EA045254B1 - Промотор pr13.5 для устойчивых т-клеточных и гуморальных иммунных реакций - Google Patents
Промотор pr13.5 для устойчивых т-клеточных и гуморальных иммунных реакций Download PDFInfo
- Publication number
- EA045254B1 EA045254B1 EA201990114 EA045254B1 EA 045254 B1 EA045254 B1 EA 045254B1 EA 201990114 EA201990114 EA 201990114 EA 045254 B1 EA045254 B1 EA 045254B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mva
- promoter
- seq
- recombinant
- virus
- Prior art date
Links
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 title claims description 38
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 title description 15
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 title description 5
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims description 113
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 52
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 52
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 51
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 49
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 50
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 50
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 26
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 25
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 22
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 101100272150 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B8R gene Proteins 0.000 description 13
- 101100272151 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR190 gene Proteins 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 6
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 5
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 5
- 101150020569 B3R gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 3
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000725630 Ectromelia virus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 101150046614 C15L gene Proteins 0.000 description 2
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 2
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 2
- 241000700664 Capripoxvirus Species 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000700627 Monkeypox virus Species 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241001455645 Rabbitpox virus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 101100280283 Vaccinia virus (strain Copenhagen) F11L gene Proteins 0.000 description 2
- 101100540425 Vaccinia virus (strain Copenhagen) VGF gene Proteins 0.000 description 2
- 101100280285 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR050 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000587120 Vaccinia virus Ankara Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 102220059024 rs747802641 Human genes 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150011225 5L gene Proteins 0.000 description 1
- 101150068622 ATI gene Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000700628 Chordopoxvirinae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 241000928771 Horsepox virus Species 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 241000692870 Inachis io Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700559 Molluscipoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000287127 Passeridae Species 0.000 description 1
- 241001569977 Penguinpox virus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700667 Pigeonpox virus Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000569181 Quailpox virus Species 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287181 Sturnus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000700568 Suipoxvirus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000385708 Turkeypox virus Species 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 206010046861 Vaccination complication Diseases 0.000 description 1
- 101100054108 Vaccinia virus (strain Copenhagen) A44L gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700574 Yatapoxvirus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 240000001854 junco Species 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000008041 oiling agent Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100001271 preclinical toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000013376 serial cultivation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Description
Уровень техники
MVA происходит от штамма вируса осповакцины Анкара, поражающего кожу (хориоаллантоисного вируса осповакцины Анкара (CVA)), который в течение многих лет поддерживался в Институте вакцинации, Анкара, Турция, и использовался в качестве основы для вакцинации людей. Однако из-за частых тяжелых поствакцинальных осложнений, связанных с вирусами осповакцины (VACV), было предпринято несколько попыток создания более аттенуированной и безопасной противооспенной вакцины.
В период с 1960 по 1974 профессору Anton Mayr удалось успешно аттенуировать CVA путем более чем 570 последовательных пассажей в клетках CEF (Mayr et al., 1975, Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA, Infection, 3:6-14). В рамках начального этапа разработки противооспенной вакцины на основе MVA были проведены клинические исследования MVA-517 (соответствующего 517-му пассажу) в комбинации с Lister Elstree (Stickl, 1974, Smallpox vaccination and its consequences: first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine MVA, Prev. Med., 3(1):97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel, 1971, Intracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus (MVA virus), Munch Med Wochenschr., 113:1149-1153) у субъектов, подверженных риску нежелательных реакций на введение противооспенной вакцины. В 197 6-м MVA, полученный из посевного материала MVA-571 (соответствующего 571-му пассажу), был зарегистрирован в Германии в качестве первичной вакцины в двухэтапной программе инъекционной противооспенной вакцинации. В дальнейшем MVA-572 были вакцинированы приблизительно 120000 европеоидов, большинство из которых - дети от 1 до 3 лет. При этом не сообщалось о серьезных побочных эффектах, несмотря на то что многие из субъектов принадлежали к популяции, имеющей высокий риск осложнений, связанных с обычным вирусом осповакцины (Mayr et al., 1978, The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behaviour in organisms with a debilitated defence mechanism (author's transl), Zentralbl. Bacteriol. (B), 167:375-390). MVA-572 был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных, Лаборатория исследования и производства вакцин, Лабораторная служба общественного здравоохранения, Научно-производственный центр микробиологии, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир SP4 0JG, Соединенное Королевство, под номером ECACC V9401 2707.
Так как для аттенуации MVA было использовано множество пассажей, существует ряд различных штаммов или изолятов в зависимости от номера пассажа в клетках CEF. Все штаммы MVA получены от доктора Mayr, и большинство происходит от MVA-572, который применялся в рамках программы по эрадикации оспы в Германии, или от MVA-575, который интенсивно использовался в качестве ветеринарной вакцины. MVA-575 был депонирован 7 декабря 2000 в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под регистрационным номером V001 20707.
Путем серийного культивирования (более 570 пассажей) CVA в первичных фибробластах эмбриона цыпленка был получен аттенуированный вирус CVA - MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара). MVA был дополнительно пассирован компанией Bavarian Nordic и получил наименование MVA-BN. У MVA, как и у MVA-BN, отсутствует приблизительно 13% (26,5 кб, соответствующих шести крупным и множеству мелких делеционных сайтов) генома, по сравнению с предковым вирусом CVA. Делеции затрагивают некоторые гены вирулентности и тропизма, а также большой фрагмент гена, кодирующего белок включений типа A (ATI), и ген, кодирующий структурный белок, который направляет зрелые вирусные частицы в тельца-включения типа А. Образец MVA-BN был депонирован 30 августа 2000 г. в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под номером V00083008.
MVA-BN может прикрепляться к клеткам человека и проникать в них, где вирусные гены крайне эффективно экспрессируются. При этом не происходит сборки и высвобождения дочерних вирионов. MVA-BN и его производные вводились многим типам животных и более чем 2000 людей, в том числе страдающим от иммунодефицита. Все вакцинации были признаны в целом безопасными и хорошо переносимыми.
Во множестве различных публикаций представлено мнение, что все штаммы MVA одинаковы и представляют собой высокоаттенуированные безопасные живые вирусные векторы. Однако в результате доклинических испытаний было показано, что MVA-BN демонстрирует исключительные аттенуированность и эффективность, по сравнению с другими штаммами MVA (WO 02/42480). MVA-BN, вариантные штаммы MVA, как, например, депонированные в ЕСАСС под номером V00083008, имеют способность к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) in vitro, но не способны к репродуктивной репликации в клетках человека, в которых могут репродуктивно реплицироваться MVA 575 или MVA 572. К примеру, MVA-BN не способен к репродуктивной репликации в кератиноцитах человека линии НаСаТ, клетках почки эмбриона человека линии 293, клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa. Более того, штаммы MVA-BN не реплицируются при моделировании на мышах, не способных к продуцированию зрелых В- и Т-клеток и в связи с этим имеющих тяжелый иммунодефицит и являющихся в высшей степени восприимчивыми к реплицирующемуся вирусу. Дополнительным или альтернативным свойством штаммов MVA-BN является способность к индукции по меньшей мере существенно схожего уровня иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК
- 1 045254 для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации.
Термин не способный к репродуктивной репликации применяется в настоящей заявке, как определено в WO 02/42480 и патенте США 6761893, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Таким образом, данный термин относится к вирусу, который через 4 дня от начала инфекции демонстрирует степень амплификации, составляющую менее чем 1, что выявляется с помощью методов, описанных в патенте США 6761893, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Степень амплификации вируса представляет собой соотношение количества вирусов, происходящих из инфицированной клетки (выход), к исходному количеству вирусов, использованных для инфицирования клеток (вход). Соотношение между выходом и входом, составляющее 1, описывает статус амплификации, при котором количество вирусов, происходящих из инфицированной клетки, совпадает с исходным количеством вирусов, использованных для инфицирования клеток.
Согласно одному из вариантов реализации изобретения MVA-BN или его производные характеризуются индуцированием по меньшей мере существенно схожего уровня иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Вирус осповакцины рассматривается как индуцирующий по меньшей мере существенно схожий уровень иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации в случае, если ответ ЦТЛ, оцененный с помощью анализа 1 или анализа 2, раскрытых в WO 02/42480, предпочтительно с помощью обоих анализов, является по меньшей мере существенно схожим при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Более предпочтительно, чтобы ответ ЦТЛ после проведения вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, оцененный с помощью по меньшей мере одного из анализов, был более интенсивным по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Наиболее предпочтительно, чтобы ответ ЦТЛ был более интенсивным при его оценке с помощью обоих анализов.
В WO 02/42480 раскрыт способ получения вирусов осповакцины, имеющих свойства MVA-BN. Высокоаттенуированный вирус MVA-BN может быть получен, например, путем дополнительного пассирования модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), такого как MVA-572 или MVA-575.
Таким образом, было показано, что MVA-BN имеет самый высокий профиль аттенуированности по сравнению с другими штаммами MVA, и является безопасным даже для животных с тяжелым иммунодефицитом.
Несмотря на то что репликация MVA в клетках млекопитающих резко подавлена, его гены эффективно транскрибируются, при этом блок вирусной репликации происходит на уровне сборки и выхода вируса. (Sutter and Moss, 1992, Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:10847-10851; Carroll and Moss, 1997, Host range and cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus: propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line, Virology, 238:198-211.) Несмотря на высокую аттенуированность и сниженную вирулентность MVA-BN доклинические исследования показали, что он вызывает как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции на VACV и продукты гетерологичных генов, клонированных в геном MVA (Harrer et al., 2005, Therapeutic Vaccination of HIV-1-infected patients on HAART with recombinant HIV-1 nef-expressing MVA: safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antiviral Therapy, 10:285-300; Cosma et al., 2003, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals, Vaccine, 22(1):21-29; Di Nicola et al., 2003, Clinical protocol. Immunization of patients with malignant melanoma with autologous CD34(+) cell-derived dendritic cells transduced ex vivo with a recombinant replication-deficient vaccinia vector encoding the human tyrosinase gene: a phase I trial, Hum Gene Ther., 14(14):1347-1 360; Di Nicola et al., 2004, Boosting T cellmediated immunity to tyrosinase by vaccinia virus-transduced, CD34(+)-derived dendritic cell vaccination: a phase I trial in metastatic melanoma, Clin Cancer Res., 10(16):5381-5390).
MVA-BN и вакцины на основе рекомбинантного MVA-BN могут быть получены, пассированы, продуцированы и произведены в клетках CEF, культивируемых в среде без сыворотки. С учетом известных характеристик, многие рекомбинантные варианты MVA-BN были предложены для доклинической и клинической разработки. Между MVA-BN, основой вирусного вектора, и различными вакцинами на основе рекомбинантного MVA не было обнаружено отличий по аттенуированности (недостаточности репликации в линиях клеток человека) или безопасности (по результатам доклинических исследований токсичности или клинических исследований).
Индукция сильных гуморальной и клеточной иммунных реакций на продукт чужеродного гена, экспрессируемый VACV-вектором, затруднена вследствие того, что продукт чужеродного гена должен
- 2 045254 конкурировать с более чем 150 антигенами вектора VACV за распознавание и индукцию специфических антител и Т-клеток. Особую проблему представляет иммунодоминирование CD8 Т-клеточных антигенных детерминант вектора, которое препятствует индукции сильной CD8 Т-клеточной реакции на продукт чужеродного гена. (Smith et al., Immunodominance of poxviral-specific CTL in a human trial of recombinant-modified vaccinia Ankara, J. Immunol., 175:8431-8437, 2005.) Это относится к реплицирующимся VACV-векторам, таким как Dryvax, а также к нереплицирующимся векторам, например NYVAC и MVA.
Для экспрессии рекомбинантного антигена (неоантигена) вектором VACV могут использоваться только поксвирус-специфические промоторы, но не обычные эукариотические промоторы. Это обусловлено особенностями биологии поксвирусов, которые реплицируются в цитоплазме и привносят свою собственную, независимую от клетки транскрипционную машинерию, не распознающую типичные эукариотические промоторы.
Цикл вирусной репликации подразделен на две основных фазы: раннюю фазу, включающую первые два часа от начала инфекции до репликации ДНК, и позднюю фазу, начинающуюся вместе с репликацией вирусной ДНК на 2-4 ч от начала инфекции.
Поздняя фаза охватывает остаток цикла вирусной репликации от ~2-20 ч от начала инфекции до высвобождения дочерних вирионов из инфицированной клетки. Существует ряд типов поксвирусных промоторов, отличающихся периодами цикла вирусной репликации, в течение которых они являются активными, и называемых в соответствии с этим, например, ранние и поздние промоторы (см., например, Davison and Moss, J. Mol. Biol., 210:771-784, 1989; Davison and Moss, J. Mol. Biol., 210:749-769, 1989; Hirschmann et al., Journal of Virology, 64:6063-6069, 1990, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки).
Тогда как ранние промоторы могут быть активны также на позднем этапе инфекции, активность поздних промоторов ограничивается поздней фазой. Промоторы третьего класса, называемые промежуточными промоторами, активны в течение перехода от ранней к поздней фазе и зависимы от репликации вирусной ДНК. Последнее относится также к поздним промоторам, однако транскрипция с промежуточных промоторов начинается раньше, чем с типичных поздних промоторов и нуждается в другом наборе транскрипционных факторов.
В последние годы становится все более очевидным, что выбор временного класса поксвирусного промотора для экспрессии неоантигена оказывает сильное влияние на силу и качество неоантигенспецифической иммунной реакции. Было показано, что Т-клеточные реакции на неоантигены, экспрессированные под контролем позднего промотора, являются более слабыми, чем на такой же антиген, экспрессированный под контролем раннего промотора (Bronte et al., Antigen expression by dendritic cells correlates with the therapeutic effectiveness of a model recombinant poxvirus tumor vaccine, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:3183-3188, 1997; Coupar et al., Temporal regulation of influenza hemagglutinin expression in vaccinia virus recombinants and effects on the immune response, Eur. J. Immunol., 16:1479-1487, 1986).
Еще более поразительно, недавно было показано, что при повторных аутологичных иммунизациях VACV, как и VACV-вектором MVA, дефектным по репликации, CD8 Т-клеточные реакции на антигены, находящиеся под контролем исключительно позднего промотора, могут полностью отсутствовать. Это нарушение привело к тому, что антиген-специфическая CD8 Т-клеточная реакция почти не проявляется после вторичной иммунизации (Kastenmuller et al., Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination, J. Exp. Med., 204:2187-2198, 2007).
Следовательно, ранняя экспрессия неоантигенов VACV-векторами, по-видимому, является определяющей для эффективных неоантиген-специфических CD8 Т-клеточных реакций. Было также показано, что антиген, экспрессированный VACV-вектором в ранней фазе, конкурирует не только с антигенами, экспрессированными в поздней фазе, но также и с другими антигенами, экспрессированными в ранней фазе, за иммунодоминирование в течение CD8 Т-клеточной реакции. (Kastenmuller et al., 2007.) Специфические свойства ранних участков поксвирусных промоторов, следовательно, могут быть крайне важны для индукции неоантиген-специфической Т-клеточной реакции. Более того, согласно общепринятой точке зрения, большее количество антигена способствует индукции более сильных антиген-специфических иммунных реакций (для информации относительно поксвирусов; см., например, Wyatt et al., Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines, Vaccine, 26:486-493, 2008).
Ранее был описан промотор, сочетающий в себе 4 ранних промоторных элемента и поздний промоторный элемент гена ATI (Funahashi et al., Increased expression in vivo and in vitro of foreign genes directed by A-type inclusion body hybrid promoters in recombinant vaccinia viruses, J. Virol., 65:5584-5588, 1991; Wyatt et al., Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines, Vaccine, 26:486-493, 2008). Было показано, что он обеспечивает повышенную раннюю экспрессию антигена. Тем не менее Т-клеточные реакции, индуцированные антигеном, экспрессия которого находится под контролем подобного промотора, были исследованы только после однократной иммунизации и явно не отличались от реакций, имевших место в случае экспрессии под контролем типичного промотора Pr7.5K (Funahashi et al., Increased expression in vivo and in vitro of foreign genes directed by A-type inclusion body hybrid promoters in recombinant vaccinia viruses, J. Virol., 65:5584-5588, 1991).
- 3 045254
Jin et al. в Arch. Virol., 138:315-330, 1994, было описано конструирование рекомбинантных промоторов VACV, состоящих из промотора ATI VACV в сочетании с тандемными повторами (2-38 копий) мутантного промотора Pr7.5, функционально связанного с геном CAT. До 10 копий мутантного промотора Pr7.5 включительно эффективно повышали раннюю экспрессию генов. Дальнейшее увеличение количества копий, похоже, имеет подавляющее действие. Для всех конструктов количество белка CAT, производимое в присутствии цитозин арабинозида (AraC) (т.е. если цикл вирусной репликации был остановлен в ранней фазе), составляло менее чем одну десятую количества, производимого в отсутствие AraC (Jin et al., Arch. Virol., 138:315-330, 1994).
Недавно было показано, что повторные иммунизации мышей рекомбинантным MVA, экспрессирующим OVA под контролем гибридного ранне-позднего промотора (pHyb), содержащего пять копий сильного раннего элемента, приводят к развитию исключительных острых CD8 Т-клеточных реакций и реакций CD8 Т-клеток памяти, по сравнению с OVA, экспрессия которого находится под контролем Pr7.5- и PrS (Baur et al., Journal of Virology, vol. 84(17):8743-8752 (2010)). Кроме того, после трех или более иммунизации белок B8R, происходящий из MVA, заменяется OVA, экспрессированным под контролем pHyb, в качестве иммунодоминантного CD8 Т-клеточного антигена Id.
Assarsson et al. в P.N.A.S., 105:2140-45, 2008, оценили одновременные уровни экспрессии 223 аннотированных генов вируса осповакцины в течение инфекции и определили их динамику с помощью геномных микрочипов высокой плотности. Они обнаружили, что многие гены штамма WR вируса осповакцины имеют высокие уровни транскрипции. Assarsson et al. привели примеры высокоэкспрессированных генов: предранних VACWR-059 (белок, связывающий двухцепочечную РНК) и VACWR-18 4 (продукт неизвестен); раннего VACWR-018 (продукт неизвестен); ранне-позднего VACWR-131 (капсидный белок); и позднего VACWR-169 (продукт неизвестен). Assarsson et al. указали на то, что вследствие исключительно высоких уровней экспрессии эти гены могут представлять особый интерес для будущих исследований, но не определили, какие промоторы инициируют транскрипцию этих генов.
Yang et al. в P.N.A.S., 107:11513-11518, 2010, применили глубокое секвенирование РНК для анализа динамики транскриптомов вируса осповакцины (VACV) в течение инфекции. До репликации вирусной ДНК были выявлены транскрипты со 118 ORF VACV; после репликации были описаны транскрипты с 93 дополнительных ORF. Высокое разрешение позволило определить точные границы многих мРНК, включая сквозные транскрипты, и расположение сайтов инициации транскрипции и перекрывающихся промоторов.
Orubu et al. в PLoS ONE, 7(6):e40167, 2012, показали, что сильные ранние промоторы, под контролем которых находится экспрессия нефункциональных или второстепенных открытых рамок считывания (ORF) MVA, могут быть использованы для иммуногенной экспрессии рекомбинантного антигена. Точная замена MVA-ортологов C11R, F11L, A44L и B8R на модельный антиген, расположенный таким образом, чтобы использовать тот же кодон инициации трансляции, сделала возможной раннюю экспрессию трансгена, подобную или несколько более интенсивную, чем та, что достигается с помощью широко используемого промотора р7.5 или коротких синтетических промоторов. Аналогично, частота антигенспецифических CD8+ Т-клеток, индуцированных путем однократного введения или первичной иммунизации аденовирусом и реиммунизации rMVA у мышей, при использовании эндогенных промоторов в их исходных геномных локусах была такой же или несколько повышенной, по сравнению с типичными конструктами.
Усиление иммуногенности, наблюдаемое при использовании промоторов C11R или F11L, в сравнении с р7.5, было подобно усилению иммуногенности, имевшему место при сравнении промотора mH5 с р7.5.
Сильные Т-клеточные гуморальные иммунные реакции на антигены, кодируемые рекомбинантными поксвирусами, могут повысить эффективность вакцины. Следовательно, в данной области техники существует потребность в композициях и способах, вызывающих сильные Т-клеточные и гуморальные иммунные реакции на антигены, кодируемые рекомбинантными поксвирусами, такими как MVA. Изобретение удовлетворяет эту потребность.
Краткая сущность изобретения
Изобретение предлагает рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, и способы их применения. В одном варианте реализации изобретения изобретение предлагает способ индукции устойчивой CD8 Т-клеточной реакции на неоантиген у млекопитающего, предпочтительно человека, включающий проведение одной или более иммунизаций вирусом MVA млекопитающего, в том числе человека.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая по меньшей мере на 95, 98 или 100% идентична SEQ ID NO: 1.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию второй нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 31 нуклеотида, которая по меньшей мере на 95, 98 или 100% идентична SEQ ID NO: 1.
- 4 045254
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 нуклеотидов, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 1.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит SEQ ID NO: 2.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена upstream-последовательность гена MVA013.5L (SEQ ID NO: 3). Приведены последовательности промоторов Pr13.5-short и Pr13.5-long. Подчеркнут пунктирной линией: Pr13.5-long (пол. 15878-15755). Подчеркнут жирной линией: Pr13.5-short (Пол. 15808-15755). Подчеркнуты сплошной линией: Стартовый кодон ATG гена MVA013.5 (пол. 15703-15701). Стоп-кодон ТАА гена MVA014L (пол. 15878-15856). Черные стрелки снизу: сайты инициации транскрипции, определенные с помощью ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (пол. 15767 и 15747). Серые стрелки сверху: сайты инициации транскрипции, приведенные Yang et al., 2010, suppl. data. Заключен в рамку: коровый промотор, приведенный Yang et al., 2010, suppl. data (пол. 15913-15899). Положения приведены на основании последовательности DQ983238.1 в GenBank.
На фиг. 2 представлены последовательность и положение промоторов Pr13.5-long и Pr13.5-short в геноме MVA (SEQ ID NO: 3). В upstream-последовательности гена MVA013.5 расположен прямой повтор, состоящий из 44 п.о. Заключена в рамку: повторяющаяся последовательность, состоящая из 44 п.о., расположенная в upstream-последовательности промотора 13.5, отделенного спейсером, состоящим из 36 п.о. Подчеркнут пунктирной линией: Pr13.5-long (пол. 15878-15755). Подчеркнут жирной линией: Pr13.5-short (пол. 15808-15755). Подчеркнут сплошной линией: стартовый кодон ATG гена MVA013.5 (пол. 15703-15701). Положения приведены на основании последовательности DQ983238.1 в GenBank.
На фиг. 3 представлены результаты измерения уровней мРНК гена овальбумина в клетках HeLa, инфицированных упомянутыми конструктами, с помощью RT-qPCR в указанные моменты с начала инфекции.
На фиг. 4 представлены результаты измерения белковой экспрессии Ova с помощью FACS в виде средней интенсивности флуоресценции (СИФ) в клетках HeLa, инфицированных упомянутыми конструктами, в указанные моменты с начала инфекции. Среднее значение интенсивности флуоресценции для клеток дикого типа (не содержащих ген Ova), составляющее 399 СИФ, представляет собой фоновый уровень флуоресценции.
На фиг. 5 представлено среднее соотношение клеток Ova+/B8R+ у мышей, вакцинированных упомянутыми конструктами, после первой, второй и третьей иммунизации.
На фиг. 6 представлено среднее соотношение Ova+/В8R+Т-клеточных реакций у мышей на 10-ю неделю после третьей иммунизации упомянутыми конструктами.
Фиг. 7А и 7В иллюстрируют образование антител после первой, второй и третьей иммунизаций упомянутыми конструктами. А. Среднее геометрическое титра (СГТ) антител. В. Соотношение СГТ в сравнении с промотором PrS. Промоторы MVA50L+PrSSL и MVA170R+PrSSL являются промоторами MVA соответствующих генов, слитыми с 5'-концом синтетического короткого сильного позднего промотора PrSSL (Short Strong Late) непосредственно upstream от ATG гена овальбумина (ААТТТТТААТАТАТАА; SEQ ID NO: 7; РСТ WO 2010/060632 A1).
На фиг. 8A-8F представлено выравнивание последовательности SEQ ID NO: 1 с нуклеотидными последовательностями различных поксвирусных промоторов Pr13.5 с помощью BLAST. Идентичные нуклеотиды обозначены точками, отсутствующие нуклеотиды обозначены тире, а замены представлены буквами.
На фиг. 9A-9D представлены учетные номера и названия последовательностей, использованных для выравнивания, представленного на фиг. 8A-8F.
Подробное описание сущности изобретения
Клетки HeLa инфицировали MVA-BN, после чего получали РНК. Синтезировали специфические праймеры к различным ORF MVA и проводили ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (FirstChoice® RLM-RACE Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germany) для получения ПЦР-продуктов, соответствующих РНК MVA, кодирующим эти ORF. ПЦР-продукты были секвенированы для определения сайтов инициации транскрипции. Исходя из этих данных, были определены промоторы для транскрипции мРНК, кодирующих эти ORF. Для контроля экспрессии гена овальбумина (OVA) в MVA-конструкты были вставлены промоторы MVA для следующих ORF: MVA13.5 (CVA022; WR 018), MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185).
Клетки HeLa были инфицированы рекомбинантными вирусами MVA in vitro, а белковую экспрессию овальбумина оценивали с помощью анализа FACS. Анализ FACS не обнаружил белковой экспрессии овальбумина на 2-й или даже 4-й час от начала инфекции для конструктов, содержащих промоторы MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185). В то же время для промотора MVA13.5 (CVA022; WR 018) интенсивная экспрессия овальбумина была выявлена уже после 2-х часов.
Предполагаемый коровый элемент промотора для ORF MVA13.5L был ранее определен в Yang et al., 2010, как содержащий 15 нт коровую последовательность и нетранслируемую лидерную последователь- 5 045254 ность размером 177 нт. Тем не менее в настоящем исследовании установлено, что сайты инициации транскрипции, используемые ORF MVA13.5L, находятся более чем на 100 нуклеотидов downstream от сайта инициации, определенного Yang et al. Соответственно промотор MVA13.5, определенный изобретателями, отличается от корового элемента промотора, определенного Yang et al.
Промотор MVA13.5, определенный изобретателями, содержит повтор, состоящий из более чем 40 нуклеотидов: TAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTA (SEQ ID NO: 1). Повторяющаяся последовательность встречается также у многих других поксвирусов, например вируса оспы лошадей, вируса оспы обезьян, вируса оспы коров, вируса натуральной оспы, вируса осповакцины, вируса оспы верблюдов, вируса оспы кроликов, вируса оспы мышей и вируса оспы гололапых песчанок (фиг. 8 и 9).
Были созданы два MVA-конструкта с промоторами, содержащими одну копию (MVA13.5 short; SEQ ID NO: 1) или две копии (MVA13.5 long; SEQ ID NO: 2) повтора, контролирующего экспрессию гена овальбумина (OVA). После инфицирования клеток HeLa обоими конструктами in vitro была выявлена интенсивная экспрессия овальбумина (фиг. 4).
С помощью RT-qPCR была оценена динамика экспрессии РНК овальбумина под контролем различных промоторов в инфицированных клетках HeLa in vitro. Как MVA13.5 short, так и MVA13.5 long продемонстрировали высокие уровни ранней экспрессии РНК (фиг. 3). MVA13.5 long продемонстрировал наивысшие уровни ранней белковой экспрессии.
CD8 Т-клеточные реакции на OVA, экспрессируемый с рекомбинантных конструктов под контролем промоторов PrS, Pr7.5 opt+spacer, Pr13.5 short и Pr13.5 long, были оценены у мышей после одной, двух и трех иммунизации рекомбинантным MVA (фиг. 5, 6). OVA-специфические и B8R (вирус)специфические CD8 Т-клеточные реакции были оценены путем определения количества CD8 Т-клеток, специфически связывающихся с гексамерами МНС I класса. Декстрамеры МНС I класса образовывали комплекс с соответствующими Н-2Kb-связывающими пептидами: SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) для OVA или TSYKFESV (SEQ ID NO: 5) для вирусного пептида B8R.
Среднее соотношение OVA-специфических к B8R-специфическим CD8 Т-клеткам составляло примерно 2,5 для MVA13.5-long после 3-х иммунизации. Три других конструкта продемонстрировали среднее соотношение, составляющее менее чем 1. Таким образом, инверсия иерархии иммунодоминирования может быть достигнута путем применения для экспрессии неоантигена промотора Pr13.5 long, но не других промоторов.
Гуморальные иммунные реакции на OVA, экспрессируемый с рекомбинантных конструктов под контролем различных промоторов, были оценены у мышей после одной, двух и трех иммунизаций рекомбинантным MVA (фиг. 7А, 7В). Гуморальная иммунная реакция для MVA13.5 long была существенно более интенсивной, чем реакция, наблюдаемая при применении рекомбинантного MVA, содержащего промотор PrS. Следовательно, применение промотора Pr13.5 long для контроля экспрессии неоантигена MVA обеспечивает неожиданно превосходные результаты.
Промоторы Pr13.5.
Изобретение охватывает выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие или состоящие из промотора Pr13.5. В рамках настоящего изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 может относиться к нуклеотидной последовательности MVA, синтетической последовательности или аналогичной поксвирусной последовательности из поксвируса, отличного от MVA. В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1. Длина нуклеотидной последовательности составляет предпочтительно 40, 41, 42, 43, 44 или 45 оснований.
Процент идентичности может быть определен путем визуальной оценки и математического расчета. Кроме того, процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей может быть определен путем сравнения информации о последовательностях с помощью компьютерной программы GAP, версия 6.0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) и предлагаемой Генетической компьютерной группой Университета Висконсина (UWGCG). Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP включают (1) унитарную матрицу сравнения (имеющую значение 1 для совпадений и 0 для несовпадений) для нуклеотидов и весовую матрицу сравнения Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res., 14:6745, 1986, как описано Schwartz and Dayhoff, eds. в Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358, 1979;
(2) штраф за каждый пропуск, составляющий 3,0, и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ на месте каждого пропуска; и (3) отсутствие штрафов за концевые пропуски.
Могут использоваться и другие программы, применяемые специалистами в области сравнения последовательностей.
- 6 045254
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 функционально связан с гетерологичной нуклеотидной последовательностью. В рамках настоящего изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая в природе не связана с промотором. В рамках настоящего изобретения функционально связанный означает, что промотор может контролировать экспрессию гетерологичной нуклеотидной последовательности в клетке, инфицированной поксвирусом. В предпочтительном варианте реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует неоантиген. В рамках настоящего изобретения неоантиген означает антиген, который не экспрессируется поксвирусным вектором в естественных условиях.
Промотор Pr13.5 может быть функционально связан с гетерологичной нуклеотидной последовательностью с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В различных вариантах реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность вводится в 13.5 ORF поксвируса.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 является поксвирусным промотором природного происхождения. Например, промотор Pr13.5 может происходить от промотора Pr13.5 модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), вируса оспы обезьян, вируса оспы коров, вируса натуральной оспы, вируса осповакцины, вируса оспы верблюдов, вируса оспы кроликов, вируса оспы мышей или вируса оспы гололапых песчанок. Источники предпочтительных промоторов Pr13.5 могут быть выбраны среди вирусов, представленных на фиг. 9. Предпочтительные промоторы Pr13.5 могут быть выбраны среди последовательностей, представленных на фиг. 8.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 является синтетическим промотором Pr13.5.
Промотор Pr13.5 может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий последовательности, состоящей из по меньшей мере 40, 41, 42, 43, 44 или 45 нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий последовательности, состоящей из по меньшей мере 40, 41, 42, 43 или 44 нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1, и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий второй нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 31 нуклеотида, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте реализации изобретения вторая нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 оснований.
В предпочтительном варианте реализации изобретения повторяющиеся последовательности разделены 20-80 нуклеотидами, более предпочтительно 30-40 нуклеотидами, наиболее предпочтительно 33, 35, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидами.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере одну копию последовательности: TAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTATTGCTCTTGTGACTAGAGAC TTTAGTTAGGTACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTA (SEQ ID NO: 2).
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит одну или более нуклеотидных замен, представленных на фиг. 8.
Изобретение охватывает способы экспрессии неоантигена, включающие функциональное связывание промотора Pr13.5 с гетерологичной нуклеотидной последовательностью.
Рекомбинантные поксвирусы, содержание промоторы Pr13.5.
Изобретение предлагает рекомбинантный поксвирусный вектор, содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с гетерологичной нуклеотидной последовательностью. В одном варианте реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность вставлена в 13.5 ORF поксвируса таким образом, чтобы функционально связать гетерологичную нуклеотидную последовательность с эндогенным вирусным промотором Pr13.5. В другом варианте реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность связана с промотором Pr13.5 и вставлена в геномный сайт, отличный от 13.5 ORF.
В предпочтительном варианте реализации изобретения поксвирусный вектор происходит от поксвирусов, принадлежащих к подсемейству Chordopoxvirinae. Поксвирусы включают вирусы, принадлежащие к родам Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Lepripoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus и Yatapoxvirus. Наиболее предпочтительными являются поксвирусы, принадлежащие к родам Orthopoxvi- 7 045254 rus и Avipoxvirus.
Другие поксвирусы, такие как вирус оспы енотов и вирус оспы мышей, могут быть использованы в настоящем изобретении, например, для производства вакцины для иммунизации диких животных. В настоящее изобретение включены также представители родов Capripoxvirus и Lepripoxvirus, поскольку они пригодны для использования в качестве векторов для крупного рогатого скота и кроликов соответственно.
В других вариантах реализации изобретения поксвирус происходит от вирусов рода Avipoxvirus. Примеры вирусов рода Avipoxvirus, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают любые вирусы оспы птиц, такие как вирус оспы кур, вирус оспы канареек, вирус оспы юнко, вирус оспы майн, вирус оспы голубей, вирус оспы попугаев, вирус оспы перепелов, вирус оспы павлинов, вирус оспы пингвинов, вирус оспы воробьев, вирус оспы скворцов и вирус оспы индеек. Предпочтительными вирусами рода Avipoxvirus являются вирус оспы канареек и вирус оспы кур.
В предпочтительном варианте реализации изобретения поксвирус представляет собой вирус осповакцины, наиболее предпочтительно MVA. Изобретение охватывает рекомбинантные вирусы MVA, созданные на основе любых возможных вирусов MVA. Предпочтительными вирусами MVA являются вариантные штаммы MVA - MVA-BN, как, например, депонированный в ЕСАСС под номером V00083008; MVA-575, депонированный 7 декабря 2000 в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под регистрационным номером V001 20707; и MVA-572, депонированный в Европейской коллекции клеточных культур животных как ЕСАСС V9401 2707. Предпочтительными являются также производные от депонированных штаммов.
В предпочтительном варианте реализации изобретения MVA имеет способность к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) или других линиях клеток птиц in vitro или в яйце, содержащем эмбрион, in vivo, но не способен к репродуктивной репликации в человеческих клетках, в которых могут репродуктивно реплицироваться MVA 575 или MVA 572. В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения MVA не способен к репродуктивной репликации в кератиноцитах человека линии НаСаТ, клетках почки эмбриона человека линии 293, клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) отличается способностью к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) in vitro, а также большей, чем у MVA-575, аттенуированностью в кератиноцитах человека линии НаСаТ, в клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa. В предпочтительном варианте реализации изобретения вирус MVA позволяет достичь в клетках CEF степени амплификации, составляющей более чем 500.
Любой антиген, включая антигены, индуцирующие Т-клеточную реакцию, может быть экспрессирован рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении. Предпочтительными являются вирусные, бактериальные, грибковые и раковые антигены. Крайне предпочтительными антигенами являются антигены HIV-1, антигены вируса лихорадки денге, специфический антиген простаты (PSA) и простатическая кислая фосфатаза (РАР), антигены HER-2/Neu, антигены сибирской язвы, антигены вируса кори, вируса гриппа, пикорнавируса, коронавируса и антигены респираторно-синцитиального вируса. В предпочтительном варианте реализации изобретения антиген представляет собой чужеродный антиген или неоантиген.
Изобретение охватывает способы создания рекомбинантных поксвирусов, предпочтительно MVA, включающие вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности в поксвирус таким образом, чтобы гетерологичная нуклеотидная последовательность была функционально связана с промотором Pr13.5.
Изобретение распространяется на применение рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, в производстве лекарства или вакцины для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Изобретение распространяется на применение рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Изобретение распространяется на использование рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, в качестве вакцин, в особенности для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Наборы, содержащие рекомбинантный MVA.
Изобретение предлагает наборы, содержащие рекомбинантный поксвирусный вектор, предпочтительно вирус MVA согласно настоящему изобретению. Набор может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре или более контейнеров или флаконов с рекомбинантным поксвирусным вектором, предпочтительно вирусом MVA, вместе с инструкциями по введению вируса млекопитающим, в том числе человеку. В инструкциях может быть указано, что рекомбинантный вирус вводится млекопитающему, предпочтительно человеку, в однократной или многократной (т.е. 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.) дозировке в определенные моменты времени (например, через по меньшей мере 4 недели, через по меньшей мере 6 недель, через по меньшей мере 8 недель после предыдущего введения). В предпочтительном варианте реализа- 8 045254 ции изобретения в инструкциях указано, что рекомбинантный вирус предназначен для введения млекопитающим, предпочтительно человеку, в по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 дозировках.
Способы индуцирования CD8 Т-клеточной и/или гуморальной иммунной реакции.
Изобретение предлагает способы индуцирования CD8 Т-клеточной и/или гуморальной иммунной реакции у хозяина. В предпочтительных вариантах реализации изобретения способ включает проведение по меньшей мере одной, двух, трех, четырех или пяти иммунизаций млекопитающего, в том числе человека, рекомбинантным поксвирусом, предпочтительно MVA, содержащим промотор Pr13.5.
Введение хозяину.
Рекомбинантный поксвирус, предпочтительно MVA согласно настоящему изобретению, может применяться для лечения целого ряда млекопитающих, включая людей и даже людей с ослабленным иммунитетом. Таким образом, настоящее изобретение предлагает также фармацевтическую композицию и вакцину для индуцирования иммунной реакции у млекопитающего, в том числе человека.
В предпочтительном варианте реализации изобретения вакцина содержит рекомбинантный поксвирус, предпочтительно MVA, в интервале концентраций от 104 до 109 TCID50/мл (дозы, инфицирующей 50% культуры клеток), предпочтительно в интервале концентраций от 105 до 5x108 ТС1О50/мл, более предпочтительно в интервале концентраций от 106 до 108 TCID50/мл и наиболее предпочтительно в интервале концентраций от 107 до 108 TCID50/мл, в особенности 108 TCID50/мл.
Предпочтительная доза для вакцинации млекопитающего, предпочтительно человека, составляет от 106 до 109 TCID50, более предпочтительно 107 TCID50 или 108 TCID50, в особенности 108 TCID50.
Как правило, фармацевтическая композиция может включать один или более фармацевтически приемлемых и/или одобренных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерол, этанол, масло, увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества или подобные им. Подходящие носители обычно представляют собой крупные, медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полилактиды, полигликолиды, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или подобные им.
Для изготовления вакцин рекомбинантный поксвирус, предпочтительно MVA согласно настоящему изобретению, может быть превращен в физиологически приемлемую форму. Это может быть сделано на основе опыта изготовления поксвирусных вакцин, которые применялись для противооспенной вакцинации (как описано Stickl et al., 1974).
Например, очищенный вирус может храниться при -80°С с титром, составляющим 5x108 TCID50/мл, в смеси с примерно 10 мМ Трис, 140 мМ NaCl, pH 7,4. Для изготовления вакцины для инъекции можно, например, лиофилизировать 102-108 вирусных частиц в 100 мкл - 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно стеклянной ампуле. Кроме того, вакцина для инъекции может производиться путем ступенчатой лиофилизации вируса в лекарственном препарате. Лекарственный препарат может содержать вспомогательные добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактоза или поливинилпирролидон или другие добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, сывороточный альбумин человека), пригодные для введения in vivo. Затем стеклянная ампула запаивается, после чего она может храниться при температурах от 4°С до комнатной в течение нескольких месяцев. При этом когда ампула не используется, предпочтительно хранить ее при температурах до -20°С.
В целях вакцинации или лечения лиофилизат может быть растворен в водном растворе, предпочтительно физиологическом растворе или буфере Трис, а затем применяться систематически или местно, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или любым другим путем введения, известным квалифицированному специалисту. Способ применения, доза и количество введений могут быть оптимизированы специалистами в данной области техники в известном порядке. Тем не менее чаще всего при вакцинации млекопитающего, предпочтительно человека, второе введение проводят примерно на вторую-шестую недели после первого введения вакцины. Третье, четвертое и последующие введения чаще всего проводятся примерно на вторую-шестую недели после предыдущего введения.
Настоящее изобретение предлагает способы иммунизации млекопитающих, в том числе человека. В одном варианте реализации изобретения проводится иммунизация млекопитающих, в том числе крыс, кроликов, мышей и людей, включающая введение дозы рекомбинантного MVA млекопитающему, предпочтительно человеку. В одном варианте реализации изобретения первая доза содержит 108 TCID50 рекомбинантного вируса MVA, а вторая и дополнительные дозы (т.е. третья, четвертая, пятая и т.д.) содержат 108 TCID50 вируса. Введения могут проводиться в первой дозировке (для первичной иммунизации) и второй или дальнейших дозировке(ах) (для реиммунизации).
Иммунизация может быть проведена систематически или местно, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или любым другим путем введения, известным квалифицированному специалисту.
- 9 045254
CD8 Т-клеточные и гуморальные иммунные реакции.
Иммунизации рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении, могут индуцировать устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию. В предпочтительных вариантах реализации изобретения после первой, второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизаций рекомбинантный MVA индуцирует у млекопитающего, предпочтительно человека, устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген, более интенсивную, чем CD8 Т-клеточная реакция на иммунодоминантную вирусную CD8 Т-клеточную антигенную детерминанту, кодируемую вектором MVA, например, TSYKFESV (SEQ ID NO: 5). В предпочтительном варианте реализации изобретения после первой, второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизаций у млекопитающего, предпочтительно человека, индуцируется иммунодоминантная Т-клеточная реакция на кодируемый антиген. В предпочтительном варианте реализации изобретения после второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизаций рекомбинантный MVA индуцирует у млекопитающего, предпочтительно человека, CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген, затрагивающую по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30 или 35% от общего количества CD8 Т-клеток. В предпочтительном варианте реализации изобретения после второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизации рекомбинантный MVA усиливает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз, т.е. от 1 до 2, 3, 4, 5 или 10% от общего количества CD8 Т-клеток), по сравнению с реакцией на кодируемый антиген после однократного введения или усиливает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз, по сравнению с Т-клеточной реакцией на вирусный антиген (например, B8R). В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомбинантный MVA вызывает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз более сильную, чем Т-клеточная реакция на вирусный антиген (например, B8R) после однократного введения. В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения CD8 Т-клеточная реакция на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, значительно усиливается вследствие 2, 3, 4 или 5 и т.д. иммунизаций, по сравнению с реакцией на поздний вирусный антиген (например, B8R).
Интенсивность CD8 Т-клеточной реакции может быть определена, например, путем отбора примерно 100-120 мкл крови в FACS/гепариновый буфер. МКПК могут быть получены путем лизиса эритроцитов с помощью лизирующего буфера для ККТ. Затем может быть проведено одновременное окрашивание OVA- и B8R-специфических CD8 Т-клеток в образцах МКПК с помощью анти-CD8α-FITC, CD44-PerCPCy5.5 и декстрамеров МНС I класса, образующих комплекс с соответствующими Н-2КЬсвязывающими пептидами: SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) или TSYKFESV (SEQ ID NO: 5). Декстрамер МНС I класса SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) может быть помечен РЕ, а декстрамер TSYKFESV (SEQ ID NO: 5) АРС. Окрашенные клетки могут анализироваться с помощью проточной цитометрии в системе BD Biosciences BD LSR II. Возможно получать по десять тысяч CD8+ Т-клеток в каждом образце.
Кроме того, интенсивность CD8 Т-клеточной реакции может быть определена путем отбора крови у иммунизированного млекопитающего, предпочтительно человека, и отделения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Они могут быть ресуспендированы в питательной среде, содержащей 5 мкг/мл брефелдина A (BFA, GolgiPlug, BD Biosciences) и 1 мкМ тестируемых пептидов, включая пептиды против иммунодоминантных антигенных детерминант MVA (т.е. TSYKFESV; SEQ ID NO: 5) (B8R) и пептиды, происходящие от экспрессируемого неоантигена. Затем МКПК можно инкубировать в течение 5 ч при 37°С в 5% CO2, собирать, ресуспендировать в 3 мл холодного ФСБ/10% ФТС/2 мМ ЭДТК и оставлять на ночь при 4°С. На следующий день МКПК могут быть окрашены антителами антиCD8a-Pac-Blue (клон 53-6.7), анти-CD62L-PE-Cy7, анти-CD44-АРС-А1еха 750 и анти-CD4-PerCP-Су5.5 (все антитела от BD Biosciences). МКПК можно инкубировать с указанными антителами в необходимых разведениях в течение 30 мин при 4°С в темноте. После промывки клетки могут быть фиксированы и пермеабилизированы с помощью набора Cytofix/Cytoperm™ Plus (BD Biosciences) согласно инструкциям производителя. После промывки МКПК может быть проведено окрашивание внутриклеточного интерферона-γ (IFN-γ) с помощью FITC-конъюгированного анти-I FN-у антитела (BD biosciences), разведенного в пермеабилизирующем буфере для отмывки (BD Biosciences). Окрашенные клетки могут анализироваться с помощью проточной цитометрии.
Иммунизации рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении, могут индуцировать устойчивую гуморальную иммунную реакцию. Гуморальные иммунные реакции могут быть оценены с помощью твердофазного ИФА.
В рамках настоящего изобретения устойчивая CD8 Т-клеточная реакция подразумевает больший процент неоантиген-специфических CD8 Т-клеток, чем процент, который наблюдается для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (5' AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAA 3'; SEQ ID NO: 6), после однократной иммунизации. В некоторых вариантах реализации изобретения при CD8 Т-клеточной реакции наблюдается по меньшей мере в 1,5 или 2 раза больше неоантиген-специфических CD8 Т-клеток, чем для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID NO: 6), после однократной иммунизации.
- 10 045254
В рамках настоящего изобретения устойчивая гуморальная иммунная реакция подразумевает титр антител, более высокий, чем титр антител, наблюдаемый для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID NO: 6), после однократной иммунизации. В некоторых вариантах реализации изобретения титр антител по меньшей мере в 1,5 или 2 раза больше, чем титр антител, наблюдаемый для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID NO: 6), после однократной иммунизации.
Тип индуцируемой рекомбинантным MVA реакции на неоантиген - устойчивая CD8 Т-клеточная реакция или устойчивая гуморальная иммунная реакция - может быть определен, как описано ниже в примерах. Например, как MVA13.5 short, так и MVA13.5 long индуцируют устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию, как определено в настоящем документе. MVA13.5 long индуцирует устойчивую гуморальную иммунную реакцию, как определено в настоящем документе.
Несмотря на то что способ предпочтительно включает однократное введение вектора, в некоторых вариантах реализации изобретения могут проводиться две, три, четыре, пять, шесть, семь или более иммунизаций млекопитающего, предпочтительно человека, рекомбинантным MVA.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения кодируемый антиген представляет собой бактериальный, вирусный или опухолевый антиген. В предпочтительном варианте реализации изобретения антиген является чужеродным антигеном для млекопитающего, в том числе человека.
Примеры
Пример 1. Конструирование MVA-рекомбинантов.
Клетки HeLa инфицировали MVA-BN при множественности заражения (MOI), составляющей 10 (10 TCID50 на клетку), а на 2- и 8-й час от начала инфекции получали тотальную РНК. Синтезировали специфические праймеры к различным ORF MVA и проводили ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (FirstChoice® RLM-RACE Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germany) для получения ПЦРпродуктов, соответствующих РНК MVA, кодирующим эти ORF. ПЦР-продукты былы секвенированы для определения сайтов инициации транскрипции. Исходя из этих данных были определены промоторы для транскрипции РНК, кодирующих эти ORF. В MVA-конструкты были вставлены промоторы MVA для следующих ORF (Baur et al., Journal of Virology, vol. 84, (17): 8743-8752 (2010)) для контроля экспрессии гена овальбумина (OVA): MVA13.5 (CVA022; WR 018), MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185).
Пример 2. Промоторзависимые уровни экспрессии РНК in vitro.
Инфицирование клеток HeLa рекомбинантными вирусами MVA при MOI, составляющей 10, производилось с помощью прикрепления вирусов на льду в течение 1 ч. После прикрепления клетки промывали и собирали в нулевой момент времени (0 ч) или инкубировали при 37°С для сбора в другие моменты времени. Пробы отбирали на 0,5, 1, 2, 4 и 8 ч от начала инфекции. Клетки гомогенизировали, и экстрагировали тотальную РНК. РНК подвергали ДНКазному расщеплению, после чего с помощью олиго(dT)праймирования была синтезирована кДНК. Полученные образцы кДНК использовались в качестве матрицы для одновременной амплификации кДНК OVA и актина с помощью Taqman-qPCR. Реакцию проводили в циклере АВ7500 от Applied Biosystem. Результаты представлены на фиг. 3.
Пример 3. Промоторзависимые уровни белковой экспрессии in vitro.
Клетки HeLa культивировали в DMEM с добавлением 10% ФТС. Клетки HeLa инфицировали при MOI рекомбинантного вируса MVA, составляющей 10 (10 TCID50 на клетку). Инфицированные клетки отбирали на 1, 2, 4, 6, 8 и 24 ч от начала инфекции, фиксировали и пермеабилизировали. В половине клеток каждого образца проводили окрашивание белка OVA с помощью антител кролика к OVA цыпленка, а в другой половине проводили окрашивание антигенов MVA с помощью поликлональных антител кролика к VACV. Образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur (BD Biosciences) и программного обеспечения FlowJo. Результаты представлены на фиг. 4.
Пример 4. Иммунизации и забор крови у мышей.
В этом исследовании использовались группы мышей (С57/В16). В каждой группе проводили суммарно три иммунизации.
В качестве контроля иммунных реакций использовали ФСБ-инъецированную группу. Для оценки иммунных реакций в течение исследования отбирали кровь из хвостовой вены.
Мышей иммунизировали интраперитонеально при 108 TCID50 соответствующих вирусов MVA в растворе ФСБ (300 мкл, общий объем) на 0, 4 и 8 недели. Заборы крови для анализа Т-клеток проводили на первую неделю после каждой иммунизации, а заборы крови для анализа антител - на третью неделю после каждой иммунизации.
Пример 5. Окрашивание Т-клеток и определение антител.
У каждой мыши отбирали примерно 100-120 мкл крови в FACS/гепариновый буфер. МКПК получали путем лизиса эритроцитов с помощью лизирующего буфера для ККТ. Затем проводили одновременное окрашивание OVA- и В8R-специфических CD8 Т-клеток в образцах МКПК с помощью антиCD8a-FITC, CD44-PerCPCy5.5 и декстрамеров МНС I класса, образующих комплекс с соответствующими Н-2Kb-связывающими пептидами: SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) или TSYKFESV (SEQ ID NO: 5). Декстрамер МНС I класса SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) был помечен РЕ, а декстрамер TSYKFESV (SEQ ID NO: 5) - 11 045254
АРС. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии в системе BD Biosciences
BD LSR II. Получали по десять тысяч CD8+ Т-клеток в каждом образце. Результаты представлены на фиг. 5, 6.
Получали сыворотку из цельной крови. Для определения специфических антител проводили твердофазный ИФА овальбумина и твердофазный ИФА MVA (набор Serazym от Seramun Diagnostika GmbH, Heidesee, Germany). Результаты представлены на фиг. 7.
Claims (10)
1. Применение рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) для индукции мощного CD8 Т-клеточного ответа на неоантиген у человека, включающее проведение одного или более введений человеку указанного рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), причем рекомбинантный MVA содержит промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, причем промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере 1 копию второй нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 31 нуклеотида, которая имеет по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 1, и причем указанный промотор генерирует по меньшей мере в 1,5 раза больше неоантигенспецифических CD8 Т-клеток, чем генерируется с соответствующим MVA-конструктом, в котором промотор заменен промотором PrS, определяемым SEQ ID NO: 6, после однократной иммунизации.
2. Применение по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 копии последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей по меньшей мере 98% идентичности с SEQ ID NO: 1.
3. Применение по пп.1, 2, в котором промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 копии последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
4. Применение по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая имеет 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
5. Применение по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит нуклеотиды 15878-15755, показанные на фиг. 1.
6. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, в котором промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере 1 копию второй нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 31 нуклеотида, которая имеет по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 1, причем указанный промотор генерирует по меньшей мере в 1,5 раза больше неоантиген-специфических CD8 Т-клеток, чем генерируется с соответствующим MVA-конструктом, в котором промотор заменен промотором PrS, определяемым SEQ ID NO: 6, после однократной иммунизации.
7. Рекомбинантный MVA по п.6, в котором промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 копии последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей по меньшей мере 98% идентичности с SEQ ID NO: 1.
8. Рекомбинантный MVA по пп.6, 7, в котором промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 копии последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, имеющей 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
9. Рекомбинантный MVA по п.6, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 оснований, которая имеет 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
10. Рекомбинантный MVA по п.6, в котором промотор Pr13.5 содержит нуклеотиды 15878-15755, показанные на фиг. 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61/719,429 | 2012-10-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045254B1 true EA045254B1 (ru) | 2023-11-09 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11028130B2 (en) | PR13.5 promoter for robust T-cell and antibody responses | |
| US8394385B2 (en) | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines | |
| EP2864487B1 (en) | Poxviral vectors for low antibody response after a first priming immunization | |
| US9163237B2 (en) | Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements | |
| EA045254B1 (ru) | Промотор pr13.5 для устойчивых т-клеточных и гуморальных иммунных реакций | |
| AU2017228587B2 (en) | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic t cell response against antigens in replication deficient recombinant virus vaccines | |
| DK2864487T3 (en) | COPPER VIRUS VECTORS TO GET LOW ANTIBODY RESPONSE AFTER A FIRST PRIMING IMMUNIZATION |