CN1726276A - Alvac在禽胚胎干细胞上的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在禽胚胎干细胞上生产ALVAC病毒的方法以及包括用该方法制得的ALVAC病毒的组合物。

Description

ALVAC在禽胚胎干细胞上的生产
                      发明领域
本发明涉及利用禽胚胎干细胞生产ALVAC病毒的改良的方法。
                      发明背景
当前在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)上生产ALVAC疫苗的方法涉及处理许多含胚卵。胚胎解离后，在感染前将细胞接种到摇瓶中。通常，感染120个摇瓶需要约200个卵。使用生长在悬液中的连续细胞系允许抑制卵处理并且允许由20升生物发酵罐代替摇瓶。在对培养条件优化后，可期望提高细胞密度，由此提高最终的病毒产量。可用于该目的的一种合适的细胞系可以是生长在悬液中稳定的鸡胚胎成纤维细胞来源的细胞系。
禽胚胎细胞系已由一些不同的研究者生产。例如，Pettite等(North Carolina State Univ.；美国专利No.5,340,740)描述了通过在小鼠成纤维细胞饲养层存在下培养禽囊胚层细胞来开发禽胚胎干细胞。Pettite(美国专利No.5,656,479；WO 93/23528)还描述并要求保护表现胚胎干细胞表型的未分化禽细胞的禽细胞培养物。
Samarut等(Institut National de la Recherche Agronomique，等；U.S.Pat.No.6,114,168；WO 96/12793)描述了用于在CEF上使用特定培养基生产禽胚胎干细胞的方法。Bouquet，等(InstitutNational de la Recherche Agronomique；美国专利No.6,280,970B1；专利申请No.2001/0036656 A1，11.1，2001公开)描述了其基因组中包含SV40T抗原的转化的禽胚胎成纤维细胞。Samarut和Pain(美国专利申请No 2001/0019840 A1，9.6，2001公开)提及了用于生产禽ES细胞的培养基和用于在所述培养基中培养的ES细胞中生产蛋白的方法。而Han，等(Hanmi Pharm.Co.Ltd.；WO 00/47717)描述了用于通过在包含特定的生长因子和分化抑制因子的培养基中培养禽原始生殖细胞而开发禽胚胎生殖细胞系的方法。
已表明禽胚胎干细胞适于生产重组病毒。例如，Foster，等(Regents of Univ.Minnesota，美国专利No.5,672,485；5,879,924；5,985,642；5,879,924)描述了用于在来源于鸡胚胎成纤维细胞的稳定细胞系中培养病毒的方法。
Reilly，等(Board of Trustees operating Michigan StateUniversity；美国专利No.5,989,805；WO 99/24068)提及了经化学诱变剂修饰的鸡胚胎干细胞生产Marek′s病毒、猪流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、鸡痘病毒、鸽痘病毒、金丝雀痘病毒、鹦鹉疱疹病毒、鸽疱疹病毒、隼疱疹病毒。新城疫病毒，传染性粘液囊病病毒、传染性支气管病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽腺病毒以及禽多瘤病毒的用途。Coussens，等(Board ofTrustees operating Michigan State University；美国专利No.5,827,738；5,833,980)也提及了Marek′s病病毒在胚胎干细胞中的增殖。Bouquet，等(Institut National de 1a RechercheAgronomique；美国专利No.6,280,970 B1；专利申请No.2001/0036656 A1，11.1，2001公开)描述了用于通过将SV40 T抗原整合入基因组中而转化的禽胚胎成纤维细胞来生产病毒的方法。
在本领域中需要用于生产基于ALVAC疫苗的改良方法。此处提供了一种这样的方法，它提供了使用生产在悬浮液中的禽胚胎干细胞来生产ALVAC载体的方法。该方法提供了产量和安全的优点。本发明的重要部分如下所述。
发明概要
本发明提供了用于通过在禽胚胎干细胞中培养ALVAC病毒以及从细胞收集病毒而增殖ALVAC病毒、制备疫苗和将疫苗提供给宿主的方法。优选的细胞为EB1或EB14细胞。在一些实施方案中，病毒在其基因组中带有编码免疫原的外源DNA，其在已给予病毒的宿主中的表达引起保护性的免疫应答。
                          附图简述
图1.细胞对DMEM/F12培养基的逐渐适应。
图2.测试1的细胞培养物分析。
图3.测试1的另外的细胞培养物分析。
图4.用vCP205进行的EB1感染。
                       发明详述
本发明提供了用于在胚胎干细胞上培养ALVAC病毒的新方法。本申请中所有引用的参考文献作为参考被引入。
痘病毒是一种有效的表达载体(Smith，等1983，Gene，25(1)：21-8；Moss，等1992，Biotechnology，20：345-62；Moss，等1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38；Moss，等1991.Science，252：1662-1667)。金丝雀痘病毒ALVAC是一种用于在宿主细胞中表达外源DNA序列的特别有用的病毒。基于ALVAC的重组病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)特别适于实施本发明(参见，例如，美国专利No.5,756,103)。ALVAC(2)除了其基因组包括在牛痘启动子控制下的牛痘E3L和K3L基因外，与ALVAC(1)是一致的(美国专利No.6,130,066；Beattie等，1995a，1995b，1991；Chang等，1992；Davies等，1993)。已证实ALVAC(1)和ALVAC(2)均在表达外源DNA中是有用的，如TAs(Tartaglia等，1993a，b；美国专利No.5,833,975)。ALVAC已根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养物保藏所(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC登录号VR-2547。
ALVAC已证实对在宿主中表达外源DNA序列是有用的(参见，例如，美国专利No.5,756,102；5,833,975；5,843,456；5,858,373；5,863,542；5942235；5989561；5997878；6265189；6267965；6309647；6541458；6596279；和6632438)。在实施本发明中，ALVAC可以以天然状态或以包含编码蛋白如抗原的外源DNA的重组体形式培养。特别有用的抗原包括那些抗原，其源自在人体中引起疾病的病原体(即，人病原体)如细菌、真菌，或病毒，除此之外，或是源自肿瘤的抗原(即，肿瘤或肿瘤相关抗原)。许多这样的抗原在本领域中是已知的并且适于实施本发明。ALVAC载体还包括免疫共刺激分子如B7.1等。本发明进一步包括在药学可接受的稀释剂中包含ALVAC载体的组合物。还涉及所述组合物对需要免疫的动物或人宿主的给药。
在一个实施方案中，本发明证实在源自禽胚胎干细胞的连续的、非致瘤的禽细胞上生产ALVAC病毒是可能的。用于该目的的合适细胞已在例如，美国专利No.5,340,740；5,656,479；5,672,485；5,879,924；5,985,642；5,989,805；6,114,168；6,280,970 B1；美国专利申请No.2001/0036656 A1；US2001/0019840 A1；和国际申请WO 93/23528；WO 96/12793；WO 99/24068；WO 00/47717；FR 02/02945；和WO 03/07661中描述。在一些实施方案中，所述细胞包括，例如，EB1、EB2、EB3、EB4、EB5和EB14细胞(如FR02/02945和WO 03/07661所述)。这些细胞从胚胎发育的很早期获得并且呈现干细胞表型。细胞在其天然状态下是未进行遗传修饰的并且被培养在悬液中。在一个实施方案中，细胞为从VIVALISSA(法国；FR 02/02945和WO 03/07661)获得的EB1细胞。在第二个实施方案中细胞为从VIVALIS SA(FR 02/02945和WO 03/07661)获得的EB14细胞。EB1和EB14细胞为对禽胚胎干细胞的早期扩增。所述这些合适的细胞包括在术语“禽胚胎干细胞系”(“AES”)的定义中。在本领域已知的任何所述细胞，连同其他AES，均适于实施本发明。
从下列作为例证给出的实施例中可以更好地理解本发明及其许多优点。
                          实施例
                          实施例1
                       材料与方法
A.细胞和病毒
从Vivalis收到处于p139(05.2001)或p148(07.2001)的EB1细胞(2×50×10E6细胞)。给培养基(改变的McCoy 5％和0％SVF)提供细胞。所有感染使用#362，澄清的(滴度7.9logTCID50/ml)、纯化的(蔗糖垫+梯度，滴度8.5log TCID 50/ml)或半纯化的(蔗糖垫，滴度9.2logTCID50)的ALVAC vCP205进行(ATCC No.VR-2557；美国专利No.5,863,542；HIV表达盒-牛痘H6启动子/HIV截短的包膜蛋白基因MN株，在ALVAC C3插入位点带有蛋白酶的I3L类群特异抗原基因)进行。
EB1细胞的系谱图如下显示：
Figure A20038010599700091
B.受感染细胞的处理
通过离心收集受感染细胞。将细胞片状沉淀物重悬入无血清培养基起始体积的1/20至1/20中，在培养基中短时超声并且再次离心获得澄清的裂解物。
C.病毒定量
为了研究在病毒制备物中ALVAC DNA的复制，我们用LightCyclerTM装置开发了一种ALVAC DNA定量PCR测定法。ALVAC DNA经纯化并用特异于编码结构VP8蛋白的K10R区域的引物在SYBRGreen染料存在时扩增。根据已知纯化的病毒DNA浓度建立的标准曲线，用于测定每个样品中的病毒DNA浓度。通过在LightCycler上，然后在SOP V100501/01上进行QPCR将ALVAC DNA定量，如下所述：
A. 设备：L2级区带；在2个隔离室中用2种不同染料包被的II型层流橱；带圆盘传送带的LightCycler(罗氏诊断Ref：2011468)；毛细管(罗氏诊断Ref：1909339)；离心机接合器(罗氏诊断Ref：1909312)；离心机(Eppendorf Ref：5415D)；圆盘传送带离心机(罗氏诊断Ref：2189682)；冰盒，薄壁96孔板模型M(COSTER Ref：6511)；微量试管，1.5ml(Eppendorf Ref：24077)；8道电子移液管，0.2-10μl(BIOHIT Ref：710200)；卡式试管头10、20、50、200、1000μl；以及10、20、50、200、1000μl手动移液管。
B. 产物：ALVAC标准DNA，50倍稀释：20至200,000拷贝；用于提取和定量的内参：ALVAC病毒，107TCID50/ml(约2×109拷贝/ml)；FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(罗氏诊断Ref：2239264)；H2O，无DNA酶和RNA酶(PROMEGA Ref：P1193)；样品：ALVAC DNA或ALVAC病毒；引物CPK1011(5μM)以及CPK1012(5μM)(参见下面)：
C. 预防措施：戴手套；Master Mix和DNA稀释必须在2个不同的橱中进行；SYBR Green需要避光保护并且在5℃±1℃保存；接合器需在冷却块中在5℃±1℃下预冷。
D. 步骤：
● 启动LightCycler：在样品制备前，用LightCycler软件，选择程序(FastStart 50℃)和定义样品数量，以及适当地作标记。
● 制备主要混合物制剂(冰上)：
○在第一个橱下在冰上制备反应混合物。使用1.5ml的反应试管，计算5个标准点、1个阴性点、1个参照点和n+1个样品所需的体积。
○将1b试管的60μl加入1a试管。用移液管混合(不要涡漩)。
  产物   [最终]   体积(μl)
  H2O(Promega)   11.6
  MgCl2   4mM   2.4
  CPK1011/CPK1012   0.5μM/0.5μM   2
  SYBR Green混合物   1×   2
○将18μl的混合物加入每个毛细管。随后将冷却块转移至第二个橱下。
● DNA制备：
○在冰上，通过毛细管用无DNA酶/RNA酶的H2O在微量试管或96孔板中稀释ALVAC DNA样品，以获得少于200,000拷贝(估算)。
○将ALVAC DNA标准样品从200,000稀释至20拷贝(10倍稀释)。
○将ALVAC参照DNA稀释100倍。
○在每个毛细管中，加入2μl DNA样品，或在阴性样品中加入2μl H2O。用塑料塞封口。在离心机上以100g离心接合器(包含毛细管)30s并且将毛细管放至圆盘传送带中。将包含样品的圆盘传送带放至LightCycler并且关上盖。
○启动运行。
● 通过LightCycler软件分析
○用于定量选择分析的方法：
●选择“配合点方法”
●步骤1：选择“算法基线”
●选择标准样品
●步骤2：校正噪音带以消除荧光背景
●步骤3：校正交叉线使得误差值低于0.1，而斜率
值在-3.3和-4.0之间(最佳理论值3.4)并且截距
值在30和40之间。在线的最优设置时，计算的标准值应该最接近他们的已知值。
○选择解链曲线分析用于Tm分析：
●步骤1：选择“带本底的线性”方法
●选择样品
●步骤2：分别在解链豌豆(pea)的起始和结束时校正指针。
●步骤3：选择“人工Tm”：软件计算样品的Tm。
● 对照
○对于所有样品，基线荧光值应该接近0
○两个参数允许对标准曲线的验证。第一个是应该低于0.1的误差。第二个是二级方程式，其斜率值包括在-3.3至-4.0之间(最佳理论值3.4)而截距值在30和40之间。
○PCR产物的解链曲线允许控制引物的特异性：Tm值通常约为78+/-1℃。也可在琼脂糖凝胶电泳上对特异性进行控制：仅一种产物将被扩增，在110bp处。
○内参用于控制DNA提取的质量。
感染效价通过标准的PFU测定法测量。
                         实施例2
                    EB1细胞的生长优化
在使用前，分析细胞以优化生长条件。如上所述，EB1细胞由VIVALI S在特定改良的培养基McCoy-5％FCS中提供。测试两个参数FCS(2.5％对5％)和CO2(0％对5％)对EB1细胞生长的影响。还测试了该细胞对DMEM-F12的适应。对于每个条件，计算世代时间。
为了进行测试，在所选条件下以104细胞/ml起始浓度给旋转器接种并且在37℃振荡孵育。培养基刚变为酸性时，在新鲜培养基中将细胞稀释至104至105细胞/ml浓度。通过台盼蓝排除法测定细胞存活率。在其中细胞存活率太低(即，＜70％)的每种情况中，进行Ficoll梯度以剔除死亡细胞(图上以箭头A和C表示的)。
通过用DMEM/F12(图上以箭头C表示)逐步稀释起始培养基(McCoy培养基)来完成细胞对DMEM/F12培养基的逐渐适应。根据G＝N/D计算对应于每天倍增(或子代)数目的世代时间(G)，其中D为培养天数而N为子代数目，其由方程式Cf＝Ci×2N确定，Cf和Ci分别为最终和起始细胞浓度。
通过未感染细胞的读数获得数据，并且以细胞的起始密度函数呈现。这些研究的结果概括在图1和表1中。
                                           表1
起始细胞浓度细胞/ml(×1000) 培养天数
  1   2   3
  4-20   1.09+/-0.42   1.24+/-0.61   nd
  20-100   1.4+/-0.14   1.05+/-0.21   1.18+/-0.17
  100-500   1.15+/-0.27   nd   0.19+/-0.14
从这些研究中，概括得出：
●EB1细胞在悬液中的平均倍增时间约为1.1子代/天；
●当在2.5％或5％FCS存在培养细胞时，生长曲线无显著性差异。
●细胞对Ficoll梯度离心敏感，并且条件应当被优化。
●在我们的条件中达到的最大细胞密度约为800,000细胞/ml。在更高密度时，培养基变酸，细胞生长停止，细胞快速凋亡和降解。
●EB1细胞可以以悬液形式在包含2.5％FCS的标准DMEM/F12培养基中生长，平均倍增时间为约每天1个子代。
●在旋转器中最大细胞密度在5×105和106细胞/ml之间，但生物发生器中的培养条件对提高生物量是有用的。
                             实施例3
                   在旋转器中EB1细胞的感染
A.测试1
将DMEM-F12-0％FCS(起始密度：4×105细胞/ml)中的100ml EB1细胞(P138)与澄清的ALVAC-HIV vCP205(感染指数为0.1)制备物在37℃孵育1小时。随后将培养物用等体积的改良的McCOY5A-5％FCS稀释(最终细胞密度：2×105细胞/ml)，并且在振荡(旋转器)和5％CO2下37℃孵育。在感染后48和96小时时收集细胞级分和培养物液体，并且分析感染性病毒(CEPs上的PFU测定法)和病毒DNA含量(qPCR)。在每个时间点，分析20ml培养物。离心后，收集悬浮碎片直接用于定量。在超声处理和定量前，将对应于细胞级分的片状沉淀物重悬入1ml(起始体积的1∶20)的Tris 10mM pH9中。效价以每ml(左列)或每级分(右列)表示。通过加入该2个级分而计算在旋转器中生产的总病毒物质：总量＝(S/ml×200)+(C/ml×10)。通过将该结果除以200而获得每ml的总值。该测试的结果在表2中显示。
                          表2
  旋转器48小时   旋转器96小时
  Log GEQ细胞级分上清液总量   /ml6.25*4.755.37   /级分7.557.047.67   /ml5.76*6.426.43   /级分7.078.728.73
  GEQ/细胞           1.2             13.4
  Log PFU细胞级分上清液总量   /ml4.95*4.304.45   /级分6.256.606.75   /ml4.94*6.266.27   /级分6.258.568.57
  PFU/细胞           0.14             9.3
*以初始体积的1∶20浓缩细胞后估测的效价
B.测试2
将DMEM-F12-0％FCS(起始密度：5.6×105细胞/ml)悬液中的22.5ml细胞(P138)与澄清的ALVAC-HIV vCP205(m.o.i0.1)制剂在37℃孵育1小时。随后将培养物用等体积改良的McCOY5A-5％FCS稀释(最终细胞密度：2.8×105细胞/ml)，并且在振荡(旋转器)和5％CO2下在37℃下孵育。在感染后50、74和96小时时收集细胞级分和培养物液体，并且分析感染性病毒(PFU测定法)和病毒的DNA含量(qPCR)。细胞培养物分析如上面测试1所述的方式进行。测试的结果概括在表3中。
                                             表3
         50小时           74小时            97小时
  Log GEQ细胞级分上清液总量   /ml6.89*6.056.28   /级分7.547.707.93   /ml7.15*6.546.69   /级分7.808.208.35   /ml7.31*6.967.05   /级分7.978.618.70
  GEQ/细胞           30.4             80             179
  Log PFU细胞级分上清液总量   /ml6.40*5.565.78   /级分7.057.217.44   /ml6.37*5.85.94   /级分7.027.457.60   /ml5.99*6.296.31   /级分6.647.947.96
  PFU/细胞            2.2             3.2             7.2
*以初始体积的1∶5浓缩细胞后估测的效价
C.测试3
在改良的McCOY 5A培养基-0％FCS的最小体积(5ml)中以0.1的感染复数感染p148EB1细胞，并且以最终密度1.5×105细胞/ml将其稀释在200ml改良的McCoy培养基2％FCS中。重复进行试验(旋转器A和B)，用半纯化的(蔗糖垫，旋转器A)或纯化的(蔗糖垫+梯度，旋转器B)vCP205(#363)制剂感染细胞。在时间点24、48、72和116小时时定量测定细胞级分和受感染细胞的上清液中的病毒DNA和感染性病毒。在旋转器A和B间在感染后未获得无显著性差异。如上面测试1所述的对细胞培养物进行分析。测试的结果概括在表4和5以及图2和3中。平行地测量细胞存活率，显示在图4中。
                                          表4
                                    ×10E6细胞/ml
                细胞数目               细胞％
  感染后的小时数 A B 平均值 A B 平均值
  0244872116   31.43830.2202.75   31.4422720.62.75   31.44028.620.32.75   100.0121.096.263.78.8   100.0133.886.065.68.8   100.0127.491.164.68.8
旋转器A
Log GEQ细胞级分上清液GEQ总量GEQ/细胞 24 48 72 116
  /ml5.934.85.17   /级分7.237.17.470.9   /ml5.976.036.07   /级分7.278.338.277.4   /ml7.286.396.64   /级分8.588.698.9427.7   /ml6.896.186.36   /级分8.198.488.6614.6
  Log PFU细胞级分上清液PFU总量PFU/细胞   /ml5.94.45.43   /级分7.26.736.730.2   /ml5.75.95.91   /级分78.218.215.2   /ml6.135.65.56   /级分7.437.867.862.3   /ml6.605.605.59   /级分7.97.897.892.5
旋转器B
Log GEQ细胞级分上清液GEQ总量GEQ/细胞             24             48              72              116
  /ml5.864.825.14   /级分7.167.127.440.9   /ml6.075.675.77   /级分7.387.978.073.7   /ml7.196.216.50   /级分8.498.518.8020.1   /ml6.996.436.56   /级分8.298.738.6623.3
  Log PFU细胞级分上清液PFU总量PFU/细胞   /ml5.565.34.26   /级分6.867.567.561.2   /ml5.915.845.84   /级分7.218.148.144.4   /ml6.195.25.20   /级分7.497.57.501.0   /ml6.505.505.51   /级分7.87.817.812.1
与平均比率上清液/细胞相关的病毒(旋转器A和B)
比率＝[PFU/GEQ培养基]/[PFU/GEQ细胞级分]
                                                            表5
                                                    平均值旋转器[A，B]/ml
Log GEQ细包级分上清液GEQ总量             24h              48h              72h               116h
  /ml5.90*4.815.16   /级分7.207.117.46   /ml6.02*5.855.92   /级分7.338.158.22   /ml7.24*6.306.57   /级分8.548.608.87   /ml6.94*6.316.46   /级分8.248.618.76
  GEQ/细胞             0.91              5.6              24               19
  Log  PFU细胞级分上清液PFU总量   /ml5.73*4.854.84   /级分7.037.157.15   /ml5.81*5.875.87   /级分7.118.188.18   /ml6.16*5.405.38   /级分7.467.687.68   /ml6.55*5.555.55   /级分7.857.857.85
  PFU/细包              0.4              4.8              1.5               2.3
*以初始体积的1∶20浓缩细胞后估测的效价。
D.在静止条件下感染，没有振荡(烧瓶)
给75cm2培养瓶接种在总体积为50ml的DMEM-F12中的无FCS的3×105细胞，并且用vCP205以0.1m.o.i.在37℃，5％CO2下感染48小时。收集培养物液体和细胞级分且定量感染性病毒(PFU测定法)和病毒DNA(qPCR)。测试结果概括在表6和图4中。
                                                     表6
        F75n*1           F75n*2          F75n*3          F75n*4
  Log GEQ细胞级分上清总量   /ml6.41*6.246.25   /级分6.417.947.95   /ml6.37*6.286.28   /级分6.377.977.98   /m16.43*6.266.26   /级分6.437.957.96   /ml6.37*6.256.25   /级分6.377.947.96
  GEQ/细胞            30              32            30             30
  Log  PFU细胞级分上清总量   /ml4.37*4.454.46   /级分4.376.156.16   /ml4.31*4.614.61   /级分4.316.316.31   /ml4.43*4.434.44   /级分4.436.136.14   /ml4.52*4.334.34   /级分4.526.036.04
  PFU/细胞           0.5              0.7             0.5             0.4
*将细胞浓缩为1ml后测定的效价(初始体积的1∶50)
从该研究中得到如下结论：
●当在旋转器中而不是在烧瓶中培养细胞时病毒产量更高(平均值：5PFU/ml对0.5PFU/ml)；
●平均PFU效价/细胞：6.3(相对于如由vCP 205#S 3317、#S3292、#3134、#LST011和#LP012计算的平均值所确定的CEPs生长病毒的2.5TCID 50/细胞)；
●平均GEQ效价/细胞：105(相对于CEPs生长的vCP205的125GEQ/细胞)。作为比较，在鸡胚胎成纤维细胞中病毒产量通常为约2.5TCID 50/细胞(5至20PFU)，相应于125GEQ/细胞；
●在Mc Coy培养基：DMEM/F12(1∶1)2.5％FCS中，最大效价(感染效价和基因组效价)在感染后72至97小时时达到。在McCoy培养基2.5％FCS中，基因组效价增加直到感染后116小时，而感染效价在感染后48小时时是稳定；
●在测试1和2中，病毒主要从细胞培养物上清液中回收，其最可能是细胞裂解的结果；
●EB1细胞以与CEPs类似的产量复制ALVAC vCP205；以及
●不经优化，在6PFU/细胞的病毒产量和5×105细胞/ml细胞密度的基础上，120个摇瓶的标准生产过程可以被一个20升的生物发生器代替。
虽然结合优选的实施方案对本发明进行了描述，可以理解的是本领域技术人员可以想到多种变化和改进。因此，随附的权利要求试图涵盖所有在本发明所要求保护的范围内进行的等效变化。

Claims (30)

1.一种用于繁殖ALVAC病毒的方法，包括：(a)用ALVAC病毒感染一种或多种禽胚胎干细胞；(b)培养感染的禽胚胎干细胞以生产病毒；(c)分离病毒。
2.权利要求1的方法，其中所述的病毒在ALVAC基因组中包含外源DNA序列。
3.权利要求2的方法，其中外源DNA编码肿瘤抗原、源自人病原体的抗原或其片段。
4.权利要求3的方法，其中病原体为细菌、真菌或病毒病原体。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中外源DNA进一步编码一种共刺激分子。
6.权利要求5的方法，其中外源DNA编码共刺激分子B7.1。
7.一种用于繁殖病毒的方法，包括：(a)用ALVAC病毒感染源自禽胚胎干细胞的一种或多种细胞；(b)培养感染的细胞以生产病毒；(c)分离病毒。
8.权利要求7的方法，其中所述的细胞为EB1或EB14细胞。
9.权利要求7或8的方法，其中所述的病毒在ALVAC基因组中包含外源DNA序列。
10.权利要求9的方法，其中外源DNA编码肿瘤抗原、源自人病原体的抗原或其片段。
11.权利要求10的方法，其中病原体为细菌、真菌或病毒病原体。
12.权利要求7-11中任意一项的方法，其中外源DNA进一步编码一种共刺激分子。
13.权利要求12的方法，其中外源DNA编码共刺激分子B7.1。
14.权利要求1-13中任意一项的方法，其中ALVAC病毒为ALVAC(2)。
15.一种包括通过权利要求1-14中任意一项的方法生产的ALVAC病毒的组合物。
16.一种可用于生产用于治疗人类疾病的药物的组合物，该组合物包括通过权利要求1-14中任意一项的方法生产的ALVAC病毒。
17.一种用于制备免疫原性组合物的方法，包括：(a)用ALVAC病毒感染禽胚胎干细胞，该病毒在ALVAC基因组内包括至少一种编码人肿瘤抗原、源自人病原体的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培养感染的细胞以生产病毒；(c)从培养的细胞中收集病毒；以及，(d)使病毒经受至少一种下列的处理：(i)灭活病毒，(ii)加入药物可接受的载体或稀释剂，(iii)加入佐剂，或(iv)冷冻干燥。
18.权利要求17的方法，其中ALVAC病毒为ALVAC(2)。
19.一种包括通过权利要求17或18的方法生产的ALVAC病毒的组合物。
20.一种可用于生产用于治疗人类疾病的药物的组合物，该组合物包括通过权利要求17或18的方法生产的ALVAC病毒。
21.一种用于制备免疫原性组合物的方法，包括：(a)用ALVAC病毒感染源自禽胚胎干细胞的一种或多种细胞，该病毒在ALVAC基因组内包括至少一种编码人肿瘤抗原、源自人病原体的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培养感染的细胞以生产病毒；(c)从培养的细胞中收集病毒；以及，(d)使病毒经受至少一种下列的处理：(i)灭活病毒，(ii)加入药物可接受的载体或稀释剂，(iii)加入佐剂，或(iv)冷冻干燥。
22.权利要求17的方法，其中ALVAC病毒为ALVAC(2)。
23.权利要求21或22的方法，其中所述的细胞为EB1或EB14细胞。
24.一种包括通过权利要求21-23中任意一项的方法生产的ALVAC病毒的组合物。
25.一种可用于生产用于治疗人类疾病的药物的组合物，其包括通过权利要求21-24中任意一项的方法生产的ALVAC病毒。
26.一种用于给宿主提供疫苗的方法，包括：(a)用ALVAC病毒感染禽胚胎干细胞，该病毒在ALVAC基因组内包括至少一种编码人肿瘤抗原、源自人病原体的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培养感染的细胞以生产病毒；(c)从培养的细胞中收集病毒；(d)使病毒经受至少一种下列的处理：(i)灭活病毒，(ii)加入药物可接受的载体或稀释剂，(iii)加入佐剂，或(iv)冷冻干燥以生产疫苗组合物；以及(e)将疫苗组合物给药于宿主，由此在宿主中产生保护性免疫应答。
27.权利要求27的方法，其中所述的细胞为EB1或EB14细胞。
28.权利要求27或28的方法，其中ALVAC病毒是ALVAC(2)。
29.一种包括通过权利要求26-29中任意一项的方法生产的ALVAC病毒的组合物。
30.一种可用于生产用于治疗人类疾病的药物的组合物，其包括通过权利要求26-29中任意一项的方法生产的ALVAC病毒。
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