるクラスＩＩ ＨＬＡハプロタイプを有する非ヒト霊長類において強い免疫応答を惹起することが見出されている（Ｒｏｓａら Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２００６，８：２１３０－７；
Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７７８－７８０（１９８８）は、マウス及びヒトにおける多くの異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合してＴ細胞によって認識されるサーカムスポロゾイトタンパク質に由来する熱帯熱マラリア原虫ペプチドについて記載している。残基位置３７８～３９８のＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１３）由来のペプチド、並びにそのＮ及びＣ欠損、例えば、ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１４）、ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１５）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮ（配列番号１６）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶ（配列番号１７）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号１８）は、強い応答を惹起した。
Ｗｅｉ Ｊ，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２００８，２３：１２１－８；
Ｂａｒｇｉｅｒｉ Ｄ Ｙら Ｍｅｍ Ｉｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ ２００７，１０２：３１３－７；
Ｐ．ｖｉｖａｘ ＭＳＰ１ ＤＹＤＶＶＹＬＫＰＬＡＧＭＹＫ（配列番号１２）の３３ｋＤａのＣ末端領域に存在するＴ細胞エピトープも、異なるクラスＩＩ ＨＬＡハプロタイプを有する非ヒト霊長類において強い免疫応答を惹起することが見出されている（Ｒｏｓａら Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２００６，８：２１３０－７；
Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７７８－７８０（１９８８）は、マウス及びヒトにおける多くの異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合してＴ細胞によって認識されるサーカムスポロゾイトタンパク質に由来する熱帯熱マラリア原虫ペプチドについて記載している。残基位置３７８～３９８のＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１３）由来のペプチド、並びにそのＮ及びＣ欠損、例えば、ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１４）、ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１５）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮ（配列番号１６）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶ（配列番号１７）、ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号１８）は、強い応答を惹起した。
本明細書に提供されるのは、そのようなＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の例である異なるタンパク質及び異なるペプチドの例である。これらのタンパク質及びペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの非限定的な例であることを意図する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、破傷風毒素、例えば、ＴＴ８３０-８４４ ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号１９）、及びＴＴ９４７-９６７ ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号２０）Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２２３７－２２４２（１９８９）；Ｒｅｎａｒｄ Ｖ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７１：１５８８－９５；ＴＴ５９０-６０３ＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶ（配列番号２１）、ＴＴ６１５-６２９ＶＲＤＩＩＤＤＦＴＮＥＳＳＱＫ（配列番号２２）、ＴＴ６３９-６５２ＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩ（配列番号２３）、ＴＴ８３０-８４３ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号２４）及びＴＴ９４７-９６７ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号２５）ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；６１：７６４－７９由来であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、インフルエンザヘマグルチニン、例えば、インフルエンザヘマグルチニン残基３０６～３１８ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２６）に由来し得る（Ｂｕｓｃｈら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４４３－４５１（１９９０）；Ｍｏｍら ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；６：２４）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に由来し得る（Ｌｉｔｊｅｎｓら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８；３３０：１－１１）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、細菌性病原体（アナプラズマ・マージナーレなど）の外膜タンパク質（ＯＭＰ）に由来し得る（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｈ，Ｎｏｒｉｍｉｎｅ Ｊ，Ｂｒａｙｔｏｎ Ｋ Ａ，Ｐａｌｍｅｒ Ｇ Ｈ，Ｂｒｏｗｎ Ｗ Ｃ。天然に複合体化された細菌外膜タンパク質の物理的結合は、免疫原性を高める（Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００８；７６：１２２３－９）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）株４１由来のＶＰ１カプシドタンパク質、例えば残基６６～７７ ＩＥＴＲＣＶＬＮＳＨＳＴＡＥＴ（配列番号２７）、残基１４５～１５９ ＥＶＶＰＱＬＬＱＹＭＦＶＰＰＧ（配列番号２８）、及び残基２４７～２６１のＬＶＶＲＩＹＭＲＭＫＨＶＲＡＷ（配列番号２９）に由来し得る（Ｗｅｉ Ｆｏｏら Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１（Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ Ｋ，Ｃｒａｉｇｈｅａｄ Ｎ，Ｌｅｅ Ｋ Ｐ，Ｌｅｖｉｎｅ Ｂ Ｌ，Ｊｕｎｅ Ｃ Ｈ．単球由来樹状細胞によるタンパク質抗原特異的ヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞の効率的な初回刺激（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ） Ｂｌｏｏｄ ２０００； ９６：３４９０－８；Ｎｅｉｄｈａｒｔ Ｊ，Ａｌｌｅｎ Ｋ Ｏ，Ｂａｒｌｏｗ Ｄ Ｌ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｍ，Ｓｈａｗ Ｄ Ｒ，Ｔｒｉｏｚｚｉ ＰＬ，Ｃｏｎｒｙ Ｒ Ｍ）に由来し得る。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子の有無にかかわらず、リポソームエマルジョン中のモノホスホリルリピッドＡを配合した組換えバキュロウイルス由来ＫＳＡ（Ｅｐ－ＣＡＭ）による結腸直腸癌患者の免疫化。Ｖａｃｃｉｎｅ ２００４；２２：７７３－８０；Ｐｉｒｉｏｕ Ｅ Ｒ，ｖａｎ Ｄｏｒｔ Ｋ，Ｎａｎｌｏｈｙ Ｎ Ｍ，ｖａｎ Ｏｅｒｓ Ｍ Ｈ，Ｍｉｅｄｅｍａ Ｆ，ｖａｎ Ｂａａｒｌｅ Ｄ。ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出のための新規方法は、未治療のＨＩＶ感染対象におけるＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の低下を示す（Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＥＢＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ＨＩＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｕｂｊｅｃｔｓ） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；３５：７９６－８０５；Ｈｅｌｌｅｒ Ｋ Ｎ，Ｕｐｓｈａｗ Ｊ，Ｓｅｙｏｕｍ Ｂ，Ｚｅｂｒｏｓｋｉ Ｈ，Ｍｕｎｚ Ｃ。別々のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、健康なウイルスキャリアにおけるエプスタイン・バーウイルス核抗原１の免疫認識を媒介する（Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ４＋Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ １ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｉｒｕｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ） Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１１３８－４６）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＥＢＶ ＬＭＰＩ、例えば、ＬＭＰ１１５９-１７５ＹＬＱＱＮＷＷＴＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３０）に由来し得る。Ｋｏｂａｙａｓｈｉら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８：９０１－８）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ２４、例えば、Ｇａｇ１３１－１５ＮＹＰＩＶＱＮＩＱＧＱＭＶＨＱＡＩＳＰＲ（配列番号３１）、
Ｇａｇ２１１－２３０ＥＷＤＲＶＨＰＶＨＡＧＰＩＡＰＧＱＭＲＥ（配列番号３２）、
Ｇａｇ２４１－２６０ＳＴＬＱＥＱＩＧＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧＥ（配列番号３３）、
Ｇａｇ２６３－２７７ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号３４）、
Ｇａｇ２７１－２９０ＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫ（配列番号３５）、
Ｇａｇ２９１－３１０ＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳ（配列番号３６）、
Ｇａｇ３０１－３２０ＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥＴ（配列番号３７）、
Ｇａｇ３２１－３４０ＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫＡＬＧＰＡ（配列番号３８）、
Ｇａｇ３３１－３５０ＫＴＩＬＫＡＬＧＰＡＡＴＬＥＥＭＭＴＡＣ（配列番号３９）に由来し得る（Ｐａｊｏｔら Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７；３７：２６３５－４４）。
Ｇａｇ２１１－２３０ＥＷＤＲＶＨＰＶＨＡＧＰＩＡＰＧＱＭＲＥ（配列番号３２）、
Ｇａｇ２４１－２６０ＳＴＬＱＥＱＩＧＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧＥ（配列番号３３）、
Ｇａｇ２６３－２７７ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号３４）、
Ｇａｇ２７１－２９０ＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫ（配列番号３５）、
Ｇａｇ２９１－３１０ＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳ（配列番号３６）、
Ｇａｇ３０１－３２０ＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥＴ（配列番号３７）、
Ｇａｇ３２１－３４０ＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫＡＬＧＰＡ（配列番号３８）、
Ｇａｇ３３１－３５０ＫＴＩＬＫＡＬＧＰＡＡＴＬＥＥＭＭＴＡＣ（配列番号３９）に由来し得る（Ｐａｊｏｔら Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７；３７：２６３５－４４）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、５５６～５８０位のＶＰＦＨＩＱＶＰＱＫＦＦＡＩＫＮＬＬＬＬＰＧＳＹＴ（配列番号４０）、残基５６～８０ ＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹ（配列番号４１）、残基３１６～３３５ ＧＱＱＳＭＰＮＲＰＮＹＩＡＦＲＤＮＦＩＧ（配列番号４２）及び残基９０６～９３０ ＥＶＤＰＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＲＰＨＲ（配列番号４３）（Ｌｅｅｎら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００８；８２：５４６－５４）で見出される残基のアデノウイルス５ヘキソンタンパク質に由来し得る。全部で、複数のＭＨＣ－ＩＩハプロタイプについて３０個超のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが同定されている。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ワクシニアウイルスタンパク質、例えば、残基２１～２９のＦ１７Ｒタンパク質残基（ＹＬＶＬＫＡＶＫＶ）及び残基２０～２８のＡ１０Ｌタンパク質残基ＦＲＩＶＳＴＶＬＰに由来し得る（Ｃａｌｖｏ－Ｃａｌｌｅら ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２００７；３：１５１１－２９）。Ｃａｌｖｏ－Ｃａｌｌｅは、２４種の異なるワクシニアタンパク質からの複数のＭＨＣ－ＩＩハプロタイプについて２５超のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定した。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、結核菌ヒートショックタンパク質に由来する（Ｌｉｕ Ｄ Ｗ，Ｔｓａｏ Ｙ Ｐ，Ｋｕｎｇ Ｊ Ｔ，Ｄｉｎｇ Ｙ Ａ，Ｓｙｔｗｕ Ｈ Ｋ，Ｘｉａｏ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｓ Ｌ）。子宮頸癌の潜在的なワクチンとしてヒートショックタンパク質ＤＮＡと融合されたヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７ペプチドＤＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ Ｅ７ ｐｅｐｔｉｄｅ ＤＮＡ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＮＡ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００； ７４：２８８８－９４。）
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＩｇＧのＦｃ部分に由来する（Ｙｏｕ Ｚ，Ｈｕａｎｇ Ｘ Ｆ，Ｈｅｓｔｅｒ Ｊ，Ｒｏｌｌｉｎｓ Ｌ，Ｒｏｏｎｅｙ Ｃ，Ｃｈｅｎ Ｓ Ｙ）。受容体媒介内部移行経路を標的とする改変抗原を発現する樹状細胞による活発なヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の誘導並びにＢ細胞応答（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｇｏｒｏｕｓ ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００； １６５：４５８１－９１）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ヒトＬＡＭＰ－１タンパク質のリソソーム標的化シグナルに由来する（Ｓｕ Ｚ，Ｖｉｅｗｅｇ Ｊ，Ｗｅｉｚｅｒ Ａ Ｚ，Ｄａｈｍ Ｐ，Ｙａｎｃｅｙ Ｄ，Ｔｕｒａｇａ Ｖ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｊ，Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ Ｄ，Ｇｉｌｂｏａ Ｅ，Ｄａｎｎｕｌｌ Ｊ）。キメラ遺伝子産物をコードするＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞を用いたテロメラーゼ特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の誘導の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；６２：５０４１－８）。
示されたＨＬＡ分子のＨＬＡハプロタイプの試料及び代表的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープには、以下のもの：
ＨＬＡＤＲ＊１１０１－破傷風トキソイドペプチド残基８２９－８４４、ヘマグルチニンペプチド残基３０６－３１８（Ｍｏｒｏ Ｍ，Ｃｅｃｃｏｎｉ Ｖ，Ｍａｒｔｉｎｏｌｉ Ｃ，Ｄａｌｌｅｇｎｏ Ｅ，Ｇｉａｂｂａｉ Ｂ，Ｄｅｇａｎｏ Ｍ，Ｇｌａｉｃｈｅｎｈａｕｓ Ｎ，Ｐｒｏｔｔｉ Ｍ Ｐ，Ｄｅｌｌａｂｏｎａ Ｐ，Ｃａｓｏｒａｔｉ Ｇ。病原体又は腫瘍由来の合成ペプチドでの負荷を受容できる機能的ＨＬＡ－ＤＲ＊１１０１テトラマーの作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＨＬＡ－ＤＲ＊１１０１ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ ｆｏｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ ｏｒ ｔｕｍｏｕｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５； ６：２４。）
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）－破傷風トキソイドペプチド残基６３９－６５２、８３０－８４３又は９４７－９６７及び１４の他の破傷風トキソイドペプチド（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ Ｌ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｒ，Ｌｏｎｇｍａｔｅ Ｊ，Ａｕｇｅ Ｃ，Ｌｏｗ Ｌ，Ｐｒｉｍｕｓ Ｊ，Ｄｉａｍｏｎｄ Ｄ Ｊ。ＨＬＡ Ａ＊０２０１／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおける最小エピトープワクチンによるＣＴＬ応答の誘導：ＨＬＡクラスＩＩ制限Ｔ（Ｈ）応答への依存性（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ＨＬＡ Ａ＊０２０１／ＤＲ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ（Ｈ） ｒｅｓｐｏｎｓｅ） Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；６１：７６４－７９；及びＪａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｌｏｎｇ ｍａｔｅ。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ｂｒｏａｄ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１－ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５－１５９又は２４７－２６１及び５つの異なる破傷風トキソイドペプチド（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ，Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ，Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１カプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１） Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；及びＪａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｐｏｏｈ。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｒｏａｄ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５－ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５－１５９又は２４７－２６１（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ，Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ，Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１キャプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１．Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊ １３０１－ＥＶ７１ ＶＰＩ 残基 １４５－１５９又は２４７－２６１（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ， Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ， Ａｌｏｎｓｏ Ｓ， Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１ カプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１． Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。
ＨＬＡ－ＤＲ９－エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ１）残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜伏膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲ５３ ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜在性膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８； ６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲ１５ ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜在性膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８； ６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１－１５種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１－９種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１－７種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１０１－８種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
が含まれるが、これらに限定されない。
ＨＬＡＤＲ＊１１０１－破傷風トキソイドペプチド残基８２９－８４４、ヘマグルチニンペプチド残基３０６－３１８（Ｍｏｒｏ Ｍ，Ｃｅｃｃｏｎｉ Ｖ，Ｍａｒｔｉｎｏｌｉ Ｃ，Ｄａｌｌｅｇｎｏ Ｅ，Ｇｉａｂｂａｉ Ｂ，Ｄｅｇａｎｏ Ｍ，Ｇｌａｉｃｈｅｎｈａｕｓ Ｎ，Ｐｒｏｔｔｉ Ｍ Ｐ，Ｄｅｌｌａｂｏｎａ Ｐ，Ｃａｓｏｒａｔｉ Ｇ。病原体又は腫瘍由来の合成ペプチドでの負荷を受容できる機能的ＨＬＡ－ＤＲ＊１１０１テトラマーの作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＨＬＡ－ＤＲ＊１１０１ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ ｆｏｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ ｏｒ ｔｕｍｏｕｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５； ６：２４。）
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）－破傷風トキソイドペプチド残基６３９－６５２、８３０－８４３又は９４７－９６７及び１４の他の破傷風トキソイドペプチド（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ Ｌ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｒ，Ｌｏｎｇｍａｔｅ Ｊ，Ａｕｇｅ Ｃ，Ｌｏｗ Ｌ，Ｐｒｉｍｕｓ Ｊ，Ｄｉａｍｏｎｄ Ｄ Ｊ。ＨＬＡ Ａ＊０２０１／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおける最小エピトープワクチンによるＣＴＬ応答の誘導：ＨＬＡクラスＩＩ制限Ｔ（Ｈ）応答への依存性（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ＨＬＡ Ａ＊０２０１／ＤＲ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ（Ｈ） ｒｅｓｐｏｎｓｅ） Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；６１：７６４－７９；及びＪａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｌｏｎｇ ｍａｔｅ。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ｂｒｏａｄ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１－ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５－１５９又は２４７－２６１及び５つの異なる破傷風トキソイドペプチド（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ，Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ，Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１カプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１） Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；及びＪａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｐｏｏｈ。テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｒｏａｄ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５－ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５－１５９又は２４７－２６１（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ，Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ，Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１キャプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１．Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊ １３０１－ＥＶ７１ ＶＰＩ 残基 １４５－１５９又は２４７－２６１（Ｗｅｉ Ｆｏｏ Ｄ Ｇ， Ｍａｃａｒｙ Ｐ Ａ， Ａｌｏｎｓｏ Ｓ， Ｐｏｈ Ｃ Ｌ．エンテロウイルス７１のＶＰ１ カプシドタンパク質上のヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋） Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１． Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。
ＨＬＡ－ＤＲ９－エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ１）残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜伏膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲ５３ ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜在性膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８； ６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲ１５ ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９－１７５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｇａｔｏ Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ｍ，Ｈａｒａｂｕｃｈｉ Ｙ，Ｃｅｌｉｓ Ｅ．ナチュラルキラーリンパ腫細胞に対するＥＢＶ潜在性膜タンパク質１特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ－ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８； ６８：９０１－８）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１－１５種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１－９種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１－７種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
ＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１０１－８種類の破傷風トキソイドペプチド（Ｊａｍｅｓ Ｅ Ａ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｄ，Ｈｕｓｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｔｉ Ｍ，Ｋｗｏｋ Ｗ Ｗ．テトラマー誘導エピトープマッピングは、破傷風毒素特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の広範で個別化されたレパートリーを明らかにし、エピトープ認識におけるＨＬＡベースの違いを示唆している（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒＥＶｅａｌｓ ｂｒｏａｄ, ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ＨＬＡ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ. Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； １９：１２９１－３０１）。
が含まれるが、これらに限定されない。
４．４ ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンコンストラクト
本明細書で使用するＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣユニバーサルＴ細胞エピトープ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤユニバーサルＴ細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルＴ細胞エピトープ融合タンパク質に結合したＧＵＣＹ２ＣＥＣＤがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルＴ細胞エピトープに結合したＧＵＣＹ２ＣＥＣＤをコードする遺伝子挿入物を有するＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスベクターを指すために互換的に使用される。好ましい実施形態では、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣワクチンのユニバーサルＴ細胞エピトープが、ユニバーサルＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥである。そのため、好ましい実施形態は、互換的にＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ及びＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤＰＡＤＲＥと呼ばれることがある。ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを使用する方法への全ての言及は、特に一般的なＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン及びＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ－ＰＡＤＲＥワクチンを説明することを意図している。
本明細書で使用するＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣユニバーサルＴ細胞エピトープ、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤユニバーサルＴ細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルＴ細胞エピトープ融合タンパク質に結合したＧＵＣＹ２ＣＥＣＤがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルＴ細胞エピトープに結合したＧＵＣＹ２ＣＥＣＤをコードする遺伝子挿入物を有するＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスベクターを指すために互換的に使用される。好ましい実施形態では、ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣワクチンのユニバーサルＴ細胞エピトープが、ユニバーサルＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥである。そのため、好ましい実施形態は、互換的にＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ及びＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤＰＡＤＲＥと呼ばれることがある。ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを使用する方法への全ての言及は、特に一般的なＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン及びＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ－ＰＡＤＲＥワクチンを説明することを意図している。
４．５ ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを使用する治療法
本発明の態様は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌／腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、同定された転移性疾患及び微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
本発明の態様は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌／腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、同定された転移性疾患及び微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
該ワクチンは、粘膜組織を含む癌の診断時に提供される通常の治療と共にアジュバント治療的処置を提供する。上述の本出願で論じたように、当業者は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現しているとして癌又は腫瘍を診断することができる。転移性疾患の検出は、日常的な方法論を用いて行うことができるが、癌の初期診断時には、ある程度の微小レベルの癌が検出できない場合がある。治療の典型的な様式には、手術、化学療法若しくは放射線療法、又は様々な組み合わせが含まれる。ＧＵＣＹ２Ｃを標的とするワクチンは、正常組織を攻撃するのではなく、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する免疫学的に保護された区画から派生する癌細胞を選択的に検出及び排除するという利点を備えた追加の対抗手段を提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、個人が癌を有すると診断され、癌がＧＵＣＹ２Ｃを発現していると特定される。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープと結合した可溶性ＧＵＣＹ２Ｃを発現するＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンは、単独で、又は手術、及び／若しくは放射線治療及び／若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
４．６ ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを使用する予防的方法
該ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ癌／腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用してもよい。摘出されたか又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
該ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ癌／腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用してもよい。摘出されたか又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
粘膜組織癌として発症するリスクがある個人は、検出可能な疾患を有する個人に先立って、癌細胞を排除する免疫応答を誘導するためにワクチンを投与され得る。いくつかの実施形態では、そのような個人はまた、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ型について特定され得る。個人に投与されるワクチンは、個人によって認識される粘膜制限抗原及び１以上のＣＤ４＋ヘルパーエピトープのタンパク質又は遺伝子コードを含む。しかし、ＰＡＤＲＥなどのユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープを利用する方がより実用的であり得る。
４．７ ワクチンの組成物、製剤、用量及び投与計画
いくつかの実施形態によるワクチンは、核酸分子、ウイルスなどの核酸分子を含むベクター、タンパク質又は細胞であり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態によるワクチンは、核酸分子、ウイルスなどの核酸分子を含むベクター、タンパク質又は細胞であり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態では、例えば、活性剤は、医薬として許容されるビヒクルと会合した溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝剤及び防腐剤）を維持する添加剤を含んでもよい。該製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
注射用組成物は、例えば、滅菌水などの希釈剤、電解質／デキストロース、植物起源の脂肪油、脂肪酸エステル、又はプロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのポリオール中に免疫原を含み得る。注射剤は無菌で、発熱物質を含まないものでなければならない。
該ワクチンは、免疫原性応答の認識及び誘導のために免疫原性物質を身体の免疫系に提示することを可能にする任意の手段によって投与され得る。医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内に投与され得る。
投与量は、活性剤の性質及び特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその様式及び投与経路；レシピエントの年齢、健康、体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果などの既知の要因に応じて変化する。ある量の免疫原が、保護的又は治療的に有効な免疫応答を誘導するために送達される。当業者は、日常的な方法によって範囲及び最適な投与量を容易に決定することができる。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
５．０ リステリア・モノサイトゲネスベクターベースのワクチン
本発明者らは、ＧＵＣＹ２Ｃ（Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）の組換え株を開発し、感染したマクロファージ内でＧＵＣＹ２Ｃを分泌する能力（図１１）、Ａｄ５（図１２）又はＤＮＡワクチン接種（図１３）後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を増強する能力を実証した。これらのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃベースのワクチン接種投与計画は、結腸直腸、胃、食道、膵臓、及び唾液を含むが、これらに限定されないＧＵＣＹ２Ｃ発現癌の患者において堅牢な抗腫瘍効果を誘導することが期待される。「Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ」のいくつかの異なるバリエーションが開示されている：
１．Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．サイトゾル分泌を促進するために、ＬＬＯのＣ末端（アミノ酸約１～約４２０）に融合されたＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）を使用する。
２．Ｌｍ－ＡｃｔＡ－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．ＡｃｔＡＮ１００＊として知られるＡｃｔＡの改変型のＣ末端に融合されたＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）を使用する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１８００３０４５７Ａ１号に記載）
３．Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｓｙｎ１８×５－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．融合タンパク質の発現を増強するためのＳｙｎ１８×５配列に結合されたＣ末端のＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）（米国特許公開第２０１８００３０４５７Ａ１号）とサイトゾル分泌を促進するためのＮ末端のＡｃｔＡＮ１００＊として知られるＡｃｔＡの改変型（米国特許公開第２０１８００３０４５７Ａ１号に記載）からなる融合タンパク質を使用する。
４．単独で、又は他のタンパク質に融合させたＧＵＣＹ２Ｃタンパク質／ペプチドの発現を促進するプロモーターを含むＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの他のバリエーションも可能であり、開示されている。
本発明者らは、ＧＵＣＹ２Ｃ（Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）の組換え株を開発し、感染したマクロファージ内でＧＵＣＹ２Ｃを分泌する能力（図１１）、Ａｄ５（図１２）又はＤＮＡワクチン接種（図１３）後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を増強する能力を実証した。これらのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃベースのワクチン接種投与計画は、結腸直腸、胃、食道、膵臓、及び唾液を含むが、これらに限定されないＧＵＣＹ２Ｃ発現癌の患者において堅牢な抗腫瘍効果を誘導することが期待される。「Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ」のいくつかの異なるバリエーションが開示されている：
１．Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．サイトゾル分泌を促進するために、ＬＬＯのＣ末端（アミノ酸約１～約４２０）に融合されたＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）を使用する。
２．Ｌｍ－ＡｃｔＡ－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．ＡｃｔＡＮ１００＊として知られるＡｃｔＡの改変型のＣ末端に融合されたＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）を使用する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１８００３０４５７Ａ１号に記載）
３．Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｓｙｎ１８×５－ＧＵＣＹ２Ｃ：
ａ．ｈｌｙ［リステリオリシンＯ；（ＬＬＯ）］；ｉａｐ［ｐ６０；ｐ６０］，ａｃｔａ[アクチン集合誘導タンパク質；（ａｃｔＡ）］などの強力なＬｍプロモーター；又は他のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用する。
b．融合タンパク質の発現を増強するためのＳｙｎ１８×５配列に結合されたＣ末端のＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（アミノ酸約２３～約４２９）（米国特許公開第２０１８００３０４５７Ａ１号）とサイトゾル分泌を促進するためのＮ末端のＡｃｔＡＮ１００＊として知られるＡｃｔＡの改変型（米国特許公開第２０１８００３０４５７Ａ１号に記載）からなる融合タンパク質を使用する。
４．単独で、又は他のタンパク質に融合させたＧＵＣＹ２Ｃタンパク質／ペプチドの発現を促進するプロモーターを含むＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの他のバリエーションも可能であり、開示されている。
いくつかの実施形態では、これらは、
１．野生型１０４０３Ｓリステリア・モノサイトゲネス株のΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢバージョン（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７,６９１,３９３号；同第７,６９５,７２５号）
２．上記のΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢバージョンに由来し、ｕｖｒＡ及びｕｖｒＢ遺伝子欠損も含む死滅しているが代謝活性のある（ＫＢＭＡ）バージョン
３．野生型１０４０３Ｓリステリア・モノサイトゲネス株のｄａｌ ｄａｔ ΔａｃｔＡバージョン
４．ｐｒｆＡ欠損リステリア・モノサイトゲネス株ＸＦＬ－７
を含むが、これらに限定されない様々なＬｍ株の「骨格」を使用し得る。
１．野生型１０４０３Ｓリステリア・モノサイトゲネス株のΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢバージョン（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７,６９１,３９３号；同第７,６９５,７２５号）
２．上記のΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢバージョンに由来し、ｕｖｒＡ及びｕｖｒＢ遺伝子欠損も含む死滅しているが代謝活性のある（ＫＢＭＡ）バージョン
３．野生型１０４０３Ｓリステリア・モノサイトゲネス株のｄａｌ ｄａｔ ΔａｃｔＡバージョン
４．ｐｒｆＡ欠損リステリア・モノサイトゲネス株ＸＦＬ－７
を含むが、これらに限定されない様々なＬｍ株の「骨格」を使用し得る。
いくつかの実施形態では、Ｌｍベクターは、上記の節４．２に記載したものなどのいくつかの異なるＧＵＣＹ２Ｃインサートのいずれか１つを含む。いくつかの好ましい実施形態では、それと結合したユニバーサルエピトープを含まないＧＵＣＹ２ＣＥＣＤのコード配列はＬｍベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、節４．２に記載されるものなどのＧＵＣＹ２Ｃインサートは、節４．３に記載のユニバーサルＴ細胞エピトープに連結され得る。本明細書で使用するＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣユニバーサルＴ細胞エピトープ及びＬｍ－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤユニバーサルＴ細胞エピトープは、感染細胞によって発現及び分泌されるユニバーサルＴ細胞エピトープ融合タンパク質に結合されたＧＵＣＹ２ＣＥＣＤがワクチンでの感染により生じるように、ユニバーサルＴ細胞エピトープに結合したＧＵＣＹ２ＣＥＣＤをコードする遺伝子インサートを有するＬｍベクターを指すために互換的に使用される。ユニバーサルＴ細胞エピトープを含有するいくつかの実施形態では、ユニバーサルＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥ．Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ及びＬｍ－ＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ－ＰＡＤＲＥは、ＰＡＤＲＥを含むそのような実施形態を指すために互換的に使用される。
６．０ ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン又はＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣワクチンとＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンの組み合わせを用いた治療法
本発明の態様は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌／腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、特定された転移性疾患並びに微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
本発明の態様は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌／腫瘍を有する個人を治療する方法を含む。治療は全身的に提供される。本明細書に記載のワクチンでこのような個人を治療することにより、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を特異的に標的とする免疫応答を、個人の免疫系の末梢区画において誘導することができる。該ワクチンは、特定された転移性疾患並びに微小転移などの任意の未検出の転移を含む原発性又は転移性疾患を治療する。
該ワクチンは、粘膜組織を含む癌の診断時に提供される通常の治療と共にアジュバント治療的処置を提供する。上述の本出願で論じたように、当業者は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現しているとして癌又は腫瘍を診断することができる。転移性疾患の検出は、日常的な方法論を用いて行うことができるが、癌の初期診断時には、ある程度の微小レベルの癌が検出できない場合がある。治療の典型的な様式は、手術、化学療法若しくは放射線療法、又は様々な組み合わせを含む。ＧＵＣＹ２Ｃを標的とするワクチンは、正常組織を攻撃するのではなく、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する免疫学的に保護された区画に由来する癌細胞を選択的に検出及び排除するという利点を備えた追加の対抗手段を提供する。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はＧＵＣＹ２Ｃを発現していると特定される。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープと結合した可溶性ＧＵＣＹ２Ｃを発現するＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンは、単独で、又は手術、及び／若しくは放射線治療及び／若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はＧＵＣＹ２Ｃを発現していると特定される。可溶性ＧＵＣＹ２Ｃを発現するＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンは、単独で、又は手術、及び／若しくは放射線治療及び／若しくは他の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として患者に投与される。
いくつかの実施形態では、個人は癌を有すると診断され、癌はＧＵＣＹ２Ｃを発現していると特定される。アデノウイルスベクター系の抗ＧＵＣＹ２ＣワクチンとＬｍベクター系の抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチンの両方を順次組み合わせて初回刺激－追加免疫法を行う。いくつかの実施形態では、個人に、まずＧＵＣＹ２Ｃの可溶型を発現するアデノウイルスベクターを投与し、続いてＬｍベクター系の抗ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを投与する。いくつかのそのような実施形態では、個人は、好ましくは、最初にＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン、続いてＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを投与されるが、該ワクチンは逆の順序で送達され得る。最初のワクチン接種と２回目のワクチン接種の間の最短間隔は約２～４週間である。好ましい間隔は約４～６週間である。間隔は最大１２ヶ月間であり得る。ワクチン併用療法は、手術、及び／又は放射線治療及び／又は他の抗癌剤の投与と組み合わせて投与され得る。
７．０ ＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン、又はＡＤ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２ＣワクチンとＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンの組み合わせを用いた予防的方法
該ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ癌／腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用されてもよい。摘出した又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
該ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ癌／腫瘍として発症するリスクがある個人において予防的に使用されてもよい。摘出した又は寛解中の原発性疾患の以前の診断は、個人をより高いリスクに置く。
ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌を発症するリスクのある個人は、検出可能な疾患を有する個人に先立って、癌細胞を排除する免疫応答を誘導するためにワクチンを投与され得る。
８．０ ワクチンの組成物、製剤、用量及び投与計画
いくつかの実施形態によるワクチンは、アデノウイルスベクター又はＬｍベクターであり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態によるワクチンは、アデノウイルスベクター又はＬｍベクターであり得る活性剤と組み合わせた医薬として許容される担体を含む。医薬製剤は周知であり、そのような活性剤を含む医薬組成物は、当業者によって日常的に製剤化され得る。適切な医薬担体は、この分野における標準的な参照テキストであるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。本発明は、医薬として許容される担体と活性剤を含む注射用医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含まない。
いくつかの実施形態では、例えば、活性剤は、医薬として許容されるビヒクルと会合した溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝剤及び防腐剤）を維持する添加剤を含んでもよい。該製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
注射用組成物は、例えば、滅菌水などの希釈剤、電解質／デキストロース、植物起源の脂肪油、脂肪酸エステル、又はプロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのポリオール中に免疫原を含み得る。注射剤は無菌で、発熱物質を含まないものでなければならない。
該ワクチンは、免疫原性応答の認識及び誘導のために免疫原性物質を身体の免疫系に提示することを可能にする任意の手段によって投与され得る。該医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内に投与され得る。
投与量は、活性剤の性質及び特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその様式及び投与経路；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果などの既知の要因に応じて変化する。ある量の免疫原が、保護的又は治療的に有効な免疫応答を誘導するために送達される。当業者は、日常的な方法によって範囲及び最適な投与量を容易に決定することができる。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の実施例は、例示的な実施形態としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例１
Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥを投与された第１相臨床試験患者は、１０未満から１０,０００超の範囲のＡｄ５中和抗体（ＮＡｂ）価を有していた。患者の半数が２００をはるかに下回る力価（Ａｄ５ ＮＡｂ低）を有し、残りの半数が２００をはるかに超える力価を有する（Ａｄ５ ＮＡｂ高い）という明らかなパターンが現れた。患者をＡｄ５ ＮＡｂ低コホートと高コホートに分けると、Ａｄ５ ＮＡｂ力価とＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答との関係が明らかになり、Ａｄ５ ＮＡｂ低患者では応答が顕著に大きかった（図３）。まとめると、これらのデータは、既存のＡｄ５ ＮＡｂが高用量の投与にもかかわらず、かつ他のワクチンとは対照的に、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥの有効性を排除することを実証する本発明者らの動物データ（図４）と一致している（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。追加の結果を表１に示す：
表１．Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、Ａｄ５ ｎＡｂによって制限される。
実施例１
Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥを投与された第１相臨床試験患者は、１０未満から１０,０００超の範囲のＡｄ５中和抗体（ＮＡｂ）価を有していた。患者の半数が２００をはるかに下回る力価（Ａｄ５ ＮＡｂ低）を有し、残りの半数が２００をはるかに超える力価を有する（Ａｄ５ ＮＡｂ高い）という明らかなパターンが現れた。患者をＡｄ５ ＮＡｂ低コホートと高コホートに分けると、Ａｄ５ ＮＡｂ力価とＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答との関係が明らかになり、Ａｄ５ ＮＡｂ低患者では応答が顕著に大きかった（図３）。まとめると、これらのデータは、既存のＡｄ５ ＮＡｂが高用量の投与にもかかわらず、かつ他のワクチンとは対照的に、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥの有効性を排除することを実証する本発明者らの動物データ（図４）と一致している（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。追加の結果を表１に示す：
表１．Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、Ａｄ５ ｎＡｂによって制限される。
Ａｄ５ ＮＡｂは、米国において約４０％を含むほとんどのヒト集団において一般的であり（Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ.ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）、Ａｄ５ベースのワクチンの免疫原性を低下させる（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。重要なことに、ほとんどの天然に存在するＡｄ５ ＮＡｂは、Ａｄ５の表面上の繊維分子を標的としている（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．ら（２０１０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１）：６３０－６３８）。Ａｄ５とは対照的に、ほとんどの国におけるＡｄ３５特異的抗体の血清有病率は非常に低い（＜１０％；Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）。まとめると、これらの観察結果は、Ａｄ５の繊維分子をＡｄ３５の繊維分子で置き換えると、天然に存在するＡｄ５免疫の影響を受けないキメラＡｄ５ウイルスベクター（Ａｄ５．Ｆ３５として知られる）が生成されることを示唆している。実際、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ第１相試験の対象の５０％が高いＡｄ５ ＮＡｂ（力価＞２００）を有していたのに対し、高いＡｄ５．Ｆ３５ＮＡｂを保有している対象は１／１０に過ぎない（図５）。そのため、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥは、公開された文献によって予測されるように、用量漸増によって達成されなかったＡｄ５特異的な既存の免疫を克服すると予想される（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）。Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。
実施例２
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを生成するために、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコード配列を合成し、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を高めるために、配列番号３に記載の哺乳動物コドン最適化配列を生成した。このコンストラクトをＡｄ５．Ｆ３５ベクターにサブクローニングし、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを生成した。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを生成するために、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコード配列を合成し、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を高めるために、配列番号３に記載の哺乳動物コドン最適化配列を生成した。このコンストラクトをＡｄ５．Ｆ３５ベクターにサブクローニングし、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを生成した。
全体として、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの構造は、３つの例外を除いて、野生型Ａｄ５（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＹ３３９８６５．１）と同一である。最初に、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ発現カセットは、Ａｄ５のＥ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域（ヌクレオチド４５５－３５１２）を置換し、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ複製を無能にした。第２に、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥはＥ３領域（ヌクレオチド２８５８６－３０４６４）の大きな欠失を有する。Ｅ３領域は、免疫抑制機能を有するいくつかのタンパク質を有する。これらのＥ３タンパク質は全て、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥにおいて欠失している。
最後に、Ａｄ５繊維をＡｄ３５繊維に置換し、患者におけるＡｄ５に対する既存の抗体によるベクターの中和を最小化する。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ ＤＮＡコンストラクト作製
ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコード配列を合成し、開始ＡＴＧのすぐ５'側のコザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）とＰＡＤＲＥ配列の直後の２つの終止コドンを保有するように合成した。ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコンストラクトをｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにサブクローニングし、次いでＡｄ５．Ｆ３５ベクターに再結合した。Ａｄ５．Ｆ３５は、左右の逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージングのためのカプセル化シグナル、Ｅ２及びＥ４領域及び後期遺伝子を含む、複製不能なアデノウイルスを生成するのに必要な全ての要素をコードするヒトＡｄ５配列を保有する。該プラスミドはＥ１及びＥ３タンパク質を欠いており、繊維をＡｄ３５繊維で置き換える。
ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコード配列を合成し、開始ＡＴＧのすぐ５'側のコザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）とＰＡＤＲＥ配列の直後の２つの終止コドンを保有するように合成した。ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥコンストラクトをｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにサブクローニングし、次いでＡｄ５．Ｆ３５ベクターに再結合した。Ａｄ５．Ｆ３５は、左右の逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージングのためのカプセル化シグナル、Ｅ２及びＥ４領域及び後期遺伝子を含む、複製不能なアデノウイルスを生成するのに必要な全ての要素をコードするヒトＡｄ５配列を保有する。該プラスミドはＥ１及びＥ３タンパク質を欠いており、繊維をＡｄ３５繊維で置き換える。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの調製、構造、及び組成
アデノウイルスベクターＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥのマスターウイルスバンクは、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学細胞遺伝子治療センター（ＣＡＧＴ）のベクター生成施設（ＶＰＦ）で、ＧＭＰ条件下で生成された。
アデノウイルスベクターＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥのマスターウイルスバンクは、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学細胞遺伝子治療センター（ＣＡＧＴ）のベクター生成施設（ＶＰＦ）で、ＧＭＰ条件下で生成された。
組換えアデノウイルスベクターを、ウイルス複製に必要なＥ１遺伝子を保有するＨＥＫ２９３細胞内で生成した。生存可能なＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥウイルスが形成され、収集した。該ウイルスを、ＨＥＫ２９３細胞において２回プラーク精製した。個々のプラークをｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ ＤＮＡの存在について試験し、ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセット精度について配列決定し、インビトロで細胞に感染させたときにｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥタンパク質を生成する能力について試験した。次いで、プラーク精製ベクターを組織培養フラスコ内のＨＥＫ２９３細胞で増殖させ、さらに１０層の細胞培養室（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）を用いて増幅した。大規模増幅後、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥをＣｓＣｌのバンディングにより精製した。Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥマスターウイルスバンク（ＭＶＢ）を完全に配列決定した。ＭＶＢの一部は、この試験の一環として対象投与のために小分けした。
実施例３
ワクチン接種プロトコル
使用されるべきＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ発現カセットを保有する組換え複製欠損Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄ５．Ｆ３５ウイルスで構成されている。このワクチンベクターは、組換えヒト５型アデノウイルス（ｒＡｄ５）を使用し、ｒＡｄ５はベクターの初期Ｅ１及びＥ３領域の欠失を保有し、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセットの挿入を可能にする。Ｅ１／Ｅ３の欠失は、ウイルス複製を無能にし、その臨床使用に関連する安全性を高める。
ワクチン接種プロトコル
使用されるべきＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ発現カセットを保有する組換え複製欠損Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄ５．Ｆ３５ウイルスで構成されている。このワクチンベクターは、組換えヒト５型アデノウイルス（ｒＡｄ５）を使用し、ｒＡｄ５はベクターの初期Ｅ１及びＥ３領域の欠失を保有し、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセットの挿入を可能にする。Ｅ１／Ｅ３の欠失は、ウイルス複製を無能にし、その臨床使用に関連する安全性を高める。
ＴＧ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％グリセロール）に配合したＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ：１０１１、１０１２、又は５×１０１２ウイルス粒子を、根治手術及び標準的なアジュバント療法後に再発の危険性がある選択された固形腫瘍（結腸直腸、膵臓、胃、又は食道）を有するヒト患者に筋肉内投与する。投与を３回施す。投与間隔は４週間隔である。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する対象の細胞（Ｔ細胞）応答及びＧＣＣに対する体液性免疫応答を、最初のワクチン接種後５、９及び１４週目に評価する。Ａｄ５に対する既存の中和抗体の効果は、以前に観察されたものよりも低下する。
実施例４
根治手術及び標準療法後の再発リスクがある胃腸腺癌の成人におけるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンの第２Ａ相用量発見試験
これは、外科的切除及び標準的なアジュバント療法を受けた胃腸（ＧＩ）悪性腫瘍（膵臓、結腸直腸、食道、及び胃の腺癌）に対するワクチンとしてのＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの非盲検用量発見第２Ａ相試験である。患者は、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの３用量レベルのうちの１用量で筋肉内に複数回投与される。ＧＣＣに対する治療関連の毒性及び免疫応答の発達は、最初（１週目）のワクチン接種後の５週目、９週目、及び１３週目に評価される。主要安全性評価項目は、有害事象（ＡＥ）、注射部位反応及び安全性実験室試験における臨床的に有意な変化を検査する。主要な有効性エンドポイントには、異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ウイルス粒子すなわちｖｐ）でのＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答の発達が含まれる。
根治手術及び標準療法後の再発リスクがある胃腸腺癌の成人におけるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンの第２Ａ相用量発見試験
これは、外科的切除及び標準的なアジュバント療法を受けた胃腸（ＧＩ）悪性腫瘍（膵臓、結腸直腸、食道、及び胃の腺癌）に対するワクチンとしてのＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの非盲検用量発見第２Ａ相試験である。患者は、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの３用量レベルのうちの１用量で筋肉内に複数回投与される。ＧＣＣに対する治療関連の毒性及び免疫応答の発達は、最初（１週目）のワクチン接種後の５週目、９週目、及び１３週目に評価される。主要安全性評価項目は、有害事象（ＡＥ）、注射部位反応及び安全性実験室試験における臨床的に有意な変化を検査する。主要な有効性エンドポイントには、異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ウイルス粒子すなわちｖｐ）でのＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答の発達が含まれる。
目的
本研究の主な目的は以下のとおりである。
１）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、４週間隔で３用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）で筋肉内（ＩＭ）に送達される逐次Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン投与の安全性及び忍容性を評価する。
２）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスクの結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、筋肉内（ＩＭ）投与を４週間隔で３回連続投与として、３つの異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）でＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する細胞（Ｔ細胞）応答を評価する。
本研究の主な目的は以下のとおりである。
１）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、４週間隔で３用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）で筋肉内（ＩＭ）に送達される逐次Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン投与の安全性及び忍容性を評価する。
２）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスクの結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する対象において、筋肉内（ＩＭ）投与を４週間隔で３回連続投与として、３つの異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）でＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する細胞（Ｔ細胞）応答を評価する。
観察された目標には、以下のものが含まれる：
１）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、又は食道の腺癌を有する対象において、４週間隔で３つの連続用量としてＩＭ投与される３つの異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）でのＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する体液性（抗体）応答を評価する。
２）Ａｄ５に対する中和抗体と免疫学的応答との関連を評価する。
３）腫瘍におけるＧＣＣタンパク質発現に対する免疫応答の相関を評価し、免疫寛容を評価する。
４）無病生存期間（ＤＦＳ）を評価する。
５）可能な場合は、全生存期間（ＯＳ）を評価する。
１）手術及び標準療法後に疾患の証拠がない高リスク結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、又は食道の腺癌を有する対象において、４週間隔で３つの連続用量としてＩＭ投与される３つの異なる用量レベル（１０１１、１０１２、及び５×１０１２ｖｐ）でのＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する体液性（抗体）応答を評価する。
２）Ａｄ５に対する中和抗体と免疫学的応答との関連を評価する。
３）腫瘍におけるＧＣＣタンパク質発現に対する免疫応答の相関を評価し、免疫寛容を評価する。
４）無病生存期間（ＤＦＳ）を評価する。
５）可能な場合は、全生存期間（ＯＳ）を評価する。
集団
標的の最終試料サイズは、評価可能な応答データを有する７２人の対象である。全ての適格基準を満たすＧＩ腺癌を有する最大８１人の対象が登録される。１ヶ月あたり約３名の患者の登録を期待する。１５人の患者が治療を完了した後に各アームで無益な分析が行われると、その時点でアームを中止する可能性がある。そのため、最小試料サイズは４５である。
標的の最終試料サイズは、評価可能な応答データを有する７２人の対象である。全ての適格基準を満たすＧＩ腺癌を有する最大８１人の対象が登録される。１ヶ月あたり約３名の患者の登録を期待する。１５人の患者が治療を完了した後に各アームで無益な分析が行われると、その時点でアームを中止する可能性がある。そのため、最小試料サイズは４５である。
プロトコル
ＴＧ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％グリセロール）で製剤化され、筋肉内投与されるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ：１０１１、１０１２、又は５×１０１２ウイルス粒子。
ＴＧ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％グリセロール）で製剤化され、筋肉内投与されるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ：１０１１、１０１２、又は５×１０１２ウイルス粒子。
この研究には、最低４５人、最大８１人の対象が登録される。対象は、腫瘍の種類及び外科的切除マージン（Ｒ０すなわち陰性切除マージン対Ｒ１すなわち陽性切除マージン）に従って層別化された３つの治療アームのうちの１つに無作為化される。治療アームＡは、４週間隔で３回の１０１１ｖｐワクチン投与を受ける。治療アームＢは、４週間隔で３回の１０１２ｖｐワクチン投与を受ける。治療アームＣは、４週間隔で３回の５×１０１２ｖｐワクチン投与を受ける。対象は各治療アームに無作為化され、有害事象の継続的な監視と同時に治療を開始する。
免疫応答及び安全性に関する１３週間の試験評価の完了後、対象は、その後の癌関連療法、少なくとも２４ヶ月間の経過観察のＤＦＳ率、再発又は死亡のどちらが最初に生じるかについて電話又は任意選択の診療所訪問によって経過観察される。
治療サイクル（すなわち、３回の投与）期間は９週間である。対象は、最終試験投与後４週目まで治療期間中に検討され、その後、死亡、早期中止、又は経過観察の完了まで経過観察される。対象は、全ての対象が少なくとも２４ヶ月の経過観察又は死亡に達するまで、研究期間中経過観察される。研究の終了時に、残りの全ての対象は、長期経過観察プロトコルへの登録を申し出される。
序論
背景情報
本研究は、胃腸（ＧＩ）管の固形腫瘍を有し、根治手術及び／又は標準療法後に再発のリスクが高い対象に行われる。対象集団には、研究適格基準を満たす結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する個人が含まれる。
背景情報
本研究は、胃腸（ＧＩ）管の固形腫瘍を有し、根治手術及び／又は標準療法後に再発のリスクが高い対象に行われる。対象集団には、研究適格基準を満たす結腸直腸、膵臓、胃、又は食道の腺癌を有する個人が含まれる。
膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌の疫学と現在の治療
膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌はそれぞれ、検出と治療の改善にもかかわらず、米国で引き続き癌の主な負担となっている。いずれの場合も、かなりの数の患者が治癒を試みて外科的切除及び標準療法を受けるが、ごく一部（疾患組織学、病期、及び他の要因によって異なる）が寛解中に残る。これらの場合における化学療法及び／又は放射線療法の形態のアジュバント療法は、全体的な臨床転帰を改善する。しかし、特に高リスクの特徴を有する患者にとっては、さらなる改善の余地が大きい。
膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌はそれぞれ、検出と治療の改善にもかかわらず、米国で引き続き癌の主な負担となっている。いずれの場合も、かなりの数の患者が治癒を試みて外科的切除及び標準療法を受けるが、ごく一部（疾患組織学、病期、及び他の要因によって異なる）が寛解中に残る。これらの場合における化学療法及び／又は放射線療法の形態のアジュバント療法は、全体的な臨床転帰を改善する。しかし、特に高リスクの特徴を有する患者にとっては、さらなる改善の余地が大きい。
ＧＩ悪性腫瘍は、２０１６年に米国における癌関連死の２６％に関与した。結腸直腸癌は４番目に最も一般的で２番目に最も致死的な癌であったが、膵臓癌、食道癌及び胃癌は、２０１６年に米国で３番目、１０番目及び１６番目に高い推定癌関連死亡率を有していた。ＧＩ悪性腫瘍の５年相対生存率は疾患ステージによって異なる。一般的に、膵臓腺癌は全ステージで最悪の５年生存率（７％）を有するが、ステージ４疾患（遠隔転移）については２％、局所的に広がる疾患については１１％、限局性疾患については２７％である。外分泌膵臓腺癌の大部分（＞８０％）は、もはや外科的切除に適さず、推定生存期間中央値が３～６ヶ月である局所転移又は遠隔転移の発症まで診断されない２。外科的に切除された膵臓腺癌の推定生存期間中央値は１８ヶ月であるが、患者のわずか２０％のみが５年生存する。
限局性膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌を有し、それでもなお再発のリスクが高いと考えられている患者の場合、治療法の柱は、手術、化学療法、及び照射を伴い得る。モノクローナル抗体による補助療法は、結腸直腸癌及び食道癌においても使用される。黒色腫、前立腺癌、及び非小細胞肺癌の患者において有用性を確立した免疫療法は、再発のリスクを低減する手段として、異なる設定でますます研究されている。
この研究は、３つの用量レベルで筋肉内（ＩＭ）に順次送達する新規ワクチン免疫療法を評価し、忍容性が高く、細胞性免疫応答を誘導するのに最も適した用量を特定することを目的としている。このワクチンの究極の治療目標は、臨床開発の後期段階で、ＧＩ腺癌の対象における再発のリスクを低減することである。
膵臓腺癌と利用可能な治療法
２０１４年に膵臓腺癌と診断された推定４６,０００人のアメリカ人のうち、約２０％が切除可能と考えられている。手術からの回復後、アジュバント療法の主なモダリティは、カペシタビンとゲムシタビン又はイリノテカン及びオキサリプラチンと５－フルオロウラシル（改変ＦＯＬＦＩＲＮＯＸ）などの化学療法である８。化学療法が最良の支持療法よりも優れており、ハザード比が約０．６０で死亡率が約３分の１低下していることは十分に確立されている９。ゲムシタビン単独グループにおける３年目の２１．４％の無病生存率と比較して、改変ＦＯＬＦＩＲＮＯＸ投与計画は、３年無病生存率を３９．７％に改善する一方で、ゲムシタビン単独グループの４８．６％と比較して、全生存率を６３．４％に改善した８。しかし、手術やアジュバント療法にかかわらず、患者の少なくとも８０％が再発し、最終的に死亡する。生存は、病理学的特徴、術前の機能状態、手術結果、及びアジュバント療法に関連する。米国癌協会によると、合わせた膵臓癌の全ステージについて、１年相対生存率は２０％であり、５年生存率は６％である。外科的切除を行うことができる場合、平均生存率は１８～２０ヶ月である。全体の５年生存率は約１０％であるが、腫瘍が完全に除去され、癌がリンパ節に転移していない場合、２０～２５％に達し得る。
２０１４年に膵臓腺癌と診断された推定４６,０００人のアメリカ人のうち、約２０％が切除可能と考えられている。手術からの回復後、アジュバント療法の主なモダリティは、カペシタビンとゲムシタビン又はイリノテカン及びオキサリプラチンと５－フルオロウラシル（改変ＦＯＬＦＩＲＮＯＸ）などの化学療法である８。化学療法が最良の支持療法よりも優れており、ハザード比が約０．６０で死亡率が約３分の１低下していることは十分に確立されている９。ゲムシタビン単独グループにおける３年目の２１．４％の無病生存率と比較して、改変ＦＯＬＦＩＲＮＯＸ投与計画は、３年無病生存率を３９．７％に改善する一方で、ゲムシタビン単独グループの４８．６％と比較して、全生存率を６３．４％に改善した８。しかし、手術やアジュバント療法にかかわらず、患者の少なくとも８０％が再発し、最終的に死亡する。生存は、病理学的特徴、術前の機能状態、手術結果、及びアジュバント療法に関連する。米国癌協会によると、合わせた膵臓癌の全ステージについて、１年相対生存率は２０％であり、５年生存率は６％である。外科的切除を行うことができる場合、平均生存率は１８～２０ヶ月である。全体の５年生存率は約１０％であるが、腫瘍が完全に除去され、癌がリンパ節に転移していない場合、２０～２５％に達し得る。
結腸直腸癌と利用可能な治療法
年間、結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断される推定１３２,０００人のアメリカ人のうち、約３分の２が外科的切除を受ける。５年生存率は、癌の性質及びステージに依存するが、２５～７０％の範囲である。
年間、結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断される推定１３２,０００人のアメリカ人のうち、約３分の２が外科的切除を受ける。５年生存率は、癌の性質及びステージに依存するが、２５～７０％の範囲である。
ＣＲＣが早期ステージで診断されると、多くの場合、手術だけで治癒することができる。後期ステージでは、依然として治癒は手術により可能であると考えられており、フルオロウラシル、フルオロピリミジン、カペシタビン、又はオキサリプラチンの形態の化学療法がアジュバント療法として使用される場合が多い。２つの研究により、術後アジュバント療法を受けた場合に、１０～１５％の３年生存率の上昇が見出される一方で、他の研究でもアジュバント治療からある程度の有益な恩恵が得られた。
外科的治療とアジュバント治療の両方及び早期診断における最近の改善により、外科的切除を受ける患者の３年間のＤＦＳが増加している。ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体の形態の標的療法も、進行した疾患を有する患者に利用可能である４が、治癒率は低いままであり、再発率が高い。ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））及びペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））の２つの抗ＰＤ－１チェックポイント免疫療法は、高いマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－ｈｉ）を特徴とする進行した再発腫瘍を有する結腸直腸癌患者に対しても承認されているが、これらの療法による全体的な奏効率は依然として低いままである。
胃癌と利用可能な治療法
推定２５,０００人のアメリカ人が毎年胃癌と診断される。初期ステージの癌患者の大多数は外科的に切除可能な疾患を有する－限局性遠位胃癌では、患者の５０％以上が治癒し得る。しかし、初期ステージの疾患は、米国で診断された全ての症例のわずか１０～２０％を占める。５年目のＯＳ率の範囲は、播種性疾患患者の生存率のほとんど０から、切除可能な局所疾患を有する限局性遠位胃癌患者の生存率の約５０％までである。アジュバント療法の臨床的利点は議論されてきたが、最近の研究は潜在的な利益を示す。ある研究では、アジュバント治療を受けた患者はカペシタビン及びオキサリプラチンを投与され、ハザード比が０．５８で、５年ＤＦＳが改善された。アジュバントフルオロピリミジンを用いた別の研究では、治療グループは最初の１年以内に手術のみと比較して１０％の生存率の増加を示すことが判明した。アジュバント療法の有無にかかわらず、現在の治療は、近位胃癌患者において平均１０～１５％の平均５年生存率をもたらし、切除された患者において５０％以上の癌再発をもたらし、現在の治療投与計画の有効性が不十分であることが示唆される。さらに、抗ＰＤ－１チェックポイント免疫療法であるペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））が、奏効率は低いものの、進行したＰＤ－Ｌ１陽性胃癌患者に対して最近承認された。
推定２５,０００人のアメリカ人が毎年胃癌と診断される。初期ステージの癌患者の大多数は外科的に切除可能な疾患を有する－限局性遠位胃癌では、患者の５０％以上が治癒し得る。しかし、初期ステージの疾患は、米国で診断された全ての症例のわずか１０～２０％を占める。５年目のＯＳ率の範囲は、播種性疾患患者の生存率のほとんど０から、切除可能な局所疾患を有する限局性遠位胃癌患者の生存率の約５０％までである。アジュバント療法の臨床的利点は議論されてきたが、最近の研究は潜在的な利益を示す。ある研究では、アジュバント治療を受けた患者はカペシタビン及びオキサリプラチンを投与され、ハザード比が０．５８で、５年ＤＦＳが改善された。アジュバントフルオロピリミジンを用いた別の研究では、治療グループは最初の１年以内に手術のみと比較して１０％の生存率の増加を示すことが判明した。アジュバント療法の有無にかかわらず、現在の治療は、近位胃癌患者において平均１０～１５％の平均５年生存率をもたらし、切除された患者において５０％以上の癌再発をもたらし、現在の治療投与計画の有効性が不十分であることが示唆される。さらに、抗ＰＤ－１チェックポイント免疫療法であるペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））が、奏効率は低いものの、進行したＰＤ－Ｌ１陽性胃癌患者に対して最近承認された。
食道癌と利用可能な治療法
国立癌研究所（Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）によると、２０１７年には推定１６,９４０人が食道癌と診断され、１５,６９０人が死亡する。およそ、半分は切除可能な腫瘍を有する。平均して、患者の１８．８％が診断後５年間生存するが、５年生存率は遠位疾患患者では４．６％に急激に低下する。食道切除術は依然として臨床的に局在する食道癌の礎となる治療法であるが、この疾患の性質は手術の失敗のみに起因する。食道の扁平上皮癌では、ネオアジュバントシスプラチンは生存率の改善をもたらすことは見出されなかったが、ネオアジュバントシスプラチン及びフルオロウラシルは５年ＤＦＳを１０％増加させた。対照的に、食道腺癌におけるネオアジュバント化学療法（カルボプラチン＆パクリタキセル）及び放射線療法は、手術単独グループでは２４ヶ月であったのに対し、ＯＳの中央値は４９．４ヶ月であった。他の研究も、胃又は胃食道接合部の腺癌を有する患者におけるエピルビシン、５－フルオロウラシル及び／又はシスプラチンによるネオアジュバント化学療法の有益な効果を見出した。加えて、ＨＥＲ２を過剰発現する少数の食道癌のＨＥＲ２を標的とし、ＶＥＧＦ経路を標的にして血管新生を阻害する抗体療法が食道癌の治療に登場した４。ネオアジュバント化学放射線療法の１３件のランダム化比較試験の最近のメタ分析は、手術のみと比較して、０．７８のプールされたハザード比を示し、８．７％の２年目での絶対生存利益及び１１の治療が必要な数に対応する。食道癌におけるネオアジュバント療法の効果は、最良の支持療法と比較して一般的に有益であるが、再発は依然として高く、多くの患者が最終的に死亡する。胃癌と同様に、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））の抗ＰＤ－１チェックポイント免疫療法は、胃食道接合部のＰＤ－Ｌ１陽性癌の患者に対して最近承認されたが、奏効率は低い。この疾患の発生率及び予後を考慮すると、疾患転帰を改善するためには、副作用を最小限に抑えた効果的なアジュバントが必要である。
国立癌研究所（Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）によると、２０１７年には推定１６,９４０人が食道癌と診断され、１５,６９０人が死亡する。およそ、半分は切除可能な腫瘍を有する。平均して、患者の１８．８％が診断後５年間生存するが、５年生存率は遠位疾患患者では４．６％に急激に低下する。食道切除術は依然として臨床的に局在する食道癌の礎となる治療法であるが、この疾患の性質は手術の失敗のみに起因する。食道の扁平上皮癌では、ネオアジュバントシスプラチンは生存率の改善をもたらすことは見出されなかったが、ネオアジュバントシスプラチン及びフルオロウラシルは５年ＤＦＳを１０％増加させた。対照的に、食道腺癌におけるネオアジュバント化学療法（カルボプラチン＆パクリタキセル）及び放射線療法は、手術単独グループでは２４ヶ月であったのに対し、ＯＳの中央値は４９．４ヶ月であった。他の研究も、胃又は胃食道接合部の腺癌を有する患者におけるエピルビシン、５－フルオロウラシル及び／又はシスプラチンによるネオアジュバント化学療法の有益な効果を見出した。加えて、ＨＥＲ２を過剰発現する少数の食道癌のＨＥＲ２を標的とし、ＶＥＧＦ経路を標的にして血管新生を阻害する抗体療法が食道癌の治療に登場した４。ネオアジュバント化学放射線療法の１３件のランダム化比較試験の最近のメタ分析は、手術のみと比較して、０．７８のプールされたハザード比を示し、８．７％の２年目での絶対生存利益及び１１の治療が必要な数に対応する。食道癌におけるネオアジュバント療法の効果は、最良の支持療法と比較して一般的に有益であるが、再発は依然として高く、多くの患者が最終的に死亡する。胃癌と同様に、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））の抗ＰＤ－１チェックポイント免疫療法は、胃食道接合部のＰＤ－Ｌ１陽性癌の患者に対して最近承認されたが、奏効率は低い。この疾患の発生率及び予後を考慮すると、疾患転帰を改善するためには、副作用を最小限に抑えた効果的なアジュバントが必要である。
提案された研究の理論的根拠
結腸癌における腫瘍関連抗原としてのグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）
環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を合成する相同タンパク質ファミリーの１つであるグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ又はＧＵＣＹ２Ｃ）は、腸上皮細胞によって特異的に発現する。ＧＣＣは、パラクリンホルモンのグアニリン及びウログアニリン及び下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）の受容体であり、その細胞外ドメインとの相互作用は細胞質触媒ドメインを活性化し、ｃＧＭＰ蓄積を誘導する。触媒ドメインはファミリーメンバー間で約５０％の相同性を共有しているが、ＧＣＣの細胞外ドメインは２０％未満の相同性を示し、抗原的にユニークな構造を作り出している。ＧＣＣは正常な腸の５００超の試料で検出されているが、１,０００超の胃腸外組織では検出されていない。さらに、腸上皮細胞において、ＧＣＣは、粘膜壁の「外側」の頂端ブラシ境界膜に特異的に局在する。この解剖学的及び機能的区画化は、通常、ＧＣＣが粘膜に制限されていることを示唆しており、放射性リガンドイメージング及び生体分布及び免疫学的研究によって確認される。重要なことに、ＧＣＣタンパク質（２００超の検体）及び／又はｍＲＮＡ（９００超の検体）は、ほぼ全ての原発性及び転移性ヒト結腸直腸腫瘍において検出され、解剖学的位置又は悪性度にかかわらず、腫瘍細胞によって均一に発現しているが、ＧＩ外腫瘍（２００超）では検出されなかった。また、ＧＣＣは結腸直腸腫瘍の８０％超で過剰発現している。腸細胞による発現のストリンジェンシー及び転移によるユニバーサル過剰発現は、ｐＮ０患者を病期分類するためのマーカーとしてのＧＣＣの有用性によって強調される。
結腸癌における腫瘍関連抗原としてのグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）
環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を合成する相同タンパク質ファミリーの１つであるグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ又はＧＵＣＹ２Ｃ）は、腸上皮細胞によって特異的に発現する。ＧＣＣは、パラクリンホルモンのグアニリン及びウログアニリン及び下痢性細菌の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）の受容体であり、その細胞外ドメインとの相互作用は細胞質触媒ドメインを活性化し、ｃＧＭＰ蓄積を誘導する。触媒ドメインはファミリーメンバー間で約５０％の相同性を共有しているが、ＧＣＣの細胞外ドメインは２０％未満の相同性を示し、抗原的にユニークな構造を作り出している。ＧＣＣは正常な腸の５００超の試料で検出されているが、１,０００超の胃腸外組織では検出されていない。さらに、腸上皮細胞において、ＧＣＣは、粘膜壁の「外側」の頂端ブラシ境界膜に特異的に局在する。この解剖学的及び機能的区画化は、通常、ＧＣＣが粘膜に制限されていることを示唆しており、放射性リガンドイメージング及び生体分布及び免疫学的研究によって確認される。重要なことに、ＧＣＣタンパク質（２００超の検体）及び／又はｍＲＮＡ（９００超の検体）は、ほぼ全ての原発性及び転移性ヒト結腸直腸腫瘍において検出され、解剖学的位置又は悪性度にかかわらず、腫瘍細胞によって均一に発現しているが、ＧＩ外腫瘍（２００超）では検出されなかった。また、ＧＣＣは結腸直腸腫瘍の８０％超で過剰発現している。腸細胞による発現のストリンジェンシー及び転移によるユニバーサル過剰発現は、ｐＮ０患者を病期分類するためのマーカーとしてのＧＣＣの有用性によって強調される。
膵臓癌、胃癌及び食道癌におけるＧＣＣ
ＧＣＣは、通常、腸上皮細胞で発現し、発現は、局所と転移の両方の設定で結腸直腸の腫瘍性形質転換中に保持される。加えて、ＧＣＣは、膵臓癌、胃癌、及び食道癌の約６０％において発現することが見出される。ＧＣＣの上皮密着結合、細胞極性及び頂端局在の破壊により、正常組織に影響を与えないまま、それは腫瘍組織における全身性薬剤の所望の標的となる。
ＧＣＣは、通常、腸上皮細胞で発現し、発現は、局所と転移の両方の設定で結腸直腸の腫瘍性形質転換中に保持される。加えて、ＧＣＣは、膵臓癌、胃癌、及び食道癌の約６０％において発現することが見出される。ＧＣＣの上皮密着結合、細胞極性及び頂端局在の破壊により、正常組織に影響を与えないまま、それは腫瘍組織における全身性薬剤の所望の標的となる。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン
Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを用いた前臨床試験
前臨床試験では、マウスＧＣＣを組み込んだＡｄ５ベクターワクチンがマウスにおいてＧＣＣ特異的免疫応答（抗体及び細胞傷害性Ｔ細胞）を生成することを実証した。これらの応答は耐久性があり、予防接種後数ヶ月持続する。加えて、ワクチンによって誘導されるＧＣＣ特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、インビトロでＧＣＣ発現ＣＲＣ細胞を死滅させることができる。肺又は肝臓で増殖するＧＣＣ発現転移性結腸直腸腫瘍を有するマウスは、ＧＣＣワクチン接種によって保護される：ＧＣＣワクチン接種は、検出可能な転移性腫瘍の数を減少させ（又は排除し）、動物の生存率を大幅に改善する。重要なことに、これらの免疫応答は転移性ＣＲＣを選択的に標的とするが、ＧＣＣを発現する正常な腸組織を標的とせず、腸の病理も引き起こさない。そのため、ＧＣＣ標的ワクチン接種は、マウスモデルにおける転移性ＣＲＣを予防／治療することができるＧＣＣ特異的免疫応答を誘導するが、有害作用を引き起こすことなくそうする。この標的化治療は、有効性が低く、かなりのオフターゲット毒性を引き起こす確立された癌治療法と比較して、臨床的に非常に有利であることが期待されている。
Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを用いた前臨床試験
前臨床試験では、マウスＧＣＣを組み込んだＡｄ５ベクターワクチンがマウスにおいてＧＣＣ特異的免疫応答（抗体及び細胞傷害性Ｔ細胞）を生成することを実証した。これらの応答は耐久性があり、予防接種後数ヶ月持続する。加えて、ワクチンによって誘導されるＧＣＣ特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、インビトロでＧＣＣ発現ＣＲＣ細胞を死滅させることができる。肺又は肝臓で増殖するＧＣＣ発現転移性結腸直腸腫瘍を有するマウスは、ＧＣＣワクチン接種によって保護される：ＧＣＣワクチン接種は、検出可能な転移性腫瘍の数を減少させ（又は排除し）、動物の生存率を大幅に改善する。重要なことに、これらの免疫応答は転移性ＣＲＣを選択的に標的とするが、ＧＣＣを発現する正常な腸組織を標的とせず、腸の病理も引き起こさない。そのため、ＧＣＣ標的ワクチン接種は、マウスモデルにおける転移性ＣＲＣを予防／治療することができるＧＣＣ特異的免疫応答を誘導するが、有害作用を引き起こすことなくそうする。この標的化治療は、有効性が低く、かなりのオフターゲット毒性を引き起こす確立された癌治療法と比較して、臨床的に非常に有利であることが期待されている。
Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンの現在までの臨床データ
Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、初期ステージの結腸直腸癌患者におけるＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの安全性及び免疫原性を決定するために、非盲検、単一アーム、単回投与の実現可能性試験においてヒトで最初に評価された（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１９７２７３７）。対象に、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの１０個の粒子を単回筋肉内注射した。
Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、初期ステージの結腸直腸癌患者におけるＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの安全性及び免疫原性を決定するために、非盲検、単一アーム、単回投与の実現可能性試験においてヒトで最初に評価された（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１９７２７３７）。対象に、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの１０個の粒子を単回筋肉内注射した。
安全性データ
本試験の対象を注射後３０分間、１０分ごとに診療所で、及びワクチン接種後３日目及び８日目に電話で急性事象について評価した。患者はまた、安全性評価のためにワクチン接種の３０日後、９０日後、及び１８０日後に診療所に戻った。有害事象をＣＴＣＡＥバージョン５．０に従って段階分けした。Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを投与された１０人の対象のうち、１０人（１００％）がＡＥを経験した。最も頻繁に報告されたワクチン関連ＡＥは、悪寒／硬直（２０％）、注射部位の痛み／腫れ（２０％）、めまい（１０％）、発汗（１０％）、痛み（１０％）及び発熱（１０％）であった。重篤な有害事象（ＳＡＥ）はなく、試験中に死亡した対象もいなかった。
本試験の対象を注射後３０分間、１０分ごとに診療所で、及びワクチン接種後３日目及び８日目に電話で急性事象について評価した。患者はまた、安全性評価のためにワクチン接種の３０日後、９０日後、及び１８０日後に診療所に戻った。有害事象をＣＴＣＡＥバージョン５．０に従って段階分けした。Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥを投与された１０人の対象のうち、１０人（１００％）がＡＥを経験した。最も頻繁に報告されたワクチン関連ＡＥは、悪寒／硬直（２０％）、注射部位の痛み／腫れ（２０％）、めまい（１０％）、発汗（１０％）、痛み（１０％）及び発熱（１０％）であった。重篤な有害事象（ＳＡＥ）はなく、試験中に死亡した対象もいなかった。
全てのＡＥはグレード１であり、ワクチン接種後の６ヶ月の経過観察期間中、グレード３／４の毒性は発生しなかった。さらに、差次的、包括的化学パネル、及び抗核抗体（ＡＮＡ）力価と共に、ＣＢＣを含む３０日目、９０日目、及び１８０日目に実施した実験室評価では、臨床的に関連する変化は認められなかった。同様の治療法で報告された臨床経験に基づいて、注射部位の痛み及び発熱などの軽度のグレード１／２毒性がウイルスベクター免疫後に予想され、幾人かの患者で観察された。重要なことに、ＧＣＣ発現組織における毒性に関連する有害事象は観察されなかった。ＧＣＣは、小腸上皮及び大腸上皮の管腔表面並びに食欲不振誘発性視床下部ニューロンで発現する自己タンパク質である。しかし、免疫区画化を制御する機構及びＧＣＣワクチン接種の前臨床試験と一致して、ＧＣＣを発現する腸又は脳組織においてＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに誘導される自己免疫の証拠はなかった。
免疫原性データ
前臨床試験では、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥによる免疫は、時間及び用量依存性のＧＣＣ特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答並びにＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される抗腫瘍免疫を誘導した。臨床試験では、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ投与後のＧＣＣ特異的免疫応答をＥＬＩＳＡ及びＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔにより定量し、抗体及びＴ細胞応答をそれぞれ定量した。ＰＡＤＲＥ及びＡｄ５に対するＴ細胞応答も、ＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔにより定量した。患者の免疫応答は、典型的には、４つのパターンのうちの１つに従った：
１）ＧＣＣに対するワクチン接種前抗体応答又はＧＣＣ、ＰＡＤＲＥ、若しくはＡｄ５及びＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種に対するＴ細胞免疫がないと、いずれの抗原に対する標的化応答も誘導されなかった。
２）ワクチン接種前の応答はなく、ワクチン接種によりＡｄ５特異的Ｔ細胞応答が誘導されたが、ＧＣＣ特異的又はＰＡＤＲＥ特異的応答は誘導されなかった。
３）Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種により、ＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答が誘導された。ＧＣＣ特異的抗体応答が外因性ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞エピトープに対する応答を必要とする動物試験と類似してＰＡＤＲＥ特異的Ｔ細胞応答又はＧＣＣ特異的抗体応答がないことは、ＧＣＣ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞耐性を反映する。
４）適応免疫の３つのアーム全てによるワクチン誘発応答：ＰＡＤＲＥ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＧＣＣ特異的抗体応答、及びＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答。
前臨床試験では、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥによる免疫は、時間及び用量依存性のＧＣＣ特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答並びにＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される抗腫瘍免疫を誘導した。臨床試験では、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ投与後のＧＣＣ特異的免疫応答をＥＬＩＳＡ及びＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔにより定量し、抗体及びＴ細胞応答をそれぞれ定量した。ＰＡＤＲＥ及びＡｄ５に対するＴ細胞応答も、ＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔにより定量した。患者の免疫応答は、典型的には、４つのパターンのうちの１つに従った：
１）ＧＣＣに対するワクチン接種前抗体応答又はＧＣＣ、ＰＡＤＲＥ、若しくはＡｄ５及びＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種に対するＴ細胞免疫がないと、いずれの抗原に対する標的化応答も誘導されなかった。
２）ワクチン接種前の応答はなく、ワクチン接種によりＡｄ５特異的Ｔ細胞応答が誘導されたが、ＧＣＣ特異的又はＰＡＤＲＥ特異的応答は誘導されなかった。
３）Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種により、ＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答が誘導された。ＧＣＣ特異的抗体応答が外因性ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞エピトープに対する応答を必要とする動物試験と類似してＰＡＤＲＥ特異的Ｔ細胞応答又はＧＣＣ特異的抗体応答がないことは、ＧＣＣ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞耐性を反映する。
４）適応免疫の３つのアーム全てによるワクチン誘発応答：ＰＡＤＲＥ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＧＣＣ特異的抗体応答、及びＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答。
Ａｄ５ ｎＡｂはＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ免疫原性を制限する
Ａｄ５は、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症を生じさせる天然のヒト病原体である。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を防止することによって再感染又はＡｄ５ベースのワクチン接種を防止するＡｄ５特異的中和抗体（ｎＡｂ）を誘導する。Ａｄ５ ｎＡｂを、Ａｄ５－ＧＦＰレポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いてＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種（０日目）前に採取した患者血清中で定量した。力価は１０未満～１０,０００超の範囲であり、患者の半数が２００をはるかに下回る力価（Ａｄ５ ｎＡｂ低）を有し、残りの半分が２００をはるかに上回る力価（Ａｄ５ ｎＡｂ高）を有するという明らかなパターンが現れた。患者をＡｄ５ ｎＡｂ低コホートと高コホートに分けたところ、Ａｄ５ ｎＡｂ力価とＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答との間の関係が明らかになり、応答はＡｄ５ ｎＡｂ低患者で有意に大きかった。ＰＡＤＲＥ特異的Ｔ細胞応答は一般的に低かったが、事前治療Ａｄ５ ｎＡｂ力価との関係を示さなかった。ＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答と同様に、Ａｄ５特異的Ｔ細胞応答も、Ａｄ５ ｎＡｂ高グループにおいてＡｄ５ ｎＡｂによって制限された。まとめると、これらのデータは、既存のＡｄ５ ｎＡｂ免疫が宿主細胞に入る前にインビボでＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥウイルス粒子を排除し、その後の遺伝子発現及び宿主免疫応答の誘導を妨げることを実証する非臨床データ７７と一致している。
Ａｄ５は、ほぼ全ヒト集団において軽度の感染症を生じさせる天然のヒト病原体である。これらの自然曝露は、標的抗原発現及び免疫応答の誘導に必要なステップである宿主細胞の感染を防止することによって再感染又はＡｄ５ベースのワクチン接種を防止するＡｄ５特異的中和抗体（ｎＡｂ）を誘導する。Ａｄ５ ｎＡｂを、Ａｄ５－ＧＦＰレポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いてＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン接種（０日目）前に採取した患者血清中で定量した。力価は１０未満～１０,０００超の範囲であり、患者の半数が２００をはるかに下回る力価（Ａｄ５ ｎＡｂ低）を有し、残りの半分が２００をはるかに上回る力価（Ａｄ５ ｎＡｂ高）を有するという明らかなパターンが現れた。患者をＡｄ５ ｎＡｂ低コホートと高コホートに分けたところ、Ａｄ５ ｎＡｂ力価とＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答との間の関係が明らかになり、応答はＡｄ５ ｎＡｂ低患者で有意に大きかった。ＰＡＤＲＥ特異的Ｔ細胞応答は一般的に低かったが、事前治療Ａｄ５ ｎＡｂ力価との関係を示さなかった。ＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答と同様に、Ａｄ５特異的Ｔ細胞応答も、Ａｄ５ ｎＡｂ高グループにおいてＡｄ５ ｎＡｂによって制限された。まとめると、これらのデータは、既存のＡｄ５ ｎＡｂ免疫が宿主細胞に入る前にインビボでＡｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥウイルス粒子を排除し、その後の遺伝子発現及び宿主免疫応答の誘導を妨げることを実証する非臨床データ７７と一致している。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの論理的根拠
Ａｄ５ ｎＡｂは、米国において約４０％を含むほとんどのヒト集団において一般的であり（Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７．；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）、Ａｄ５ベースのワクチンの免疫原性を低下させる（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１））。重要なことに、ほとんどの天然に存在するＡｄ５ ｎＡｂは、Ａｄ５の表面上の繊維分子を標的としている（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．ら（２０１０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１）：６３０－６３８）。Ａｄ５とは対照的に、ほとんどの国におけるＡｄ３５特異的抗体の血清有病率は非常に低い（＜１０％，Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）。まとめると、これらの観察結果は、Ａｄ５の繊維分子をＡｄ３５の繊維分子で置き換えると、天然に存在するＡｄ５免疫の影響を受けないキメラＡｄ５ウイルスベクター（Ａｄ５．Ｆ３５として知られる）が生成されることを示唆している。実際、既存のＡｄ５ ｎＡｂを有する１２人の患者のコホートにおいて、８人の患者（６７％）の血清は、インビトロでキメラＡｄ５．Ｆ３５を中和することができなかった。さらに、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの第１相試験の対象の５０％が高いＡｄ５ ｎＡｂ（力価＞２００）を有していたのに対し、Ａｄ５．Ｆ３５ ｎＡｂが高い対象は１／１０に過ぎない（図５）。そのため、Ａｄ５．Ｆ３５は、さらなる安全リスクなしに、Ａｄ５．Ｆ３５ ｎＡｂの予想される血清有病率を２５％未満に減少させることによって、Ａｄ５と比較して有利である。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥは、公開された文献によって予測される用量漸増によって達成されなかったＡｄ５特異的な既存免疫を克服すると予想される（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．ＣＬ１ｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。
Ａｄ５ ｎＡｂは、米国において約４０％を含むほとんどのヒト集団において一般的であり（Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７．；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）、Ａｄ５ベースのワクチンの免疫原性を低下させる（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１））。重要なことに、ほとんどの天然に存在するＡｄ５ ｎＡｂは、Ａｄ５の表面上の繊維分子を標的としている（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．ら（２０１０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１）：６３０－６３８）。Ａｄ５とは対照的に、ほとんどの国におけるＡｄ３５特異的抗体の血清有病率は非常に低い（＜１０％，Ｎｗａｎｅｇｂｏ，Ｅ．ら（２００４） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（２）：３５１－３５７；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（３２）：５２０３－５２０９）。まとめると、これらの観察結果は、Ａｄ５の繊維分子をＡｄ３５の繊維分子で置き換えると、天然に存在するＡｄ５免疫の影響を受けないキメラＡｄ５ウイルスベクター（Ａｄ５．Ｆ３５として知られる）が生成されることを示唆している。実際、既存のＡｄ５ ｎＡｂを有する１２人の患者のコホートにおいて、８人の患者（６７％）の血清は、インビトロでキメラＡｄ５．Ｆ３５を中和することができなかった。さらに、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの第１相試験の対象の５０％が高いＡｄ５ ｎＡｂ（力価＞２００）を有していたのに対し、Ａｄ５．Ｆ３５ ｎＡｂが高い対象は１／１０に過ぎない（図５）。そのため、Ａｄ５．Ｆ３５は、さらなる安全リスクなしに、Ａｄ５．Ｆ３５ ｎＡｂの予想される血清有病率を２５％未満に減少させることによって、Ａｄ５と比較して有利である。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥは、公開された文献によって予測される用量漸増によって達成されなかったＡｄ５特異的な既存免疫を克服すると予想される（Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．ら（２００８）．ＣＬ１ｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６（１１）：１７６９－１７８１）。
免疫原性、安全性、及び生体分布プロファイルにおけるＡｄ５ベクターとＡｄ５．Ｆ３５ベクターとの間の類似性は、公表された非臨床試験によって裏付けられている。実際、安全性プロファイルはＡｄ５．Ｆ３５の方がより良好であり得るといういくつかの兆候がある。筋肉（ワクチン接種部位）のＡｄ５．Ｆ３５導入はＡｄ５に匹敵するが、肝臓（１０００×）、脾臓（３×）、腎臓（１００×）、心臓（１０×）及び肺（１００×）は、Ａｄ５．Ｆ３５による導入効率がＡｄ５よりも著しく低いことを実証する。肝臓に対するＡｄ５．Ｆ３５のより低い指向性の状況では、Ａｄ５．Ｆ３５は血清炎症誘発性サイトカイン及び肝臓酵素において著しくより低い上昇をもたらし、Ａｄ５．Ｆ３５ウイルスがＡｄ５ベクターよりも良好な安全性プロファイルを有することを示唆している。さらに、Ａｄ５．Ｆ３５ベクターは、Ａｄ５ベクターよりもＡｄ５ ｎＡｂに対する感受性が著しく低く、Ａｄ５ ｎＡｂ力価の高い動物における標的抗原特異的免疫応答の大きさを増加させる（２００超）。そのため、Ａｄ５．Ｆ３５ベクターは、Ａｄ５ベクターよりもＡｄ５ ｎＡｂの状況において、より良好な生体分布、安全性、及び有効性を示す。まとめると、これらのデータは、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥに対する中和免疫が患者において著しく低下し、ヒト対象におけるＧＣＣ特異的Ｔ細胞応答の速度及び大きさを増加させることを示唆している。その状況において、本発明者らはＡｄ５繊維分子をＡｄ３５繊維分子に置き換えてワクチンを改変し、キメラウイルスベクターＡｄ５．Ｆ３５を生成した。この研究では、ＧＩ悪性腫瘍患者におけるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの安全性、免疫原性、及び既存のｎＡｂ耐性を調べる。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの設計
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ発現カセットを保有する組換え複製欠損Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄ５．Ｆ３５ウイルスで構成される。このワクチンベクターは、３０超のタンパク質をコードする約３８ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを有する安定な非エンベロープ正二十面体ウイルスである組換えヒト５型アデノウイルス（ｒＡｄ５）を使用する。ｒＡｄ５は、ベクターの初期Ｅ１領域とＥ３領域が欠失しており、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセットの挿入を可能にする。Ｅ１／Ｅ３の欠失は、ウイルスの複製を無能にし、臨床使用に伴う安全性を高める。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンは、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ発現カセットを保有する組換え複製欠損Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄ５．Ｆ３５ウイルスで構成される。このワクチンベクターは、３０超のタンパク質をコードする約３８ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを有する安定な非エンベロープ正二十面体ウイルスである組換えヒト５型アデノウイルス（ｒＡｄ５）を使用する。ｒＡｄ５は、ベクターの初期Ｅ１領域とＥ３領域が欠失しており、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセットの挿入を可能にする。Ｅ１／Ｅ３の欠失は、ウイルスの複製を無能にし、臨床使用に伴う安全性を高める。
ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥカセットは、ヒトＧＣＣの細胞外ドメイン（残基１～４３０）とＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープＰＡＤＲＥからなる融合産物の発現を促進するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターで構成されている。インビボでは、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥベクターは、感染細胞によるＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ免疫原の発現を誘導し、ＧＣＣ及びＰＡＤＲＥに対する免疫応答を誘導する。ＰＡＤＲＥは、ＧＣＣ特異的Ｂ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞にＣＤ４＋Ｔ細胞「ヘルプ」を提供し、ＰＡＤＲＥを有していないＧＣＣワクチン接種と比較して、前臨床モデルにおいて優れた免疫及び抗腫瘍効果をもたらすワクチンに含まれる。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ投与の論理的根拠
本発明者らの第１相試験の結果から、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンに対する免疫学的応答が確認されるが、これはＡｄ５中和抗体によって抑制された。ヒト集団における天然Ａｄ５曝露の高い有病率と、約４０％の患者に見られる結果として得られる中和抗体の発達を考慮して、本研究は、逐次用量投与、より高い用量レベル、及び／又はＡｄ５骨格の変更（Ａｄ５からＡｄ５．Ｆ３５）がこの障害を克服するかどうかを決定する。この手法は、より高い用量レベルが既存の高いＡｄ５ ｎＡｂ力価を克服して細胞性免疫応答をもたらすことができた他のＡｄ５ワクチンによる結果によって支持される。
本発明者らの第１相試験の結果から、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチンに対する免疫学的応答が確認されるが、これはＡｄ５中和抗体によって抑制された。ヒト集団における天然Ａｄ５曝露の高い有病率と、約４０％の患者に見られる結果として得られる中和抗体の発達を考慮して、本研究は、逐次用量投与、より高い用量レベル、及び／又はＡｄ５骨格の変更（Ａｄ５からＡｄ５．Ｆ３５）がこの障害を克服するかどうかを決定する。この手法は、より高い用量レベルが既存の高いＡｄ５ ｎＡｂ力価を克服して細胞性免疫応答をもたらすことができた他のＡｄ５ワクチンによる結果によって支持される。
この研究のために選択された用量は、Ａｄ５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥワクチン及び他のＡｄ５ベースのワクチンの臨床試験に関する以前のヒトの経験に基づいている。１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）用量は、以前の第１相臨床試験において単回投与として試験されており、安全で忍容性があった。本研究では、計３回の注射について、４週間隔で筋肉内（ＩＭ）に投与される１×１０１１ｖｐ Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの反復投与を検討する。さらに、この研究はまた、４週間隔で３回投与される２つの追加用量レベルを調査する。まとめると、該用量は、１×１０１１ｖｐ、１×１０１２ｖｐ、及び５×１０１２ｖｐである。５×１０１２ｖｐの最大用量は、ワクチンの溶解性に制限があることを考慮すると、達成可能なほぼ最高用量である。
この第２Ａ相試験で使用されたより高い用量投与計画（１×１０１２及び５×１０１２）のＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、ヒトにおいて以前に試験されておらず、他のアデノウイルスベースのワクチンは、同様の用量レベルで投与されており、十分に忍容性があった。同様に、ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥベクターの反復投与は臨床的に評価されていないが、他の研究では、同等の用量レベルを用いたアデノウイルスベースのワクチンの反復投与が使用されており、忍容性は十分であった。
研究内容
治験用生成物は、本研究で基準として試験又は使用されている有効成分の医薬形態として定義される。この試験で使用する活性治験用生成物であるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、筋肉内注射用ＴＧ緩衝液に配合したヒトＧＣＣタンパク質に対する複製欠損型アデノウイルスワクチンである。
治験用生成物は、本研究で基準として試験又は使用されている有効成分の医薬形態として定義される。この試験で使用する活性治験用生成物であるＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、筋肉内注射用ＴＧ緩衝液に配合したヒトＧＣＣタンパク質に対する複製欠損型アデノウイルスワクチンである。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥの特徴
ウイルス：アデノウイルス科；非エンベロープ、正二十面体ビリオン、直径７０～９０ｎｍ、二本鎖、線状ＤＮＡゲノム。野生型ウイルスは溶解性であるが、ワクチン中のＥ１／Ｅ３欠失バージョンは複製されない。
ウイルス：アデノウイルス科；非エンベロープ、正二十面体ビリオン、直径７０～９０ｎｍ、二本鎖、線状ＤＮＡゲノム。野生型ウイルスは溶解性であるが、ワクチン中のＥ１／Ｅ３欠失バージョンは複製されない。
病原性：Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは複製欠損アデノウイルスであるため、生産的な感染のリスクは低い。野生型アデノウイルス感染の症状は、発熱、鼻炎、咽頭炎、咳及び結膜炎である。アデノウイルスは、強い免疫応答をもたらすることができる。アデノウイルスは宿主細胞ゲノムに組み込まれず、Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは組み込みを促進する追加の特徴を持たない。Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥによって発現する導入遺伝子は、免疫応答が生成される分泌型ＧＣＣ－ＰＡＤＲＥ融合タンパク質を生成する。これらの応答は、患者において抗腫瘍活性を有することが期待される。
Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、ＴＧ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％グリセロール）に配合されたＡｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥウイルス粒子で構成される液体中にタンパク質起源の可視微粒子を含み得る組換えアデノウイルス５型粒子の乳白色懸濁液である。該ワクチンは、１．２ｍＬの透明な無色の滅菌溶液を含むバイアル中に必要な濃度で供給される。Ａｄ５．Ｆ３５－ｈＧＣＣ－ＰＡＤＲＥは、光から保護され、－７０℃以下で保存されなければならない。調剤されない限り、バイアルは解凍してはならない。凍結融解サイクルはワクチンの効力を低下させ、避けなければならない。
実施例５
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）が遺伝子導入を媒介し、強力な免疫応答を誘導する能力によって、癌及び感染症に対する実験的ワクチンのための人気のベクターとなった。実際、Ａｄ５ベクターを用いた臨床試験は４００超あり、ほとんどの試験は癌治療の開発に焦点を当てている。しかし、自然感染では、宿主免疫系はＡｄ５カプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）を発達させ、ウイルスの拡散を制限し、再感染を阻止する。Ａｄ５感染は多くのヒト集団に固有であるため、世界人口の７０％超に存在する既存のＮＡｂは、Ａｄ５ベースのワクチン計画を制限する。これらの考察は、最も多くの患者において治療的免疫応答を生じさせることができる、癌及び病原体関連抗原を標的とするワクチンに使用するための改善されたベクターの必要性を強調する。重要なことに、アデノウイルスのカプシドは、ヘキソン、ペントン、及び繊維タンパク質で構成されているが、ヒトにおいて天然Ａｄ５感染によって誘発されるＮＡｂは主にＡｄ５繊維に向けられており、この要素に対する既存の免疫を回避する計画がＡｄ５ベースのワクチンを改善し得ることを示唆している。
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）が遺伝子導入を媒介し、強力な免疫応答を誘導する能力によって、癌及び感染症に対する実験的ワクチンのための人気のベクターとなった。実際、Ａｄ５ベクターを用いた臨床試験は４００超あり、ほとんどの試験は癌治療の開発に焦点を当てている。しかし、自然感染では、宿主免疫系はＡｄ５カプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）を発達させ、ウイルスの拡散を制限し、再感染を阻止する。Ａｄ５感染は多くのヒト集団に固有であるため、世界人口の７０％超に存在する既存のＮＡｂは、Ａｄ５ベースのワクチン計画を制限する。これらの考察は、最も多くの患者において治療的免疫応答を生じさせることができる、癌及び病原体関連抗原を標的とするワクチンに使用するための改善されたベクターの必要性を強調する。重要なことに、アデノウイルスのカプシドは、ヘキソン、ペントン、及び繊維タンパク質で構成されているが、ヒトにおいて天然Ａｄ５感染によって誘発されるＮＡｂは主にＡｄ５繊維に向けられており、この要素に対する既存の免疫を回避する計画がＡｄ５ベースのワクチンを改善し得ることを示唆している。
本発明者らは、胃腸（ＧＩ）癌抗原グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するマウスモデルにおける抗腫瘍免疫を改善するために、Ａｄ５繊維を希少なアデノウイルス血清型Ａｄ３５（国際血清有病率約１０％）の繊維に置き換えることによって、既存のＡｄ５ ＮＡｂを克服することを目指した。前臨床モデルは、Ａｄ５ベースのＧＵＣＹ２Ｃ指向性ワクチン（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）が自己免疫を伴わずにＣＤ８＋ Ｔ細胞及び抗体応答を惹起することを実証した。さらに、マウスのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチン接種は、肺及び肝臓における転移性結腸直腸癌に対する長期のＴ細胞媒介性保護を誘導した。さらに、それらの結果は、最近のヒトにおける最初の第Ｉ相臨床試験（ＮＣＴ０１９７２７３７）で再現され、ヒト化バージョンのワクチン（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ）が、従来の治療法に続く結腸直腸癌患者においてＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を安全に誘導することを実証した。しかし、Ａｄ５に対するＮＡｂの高い既存の力価を有する患者は、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチン接種後にＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を生じさせることができなかった。Ａｄ５ ＮＡｂを克服するために、本発明者らは、マウス及びヒトにおけるＡｄ５に対する同等の安全性及び抗腫瘍活性並びにＡｄ５ ＮＡｂに対する耐性を有する、Ａｄ３５の繊維保有キメラＡｄ５ベクター（Ａｄ５．Ｆ３５）を作製した。このキメラワクチンは、Ａｄ５免疫が低い患者だけでなく、既存のＡｄ５ ＮＡｂが高い患者でも、ＧＩ癌患者に投与して、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を安全に誘導することができる。
材料と方法
アデノウイルスベクター
サイト１（Ｓ１）として知られるインフルエンザＨＡ１０７－１１９ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有するマウス細胞外ドメイン（ＧＵＣＹ２Ｃ１－４２９）を含むアデノウイルスについては先に記載した（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）。ここで、ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１をｐＳｈｕｔｔｌｅにクローニングし、以前に作製した複製欠損キメラアデノウイルス（Ａｄ５．Ｆ３５）のＥ１領域にサブクローニングし、Ａｄ５繊維をＡｄ３５繊維に置き換えてＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を作製した。この研究で用いた全てのアデノウイルスワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所のグッドラボラトリー・プラクティスの下で、ＨＥＫ２９３細胞内で生成され、塩化セシウム超遠心分離によって精製され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞ＤＮＡ混入について陰性であることが認定された。インビトロＧＵＣＹ２Ｃ発現実験（用量反応及び経時変化）をＡ５４９（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））細胞において行った。ウイルスを指示された用量で培養物に添加し、示された時点で培養上清を収集した。２μｇ／ｍＬのＭＳ７マウス抗ＧＵＣＹ２Ｃモノクローナル抗体及び０．１μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ）を用いて、ウェスタンブロットにより上清中の相対的なＧＵＣＹ２Ｃレベルを定量した。
アデノウイルスベクター
サイト１（Ｓ１）として知られるインフルエンザＨＡ１０７－１１９ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有するマウス細胞外ドメイン（ＧＵＣＹ２Ｃ１－４２９）を含むアデノウイルスについては先に記載した（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）。ここで、ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１をｐＳｈｕｔｔｌｅにクローニングし、以前に作製した複製欠損キメラアデノウイルス（Ａｄ５．Ｆ３５）のＥ１領域にサブクローニングし、Ａｄ５繊維をＡｄ３５繊維に置き換えてＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を作製した。この研究で用いた全てのアデノウイルスワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所のグッドラボラトリー・プラクティスの下で、ＨＥＫ２９３細胞内で生成され、塩化セシウム超遠心分離によって精製され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞ＤＮＡ混入について陰性であることが認定された。インビトロＧＵＣＹ２Ｃ発現実験（用量反応及び経時変化）をＡ５４９（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））細胞において行った。ウイルスを指示された用量で培養物に添加し、示された時点で培養上清を収集した。２μｇ／ｍＬのＭＳ７マウス抗ＧＵＣＹ２Ｃモノクローナル抗体及び０．１μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ）を用いて、ウェスタンブロットにより上清中の相対的なＧＵＣＹ２Ｃレベルを定量した。
マウス及び免疫化
８週齢の雄及び雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコル０２０９２）によって承認された。免疫のために、０．５ｍＬのインスリン注射器を用いて、各後肢に１回で５０μＬの２回の筋肉内注射として投与される１０１０又は１０１１ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、又はＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰ（対照）をマウスに投与した。
８週齢の雄及び雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコル０２０９２）によって承認された。免疫のために、０．５ｍＬのインスリン注射器を用いて、各後肢に１回で５０μＬの２回の筋肉内注射として投与される１０１０又は１０１１ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、又はＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰ（対照）をマウスに投与した。
ＥＬＩＳｐｏｔによるＴ細胞応答の定量化
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、製造業者のプロトコルに従ってマウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）単色ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて実施した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートにＩＦＮ－γ捕捉抗体を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、ＣＴＬ－ＴＥＳＴ培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中ペプチドなし又は１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドで５００,０００細胞／ウェルで、３７℃で２４時間播種した。Ｔ細胞結合力研究のために、１０６細胞／ウェルに正規化したＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドの濃度を低下させて（１０μｇ／ｍＬから５６ｐｇ／ｍＬ）、６００,０００～８００,０００細胞／ウェルで脾細胞を播種した。インキュベーション後、細胞を除去し、ＩＦＮγ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ユニバーサルアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ及びＡｕｔｏｇａｔｅ機能を用いて決定した。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を、ペプチド刺激ウェルから０．１％ＤＭＳＯウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、製造業者のプロトコルに従ってマウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）単色ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて実施した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートにＩＦＮ－γ捕捉抗体を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、ＣＴＬ－ＴＥＳＴ培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中ペプチドなし又は１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドで５００,０００細胞／ウェルで、３７℃で２４時間播種した。Ｔ細胞結合力研究のために、１０６細胞／ウェルに正規化したＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドの濃度を低下させて（１０μｇ／ｍＬから５６ｐｇ／ｍＬ）、６００,０００～８００,０００細胞／ウェルで脾細胞を播種した。インキュベーション後、細胞を除去し、ＩＦＮγ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ユニバーサルアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ及びＡｕｔｏｇａｔｅ機能を用いて決定した。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を、ペプチド刺激ウェルから０．１％ＤＭＳＯウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
腫瘍研究
ＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）ＣＴ２６結腸直腸癌細胞をインビボ腫瘍研究に使用した。ルシフェラーゼ発現細胞を、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって生成されたレンチウイルス上清でｐＬｅｎｔｉ４－Ｖ５－ＧＷ－ルシフェラーゼと共に形質導入することによって作製した。腫瘍実験のために、５×１０５ＣＴ２６細胞を尾静脈に送達する７日前に、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、又はＰＢＳ（対照）で免疫した。ＰＢＳ中の３．７５ｍｇのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の皮下注射、続いて８分間のインキュベーション及びＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲイメージングステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた１０秒曝露によるイメージングにより、腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度（光子／秒）を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅインビボイメージングソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
ＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）ＣＴ２６結腸直腸癌細胞をインビボ腫瘍研究に使用した。ルシフェラーゼ発現細胞を、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって生成されたレンチウイルス上清でｐＬｅｎｔｉ４－Ｖ５－ＧＷ－ルシフェラーゼと共に形質導入することによって作製した。腫瘍実験のために、５×１０５ＣＴ２６細胞を尾静脈に送達する７日前に、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１、又はＰＢＳ（対照）で免疫した。ＰＢＳ中の３．７５ｍｇのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の皮下注射、続いて８分間のインキュベーション及びＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲイメージングステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた１０秒曝露によるイメージングにより、腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度（光子／秒）を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅインビボイメージングソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
抗体中和アッセイ
血清試料を、事前に、トーマス・ジェファーソン大学の施設内倫理委員会によって承認されたＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ（ＮＣＴ０１９７２７３７）による免疫前に患者から取得した。Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ベクターに対する中和抗体価を定量した。簡単に説明すると、熱不活化血清試料の希釈液を、１０５Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を含む９６ウェル組織培養プレートに添加し、１０８ｖｐのＧＦＰ発現Ａｄ５又はＡｄ５．Ｆ３５ウイルス（それぞれＡｄ５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ又はＡｄ５．Ｆ３５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ；Ｂａｙｌｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌａｂ）で感染させた。３７℃で４１時間のインキュベーション後に、ｅＧＦＰ蛍光（４９０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）をＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａｔｅプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて定量した。試料蛍光を、細胞及びウイルスを含む対照ウェル（０％中和）又は細胞のみを含むウェル（１００％中和）に正規化した。力価を、５０％中和をもたらす血清希釈液として非線形回帰を用いて定量した（Ｐｒｉｓｍ ｖ８，ＧｒａｐｈＰａｄ ソフトウェア）。
血清試料を、事前に、トーマス・ジェファーソン大学の施設内倫理委員会によって承認されたＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ（ＮＣＴ０１９７２７３７）による免疫前に患者から取得した。Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ベクターに対する中和抗体価を定量した。簡単に説明すると、熱不活化血清試料の希釈液を、１０５Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を含む９６ウェル組織培養プレートに添加し、１０８ｖｐのＧＦＰ発現Ａｄ５又はＡｄ５．Ｆ３５ウイルス（それぞれＡｄ５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ又はＡｄ５．Ｆ３５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ；Ｂａｙｌｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌａｂ）で感染させた。３７℃で４１時間のインキュベーション後に、ｅＧＦＰ蛍光（４９０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）をＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａｔｅプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて定量した。試料蛍光を、細胞及びウイルスを含む対照ウェル（０％中和）又は細胞のみを含むウェル（１００％中和）に正規化した。力価を、５０％中和をもたらす血清希釈液として非線形回帰を用いて定量した（Ｐｒｉｓｍ ｖ８，ＧｒａｐｈＰａｄ ソフトウェア）。
Ａｄ５中和免疫試験
抗Ａｄ５免疫を誘導するために、１０１０のＡｄ５－ＧＦＰを４週間隔で１回又は２回マウスに鼻腔内曝露した。最後の曝露の３０日後、上記のように血清中のＡｄ５ ＮＡｂを定量し、マウスに１０１１ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１又はＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で筋肉内に免疫した。
抗Ａｄ５免疫を誘導するために、１０１０のＡｄ５－ＧＦＰを４週間隔で１回又は２回マウスに鼻腔内曝露した。最後の曝露の３０日後、上記のように血清中のＡｄ５ ＮＡｂを定量し、マウスに１０１１ｖｐのＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１又はＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で筋肉内に免疫した。
生体分布及び毒性研究
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、２８日間隔で１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の一用量、１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の３用量、又はＰＢＳ（対照）で筋肉内に免疫した。動物を有害事象について１日１回監視し、投薬日（投薬後５分、１時間、及び３時間）に追加評価を行った。１４日目及び９０日目に、指定した動物を屠殺し、盲検病理学者による病理組織学的分析のために脳、唾液腺、胃、小腸、結腸、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び注射部位を採取及び秤量し（病理学的評価はＩＤＥＸＸ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃｓによって実施した）、ＧＵＣＹ２Ｃ導入遺伝子について前述のアッセイを用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるウイルスＤＮＡの検出を行った。また、上記のようなウイルスＤＮＡの病理組織学的解析及び検出、並びに上記のようにＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔによるＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答の定量のために脾臓を採取した。
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、２８日間隔で１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の一用量、１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の３用量、又はＰＢＳ（対照）で筋肉内に免疫した。動物を有害事象について１日１回監視し、投薬日（投薬後５分、１時間、及び３時間）に追加評価を行った。１４日目及び９０日目に、指定した動物を屠殺し、盲検病理学者による病理組織学的分析のために脳、唾液腺、胃、小腸、結腸、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び注射部位を採取及び秤量し（病理学的評価はＩＤＥＸＸ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃｓによって実施した）、ＧＵＣＹ２Ｃ導入遺伝子について前述のアッセイを用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるウイルスＤＮＡの検出を行った。また、上記のようなウイルスＤＮＡの病理組織学的解析及び検出、並びに上記のようにＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔによるＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答の定量のために脾臓を採取した。
統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ８を用いて行った。統計的有意性は、以下：ｎｓ＝ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１のように考慮した。コホートサイズは、β＝０．２及びα＝０．０５の先行研究に基づいて供給された。生存転帰の多重比較の場合には、ボンフェローニ法を用いて有意性閾値を修正した。ワクチン誘発性Ｔ細胞応答者と非応答者を同定するために、修正された分布フリーリサンプリング手法を使用し、ＤＭＳＯ及び２０超の特異的スポット／１０６細胞と比較して、陽性Ｔ細胞応答を２倍と定義した。性別及びワクチン接種回数が応答に及ぼす影響を決定するために、対数変換されたワクチン応答の大きさを、ＲパッケージＭＡＳＳを用いた赤池情報量基準によるステップワイズ後方変数選択で、異なる性別、コホート、及び治療投与計画のマウスにおいて最大３者間相互作用について比較した。
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ８を用いて行った。統計的有意性は、以下：ｎｓ＝ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１のように考慮した。コホートサイズは、β＝０．２及びα＝０．０５の先行研究に基づいて供給された。生存転帰の多重比較の場合には、ボンフェローニ法を用いて有意性閾値を修正した。ワクチン誘発性Ｔ細胞応答者と非応答者を同定するために、修正された分布フリーリサンプリング手法を使用し、ＤＭＳＯ及び２０超の特異的スポット／１０６細胞と比較して、陽性Ｔ細胞応答を２倍と定義した。性別及びワクチン接種回数が応答に及ぼす影響を決定するために、対数変換されたワクチン応答の大きさを、ＲパッケージＭＡＳＳを用いた赤池情報量基準によるステップワイズ後方変数選択で、異なる性別、コホート、及び治療投与計画のマウスにおいて最大３者間相互作用について比較した。
結果
Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ベクター
世界中のＡｄ５血清有病率は７０％を超えている（一部の地域では９０％超）が、Ａｄ３５は約１０％であり、より低い力価と関連している。図６パネルＡ。そのため、本発明者らは、繊維をＡｄ３５繊維に置換したＡｄ５で構成されるキメラアデノウイルス（Ａｄ５．Ｆ３５）を構築し、ヒト及びマウスにおいてＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を誘導し、Ａｄ５特異的免疫に抵抗する能力を評価した。Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１は、Ｃ末端のサイト１として知られるＩ－Ｅｄ制限ＣＤ４＋エピトープに融合されたマウスＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメインを発現する複製欠損ヒトＡｄ５である。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を作製するために、Ａｄ５繊維（Ｌ５）をＡｄ３５繊維に置き換えた（図６パネルＢ）。ＨＥＫ２９３細胞において作製された複製欠損Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１は、Ａ５４９ヒト肺胞基底上皮細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１タンパク質の用量依存的発現（図６パネルＣ）及び時間依存的発現（図６パネルＤ）をインビトロでもたらした。
Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ベクター
世界中のＡｄ５血清有病率は７０％を超えている（一部の地域では９０％超）が、Ａｄ３５は約１０％であり、より低い力価と関連している。図６パネルＡ。そのため、本発明者らは、繊維をＡｄ３５繊維に置換したＡｄ５で構成されるキメラアデノウイルス（Ａｄ５．Ｆ３５）を構築し、ヒト及びマウスにおいてＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を誘導し、Ａｄ５特異的免疫に抵抗する能力を評価した。Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１は、Ｃ末端のサイト１として知られるＩ－Ｅｄ制限ＣＤ４＋エピトープに融合されたマウスＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメインを発現する複製欠損ヒトＡｄ５である。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を作製するために、Ａｄ５繊維（Ｌ５）をＡｄ３５繊維に置き換えた（図６パネルＢ）。ＨＥＫ２９３細胞において作製された複製欠損Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１は、Ａ５４９ヒト肺胞基底上皮細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１タンパク質の用量依存的発現（図６パネルＣ）及び時間依存的発現（図６パネルＤ）をインビトロでもたらした。
Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１はＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗腫瘍免疫を誘導する
Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１によるＧＵＣＹ２Ｃ発現のインビトロ検証に続いて、ワクチン接種後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答をインビボで誘導する能力を確認した。１０１０ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で筋肉内免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１と比較して５４％低いＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答（図７パネルＡ）を生成し、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体応答を有していなかった（図７パネルＢ）。重要なことに、Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ標的化ワクチンの抗腫瘍効果の重要な決定因子である同等の結合力のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成した（図７パネルＣ）。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体応答は、検出可能な抗腫瘍活性を有していない。同様に、Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ワクチンは、同等のＳ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をもたらした（図７パネルＤ）。
Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１によるＧＵＣＹ２Ｃ発現のインビトロ検証に続いて、ワクチン接種後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答をインビボで誘導する能力を確認した。１０１０ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で筋肉内免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１と比較して５４％低いＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答（図７パネルＡ）を生成し、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体応答を有していなかった（図７パネルＢ）。重要なことに、Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ワクチンは、ＧＵＣＹ２Ｃ標的化ワクチンの抗腫瘍効果の重要な決定因子である同等の結合力のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成した（図７パネルＣ）。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体応答は、検出可能な抗腫瘍活性を有していない。同様に、Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５ワクチンは、同等のＳ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をもたらした（図７パネルＤ）。
以前の研究で、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンが転移性結腸直腸癌のマウスモデルにおいて防御的抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導することが明らかになった。そのため、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を発現するＡｄ５又はＡｄ５．Ｆ３５で免疫し、７日後にＧＵＣＹ２Ｃ及びホタルルシフェラーゼを発現するＣＴ２６結腸直腸癌細胞で負荷した。このモデルは、特に、ＧＵＣＹ２Ｃワクチンが開発されている臨床環境で転移性疾患の二次防御をエミュレートしている。以前に実証したように、Ａｄ５ワクチン接種は転移性腫瘍負荷をほぼ排除し（図８パネルＡ及びＢ）、疾患進行を遅らせ（図８パネルＣ）、生存率を改善した（図８パネルＤ）。同様に、Ａｄ５．Ｆ３５は、腫瘍負荷（図８パネルＡ及びＢ）、疾患進行（図８パネルＣ）、及び生存期間の延長（図８パネルＤ）も低下させた。重要なことに、Ａｄ５ベース及びＡｄ５．Ｆ３５ベースのＧＵＣＹ２Ｃワクチンの有効性は、腫瘍負荷を低下させ、疾患進行を阻止し、生存を促進することにおいて同一であった（図８パネルＡ～Ｄ）。
Ａｄ５．Ｆ３５はマウス及びヒトにおけるＡｄ５指向性免疫に抵抗する
Ａｄ５に対するＮＡｂは、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチン接種を受けた患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答の不良と相関し、Ａｄ５へのマウスの事前曝露はワクチン誘発免疫を同様に鈍らせた。既存のＡｄ５免疫に対するＡｄ５．Ｆ３５ベースのワクチン耐性を、患者の自然な感染経路であるＡｄ５への呼吸器事前曝露のモデルで定量し、続いてワクチン接種及びＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答の定量化を行った。対照マウス（Ａｄ５に事前曝露していない；未処置）及び鼻腔内にＡｄ５に１回（１×）又は２回（２×）事前曝露したマウスに、４週間後にＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を発現するＡｄ５又はＡｄ５．Ｆ３５で筋肉内にワクチン接種し、２週間後に免疫応答を定量した（図９パネルＡ）。予想通り、１回のＡｄ５事前曝露は、中等度（＜１：２００）Ａｄ５ ＮＡｂを誘導し、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を約７５％低下させるが、２回の事前曝露は、高い（＞１：２００）Ａｄ５ ＮＡｂ誘導し、Ａｄ５ワクチン接種後にＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を９０％超低下させた（図９パネルＢ）。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答は、Ａｄ５．Ｆ３５ワクチン接種後、わずか６０％（１回事前曝露）及び８０％（２回事前曝露）低下させた（図９パネルＢ）。重要なことに、Ａｄ５への連続的事前曝露後、Ａｄ５（３０％コホート応答）と比較して、Ａｄ５．Ｆ３５は集団のかなり大きな割合（８０％コホート応答）でＴ細胞応答をもたらした（図９パネルＣ）。
Ａｄ５に対するＮＡｂは、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチン接種を受けた患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答の不良と相関し、Ａｄ５へのマウスの事前曝露はワクチン誘発免疫を同様に鈍らせた。既存のＡｄ５免疫に対するＡｄ５．Ｆ３５ベースのワクチン耐性を、患者の自然な感染経路であるＡｄ５への呼吸器事前曝露のモデルで定量し、続いてワクチン接種及びＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答の定量化を行った。対照マウス（Ａｄ５に事前曝露していない；未処置）及び鼻腔内にＡｄ５に１回（１×）又は２回（２×）事前曝露したマウスに、４週間後にＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を発現するＡｄ５又はＡｄ５．Ｆ３５で筋肉内にワクチン接種し、２週間後に免疫応答を定量した（図９パネルＡ）。予想通り、１回のＡｄ５事前曝露は、中等度（＜１：２００）Ａｄ５ ＮＡｂを誘導し、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を約７５％低下させるが、２回の事前曝露は、高い（＞１：２００）Ａｄ５ ＮＡｂ誘導し、Ａｄ５ワクチン接種後にＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を９０％超低下させた（図９パネルＢ）。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答は、Ａｄ５．Ｆ３５ワクチン接種後、わずか６０％（１回事前曝露）及び８０％（２回事前曝露）低下させた（図９パネルＢ）。重要なことに、Ａｄ５への連続的事前曝露後、Ａｄ５（３０％コホート応答）と比較して、Ａｄ５．Ｆ３５は集団のかなり大きな割合（８０％コホート応答）でＴ細胞応答をもたらした（図９パネルＣ）。
マウスにおけるこれらの観察を、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ第Ｉ相試験（ＮＣＴ０１９７２７３７）において結腸直腸癌患者由来の血清を用いて再現した。Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５に対するＮＡｂ力価を、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥによるワクチン接種前に収集された血清試料中の確立されたＡｄ５／Ａｄ５．Ｆ３５レポーターウイルス阻害バイオアッセイを用いて定量した。これらの患者において、Ａｄ５．Ｆ３５特異的ＮＡｂ力価は、Ａｄ５特異的力価よりも実質的に低かった（図９パネルＤ）。最も重要なことに、患者の５０％が低い（＜１：２００）Ａｄ５ ＮＡｂ力価を保有し（図９パネルＤ及びＥ）、これは４０％のＧＵＣＹ２Ｃ特異的奏効率と密接に相関した。顕著に対照的に、９０％がＡｄ５．Ｆ３５ ＮＡｂ力価が低く、Ａｄ５．Ｆ３５ベースのワクチンで免疫された患者の大多数がＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を生成する可能性があることが示唆された（図９パネルＥ）。全体として、これらの観察は、Ａｄ５送達プラットフォームを中和する環境曝露の反復によって誘導される既存のウイルス免疫が、キメラＡｄ５．Ｆ３５ベクターによって克服され、わずかな集団ワクチン応答を増強し得ることを示唆している。
Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の安全性、生体分布、及び毒性
食品医薬品局ＩＮＤ（治験新薬（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ））対応研究は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の毒性、生体分布、及び免疫原性を定量化し、急性及び慢性の影響を調べるために３つのスキームを使用した（図１０パネルＡ）。示すように、性別のバランスのとれたコホートに、１回の筋肉内注射又は４週間隔をあけた３回の筋肉内注射のいずれかとして１０１１Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を投与し、毎日監視し、１４日目又は９０日目に分析のために屠殺した（図１０パネルＡ）。観察、体重変化、又は生存による寿命期中の急性又は慢性毒性の徴候はなかった（図１０パネルＡ～Ｄ）。同様に、剖検における臓器重量又は組織病理学（図示せず）に臨床的有意差はなかった。臓器重量の小さな統計的差異は臨床的に重要ではないと考えられ、ワクチン曝露（用量、時間）とは無関係であった。ｑＰＣＲによって定量化した生体分布は、急性及び慢性曝露後に、注射部位及び脾臓においてＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を検出したが、他の臓器では顕著ではなかった。さらに、堅牢なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を１４日目に定量し、単回投与後のマウスの７０％において９０日間持続した（図１０パネルＥ～Ｇ）。予想通り、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、より大きく、３回のワクチン接種後９０日目により多くのマウス（１００％）で持続した（図１０パネルＥ～Ｇ）。
食品医薬品局ＩＮＤ（治験新薬（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ））対応研究は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１の毒性、生体分布、及び免疫原性を定量化し、急性及び慢性の影響を調べるために３つのスキームを使用した（図１０パネルＡ）。示すように、性別のバランスのとれたコホートに、１回の筋肉内注射又は４週間隔をあけた３回の筋肉内注射のいずれかとして１０１１Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を投与し、毎日監視し、１４日目又は９０日目に分析のために屠殺した（図１０パネルＡ）。観察、体重変化、又は生存による寿命期中の急性又は慢性毒性の徴候はなかった（図１０パネルＡ～Ｄ）。同様に、剖検における臓器重量又は組織病理学（図示せず）に臨床的有意差はなかった。臓器重量の小さな統計的差異は臨床的に重要ではないと考えられ、ワクチン曝露（用量、時間）とは無関係であった。ｑＰＣＲによって定量化した生体分布は、急性及び慢性曝露後に、注射部位及び脾臓においてＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を検出したが、他の臓器では顕著ではなかった。さらに、堅牢なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を１４日目に定量し、単回投与後のマウスの７０％において９０日間持続した（図１０パネルＥ～Ｇ）。予想通り、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、より大きく、３回のワクチン接種後９０日目により多くのマウス（１００％）で持続した（図１０パネルＥ～Ｇ）。
考察
何十年にもわたる遺伝子治療試験を通じて、Ａｄ５は人気のベクターであり続けてきたが、高いＡｄ５血清有病率はユニバーサルワクチン接種に対する障害のままである。自然呼吸器感染症は、Ａｄ５ベースのワクチンを中和する長寿命の抗体を作製し、導入遺伝子の送達及び潜在的な治療上の利益を排除し得る。その状況では、Ａｄ５血清有病率は複数の国で７０％超であり、満たされていない代替ベクターの必要性を強調している。本明細書で、キメラＡｄ５．Ｆ３５が既存のＡｄ５免疫に抵抗し、導入遺伝子特異的抗腫瘍免疫を誘導することを実証する。実際、Ａｄ５．Ｆ３５は、マウス及びヒトにおいてＡｄ５曝露に関連付けられる中和の影響を受けにくく、Ａｄ５に事前曝露されたマウスにおいてかなり高い割合のワクチン応答者をもたらす。これらの観察結果は、Ａｄ５．Ｆ３５が患者集団においてより高い割合のワクチン応答者をもたらすという示唆を支持する。
何十年にもわたる遺伝子治療試験を通じて、Ａｄ５は人気のベクターであり続けてきたが、高いＡｄ５血清有病率はユニバーサルワクチン接種に対する障害のままである。自然呼吸器感染症は、Ａｄ５ベースのワクチンを中和する長寿命の抗体を作製し、導入遺伝子の送達及び潜在的な治療上の利益を排除し得る。その状況では、Ａｄ５血清有病率は複数の国で７０％超であり、満たされていない代替ベクターの必要性を強調している。本明細書で、キメラＡｄ５．Ｆ３５が既存のＡｄ５免疫に抵抗し、導入遺伝子特異的抗腫瘍免疫を誘導することを実証する。実際、Ａｄ５．Ｆ３５は、マウス及びヒトにおいてＡｄ５曝露に関連付けられる中和の影響を受けにくく、Ａｄ５に事前曝露されたマウスにおいてかなり高い割合のワクチン応答者をもたらす。これらの観察結果は、Ａｄ５．Ｆ３５が患者集団においてより高い割合のワクチン応答者をもたらすという示唆を支持する。
Ａｄ５繊維に対するＮＡｂが再感染を制限する程度は議論の余地がある。いくつかの研究では、Ａｄ５繊維を別の血清型のものに置き換えると、既存のＡｄ５免疫が回避される。対照的に、他の研究は、これらのキメラアデノウイルスが既存のＡｄ５ ＮＡｂを回避しないことを示唆しており、ヘキソンが抗体中和の主要な標的であることを示唆している。筋肉内又は静脈内投与によって既存のＡｄ５免疫を生成した以前の研究とは対照的に、ここではＡｄ５免疫がマウスの鼻腔内曝露によって誘導され、自然のヒト呼吸器感染症を再現する。さらに、結腸直腸癌患者における天然の既存のＡｄ５ ＮＡｂは、反復呼吸感染によって均一に生成され、同様にＡｄ５．Ｆ３５ベクターによって克服された。重要なことに、アデノウイルス感染後の抗体応答の質は、曝露経路に依存する。実際、呼吸器感染症は繊維特異的ＮＡｂを誘発し、筋肉内曝露はカプシド特異的ＮＡｂを誘導する。ＮＡｂ応答におけるこれらの質的差異は、免疫の様々な経路を反映し、実験室間の観察上の不一致に寄与し得る。関連する動物モデルを用いて、患者試料で確認及び検証された本研究は、Ａｄ５．Ｆ３５ベースのワクチンが実質的な（約９０％）割合の患者において臨床的に関連する免疫応答をもたらすべきであるという示唆を支持する。
世界集団における固有のＡｄ５免疫によって課せられた広範な制限を認識し、ワクチン開発における扱いやすい計画として、代替血清型及びキメラコンストラクトへの新たな関心が高まっている。Ａｄ２６、Ａｄ３５、及びＡｄ４８ベクターは、第Ｉ相臨床試験に進んでいる。その点で、健常患者間のＡｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３５、及びＡｄ４８免疫の比較により、固有のＡｄ３５血清陽性率が世界集団全体で最も低いことが明らかになり、本明細書で使用したキメラ計画が強化された。同様に、Ａｄ５及びＡｄ４８成分を含む最初のヘキソンキメラアデノウイルスは、患者において安全で免疫原性であった。興味深いことに、Ａｄ５－Ａｄ３５キメラベクターは、いずれの親ベクターと比較してもインビトロで様々なヒト細胞型をより効率的に形質導入する。
抗腫瘍効果は同等であったが、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１については、Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１と比較してＣＤ８＋ Ｔ細胞応答はより低く、抗体応答はなかった。しかし、ＧＵＣＹ２Ｃ指向性免疫療法の抗腫瘍効果は、エフェクターＴ細胞量ではなく、主にＴ細胞結合力によって促進される。その状況において、Ａｄ５及びＡｄ５．Ｆ３５免疫後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の機能的結合力は同等であり、それらの同等の抗腫瘍効果と一致した。ベクター間の導入遺伝子特異的免疫の量的差異は、様々な要因を反映し得る。そのため、Ａｄ５．Ｆ３５免疫後のＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１導入遺伝子の量及び持続性は、Ａｄ５と比較してより低く、インビボでのＡｄ５形質導入効率がＡｄ５．Ｆ３５よりも数倍高い可能性があるという以前の観察結果と一致する。さらに、Ａｄ５繊維はＣＸＡＤＲ（コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体）に結合するが、Ａｄ３５繊維はＣＤ４６に結合し、２つのウイルスが別々の細胞型に感染し得ることを示唆している。
チェックポイント阻害剤は、診療所で実践シフトの結果及びいくつかの悪性腫瘍の治療のための効果的な計画として定義される免疫療法を生み出したが、普遍的に成功しているわけではない。その状況では、マイクロサテライトの安定した結腸直腸及び膵臓（それぞれ癌死亡率の第２及び第３の主要原因）を含む多くの癌種におけるネオエピトープの不足は、チェックポイント遮断に対して無反応にさせる。実際、５つの結腸直腸癌標本の表面に提示されたネオエピトープの検査は、合計３つのネオエピトープを明らかにした。そのため、癌関連自己抗原を標的とするワクチンは、単独で及びチェックポイント阻害剤と組み合わせて、これらのコールド腫瘍からの転移を予防及び治療するための計画として再登場した。
チェックポイント阻害剤は、一部の癌の転移性環境における第一選択療法となっているが、Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現するキメラ抗原受容体は、転移性及び難治性疾患の患者に展開されている。対照的に、少数の癌免疫療法は、従来の外科的／放射線／化学療法後に「疾患の証拠がない」（ＮＥＤ）初期ステージの癌患者で、疾患再発のリスクが非常に高い癌患者のために開発されている。実際、ステージＩＩの約２５％、及びステージＩＩＩの約５０％の結腸直腸癌患者は、手術及び化学療法後に再発するが、切除可能な膵臓癌患者の７０％が再発を経験する。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥなどの腫瘍関連抗原を標的とするワクチンは、特にチェックポイント阻害剤又はＣＡＲ－Ｔ細胞を投与される資格がないＮＥＤ患者の転移性疾患の二次予防のための安全で効果的な免疫療法を提供し得る。
本研究は、キメラアデノウイルスベクターＡｄ５．Ｆ３５が広く使用されているＡｄ５ベクターよりも好ましい可能性があることを示唆しており、さらなる調査が必要である。実際、結腸直腸、膵臓、胃、及び食道を含むＧＵＣＹ２Ｃ発現癌の患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ指向性免疫療法の進行中の臨床研究は、Ａｄ５ベクターではなくＡｄ５．Ｆ３５を使用することで恩恵を受けられることを示唆している。その状況において、今後の臨床試験では、ＧＩ癌患者におけるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥの安全性、免疫原性、及び既存の免疫に対する耐性が検討される（ＮＣＴ０４１１１１７２）。高い割合の患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ標的化免疫の安全な生成は、全ての癌死亡の２５％を占め５１、確立された免疫療法は効果がないＧＩ癌患者において、標準療法後の再発を予防するＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥの能力を確立する有効性試験につながる。
実施例６
背景：組換え弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、癌免疫療法の新たなプラットフォームであり、多くのウイルスベクターの限界であるベクター特異的中和免疫に対するその非感受性を部分的に反映している。さらに、Ｌｍは抗原提示細胞（ＡＰＣ）に指向性を有する細胞内細菌であり、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）及びＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって免疫応答を開始するのに関与する免疫細胞にワクチンを導く。これらの利点は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者における第Ｉ相臨床試験で最近試験されたＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチンの限界と一致している。Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ免疫原性は、Ａｄ５ウイルスベクターを標的とする既存の中和抗体（ＮＡｂ）によってヒト集団において制限される。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答の誘導に必須のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の不在によって特徴付けられる。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃを組み込んだＬｍワクチン（Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃ）は、ベクター特異的免疫に対して耐性であるべきであり、ＡＰＣに対するその指向性を反映して、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＢ細胞にＣＤ４＋Ｔ細胞の助けを提供するＬｍ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導し、ＣＲＣ排除をもたらすべきである。
背景：組換え弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、癌免疫療法の新たなプラットフォームであり、多くのウイルスベクターの限界であるベクター特異的中和免疫に対するその非感受性を部分的に反映している。さらに、Ｌｍは抗原提示細胞（ＡＰＣ）に指向性を有する細胞内細菌であり、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）及びＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって免疫応答を開始するのに関与する免疫細胞にワクチンを導く。これらの利点は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者における第Ｉ相臨床試験で最近試験されたＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチンの限界と一致している。Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥ免疫原性は、Ａｄ５ウイルスベクターを標的とする既存の中和抗体（ＮＡｂ）によってヒト集団において制限される。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答の誘導に必須のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の不在によって特徴付けられる。対照的に、ＧＵＣＹ２Ｃを組み込んだＬｍワクチン（Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃ）は、ベクター特異的免疫に対して耐性であるべきであり、ＡＰＣに対するその指向性を反映して、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＢ細胞にＣＤ４＋Ｔ細胞の助けを提供するＬｍ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導し、ＣＲＣ排除をもたらすべきである。
目的／仮説：Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃは、現在のＧＵＣＹ２Ｃワクチンよりも優れており、中和抗体及びＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞耐性を克服し、安全で効果的なＣＲＣ免疫療法を生成する。
具体的な目的：本提案では、（１）免疫原性、（２）転移性ＣＲＣモデルにおける抗腫瘍活性、及び（３）Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃの安全性を定義する。
研究設計：Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃを生成し、その免疫原性を、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞並びにＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＢ細胞）を定量することによってマウスで試験する。さらに、Ｌｍ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を定量化し、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を誘導する上でのそれらの役割をＣＤ４枯渇研究によって決定する。Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃの抗腫瘍効果を、転移性ＣＲＣのマウスモデルで試験し、ベンチマークＧＵＣＹ２Ｃワクチン（Ａｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）と比較する。最後に、Ｌｍ－ＬＬＯＧＵＣＹ２Ｃ毒性を、特に正常なＧＵＣＹ２Ｃ発現組織において調べる。提案された研究の陽性対照及び陰性対照には、それぞれＡｄ５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＬｍ－ＬＬＯ（ＧＵＣＹ２Ｃを欠く）が含まれる。
イノベーション：ＧＵＣＹ２Ｃワクチンの開発が開始から臨床試験まで進むにつれて、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫生物学とワクチンプラットフォームに関する本発明者らの理解は十分に進歩し、より多くの情報に基づいたＧＵＣＹ２Ｃワクチン設計が可能になった。その状況において、発明者らは、Ｌｍの性質（ベクター免疫に対する耐性；ＡＰＣ指向性）及びＧＵＣＹ２Ｃ（腸特異的；ＣＲＣにおける普遍的発現；選択的ＣＤ４＋Ｔ細胞耐性）は相互に有利であり得、ＣＲＣに対する有効な免疫療法を生じる。患者におけるＬｍワクチンの安全性と有効性の確立及びＧＵＣＹ２Ｃ免疫原性の状況で、ここでの結果はすぐに第Ｉ相臨床試験に変換され、この仮説を動物からヒトに拡大し、最終的には民間及び軍のＣＲＣ集団における効果的な免疫療法につながる可能性がある。
潜在的なＣＲＣ免疫療法としてＧＵＣＹ２Ｃを標的とするリステリアベースの癌ワクチン（Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＵＣＹ２Ｃ）の免疫原性、有効性、及び安全性。ＣＲＣは４番目に最も一般的な新生物であり、年間約１５０,０００人の新規症例があり、民間人及び軍人における癌死亡率の第２の主要原因であり、死亡率は約５０％である。
実施例７
ＧＵＣＹ２Ｃ＝発現癌を治療するためのワクチン。該ワクチンは、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスを用いて結腸直腸癌抗原であるＧＵＣＹ２Ｃを「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）に送達し、ＧＵＣＹ２Ｃ発現癌を見つけて排除し得るＧＵＣＹ２Ｃに対するＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を誘導する。新規組換えリステリア・モノサイトゲネスワクチンを、結腸直腸癌のマウスモデルで最初に試験し、その活性、有効性、及び安全性を決定する。
ＧＵＣＹ２Ｃ＝発現癌を治療するためのワクチン。該ワクチンは、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスを用いて結腸直腸癌抗原であるＧＵＣＹ２Ｃを「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）に送達し、ＧＵＣＹ２Ｃ発現癌を見つけて排除し得るＧＵＣＹ２Ｃに対するＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞応答を誘導する。新規組換えリステリア・モノサイトゲネスワクチンを、結腸直腸癌のマウスモデルで最初に試験し、その活性、有効性、及び安全性を決定する。
主要課題１：Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣと対照のＬｍワクチンの作製
主要課題２：ＷＴマウスにおける耐性を克服するＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣの能力の決定。ＷＴ及びＫＯマウスにおけるＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ誘導免疫応答の定量化
主要課題３：ＧＣＣ特異的応答がＣＤ４＋Ｔ細胞依存性かどうかの決定
転移性ＣＲＣモデルにおけるＬｍＬＬＯ－ＧＣＣの抗腫瘍活性の定量化
ＬｍＬＬＯ－ＧＣＣとＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果の比較
主要課題５：Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ及びＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１に対する免疫応答に対するベクター特異的免疫の影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するＬｍ－ＬＬＯＧＣＣ又はＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１免疫マウスの免疫応答の定量化
主要課題６：ベクター特異的免疫がＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣとＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果に及ぼす影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するマウスにおけるＬｍ－ＬＬＯＧＣＣ又はＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果の定量化
Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣの安全性の実証
主要課題７：毒性の徴候についてのＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ免疫マウスの検査。ＧＣＣ発現組織及び非発現組織におけるＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ症状の確立
主要課題２：ＷＴマウスにおける耐性を克服するＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣの能力の決定。ＷＴ及びＫＯマウスにおけるＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ誘導免疫応答の定量化
主要課題３：ＧＣＣ特異的応答がＣＤ４＋Ｔ細胞依存性かどうかの決定
転移性ＣＲＣモデルにおけるＬｍＬＬＯ－ＧＣＣの抗腫瘍活性の定量化
ＬｍＬＬＯ－ＧＣＣとＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果の比較
主要課題５：Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ及びＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１に対する免疫応答に対するベクター特異的免疫の影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するＬｍ－ＬＬＯＧＣＣ又はＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１免疫マウスの免疫応答の定量化
主要課題６：ベクター特異的免疫がＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣとＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果に及ぼす影響の比較。既存のベクター特異的免疫を有するマウスにおけるＬｍ－ＬＬＯＧＣＣ又はＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１の抗腫瘍効果の定量化
Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣの安全性の実証
主要課題７：毒性の徴候についてのＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ免疫マウスの検査。ＧＣＣ発現組織及び非発現組織におけるＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ症状の確立
第１世代組換えＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチン
組み込みプラスミドｐＰＬ２を用いて、切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）発現カセット及びＬＬＯプロモーターの下流の弱毒化（ΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢ）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）のゲノムへの組換えＧＣＣ又はＧＣＣ－Ｓ１組み込みを誘導し、Ｌｍ感染細胞のサイトゾルに分泌されるＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質を生成した（図１４）。これらのコンストラクトは、以前のウイルスベクター系のワクチンで使用されたＧＣＣの完全な細胞外ドメイン（残基２３～４２９）を含む。
組み込みプラスミドｐＰＬ２を用いて、切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）発現カセット及びＬＬＯプロモーターの下流の弱毒化（ΔａｃｔＡ／ΔｉｎＬＢ）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）のゲノムへの組換えＧＣＣ又はＧＣＣ－Ｓ１組み込みを誘導し、Ｌｍ感染細胞のサイトゾルに分泌されるＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質を生成した（図１４）。これらのコンストラクトは、以前のウイルスベクター系のワクチンで使用されたＧＣＣの完全な細胞外ドメイン（残基２３～４２９）を含む。
Ｌｍ培養物の上清中のＧＣＣ発現を確認することにより、第１世代Ｌｍ－ＧＣＣ及び対照ワクチンの品質管理を行った（図１５）。ＬＬＯ－ＧＣＣ又はＬＬＯ－ＧＣＣ－Ｓ１融合タンパク質を、抗ＧＣＣ抗体又は抗ＬＬＯ抗体を用いて上清中で検出した。
第１世代Ｌｍ－ＧＣＣワクチンの免疫原性をＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した（図１６）。十分に確立されたアデノウイルスベースのワクチン（Ａｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１）を陽性対照として用いた。免疫化に続いて、ＧＣＣに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔにより定量した。予想通り、対照Ｌｍ－ＬＬＯはＧＣＣ特異的応答を誘導しなかった。しかし、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ及びＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ－Ｓ１も応答を誘導できなかった。応答は、陽性対照Ａｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１ワクチンによって誘導され、それぞれＬｍ及びＡｄ５ベクター中の抗原ＬＬＯ及びＤＢＰに対する応答が生成された。まとめると、これらのデータから、Ｌｍ－ＬＬＯＧＣＣワクチンはＧＣＣ特異的応答の誘導因子として不十分であることが示唆された。
第２世代組換えＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチン
ＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質の低発現の状況で（図１５）、本発明者らは、ＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質のサイズが大きいことが、その発現及び免疫誘導を妨げている可能性があるという仮説を立てた。実際、ＬＬＯに融合した大きな腫瘍抗原を用いた同様の研究は、融合タンパク質を生成するのに同様の困難さを示す。したがって、３つの異なる第２世代ワクチンを作製し、それぞれに約１／３のＧＣＣを含めた（図１７）。これらの設計には、異なるＧＣＣ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが含まれており、２つの異なる断片で各エピトープに対する応答を試験することができる。
ＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質の低発現の状況で（図１５）、本発明者らは、ＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質のサイズが大きいことが、その発現及び免疫誘導を妨げている可能性があるという仮説を立てた。実際、ＬＬＯに融合した大きな腫瘍抗原を用いた同様の研究は、融合タンパク質を生成するのに同様の困難さを示す。したがって、３つの異なる第２世代ワクチンを作製し、それぞれに約１／３のＧＣＣを含めた（図１７）。これらの設計には、異なるＧＣＣ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが含まれており、２つの異なる断片で各エピトープに対する応答を試験することができる。
ＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質の発現を、ウェスタンブロットにより第２世代Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチンで確認した。各第２世代ワクチンは異なるＧＣＣ断片を含むため、複数のＧＣＣ特異的モノクローナル抗体を用いて、Ｌｍ上清中のＧＣＣ－ＬＬＯ融合タンパク質を検出した（図１８）。これらのデータは、各組換えＬｍワクチンによるＬＬＯ－ＧＣＣ融合タンパク質発現を確認する。予想通り、より短い融合タンパク質は、第１世代ワクチンで生成された全長ＬＬＯＧＣＣ生成物よりも高いレベルで発現した。
ＧＣＣ断片を含む第２世代Ｌｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチンを、ＧＣＣ－／－（図１９パネルＡ）又はＧＣＣ＋／＋（図１９パネルＢ）マウスに投与した。ＧＣＣ－／－マウスはＣＤ４＋Ｔ細胞応答のみを生成し、ＧＣＣ＋／＋はＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のみを生成するため、マウスにこれらのエピトープを含むワクチン断片のみを投与した。ＧＣＣ－／－マウスは、断片１及び２を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープで免疫した場合に、ＧＣＣに対して堅牢なＣＤ４＋Ｔ細胞応答をもたらした（図１９パネルＡ）。しかし、ＧＣＣ＋／＋マウスは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ含有断片２及び３で免疫した場合に、ＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生成できなかった（図１９パネルＢ）。ＧＣＣ＋／＋マウスにおけるＧＣＣに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の欠如を確認するために、本発明者らは抗腫瘍免疫実験を行った（図２０パネルＡ～Ｃ）。ＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔのデータ（図１９、パネルＡ及びＢ）と一致して、ＧＣＣ＋／＋マウスにおけるＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣ断片免疫化は、１００％有効であったＡｄ５－ＧＣＣ－Ｓ１と比較して抗腫瘍効果を示さなかった（図２０パネルＡ、Ｂ及びＣ）。
第２世代組換えＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチン
全長ＧＣＣ又はＧＣＣの断片を含むワクチンを接種したマウスにおける不良のＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチン免疫原性の状況において（図１４～２０）、本発明者らは、ＧＣＣがＬＬＯ融合タンパク質の状況で適切に処理及び提示されない可能性があるという仮説を立てた。したがって、Ｌｍ感染細胞のサイトゾルで高発現している別のＬｍタンパク質であるＡｃｔＡに融合させたＧＣＣ含有組換えＬｍワクチンを生成した（図２１パネルＡ）。これらのワクチンは、Ｌｍ感染マクロファージにおいてＧＣＣ融合タンパク質生成を誘導し、Ｓｙｎ１８エンハンサー配列の包含によって発現が著しく増強された（図２１パネルＢ）。しかし、ＬｍＡｃｔＡ－ＧＣＣワクチンは、ＧＣＣ＋／＋マウスにおいてＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導できなかった（図２１パネルＣ～Ｄ）。
全長ＧＣＣ又はＧＣＣの断片を含むワクチンを接種したマウスにおける不良のＬｍ－ＬＬＯ－ＧＣＣワクチン免疫原性の状況において（図１４～２０）、本発明者らは、ＧＣＣがＬＬＯ融合タンパク質の状況で適切に処理及び提示されない可能性があるという仮説を立てた。したがって、Ｌｍ感染細胞のサイトゾルで高発現している別のＬｍタンパク質であるＡｃｔＡに融合させたＧＣＣ含有組換えＬｍワクチンを生成した（図２１パネルＡ）。これらのワクチンは、Ｌｍ感染マクロファージにおいてＧＣＣ融合タンパク質生成を誘導し、Ｓｙｎ１８エンハンサー配列の包含によって発現が著しく増強された（図２１パネルＢ）。しかし、ＬｍＡｃｔＡ－ＧＣＣワクチンは、ＧＣＣ＋／＋マウスにおいてＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導できなかった（図２１パネルＣ～Ｄ）。
次に、ＧＣＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの５つのタンデムリピートを含むがＧＣＣの他のドメインを欠く新規コンストラクトを作製することによって、ＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強することを試みた（図２２）。これらのエピトープをＡｃｔＡ及びＳｙｎ１８に融合させて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導することができる高度に免疫原性のコンストラクトであると予想されるものを生成した。しかし、このワクチンによる野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫では、何の応答も生じなかった（図２２）。
最後に、本発明者らのコンストラクト設計に根本的な欠陥がある可能性があり、それはいかなる抗原に対してもＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をもたらすることができないという仮説を立てた。この仮説を検証するために、本発明者らは、大腸菌のβガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、マウスＨｅｒ２、及びＡｄ５ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）からのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同様に、ＧＣＣの優勢なＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに融合されたＡｃｔＡ－Ｓｙｎ１８含有新規コンストラクトを生成した（図２３）。そのワクチンはＬａｃＺとＡｄ５に対して堅牢な応答をもたらしたが、ＧＣＣとＨｅｒ２に対しては意味のある応答を生成できなかった（図２３）。現在、本発明者らは、ＧＣＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの抗原処理及び提示を増強するように設計された新規Ｌｍコンストラクトを作製している。
本発明者らは、ＧＣＣエピトープ提示の増加及びＧＣＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の生成をもたらすと期待するいくつかの新規Ｌｍコンストラクトを設計し、現在生成している。残りのプロジェクト期間にわたって、これらのワクチンの生成を完了し、その免疫原性を試験する。まとめると、これらの研究と完了した作業は、結腸直腸癌免疫療法のためのＧＣＣを標的とするリステリアベースのワクチンの潜在的な有用性を確立するであろう。
実施例８
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、米国で癌死の第２の主要原因であり、４番目に一般的に診断される癌である。さらに、転移性ＣＲＣ患者の５年生存率は現在１４％であり、何十年もの間比較的停滞したままであり、転移性ＣＲＣを予防及び治療するための効果的な治療法の欠如が強調される。この状況において、腸管受容体及び腫瘍関連抗原グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）は、開発中の免疫療法選択肢として浮上している。ＣＲＣ患者を対象とした最近の第Ｉ相試験で、ＧＵＣＹ２Ｃに対するアデノウイルスベースのワクチン（Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃ）の免疫原性と安全性が実証された。しかし、ワクチン抗原に対する最適な免疫は、異種ワクチンベクターとの組み合わせ手法を用いて日常的に達成され、これはベクター特異的免疫に関連する制限を回避するのに役立ち、したがって、同じベクターを用いた相同ワクチン接種よりも優れている場合が多い。本明細書で、ＧＵＣＹ２Ｃを分泌するリステリア・モノサイトゲネスの組換え株（Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ）を構築し、Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃと組み合わせてその免疫原性を調べ、最適なＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種投与計画を定義した。本発明者らは、Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いて、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「初回刺激」し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いて、記憶ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「増強」する異種初回刺激－追加免疫投与計画を利用して、最適なＧＵＣＹ２Ｃ及び抗腫瘍免疫が達成されることを実証する。本発明者らは、この組み合わせが、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数の量並びにＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力及び多機能性の有意な増強につながることを報告する。さらに、本発明者らは、この免疫が安全であることを実証し、ワクチン接種マウスの病理組織学的評価が毒性の徴候を示さないことを実証する。まとめると、これらの知見から、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが既存のＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を有する患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ免疫を増強するために利用され、将来のＧＵＣＹ２Ｃ標的ワクチン臨床試験に情報を提供し得ることが示唆される。
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、米国で癌死の第２の主要原因であり、４番目に一般的に診断される癌である。さらに、転移性ＣＲＣ患者の５年生存率は現在１４％であり、何十年もの間比較的停滞したままであり、転移性ＣＲＣを予防及び治療するための効果的な治療法の欠如が強調される。この状況において、腸管受容体及び腫瘍関連抗原グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）は、開発中の免疫療法選択肢として浮上している。ＣＲＣ患者を対象とした最近の第Ｉ相試験で、ＧＵＣＹ２Ｃに対するアデノウイルスベースのワクチン（Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃ）の免疫原性と安全性が実証された。しかし、ワクチン抗原に対する最適な免疫は、異種ワクチンベクターとの組み合わせ手法を用いて日常的に達成され、これはベクター特異的免疫に関連する制限を回避するのに役立ち、したがって、同じベクターを用いた相同ワクチン接種よりも優れている場合が多い。本明細書で、ＧＵＣＹ２Ｃを分泌するリステリア・モノサイトゲネスの組換え株（Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ）を構築し、Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃと組み合わせてその免疫原性を調べ、最適なＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種投与計画を定義した。本発明者らは、Ａｄ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いて、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「初回刺激」し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いて、記憶ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「増強」する異種初回刺激－追加免疫投与計画を利用して、最適なＧＵＣＹ２Ｃ及び抗腫瘍免疫が達成されることを実証する。本発明者らは、この組み合わせが、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数の量並びにＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力及び多機能性の有意な増強につながることを報告する。さらに、本発明者らは、この免疫が安全であることを実証し、ワクチン接種マウスの病理組織学的評価が毒性の徴候を示さないことを実証する。まとめると、これらの知見から、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが既存のＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を有する患者におけるＧＵＣＹ２Ｃ免疫を増強するために利用され、将来のＧＵＣＹ２Ｃ標的ワクチン臨床試験に情報を提供し得ることが示唆される。
材料と方法
ワクチン
サイト１（Ｓ１）として知られるインフルエンザＨＡ１０７－１１９ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに融合されたマウスＧＵＣＹ２Ｃ１－４２９を発現するキメラ複製欠損アデノウイルスについては先に記載した（Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）。本研究で用いたＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所によって生成され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞ＤＮＡ混入に対して陰性であることが認定された。
ワクチン
サイト１（Ｓ１）として知られるインフルエンザＨＡ１０７－１１９ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに融合されたマウスＧＵＣＹ２Ｃ１－４２９を発現するキメラ複製欠損アデノウイルスについては先に記載した（Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）。本研究で用いたＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰワクチンは、ベイラー医科大学細胞遺伝子治療ベクター開発研究所によって生成され、複製能のあるアデノウイルス、マイコプラズマ、及び宿主細胞ＤＮＡ混入に対して陰性であることが認定された。
病原因子インターナリンＢ及びａｃｔＡの欠損を含む弱毒化Ｌｍ株であるＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢは、ＡＴＣＣから注文し、この研究で利用された全てのＬｍワクチンの親株として機能する。組換えＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ及びＬｍ－ＬａｃＺは、ａｃｔＡプロモーターの制御下にあるＡｃｔＡタンパク質の最初の１００個のアミノ酸をインフレームでそれぞれ有するマウスＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン２３－４２９又はβ－ガラクトシダーゼ６１８-１０２４を合成することによって作製した。得られた配列をｐＰＬ２組み込みベクターにクローニングし、Ｌｍ染色体に組み込んだ。Ｌｍ株をＯＤ６００が約１になるまでブレインハートインフュージョンブロス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させ、小分けし、－８０℃で保存した。実験当日、アリコートを解凍し、３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ワクチン接種のためにＰＢＳで所望の濃度に希釈した。
インビトロ感染
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｊ７７４Ａ．１細胞をＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍで１０：１の感染多重度で感染させた。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、遊離細胞外細菌を排除するために１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン含有培地に再懸濁し、さらに５時間インキュベートした。免疫蛍光試験のために、感染前に２ｍＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＰＴＰＸ色素と３７℃で１０分間インキュベートすることにより、Ｌｍを標識した。ウェスタンブロット研究のために、プロテアーゼ阻害剤を補充したＭ－ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて細胞からタンパク質を抽出した。ＧＵＣＹ２Ｃタンパク質を、抗ＧＵＣＹ２Ｃモノクローナル抗体ＭＳ２０を用いて染色し、抗ｐ６０モノクローナル抗体ｐ６０１７（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）を用いてｐ６０を染色した。
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｊ７７４Ａ．１細胞をＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍで１０：１の感染多重度で感染させた。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、遊離細胞外細菌を排除するために１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン含有培地に再懸濁し、さらに５時間インキュベートした。免疫蛍光試験のために、感染前に２ｍＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＰＴＰＸ色素と３７℃で１０分間インキュベートすることにより、Ｌｍを標識した。ウェスタンブロット研究のために、プロテアーゼ阻害剤を補充したＭ－ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて細胞からタンパク質を抽出した。ＧＵＣＹ２Ｃタンパク質を、抗ＧＵＣＹ２Ｃモノクローナル抗体ＭＳ２０を用いて染色し、抗ｐ６０モノクローナル抗体ｐ６０１７（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）を用いてｐ６０を染色した。
マウスと免疫化
８週齢の雄及び雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスを実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコル０１９５６）によって承認された。アデノウイルス免疫のために、各後肢に１回ずつ、５０μＬの２回の注射として、マウスに１０１０ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１又は対照としてのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰを筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。Ｌｍ免疫のために、５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ、空のＬｍ、又はＬｍ－ＬａｃＺを、ＰＢＳ中１００μＬ懸濁液として静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＥＬＩＳｐｏｔ実験では、空のＬｍを対照として使用し、腫瘍実験では、アジュバントとして機能し、抗腫瘍応答を高めるＡｃｔＡタンパク質の能力によりＬｍ－ＬａｃＺを対照のために用いた。初回刺激－追加免疫のために、ワクチンを２１日あけて送達した。
８週齢の雄及び雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスを実験のためにジャクソン研究所から購入した。動物プロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコル０１９５６）によって承認された。アデノウイルス免疫のために、各後肢に１回ずつ、５０μＬの２回の注射として、マウスに１０１０ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１又は対照としてのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＦＰを筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。Ｌｍ免疫のために、５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ、空のＬｍ、又はＬｍ－ＬａｃＺを、ＰＢＳ中１００μＬ懸濁液として静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＥＬＩＳｐｏｔ実験では、空のＬｍを対照として使用し、腫瘍実験では、アジュバントとして機能し、抗腫瘍応答を高めるＡｃｔＡタンパク質の能力によりＬｍ－ＬａｃＺを対照のために用いた。初回刺激－追加免疫のために、ワクチンを２１日あけて送達した。
Ａｄ５中和免疫研究
１０１０Ａｄ５－ＧＦＰへの鼻腔内曝露によりＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡｄ５免疫を誘導した。感染後２８日目に、マウスから採血し、血清を採取し、１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１に続いて、２１日後に、５×１０６ ＣＦＵのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍで免疫した。マウスにおけるＡｄ５中和抗体価を、先に記載したように定量した。
１０１０Ａｄ５－ＧＦＰへの鼻腔内曝露によりＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡｄ５免疫を誘導した。感染後２８日目に、マウスから採血し、血清を採取し、１０１１ｖｐのＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１に続いて、２１日後に、５×１０６ ＣＦＵのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍで免疫した。マウスにおけるＡｄ５中和抗体価を、先に記載したように定量した。
ＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、マウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）単色ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて実施した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートにＩＦＮ－γ捕捉抗体を４℃でコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドを含む又は含まないＣＴＬ－ＴＥＳＴ培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）中の０．１％ＤＭＳＯ溶液に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＴＣＲ結合力研究のために、脾細胞を様々な濃度のＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチド（１０μｇ／ｍＬから３ｐｇ／ｍＬ）で播種した。翌日、細胞を除去し、ＩＦＮ－γ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ユニバーサルアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ及びＡｕｔｏｇａｔｅ関数を用いて計算した。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を、ペプチドパルスウェルから０．１％ＤＭＳＯウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、マウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）単色ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて実施した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートにＩＦＮ－γ捕捉抗体を４℃でコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄し、免疫マウスの脾細胞を、１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドを含む又は含まないＣＴＬ－ＴＥＳＴ培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）中の０．１％ＤＭＳＯ溶液に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＴＣＲ結合力研究のために、脾細胞を様々な濃度のＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチド（１０μｇ／ｍＬから３ｐｇ／ｍＬ）で播種した。翌日、細胞を除去し、ＩＦＮ－γ生成スポット形成細胞を検出するために発色試薬を添加した。ウェルあたりのスポット形成細胞数を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ユニバーサルアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ及びＡｕｔｏｇａｔｅ関数を用いて計算した。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的応答を、ペプチドパルスウェルから０．１％ＤＭＳＯウェルの平均スポット数を差し引くことによって計算した。
細胞内サイトカイン染色
免疫マウスの１０６脾細胞をＤＭＳＯ又は１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチド及び抗ＣＤ１０７－ＦＩＴＣ（クローン１Ｄ４Ｂ）の存在下で９６ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、脾細胞を３７℃でさらに５時間インキュベートした。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＣＤ８ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５３－６．７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１９－ＢＶ５１０（６Ｄ５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色した。ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて透過処理し、細胞内サイトカインを、抗ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＭＩＰ１α－ＡＰＣ（３９６２４；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析を行った。
免疫マウスの１０６脾細胞をＤＭＳＯ又は１０μｇ／ｍＬのＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチド及び抗ＣＤ１０７－ＦＩＴＣ（クローン１Ｄ４Ｂ）の存在下で９６ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、脾細胞を３７℃でさらに５時間インキュベートした。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＣＤ８ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５３－６．７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１９－ＢＶ５１０（６Ｄ５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色した。ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて透過処理し、細胞内サイトカインを、抗ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＭＩＰ１α－ＡＰＣ（３９６２４；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析を行った。
腫瘍研究
ＧＵＣＹ２Ｃ及びルシフェラーゼ発現マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）ＣＴ２６結腸直腸癌細胞株を前述のように作製し、インビボ腫瘍研究に使用した。最終免疫の６日後、マウスの尾静脈に５×１０５ＣＴ２６細胞を静脈内投与した。ＰＢＳ中の３．７５ｍｇのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の皮下注射、続いて８分間のインキュベーション及びＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲイメージングステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１０秒間の曝露後に画像化することによって腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度（光子／秒）を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージングソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
ＧＵＣＹ２Ｃ及びルシフェラーゼ発現マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）ＣＴ２６結腸直腸癌細胞株を前述のように作製し、インビボ腫瘍研究に使用した。最終免疫の６日後、マウスの尾静脈に５×１０５ＣＴ２６細胞を静脈内投与した。ＰＢＳ中の３．７５ｍｇのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の皮下注射、続いて８分間のインキュベーション及びＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲイメージングステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１０秒間の曝露後に画像化することによって腫瘍負荷を毎週定量した。全放射輝度（光子／秒）を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージングソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
結果
Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン設計
マウスＧＵＣＹ２Ｃ２３-４２９の細胞外ドメインを、Ｊａｖａ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌを用いてリステリア・モノサイトゲネス用にコドン最適化し、ａｃｔＡプロモーターのＡｃｔＡＮ１００、及び図２４パネルＡに示すエンハンサー配列の下流で合成した。得られた配列をｐＰＬ２組み込みベクターにクローニングし、生弱毒化二重欠損株Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのゲノムに安定に組み込んだ。ＡｃｔＡ－ＧＵＣＹ２Ｃ融合タンパク質の分泌を確認するため、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞株をＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍ株で感染させた。６時間のインキュベーション後に、マクロファージをウェスタンブロット（図２４パネルＢ）及び免疫蛍光（図２４パネルＣ）によってＧＵＣＹ２Ｃタンパク質発現について染色した。
Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン設計
マウスＧＵＣＹ２Ｃ２３-４２９の細胞外ドメインを、Ｊａｖａ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌを用いてリステリア・モノサイトゲネス用にコドン最適化し、ａｃｔＡプロモーターのＡｃｔＡＮ１００、及び図２４パネルＡに示すエンハンサー配列の下流で合成した。得られた配列をｐＰＬ２組み込みベクターにクローニングし、生弱毒化二重欠損株Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのゲノムに安定に組み込んだ。ＡｃｔＡ－ＧＵＣＹ２Ｃ融合タンパク質の分泌を確認するため、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞株をＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ又は対照Ｌｍ株で感染させた。６時間のインキュベーション後に、マクロファージをウェスタンブロット（図２４パネルＢ）及び免疫蛍光（図２４パネルＣ）によってＧＵＣＹ２Ｃタンパク質発現について染色した。
異種Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫投与計画は、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及び抗腫瘍免疫を増強する
Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣによるＧＵＣＹ２Ｃ融合タンパク質発現のインビトロ確認後に、次に、最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫投与計画の特定を模索した。そのため、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを、現在第ＩＩ相試験（ＮＣＴ０４１１１１７２）においてＧＵＣＹ２Ｃに対するキメラアデノウイルスベースのワクチン（Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）と組み合わせて試験した。Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチンを相同又は異種ワクチン接種として２１日あけて投与する初回刺激－追加免疫計画を用いてＧＵＣＹ２Ｃ免疫原性及び抗腫瘍免疫を評価した。特に、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「刺激」するためにＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を用い、続いて「追加免疫」するためにＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いる異種免疫投与計画により、他の全ての免疫投与計画と比較してＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔによって定量される著しく高いＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が生じた（図２５パネルＡ）。同様に、結腸直腸腫瘍負荷の状況において、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫は、他のワクチン接種方法と比較して、転移性腫瘍負荷を著しく低下させ（図２５パネルＢ及びＣ）、生存期間中央値を増加させた（図２５パネルＤ）。重要なことに、免疫の順序は最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫に不可欠であり、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ＋Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチン接種と比較して、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の１５倍超の増加（ｐ＜０．０００１）を誘導し、生存期間中央値を著しく改善した（７１ｄ対３８ｄ、ｐ＜０．０５）。さらに、本発明者らは、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣがＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１初回刺激の１００日後にＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を増強することを見出し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが最初の初回刺激ワクチン接種のずっと後にＧＵＣＹ２Ｃ記憶応答を増強する可能性があることが示唆された。
Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣによるＧＵＣＹ２Ｃ融合タンパク質発現のインビトロ確認後に、次に、最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫投与計画の特定を模索した。そのため、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチンを、現在第ＩＩ相試験（ＮＣＴ０４１１１１７２）においてＧＵＣＹ２Ｃに対するキメラアデノウイルスベースのワクチン（Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１）と組み合わせて試験した。Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチンを相同又は異種ワクチン接種として２１日あけて投与する初回刺激－追加免疫計画を用いてＧＵＣＹ２Ｃ免疫原性及び抗腫瘍免疫を評価した。特に、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を「刺激」するためにＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１を用い、続いて「追加免疫」するためにＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃを用いる異種免疫投与計画により、他の全ての免疫投与計画と比較してＩＦＮγ－ＥＬＩＳｐｏｔによって定量される著しく高いＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が生じた（図２５パネルＡ）。同様に、結腸直腸腫瘍負荷の状況において、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫は、他のワクチン接種方法と比較して、転移性腫瘍負荷を著しく低下させ（図２５パネルＢ及びＣ）、生存期間中央値を増加させた（図２５パネルＤ）。重要なことに、免疫の順序は最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫に不可欠であり、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ＋Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチン接種と比較して、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の１５倍超の増加（ｐ＜０．０００１）を誘導し、生存期間中央値を著しく改善した（７１ｄ対３８ｄ、ｐ＜０．０５）。さらに、本発明者らは、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２ＣがＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１初回刺激の１００日後にＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を増強することを見出し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが最初の初回刺激ワクチン接種のずっと後にＧＵＣＹ２Ｃ記憶応答を増強する可能性があることが示唆された。
ベクター特異的免疫がＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫に及ぼす影響
ウイルスベースのワクチンの既知の限界は、ベクター特異的免疫が標的ワクチン抗原の免疫原性に干渉する能力である。具体的には、一般的なアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に対する中和抗体（ＮＡｂ）は、健常ドナーの７０％超で検出可能であり、アデノウイルスベースのワクチンの有効性を鈍らせることが実証されている。Ａｄ５．Ｆ３５などのキメラアデノウイルスは、Ａｄ５ ＮＡｂに関連する中和の影響を受けにくいが、その効果は控えめであるため、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１のＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答は、事前Ａｄ５曝露の存在下で部分的に低下する。対照的に、ヒトにおけるＬｍ感染は、Ｌｍに対するＮＡｂをもたらさず、事前曝露は、標的ワクチン抗原の免疫原性を制限しない。これらの観察と一致して、本発明者らは、事前Ｌｍ曝露がＬｍ－ＧＵＣＹ２ＣのＧＵＣＹ２Ｃ免疫原性を制限しないことを見出した。そのため、本発明者らは、事前Ａｄ５曝露がＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種手法を制限する可能性があるという影響に焦点を当てた。まず、抗体中和に関連する可能性のあるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチンの低い初回刺激用量で追加免疫するＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの能力を定義することを望んだ。そのため、本発明者らは、減少用量のＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１でマウスを免疫し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが同様に１０１１ｖｐから１０９ｖｐの範囲の用量でＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を増強することを見出した（図２６パネルＡ）。次に、インビボで既存のＡｄ５免疫を模倣することを望んだ。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種投与計画の開始の２８日前に、Ａｄ５特異的免疫を誘導するために、マウスを１０１０ＶＰのＡｄ５－ＧＦＰ又はＰＢＳに鼻腔内曝露した。予想通り、Ａｄ５－ＧＦＰ曝露は、ワクチン接種時にマウスにおいてＮＡｂを誘導した（図２６パネルＢ）。しかし、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、未処置マウス及びＡｄ５－ＧＦＰに事前曝露したマウスにおいて、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強した（図２６パネルＣ）。同様に、未処置及びＡｄ５－ＧＦＰ曝露マウスのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種は、転移性腫瘍負荷の低下（図２６パネルＤ）及び生存期間の延長（図２６パネルＥ）によって定量されるように同様に抗腫瘍免疫を増強した。そのため、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、不十分なＧＵＣＹ２Ｃ初回刺激ワクチン接種に関連する状況において、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を増強するのに有効であり得る。
ウイルスベースのワクチンの既知の限界は、ベクター特異的免疫が標的ワクチン抗原の免疫原性に干渉する能力である。具体的には、一般的なアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に対する中和抗体（ＮＡｂ）は、健常ドナーの７０％超で検出可能であり、アデノウイルスベースのワクチンの有効性を鈍らせることが実証されている。Ａｄ５．Ｆ３５などのキメラアデノウイルスは、Ａｄ５ ＮＡｂに関連する中和の影響を受けにくいが、その効果は控えめであるため、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１のＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫応答は、事前Ａｄ５曝露の存在下で部分的に低下する。対照的に、ヒトにおけるＬｍ感染は、Ｌｍに対するＮＡｂをもたらさず、事前曝露は、標的ワクチン抗原の免疫原性を制限しない。これらの観察と一致して、本発明者らは、事前Ｌｍ曝露がＬｍ－ＧＵＣＹ２ＣのＧＵＣＹ２Ｃ免疫原性を制限しないことを見出した。そのため、本発明者らは、事前Ａｄ５曝露がＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種手法を制限する可能性があるという影響に焦点を当てた。まず、抗体中和に関連する可能性のあるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１ワクチンの低い初回刺激用量で追加免疫するＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの能力を定義することを望んだ。そのため、本発明者らは、減少用量のＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１でマウスを免疫し、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが同様に１０１１ｖｐから１０９ｖｐの範囲の用量でＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を増強することを見出した（図２６パネルＡ）。次に、インビボで既存のＡｄ５免疫を模倣することを望んだ。Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種投与計画の開始の２８日前に、Ａｄ５特異的免疫を誘導するために、マウスを１０１０ＶＰのＡｄ５－ＧＦＰ又はＰＢＳに鼻腔内曝露した。予想通り、Ａｄ５－ＧＦＰ曝露は、ワクチン接種時にマウスにおいてＮＡｂを誘導した（図２６パネルＢ）。しかし、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、未処置マウス及びＡｄ５－ＧＦＰに事前曝露したマウスにおいて、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強した（図２６パネルＣ）。同様に、未処置及びＡｄ５－ＧＦＰ曝露マウスのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種は、転移性腫瘍負荷の低下（図２６パネルＤ）及び生存期間の延長（図２６パネルＥ）によって定量されるように同様に抗腫瘍免疫を増強した。そのため、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、不十分なＧＵＣＹ２Ｃ初回刺激ワクチン接種に関連する状況において、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的免疫を増強するのに有効であり得る。
初回刺激－追加免疫ワクチン接種後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの質的変化
ワクチン特異的Ｔ細胞の量を増やすことに加えて、以前の研究は、初回刺激－追加免疫がワクチン特異的Ｔ細胞の品質に影響を与えることを実証している。そのため、本発明者らは、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１初回刺激及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ初回刺激－追加免疫ワクチン接種後のピークエフェクター応答におけるＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の結合力及び多機能性を比較することによって、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールに対する影響を決定することを望んだ。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力を評価するために、本発明者らは、減少濃度のＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドで免疫したマウスの脾細胞をパルスし、ＩＦＮ－γ応答を定量した。初回刺激免疫のみで免疫したマウスと比較して、初回刺激－追加免疫で免疫したマウスのＥＣ５０は約２．５倍シフトし（０．００４６μｇ／ｍＬ対００１８μｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０００１）、初回刺激－追加免疫後のマウスにおける高結合力ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞の富化が示唆された（図２７パネルＡ）。次に、フローサイトメトリーを用いて、初回刺激及び初回刺激－追加免疫ワクチン接種後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の多機能性を評価した。ＥＬＩＳｐｏｔ実験と一致して、初回刺激－追加免疫は、初回刺激免疫単独（図２７パネルＢ）と比較してＩＦＮ－γ応答、並びにエフェクターサイトカインＭＩＰ１α及び脱顆粒ＣＤ１０７ａの表面マーカーを著しく増強した。さらに、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ１α、及びＣＤ１０７ａ染色による二重陽性（図２７パネルＣ及びＥ）及び三重陽性（図２７パネルＤ及びＥ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は、初回刺激－追加免疫ワクチン接種後に著しく上昇し、初回刺激－追加免疫が複数のエフェクター機能を有するＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成することが示唆された。そのため、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数を著しく増幅することに加えて、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫後の抗腫瘍免疫の増強は、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力及び多機能性の質的変化を介して付与され得る可能性が高い。
ワクチン特異的Ｔ細胞の量を増やすことに加えて、以前の研究は、初回刺激－追加免疫がワクチン特異的Ｔ細胞の品質に影響を与えることを実証している。そのため、本発明者らは、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１初回刺激及びＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ初回刺激－追加免疫ワクチン接種後のピークエフェクター応答におけるＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の結合力及び多機能性を比較することによって、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールに対する影響を決定することを望んだ。ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力を評価するために、本発明者らは、減少濃度のＧＵＣＹ２Ｃ２５４-２６２ペプチドで免疫したマウスの脾細胞をパルスし、ＩＦＮ－γ応答を定量した。初回刺激免疫のみで免疫したマウスと比較して、初回刺激－追加免疫で免疫したマウスのＥＣ５０は約２．５倍シフトし（０．００４６μｇ／ｍＬ対００１８μｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０００１）、初回刺激－追加免疫後のマウスにおける高結合力ＧＵＣＹ２Ｃ特異的Ｔ細胞の富化が示唆された（図２７パネルＡ）。次に、フローサイトメトリーを用いて、初回刺激及び初回刺激－追加免疫ワクチン接種後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の多機能性を評価した。ＥＬＩＳｐｏｔ実験と一致して、初回刺激－追加免疫は、初回刺激免疫単独（図２７パネルＢ）と比較してＩＦＮ－γ応答、並びにエフェクターサイトカインＭＩＰ１α及び脱顆粒ＣＤ１０７ａの表面マーカーを著しく増強した。さらに、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ１α、及びＣＤ１０７ａ染色による二重陽性（図２７パネルＣ及びＥ）及び三重陽性（図２７パネルＤ及びＥ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は、初回刺激－追加免疫ワクチン接種後に著しく上昇し、初回刺激－追加免疫が複数のエフェクター機能を有するＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成することが示唆された。そのため、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数を著しく増幅することに加えて、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫後の抗腫瘍免疫の増強は、ＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの結合力及び多機能性の質的変化を介して付与され得る可能性が高い。
異種初回刺激－追加免疫は毒性を誘発しない
以前に、ＧＵＣＹ２Ｃワクチンが内因性ＧＵＣＹ２Ｃ発現組織に対する自己免疫を呼び起こすことなく全身性抗腫瘍免疫を誘導する能力を実証した。Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの量、結合力、及び多機能性の変化を考慮すると、この免疫投与計画の安全性を特徴付けることを望んだ。そのため、本発明者らは、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫による潜在的な毒性を解明するために、２つのワクチン接種及び評価スケジュールを使用した。図２８パネルＡに示されるように、０日目にマウスに１０１０ｖｐＡのｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で免疫し、その後、２１日目と４２日目に５×１０６ＣＦＵのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの２回の追加免疫を行った。最終免疫の７日後及び３０日後に、マウスを屠殺し、臓器を摘出し、急性及び／又は慢性毒性の評価をそれぞれ行った。追加のコホートに、全ての免疫の日にＰＢＳを投与した。急性又は慢性のコホートにおける毒性の徴候は、生活中の観察又は生存中に観察されなかった（図２８パネルＢ）。注目すべきことに、急性及び慢性コホートにおける雌ではなく雄マウスが、対照コホートと比較して研究全体を通して体重が減少していた（図２８パネルＣ及びＤ）。同様に、脳及び小腸臓器の重量の統計的に有意な減少は、おそらく一般的な体の大きさの違いのために、急性及び／又は慢性コホートの雄マウスにおいてのみ認められた。興味深いことに、急性及び慢性コホートの雌マウスは、胃重量の減少を示した。さらに、最近Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃで免疫した急性コホートのマウスは脾腫を示し、先行研究と一致し、おそらく脾臓に対するＬｍ指向性に起因する。全体として、脾腫を除いて、性別をこえて、グループにおいて臓器重量の差は維持されなかった。臓器サイズのわずかな違いにもかかわらず、盲検病理学者による組織病理学的スコアリングは、既知のＧＵＣＹ２Ｃ発現組織（小腸、結腸、脳）とＧＵＣＹ２Ｃ欠損組織（唾液腺、胃、心臓、肺、腎臓、及び肝臓）との間で炎症における差異を明らかにしなかった。脾臓の炎症の増加は急性コホートで認められ、脾腫の所見と一致した。まとめると、これらのデータは、先行研究と一致して、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫が、内因性ＧＵＣＹ２Ｃ発現組織に対する自己免疫を生じさせることなくＧＵＣＹ２Ｃ免疫を増強することを示唆している。
以前に、ＧＵＣＹ２Ｃワクチンが内因性ＧＵＣＹ２Ｃ発現組織に対する自己免疫を呼び起こすことなく全身性抗腫瘍免疫を誘導する能力を実証した。Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールの量、結合力、及び多機能性の変化を考慮すると、この免疫投与計画の安全性を特徴付けることを望んだ。そのため、本発明者らは、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫による潜在的な毒性を解明するために、２つのワクチン接種及び評価スケジュールを使用した。図２８パネルＡに示されるように、０日目にマウスに１０１０ｖｐＡのｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１で免疫し、その後、２１日目と４２日目に５×１０６ＣＦＵのＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃの２回の追加免疫を行った。最終免疫の７日後及び３０日後に、マウスを屠殺し、臓器を摘出し、急性及び／又は慢性毒性の評価をそれぞれ行った。追加のコホートに、全ての免疫の日にＰＢＳを投与した。急性又は慢性のコホートにおける毒性の徴候は、生活中の観察又は生存中に観察されなかった（図２８パネルＢ）。注目すべきことに、急性及び慢性コホートにおける雌ではなく雄マウスが、対照コホートと比較して研究全体を通して体重が減少していた（図２８パネルＣ及びＤ）。同様に、脳及び小腸臓器の重量の統計的に有意な減少は、おそらく一般的な体の大きさの違いのために、急性及び／又は慢性コホートの雄マウスにおいてのみ認められた。興味深いことに、急性及び慢性コホートの雌マウスは、胃重量の減少を示した。さらに、最近Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃで免疫した急性コホートのマウスは脾腫を示し、先行研究と一致し、おそらく脾臓に対するＬｍ指向性に起因する。全体として、脾腫を除いて、性別をこえて、グループにおいて臓器重量の差は維持されなかった。臓器サイズのわずかな違いにもかかわらず、盲検病理学者による組織病理学的スコアリングは、既知のＧＵＣＹ２Ｃ発現組織（小腸、結腸、脳）とＧＵＣＹ２Ｃ欠損組織（唾液腺、胃、心臓、肺、腎臓、及び肝臓）との間で炎症における差異を明らかにしなかった。脾臓の炎症の増加は急性コホートで認められ、脾腫の所見と一致した。まとめると、これらのデータは、先行研究と一致して、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ免疫が、内因性ＧＵＣＹ２Ｃ発現組織に対する自己免疫を生じさせることなくＧＵＣＹ２Ｃ免疫を増強することを示唆している。
考察
特にマイクロサテライト安定なミスマッチ修復能のある腫瘍患者にとって、ＣＲＣ管理における主な限界は、依然として、外科的切除後の疾患再発の可能性と、転移性疾患を治療するための現在の治療法の無効性である。これらの状況では、ワクチン接種は、従来の治療を免れたＣＲＣ細胞を排除し、長期的な免疫を与え、それによって将来の再発から保護することによって理想的な治療法であり得る。本明細書で、免疫原性であり、自己免疫を引き起こすことなく強力な抗腫瘍免疫を誘導するワクチンベクターの異種の組み合わせを利用する最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫投与計画を定義する。
特にマイクロサテライト安定なミスマッチ修復能のある腫瘍患者にとって、ＣＲＣ管理における主な限界は、依然として、外科的切除後の疾患再発の可能性と、転移性疾患を治療するための現在の治療法の無効性である。これらの状況では、ワクチン接種は、従来の治療を免れたＣＲＣ細胞を排除し、長期的な免疫を与え、それによって将来の再発から保護することによって理想的な治療法であり得る。本明細書で、免疫原性であり、自己免疫を引き起こすことなく強力な抗腫瘍免疫を誘導するワクチンベクターの異種の組み合わせを利用する最適なＧＵＣＹ２Ｃ免疫投与計画を定義する。
先行研究と一致して、初回刺激－追加免疫ワクチン接種は、ワクチン特異的Ｔ細胞の量を上昇させるだけでなく、ワクチン特異的Ｔ細胞プールの品質にも大きく影響することを見出している。本発明者らは、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫後のＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞プールが、より高い結合力を有し、増加したエフェクター機能を示すことを報告する。特に、複数の研究により、より高い結合力のＴＣＲ及び多機能Ｔ細胞が、癌細胞を除去し、ウイルス感染を可能な限り排除するのにより有効であり得ることが実証されている。したがって、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫によって付与されるさらなる抗腫瘍免疫は、全３つの因子の組み合わせを介するものであり得る。
アデノウイルスベースの癌ワクチンは、再感染を阻止し、したがって免疫時のワクチンの有効性を制限するＡｄ５特異的ＮＡｂを有する個人の割合が高いことによって部分的に妨げられてきた。Ａｄ５．Ｆ３５などの希少な血清型及びキメラアデノウイルスベクターの使用は、Ａｄ５の既存の免疫に関連する中和の影響を受けにくいが、ワクチン接種時のベクター特異的ＮＡｂの誘導は、追加の免疫の有用性を制限する。そのため、２つの異なるベクターを利用する異種免疫は、この設定における相同免疫よりも好ましい場合がある。さらに、ウイルスベクターとは対照的に、Ｌｍなどの細菌ベクターはワクチン接種時にＮＡｂを誘導しない。そのため、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫が経時的に低下するにつれて、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃによる反復ワクチン接種は許容され、患者においてＧＵＣＹ２Ｃ免疫を治療レベルまで一貫して上昇させることが必要であり得る。
Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃは、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１初回刺激後にＧＵＣＹ２Ｃ特異的メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の強力な増殖を誘導したが、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ単独では単剤療法としての効果は乏しかった。実際、相同なＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃワクチン接種では、ＥＬＩＳｐｏｔによるとＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が明らかに存在せず、ＣＲＣ負荷に対する保護が与えられなかった。興味深いことに、Ｌｍワクチンを単剤療法として検討する研究は、さまざまな成功を報告している。腫瘍抗原ＨＥＲ２及びＰＳＡに対するＬｍワクチンは、単剤療法として強力な抗腫瘍免疫を生成するが、ＰＡＰ及びメソセリンを含む他の腫瘍抗原に対するＬｍワクチンは、同様に、限られた免疫原性のみを実証し、異種初回刺激－追加免疫として利用された。さらに、Ｌｍワクチンと抗ＧＩＴＲ抗体及び抗ＰＤ－１抗体などの免疫調節剤を組み合わせた場合の抗腫瘍免疫の増強が報告されている。そのため、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが単独で検出可能なＧＵＣＹ２Ｃ免疫応答を刺激しない理由を理解して、免疫モジュレーターとＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃを組み合わせてさらに調査すると、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ生物学に重要な洞察を生み出し、ＧＵＣＹ２Ｃ免疫のさらなる増強につながる可能性がある。
胃腸癌におけるＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－ＰＡＤＲＥワクチンを試験する進行中の臨床試験（ＮＣＴ０４１１１１７２）の状況において、これらの研究は、この試験に登録された患者がＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃによる追加ワクチン接種の恩恵を受ける可能性があることを示唆している。本発明者らの研究は、Ａｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１＋Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃが、いずれかのベクターによる相同免疫と比較して、優れたＧＵＣＹ２Ｃ抗腫瘍免疫及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を誘導することを実証する。さらに、本発明者らの研究は、Ｌｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫がＡｄ５．Ｆ３５－ＧＵＣＹ２Ｃ－Ｓ１免疫による最初の初回刺激のずっと後に有効であり得ることを示唆しており、最初の初回刺激免疫との間隔が長いにもかかわらず、患者がＬｍ－ＧＵＣＹ２Ｃ追加免疫から患者が恩恵を受ける可能性があることを示唆する。
Claims (52)
- ａ）アデノウイルスＡｄ５．Ｆ３５ベクター：
ｂ）ｉ）作動可能に連結された異種プロモーター、
ｉｉ）インフレームで融合された可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸、
ｉｉｉ）ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット：
を含む組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。 - 複製欠損である、請求項１に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、配列番号５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む、請求項２に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープＰＡＤＲＥをコードする核酸を含む、請求項２に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記ＰＡＤＲＥが配列番号７によってコードされる、請求項４に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記遺伝子発現カセットが、融合配列を形成するための配列番号７に記載のユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む、請求項３に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記異種プロモーターがＣＭＶ ＩＥである、請求項６に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 前記融合配列が、可溶性ヒトＧＵＣＹ２ＣドメインのＣ末端に融合されたＰＡＤＲＥをコードし、配列番号９に記載の配列である、請求項６に記載の組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス。
- 請求項８に記載のアデノウイルス及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む注射用医薬組成物。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、請求項９に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記癌の細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する方法。
- 癌組織がＧＵＣＹ２Ｃを発現するかを決定するために、前記投与工程が、前記癌組織の試料を分析する工程に先行する、請求項１０に記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び／又は放射線治療及び／又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項１０に記載のヒト患者を治療する方法。
- ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌が食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項１０に記載のヒト患者を治療する方法。
- 前記癌が原発性である、請求項１２に記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項１２に記載の方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、
ＧＵＣＹ２Ｃが、
（ｉ）手術、化学療法又は放射線療法による治療の工程；続いて
（ｉｉ）請求項９に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む前記癌の細胞によって発現される治療方法。 - 前記癌が前記第１の治療工程の完了後に検出不能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項１５に記載の治療方法。
- ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合させた可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、配列番号５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む、請求項１８に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープＰＡＤＲＥをコードする核酸を含む、請求項１８に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記ＰＡＤＲＥが配列番号７によってコードされる、請求項２０に記載の組換えＡｄ５．リステリア・モノサイトゲネス。
- 前記遺伝子発現カセットが、融合配列を形成するための配列番号７に記載のユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む、請求項１８に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 前記融合配列が、可溶性ヒトＧＵＣＹ２ＣドメインのＣ末端に融合されたＰＡＤＲＥをコードし、配列番号９に記載の配列である、請求項１８に記載の組換えリステリア・モノサイトゲネス。
- 請求項１８～２４のいずれかに記載のリステリア・モノサイトゲネス及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む注射用医薬組成物。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、請求項８に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記癌の細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する方法。
- 前記癌組織がＧＵＣＹ２Ｃを発現しているかを決定するために、前記投与工程が、癌組織の試料を分析する工程に先行する、請求項２５に記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び／又は放射線治療及び／又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項２５に記載のヒト患者を治療する方法。
- ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌が食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項２５に記載のヒト患者を治療する方法。
- 前記癌が原発性である、請求項２５に記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項２５に記載の方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、
ＧＵＣＹ２Ｃが、
（ｉ）手術、化学療法又は放射線療法による治療の工程；続いて
（ｉｉ）請求項８に記載の医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む前記癌の細胞によって発現される治療方法。 - 前記癌が前記第１の治療工程の完了後に検出不能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項３１に記載の治療方法。
- 癌と診断されたヒト患者を治療する方法であって、前記癌の細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現し、
ａ）ｉ）アデノウイルスＡｄ５．Ｆ３５ベクター：
作動可能に連結された異種プロモーター、
インフレームで融合された可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸、
ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット
を含む組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルス
を含む医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程；及び
ｂ）ｉ）作動可能に連結された異種プロモーター
インフレームで融合された可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸
ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸
を含む遺伝子発現カセット
を含む組換えリステリア・モノサイトゲネス
を含む医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程
を含む治療方法。 - 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが複製欠損である、請求項３３に記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが、配列番号５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープＰＡＤＲＥをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項３３～３５のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが配列番号７によってコードされるＰＡＤＲＥを含む、請求項３３～３６のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが、融合配列を形成する配列番号７に記載のユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合される配列５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項３３～３７のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスの異種プロモーターが、ＣＭＶ ＩＥプロモーターである、請求項３３～３８のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えＡｄ５．Ｆ３５アデノウイルスが、可溶性ヒトＧＵＣＹ２ＣドメインのＣ末端に融合されたＰＡＤＲＥをコードし、配列番号９に記載の配列である融合配列を含む、請求項３３～３９のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む、請求項３３～４０のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、配列番号５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む、請求項３３～４１のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープＰＡＤＲＥをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットの組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む、請求項３３～４２のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、配列番号７によってコードされるユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープＰＡＤＲＥをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットの組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む、請求項３３～４３のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、融合配列を形成する配列番号７に記載のユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸にインフレームで融合された配列５に記載の可溶性ヒトＧＵＣＹ２Ｃドメインをコードする核酸を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項３３～４４のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えリステリア・モノサイトゲネスが、可溶性ヒトＧＵＣＹ２ＣドメインのＣ末端に融合されたＰＡＤＲＥをコードする核酸を含み、配列番号９に記載の配列である遺伝子発現カセットを含む、請求項３３～４５のいずれかに記載の方法。
- 工程ａ）に先行して、癌組織の試料を分析して、癌組織がＧＵＣＹ２Ｃを発現しているかを決定する、請求項３３～４６のいずれかに記載の方法。
- 前記治療投与計画が、手術、及び／又は放射線治療及び／又は他の抗癌剤の投与も含む、請求項３３～４７のいずれかに記載の方法。
- 前記ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌が、食道、胃、膵臓、又は結腸直腸である、請求項３３～４７のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が原発性である、請求項３３～４９のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項３３～４９のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が、前記第１の治療工程の完了後に検出不可能であり、前記患者が微小転移に罹患していると疑われる、請求項３３～５０のいずれかに記載の方法。
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