CN104812894A - 新型mva病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型的改造安卡拉牛痘(MVA)病毒。本发明还涉及所述MVA病毒的培养方法以及所述MVA病毒的生产方法。进而，本发明涉及包含所述MVA病毒以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体的药物组合物。此外，本发明涉及包含所述MVA病毒的疫苗。另外，本发明涉及所述MVA病毒在医药方面的用途。

Description

新型MVA病毒及其用途

技术领域

本发明涉及新型的改造安卡拉牛痘(Modified Vaccinia Ankara，MVA)病毒。本发明还涉及所述MVA病毒的培养方法以及所述MVA病毒的生产方法。进而，本发明涉及包含所述MVA病毒及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体的药物组合物。此外，本发明涉及包含所述MVA病毒的疫苗。另外，本发明涉及所述MVA病毒在医药方面的用途。

背景技术

疫苗是可利用的最为有效的人类健康干预措施之一，针对非常广谱的感染性疾病发挥防护作用。然而，仍不能针对多种潜伏病原体和慢性病原体产生保护性免疫或治疗性免疫。主要引发抗体应答的传统方法还未成功。原因包括表位可能是易变的，经常被微生物诱饵遮蔽或保护，或者由于病原体以抗体无法接近的方式隐藏。

与使用灭活病毒体或纯化亚单位的免疫接种相比，活疫苗诱导还牵涉免疫系统的细胞区室(cellular compartment)的广泛应答。然而，由于免疫功能低下的个体数量的增加以及国际流动性的扩大，使用具有复制能力的毒株可能涉及诸如回复突变(reversion)为更多种病原体形式的风险(Zurbriggen等，2008，Appl Environ Microbiol 74，5608-5614)或者对疫苗的接受者和接触人员均造成严重的不良状况(Kemper等，2002，Eff Clin Pract 5，84-90；Parrino和Graham，2006，J Allergy Clin Immunol118，1320-1326)。

现代的载体化疫苗(Excler等，2010，Biologicals 38，511-521；Plotkin，2009，Clin Vaccine Immunol 16，1709-1719)将不能在人或动物接受者中复制的宿主受限载体(host-restricted vector)所固有的高度安全属性与减毒感染的优势结合起来。特别有前景的超减毒载体为宿主受限痘病毒，包括改造的安卡拉牛痘(MVA)病毒。超减毒痘病毒已在临床实验中显示出安全性(Cebere等，2006，Vaccine 24，417-425；Dorrell等，2007，Vaccine 25，3277-3283；Gilbert等，2006，Vaccine 24，4554-4561；Mayr，2003，Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26，423-430；Webster等，2005，Proc Natl Acad Sci U S A 102，4836-4841)，并且，所述超减毒痘病毒还是免疫应答的有效刺激物(Drillien等，2004，J Gen Virol 85，2167-2175；Liu等，2008，BMC Immunol 9，15；Ryan等，2007，Vaccine 25，3380-3390；Sutter和Moss，1992，Proc Natl Acad Sci U S A 89，10847-10851；Sutter等，1994，Vaccine 12，1032-1040)。特别地，MVA病毒与痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒属(Orthopoxvirus)的成员牛痘(Vaccinia)病毒相关。已通过将尿囊绒毛膜安卡拉牛痘(Chorioallantois Vaccinia Ankara，CVA)病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代516次产生MVA病毒。在作为生产基质的鸡源材料上反复传代的减毒过程中，MVA病毒在多个位点丧失了约15％的基因组DNA(Mayr和Munz，1964，Zentralbl Bakteriol Orig195，24-35；Meyer等，1991，J Gen Virol 72(Pt 5)，1031-1038)。分析确定了MVA病毒相对于野生型CVA毒株的基因组改变。识别出基因组DNA的六个主要缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)，共计31,000个碱基对(Meyer等，1991，J Gen Virol 72(Pt 5)，1031-1038)。其宿主细胞变得严格限于禽类细胞。虽然亲代牛痘病毒具有广泛的宿主范围，MVA病毒具有非常窄的宿主范围。例如，MVA在人类和非人灵长类细胞中不复制。在人HeLa细胞系中，复制阻断似乎发生在基因组组装中的限定步骤(Sancho等，2002，J Virol 76，8318-8334)。此外，HEK 293和Vero细胞系不是优选的生产体系。进一步显示了在多种动物模型中，获得的MVA病毒明显无毒(Mayr和Danner，1978，Dev Biol Stand 41，225-234)。此外，临床实验中测试了将MVA毒株作为疫苗针对人类天花病进行免疫(Mayr，2003，Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26，423-430)。这些研究涉及超过120,000个人，其中包括高风险患者，证明了与CVA相比，MVA在保持良好的免疫原性的同时，具有减弱的毒力或感染力。

然而，充足供应MVA病毒的要求仍具挑战性。一方面，由于MVA病毒在接受者体内以极低水平复制或完全不复制，必须以高剂量给予MVA病毒。另一方面，目前可用的MVA病毒生产体系耗时且昂贵，不能满足制药工业的需求。

如上所述，MVA的研究和生产依赖于禽类细胞。目前，适于禽类宿主的疫苗株仅在具胚的鸡卵或用此类卵制备的成纤维细胞上生产。该技术伴随进一步的缺点，包括原代动物源材料连续流入所要求的临床生产流程以及维持SPF(无特定病原体)供体群的成本。由于从收集具胚的卵到生产疫苗的时间短，在半成品(final bulk)上进行外源因子(extraneousagents)测试(Philipp和Kolla，2010，Biologicals 38，350-351)。偶尔地，当通过质量测试确认有污染时，必须丢弃整批疫苗(Enserink，2004，Science 306，385)。

近来，为促进发展中国家或新兴工业国家中的工业应用和疫苗项目，本发明的发明人设计并生产了完全容许(permissive)依赖于禽类基质的疫苗株的宿主细胞系(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)。他们还开发了针对此类病毒的高效、完全可扩展的化学上确定的(chemically-defined)生产流程(Jordan等，2011，Biologicals 39，50-58)。

在这里，本发明人利用手边的上述技术首次表征了在高度人工条件下、在完全容许同一超减毒病毒的细胞基质上的已适应的(adapted)超减毒MVA病毒的后代的稳定分离体，所述高度人工条件由在化学上确定的悬浮培养中生产病毒而施加。这是非常规实验，其结果是出乎预料的。正如病毒学原理(Principles of Virology，ISBN-10：1555814433)所描述的，连续传代的动机一般为使得病毒适应于初始的容许度(permissivity)低的基质：“可通过在除正常宿主以外的细胞中生长、或者通过在非生理温度下繁殖，选出毒力较小(减毒)的病毒。能够在这些选择性条件下更好繁殖的突变体在病毒复制过程中出现。对此类突变体进行分离、纯化并随后在合适模型中进行致病性测试，与其亲代相比，某些突变体可能具有较低的致病性。”

上述表征使得鉴别了结构蛋白中具有点突变的新型MVA病毒。该结果与在人工培养条件下的病毒繁殖、而不是在特定宿主细胞中进行选择相一致。与已知的MVA病毒株相比，该新型MVA病毒在化学上确定的悬浮培养中显示出有益性质，例如增加的感染活性以及在胞外空间中具有更多的感染单位。所述有益性质改进了所述MVA病毒的工业生产。具体而言，这允许高产量地生产该新型MVA病毒株。此外，可直接从无细胞上清液分离该新型MVA病毒株，方便了纯化，从而方便了生产所述MVA病毒的生物反应器的操作以及物流(logistic)。如此，降低了MVA病毒生产的成本。

发明内容

在第一方面，本发明涉及改造的安卡拉牛痘(MVA)病毒，所述病毒包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

在第二方面，本发明涉及第一方面所述的MVA病毒的基因组。

在第三方面，本发明涉及包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组的细胞。

在第四方面，本发明涉及第一方面所述的MVA病毒的培养方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供第三方面所述的细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；以及

(iii)分离所述MVA病毒。

在第五方面，本发明涉及第一方面所述的MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)用MVA病毒感染细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；

(iii)分离所述MVA病毒；以及

(iv)利用步骤(iii)中分离的所述MVA病毒重复步骤(i)至步骤(iii)，直至检测到包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

在第六方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。

在第七方面，本发明涉及疫苗，所述疫苗包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组。

在第八方面，本发明涉及第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组在医药方面的用途。

在第九方面，本发明涉及包含核酸序列的MVA病毒，其中，A3L基因和/或A9L基因功能性缺失。

在第十方面，本发明涉及包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因并表达所述基因的细胞。

在第十一方面，本发明涉及包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因的核酸分子，其中，所述基因可操作地连接至异源核酸序列。

在第十二方面，本发明涉及重组MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供细胞；

(ii)将第九方面所述的MVA病毒和第十一方面所述的核酸分子导入所述细胞；以及

(iii)在允许所述MVA病毒和所述核酸分子的核酸序列之间进行同源重组的条件下对所述细胞进行培养，从而获得所述重组MVA病毒。

对本发明的这一总结并未描述本发明的全部特征。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解的是，本发明并不局限于本文所述的特定的方法、方案和试剂，因为它们还可以有所变化。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅为所附的权利要求所限。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

优选地，本文使用的术语按如下文献的描述定义：“A multilingualglossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和H.著(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland。

本说明书全文引用了若干文献。不论在上文或下文中，本文引用的各文献(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明、GenBank提交序列登记号等)均通过引用的方式整体并入本文。在此不应解释为承认本发明无权借助在先发明而使本发明早于这些公开。

下面将描述本发明的要素。这些要素通过具体实施方式列出，然而，应当理解的是，可以任意方式和任意数量将其组合，从而创造其它实施方式。多方面描述的实施例和优选实施方式不应看作是将本发明仅仅限制为明确描述的实施方式。这种描述应当被理解为支持并且涵盖了将明确描述的实施方式与任意数量的公开和/或优选的要素进行组合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，应当认为本申请中描述的全部要素的任意排列和组合均已被本申请的描述公开。

本说明书和所附权利要求全文中，除非上下文另有要求，词语“包含/含有/包括(comprise)”及其变化形式例如“comprises”和“comprising”，将被理解为暗示囊括所说明的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或者其它整数组或步骤组。除非相关内容另有明确说明，本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一(个)(a/an)”以及“该/所述(the)”包括复数的情况。

本文使用的术语“减毒病毒”是指在待接受者(例如人或动物接受者)中具有削弱的毒力的病毒。此类性质可通过使得病毒适应于窄的温度范围或者窄的宿主范围以及其它人工复制环境(包括化学上确定的介质)来实现。在衍生自待接受者(例如人或动物接受者)的细胞或者从组织环境取出的细胞中，此类病毒的复制受到限制。该病毒可在待接受者体外(例如在容许的细胞培养物或实验动物中)复制至高滴度。减毒病毒株的实例是针对严重的麻疹疾病提供保护的Ender’s减毒麻疹病毒Edmonston株，或世界卫生组织(WHO)在1970年代开展的痘病根除运动中使用的牛痘病毒株。

本文使用的术语“高减毒病毒”是指在待接受者(例如人或动物接受者)中具有被阻断的毒力的病毒。此类性质可通过使得病毒适应于窄的温度范围或者窄的宿主范围以及其它人工复制环境(包括化学上确定的介质)来实现。在衍生自待接受者(例如人或动物接受者)的细胞或者从组织环境取出的细胞中，此类病毒的复制被阻断。该病毒可在待接受者体外(例如在容许的细胞/细胞培养物或实验动物中)复制至高滴度。本发明的MVA病毒为高减毒病毒。它在人或非人灵长类细胞中不复制。

本文使用的术语“宿主受限病毒”是指(仅仅或主要)在特定的宿主生物体内(例如在细胞、如禽类细胞中，或在动物、如实验动物体内)复制的病毒。在其它生物体内(例如在除禽类细胞外的其它细胞中)，宿主受限病毒不复制或仅以极低的水平复制。可通过在宿主生物体内(例如在禽类细胞中)对病毒进行“(连续)病毒传代”来获得宿主受限病毒。本发明的MVA病毒限于禽类细胞。它在人类细胞中不复制。

本文使用的术语“病毒传代”是指包含用病毒感染一系列宿主生物体的过程，所述宿主生物体例如为细胞或动物(例如实验动物)。每次使得病毒孵育一定时间，随后用孵育的病毒感染下一个宿主生物体。该过程也可定义为“连续病毒传代”。例如，连续病毒传代允许生成(高)减毒和/或宿主受限病毒。本发明的MVA病毒为高减毒病毒。该MVA病毒限于禽类细胞。它在人或非人灵长类细胞中不复制。

被术语“容许/容许的(permissive)”所限定的宿主生物体(例如细胞、如禽类细胞，或者动物、如实验动物)是指病毒能够回避所述生物体的防御、能够入侵细胞、在所述细胞中复制并从所述细胞逃逸。这通常在病毒调控了所述生物体和/或所述生物体的免疫系统的一种或数种细胞内源防御机制的情况下发生。

本文使用的术语“接受者”是指可接受病毒的受试者，例如可利用病毒进行免疫接种的受试者。受试者可为人或动物。所述动物可为哺乳类物种的成员，诸如犬科动物、猫科动物、狼、鼬属动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)、马科动物、牛科动物、绵羊、山羊、猪、蝙蝠(例如狐蝠科(megabat)或微型蝙蝠)或非人灵长类(例如猴，如类人猿)。特别地，本发明的MVA病毒在人或非人灵长类接受者体内不复制。

本文使用的术语“宿主生物体”是指可用于病毒生产和/或适应的生物体。宿主生物体可为细胞或动物(例如实验动物)。所述细胞可为禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，如鸭视网膜(CR)细胞)。所述动物，特别是实验动物，可为鸟类(如鸡、鹌鹑、鹅或鸭)、犬科动物、鼬属动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)、绵羊、山羊、猪、蝙蝠(例如狐蝠科或微型蝙蝠)或非人灵长类(例如猴，如类人猿)。特别地，本发明的MVA病毒在禽类细胞中(例如在鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞中)或鸟类体内(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭体内)复制。

本文使用的术语“感染”是指病毒在细胞内复制并产生病毒粒子的能力。可通过检测病毒负载或通过观测人或动物中的疾病进展来对感染性进行评估。

本文使用的术语“疫苗”是指能够被用于引发接受者(例如人或动物接受者)体内的保护性免疫的试剂。就有效性而言，疫苗能够在部分被免疫群体中引发免疫，而一些个体可能无法产生稳健或保护性的免疫应答，或者在一些情况下，无法产生任何免疫应答。这种无法产生可能源于接受者的遗传背景，或由于免疫缺陷状态(获得性免疫或先天性免疫的缺陷)或者免疫阻遏(例如由于化疗处理或使用免疫阻遏药物)。可在动物模型中确定疫苗效力。本发明的疫苗包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组。就这一方面而言，需要指出的是，MVA病毒本身可为疫苗。MVA病毒能够赋予针对痘病的保护。然而，所述病毒可进一步包含异源核酸序列，例如编码抗原、特别是抗原表位(可在接受者体内引发针对所述抗原、特别是抗原表位的额外的保护性免疫)的序列。也可将包含异源核酸序列的MVA病毒称为重组MVA病毒。

本文使用的术语“免疫接种(vaccination)”意味着用感染性病毒(例如所述感染性病毒的减毒或灭活形式)激发(challenge)接受者(例如人或动物接受者)以诱导特异性免疫。在本发明中，用第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组激发接受者，以诱导针对痘病的免疫。然而，在本发明的上下文中，术语“免疫接种”还涵盖了用进一步包含异源核酸序列的MVA病毒激发接受者。所述异源序列为可引发针对该序列的额外保护性免疫的序列。所述异源序列可编码抗原、特别是抗原表位。也可将包含异源核酸序列的MVA病毒称为重组MVA病毒。

对于所述病毒而言为异源的此类表位的实例涵盖了例如来自于其它病毒蛋白的表位，所述其它病毒例如为流感病毒(Influenza virus)、肝炎病毒(Hepatitis virus)(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒(Flavivirus)、副粘病毒(Paramyxovirus)、汉坦病毒(Hantavirus)或线状病毒(Filovirus)；或者衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白的表位。在将疫苗给予至接受者体内后，表位被表达并提呈至免疫系统，从而可诱导针对这些表位的特异性免疫应答。因此使得接受者对于含有该表位的蛋白免疫。

本文使用的术语“异源核酸序列”是指在天然状态下通常不与病毒(特别是本发明所述的MVA病毒)紧密结合的核酸序列。包含异源核酸序列的病毒也可称为重组病毒。

视情况而定，本文使用的术语“保护”意味着在接受者(例如人)中对疾病(例如痘病)的发展或持续进行预防或治疗或进行预防以及治疗。

本文使用的术语“保护性免疫”包含对于例如消除或减少病原体(例如病毒，如痘病毒)负载或被感染细胞而言、或者对于在被免疫(接种)的受试者中产生其它任何可测量的感染的缓和而言有效的体液(抗体)免疫或细胞免疫或者这两者。

如上所述，本发明的发明人表征了在高度人工条件下、在完全容许同一超减毒病毒的细胞基质上的已适应的超减毒MVA病毒的后代的稳定分离体，所述高度人工条件由在化学上确定的悬浮培养中生产病毒而施加。上述表征使得鉴别了结构蛋白中具有点突变的新型MVA病毒。与已知的MVA病毒株相比，该新型MVA病毒在化学上确定的悬浮培养中显示出有益性质，例如增加的感染活性以及在胞外空间中具有更多的感染单位。所述有益性质改进了所述MVA病毒的工业生产。具体而言，这允许高产量地生产该新型MVA病毒株。此外，可直接从无细胞上清液分离该新型MVA病毒株，方便了纯化，从而方便了生产所述MVA病毒的生物反应器的操作以及物流。如此，降低了MVA病毒生产的成本。

因此，本发明的第一方面涉及(突变的)改造的安卡拉牛痘(MVA)病毒，所述病毒包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物和/或所述A34R基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)。

需要指出的是，编码上述基因产物的核酸序列包含导致所述各基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸替代)。“氨基酸替代”在本文中也可称为“氨基酸取代”。本文使用的术语“氨基酸插入”是指发生在A3L、A34R和/或A9L基因产物的氨基酸序列内部的氨基酸修饰，而本文使用的术语“氨基酸添加”是指发生在A3L、A34R和/或A9L基因产物的N端或C端的氨基酸修饰。

在一个实施方式中，MVA病毒包含编码A3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述A3L基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。在另一实施方式中，MVA病毒包含编码A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述A34R基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

优选地，所述核酸序列进一步编码A9L基因产物，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

更优选地，

(i)所述病毒包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A3L基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)；

(ii)所述病毒包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)；或者

(iii)所述病毒包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个突变)。

需要指出的是，编码上述基因产物的核酸序列包含导致所述各基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸替代)。

本发明的发明人出乎预料地发现，与未突变的MVA病毒相比，可以更高的产量生产此类突变的MVA病毒。

优选地，

(i)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于跨越(spanning)SEQ ID NO：1所示的A3L基因产物第634-644位的氨基酸位置、优选第636-642位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置的区域；

(ii)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于跨越SEQ ID NO：2所示的A34R基因产物第81-91位的氨基酸位置、优选第83-89位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置的区域；和/或

(iii)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于跨越SEQ ID NO：3所示的A9L基因产物第70-80位的氨基酸位置、优选第72-78位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置的区域。

因此，所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)可：(i)位于SEQ ID NO：1所示的A3L基因产物第634、635、636、637、638、639、640、641、642、643或644位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置；(ii)位于SEQ ID NO：2所示的A34R基因产物第81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置；和/或(iii)位于SEQ ID NO：3所示的A9L基因产物第70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80位的氨基酸位置、或与之对应的氨基酸位置。

在本发明的上下文中，如果两个以上基因产物中的氨基酸残基占据所述基因产物结构中的类似位置(analogous position)，则称所述两个以上基因产物中的氨基酸残基彼此“对应(correspond)”。本领域所公知的是，可基于氨基酸序列或结构相似度对基因产物序列进行比对，来确定两个以上基因产物中的类似位置。此类比对工具为本领域技术人员所熟知，并可以例如获取自万维网，例如使用标准设置的ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw)或Align(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)，优选Align EMBOSS::needle，Matrix:Blosum62，Gap Open 10.0，GapExtend 0.5。本领域技术人员理解的是，可能有必要在任一序列中引入空位(gaps)以产生令人满意的比对。如果两个以上基因产物中的氨基酸残基的比对为最佳序列比对，则称所述两个以上基因产物中的氨基酸残基彼此“对应”。两个基因产物之间的“最佳序列比对”定义为产生最大数量的比对相同的残基的比对。如果在10、20或30个氨基酸的长度内两条所比对的序列间的序列相似度(优选一致性)降低到小于30％、优选小于20％、更优选小于10％，“最佳序列比对区”结束，从而确定了用于相似度得分的比较序列的长度的边界。

进一步优选地，

(i)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(ii)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(iii)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(iv)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；和/或

(v)所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替代)位于A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置。

更优选地，所述氨基酸序列修饰为氨基酸缺失或氨基酸替代，其中，

(i)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H缺失，或被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电的氨基酸(优选D或E)或极性不带电氨基酸(优选S、T、N或Q)替代；

(ii)位于A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的R缺失，或被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电的氨基酸(优选D或E)或极性不带电氨基酸(优选S、T、N或Q)替代；

(iii)位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D缺失，或被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带正电的氨基酸(优选R、H或K)或极性不带电氨基酸(优选S、T、N或Q)替代；

(iv)位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K缺失，或被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电的氨基酸(优选D或E)或极性不带电氨基酸(优选S、T、N或Q)替代；和/或

(v)位于A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K缺失，或被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电的氨基酸(优选D或E)或极性不带电氨基酸(优选S、T、N或Q)替代。

甚至更优选地，所述氨基酸替代为如下氨基酸替代：

(i)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代(H639Y A3L基因产物突变)；

(ii)位于A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的R被Y替代(R638Y A3L基因产物突变)；

(iii)位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代(D86Y A34R基因产物突变)；

(iv)位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(K75E A9L基因产物突变)；和/或

(v)位于A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(K74E A9L基因产物突变)。

甚至进一步更优选地，所述氨基酸替代为如下氨基酸替代：

(i)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，且位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代(H639Y A3L/D86Y A34R基因产物突变)；

(ii)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，且位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(H639Y A3L/K75E A9L基因产物突变)；

(iii)位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代，且位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(D86Y A34R/K75E A9L基因产物突变)；或者

(iv)位于A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，位于A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代，且位于A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(H639Y A3L/D86YA34R/K75E A9L基因产物突变)。

最优选地，

(i)具有H639Y突变的A3L基因产物具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少85％、优选90％、更优选95％、最优选99％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的所述序列的变异体(variant)，其中，所述变异体(仍)包含位于第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸Y；

(ii)具有D86Y突变的A34R基因产物具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少85％、优选90％、更优选95％、最优选99％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的所述序列的变异体，其中，所述变异体(仍)包含位于第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸Y；和/或

(iii)具有K75E突变的A9L基因产物具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少85％、优选90％、更优选95％、最优选99％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的所述序列的变异体，其中，所述变异体(仍)包含位于第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸E。

特别优选地，序列一致性为：(i)就SEQ ID NO：4所示的参比氨基酸序列上连续延伸的至少50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600个或更多氨基酸而言，各自具有至少85％、90％、95％或99％的序列一致性；(ii)就SEQ ID NO：5所示的参比氨基酸序列上连续延伸的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160个或更多氨基酸而言，各自具有至少85％、90％、95％或99％的序列一致性；或者(iii)就SEQ ID NO：6所示的参比氨基酸序列上连续延伸的至少20、30、40、50、60、70、80、90个或更多氨基酸而言，各自具有至少85％、90％、95％或99％的序列一致性。进一步特别优选地，所述序列一致性为：就SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的参比氨基酸序列的全长而言，各自具有至少85％的一致性；就SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的参比氨基酸序列的全长而言，各自具有至少90％的一致性；就SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的参比氨基酸序列的全长而言，各自具有至少95％的一致性；或者，就SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的参比氨基酸序列的全长而言，各自具有至少99％的一致性。

优选地，上述变异体为功能活性变异体。这意味着与已知的MVA病毒相比，氨基酸序列的(额外)变异对本发明所述的MVA病毒的有益性质(例如增加的感染活性和/或培养中在胞外空间中的更多感染单位)没有负面影响。所述有益性质允许例如高产量地生产本发明所述的MVA病毒。测试在上述变异体中仍存在所述有益性质的实验在实验部分中描述。

MVA的上述A3L基因产物(也称为P4b蛋白)为三个主要核心蛋白之一，在球形的非感染性未成熟病毒体(IV)成为胞内成熟病毒体(IMV)的成熟过程中被I7L编码的病毒蛋白酶加工。MVA的A3L基因产物在极早期步骤促进病毒体的形态建成，从而允许发生在向感染性IMV转变的过程中的正确压缩(condensation)和膜重排。另外，MVA的上述A34R基因产物使得胞外包膜病毒(EEV)的外膜去稳定化，从而对于在胞外空间的感染活性以及病毒的传播极其重要。EEV已演变为使得病毒传播至远处的媒介。EEV额外的膜并不是配备来介导与靶细胞的融合，必须将该膜破坏从而释放IMV，这是实际的病毒感染单位。此外，MVA的A34R基因产物调控与细胞结合的包膜病毒(cell-associatedenveloped virus，CEV)从产生该病毒的细胞脱离的速度。进而，MVA的A9L基因产物与A3L基因产物类似，参与MVA成熟的早期步骤。A9L基因产物是对IMV核心的正确压缩而言重要的因子。

优选地，所述MVA病毒为分离的MVA病毒。本文使用的术语“分离的MVA病毒”是指从其天然环境或培养环境移出的病毒。因此，分离的MVA病毒可不含某些或全部细胞组分(即病毒天然存在于其中或在其中培养的细胞的组分，例如细胞质组分或膜组分)。它还可不含某些或全部培养组分(例如培养介质或与培养有关的杂质，例如培养物残余物)。

可对分离的MVA病毒进行进一步纯化。因此，更优选地，所述MVA病毒为纯化的MVA病毒。本文使用的术语“纯化的MVA病毒”是指在减少或消除从中获取该病毒的无关物质的存在的条件下分离的病毒，所述无关物质即污染物，包括天然物质，例如细胞碎片、细胞残余物、细胞蛋白、细胞DNA分子和/或细胞RNA分子。纯化的MVA病毒优选实质上不含(substantially free)细胞组分和/或培养组分。本文使用的术语“实质上不含”操作性地用在对物质的分析测试的上下文中。实质上不含污染物的纯化的MVA病毒优选为至少50％的纯度、更优选至少90％的纯度、甚至更优选至少99％或100％的纯度。可通过层析、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本领域已知的其它方法来评估纯度。

优选地，所述MVA病毒进一步包含异源核酸序列。术语“异源核酸序列”如上文所定义。异源核酸序列的表达可处于MVA病毒启动子的转录控制之下。异源核酸序列被插入至MVA病毒的核酸序列中。在本发明一个优选的实施方式中，异源核酸序列被插入至MVA病毒核酸序列/基因组的非必要区域(non-essential region)。在本发明一个更优选的实施方式中，异源核酸序列被插入至MVA核酸序列/基因组的天然存在的缺失位点(例如缺失位点I、II、III、IV、V或VI)。将异源核酸序列插入至MVA病毒基因组的方法为本领域技术人员所熟知。

更优选地，所述异源核酸序列选自于编码抗原(特别是抗原表位)、诊断性化合物或治疗性化合物的序列。术语“表位(也称为抗原决定簇)”是指免疫系统(特别是抗体、B细胞或T细胞)所识别的抗原的部分。

抗原或表位可有利地用作疫苗，以诱导针对所述抗原或表位的免疫应答。对于所述病毒而言为异源的此类抗原的实例涵盖了例如其它病毒的蛋白，所述其它病毒例如为流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白，例如Her2/neu或MUC-1。对于所述病毒而言为异源的此类表位的实例涵盖了例如衍生自其它病毒蛋白的表位，所述其它病毒例如为流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白的表位，例如Her2/neu或MUC-1的胞外肽。

治疗性化合物可为具有治疗效果的任何化合物。例如，治疗性化合物可为影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物，能够调动生物作用(例如免疫应答)的化合物，或能在一种或多种生物过程中起到其它作用的化合物。具体而言，所述化合物可为抗微生物化合物、抗病毒化合物、抗真菌化合物、免疫阻遏化合物、生长因子、酶、抗炎化合物或抗过敏化合物。治疗性化合物还可为反义核酸。

诊断性化合物可为具有诊断效果的任何化合物。例如，诊断性化合物可为标志物/报告蛋白，例如抗体、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶或赋予抗生素耐受性的蛋白(例如针对氨苄青霉素的bla(β-内酰胺酶)或针对新霉素或G418的npt(新霉素磷酸转移酶))。可借助例如杂交技术、荧光显微术或ELISA测定法，将所述标志物/报告蛋白用于识别或分离病毒。此外，病毒中含有的赋予抗生素耐受性的蛋白将针对抗生素选择的耐受性赋予被感染的细胞。

如上文已经描述的，所述MVA病毒为高减毒病毒。在本发明的一个实施方式中，所述MVA病毒能够在禽类细胞中生产性复制(productivereplication)。本文使用的术语“生产性复制”可指病毒造成细胞病变效应，且复制至最终导致被感染的培养物中大量细胞死亡的水平。就繁殖性复制(reproductive replication)而言，至少一次能够从被感染的培养物中回收到比加入至培养物中使其感染的病毒更多的病毒。与生产性复制相反，繁殖性复制能够以非常低的水平发生，不伴有细胞病变效应，最终可实现生存培养物中病毒的丢失。

所述禽类细胞优选为鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞(例如鸭体节(somite)细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)可为原代细胞(或来自于原代细胞培养物的细胞)、次代细胞(secondary cells)(或来自于次代细胞培养物的细胞)或无限增殖化细胞(或来自于细胞系的细胞)。本文使用的术语“原代细胞”或“原代细胞培养物”是指在衰老、细胞培养停滞或细胞死亡之前，通常传代不能超过50次群体倍增的细胞或培养物。本文使用的术语“次代细胞”或“次代细胞培养物”是指直接衍生自原代细胞或原代细胞培养物的细胞或培养物。群体倍增限制仍然适用。本文使用的术语“无限增殖化细胞”或“无限增殖化细胞培养物”是指其子代不受潜在的细胞倍增数限制的细胞或培养物。细胞培养物可由原代细胞、次代细胞或无限增殖化细胞(即细胞系的细胞)组成。在本发明优选的实施方式中，所述细胞来自于CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系来自于无限增殖化的美洲家鸭(Muscovy duck)视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)，其被设计用于疫苗生产。CR.pIX细胞系进一步在其基因组中稳定整合有编码腺病毒pIX蛋白的基因并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

在本发明的另一实施方式中，所述MVA病毒不能在哺乳动物细胞中生产性复制，其中，所述哺乳动物细胞不为幼年仓鼠肾(BHK)细胞、果蝠R05T细胞、果蝠R05R细胞或果蝠R06E细胞。R05T、R05R和R06E细胞为通过使埃及果蝠(Egyptian rousette)原代细胞无限增殖化获得的细胞。这些是容许MVA的极少数哺乳动物细胞系中的一些(Jordan等，2009，Virus Res 145，54-62)。在本发明一个优选的实施方式中，所述MVA病毒不能在灵长类动物细胞、更优选人类细胞中生产性复制。

本发明所述的MVA病毒可包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，所述A3L基因产物具有氨基酸修饰之前(prior to)的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述A34R基因产物具有氨基酸修饰之前的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。所述核酸序列可进一步编码A9L基因产物，所述A9L基因产物具有氨基酸修饰之前的SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

进而，各A3L基因可具有突变之前的SEQ ID NO：7所示的核酸序列，各A34R基因可具有突变之前的SEQ ID NO：8所示的核酸序列，和/或各A9L基因可具有突变之前的SEQ ID NO：9所示的核酸序列。

此外，突变的A3L基因可具有SEQ ID NO：10所示的核酸序列，突变的A34R基因可具有SEQ ID NO：11所示的核酸序列，和/或突变的A9L基因可具有SEQ ID NO：12所示的核酸序列。

此外，本发明所述的MVA病毒可包含突变之前的登记号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)所示的核酸序列。

在第二方面，本发明涉及第一方面所述的(突变的)MVA病毒的基因组。

在第三方面，本发明涉及包含第一方面所述的(突变的)MVA病毒或第二方面所述的基因组的细胞。包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组的细胞也可称为宿主细胞。所述细胞可用于培养第一方面所述的MVA病毒。所述细胞可为第一方面所述的MVA病毒能够在其中复制的任何细胞。优选所述细胞不为灵长类动物细胞，特别是人类细胞。进一步优选地，所述细胞为禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)可为原代细胞(或来自于原代细胞培养物的细胞)、次代细胞(或来自于次代细胞培养物的细胞)或无限增殖化细胞(或来自于细胞系的细胞)。对于术语“原代细胞”、“原代细胞培养物”、“次代细胞”、“次代细胞培养物”、“无限增殖化细胞”或“无限增殖化细胞培养物”的定义，请参见本发明第一方面。在本发明优选的实施方式中，所述细胞来自于CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系来自于无限增殖化的美洲家鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)，其被设计用于疫苗生产。CR.pIX细胞系进一步在其基因组中稳定整合有编码腺病毒pIX蛋白的基因并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

优选地，所述细胞为分离的细胞。本文使用的术语“分离的细胞”是指从其天然环境或培养环境移出的细胞。因此，分离的细胞可不含某些或全部的天然组分或培养组分(即细胞天然存在于其中的生物体的组分(例如器官，特别是组织)或者细胞在其中进行培养的组分(例如培养介质或与培养有关的杂质，例如培养物残余物))。

可用第一方面所述的MVA病毒感染所述细胞，或用第二方面所述的基因组转染所述细胞。感染或转染细胞的技术为本领域技术人员所知晓。

进一步优选地，所述细胞为非贴壁/悬浮细胞。一般地，细胞可在悬浮培养或贴壁培养中生长。一些细胞天然以悬浮状态生活，而不附着在表面，所述细胞例如存在于血液中的细胞(例如造血细胞)。贴壁细胞(例如原代细胞)需要表面，例如组织培养的塑料载体或微载体，可用细胞外基质组分进行包被，以增加贴壁性质并提供生长和分化所需的其它信号。固态组织衍生的大部分细胞为贴壁的。贴壁细胞通常以其原始形式被用于细胞生物学研究。还有细胞经过改造而能够在悬浮培养中存活，从而能够生长至比在贴壁条件下更高的密度。在贴壁条件下，生长相应地受到表面积的限制，这可能限制产量。此类适应于悬浮的细胞或适应于非贴壁生长的细胞通常用于蛋白大量生产或批量收集。在非贴壁条件下，生长由培养介质中细胞浓度所限，从而能够简单地放大。

术语“非贴壁”和“悬浮”在本文中可互换使用。在本发明的上下文中，术语“非贴壁细胞”和“悬浮细胞”是指能在悬浮培养中存活而不附着于表面的细胞(所述表面例如组织培养塑料载体或微载体)。所述细胞可为天然能够悬浮生活而不附着于表面的细胞。所述细胞还可为经改造为或适应于能够在悬浮培养中存活而不附着于表面的细胞(所述表面例如组织培养塑料载体或微载体)。如上所述，大部分细胞为未经改造或未经适应的原始形式的贴壁细胞。非贴壁细胞通常可生长至比贴壁条件所允许的密度更高的密度。因此，非贴壁细胞更适于工业水平的培养，例如在生物反应器设备或搅动培养(agitated culture)中。通常必须使细胞适应非贴壁细胞培养。由于原始细胞在无血清条件和/或缺少合适表面时将发生凋亡，这一适应是需要以减少的血清量(例如从10％至0％胎牛血清(FCS)的一系列稀释)进行传代的较长过程，由此选出被不可逆改造的细胞群体。适应的非贴壁细胞为本领域所知晓。本领域技术人员了解将细胞从贴壁状态变为非贴壁状态的方案(参见例如Appl MicrobiolBiotechnol.，2008年3月；78(3)：391-9；电子公开2008年1月9日)。

与此相反，本文使用的术语“贴壁细胞”是指需要表面(例如组织培养塑料载体或微载体)的细胞。所述表面可包被有细胞外基质组分，以增加贴壁性质并提供生长和分化所需的其它信号。所述细胞需要定期传代，但允许容易地在倒置显微镜下可视检查。所述细胞需要酶解分离(例如利用胰蛋白酶)。此外，贴壁细胞的生长受表面积所限，这会限制产量。

在本发明优选的实施方式中，非贴壁/悬浮细胞在无血清条件下生长。本文使用的术语“无血清条件”是指细胞在缺乏动物血清的介质中生长的条件。事实上，细胞在缺乏任何动物来源组分的介质中并优选在不含任何生物组分的复杂混合物的介质中(所谓的“化学上确定的介质”)生长。

在第四方面，本发明涉及第一方面所述的(突变的)MVA病毒的培养方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供第三方面所述的细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；以及

(iii)分离所述(突变的)MVA病毒。

第三方面所述的细胞包含第一方面所述的(突变的)MVA病毒或第二方面所述的基因组。步骤(ii)中对所述细胞进行培养可在细胞增殖介质并随后在病毒生产介质中进行，或者，步骤(ii)中对所述细胞进行培养可(仅)在细胞增殖介质中进行。优选地，步骤(ii)中对所述细胞进行培养(仅)在细胞增殖介质中进行。单一介质的使用具有如下优势：便于MVA病毒培养过程，特别是工业化的MVA病毒培养过程。例如，便于生产所述MVA病毒的生物反应器的操作以及物流。

优选地，在细胞增殖介质中对细胞培养1天至3天，例如1天、2天或3天，并随后在病毒生产介质中对细胞培养1天至10天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。还优选仅在增殖介质中对细胞培养1天至10天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

本文使用的术语“细胞增殖介质”是指支持细胞分裂至少10次细胞倍增的介质，使得例如在所述介质中对所接种的8×10⁵个细胞进行传代而能得到约4×10⁸个细胞，从而对于例如200升的生物反应器而言足够。本文使用的术语“增殖细胞”是指分裂细胞，即能够以在48小时或更短时间内至少一次的倍增速度再分裂至少10次细胞倍增的细胞。

优选地，细胞增殖介质无血清。无血清介质尤其缺乏动物血清。事实上，细胞在缺乏任何动物来源组分的介质中并优选在不含任何生物组分的复杂混合物的介质中(所谓的“化学上确定的介质”)生长。进一步优选地，细胞增殖介质具有低蛋白含量和/或低盐含量。优选地，所述(低)蛋白含量为10-250ng/ml、更优选50-200ng/ml、甚至更优选50-150ng/ml、并最优选50-100ng/ml，例如10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/ml、210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml、240ng/ml、或250ng/ml。优选地，所述(低)盐含量为150-350mOsm/kg、更优选180-350mOsm/kg、甚至更优选200-320mOsm/kg、并最优选250-300mOsm/kg，例如150mOsm/kg、160mOsm/kg、170mOsm/kg、180mOsm/kg、190mOsm/kg、200mOsm/kg、210mOsm/kg、220mOsm/kg、230mOsm/kg、240mOsm/kg、250mOsm/kg、260mOsm/kg、270mOsm/kg、280mOsm/kg、290mOsm/kg、300mOsm/kg、310mOsm/kg、320mOsm/kg、330mOsm/kg、340mOsm/kg、或350mOsm/kg。优选地，上述细胞增殖介质进一步包含葡萄糖。优选地，所述葡萄糖的含量为1-6g/l、更优选2.5-5.5g/l、甚至更优选3.5-5g/l，并最优选4-4.5g/l，例如1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l、或6g/l。因此，在本发明的一个实施方式中，细胞增殖介质无血清、具有低蛋白含量并具有低盐含量。在本发明的另一优选实施方式中，细胞增殖介质无血清、具有低蛋白含量、具有低盐含量、并进一步包含葡萄糖。优选的含量如上所述。

本文使用的术语“病毒生产介质”是指在增殖细胞的培养中增强病毒生产的介质。通过加入病毒生产介质，诱导了细胞聚集，培养物中的细胞增殖降低了至少2倍或完全停止。优选地，病毒生产介质含有CaCl₂、MgSO₄和/或NaCl。优选地，CaCl₂含量为150-250mg/l、更优选180-250mg/l、并最优选200-220mg/l，例如150mg/l、155mg/l、160mg/l、165mg/l、170mg/l、175mg/l、180mg/l、185mg/l、190mg/l、195mg/l、200mg/l、205mg/l、210mg/l、215mg/l、220mg/l、225mg/l、230mg/l、235mg/l、240mg/l、245mg/l、或250mg/l；MgSO₄含量为50-150mg/l、更优选70-150mg/l、并最优选90-120mg/l，例如50mg/l、55mg/l、60mg/l、65mg/l、70mg/l、75mg/l、80mg/l、85mg/l、90mg/l、95mg/l、100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l、或150mg/l；和/或NaCl含量为5000-7500mg/l、更优选6000-7000mg/l、并最优选6500-6800mg/l，例如5000mg/l、5500mg/l、6000mg/l、6500mg/l、7000mg/l、或7500mg/l。例如，病毒生产介质可包含205mg/l CaCl₂、100mg/l MgSO₄和/或6500mg/l NaCl的盐含量。

优选地，步骤(ii)中对所述细胞进行培养为搅动培养或在生物反应器中进行。类似于化学反应器，生物反应器一般根据其混合特性来分类。所述生物反应器可以是(充分混合的)搅拌槽反应器或活塞流(管形)反应器。在理想的充分混合生物反应器中，认为混合的强度足以使得流体(细胞和培养介质)在整个反应器中均匀。在优选的实施方式中，生物反应器为补料分批式(fed-batch)、分批式(batch)或连续式生物反应器，或所述培养为分批、补料分批或连续培养过程。当进料和产物流连续地补入和排出系统时，生物反应器通常被称为连续式的。理论上，反应器可具有连续的再循环流，而无连续的营养补入或产物收集，这时仍然为分批式生物反应器。补料分批式生物反应器通常具有间歇式的补料。它在运行中可伴有或不伴有介质的排出。本文使用的术语“补料分批培养”可以指如下细胞培养过程：在合适的培养介质中提供定量的细胞，悬浮培养较长的时间(典型地为4-10天)，在该时间内不移除介质。然而，在培养过程开始后的某些时间为培养物提供额外的组分。所提供的组分典型地包含在培养过程中耗尽的细胞营养补充物。补料分批培养通常在当活细胞与死细胞之比降至临界值以下的时间点停止。

可从无细胞上清液和/或细胞裂解液分离第一方面所述的MVA病毒。可按照本领域技术人员易得的标准程序实施从无细胞上清液和/或细胞裂解液分离第一方面所述的MVA病毒。优选地，从无细胞上清液分离第一方面所述的MVA病毒。本发明的发明人已经示出了可直接从无细胞上清液分离第一方面所述的MVA病毒，这方便了MVA病毒分离过程、特别是工业化的MVA病毒分离过程。这转而降低了MVA病毒生产的成本。例如，对于MVA病毒分离而言细胞裂解不再必须。通过这一方式，可减少细胞物质、特别是细胞DNA对MVA病毒分离株的污染。结果，可更容易地实现世界卫生组织对于病毒制剂的DNA限量值。

多种病毒分离程序为本领域所知晓。对本发明有利的分离程序不干扰待分离的病毒。例如，应避免长时间暴露于在分离中发生的叶轮剪切力(impeller shear force)和其它因素。步骤(iii)的分离优选通过经由离心、沉降和/或过滤(例如通过离心和过滤，通过沉降和过滤，通过沉降和离心，或通过离心、沉降和过滤)将病毒与细胞分离来实现。为了分离在所述细胞中培养的病毒，本领域技术人员能够容易地适应/调整合适的分离参数，例如离心分离使用的加速度-力/重力和/或时间、过滤分离使用的滤器尺寸和/或沉降分离使用的沉降时间。

在第五方面，本发明涉及第一方面所述的(突变的)MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)用MVA病毒感染细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；

(iii)分离所述MVA病毒；以及

(iv)利用步骤(iii)中分离的所述MVA病毒重复步骤(i)至步骤(iii)，直至检测到包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列的(突变的)MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物和/或所述A34R基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)。

需要指出的是，编码上述基因产物的核酸序列包含导致所述各基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸替代)。

优选地，重复步骤(i)至步骤(iii)，直至检测到包含进一步编码A9L基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

更优选地，

(i)检测到包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A3L基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)；

(ii)检测到包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个突变)；或者

(iii)检测到包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即，所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个突变)。

需要指出的是，编码上述基因产物的核酸序列包含导致所述各基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸替代)。

对于氨基酸修饰的优选实施方式，请参见本发明第一方面。

步骤(i)中提供的MVA病毒特别地包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列不包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的突变。特别地，该病毒不包含本发明第一方面所涉及的优选的氨基酸修饰。

步骤(i)中的MVA病毒可包含登记号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)所示的核酸序列。

优选地，将步骤(i)至步骤(iii)重复至少2次、优选至少7次、更优选至少14次、最优选至少20次，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。

进一步优选地，在病毒生产介质中培养细胞。对于术语“病毒生产介质”的定义以及“病毒生产介质”的优选实施方式，请参见本发明第四方面。

可在病毒生产介质中对病毒进行步骤(ii)的培养1-10天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。对于优选的培养条件和分离形式，也请参见本发明第四方面。

步骤(i)中的细胞可为MVA病毒能够在其中复制的任何细胞。优选地，所述细胞不为灵长类动物细胞，特别是人细胞。进一步优选地，所述细胞为禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)可为原代细胞(或来自于原代细胞培养物的细胞)、次代细胞(或来自于次代细胞培养物的细胞)或无限增殖化细胞(或来自于细胞系的细胞)。对于术语“原代细胞”、“原代细胞培养物”、“次代细胞”、“次代细胞培养物”、“无限增殖化细胞”或“无限增殖化细胞培养物”的定义，请参见本发明第一方面。在本发明优选的实施方式中，所述细胞来自于CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系来自于无限增殖化的美洲家鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)。CR.pIX细胞系进一步在其基因组中稳定整合有编码腺病毒pIX蛋白的基因并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

在第六方面，本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。

如上所述，第一方面所述的(突变的)MVA病毒为高度宿主受限的，因而为高减毒的。因此，就对广泛的接受者进行处理而言它是理想的。

术语“宿主受限”、“高减毒”和“接受者”如上定义。所述接受者优选为灵长类、更优选为人类。

本文使用的术语“赋形剂”意在表示药物组合物中不为活性成分的全部物质。赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂和/或着色剂。用于治疗用途的可接受的载体和/或稀释剂为药物领域所公知，并在例如如下文献中描述：Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.RGennaro编，1985)。适合的载体的实例包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡和/或可可脂。适合的稀释剂的实例包括但不限于乙醇、甘油和/或水。可根据所期望的给药途径和标准药学实践选择药物赋形剂、稀释剂和/或载体。药物组合物可进一步包含适合的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或増溶剂。适合的粘合剂的实例包括但不限于淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠)、羧甲基纤维素和/或聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和/或氯化钠。药物组合物也可包含防腐剂、稳定剂、染料、抗氧化剂、助悬剂和/或调味剂。防腐剂的实例包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸和/或对-羟基苯甲酸的酯。

可通过本领域技术人员熟知的多种方式配制和/或给予本发明设计的药物组合物。优选地，本发明的药物组合物为液体形式，例如溶液(例如注射液)形式。可通过例如肌肉内或胃肠外的方式注射所述溶液。本领域技术人员可通过已知的方式对药物组合物的给药方式、剂量以及给药次数进行优化。

在第七方面，本发明进一步涉及疫苗，所述疫苗包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组。

如上所述，第一方面所述的(突变的)MVA病毒为高度宿主受限的，因而为高减毒的。因此，它是对广泛的接受者进行处理的理想的疫苗。术语“宿主受限”、“高减毒”、“接受者”和“疫苗”如上定义。所述接受者优选为灵长类、更优选为人类。在这一方面，需要指出的是，MVA病毒本身可为疫苗。MVA病毒赋予针对痘病的保护。然而，所述病毒或所述基因组可进一步包含异源核酸序列，例如编码抗原、特别是抗原表位(可在接受者体内引发针对所述抗原或抗原表位的保护性免疫、特别是额外的保护性免疫)的序列。术语“异源核酸序列”如上定义。此类抗原的实例涵盖了例如其它病毒的蛋白，所述其它病毒例如流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或者与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白，例如Her2/neu或MUC-1。此类表位的实例涵盖了例如衍生自其它病毒蛋白的表位，所述其它病毒例如流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或者衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白的表位，例如Her2/neu或MUC-1的胞外肽。也可将包含异源核酸序列的MVA病毒称为重组MVA病毒。在将疫苗给予至接受者体内后，抗原(特别是表位)被表达并提呈至免疫系统，从而可诱导针对所述抗原(特别是表位)的特异性免疫应答。因此使得接受者对所述抗原(特别是表位)免疫。

优选地，包含第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组的疫苗为痘病毒、流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒和/或线状病毒疫苗。所述疫苗还可用于针对乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌的免疫接种。

可通过本领域技术人员熟知的多种方式配制和给予本发明设计的疫苗。优选地，本发明的疫苗为液体形式，例如溶液(例如注射液)形式。可通过例如肌肉内或胃肠外的方式注射所述溶液。本领域技术人员可通过已知的方式对疫苗的给药方式、剂量以及给药次数进行优化。就制备疫苗或制成疫苗制剂而言，将第一方面所述的MVA病毒、特别是重组MVA病毒转变为生理学上可接受的形式。这可基于针对痘病进行免疫接种的痘病毒疫苗的制备经验来完成(如在Stickl等，1974，Dtsch MedWochenschr 99，2386-2392中所描述的)。所述疫苗对于在免疫功能低下的接受者(例如灵长类，包括人类)中诱导免疫应答而言特别有用。本文使用的术语“免疫功能低下”描述了仅显示出不完全免疫应答或针对感染性试剂的防御效力减弱的接受者的免疫系统的状态。

在第八方面，本发明涉及第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组在医药方面的用途。优选地，第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组是用于免疫接种和/或治疗用途。具体而言，用第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组激发接受者，以诱导特异性免疫。接受者优选为灵长类、更优选为人类。所述灵长类(例如人类)可为免疫功能低下者。在这一方面，需要指出的是，MVA病毒本身可为疫苗。MVA病毒赋予针对痘病的保护。然而，所述病毒或所述基因组可进一步包含异源核酸序列，例如编码抗原、特别是抗原表位(可在接受者体内引发针对所述抗原或抗原表位的保护性免疫、特别是额外的保护性免疫)的序列。术语“免疫接种”、“接受者”、“异源核酸序列”如上定义。优选的抗原(特别是表位)在本发明第一方面和第七方面中描述。优选地，所述MVA病毒或基因组用于针对痘病毒、流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒、线状病毒、肿瘤和/或癌症(例如乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌)进行免疫接种。

可替代地或额外地，用第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组激发接受者，以引发治疗作用。如上所述，所述病毒或基因组中包含的异源序列可编码治疗性化合物。例如，治疗性化合物可为影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物，能够调动生物作用(例如免疫应答)的化合物或能够在一种或多种生物过程中起到其它作用的化合物。具体而言，所述化合物可为抗微生物化合物、抗病毒化合物、抗真菌化合物、免疫阻遏化合物、生长因子、酶、抗炎化合物或抗过敏化合物。治疗性化合物还可为反义核酸。

本领域技术人员可通过已知的方式对免疫接种的方式、免疫接种的剂量以及免疫接种的次数进行优化。可通过本领域技术人员熟知的多种方式配制和/或给予疫苗。优选地，以液体形式给予所述疫苗。优选地，通过例如肌肉内或胃肠外的方式注射所述疫苗。优选地，以药学有效量给予接受者第一方面所述的MVA病毒或第二方面所述的基因组。术语“药学有效量”是指在具体的给药途径下对于引发免疫应答而言有效的MVA病毒或基因组的量。

在第九方面，本发明涉及包含核酸序列的MVA病毒，其中，A3L基因和/或A9L基因功能性缺失。优选地，A34R基因进一步功能性缺失。

更优选地，

(i)A3L基因和A9L基因功能性缺失；

(ii)A3L基因和A34R基因功能性缺失；

(iii)A9L基因和A34R基因功能性缺失；或

(iv)A3L基因、A9L基因和A34R基因功能性缺失。

(未缺失的)A3L基因可具有SEQ ID NO：7所示的核酸序列；(未缺失的)A34R基因可具有SEQ ID NO：8所示的核酸序列；和/或(未缺失的)A9L基因可具有SEQ ID NO：9所示的核酸序列。此外，所述MVA病毒可包含缺失之前的登记号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)所示的核酸序列。

在本发明的上下文中，涉及上述A3L、A9L和/或A34R基因的术语“功能性缺失”应理解为该基因缺失的程度使得A3L、A9L和/或A34R基因产物各自的生物活性降低、优选彻底消除或被改造。例如，与生物活性的(未缺失的)A3L、A9L和/或A34R基因产物相比，其生物活性可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％。

可通过对A3L、A9L和/或A34R基因进行部分删除，对A3L、A9L和/或A34R基因进行完全删除，和/或在A3L、A9L和/或A34R基因中引入一个或多个终止密码子来实现此类功能性缺失。

可利用本领域技术人员知晓的各种实验来测试与生物活性的(未缺失的)A3L、A9L和/或A34R基因产物相比A3L、A9L和/或A34R基因产物各自生物活性的降低或消失。检测与生物活性的(未缺失的)A3L、A9L和/或A34R基因产物相比A3L、A9L和/或A34R基因产物各自生物活性的降低或消失的一种方式为进行实施例6所述的彗星测定法。就彗星测定法而言，用适当少量的病毒(例如每宿主细胞0.01-0.001个病毒)感染贴壁容许细胞的单细胞层。来自A3L、A9L和/或A34R基因缺失的病毒的子代将不能从最初感染的细胞中逃逸，并将造成小的、有限的圆形斑块(plaques)(表现出细胞病变效应的临近细胞的集合)或将不造成任何斑块。具有活性A3L、A9L和/或A34R基因产物的病毒将造成肉眼都清晰可见的斑块，在2-7天内斑块将扩展，最后将单细胞层完全耗尽。

对于A3L基因、A9L基因和A34R基因的基因产物的描述，请参见本发明第一方面。

优选地，所述MVA病毒为分离的MVA病毒。本文使用的术语“分离的MVA病毒”是指从其天然环境或培养环境移出的病毒。因此，分离的MVA病毒可不含某些或全部细胞组分(即病毒天然存在于其中或在其中培养的细胞的组分，例如细胞质组分或膜组分)。它还可不含某些或全部培养组分(例如培养介质或与培养有关的杂质，例如培养物残余物)。

可对分离的MVA病毒进行进一步纯化。因此，更优选地，所述MVA病毒为纯化的MVA病毒。本文使用的术语“纯化的MVA病毒”是指在减少或消除从中获取该病毒的无关物质的存在的条件下分离的病毒，所述无关物质即污染物，包括从其中获取病毒的天然物质，例如细胞碎片、细胞残余物、细胞蛋白、细胞DNA分子和/或细胞RNA分子。纯化的MVA病毒优选实质上不含细胞组分和/或培养组分。本文使用的术语“实质上不含”操作性地用在对物质的分析测试的上下文中。实质上不含污染物的纯化的MVA病毒优选为至少50％的纯度、更优选至少90％的纯度、甚至更优选至少99％或100％的纯度。可通过层析、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本领域已知的其它方法来评估纯度。

进一步优选地，功能性缺失的基因被异源核酸序列替代。例如，功能性缺失的A3L基因被异源核酸序列替代，功能性缺失的A9L基因被异源核酸序列替代，和/或功能性缺失的A34R基因被异源核酸序列替代。将异源核酸序列插入MVA病毒基因组的方法为本领域技术人员所知晓。异源核酸序列的表达可处于MVA病毒启动子的转录控制下。

术语“异源核酸序列”如上定义。优选地，异源核酸序列选自于编码抗原(特别是抗原表位)、诊断性化合物或治疗性化合物的序列。

抗原或表位可有利地用作疫苗，以诱导针对所述抗原或表位的免疫应答。对于所述病毒而言为异源的此类抗原的实例涵盖了例如其它病毒的蛋白，所述其它病毒例如为流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白，例如Her2/neu或MUC-1。对于所述病毒而言为异源的此类表位的实例涵盖了例如衍生自其它病毒蛋白的表位，所述其它病毒例如为流感病毒、肝炎病毒(例如丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或线状病毒；或衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白的表位，例如Her2/neu或MUC-1的胞外肽。

治疗性化合物可为具有治疗效果的任何化合物。例如，治疗性化合物可为影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物，能够调动生物作用(例如免疫应答)的化合物，或能在一种或多种生物过程中起到其它作用的化合物。具体而言，所述化合物可为抗微生物化合物、抗病毒化合物、抗真菌化合物、免疫阻遏化合物、生长因子、酶、抗炎化合物或抗过敏化合物。治疗性化合物还可为反义核酸。

诊断性化合物可为具有诊断效果的任何化合物。例如，诊断性化合物可为标志物/报告蛋白，例如抗体、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶或赋予抗生素耐受性的蛋白(例如针对氨苄青霉素的bla(β-内酰胺酶)或针对新霉素或G418的npt(新霉素磷酸转移酶))。可借助例如杂交技术、荧光显微术或ELISA测定法，将所述标志物/报告蛋白用于识别或分离病毒。此外，病毒中含有的赋予抗生素耐受性的蛋白将针对抗生素选择的耐受性赋予被感染的细胞。

在本发明优选的实施方式中，所述病毒包含A3L基因产物、A9L基因产物和/或A34R基因产物，其中，所述基因产物优选包含一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸序列修饰)。在本发明的一个实施方式中，所述病毒包含A3L基因产物，其中，所述基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)。在本发明的另一实施方式中，所述病毒包含A9L基因产物，其中，所述基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)。在本发明的又一实施方式中，所述病毒包含A34R基因产物，其中，所述基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)。

在本发明更优选的实施方式中，所述病毒包含：

(i)A9L基因产物和A34R基因产物，其中，所述A9L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)，所述A34R基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)；

(ii)A9L基因产物和A3L基因产物，其中，所述A9L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)，所述A3L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)；

(iii)A34R基因产物和A3L基因产物，其中，所述A34R基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)，所述A3L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)；或

(iv)A9L基因产物、A34R基因产物和A3L基因产物，其中，所述A9L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)，所述A34R基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)，所述A3L基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸替代)。“氨基酸替代”在本文中也称为“氨基酸取代”。本文使用的术语“氨基酸插入”是指发生在A3L、A34R和/或A9L基因产物的氨基酸序列内部的氨基酸修饰，而本文使用的术语“氨基酸添加”是指发生在A3L、A34R和/或A9L基因产物的N端或C端的氨基酸修饰。对于氨基酸修饰的优选实施方式，请参见本发明第一方面。

在第十方面，本发明涉及包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因并表达所述基因的细胞。

所述细胞优选包含：

(i)A3L基因和A9L基因；

(ii)A3L基因和A34R基因；

(iii)A9L基因和A34R基因；或

(iv)A3L基因、A9L基因和A34R基因。

所述细胞也称为重组细胞。具体而言，从MVA病毒/MVA病毒基因组分离所述基因，即所述基因不包含于MVA病毒/MVA病毒基因组，或者，不作为MVA病毒/MVA病毒基因组的一部分。

可用MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因转染所述细胞。MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因可在所述细胞中稳定维持或暂时存在。优选地，MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因在所述细胞中稳定维持。

A3L基因可具有SEQ ID NO：7所示的核酸序列；A34R基因可具有SEQ ID NO：8所示的核酸序列；和/或A9L基因可具有SEQ ID NO：9所示的核酸序列。

优选地，所述细胞进一步包含第九方面所述的MVA病毒。所述细胞能够反式提供(providing in trans)第九方面所述的MVA病毒的功能性缺失基因(即A3L、A9L和/或A34R基因)的基因产物(即A3L、A9L和/或A34R基因产物)。例如，(i)如果A3L基因在第九方面所述的MVA病毒中功能性缺失，包含A3L基因并表达所述基因的细胞能够反式提供A3L基因产物；(ii)如果A9L基因在第九方面所述的MVA病毒中功能性缺失，包含A9L基因并表达所述基因的细胞能够反式提供A9L基因产物；和/或(iii)如果A34R基因在第九方面所述的MVA病毒中功能性缺失，包含A34R基因并表达所述基因的细胞能够反式提供A34R基因产物。

A3L基因产物可具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；A34R基因产物可具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；和/或A9L基因产物可具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

进一步优选地，

(i)MVA病毒的A3L基因包含导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(ii)MVA病毒的A9L基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；和/或

(iii)MVA病毒的A34R基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸替代)。对于氨基酸修饰的优选实施方式，请参见本发明第一方面。

因此，所述细胞不仅能够反式提供第九方面所述的MVA病毒的功能性缺失基因(即A3L基因、A9L基因和/或A34R基因)的基因产物(即A3L基因产物、A9L基因产物和/或A34R基因产物)(参见上文)。还(或者)能够反式提供具有一个/至少一个氨基酸序列修饰的第九方面所述的MVA病毒的功能性缺失基因(即A3L基因、A9L基因和/或A34R基因)的基因产物(即A3L基因产物，其中该基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)；A9L基因产物，其中该基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)；和/或A34R基因产物，其中该基因产物包含一个/至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰))。因此，所述细胞用于制备(未突变的)MVA病毒，该MVA病毒包含不具有氨基酸序列修饰的A3L基因产物、A9L基因产物和/或A34R基因产物；或者，所述细胞用于制备(突变的)MVA病毒，该MVA病毒包含具有氨基酸序列修饰的A3L基因产物、A9L基因产物和/或A34R基因产物。对于氨基酸修饰的优选实施方式，请参见本发明第一方面。

所述细胞可为哺乳动物细胞(例如人类或灵长类细胞)，或禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)可为原代细胞(或来自于原代细胞培养物的细胞)、次代细胞(或来自于次代细胞培养物的细胞)或无限增殖化细胞(或来自于细胞系的细胞)。对于术语“原代细胞”、“原代细胞培养物”、“次代细胞”、“次代细胞培养物”、“无限增殖化细胞”或“无限增殖化细胞培养物”的定义，请参见本发明第一方面。在本发明优选的实施方式中，所述细胞来自于CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系来自于无限增殖化的美洲家鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)。CR.pIX细胞系进一步在其基因组中稳定整合有编码腺病毒pIX蛋白的基因并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

在第十一方面，本发明涉及包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因的核酸分子，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列。在本发明的一个实施方式中，所述核酸分子包含A3L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列。在本发明的另一实施方式中，所述核酸分子包含A9L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列。在本发明的又一实施方式中，所述核酸分子包含A34R基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列。

优选地，所述核酸分子包含：

(i)A3L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列；以及A9L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列，

(ii)A3L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列；以及A34R基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列，

(iii)A9L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列；以及A34R基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列，或者

(iv)A3L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列；A9L基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列；以及A34R基因，其中，优选所述基因可操作地连接至异源核酸序列。

也可将所述核酸分子称为重组核酸分子。具体而言，从MVA病毒/MVA病毒基因组分离上述基因，即所述基因不包含于MVA病毒/MVA病毒基因组，或者，不作为MVA病毒/MVA病毒基因组的一部分。

A3L基因可具有SEQ ID NO：7所示的核酸序列；A34R基因可具有SEQ ID NO：8所示的核酸序列；和/或A9L基因可具有SEQ ID NO：9所示的核酸序列。

术语“可操作地连接”意味着以能够实现相应构建体的读码框内(in-frame)表达的方式将A3L、A9L或A34R基因连接至异源核酸序列，所述方式例如通过避免移码(frame-shifts)或终止密码子、或通过经由内部核糖体进入位点(该内部核糖体进入位点允许翻译起始不依赖于mRNA的5'帽子结构)而分离异源核酸。此类内部核糖体进入位点为本领域所知晓，例如可来自于脊髓灰质炎病毒或脑心肌炎病毒基因组RNA。

术语“异源核酸序列”如上定义。优选地，异源核酸序列选自于编码抗原、表位、诊断性化合物或治疗性化合物的序列。更优选地，异源核酸序列为编码诊断性化合物的序列。诊断性化合物可为具有诊断效果的任何化合物。例如，诊断性化合物可为标志物/报告蛋白，例如抗体、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶或赋予抗生素耐受性的蛋白(例如针对氨苄青霉素的bla(β-内酰胺酶)或针对新霉素或G418的npt(新霉素磷酸转移酶))。可借助例如杂交技术、荧光显微术或ELISA测定法，将所述标志物/报告蛋白用于识别或分离病毒。此外，病毒中含有的赋予抗生素耐受性的蛋白将针对抗生素选择的耐受性赋予被感染的细胞。对于抗原、表位或治疗性化合物的优选实施方式，请参见本发明的第一方面。

优选地，

(i)MVA病毒的A3L基因包含导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(ii)MVA病毒的A9L基因包含导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；和/或

(iii)MVA病毒的A34R基因导致所述基因产物发生一个/至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。

所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸缺失)、氨基酸插入(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸插入)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸添加)和/或氨基酸替代(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸替代)。对于氨基酸修饰的优选实施方式，请参见本发明第一方面。

在第十二方面，本发明涉及重组MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供细胞；

(ii)将第九方面所述的MVA病毒和第十一方面所述的核酸分子导入所述细胞；以及

(iii)在允许所述MVA病毒和所述核酸分子的核酸序列之间进行同源重组的条件下对所述细胞进行培养，从而获得所述重组MVA病毒。

所述细胞可为哺乳动物细胞(例如人类或灵长类细胞)，或禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭的细胞，例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)可为原代细胞(或来自于原代细胞培养物的细胞)、次代细胞(或来自于次代细胞培养物的细胞)或无限增殖化细胞(或来自于细胞系的细胞)。对于术语“原代细胞”、“原代细胞培养物”、“次代细胞”、“次代细胞培养物”、“无限增殖化细胞”或“无限增殖化细胞培养物”的定义，请参见本发明第一方面。在本发明优选的实施方式中，所述细胞来自于CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系来自于无限增殖化的美洲家鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)。CR.pIX细胞系进一步在其基因组中稳定整合有编码腺病毒pIX蛋白的基因并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

优选地，用第九方面所述的MVA病毒感染所述细胞和/或用第十一方面所述的核酸分子转染所述细胞。本领域技术人员了解允许所述MVA病毒和所述核酸分子的核酸序列之间进行同源重组从而获得重组MVA病毒的条件。此外，本领域技术人员了解对同源重组是否成功进行评估的实验测试。

在不脱离本发明范围的情况下，对本发明的多种改造和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方式进行了描述，应理解的是，所请求保护的发明不应当过度限于这些具体实施方式。事实上，本发明旨在涵盖那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的方式的多种改造。

以下附图和实施例仅为对本发明进行说明，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求指明。

附图说明

图1：(A)MVA的盲传(blind passage)，其中，前代输入(input)病毒的浓度未知。期望的MOI为0.01至0.1，或感染时在2×10⁶个细胞/mL中为2×10⁴至2×10⁵pfu/mL输入病毒。(B)重复(A)中示出的实验，例外之处在于以设定为0.05的MOI开始各传代，并且总是对高传代数和低传代数的MVA进行平行研究。注意到MVA传至10代开始产量(yields)的再次突然增加表现出可重复性(reproducibility)。(C)峰值滴度通常在感染后48h获得。该图中仅示出这些产量。注意到各实验的参照传代表现出稳定的产量(在滴度方法的变化范围内，黑色符号)，并随着传代数增加产量逐渐提高、然后突然提高。(D)感染后48h高传代数MVA与低传代数MVA的产量之比。该计算利用子图(C)的数据进行。比值为1表明性质类似，并对第10代至第23代的MVA进行了观测。

图2：本文所述的突变在尿囊绒毛膜安卡拉牛痘(CVA，Genbank条目AM501482)基因组中的位置，所述尿囊绒毛膜安卡拉牛痘为高减毒的改造的安卡拉牛痘病毒(MVA)的亲代病毒。示出了所选择的用于取向(orientation)的限制性酶切位点、末端反向重复序列和缺失位点(Meyer等，1991，J Gen Virol 72(Pt 5)，1031-1038)(带罗马数字的浅色方框)。受到影响的基因(A3L、A9L和A34R)以黑色方框示出。虚线指出相关的序列改变。示出了编码链，字母数字混合项描述了MVA-CR株中各基因在DNA水平和氨基酸水平的突变。

图3：将不同谱系(lineages)名称添加至图1中已部分示出的数据。(A)MVA的盲传，其中，前代输入病毒的浓度未知。期望的MOI为0.01至0.1，或感染时在2×10⁶个细胞/mL中为2×10⁴至2×10⁵pfu/mL输入病毒。在该实验中，将MVA-A2传代成为MVA-X谱系，从而分离MVA-X14和MVA-X20。(B)重复(A)中示出的实验，例外之处在于以设定为0.05的MOI开始各传代，并且总是对高传代数和低传代数的MVA进行平行研究：低传代数曲线以MVA-A2开始，参照高传代数曲线以MVA-X14开始。注意到MVA传至10代开始产量的再次突然增加表现出可重复性。(C)峰值滴度通常在感染后48h获得。该图中仅示出这些产量。注意到各实验的参照传代表现出稳定的产量(在滴度方法的变化范围内，黑色符号)，并随着传代数增加产量逐渐提高、然后突然提高。在该受控的实验中，MVA-A2导致获得MVA-CR谱系，MVA-X14导致获得MVA-Y谱系。对分离株MVA-A2、MVA-CR7和MVA-CR11的基因组DNA进行测序。(D)A34R中的G256T基因型被发明人富集：注意到在MVA-X14、MVA-Y23和MVA-CR11中突然表现出对BsaWI的耐受性并持续积累。未消化的PCR扩增产物与无模板对照在图(F)中示出。(E)感染后48h高传代数MVA与低传代数MVA的产量之比。该计算利用子图(C)的数据进行。比值为1表明性质类似，并对第10代至第23代的MVA进行了观测。

图4：MVA-CR为新型毒株，MVA-CR19为该毒株的纯化分离株。(A)斑块纯化过程以及随后的限制性酶切消化检测。(B)传统的测序图谱表明，病毒分离株MVA-CR19在全部3个基因A3L、A9L和A34R中具有新型的纯基因型(pure genotype)。

图5：在结晶紫染色的细胞单层中MVA-A2和MVA-CR19的宏观斑块表型(macroscopic plaque phenotypes)。注意到MVA-CR19在感染后72小时已然出现彗星，而MVA-A2感染的CR细胞表现为具有圆形斑块的散点。MVA-CR19感染后96小时，培养物出现爆发性(fulminant)CPE，由于细胞质量大量损失，整体毒株强度表现得较弱。在该时间点，MVA-A2感染后也出现可见的彗星。在哺乳动物R05T培养物中看到与此相反的关系：仅在亲代MVA-A2感染后120h，斑块明显且形状类似彗星。对于该细胞系，MVA-CR19分离株表现为高减毒的。左侧子图示出肉眼可见的斑块(比例尺为0.5cm)，右侧子图示出初始放大40×后的细胞(比例尺为100μm)。

图6：40倍初始放大的斑块表型。注意到与被MVA-A2感染相比，被MVA-CR19感染的CR细胞的斑块更明显(上方的行)；MVA-CR11造成的斑块大小处于中间状态，似乎突变已在混合基因型中发挥辅助功能。在R05T细胞上观察到相反的情况：MVA-CR19似乎比MVA-A2更为减毒(下方的行)；同样地，MVA-CR11处于中间状态。

图7：悬浮培养的CR生产细胞的病毒释放。A2和CR19是指MVA分离株，CD-U3和CD-VP4是指为进行病毒生产所加入的1体积的相应介质，细胞增殖一直在CD-U3中进行。(A)在加入(黑色符号)或不加入(空心符号)病毒生产介质的细胞增殖介质中MVA-A2和MVA-CR19分离株的复制的动力学。10⁵pfu/ml处的虚线对应于输入病毒，MOI为0.05。(B)感染后48h上清液或完全裂解液(上清液和细胞结合的病毒)中感染单位的分布。浅色柱表明完全裂解液的pfu/mL，深色柱表明释放到细胞上清液中的感染单位的浓度。各柱顶部的饼图表示出相对于完全裂解液(LYS)，无细胞部分(SN)中的感染单位。(A)中示出的曲线为三次独立平行实验的平均值，为维持四条独立曲线之间的比较清晰明了，未示出标准差。在(B)中，对于48h的值，示出三次重复的标准差。获得这些数据点的样品来自动力学子图(A)。

图8：在存在血清的条件下培养的贴壁生产细胞的病毒释放。浅色柱表明完全裂解液的pfu/mL，深色柱表明释放到细胞上清液中的感染单位的浓度，各柱顶部的饼图表示出裂解液中的无细胞病毒的百分数。在感染的CR或CR.pIX细胞中于感染后48h对培养物进行MVA-A2或MVA-CR19测定，并在R05T细胞中于感染后144h对培养物进行MVA-A2或MVA-CR19测定。

图9：在贴壁的血清依赖性CR细胞和哺乳动物R05T细胞中获得的MVA的连续代系(sequential generations)。MVA-B为衍生自贴壁CR细胞的谱系，MVA-R为衍生自R05T细胞的谱系。(A)在前代滴度未知的条件下进行连续感染(sequential infection)。获得的输入病毒中的波动示于下侧(黑色)曲线中，产量示于上侧曲线中。单位为log10(pfu/mL)。(B)产量除输入病毒描述了各代病毒的扩增。MVA-X(上侧不连续曲线)为衍生自图1示出的化学上确定的悬浮培养的谱系。代数越高示出的扩增约多，峰值为每pfu输入病毒10000个感染性子代病毒。

图10：化学上确定的悬浮环境的优异特异性。MVA-B和MVA-R毒株中A3L C1915T、A9L A223G和A34R G256T区域的序列。在鸭或果蝠起源的贴壁培养物上传代的两个谱系维持野生型序列，在本文所述的开放读码框中未显出任何基因型改变的迹象。

图11：实施微聚焦测定法染色后Vero细胞的外观。与平行分离的MVA-B20(由贴壁的美洲家鸭细胞系获得)相比，MVA-R18(在来自埃及果蝠的细胞中传代获得的谱系或病毒株)滴度(titrations)中的灶点(foci)更明显。新获得的在灵长类起源的细胞中受限的复制表明作为疫苗株用于更大免疫刺激的潜能。

图12：MVA-CR分离株MVA-CR11和MVA-CR19的减毒。子图(A′)示出分离株MVA-CR11的复制性质，相对于(A)中示出的分离株MVA-CR19，再次处于中间位置。子图(B)示出MVA-CR19所造成的被感染的非禽类细胞的细胞病变效应(或不存在细胞病变效应)的实例。200倍初始放大(比例尺为20μm)的图示出第9天的图(A)的细胞。

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实施例

实施例1：在化学上确定的悬浮培养中MVA的连续分离株

在这一实施例中，我们研究了在已经完全容许该病毒的细胞系中获得的MVA的连续代系的性质。利用化学上确定的介质及稳定病毒体的组分(例如在最小程度纯化的具胚的卵的裂解物中含有的大量胞外蛋白和脂类或惯用于脊椎动物细胞培养的牛血清补充物)的缺失来施加选择性环境。

出于对DNA病毒稳定性的预期进行验证的目的，我们在CR细胞系中对MVA进行传代。为实验的目的，我们使用登记号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)所述的MVA毒株。所采用的悬浮培养和化学上确定的程序完全在监管部门提出的约束之下，为之前已开发并已提出的(Jordan等，2011，Biologicals 39，50-58)。在这里进行简要描述：为生产高滴度的超减毒痘病毒，使CD-U3介质中的CR或CR.pIX悬浮培养物增殖到4×10⁶个细胞/mL。加入1体积的CD-VP4病毒生产介质，将该培养物用病毒接种至所指明的感染复数(MOI)，所述感染复数通常为0.01至0.1。CR和CR.pIX细胞衍生自无限增殖化的美洲家鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27，748-756)，设计用于疫苗生产。CD-U3介质(PAA，目录号T1250,3001)为CD-U2细胞增殖介质的改进版，CD-VP4(Biochrom目录号F9127)为开发用于在病毒复制时补充增殖介质的病毒生产介质(Jordan等，2011，Biologicals 39，50-58)。在以下实施例中描述的所有培养在37℃、8％的增强CO₂气氛中进行。悬浮培养在5cm振幅的摇床(Infors)中孵育，试管为180rpm，摇瓶为150rpm。

以确定的时间间隔将样品从悬浮培养中移出，通常利用BransonS250-D单元供电的3.2mm超声器尖头(10％能量)超声处理45s，释放所述样品中的感染性病毒。

通过将连续稀释的病毒制剂加入至处于含有5％FCS的DMEM:F12介质(Gibco)中的80％汇合的Vero单层中，确定感染单位的数量。MVA在Vero细胞中不能复制，因此使用此类基质使得能够严格地只对输入病毒进行定量。48小时后，用甲醇将细胞固定，并与多克隆牛痘病毒抗体(Quartett Immunodiagnostika，Berlin，Germany)孵育，所述多克隆牛痘病毒抗体在含有1％胎牛血清的PBS中以1:1000稀释。用含有0.05％Tween 20的PBS进行两步洗涤，以1:1000加入牛痘特异性抗体的二抗。所述二抗偶联有过氧化酶，所述过氧化酶在与AEC试剂(3-氨基-9-乙基-咔唑；在含有0.015％H₂O₂、pH为5.0的0.1M乙酸盐缓冲液中为0.3mg/ml)孵育时催化颜色反应。利用光学显微镜识别感染灶点(infectedfoci)，从能够产生阳性染料反应的最大稀释倍数的MVA悬液计算斑块形成单位/ml。在平行重复中实施全部滴定(每样品总共4个滴定值)。

这是第一次将已适应于在原代鸡细胞中增殖的MVA连续暴露于无限增殖化(而不是原代)培养物，所述培养物同时也是非衍生自鸡的禽类生产基质。进而，我们在不添加血清、白蛋白或预期将稳定病毒的其它组分的化学上确定的培养介质中进行传代。

如图1A/图3A所示，随着传代增加，产量逐渐增加。实施此类初步实验来对各直接前代的病毒产量进行估计，利用这样的估计，我们设计利用0.01-0.1的MOI感染随后的培养物。由于直到能够对滴度进行评估所需的时间，不同代之间的真实MOI发生变化，在我们的情况下(任何传代都可能造成病毒复制的减弱或阻尼效果)，产量和MOI随着传代增加而上升。在发现MVA在完全容许的细胞系中存在令人惊讶的潜在传代效应后，我们在更严格的条件下重复了实验。

图1B-图1C中示出的数据通过利用各自的前代感染后48h分离的病毒将各代的MOI调整至0.05获得。将来自图1A/图3A的初步实验的倒数第二的14代病毒用作高传代数参照。因此，MVA性质的任何改变在该重复实验中确认。

图1B示出叠加的多代的动力学。对于各实验，对在独立的复样(duplicates)上进行的两个独立平行感染(从低传代数MVA及高传代数MVA开始)进行定量。在以低传代数病毒开始的曲线的第10代和第11代，我们发现产量从(已经很高的)10⁸pfu/mL大幅移动至超过10⁹pfu/mL。

为了使该效应更好地可视化，图1C仅描绘了48h峰值病毒滴度与传代次数的关系。从第14代开始的MVA传代在3.4×10⁹pfu/mL附近震荡，而低于10代的MVA传代在3.8×10⁸pfu/mL的范围。第10代和11代病毒突然复制至平均峰值为3.66×10⁹pfu/mL。由于测定病毒的滴度与变异(variations)相关，图1D/3D描绘了在各特定传代中低传代数病毒与高传代数病毒的比值。由于高传代数病毒的复制性质保持稳定，该方法对滴度标准差进行了标准化。较高的数值表明高传代数病毒的优势，比值为1表明低传代数病毒和高传代数病毒的性质高度相似、甚至相同。

图1D的数据显示，对于各代，较低传代数病毒的产量接近高传代数病毒的产量。尽管在实验开始时释放了高20倍量的高传代数病毒，该数值在10代后降至相等。在这一具体实验中，迈向高传代数表型的额外步骤开始于第8代。在第10代获得稳定的超高产量病毒，并显示出在第11代得以维持。在以独立参照谱系(起始于第14代)开始的超过8代病毒显示出总体稳定性。

实施例2：MVA基因组DNA的测序

随后，我们测定了选定的病毒代系(passages)的DNA序列：如已描述的，在CD-U3和CD-VP4混合介质的1:1混合物中，利用MVA以0.01的MOI感染100mL 2×10⁶个细胞/mL的AGE1.CR培养物(Jordan等，2011，Biologicals 39，50-58)。感染后48h，以200×g离心去除细胞，在清澈的上清液中加入聚乙二醇(处于纯水中的13w/v％储液)至8％的浓度。在冰上孵育30min后，以6600×g对悬浮液离心60min，在500μLPBS中将含有病毒粒子的半透明沉淀重悬。

用8单位的Turbo DNase(Ambion)消化病毒外(extraviral)DNA，随后利用DNA血液小量制备试剂盒(Qiagen)分离总DNA(主要是病毒基因组)；两个程序均按照供应商的说明书进行。

为了计算期望产量：MVA基因组为178kbp，每bp DNA为660g/mol，对应于1.17×10⁸g DNA/mol病毒。用该值除以NA(6.02×10²³/mol)，得到1.95×10^-16g DNA/MVA粒子。假设产量为10⁸pfu/mL，预计可为1.95×10^-8g病毒DNA/mL，或19.5ng/mL。

在制剂中，我们获得约8μg总DNA，进行多重qPCR以进一步估计病毒基因组DNA与细胞DNA之比。利用CgTTTTgCATCATACCTCCATCTT(SEQ ID NO：13)、6FAM-AggCATAAACgATTgCTgCTgTTCCTCTgT-BHQ1(SEQ ID NO：14)和gCgggTgCTggAgTgCTT(SEQ ID NO：15)，借助qPCR，针对胞内成熟病毒的膜蛋白MVA128L的基因(GenBank#U94848的120811-120898bp)来对MVA水平进行定量。就检测细胞DNA而言，利用TgACTCCggTCCTTCTAACACA(SEQ ID NO：16)、YAK-CCCggTggTCCCgCTgTgC-BHQ1(SEQ ID NO：17)和TCACggCAACTggTTTAATgg(SEQ ID NO：18)对E1A转基因进行定量。在25μL的最终反应体积中，将100nM引物、80nM探针与dNTP(混合至200μM)以及TaqMan Universal PCR Master Mix(#4324018，AppliedBiosystems)(混合至1×浓度)混合。在ABI Prism 7000上进行热循环：50℃2min；95℃10min；以及40个循环的95℃15s和60℃1min。MVA的典型Ct值为16，细胞DNA的典型Ct值为33。Ct值的差异表明相对分子浓度的差异，从而病毒与宿主DNA之比为2^33-16或130000:1，这对于全基因组测序而言是适当的。

借助Roche/454GS FLX+技术获得序列。对第2代、第7代和第11代(图1中示出)的病毒基因组DNA进行测序(各基因组为50倍覆盖度)，并使用非强制算法(unforced algorithm)(没有引导序列)进行组装。如由痘病毒所预期的，对这三代的比对揭示了极高的序列保守性。核苷酸重复中的一些单碱基缺失最有可能展示了测序假象(例如tttttat-aaaataa相对于tttttataaaaataa)，并未将其纳入进一步的分析中。

只有三个符合非假象定义的点突变，这三个点突变在所检查的第11代病毒基因组中发现。全部三个点突变都在编码区域，各自影响了不同的结构蛋白，且各自改变了氨基酸组成。我们认为这些改变非常显著，且完全出乎预料。因此，我们获得了一种新型MVA毒株，在下文中将该毒株称为MVA-CR。

在MVA-CR中发现的三个突变中的第一个位于CVA毒株(GenBank#AM501482)(本文将CVA毒株用于定位目的)的第111561bp处。该突变是在按照通用痘病毒基因组注释(Meyer等，1991，J Gen Virol 72(Pt5)，1031-1038；Rosel等，1986，J Virol 60，436-449)被称为A3L的基因的编码序列中第1915位核苷酸的C至T转换(简称为C1915T)。该基因产物为主要核心蛋白P4b前体。C1915T突变导致氨基酸序列中在第639位密码子处从His(CAU)改变为Tyr(UAU)。注意到A3L基因在痘病毒基因组中为反义方向，因此编码序列中的C1915T对应于CVA基因组DNA中的G111561A。

第二个突变是A9L编码的10.6k病毒体膜蛋白编码序列中的A223G转换，在CVA基因组中为T119151C转换。A223G突变将第75位密码子由Lys(AAG)改变为Glu(GAG)。

第三个突变是A34R编码的EEV膜糖蛋白的编码序列中的G256T颠换，在CVA基因组DNA中为G144417T颠换。G256T突变将第86位密码子由Asp(GAT)改变为Tyr(UAU)。

本实验中使用的MVA的基因组中的位置，登记号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)：A3L，互补链上100334bp至102268bp；A9L，互补链上107855bp至108139bp；以及A34R，基因组链上129078..129584。所使用的毒株为可从American Type Culture Collection(ATCC)获得的编号为VR-1508的病毒。

全部三个突变所影响的MVA蛋白为感染性粒子的组分。更详细地对受影响的蛋白功能进行描述如下：

A3L基因产物：A3L基因产物P4b为三个主要核心蛋白之一，在球形的非感染性未成熟病毒体(IV)成为胞内成熟病毒体(IMV)的成熟过程中被I7L编码的病毒蛋白酶加工(Byrd等，2002，J Virol 76，8973-8976)。P4b蛋白在极早期步骤促进病毒体的形态建成。它参与向感染性IMV转变的过程中的正确压缩和膜重排(Heljasvaara等，2001，JVirol 75，5778-5795；Kato等，2004，Virology 330，127-146)。

A9L基因产物：该基因产物与P4b类似，参与MVA成熟的早期步骤。A9L基因产物是对IMV核心的正确压缩而言重要的因子(Yeh等，2000，J Virol 74，9701-9711)。

A34R基因产物：胞外包膜病毒(EEV)已演变为使得病毒传播至远处的媒介。EEV额外的膜并不是配备来介导与靶细胞的融合，必须将该膜破坏从而释放IMV，这是牛痘病毒的实际感染单位。A34R缺失突变的研究表明，通过使得EEV的外膜去稳定化，该因子对于在胞外空间的感染活性以及牛痘病毒的传播极其重要(Husain等，2007，Virology 366，424-432)。A34R蛋白与A33R和B5R蛋白(Blasco等，1993，J Virol 67，3319-3325；Katz等，2002，J Virol 76，11637-11644；Meiser等，2003，J Gen Virol 84，1383-1392)共同调控与细胞结合的包膜病毒(CEV)从产生该病毒的细胞脱离的速度。

先前从未描述过具有上述突变的MVA病毒。因此，在稳定的禽类细胞系的化学上确定的悬浮培养中对MVA进行传代通过改变两种整合蛋白(A3L和A9L基因产物)，改进了实际的感染性实体(成熟病毒)。这些改变增加了感染性，提高了成熟速度，和/或增加了在不含血清的预期稳定化成分的此类环境中的稳定性。此外，在调控病毒胞外形式性质的A34R基因产物中检测到点突变。该改变增加了脱离速度并降低了外病毒包膜(其遮蔽成熟粒子的感染性)的稳定性。

实施例3：确认实验

为了排除将我们出乎预料的发现解释为测序假象，我们实施了确认实验。为了确认MVA-CR在制剂中的存在，我们设计了用于扩增全部受影响的开放读码框的引物，用于额外的测序反应。利用KOD HiFi DNA聚合酶(TOYOBO Novagen)实施PCR，进行20s、55℃退火，60s、72℃延伸(对A3L而言为120s)以及20s、94℃变性的36个循环。用于扩增A9L编码序列的引物(f＝正向，r＝反向)为GCAAACGCGATAAGGATACG(a9lf)(SEQ ID NO：19)和AAGCGGATGCAGAATAGACG(a9lr)(SEQID NO：20)；用于扩增A34R编码序列的引物为gCggAATCATCAACACTACCC(a34rf)(SEQ ID NO：21)以及TAATAACAAACgCggCgTCCATggC(a34rr)(SEQ ID NO：22)。对相当大的A3L开放读码框的测序利用数个引物跨越进行：利用GCAGAAGAACACCGCTTAGG(a3lf)(SEQ ID NO：23)和ATGGAAGCCGTGGTCAATAG(a3lr)(SEQ ID NO：24)实施扩增，利用TGAGAGCTCGCATCAATC(a3lf2)(SEQ ID NO：25)、ATCGGACTGTCGGATGTTGTG(a3lf3)(SEQ ID NO：26)以及CTAGAATCGGTGACCAACTC(a3lr3)(SEQ ID NO：27)实施测序。

偶然发现，A34R中的突变D86Y引入AccI限制性酶的靶点：从变为ccG/(粗体字为突变，大写字母为限制性酶切靶点)。同时，由于突变D86Y，野生型的BsaWI位点丧失，从agA/变为利用AccI对772bp的A34R扩增产物进行消化，对于亲代MVA而言产生399和373bp，而对于MVA-CR而言产生399、316和57bp。相反地，利用BsaWI消化，对于亲代MVA而言产生452和320bp，而对于MVA-CR而言为全长772bp。通过在TAE缓冲液中进行3％琼脂糖凝胶电泳将所述片段分开。

图3D示出A34R中的D86Y突变是MVA-CR11群体的一部分。该突变还独立地在X14谱系中获得。该结果确认了本文发现的突变不是偶然事件，而与病毒复制过程中起效的环境相关。

我们还通过对扩增片段的常规测序确认了这些意料不到的结果。由于测序有意地在纯化的PCR反应物上直接实施而不进行亚克隆，预期图4示出的图谱将反映平均序列，即不仅为丰度最高的序列，还存在序列变异。通过利用琼脂糖凝胶电泳解析PCR产物、将含有单个显著信号的胶条切下、并按照制造商的指示利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离其中的DNA混合物，从而进行PCR反应物的纯化。利用与扩增相同的引物实施测序。

我们确认了在MVA-CR11和独立的X14谱系中都存在全部三个观测到的突变。

实施例4：新型MVA-CR毒株的分离和纯化

为了获得纯的MVA-CR病毒，我们接下来实施了斑块纯化：将1×10⁶个贴壁CR细胞接种至6孔板的各孔中，所述各孔中具有含5％FCS的DMEM:F12介质(Biochrom)。24小时后，仅加入总pfu为10⁴的MVA-CR16，所述MVA-CR16即为MVA-CR11再在化学上确定的CR悬浮培养中经过5次传代的后代。用少量感染单位感染允许获得充分分开的斑块。30min后，用处于含有5％FCS的DMEM:F12介质中的0.8％低熔点琼脂糖(Sigma#A9045)替换培养介质。琼脂糖覆盖防止由被感染的细胞单层释放的子代病毒扩散，从而各个斑块不会交叉污染。该覆盖还允许通过借助中空针回收小琼脂糖芯(约2mm直径)来分离子代病毒。此类琼脂糖芯挑取自细胞病变效应的灶点，并转移至12孔板中处于80％最大汇合度的新鲜贴壁细胞单层，每个琼脂糖芯放入单独的孔。病毒从琼脂糖芯中扩散出，感染孔内的细胞，由于获得的病毒(理论上)衍生自单个初始斑块，认为通过该程序获得的病毒为纯化的。然而，一些病毒倾向于聚集，痘病毒也存在该问题，从而特定的宿主培养可被病毒的混合物感染。如图4所示，认为从MVA-A2的第17代移出(因此称为MVA-CR17*，星号表示斑块纯化为额外操作)的该制剂的分离株#9为纯的，选择它进行进一步的斑块纯化。第二轮获得期望的A34R基因型。选择该第二轮的分离株#1，并在化学上确定的CR培养中扩增。直接由PCR中对A3L、A9L和A34R基因进行测序，而不对片段进行任何亚克隆，发现了新型的纯的独特群体。

综上所述，通过对衍生自在无限增殖化的细胞系上进行的化学上确定的过程的病毒进行重复分离，我们获得并进一步纯化出新型牛痘病毒毒株，根据微生物学定义，毒株(strain)意味着“在纯培养物中单个分离株的后代…能够与其它分离株…在表型和基因型特征方面区分开”(van Belkum等，2007，Clin Microbiol Infect 13Suppl 3，1-46)。我们将该毒株称为MVA-CR。该毒株的首个完全纯化的确凿(tangible)成员为MVA-CR19，区别特征为选自于由下列突变所组成的组中的至少一个突变：A3L基因中的C1915T、A9L基因中的A223G以及A34R基因中的G256T，全部数字指的是编码链。

实施例5：MVA-CR的性质(产量)

与含有亲代毒株的群体相比，含有MVA-CR的制剂的产量提高了几乎10倍。这是极其重要的性质。基于MVA的疫苗的超减毒性是重要的安全特征，但也伴随剂量需求的成本：为有效地刺激免疫系统，估计每次免疫接种需要10⁸个MVA感染单位(Coulibaly等，2005，Virology 341，91-101；Gilbert等，2006，Vaccine 24，4554-4561)，并且，就针对感染性疾病的全球项目而言，每年可能需要上亿剂量的高减毒痘病毒。作为比较，还在禽类细胞中生产的具有有限复制潜能的较少减毒的毒株包括针对麻疹、腮腺炎和黄热病的疫苗；这些仅需要每剂量10³至5.5×10⁴个感染单位(来自Sanofi Pasteur的YF-以及来自Merck的M-M-的包装说明书的信息)。针对天花常规接种的牛痘Dryvax株的保护剂量为2.5×10⁵个感染单位(Rotz等，2001，MMWR Recomm Rep 50，1-25；quiz CE21-27)，比基于MVA的疫苗的推荐剂量低了400倍。因此，为了顾及所有的预计的疫苗接受者，将需要新型高效且稳健的基于MVA的疫苗的生产体系，并需要新型MVA毒株来实现技术进步。

实施例6：MVA-CR的性质(从宿主细胞中逃逸)

另一同样重要的性质是病毒制剂的纯度。对于连续细胞系衍生的任何疫苗而言，需要对制剂进行纯化以耗尽来自宿主细胞的组分。就残余DNA而言，认为每剂量的最高水平为10ng(Hess等，2012，Vaccine 30，2715-2727)是可接受的。传统MVA中相当大的部分是与细胞高度结合的。我们鉴别的新型突变体使得病毒更易释放和从宿主细胞脱离。EEV外膜的去稳定化使得胞外体积中存在更大部分的实际病毒感染单位(病毒体，对应于IMV)。

为了确认的目的，实施了如先前描述的针对未减毒的牛痘病毒的“彗星测定法”(McIntosh和Smith，1996，J Virol 70，272-281)。此类测定法使病毒从宿主细胞中逃逸的能力可视化：圆形斑块表明强细胞结合，而细长的彗星状斑块表明子代病毒从宿主细胞脱离，开始在更远的位点造成感染。在我们的实验中，在T25培养瓶中接种1×10⁶个贴壁CR或1.5×10⁶个R05T细胞。R05T是对来自埃及果蝠的原代细胞进行无限增殖化获得的细胞系。这是极少数容许MVA的哺乳动物细胞系之一(Jordan等，2009，Virus Res 145，54-62)，作为本文所述实验的参照。24h后，加入50000pfu的MVA-V2或MVA-CR19。将培养瓶放入培养箱静置至少72h，保证释放出的病毒再次感染最近邻处，从而仍能够与最初的斑块相连。直接向介质中加入0.2倍体积的PBS中的10％甲醛，将细胞单层固定。如图5所示，在用水中的0.05％结晶紫(Sigma)染色后，甚至肉眼都可观察到MVA-A2和MVA-CR19具有不同的斑块形态。

图6示出用MVA-A2、MVA-CR11或MVA-CR19感染的CR和R05T细胞单层的40×初始放大的典型斑块。在这一较高的放大倍率下，我们更清楚地观察到R05T上更高减毒的MVA-CR19，并确认了CR细胞中由MVA-CR19造成的明显斑块的存在。

随后我们检查了在贴壁培养中的斑块表型是否也是化学上确定的被感染的细胞培养中更大病毒移动性的指标。因此，我们用实施例1所述的MVA-A2和MVA-CR19分离株对CR.pIX悬浮培养物进行感染，只是这一次在200×g将样品离心5分钟，获得无细胞上清液(缩写为“SN”)。弃去细胞沉淀，对SN中的病毒进行三次冷冻/解冻循环(-85℃/37℃)，使得EEV的外膜破裂，增强感染性。

进而，我们还在不添加CD-VP4病毒生产介质的仅CD-U3细胞增殖介质中在单相过程(monophasic process)中测试了病毒复制。我们之前展示了在感染时添加CD-VP4的二相过程(biphasic process)显著提高了高减毒痘病毒的产量(Jordan等，2011，Biologicals 39，50-58)。出于这一原因，非常出乎预料的是，图7A中所示的复制动力学的比较表明，MVA-CR19分离株在单相过程中的复制与在二相环境中(灰色曲线)同样有效。就MVA-A2而言，证实了所预计的至少10倍的差别(黑色曲线，空心符号为单相过程)。

因此，我们获得了促进MVA从宿主细胞释放的功能获得型突变。这也被图7中示出的数据(当我们将上清液(SN)和完全裂解液中的感染单元进行比较时)所确认。就图中的子图B而言，不仅由SN、还由完全细胞悬液的超声裂解液对感染后48h的病毒进行测定。与MVA-A2(在单相过程和二相过程中分别为3.6％和4.9％)相比，在无细胞部分中感染性MVA-CR19病毒的百分比更高(在单相过程中为74.0％，在二相过程中为37.5％)。

在病毒生产介质的存在下更多MVA-CR19病毒被困在宿主细胞中这一事实与我们通过诱导细胞聚集体促进细胞-细胞间的病毒传播的意图相一致。该观测还在图8示出的贴壁培养中得以确认，其中，与MVA-A2相比，在全部测试的培养中MVA-CR19的释放均得到促进，尽管区别不太明显。如前文所讨论的，EEV的外膜干扰MVA的感染性，MVA-CR胞外感染性增加的一个原因在于降低了该组分的稳定性。在不搅拌且存在稳定病毒体的胎牛血清的条件下，MVA-CR19的该外膜被保留的时间间隔更长，抹杀(levelling)了MVA-CR19的这种潜在优势。进而，由于已知二价阳离子促进细胞贴壁(Attramadal，1969，J Periodontal Res 4，166)，设计用于贴壁培养的介质中二价阳离子的浓度更高。升高的Mg²⁺和Ca²⁺浓度也可能使得病毒包膜与细胞质膜的结合更强，再次抹杀了我们观测到的MVA-CR在化学上确定的悬浮培养中的任何优势。

因此，MVA-CR19获得了增强的从宿主细胞逃逸的能力。然而，完全出乎预料和令人惊讶的明显趋势是，随着MVA-CR毒株纯度的增加(我们获得了MVA-CR19分离株)，R05T细胞系中的减毒似乎提高，这由该细胞系中小的完全受限的灶点体现。该性质是极其有价值的：该新型MVA-CR毒株在维持高减毒的同时更易于从生产细胞中逃逸。由于可利用无细胞上清液而不是全细胞裂解液作为收集源(harvest bulk)，胞外病毒分数的增加极大促进了纯化。此外，真正的单相生产过程是可能的：可在与用于细胞增殖的相同的培养介质中生产高滴度的MVA-CR。除了加入少量(少于培养体积的5％-20％)添加物以提供葡萄糖或其它营养物，或者调节pH，不再需要任何病毒生产介质。

实施例7：MVA-CR的性质(对于化学上确定过程的特异性)

为进一步表征该选择性压力驱动产生的毒株MVA-CR，我们还在实验中从贴壁CR和R05T细胞系分离了连续几代的MVA，该实验反映了实施例1描述的初步实验。利用贴壁CR细胞系来检验MVA-CR的产生除了受到培养条件的影响，是否还受到宿主细胞特性的影响。将尽管是哺乳动物细胞系、但也容许MVA的R05T细胞系作为参照，再次测试选择的特异性和亲代MVA的稳定性。

就这一实验而言，对于各代，在T25培养瓶中分别接种1.5×10⁶个CR.pIX细胞和1×10⁶个R05T细胞。以预计为0.1的MOI进行感染。在稍晚阶段通过滴定测定的实际输入病毒示于图9A中。对于连续的病毒代系，在感染后48h至72h对具有完全细胞病变效应的CR培养物进行回收、并在感染后72h至96h对R05T培养物进行回收。如实施例1所描述的，通过超声处理从裂解液中释放病毒。

图9B通过输入病毒与从悬浮CR、贴壁CR或贴壁R05T培养物分别获得的各代释放的子代病毒之比，描绘了病毒的扩增。用于计算悬液中扩增的数据由实施例1所述的第一个实验获得。三个实验的线性回归线表明病毒复制效力随代数增加而提高，表明在全部三种体系中MVA发生某些适应。该效果似乎在哺乳动物R05T细胞中是最大的，R05T细胞也是与MVA的同源鸡宿主差异最大的。

然而，本研究真正令人惊讶并被本研究充分证实的事实是，虽然MVA适应于血清依赖性培养，A34R中的G256T基因型在这两种体系的任一种中均不出现也不积累。利用实施例3所建立的相同方法，将该结果在图9的子图C中总结性示出。

图9C中示出的观测结果已经通过对A3L、A9L和A34R基因的测序而得以确认。如图10所示，没有任何迹象表明在鸭或果蝠衍生的贴壁细胞系中传代的病毒中出现或积累新型MVA-CR基因型。

对于R05T衍生的MVA而言，扩增速度的顺序增加最大。进而，在感染单位的测定中，我们观察到与平行分离的MVA-B20(MVA在CR细胞中复制更快，使得在12周实验的末期领先2代)相比，MVA-R毒株(例如图11中示出的MVA-R18分离株)产生更强的信号，且灶点通常牵涉多于一个细胞。灶点牵涉多个细胞且染色更强给出如下结论：在通常为非容许的Vero指示细胞系中复制受到限制。与本文检查的全部CR衍生的毒株(MVA-B、MVA-X、MVA-Y和MVA-CR本身)相反，MVA-R毒株在哺乳动物体系中似乎减毒较少。相比MVA-CR毒株，此类病毒可具有所期望的性质：由于在感染处复制受限，它可能免疫原性更强，并且，它可能极其适合作为动物中载体疫苗的骨架(特别是在难以进行狂犬病免疫接种的翼手目动物中)。

综上所述，MVA在化学上确定的悬浮培养中的复制为出现MVA-CR的主要驱动力。通常情况下，寄生虫(病毒)与宿主的相互作用形成选择性环境。然而，在本文中，人工的化学上确定的介质、悬浮培养或二者的组合(最能满足疫苗工业生产的需要)明显是将最初的野生型MVA基因型转化为MVA-CR的主要驱动力。

实施例8：MVA-CR的性质：减毒

减毒描述了与亲代群体相比，病毒群体复制潜能的任何损失。与牛痘病毒相比，MVA丧失了在大部分哺乳动物细胞(特别是灵长类动物细胞、包括人类细胞)中复制的潜能。这一性质是允许MVA作为疫苗载体被应用、并允许用于免疫功能低下的人类接受者的重要特征。

为了测试MVA-CR的减毒是否被维持，我们用MVA-A2、MVA-CR11和MVA-CR19感染了CR、Vero和R05T细胞系的贴壁单层细胞。在6孔板的各孔中分别接种5×10⁵个(CR)、2×10⁵个(R05T)和1×10⁵个(R06E和Vero)细胞，并加入MVA至MOI为0.1。通过将板冷冻并在指定的时间点对解冻的裂解液进行超声处理来制备细胞裂解液。如上所述，全部样品在-85℃储存，并在实验最后利用在Vero细胞上实施的微聚焦测定法对全部样品一并进行滴定。图12中的复制数据确认了MVA-CR毒株在Vero细胞中完全减毒且不复制，在R06E细胞(也为来自埃及果蝠的细胞系)中复制非常缓慢，在R05T细胞中适度复制，而在CR培养物中非常大量地产生。之前在MVA-A2中也确认了类似的复制表型(Jordan等，2012，Viruses 4，889-900)。

Claims (40)

1.一种改造的安卡拉牛痘(MVA)病毒，所述病毒包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

2.权利要求1所述的MVA病毒，其中，所述核酸序列进一步编码A9L基因产物，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

3.权利要求2所述的MVA病毒，其中

(i)所述病毒包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变；或者

(ii)所述病毒包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

4.权利要求2所述的MVA病毒，其中，所述病毒包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

5.权利要求1-4中任一项所述的MVA病毒，其中，

(i)所述氨基酸序列修饰位于跨越SEQ ID NO：1所示的A3L基因产物第634-644位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的区域；

(ii)所述氨基酸序列修饰位于跨越SEQ ID NO：2所示的A34R基因产物第81-91位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的区域；和/或

(iii)所述氨基酸序列修饰位于跨越SEQ ID NO：3所示的A9L基因产物第70-80位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的区域。

6.权利要求5所述的MVA病毒，其中，

(i)所述氨基酸序列修饰位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(ii)所述氨基酸序列修饰位于所述A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(iii)所述氨基酸序列修饰位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；

(iv)所述氨基酸序列修饰位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置；和/或

(v)所述氨基酸序列修饰位于所述A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置。

7.权利要求5或6所述的MVA病毒，其中，所述氨基酸序列修饰为氨基酸缺失或氨基酸替代，其中，

(i)位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H缺失，或被疏水性氨基酸、带负电的氨基酸或极性不带电氨基酸替代，所述疏水性氨基酸优选A、V、I、L、M、F、Y或W，所述带负电的氨基酸优选D或E，所述极性不带电氨基酸优选S、T、N或Q；

(ii)位于所述A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的R缺失，或被疏水性氨基酸、带负电的氨基酸或极性不带电氨基酸替代，所述疏水性氨基酸优选A、V、I、L、M、F、Y或W，所述带负电的氨基酸优选D或E，所述极性不带电氨基酸优选S、T、N或Q；

(iii)位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D缺失，或被疏水性氨基酸、带正电的氨基酸或极性不带电氨基酸替代，所述疏水性氨基酸优选A、V、I、L、M、F、Y或W，所述带正电的氨基酸优选R、H或K，所述极性不带电氨基酸优选S、T、N或Q；

(iv)位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K缺失，或被疏水性氨基酸、带负电的氨基酸或极性不带电氨基酸替代，所述疏水性氨基酸优选A、V、I、L、M、F、Y或W，所述带负电的氨基酸优选D或E，所述极性不带电氨基酸优选S、T、N或Q；和/或

(v)位于所述A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K缺失，或被疏水性氨基酸、带负电的氨基酸或极性不带电氨基酸替代，所述疏水性氨基酸优选A、V、I、L、M、F、Y或W，所述带负电的氨基酸优选D或E，所述极性不带电氨基酸优选S、T、N或Q。

8.权利要求7所述的MVA病毒，其中，所述氨基酸替代为如下氨基酸替代：

(i)位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代(H639Y A3L基因产物突变)；

(ii)位于所述A3L基因产物第638位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的R被Y替代(R638Y A3L基因产物突变)；

(iii)位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代(D86Y A34R基因产物突变)；

(iv)位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(K75E A9L基因产物突变)；和/或

(v)位于所述A9L基因产物第74位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(K74E A9L基因产物突变)。

9.权利要求7或8所述的MVA病毒，其中，所述氨基酸替代为如下氨基酸替代：

(i)位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，且位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代(H639Y A3L/D86Y A34R基因产物突变)；

(ii)位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，且位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(H639Y A3L/K75E A9L基因产物突变)；

(iii)位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代，且位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(D86Y A34R/K75E A9L基因产物突变)；或者

(iv)位于所述A3L基因产物第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的H被Y替代，位于所述A34R基因产物第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的D被Y替代，且位于所述A9L基因产物第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的K被E替代(H639YA3L/D86Y A34R/K75E A9L基因产物突变)。

10.权利要求7-9中任一项所述的MVA病毒，其中，

(i)具有H639Y突变的所述A3L基因产物具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少95％一致性的所述序列的变异体，其中，所述变异体包含位于第639位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸Y；

(ii)具有D86Y突变的所述A34R基因产物具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少95％一致性的所述序列的变异体，其中，所述变异体包含位于第86位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸Y；和/或

(iii)具有K75E突变的所述A9L基因产物具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或为与所述氨基酸序列具有至少95％一致性的所述序列的变异体，其中，所述变异体包含位于第75位的氨基酸位置或与之对应的氨基酸位置的氨基酸E。

11.权利要求1-10中任一项所述的MVA病毒，其中，所述病毒还包含异源核酸序列。

12.权利要求11所述的MVA病毒，其中，所述异源核酸序列选自于编码抗原、特别是抗原表位，诊断性化合物或治疗性化合物的序列。

13.权利要求1-12中任一项所述的MVA病毒，其中，所述病毒在禽类细胞中能够生产性复制。

14.权利要求1-13中任一项所述的MVA病毒，其中，所述病毒在灵长类动物细胞、更优选人类细胞中不能生产性复制。

15.权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒的基因组。

16.包含权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒或权利要求15所述的基因组的细胞。

17.权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞为非贴壁/悬浮细胞。

18.权利要求16或17所述的细胞，其中，所述细胞为禽类细胞。

19.权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒的培养方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供权利要求16-18中任一项所述的细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；以及

(iii)分离所述MVA病毒。

20.权利要求19所述的方法，其中，在细胞增殖介质并随后在病毒生产介质中对所述细胞进行培养，或仅在细胞增殖介质中对所述细胞进行培养。

21.权利要求19或20所述的方法，其中，从无细胞上清液和/或细胞裂解液中分离所述MVA病毒。

22.权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)用MVA病毒感染细胞；

(ii)对所述细胞进行培养；

(iii)分离所述MVA病毒；以及

(iv)利用步骤(iii)中分离的所述MVA病毒重复步骤(i)至步骤(iii)，直至检测到包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

23.权利要求22所述的方法，其中，重复步骤(i)至步骤(iii)，直至检测到包含进一步编码A9L基因产物的核酸序列的MVA病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

24.权利要求22或23所述的方法，其中，在病毒生产介质中对所述细胞进行培养。

25.包含权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒或权利要求15所述的基因组以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体的药物组合物。

26.包含权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒或权利要求15所述的基因组的疫苗。

27.权利要求1-14中任一项所述的MVA病毒或权利要求15所述的基因组在医药方面的用途。

28.权利要求27所述的MVA病毒或基因组在免疫接种方面的用途。

29.包含核酸序列的MVA病毒，其中，A3L基因和/或A9L基因功能性缺失。

30.权利要求29所述的MVA病毒，其中，A34R基因进一步功能性缺失。

31.权利要求29或30所述的MVA病毒，其中，功能性缺失的所述基因被异源核酸序列替代。

32.权利要求31所述的MVA病毒，其中，所述异源核酸序列选自于编码抗原、特别是抗原表位，诊断性化合物或治疗性化合物的序列。

33.权利要求29-32中任一项所述的MVA病毒，其中，所述病毒包含A3L基因产物、A9L基因产物和/或A34R基因产物，其中，所述基因产物优选包含氨基酸序列修饰。

34.包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因并表达所述基因的细胞。

35.权利要求34所述的细胞，其中，

(i)所述MVA病毒的所述A3L基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变；

(ii)所述MVA病毒的所述A9L基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变；和/或

(iii)所述MVA病毒的所述A34R基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

36.权利要求34或35所述的细胞，其中，所述细胞进一步包含权利要求29-33中任一项所述的MVA病毒。

37.权利要求34-36中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为禽类细胞。

38.包含MVA病毒的A3L基因、A9L基因和/或A34R基因的核酸分子，其中，所述基因可操作地连接至异源核酸序列。

39.权利要求38所述的核酸分子，其中，

(i)所述MVA病毒的所述A3L基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变；

(ii)所述MVA病毒的所述A9L基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变；和/或

(iii)所述MVA病毒的所述A34R基因包含导致所述基因产物发生氨基酸序列修饰的至少一个突变。

40.一种重组MVA病毒的生产方法，所述方法包含如下步骤：

(i)提供细胞；

(ii)将权利要求29-33中任一项所述的MVA病毒和权利要求38或39所述的核酸分子导入所述细胞；以及

(iii)在允许所述MVA病毒和所述核酸分子的核酸序列之间进行同源重组的条件下对所述细胞进行培养，从而获得所述重组MVA病毒。