CN106399588B - 一种用于检测禽白血病病毒j亚群的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测禽白血病病毒J亚群(ALV‑J)的试剂盒，属于RT‑PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有一对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明还提供了检测禽白血病病毒J亚群的方法。本发明试剂盒和检测方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、通用性好、低成本的特点，可在6.5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，本发明为ALV‑J的早期快速诊断和开展分子流行病学调查提供技术手段，以更好地指导养禽生产中对该病的防控。

Description

一种用于检测禽白血病病毒J亚群的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测禽白血病病毒J亚群的试剂盒及其应用。
背景技术
禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Loueosis virus，ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类肿瘤性疾病的总称。根据宿主范围、病毒囊膜抗原差异、病毒干扰试验和基因组分子生物学特性，将ALV分为A～J 10个亚群。J亚群禽白血病毒(Avian Leukosis Viruss Subgroup J，ALV-J)是1991年首次从肉鸡中分离得到的一种新型禽白血病毒，其原型株为HPRSl03。ALV-J主要引起肉鸡发生髓细胞瘤变(ML)以及其它各种恶性肿瘤。基本所有类型的鸡对ALV-J都易感。近年来我国主要以ALV-J感染为主，占ALV感染鸡群的65-70％，且本病可垂直传播，给养禽业造成巨大危害。
根据病毒血清中和试验、在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、与相同或不同亚群成员的干扰模式、囊膜糖蛋白的特性以及基因组的分子生物学特性等，将禽白血病/肉瘤病毒划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚群。自然感染鸡群的只有A、B、C、D、E和J六个亚群。这六个亚群中，相对来说，J亚群与其它亚群间的抗原性差异最大，而且外源性J亚群的致病性和传染性最强，内源性ALV-J普遍存在生物体内，无致病性，通常不作为检测目标，一般ALV-J的检测指的是致病力较强的外源性ALV-J。
ALV-J属于转录病毒科、甲型反转录病毒属，病毒粒子呈球形，由外部囊膜和内部电子致密核心组成。编码反转录酶(RT)的pol基因位于核芯，该酶是前病毒DNA整合进宿主基因组所必需的。病毒的囊膜包含env基因编码的2个糖蛋白：表面糖蛋白(SU)gp85和穿膜蛋白(TM)gp37。SU是存在于病毒颗粒表面的棒状结构，决定病毒的亚群特异性，是病毒亚群特异性抗原。囊膜糖蛋白gp85位于病毒粒子表面呈球形结构，通过识别细胞膜上的特异性病毒受体与宿主细胞相互作用，是病毒的亚群特异性抗原，在免疫机能健全的鸡体内能够诱导特异性抗体产生。gp85蛋白参与病毒中和反应，决定病毒的亚群特异性和宿主范围。
传统的ALV-J检测方法为病理组织学检查、病毒分离和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ALV-J的靶细胞是骨髓细胞，ALV-J感染后形成肉眼可见的骨髓细胞瘤，经HE染色后，瘤细胞形态一致，有丰富的嗜酸性细胞浆。经典的ALV感染产生的是法氏囊肿瘤或淋巴细胞瘤，瘤细胞体积大，胞浆较少，呈嗜碱性染色。通过肿瘤鉴定和病毒学检查初步诊断ALV-J在鸡群中的感染，进一步可以通过病毒分离进行确诊。ALV-J在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长良好，但却不能在哺乳动物细胞培养物中复制或转化。将病鸡的血液、泄殖腔拭子、胚胎或羽髓材料经处理后接种于CEF上培养，ALV-J能在CEF上增殖，但是不产生细胞病变，分离得到的病毒可以与抗ALV-J的抗血清进行中和反应，但是该方法需要在实验室制备抵抗内源性疾病的CEF，不适合进行大批量样本的检测，而且ALV-J基因变快，其抗原性不断发生变化，需要筛选匹配的ALV-J特异性的血清进行中和试验，给检测增加了难度。
随着分子生物技术的飞速发展，RT-PCR被应用于ALV-J的检测中，其敏感性比ELISA高。Smith EJ等通过设计E元件和3’LTR特异性的引物，建立了特异性检测ALV-J前病毒DNA的PCR扩增方法，由于其灵敏性和特异性高，可以替代常规的病毒分离。研究表明，用特异性引物对ALV-J进行RT-PCR扩增不失为一种快速、准确的检测方法，该方法省时省力，不仅能用于养殖场中ALV-J的快速检测，还可以用于生物制品、SPF鸡胚、家禽肉制品等的ALV-J快速检测。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于检测禽白血病病毒J亚群的特异性引物。
本发明的第二个目的在于提供检测禽白血病病毒J亚群的试剂盒。
本发明以HLJ13SH01(GenBank登录号为KM376510)基因组序列作为参考设计引物，可特异性扩增ALV-J env基因序列，其上游引物序列位于pol基因的末端，下游引物位于gp85基因的末端，扩增长度约1091bp的序列，上游引物在5296nt-5315nt之间，下游引物在6363nt-6383nt之间。在众多备选的引物中，经过多次筛选，比对试验，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物对。
本发明提供的优选的特异性引物对，其序列为：
上游引物：5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物：5’-GGTAAAGTTAGGAGAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.2)。
提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为禽白血病病毒J亚群阳性，否则为阴性。
本发明提供了上述特异性引物对在制备检测禽白血病病毒J亚群试剂盒中的应用。
本发明提供了上述特异性引物对在禽类生物制品质量控制中的应用。
含有SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对的检测试剂属于本发明的保护范围。
含有SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。
进一步地，本发明的试剂盒其PCR阶段的工作程序为：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
本发明的上述试剂盒是对待测样本进行RT-PCR检测后，扩增产物若有1091bp大小的条带，则待测样本中含有禽白血病病毒J亚群。
本发明还提供了一种检测禽白血病病毒J亚群的非诊断目的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)利用SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对对步骤(1)的cDNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断待测样本中是否有禽白血病病毒J亚群。
其中，步骤(2)中阳性样本扩增的目的片段为1091bp。
本发明的优点在于，1)扩增的目的片段位于ALV-J env基因的高度保守区，长度为1091bp，敏感性好、操作方便、对的ALV-J能较好检出；2)将ALV-J病毒样本cDNA进行10倍系列稀释，发现进行10000倍稀释后利用本方法仍能检测到ALV-J特异性条带，表明该方法具有较高的灵敏度；3)利用本方法只能扩增出外源性ALV-J，降低内源性ALV-J对检测结果的干扰，提高检测效率；4)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒、传染性喉气管炎病毒、禽白血病A//B亚群、禽网状内皮组织增生病病毒、马立克氏病毒和禽传染性贫血病病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；5)本发明方法适用于养禽生产中进行ALV-J的检测。由于J亚群禽白血病属免疫抑制疾病，可垂直传播，因此疫苗、SPF鸡胚等生物制品均需对其进行检测，本方法适用于对ALV-J大批量样品的检测。试验证明此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，可在6.5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，克服了传统检测方法耗时较长的缺点，可为ALV-J的早期快速诊断提供技术手段，为做好鸡群白血病净化提供保障。
附图说明
图1是最佳扩增引物筛选电泳结果。点样顺序为M：Marker III；1：引物1(1091bp)；2：引物2(1147bp)；3：引物3(981bp)。
图2是RT-PCR反应最佳退火温度筛选电泳结果。点样顺序为M：Marker III；1：49℃；2：52℃；3：54℃；4：55℃；5：56℃；6：58℃。
图3是RT-PCR反应最佳循环数筛选电泳结果。M：Marker III；1：28循环；2：29循环；3：30循环；4：31循环；5：32循环；6：33循环。
图4是该引物对ALV-J进行检测的电泳结果。点样顺序为M：DNA Maker III；P：阳性对照；N：阴性对照；1：样品1(2015年山东分离株)；2：样品2(2016年河北分离株)；3：样品3(2014年广东分离株)；4：样品4(2016年辽宁分离株)。
图5是对该引物对ALV-J的灵敏度电泳检测结果。点样顺序为M：DNA maker III；P：阳性对照；N：阴性对照；1：cDNA稀释10倍；2：cDNA稀释102倍；3：cDNA稀释103倍；4：cDNA稀释104倍；5：cDNA稀释105倍。
图6是对其它常见禽病病原进行检测的电泳结果。其中M：DNA Maker III；P：阳性对照；N：阴性对照；1：H5亚型禽流感病毒；2：H7亚型禽流感病毒；3：H9亚型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：传染性支气管炎病毒(IBV)；6：传染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽呼肠孤病毒(REOV)；8：禽腺病毒(FadV)；9：传染性喉气管炎病毒(ILTV)；10：禽白血病A亚群(ALV-A)；11：禽白血病B亚群(ALV-B)；12：禽网状内皮组织增生病病毒(REV)；13：马立克氏病毒(MDV)；14：禽传染性贫血病病毒(CAV)。
图7现有技术进行PCR特异性检测结果，样品顺序：M：Marker III；P：阳性对照；N：阴性对照；1：鸡胚尿囊液。
图8采用现有技术进行PCR特异性检测结果，样品顺序：M：
Marker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：鸡胚尿囊液。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参照仪器操作说明。LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；VS-1涡旋振荡器购自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S组织研磨震荡器购自鼎昊源科技有限公司。反转录酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍体积的反应缓冲液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和随机引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，购自北京爱普锐晟科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司。Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；HW·SYII-KP3型电热恒温水槽购自北京长风仪器仪表公司。
本发明实施例中选用的生物材料如下：禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒和禽传染性喉气管炎病毒，新城疫病毒BJ14(基因VI型)、La Sota(基因II型)、aSG10(基因VII型)、F48E8(基因IX型)均由中国农业大学动物医学院保藏和提供。
实施例1用于检测禽白血病病毒J亚群的特异性引物的设计
NCBI数据库中HLJ13SH01(GenBank登录号为KM376510)基因组序列作为参考，设计特异性引物。在众多备选的引物中(表1所示)，经过多次筛选，比对试验，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，经反复筛选和验证，最终获得优化后的引物对，各引物扩增电泳结果如图1所示。选择扩增目的条带最亮，无非特异性杂带的引物对1为最佳引物，其上游引物序列位于pol基因的末端，下游引物位于gp85基因的末端，扩增长度约1091bp的序列，上游引物在5296nt-5315nt之间，下游引物在6363nt-6383nt之间。
表1用于检测J亚群禽白血病病毒的备选引物序列
本发明提供的优选特异性引物对，其序列为：上游引物：5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物：5’-GGTAAAGTTAGGAGAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.2)。
实施例2检测J亚群禽白血病病毒的RT-PCR检测方法最佳退火温度的摸索
1、检测样品的预处理
(1)组织样品处理：取100mg脏器组织样品加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测分析。
(2)泄殖腔或口咽拭子样品处理：将拭子样品加入0.5ml灭菌生理盐水并用涡旋振荡器振荡混悬，样品悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。
2、样品总RNA的提取
参照Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen)说明书进行提取。
3、反转录为cDNA
在0.2ml离心管内加入下列成分：RNA溶液4μl，随机引物1μl，轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl，DEPC处理水7.5μl，轻轻混匀，37℃作用1h，得到样本cDNA。
4、PCR检测
利用实施例1最终确定的引物对进行聚合酶链式反应(PCR)，
在0.2ml离心管中加入下列成分：
轻轻混匀后，以不同的退火温度分别进行如下反应：94℃预变性5min，94℃45s，(49℃、52℃、54℃、55℃、56℃和58℃)45s，72℃70s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe，取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带长度为1091bp则证明待测样品为禽白血病病毒J亚群检测阳性，否则为检测阴性。
电泳结果如图2所示，55℃为扩增目的条带最亮，结合退火温度过高不利于引物与模板结合，所以选择该温度为最佳温度。
实施例3检测J亚群禽白血病病毒的RT-PCR检测方法最佳循环数摸索
检测样品的预处理、样品总RNA的提取、反转录为cDNA参见实施例2对应的方法。利用实施例1和2确定的条件，设计6个不同的循环数(28、29、30、31、32和33)对ALV-J进行RT-PCR。
在0.2ml离心管中加入成分参见实施例2。轻轻混匀后，采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后经过72℃10min延伸，PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe，取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带长度为1091bp则证明待测样品为禽白血病病毒J亚群检测阳性，否则为检测阴性。电泳结果如图3所示，30个循环数扩增目的条带条带与更多循环数亮度相似，且没有非特异性杂带，能节省时间、提高检测效率，因此选择其为最佳循环数。
实施例4检测禽白血病病毒J亚群的RT-PCR检测方法的建立
检测样品的预处理、样品总RNA的提取、反转录为cDNA参见实施例2对应的方法。在0.2ml离心管中加入成分参见实施例2。轻轻混匀后，采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后经过72℃10min延伸，PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe，取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带长度为1091bp则证明待测样品为禽白血病病毒J亚群检测阳性，否则为检测阴性。
利用上述方法对不同分离株的ALV-J进行检测，结果均有较好的检出，样品1(2015年山东分离株)；样品2(2016年河北分离株)；样品3(2014年广东分离株)；样品4(2016年辽宁分离株)如图4所示。
实施例5检测禽白血病病毒J亚群的RT-PCR检测方法的敏感性检测
按照实施例4建立的方法进行。
将cDNA溶液进行10倍系列稀释，稀释度为10、102、103、104和105倍，分别以稀释后的模板按如下体系进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃45s，55℃45s，72℃70s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带1091bp，如果扩增出目的条带则证明为禽白血病病毒J亚群检测阳性，否则为禽白血病病毒J亚群检测阴性。
利用上述方法对禽白血病病毒J亚群进行检测，结果显示对反转录的禽白血病病毒J亚群cDNA稀释104倍后，仍能检测到病毒DNA，如图5所示，表明本方法具有良好的敏感性。
实施例6检测禽白血病病毒J亚群的RT-PCR检测方法对禽常见病病原的特异性检测
1、利用实施例4建立方法对其它常见的禽病病原：禽白血病病毒A亚群、禽白血病病毒B亚群、禽流感病毒H5H7H9、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒、禽传染性喉气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、马立克氏病病毒和禽传染性贫血病病毒进行检测，结果如图3所示，结果显示，除阳性对照(ALV-J)外，其他实验对象的检测结果皆为阴性，表明本方法在检测禽类常见的其他病原体过程中，实施例4建立的方法针对禽白血病病毒J亚群具有良好的特异性。
2、与现有技术公开的检测ALV-J方法特异性的对比
现有技术公开了一种检测ALV-J的PCR方法，所采用的引物序列为：ALV-J-545-F：GGATGAGGTGACTAAGAAAG，ALV-J-545-R：CGAACCAAAGGTAACACACG。因SPF鸡胚和临床病料中通常携带内源性ALV-J，其不具有致病性，不做为检测目标，所以发明人采用上述引物进行了SPF鸡胚中外源性ALV-J检测，结果如图7所示，专利申报引物特异性好，仅能扩增出外源性ALV-J的目的片段，而不会扩增出鸡胚尿囊液中内源性白血病。如图8，与本发明实施例4的检测效果相比，该文献所用引物特异性差，能扩增出SPF鸡胚中内源性ALV-J，出现假阳性。将扩增出的阳性片段进行测序比对其与内源性ALV-J同源性最高。

Claims (9)

1.一种用于检测外源性禽白血病病毒J亚群的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的靶基因为禽白血病病毒J亚群env基因的保守序列，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
2.权利要求1所述特异性引物对在制备检测外源性禽白血病病毒J亚群试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述特异性引物对在禽类生物制品质量控制中的应用。
4.含有权利要求1所述特异性引物对的检测试剂。
5.含有权利要求1所述特异性引物对的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，对待测样本进行RT-PCR检测后，扩增产物若有1091bp大小的条带，则待测样本中含有外源性禽白血病病毒J亚群。
8.一种检测外源性禽白血病病毒J亚群的非诊断目的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)利用权利要求1所述特异性引物对对步骤(1)的cDNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断待测样本中是否有禽白血病病毒J亚群。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中阳性样本扩增的目的片段为1091bp。
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