JP2015535687A - 新規mvaウイルス及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに関する。本発明はまた、前記MVAウイルスを培養するための方法、及び前記MVAウイルスを生産するための方法に関する。さらに、本発明は、前記MVAウイルスと、1つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記MVAウイルスを含むワクチンに関する。加えて、本発明は、医薬に使用するための前記MVAウイルスに関する。
Description
本発明は、新規改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに関する。本発明はまた、前記MVAウイルスを培養するための方法、及び前記MVAウイルスを生産するための方法に関する。さらに、本発明は、前記MVAウイルスと、1つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記MVAウイルスを含むワクチンに関する。加えて、本発明は、医薬に使用するための前記MVAウイルスに関する。
発明の背景
ワクチンは、利用可能で最も有効なヒト治療行為の1つであり、非常に広範囲の感染性疾患から保護する。しかしながら、いくつかの潜在的及び慢性的な病原体に対しては、防御免疫又は治療免疫を依然として高めることができない。抗体反応を主に誘発する従来のアプローチは成功していない。理由としては、エピトープが可変性であり得るか、微生物腐敗によって頻繁に遮蔽若しくは保護され得るか、又は病原体が抗体にアクセス不可能なように隠れることが挙げられる。
ワクチンは、利用可能で最も有効なヒト治療行為の1つであり、非常に広範囲の感染性疾患から保護する。しかしながら、いくつかの潜在的及び慢性的な病原体に対しては、防御免疫又は治療免疫を依然として高めることができない。抗体反応を主に誘発する従来のアプローチは成功していない。理由としては、エピトープが可変性であり得るか、微生物腐敗によって頻繁に遮蔽若しくは保護され得るか、又は病原体が抗体にアクセス不可能なように隠れることが挙げられる。
不活性化ビリオン又は精製サブユニットによるワクチン接種と比較して、生ワクチンは、免疫系の細胞区画にも関与する広範な応答を誘導する。しかしながら、免疫不全者数の増加及び国際的流動性の拡大により、複製可能な株の使用は、より病原性の形態への復帰などのリスクを伴い得るか(Zurbriggen et al. 2008 in Appl Environ Microbiol 74, 5608-5614)、又はワクチンのレシピエント及び接触者の両方で深刻な有害事象である(Kemper et al. 2002 in Eff Clin Pract 5, 84-90; Parrino and Graham 2006 in J Allergy Clin Immunol 118, 1320-1326)。
最新のベクター化ワクチン(Excler et al. 2010 in Biologicals 38, 511-521; Plotkin 2009 in Clin Vaccine Immunol 16, 1709-1719)は、弱毒化感染の利点と、ヒト又は動物レシピエントでは複製不可能な宿主制限ベクターに固有の強い安全性プロファイルとを併せ持つ。特に有望な超弱毒化ベクターは、改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスを含む宿主制限ポックスウイルスである。超弱毒化ポックスウイルスは臨床試験で安全性が実証されており(Cebere et al. 2006 in Vaccine 24, 417-425; Dorrell et al. 2007 in Vaccine 25, 3277-3283; Gilbert et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561; Mayr 2003 in Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430; Webster et al. 2005 in Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4836-4841)、依然として効率的な免疫応答刺激因子である(Drillien et al. 2004 in J Gen Virol 85, 2167-2175; Liu et al. 2008 in BMC Immunol 9, 15; Ryan et al. 2007 in Vaccine 25, 3380-3390; Sutter and Moss 1992 in Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10847-10851; Sutter et al. 1994 in Vaccine 12, 1032-1040)。特に、MVAウイルスは、Poxviridae科のオルトポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスに関係している。MVAウイルスは、漿尿膜ワクシニアアンカラ(CVA)ウイルスのニワトリ胚線維芽細胞で516連続継代することによって作製された。ニワトリ由来の物質を生産基質として繰り返し継代することによる弱毒化過程中に、MVAウイルスは、複数の部位においてゲノムDNAの約15%を喪失した(Mayr and Munz 1964 in Zentralbl Bakteriol Orig 195, 24-35; Meyer et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038)。MVAウイルスは分析されて、野生型CVA株に対するゲノムの変化が決定されている。合計31,000塩基対に及ぶゲノムDNAの6つの主な欠失(欠失I、II、III、IV、V及びVI)が同定されている(Meyer, et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038)。それは、厳密には、鳥類細胞に制限された宿主細胞になった。親ワクシニアウイルスは広い宿主範囲を有するのに対して、MVAウイルスは非常に狭い宿主範囲を有する。例えば、MVAは、ヒト細胞及び非ヒト霊長類細胞では複製しない。ヒトHeLa細胞株では、複製妨害は、ゲノムパッケージングにおける規定の工程で起こると思われる(Sancho et al. 2002 in J Virol 76, 8318-8334)。加えて、細胞株HEK293及びVeroは、好ましい生産系ではない。得られるMVAウイルスは有意に非病原性であったことが、様々な動物モデルでさらに示された(Mayr and Danner 1978 in Dev Biol Stand 41, 225-234)。加えて、MVA株は、ヒト天然痘疾患に対する予防接種ワクチンとして臨床試験で試験されている(Mayr 2003 in Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430)。これらの研究では、高リスク患者を含む120,000人超のヒトが参加しており、MVAは、CVAと比較して低下した病原性又は感染力を有していたが、優れた免疫原性を維持していたことが判明した。
しかしながら、MVAウイルスの十分な供給を提供するのは困難である。一方、MVAウイルスは、レシピエントにおいて非常に低レベルで複製するか又は全く複製しないので、高用量で投与されなければならない。一方、現在利用可能なMVAウイルス生産系は時間がかかる高価なものであり、製薬業界の要求を満たすことができない。
上述のように、MVAの研究及び生産は、鳥類細胞に依存している。現在のところ、鳥類宿主に適合されたワクチン株は、孵化鶏卵又はこのような卵から調製された線維芽細胞でのみ生産される。この技術は、要求の厳しい臨床生産過程への一次動物由来物質の連続注入、及びSPF(特定病原体除去)ドナー集団の維持費用を含むさらなる不利点を伴う。孵化卵の採取からワクチン生産までの時間が短いため、外来物質の試験は最終バルクで実施される(Philipp and Kolla 2010 in Biologicals 38, 350-351)。時折、品質試験によって混入が確認された場合には、完成したワクチンロットを廃棄しなければならない(Enserink 2004 in Science 306, 385)。
最近、発展途上国又は新興工業国における工業的応用及びワクチンプログラムを促進するために、本発明の発明者らは、鳥類基質に依存するワクチン株に対して完全に許容性の宿主細胞株を設計及び作製した(Jordan et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)。本発明者らはまた、これらのウイルスのための高効率で十分に拡張可能な化学的に定義された生産方法を開発した(Jordan et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)。
今回初めて、身近な上記技術を用いて、本発明者らは、化学的に定義された懸濁培養液におけるウイルス生産で課せられる非常に人工的な条件下において、既に適合された超弱毒化MVAウイルスの次世代の安定単離株を、同じ超弱毒化ウイルスに対して完全に許容性の細胞基質で特性決定した。これは異例の実験であり、その結果は驚くべきものである。Principles of Virology (ISBN-10: 1555814433)に記載されているように、連続継代の動機は、一般に、最初は低許容性の基質にウイルスを適合させることである:「正常宿主の細胞以外の細胞における成長によって、又は非生理的温度での繁殖によって、低病原性(弱毒化)ウイルスを選択し得る。これらの選択条件下でより良く繁殖することができる突然変異体が、ウイルス複製中に生じる。このような突然変異体を単離し、精製し、続いて適切なモデルで病原性について試験すると、いくつかのものは親よりも低病原性であり得る」。
上記特性決定の結果、構造タンパク質の点突然変異を有する新規MVAウイルスが同定された。この結果は、特定の宿主細胞内における選択よりも、人工的な培養条件下におけるウイルス繁殖と一致している。新規MVAウイルスは、化学的に定義された懸濁培養液中で、公知のMVAウイルス株と比較して有益な特性(例えば、増加した感染活性、及び細胞外空間における多数の感染単位)を示す。前記有益な特性は、前記MVAウイルスの工業的な生産を改善する。特に、それらは、新規MVAウイルス株を高収率で生産することを可能にする。加えて、この新規MVAウイルス株は無細胞上清から直接単離し得るので、精製が容易になり、従って、前記MVAウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作が容易になる。そして、これにより、MVAウイルスの生産コストが削減される。
発明の概要
第1の態様では、本発明は、A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列を含む改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに関する。
第1の態様では、本発明は、A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列を含む改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに関する。
第2の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルスのゲノムに関する。
第3の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含む細胞に関する。
第4の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルスを培養するための方法であって、
(i)第3の態様の細胞を提供する工程、
(ii)該細胞を培養する工程、及び
(iii)該MVAウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
(i)第3の態様の細胞を提供する工程、
(ii)該細胞を培養する工程、及び
(iii)該MVAウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
第5の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルスを生産するための方法であって、
(i)MVAウイルスを細胞に感染させる工程、
(ii)該細胞を培養する工程、
(iii)該MVAウイルスを単離する工程、及び
(iv)A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるまで、工程(iii)で単離されたMVAウイルスを用いて工程(i)〜(iii)を繰り返す工程
を含む方法に関する。
(i)MVAウイルスを細胞に感染させる工程、
(ii)該細胞を培養する工程、
(iii)該MVAウイルスを単離する工程、及び
(iv)A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるまで、工程(iii)で単離されたMVAウイルスを用いて工程(i)〜(iii)を繰り返す工程
を含む方法に関する。
第6の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムと、1つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。
第7の態様では、本発明は、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含むワクチンに関する。
第8の態様では、本発明は、医薬に使用するための第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムに関する。
第9の態様では、本発明は、核酸配列を含むMVAウイルスであって、A3L遺伝子及び/又はA9L遺伝子が機能欠失しているMVAウイルスに関する。
第10の態様では、本発明は、MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞に関する。
第11の態様では、本発明は、異種核酸配列に作動可能に連結されたMVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む核酸分子に関する。
第12の態様では、本発明は、リコンビナントMVAウイルスを生産するための方法であって、以下
(i)細胞を提供する工程、
(ii)第9の態様のMVAウイルス及び第11の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
(iii)該MVAウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントMVAウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
(i)細胞を提供する工程、
(ii)第9の態様のMVAウイルス及び第11の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
(iii)該MVAウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントMVAウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
本発明のこの概要は、本発明の全ての特徴を説明しているわけではない。
発明の詳細な説明
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬は変化し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬は変化し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されているように定義される。
いくつかの文献は、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用される各文献(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、GenBankアクセッションナンバーの配列提出物などを含む)は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる内容も、本発明は、先行発明によるこのような開示に対する先行権を有しないという自認と解釈されるべきではない。
以下、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施態様を用いて記載するが、それらを任意の方法及び任意の数で組み合わせて、さらなる実施態様を作り得ることを理解すべきである。様々に記載されている実施例及び好ましい実施態様は、本発明を明記されている実施態様のみに限定するものと解釈すべきではない。本説明は、明記されている実施態様を任意の数の開示されている要素及び/又は好ましい要素と組み合わせた実施態様をサポート及び包含すると理解すべきである。さらに、本出願における全ての記載されている要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈上特に指示がない限り、本出願の説明によって開示されているとみなすべきである。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要がない限り、「含む(comprise)」という単語並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変化形は、示されている整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを含み、いかなる他の整数又は工程も整数又は工程のグループも除外しないことを意味すると理解されよう。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「a」、「an」及び「the」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される「弱毒化ウイルス」という用語は、目的のレシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)における病原性が低下したウイルスを指す。このような特性は、ウイルスを狭い温度範囲又は狭い宿主範囲及び他の人工的な複製環境(化学的に定義された培地を含む)に適合させることによって達成され得る。このようなウイルスの複製は、目的のレシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)由来の細胞内、又は組織環境から取り出された細胞内に限定される。それは、目的のレシピエント以外では(例えば、許容細胞培養液又は実験動物内では)高力価に複製し得る。弱毒化ウイルス株の例は、重度の麻疹疾患から保護するために投与されるEnderの弱毒化麻疹ウイルスEdmonston株、又は1970年代に世界保健機関(WHO)の痘根絶キャンペーンで使用されたワクシニアウイルス株である。
本明細書で使用される「高度弱毒化ウイルス」という用語は、目的のレシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)における病原性が妨害されたウイルスを指す。このような特性は、ウイルスを狭い温度範囲又は狭い宿主範囲及び他の人工的な複製環境(化学的に定義された培地を含む)に適合させることによって達成され得る。このようなウイルスの複製は、目的のレシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)由来の細胞内、又は組織環境から取り出された細胞内で妨害される。それは、目的のレシピエント以外では(例えば、許容細胞/細胞培養液又は実験動物内では)高力価に複製し得る。本発明のMVAウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。それは、ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞内では複製しない。
本明細書で使用される「宿主制限ウイルス」という用語は、特定の宿主生物内(例えば、鳥類細胞などの細胞内、又は実験動物などの動物内)で(のみ又は主に)複製するウイルスを指す。それは、他の生物内(例えば、鳥類細胞以外の細胞内)では複製しないか、又は非常に低レベルで複製するに過ぎない。宿主制限ウイルスは、宿主生物内(例えば、鳥類細胞内)でウイルスを「(連続)ウイルス継代」することによって得られ得る。本発明のMVAウイルスは、鳥類細胞に制限される。それは、ヒト細胞内では複製しない。
本明細書で使用される「ウイルス継代」という用語は、ウイルスを一連の宿主生物(例えば、細胞又は動物、例えば実験動物)に感染させることを含む過程を指す。ウイルスを加える度にいくらかインキュベーションし、次いで、インキュベーションしたウイルスを次の宿主生物に感染させる。この過程は、「連続ウイルス継代」とも表記され得る。例えば、連続ウイルス継代により、(高度)弱毒化ウイルス及び/又は宿主制限ウイルスの作製が可能になる。本発明のMVAウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。それは、鳥類細胞に制限される。それは、ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞内では複製しない。
宿主生物(例えば、鳥類細胞などの細胞又は実験動物などの動物)が「許容性」という用語によって規定される場合、それは、ウイルスが前記生物の防御を回避することができ、細胞に侵入して前記細胞内で複製し、前記細胞から脱出することができるという事実を指す。通常、ウイルスが前記生物の細胞内因性防御及び/又は前記生物の免疫系の1つ又はいくつかをモデュレーションした場合に、これが起こる。
本明細書で使用される「レシピエント」という用語は、ウイルスを受け入れ得る(例えば、ウイルスをワクチン接種し得る)被験体を指す。被験体は、ヒト又は動物であり得る。前記動物は、哺乳類種のメンバー、例えばイヌ、ネコ、オオカミ、イタチ、齧歯類(例えば、マウス、ラット又はハムスター)、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、コウモリ(例えば、オオコウモリ又はココウモリ)又は非ヒト霊長類(例えば、類人猿などのサル)であり得る。特に、本発明のMVAウイルスは、ヒトレシピエント又は非ヒト霊長類レシピエントでは複製しない。
本明細書で使用される「宿主生物」という用語は、ウイルスの生産及び/又は適合に使用され得る生物を指す。宿主生物は、細胞又は動物、例えば実験動物であり得る。細胞は、鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル網膜(CR)細胞)であり得る。動物、特に実験動物は、鳥類(例えば、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ又はアヒル)、イヌ、イタチ、齧歯類(例えば、マウス、ラット又はハムスター)、ヒツジ、ヤギ、ブタ、コウモリ(例えば、オオコウモリ又はココウモリ)又は非ヒト霊長類(例えば、類人猿などのサル)であり得る。特に、本発明のMVAウイルスは、鳥類細胞内(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞内)で、又は鳥類で(例えば、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ又はアヒルで)複製する。
本明細書で使用される「感染」という用語は、ウイルスが細胞内で複製してウイルス粒子を産生する能力を指す。感染力は、ウイルス負荷を検出することによって、又はヒト若しくは動物における疾患進行を観察することによって評価され得る。
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、レシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)で防御免疫を誘発するのに使用され得る薬剤を指す。いくつかの個体は、ロバストな免疫応答も防御免疫応答も、又はいくつかの場合ではいかなる免疫応答も開始することができない場合があるので、有効であるためには、ワクチンは、免疫集団の一部で免疫を誘発し得る。この不能性は、レシピエントの遺伝的背景、又は免疫不全状態(後天性又は先天性のいずれか)若しくは免疫抑制(例えば、化学療法による処置又は免疫抑制薬の使用に起因する)の理由から生じ得る。ワクチンの有効性は、動物モデルで立証され得る。本発明のワクチンは、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含む。これに関して、MVAウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルスは、レシピエントでさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列(例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列)をさらに含み得る。異種核酸配列を含むMVAウイルスは、リコンビナントMVAウイルスとも表記され得る。
本明細書で使用される「ワクチン接種」という用語は、感染性ウイルス(例えば、前記感染性ウイルスの弱毒化型又は不活性型)をレシピエント(例えば、ヒト又は動物レシピエント)に負荷して、特異的免疫を誘導することを意味する。本発明では、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、痘に対する免疫を誘導する。しかしながら、本発明との関連では、「ワクチン接種」という用語はまた、異種核酸配列をさらに含むMVAウイルスをレシピエントに負荷することを包含する。異種配列は、さらなる防御免疫を誘発すべき配列である。それは、抗原、特に抗原のエピトープをコードし得る。異種核酸配列を含むMVAウイルスは、リコンビナントMVAウイルスとも表記され得る。
前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープを包含する。ワクチンをレシピエントの体内に投与した後、エピトープが発現されて免疫系に提示され、これらのエピトープに対する特異的免疫応答が誘導され得る。従って、レシピエントは、エピトープを含有するタンパク質に対して免疫される。
本明細書で使用される「異種核酸配列」という用語は、天然には通常見られない核酸配列であって、ウイルス、特に本発明のMVAウイルスに密接に関連する核酸配列を指す。異種核酸配列を含むウイルスは、リコンビナントウイルスとも表記され得る。
本明細書で使用される「保護する」という用語は、レシピエント(例えば、ヒト)における疾患(例えば、痘)の発症又は継続を必要に応じて予防若しくは処置するか、又はその両方をすることを意味する。
本明細書で使用される「防御免疫」は、免疫(ワクチン接種)された被験体において、例えば、多量の病原体(例えば、ポックスウイルスなどのウイルス)若しくは感染細胞を排除若しくは軽減するか、又は感染症の任意の他の測定可能な緩和をもたらすのに有効な体液性(抗体)免疫若しくは細胞性免疫又はその両方を含む。
上述のように、本発明の発明者らは、化学的に定義された懸濁培養液におけるウイルス生産で課せられる非常に人工的な条件下において、既に適合された超弱毒化MVAウイルスの次世代の安定単離株を、同じ超弱毒化ウイルスに対して完全に許容性の細胞基質で特性決定した。上記特性決定の結果、構造タンパク質の点突然変異を有する新規MVAウイルスが同定された。新規MVAウイルスは、化学的に定義された懸濁培養液中で、公知のMVAウイルス株と比較して有益な特性(例えば、増加した感染活性、及び細胞外空間における多数の感染単位)を示す。前記有益な特性は、前記MVAウイルスの工業的な生産を改善する。特に、それらは、新規MVAウイルス株を高収率で生産することを可能にする。加えて、この新規MVAウイルス株は無細胞上清から直接単離し得るので、精製が容易になり、従って、前記MVAウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作が容易になる。そして、これにより、MVAウイルスの生産コストが削減される。
従って、本発明の第1の態様は、A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列を含む(突然変異)改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び/又は前記A34R遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む(突然変異)改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスに関する。
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことに留意すべきである。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸置換)であり得る。「アミノ酸置換(amino acid replacement)」はまた、本明細書では「アミノ酸置換(amino acid substitution)」とも表記され得る。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」という用語は、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及び/又はA9L遺伝子産物のアミノ酸配列内で起こるアミノ酸改変を指すが、本明細書で使用される「アミノ酸付加」という用語は、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及び/又はA9L遺伝子産物のN末端又はC末端で起こるアミノ酸改変を指す。
一実施態様では、MVAウイルスは、A3L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記A3L遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む核酸配列を含む。別の実施態様では、MVAウイルスは、A34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記A34R遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む核酸配列を含む。
好ましくは、核酸配列は、A9L遺伝子産物をさらにコードし、前記核酸配列は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む。
より好ましくは、
(i)ウイルスは、A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む、
(ii)ウイルスは、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む、又は
(iii)ウイルスは、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つの突然変異)を含む。
(i)ウイルスは、A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む、
(ii)ウイルスは、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む、又は
(iii)ウイルスは、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つの突然変異)を含む。
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことに留意すべきである。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸置換)であり得る。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、このような突然変異MVAウイルスが非突然変異MVAウイルスよりも高収率で生産され得ることを見出した。
(i)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、配列番号1のA3L遺伝子産物のアミノ酸位置634〜644、好ましくはアミノ酸位置636〜642又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、
(ii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、配列番号2のA34R遺伝子産物のアミノ酸位置81〜91、好ましくはアミノ酸位置83〜89又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、及び/又は
(iii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、配列番号3のA9L遺伝子産物のアミノ酸位置70〜80、好ましくはアミノ酸位置72〜78又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあることが好ましい。
(ii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、配列番号2のA34R遺伝子産物のアミノ酸位置81〜91、好ましくはアミノ酸位置83〜89又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、及び/又は
(iii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、配列番号3のA9L遺伝子産物のアミノ酸位置70〜80、好ましくはアミノ酸位置72〜78又はそれらに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあることが好ましい。
従って、アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、(i)配列番号1のA3L遺伝子産物のアミノ酸位置634、635、636、637、638、639、640、641、642、643若しくは644又はそれらに対応するアミノ酸位置、(ii)配列番号2のA34R遺伝子産物のアミノ酸位置81、82、83、84、85、86、87、88、89、90若しくは91又はそれらに対応するアミノ酸位置、及び/又は(iii)配列番号3のA9L遺伝子産物のアミノ酸位置70、71、72、73、74、75、76、77、78、79若しくは80又はそれらに対応するアミノ酸位置にあり得る。
本発明との関連では、2つ以上の遺伝子産物中のアミノ酸残基は、その残基がその遺伝子産物構造で類似位置を占めている場合に、互いに「対応する」と言われる。当技術分野で周知であるように、2つ以上の遺伝子産物中の類似位置は、アミノ酸配列又は構造類似性に基づいて遺伝子産物の配列をアライメントすることによって決定され得る。このようなアライメントツールは当業者に周知であり、例えば、ワールドワイドウェブで入手することができ、例えば標準的な設定(好ましくは、Align EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5)を使用するClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw)又はAlign (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)である。当業者であれば、十分なアライメントを実現するためにはいずれかの配列内にギャップを導入することが必要であり得ることを理解する。2つ以上の遺伝子産物中のアミノ酸残基は、その残基が最良の配列アライメントでアライメントされている場合に、「対応する」と言われる。2つの遺伝子産物間の「最良の配列アライメント」は、アライメントされた同一残基の数を最大にするアライメントと定義される。2つのアライメント配列間の配列類似性、好ましくは同一性が10、20又は30アミノ酸長にわたって30%未満、好ましくは20%未満、より好ましくは10%未満に低下する場合、「最良の配列アライメントの領域」は終了し、それにより、類似性スコアを決定するための比較配列の長さの境界及び限度が決定される。
(i)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(ii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iv)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、並びに/又は
(v)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置にあることがさらに好ましい。
(ii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iii)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iv)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、並びに/又は
(v)アミノ酸配列改変(例えば、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換)は、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置にあることがさらに好ましい。
アミノ酸配列改変はアミノ酸欠失又はアミノ酸置換であり、
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639若しくはそれに対応するアミノ酸位置のHが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638若しくはそれに対応するアミノ酸位置のRが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86若しくはそれに対応するアミノ酸位置のDが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、正のアミノ酸、好ましくはR、H若しくはK、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、並びに/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されていることがより好ましい。
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639若しくはそれに対応するアミノ酸位置のHが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638若しくはそれに対応するアミノ酸位置のRが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86若しくはそれに対応するアミノ酸位置のDが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、正のアミノ酸、好ましくはR、H若しくはK、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、並びに/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されていることがより好ましい。
アミノ酸置換は、
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置のRのYによるアミノ酸置換(R638Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、及び/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K74E A9L遺伝子産物突然変異体)であることがさらにより好ましい。
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置のRのYによるアミノ酸置換(R638Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、及び/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K74E A9L遺伝子産物突然変異体)であることがさらにより好ましい。
アミノ酸置換は、
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、又は
(iv)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)であることがさらにより好ましい。
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、又は
(iv)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)であることがさらにより好ましい。
(i)H639Y突然変異を有するA3L遺伝子産物は配列番号4のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは99%、例えば少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一のその変異体であって、アミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Yを(依然として)含む変異体であり、
(ii)D86Y突然変異を有するA34R遺伝子産物は配列番号5のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは99%、例えば少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一のその変異体であって、アミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Yを(依然として)含む変異体であり、及び/又は
(iii)K75E突然変異を有するA9L遺伝子産物は配列番号6のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは99%、例えば少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一のその変異体であって、アミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Eを(依然として)含む変異体であることが最も好ましい。
(ii)D86Y突然変異を有するA34R遺伝子産物は配列番号5のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは99%、例えば少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一のその変異体であって、アミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Yを(依然として)含む変異体であり、及び/又は
(iii)K75E突然変異を有するA9L遺伝子産物は配列番号6のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは99%、例えば少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一のその変異体であって、アミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Eを(依然として)含む変異体であることが最も好ましい。
配列同一性は、(i)配列番号4の各参照アミノ酸配列の少なくとも50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも85%、90%、95%又は99%であるか、(ii)配列番号5の各参照アミノ酸配列の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも85%、90%、95%又は99%であるか、又は(iii)配列番号6の各参照アミノ酸配列の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90アミノ酸又はそれ以上の連続するストレッチにわたって少なくとも85%、90%、95%又は99%であることが特に好ましい。配列同一性は、配列番号4、配列番号5又は配列番号6の各参照アミノ酸配列の全長にわたって少なくとも85%であるか、全長にわたって少なくとも90%であるか、全長にわたって少なくとも95%であるか、又は全長にわたって少なくとも99%であることがさらに特に好ましい。
好ましくは、上記変異体は、機能的に活性な変異体である。これは、アミノ酸配列中の(さらなる)変異が、培養中に、公知のMVAウイルスと比較した本発明のMVAウイルスの有益な特性(例えば、増加した感染活性、及び/又は細胞外空間における多数の感染単位)に悪影響を与えないことを意味する。前記有益な特性は、例えば、本発明のMVAウイルスを高収率で生産することを可能にする。前記有益な特性が上記変異体に依然として存在することを試験するための実験は、実験セクションに記載されている。
MVAの上記A3L遺伝子産物(P4bタンパク質とも称される)は3つの主なコアタンパク質の1つであり、球状の非感染性未成熟ビリオン(IV)が細胞内成熟ビリオン(IMV)に成熟する間に、I7Lコードウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる。MVAのA3L遺伝子産物は、非常に初期の段階におけるビリオンの形態形成に寄与して、感染性IMVへの移行における正確な凝縮及び膜再構成を可能にする。さらに、MVAの上記A34R遺伝子産物は、細胞外エンベロープウイルス(EEV)の外膜を不安定化するので、細胞外空間における感染活性及びウイルスの拡散に極めて重要である。EEVは、ウイルスが遠位部位に拡散するのを可能にするビヒクルとして進化してきた。EEVのさらなる膜は、ターゲット細胞との融合を媒介するために備わっているのではなく、IMV(実際のウイルス感染単位)を放出するためには破壊されなければならない。加えて、MVAのA34R遺伝子産物は、細胞結合エンベロープウイルス(CEV)が産生細胞から離れる速度をモデュレーションする。さらに、MVAのA9L遺伝子産物は、A3L遺伝子産物のように、MVA成熟の初期段階に関与する。それは、IMVのコアの正確な凝縮に重要な因子である。
好ましくは、MVAウイルスは、単離されたMVAウイルスである。本明細書で使用される「単離されたMVAウイルス」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出されたウイルスを指す。従って、単離されたMVAウイルスは、一部又は全部の細胞成分(すなわち、ウイルスが天然に存在する細胞又はそれが培養される細胞の成分(例えば、細胞質成分又は膜成分))を含まなくてもよい。それはまた、一部又は全部の培養成分(例えば、培養培地又は培養関連不純物、例えば培養残物)を含まなくてもよい。
単離されたMVAウイルスは、さらに精製され得る。従って、より好ましくは、MVAウイルスは、精製されたMVAウイルスである。本明細書で使用される「精製されたMVAウイルス」という用語は、無関係な物質(すなわち、ウイルスが得られるネイティブな物質、例えば細胞残屑、細胞残骸、細胞タンパク質、細胞DNA分子及び/又は細胞RNA分子を含む混入物質)の存在を低減又は排除する条件下で単離されたウイルスを指す。精製されたMVAウイルスは、好ましくは、細胞及び/又は培養成分を実質的に含まない。本明細書で使用される「実質的に含まない」という用語は、物質の分析試験との関連で操作上使用される。混入物質を実質的に含まない精製されたMVAウイルスは、好ましくは少なくとも50%純粋であり、より好ましくは少なくとも90%純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも99%又は100%純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野で公知の他の方法によって評価され得る。
MVAウイルスは、異種核酸配列をさらに含むことが好ましい。「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。異種核酸配列の発現は、MVAウイルスプロモーターの転写コントロール下にあり得る。異種核酸配列は、MVAウイルスの核酸配列に挿入される。本発明の好ましい実施態様では、異種核酸配列は、MVAウイルスの核酸配列/ゲノムの非必須領域に挿入される。本発明のより好ましい実施態様では、異種核酸配列は、MVAの核酸配列/ゲノムの天然に存在する欠失部位(例えば、欠失部位I、II、III、IV、V又はVI)に挿入される。異種核酸配列をMVAウイルスゲノムに挿入する方法は当業者に公知である。
異種核酸配列は、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択されることがより好ましい。「エピトープ(抗原決定基としても公知である)」という用語は、免疫系によって、具体的には抗体、B細胞又はT細胞によって認識される抗原の部分を指す。
抗原又はエピトープは、前記抗原又はエピトープに対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして有用であり得る。前記ウイルスに対して異種のこのような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばHer2/neu又はMUC−1を包含する。前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルス由来のタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばHer2/neu又はMUC−1の細胞外ペプチドを包含する。
治療用化合物は、治療効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は1つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、診断用化合物は、マーカー/レポータータンパク質、例えば抗体、GFP、EGFP、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するbla(β−ラクタマーゼ)、若しくはネオマイシン若しくはG418に対するnpt(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)であり得る。前記マーカー/レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はELISAアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。
既に上述のように、MVAウイルスは、高度弱毒化ウイルスである。本発明の一実施態様では、MVAウイルスは、鳥類細胞内で産生的に複製可能である。本明細書で使用される「産生的複製」という用語は、ウイルスが細胞変性効果を引き起こし、最終的には感染培養物中で大量の細胞死を引き起こすレベルまで複製することを意味し得る。再産生的複製の場合、培養物に感染させるために追加したウイルスよりも多くのウイルスを、感染培養物から少なくとも一度は回収し得る。産生的複製とは対照的に、再産生的複製は、細胞変性効果を伴わずに非常に低レベルで起こり得、最終的には生存培養物中のウイルスの消失につながり得る。
前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞(例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)である。前記鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)は、一次細胞(又は一次細胞培養物由来の細胞)、二次細胞(又は二次細胞培養物由来の細胞)又は不死化細胞(細胞株由来の細胞)であり得る。本明細書で使用される「一次細胞」又は「一次細胞培養物」という用語は、通常は、老化、培養停止又は細胞死に悩む前に、50回の集団倍加を超えて継代することができない細胞又は培養物を指す。本明細書で使用される「二次細胞」又は「二次細胞培養物」という用語は、一次細胞又は一次細胞培養物に直接由来する細胞又は培養物を指す。集団倍加の制限は、依然として当てはまる。本明細書で使用される「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語は、可能な細胞倍加の回数によって制限されない細胞又は培養物及びその子孫を指す。細胞培養物は、一次細胞、二次細胞又は不死化細胞(すなわち、細胞株の細胞)からなり得る。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、CR又はCR.pIX細胞株に由来する。CR及びCR.pIX細胞株は、ワクチン生産のために設計された不死化バリケン(Muscovy duck)網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来する。CR.pIX細胞株は、アデノウイルスpIXタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
本発明の別の実施態様では、MVAウイルスは、哺乳類細胞内では産生的に複製不可能であり、前記哺乳類細胞は、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、フルーツコウモリR05T細胞、フルーツコウモリR05R細胞及びフルーツコウモリR06E細胞ではない。R05T細胞、R05R細胞及びR06E細胞は、Egyptian rousette由来の一次細胞の不死化によって得られた細胞である。これらは、非常に数少ないMVA許容性の哺乳類細胞株の1つである(Jordan et al. 2009 in Virus Res 145, 54-62)。本発明の好ましい実施態様では、MVAウイルスは、霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞内では産生的に複製不可能である。
本発明のMVAウイルスは、配列番号1のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するA3L遺伝子産物、及び/又は配列番号2のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するA34R遺伝子産物をコードする核酸配列を含み得る。前記核酸配列は、配列番号3のアミノ酸改変前アミノ酸配列を有するA9L遺伝子産物をさらにコードし得る。
さらに、各A3L遺伝子は配列番号7の突然変異前核酸配列を有し得、各A34R遺伝子は配列番号8の突然変異前核酸配列を有し得、及び/又は各A9L遺伝子は配列番号9の突然変異前核酸配列を有し得る。
さらに、突然変異A3L遺伝子は配列番号10の核酸配列を有し得、突然変異A34R遺伝子は配列番号11の核酸配列を有し得、及び/又は突然変異A9L遺伝子は配列番号12の核酸配列を有し得る。
加えて、本発明のMVAウイルスは、アクセッションナンバーAY603355(バージョンAY603355.1及びGI:47088326)の突然変異前核酸配列を含み得る。
第2の態様では、本発明は、第1の態様の(突然変異)MVAウイルスのゲノムに関する。
第3の態様では、本発明は、第1の態様の(突然変異)MVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含む細胞に関する。第1の態様の(突然変異)MVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含む細胞は、宿主細胞とも表記され得る。前記細胞は、第1の態様のMVAウイルスを培養するためのものであり得る。前記細胞は、第1の態様のMVAウイルスが複製することができる任意の細胞であり得る。前記細胞は、霊長類細胞、特にヒト細胞ではないことが好ましい。前記細胞は、鳥類細胞であることがさらに好ましい。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞(例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)である。前記鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)は、一次細胞(又は一次細胞培養物由来の細胞)、二次細胞(又は二次細胞培養物由来の細胞)又は不死化細胞(細胞株由来の細胞)であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第1の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、CR又はCR.pIX細胞株に由来する。CR及びCR.pIX細胞株は、ワクチン生産のために設計された不死化バリケン網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来する。CR.pIX細胞株は、アデノウイルスpIXタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
好ましくは、細胞は、単離された細胞である。本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出された細胞を指す。従って、単離された細胞は、一部又は全部のネイティブな成分又は培養成分(すなわち、細胞が天然に存在する生物の成分(例えば、器官、特に組織)又はそれが培養される有機体の成分(例えば、培養培地又は培養物関連不純物、例えば培養残物))を含まなくてもよい。
第1の態様のMVAウイルスを細胞に感染させ得るか、又は第2の態様のゲノムで細胞をトランスフェクションし得る。細胞に感染させる技術又は細胞をトランスフェクションする技術は当業者に公知である。
細胞は、非接着/懸濁細胞であることがさらに好ましい。一般に、懸濁液又は接着培養物中で細胞を成長させ得る。血流中に存在する細胞(例えば、造血細胞)などのいくつかの細胞は、表面に付着せずに懸濁液中で自然に生存する。接着細胞(例えば、一次細胞)は、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体などの表面を必要とし、これらを細胞外マトリックス成分でコーティングして、接着特性を増加させ、成長及び分化に必要な他のシグナルを提供し得る。固形組織由来のほとんどの細胞は、接着性である。接着細胞は、通常、細胞生物学研究ではその元の形態で使用される。懸濁培養液中で生存することができるように改変された細胞もあり、接着条件が可能にするよりも高密度にそれらを成長させ得る。接着条件下では、成長は、すなわち、生産収率を制限し得る表面積によって制限される。このような懸濁液適合細胞又は非接着成長適合細胞は、通常、バルクタンパク質の生産又はバッチ回収に使用される。非接着条件下では、成長は、培養培地中の細胞の濃度によって制限されるので、より容易なスケールアップが可能になる。
「非接着」及び「懸濁液」という用語は、本明細書で互換的に使用される。本発明との関連では、「非接着細胞」及び「懸濁細胞」という用語は、表面(例えば、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体)に付着せずに懸濁培養液中で生存することができる細胞を指す。前記細胞は、表面に付着せずに懸濁液中で自然に生存し得る細胞であり得る。前記細胞はまた、表面(例えば、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体)に付着せずに懸濁培養液中で生存することができるように改変又は適合された細胞であり得る。上述のように、ほとんどの細胞は、それらの元の形態、非改変形態又は非適合形態の接着細胞である。通常、接着条件が可能にするよりも高密度に非接着細胞を成長させ得る。従って、それは、工業規模での(例えば、バイオリアクター環境又は撹拌培養での)培養により適切である。細胞は、通常、非接着細胞培養に適合されなければならない。元の細胞は、無血清条件下及び/又は適切な表面の非存在下ではアポトーシスを受けるので、この適合は、漸減量の血清(例えば、10%から0%までの希釈系列のウシ胎仔血清(FCS))と共に継代することにより、不可逆的に改変された細胞集団を選択することを必要とする長期的な過程である。適合された非接着細胞は、当技術分野で公知である。当業者であれば、細胞を接着状態から非接着状態に移行させるためのプロトコールを認識している(例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Mar;78(3):391-9. Epub 2008 Jan 9を参照のこと)。
それとは対照的に、本明細書で使用される「接着細胞」という用語は、組織培養プラスチック担体又はマイクロ担体などの表面を必要とする細胞を指す。前記表面を細胞外マトリックス成分でコーティングして、接着特性を増加させ、成長及び分化に必要な他のシグナルを提供し得る。前記細胞は定期的な継代を必要とするが、倒立顕微鏡下における容易な目視検査を可能にする。前記細胞は、(例えば、トリプシンを用いて)酵素的に解離され得る。加えて、接着細胞の成長は、生産収率を制限し得る表面積によって制限される。
本発明の好ましい実施態様では、非接着/懸濁細胞は、無血清条件下で成長する。本明細書で使用される「無血清条件」という用語は、動物血清を欠く培地中で細胞が成長する条件を指す。代わりに、細胞は、いかなる動物由来成分も欠く培地中、好ましくは、生物学的成分のいかなる複合混合物も含まない培地(いわゆる「化学的に定義された培地」)中で成長する。
第4の態様では、本発明は、第1の態様の(突然変異)MVAウイルスを培養するための方法であって、
(i)第3の態様の細胞を提供する工程、
(ii)該細胞を培養する工程、及び
(iii)該(突然変異)MVAウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
(i)第3の態様の細胞を提供する工程、
(ii)該細胞を培養する工程、及び
(iii)該(突然変異)MVAウイルスを単離する工程
を含む方法に関する。
第3の態様の細胞は、第1の態様の(突然変異)MVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含む。工程(ii)では、細胞を細胞増殖培地中で培養し、続いてウイルス生産培地中で培養し得るか、又は工程(ii)では、細胞を細胞増殖培地中で(のみ)培養し得る。好ましくは、工程(ii)では、細胞を細胞増殖培地中で(のみ)培養する。単一培地の使用は、MVAウイルス培養過程、特に工業的なMVAウイルス培養過程を容易にするという利点を有する。例えば、それは、前記MVAウイルスを生産するバイオリアクターのロジスティック及び操作を容易にする。
細胞を細胞増殖培地中で1日間〜3日間、例えば1日間、2日間又は3日間培養し、続いて細胞をウイルス生産培地中で1日間〜10日間、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間又は10日間培養することが好ましい。細胞を増殖培地中でのみ1日間〜10日間、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間又は10日間培養することも好ましい。
本明細書で使用される「細胞増殖培地」という用語は、例えば、継代によってその培地中の8×10^5個の細胞のシードが、例えば200リットルバイオリアクターに十分な約4×10^8個の細胞になり得るように、少なくとも10回の細胞倍加のための細胞分裂を支援する培地を指す。本明細書で使用される「増殖細胞」という用語は、分裂細胞(すなわち、48時間以内に少なくとも1回の倍加速度で、さらに少なくとも10回の細胞倍加により分裂し得る細胞)を指す。
細胞増殖培地は、血清を含まないことが好ましい。無血清培地は、特に動物血清を欠く。代わりに、細胞は、いかなる動物由来成分も欠く培地中、好ましくは、生物学的成分のいかなる複合混合物も含まない培地(いわゆる「化学的に定義された培地」)中で成長する。細胞増殖培地は、低タンパク質含有量及び/又は低塩含有量を有することがさらに好ましい。好ましくは、(低)タンパク質含有量は、10〜250ng/ml、より好ましくは50〜200ng/ml、さらにより好ましくは50〜150ng/ml、最も好ましくは50〜100ng/mlの範囲内、例えば10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240又は250ng/mlである。好ましくは、(低)塩含有量は、150〜350mOsm/kg、より好ましくは180〜350mOsm/kg、さらにより好ましくは200〜320mOsm/kg、最も好ましくは250〜300mOsm/kgの範囲内、例えば150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340又は350mOsm/kgである。上記細胞増殖培地は、グルコースを含むことがさらに好ましい。好ましくは、グルコース含有量は、1〜6g/l、より好ましくは2.5〜5.5g/l、さらにより好ましくは3.5〜5g/l、最も好ましくは4〜4.5g/lの範囲内、例えば1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6g/lである。従って、本発明の一実施態様では、細胞増殖培地は血清を含まず、低タンパク質含有量を有し、低塩含有量を有する。本発明の別の好ましい実施態様では、細胞増殖培地は血清を含まず、低タンパク質含有量を有し、低塩含有量を有し、グルコースをさらに含む。好ましい量は、上に記載されている。
本明細書で使用される「ウイルス生産培地」という用語は、増殖細胞の培養でウイルスの生産を増強する培地を指す。ウイルス生産培地を追加することによって、細胞凝集が誘導され、培養物中の細胞増殖は少なくとも2倍減少するか、又は完全に停止する。ウイルス生産培地は、CaCl2、MgSO4及び/又はNaClを含むことが好ましい。好ましくは、CaCl2含有量は、150〜250mg/l、より好ましくは180〜250mg/l、最も好ましくは200〜220mg/lの範囲内、例えば150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245又は250mg/lであり、MgSO4含有量は、50〜150mg/l、より好ましくは70〜150mg/l、最も好ましくは90〜120mg/lの範囲内、例えば50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145又は150mg/lであり、及び/又はNaCl含有量は、5000〜7500mg/l、より好ましくは6000〜7000mg/l、最も好ましくは6500〜6800mg/lの範囲内、例えば5000、5500、6000、6500、7000又は7500mg/lである。例えば、ウイルス生産培地は、205mg/lのCaCl2、100mg/lのMgSO4及び/又は6500mg/lのNaClの塩含有量を含み得る。
好ましくは、工程(ii)では、細胞を撹拌培養又はバイオリアクターで培養する。バイオリアクターは、一般に、化学反応器と同様に、それらの混合特徴に応じて分類される。前記バイオリアクターは、(強混合型)撹拌タンク反応器又はプラグフロー(管状)反応器であり得る。理想的な強混合型バイオリアクターでは、混合は、反応器によって流体(細胞及び培養培地)が均一になるのに十分な強度であると想定される。好ましい実施態様では、バイオリアクターは、フェドバッチバイオリアクター、バッチバイオリアクター若しくは連続バイオリアクターであるか、又は培養は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法又は連続培養法である。供給物ストリーム及び生成物ストリームが連続的に供給されてシステムから回収される場合、バイオリアクターは、通常、連続的と称される。原則として、反応器は連続的な再循環フローを有し得るが、栄養素の供給又は生成物の回収は非連続的である;それは、依然としてバッチバイオリアクターである。フェドバッチバイオリアクターは、通常、間欠送りを有する。それは、実行中に培地を回収してもよいし、又は培地を回収しなくてもよい。本明細書で使用される「フェドバッチ培養」という用語は、規定量の細胞を適切な培養培地中に提供し、懸濁液中で長時間(典型的には、4〜10日間)(この時間中は培地を除去しない)培養する細胞培養法を指し得る。しかしながら、培養過程開始後のある時点において、さらなる成分を培養物に提供する。提供される成分は、典型的には、培養過程中に枯渇した細胞用栄養サプリメントを含む。フェドバッチ培養は、典型的には、死細胞と生細胞との比が臨界値未満に低下する時点で停止する。
第1の態様のMVAウイルスは、無細胞上清及び/又は細胞溶解物から単離され得る。無細胞上清及び/又は細胞溶解物からの第1の態様のMVAウイルスの単離は、当業者に容易に利用可能な標準的手順に従って実施され得る。好ましくは、第1の態様のMVAウイルスは、無細胞上清から単離される。すなわち、本発明の発明者らは、無細胞上清から第1の態様のMVAウイルスを直接単離し得ることを示したが、これが、MVAウイルス単離過程、特に工業的なMVAウイルス培養過程を容易にする。そして、これにより、MVAウイルスの生産コストが削減される。例えば、MVAウイルスを単離するための細胞溶解はもはや必要とされない。このように、細胞物質、特に細胞DNAがMVAウイルス単離株に混入するのを減少させ得る。その結果として、ウイルス調製に関する世界保健機関のDNA限界値がより容易に得られ得る。
ウイルスの様々な単離手順は、当技術分野で公知である。本発明に有用な単離手順は、単離されるべきウイルスに干渉しない。例えば、インペラの剪断力及び単離中に生じる他の要因に対する長時間の曝露は回避すべきである。工程(iii)における単離は、遠心分離、沈降及び/又はろ過を介して、例えば遠心分離及びろ過を介して、沈降及びろ過を介して、沈降及び遠心分離を介して、又は遠心分離、沈降及びろ過を介して細胞からウイルスを分離することによって達成されることが好ましい。前記細胞で培養されたウイルスを単離するために、当業者であれば、適切な分離パラメータ、例えば分離に遠心分離を使用する場合には加速力/G力及び/若しくは時間、分離にろ過を使用する場合にはフィルタサイズ、並びに/又は分離に沈降を使用する場合には沈降時間を容易に適合/調整し得る。
第5の態様では、本発明は、第1の態様の(突然変異)MVAウイルスを生産するための方法であって、
(i)MVAウイルスを細胞に感染させる工程、
(ii)該細胞を培養する工程、
(iii)該MVAウイルスを単離する工程、及び
(iv)A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び/又は前記A34R遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含む(突然変異)MVAウイルスが検出されるまで、工程(iii)で単離されたMVAウイルスを用いて工程(i)〜(iii)を繰り返す工程
を含む方法に関する。
(i)MVAウイルスを細胞に感染させる工程、
(ii)該細胞を培養する工程、
(iii)該MVAウイルスを単離する工程、及び
(iv)A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び/又は前記A34R遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含む(突然変異)MVAウイルスが検出されるまで、工程(iii)で単離されたMVAウイルスを用いて工程(i)〜(iii)を繰り返す工程
を含む方法に関する。
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことに留意すべきである。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸置換)であり得る。
好ましくは、A9L遺伝子産物をさらにコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるまで、工程(i)〜(iii)を繰り返す。
より好ましくは、
(i)A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるか、
(ii)A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるか、又は
(iii)A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出される。
(i)A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるか、
(ii)A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるか、又は
(iii)A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物(すなわち、前記A3L遺伝子産物、前記A34R遺伝子産物及び前記A9L遺伝子産物)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つの突然変異)を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出される。
上記遺伝子産物をコードする核酸配列は、各前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことに留意すべきである。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸置換)であり得る。
アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
工程(i)で提供されるMVAウイルスは、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす突然変異を含まない核酸配列を特に含む。それは、本発明の第1の態様で言及される好ましいアミノ酸改変を特に含まない。
工程(i)におけるMVAウイルスは、アクセッションナンバーAY603355(バージョンAY603355.1及びGI:47088326)の核酸配列を含み得る。
工程(i)〜(iii)を少なくとも2回、好ましくは少なくとも7回、より好ましくは少なくとも14回、最も好ましくは少なくとも20回、例えば少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回又は20回繰り返すことが好ましい。
細胞をウイルス生産培地中で培養することがさらに好ましい。「ウイルス生産培地」という用語の定義及び「ウイルス生産培地」の好ましい実施態様については、本発明の第4の態様を参照のこと。
工程(ii)では、ウイルスをウイルス生産培地中で1日間〜10日間、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間又は10日間培養し得る。好ましい培養条件及び単離形態については、本発明の第4の態様も参照のこと。
工程(i)における細胞は、MVAウイルスが複製することができる任意の細胞であり得る。前記細胞は、霊長類細胞、特にヒト細胞ではないことが好ましい。前記細胞は、鳥類細胞であることがさらに好ましい。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞(例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)である。前記鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)は、一次細胞(又は一次細胞培養物由来の細胞)、二次細胞(又は二次細胞培養物由来の細胞)又は不死化細胞(又は細胞株由来の細胞)であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第1の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、CR又はCR.pIX細胞株に由来する。CR及びCR.pIX細胞株は、不死化バリケン(Muscovy duck)網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来する。CR.pIX細胞株は、アデノウイルスpIXタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞である。前記細胞は、一次細胞である。
第6の態様では、本発明はまた、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムと、1つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。
上述のように、第1の態様の(突然変異)MVAウイルスは、高度に宿主制限的であるので、高度に弱毒化されている。従って、それは、広範囲のレシピエントを処置するのに理想的である。
「宿主制限」、「高度弱毒化」及び「レシピエント」という用語は、上で定義されている。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。
「賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、有効成分ではない医薬組成物中の全ての物質を示すことを意図する。賦形剤の例としては、限定されないが、結合剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤及び/又は着色剤が挙げられる。治療用途の許容しうる担体及び/又は希釈剤は製薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体の例としては、限定されないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス及び/又はココアバターが挙げられる。適切な希釈剤の例としては、限定されないが、エタノール、グリセロール及び/又は水が挙げられる。薬学的な賦形剤、希釈剤及び/又は担体は、目的の投与経路及び標準的な薬務に関して選択され得る。医薬組成物は、適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤及び/又は可溶化剤をさらに含み得る。適切な結合剤の例としては、限定されないが、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、フリーフローラクトース、β−ラクトース、コーンシロップ、天然ゴム及び合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及び/又はポリエチレングリコールが挙げられる。適切な潤滑剤の例としては、限定されないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び/又は塩化ナトリウムが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、抗酸化剤、懸濁化剤及び/又は香味剤も医薬組成物に含まれ得る。保存剤の例としては、限定されないが、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及び/又はp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。
本発明によって意図される医薬組成物は、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び/又は投与され得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、液体形態、例えば注射液などの溶液の形態である。前記溶液は、例えば、筋肉内注射又は非経口注射され得る。当業者であれば、医薬組成物の投与様式、用量及び投与回数を公知の方法で最適化し得る。
第7の態様では、本発明はさらに、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含むワクチンに関する。
上述のように、第1の態様の(突然変異)MVAウイルスは、高度に宿主制限的であるので、高度に弱毒化されている。従って、それは、広範囲のレシピエントを処置するのに理想的である。「宿主制限」、「高度弱毒化」、「レシピエント」及び「ワクチン」という用語は、上で定義されている。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。これに関して、MVAウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルス又は前記ゲノムは、レシピエントで防御免疫、特にさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列(例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列)をさらに含み得る。「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。このような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばHer2/neu又はMUC−1を包含する。このようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルス由来のタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばHer2/neu又はMUC−1の細胞外ペプチドを包含する。異種核酸配列を含むMVAウイルスは、リコンビナントMVAウイルスとも表記され得る。ワクチンをレシピエントの体内に投与した後、抗原、特にエピトープが発現されて免疫系に提示され、前記抗原、特にエピトープに対する特異的免疫応答が誘導され得る。従って、レシピエントは、前記抗原、特にエピトープに対して免疫される。
好ましくは、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムを含むワクチンは、ポックスウイルスワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、肝炎ウイルスワクチン、例えばC型肝炎ウイルスワクチン、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチン、フラビウイルスワクチン、パラミクソウイルスワクチン、ハンタウイルスワクチン及び/又はフィロウイルスワクチンである。それはまた、乳ガン、黒色腫、膵臓ガン又は前立腺ガンに対するワクチン接種に使用され得る。
本発明によって意図されるワクチンは、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び投与され得る。好ましくは、本発明のワクチンは、液体形態、例えば注射液などの溶液の形態である。前記溶液は、例えば、筋肉内注射又は非経口注射され得る。当業者であれば、ワクチンの投与様式、用量及び投与回数を公知の方法で最適化し得る。ワクチンの製剤化又は調製のために、第1の態様のMVAウイルス、特にリコンビナントMVAウイルスは、生理学的に許容しうる形態に変換される。これは、(Stickl et al. 1974 in Dtsch Med Wochenschr 99, 2386-2392)によって記載されているように)痘に対するワクチン接種に使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて行われ得る。前記ワクチンは、ヒトを含む霊長類などの免疫不全レシピエントで免疫応答を誘導するのに特に有用である。本明細書で使用される「免疫不全」という用語は、不完全な免疫応答しか示さないか、又は感染性病原体に対する防御効率が低下しているレシピエントの免疫系の状態を説明するものである。
第8の態様では、本発明は、医薬に使用するための第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムに関する。好ましくは、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムは、ワクチン接種及び/又は治療に使用するためのものである。特に、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、特異的免疫を誘導する。好ましくは、レシピエントは、霊長類、より好ましくはヒトである。ヒトなどの前記霊長類は、免疫不全であり得る。これに関して、MVAウイルスそれ自体がワクチンであり得ることに留意すべきである。それは、痘に対する保護を付与する。しかしながら、前記ウイルス又は前記ゲノムは、レシピエントで防御免疫、特にさらなる防御免疫が誘発され得る異種核酸配列(例えば、抗原、特に抗原のエピトープをコードする配列)をさらに含み得る。「ワクチン接種」、「レシピエント」、「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましい抗原、特にエピトープは、本発明の第1及び第7の態様に記載されている。好ましくは、前記MVAウイルス又はゲノムは、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス、フィロウイルス、腫瘍及び/又はガン、例えば乳ガン、黒色腫、膵臓ガン又は前立腺ガンに対するワクチン接種に使用するためのものである。
あるいは又は加えて、第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムをレシピエントに負荷して、治療効果を誘発する。上述のように、前記ウイルス又はゲノムに含まれる異種配列は、治療用化合物をコードし得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は1つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
当業者であれば、ワクチン接種の様式、ワクチン接種の用量及びワクチン接種の回数を公知の方法で最適化し得る。ワクチンは、当業者に周知の様々な方法で製剤化及び投与され得る。好ましくは、ワクチンは、液体形態で投与される。好ましくは、ワクチンは、例えば、筋肉内注射又は非経口注射される。第1の態様のMVAウイルス又は第2の態様のゲノムは、薬学的有効量でレシピエントに投与されることが好ましい。「薬学的有効量」という用語は、特定の投与経路で免疫応答を誘発するのに有効なMVAウイルス又はゲノムの量を指す。
第9の態様では、本発明は、核酸配列を含むMVAウイルスであって、A3L遺伝子及び/又はA9L遺伝子が機能欠失しているMVAウイルスに関する。好ましくは、A34R遺伝子がさらに機能欠失している。
より好ましくは、
(i)A3L遺伝子及びA9L遺伝子が機能欠失しているか、
(ii)A3L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失しているか、
(iii)A9L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失しているか、又は
(iv)A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失している。
(i)A3L遺伝子及びA9L遺伝子が機能欠失しているか、
(ii)A3L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失しているか、
(iii)A9L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失しているか、又は
(iv)A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子が機能欠失している。
(非欠失)A3L遺伝子は配列番号7の核酸配列を有し得、(非欠失)A34R遺伝子は配列番号8の核酸配列を有し得、及び/又は(非欠失)A9L遺伝子は配列番号9の核酸配列を有し得る。さらに、MVAウイルスは、アクセッションナンバーAY603355(バージョンAY603355.1及びGI:47088326)の欠失前核酸配列を含み得る。
本発明との関連では、上記A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子の「機能欠失」という用語は、これらの遺伝子が、各A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物の生物学的活性が減少(好ましくは、無効化又は改変)される程度に欠失していると理解すべきである。例えば、生物学的活性は、生物学的に活性な(非欠失)A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物と比較して少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150又は200%減少され得る。
このような機能欠失は、A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/若しくはA34R遺伝子を部分的に欠失することによって、A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/若しくはA34R遺伝子を完全に欠失することによって、並びに/又は1つ以上の終止コドンをA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/若しくはA34R遺伝子を導入することによって達成され得る。
生物学的に活性な(非欠失)A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物と比較した各A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物の生物学的活性の減少又は消失は、当業者に公知の様々な実験で試験され得る。生物学的に活性な(非欠失)A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物と比較した各A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物の生物学的活性の減少又は消失を検出する一方法は、実施例6に記載されているように、コメットアッセイを行うことである。コメットアッセイでは、適切な少数のウイルス(例えば、宿主細胞1個当たりウイルス0.01〜0.001個)を接着許容細胞の細胞単層に感染させる。A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子が欠失しているウイルス由来の子孫は、最初の感染細胞から脱出せず、小さくて限定的な円形のプラーク(細胞変性効果を示す隣接細胞凝集体)をもたらすか、又はいかなるプラークも全くもたらさないであろう。活性なA3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物を備えるウイルスは、肉眼でも明確に視認可能なプラークをもたらすであろう;プラークは2〜7日以内に拡大し、最終的には細胞単層を完全に消費するであろう。
A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子の遺伝子産物の説明に関しては、本発明の第1の態様を参照のこと。
好ましくは、MVAウイルスは、単離されたMVAウイルスである。本明細書で使用される「単離されたMVAウイルス」という用語は、そのネイティブな環境又は培養環境から取り出されたウイルスを指す。従って、単離されたMVAウイルスは、一部又は全部の細胞成分(すなわち、ウイルスが天然に存在する細胞又はそれが培養される細胞の成分(例えば、細胞質成分又は膜成分))を含まなくてもよい。それはまた、一部又は全部の培養成分(例えば、培養培地又は培養関連不純物、例えば培養残物)を含まなくてもよい。
単離されたMVAウイルスは、さらに精製され得る。従って、より好ましくは、MVAウイルスは、精製されたMVAウイルスである。本明細書で使用される「精製されたMVAウイルス」という用語は、無関係な物質(すなわち、ウイルスが得られるネイティブな物質、例えば細胞残屑、細胞残骸、細胞タンパク質、細胞DNA分子及び/又は細胞RNA分子を含む混入物質)の存在を低減又は排除する条件下で単離されたウイルスを指す。精製されたMVAウイルスは、好ましくは、細胞及び/又は培養成分を実質的に含まない。本明細書で使用される「実質的に含まない」という用語は、物質の分析試験との関連で操作上使用される。混入物質を実質的に含まない精製されたMVAウイルスは、好ましくは少なくとも50%純粋であり、より好ましくは少なくとも90%純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも99%又は100%純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野で公知の他の方法によって評価され得る。
機能欠失遺伝子は、異種核酸配列によって置換されることがさらに好ましい。例えば、機能欠失A3L遺伝子は異種核酸配列によって置換され、機能欠失A9L遺伝子は異種核酸配列によって置換され、及び/又は機能欠失A34R遺伝子は異種核酸配列によって置換される。異種核酸配列をMVAウイルスゲノムに挿入する方法は当業者に公知である。異種核酸配列の発現は、MVAウイルスプロモーターの転写コントロール下にあり得る。
「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましくは、異種核酸配列は、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される。
抗原又はエピトープは、前記抗原又はエピトープに対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして有用であり得る。前記ウイルスに対して異種のこのような抗原の例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質、例えばHer2/neu又はMUC−1を包含する。前記ウイルスに対して異種のこのようなエピトープの例は、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、例えばC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、フラビウイルス、パラミクソウイルス、ハンタウイルス若しくはフィロウイルスなどの他のウイルスのタンパク質由来のエピトープ、又は腫瘍及びガンの発症に関連するタンパク質由来のエピトープ、例えばHer/2又はMUC−1の細胞外ペプチドを包含する。
治療用化合物は、治療効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を与えるか若しくはこれに関与する化合物、免疫応答などの生物学的作用を引き起こすことができる化合物、又は1つ以上の生物学的過程において任意の他の役割を果たし得る化合物であり得る。特に、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、免疫抑制化合物、成長因子、酵素、抗炎症化合物又は抗アレルギー化合物であり得る。治療用化合物はまた、アンチセンス核酸であり得る。
診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、マーカー/レポータータンパク質、例えば抗体、GFP、EGFP、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するbla(β−ラクタマーゼ)、若しくはネオマイシン若しくはG418に対するnpt(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)であり得る。前記マーカー/レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はELISAアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。
本発明の好ましい実施態様では、ウイルスは、A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、好ましくは、1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸配列改変)を含む。本発明の一実施態様では、ウイルスは、A3L遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む。本発明の別の実施態様では、ウイルスは、A9L遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む。本発明のさらなる実施態様では、ウイルスは、A34R遺伝子産物を含み、前記遺伝子産物は、1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む。
本発明のより好ましい実施態様では、ウイルスは、
(i)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、
(ii)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物、
(iii)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物、又は
(iv)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物を含む。
(i)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、
(ii)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物、
(iii)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物、又は
(iv)1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA9L遺伝子産物、1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA34R遺伝子産物、及び1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含むA3L遺伝子産物を含む。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸置換)であり得る。「アミノ酸置換(amino acid replacement)」はまた、本明細書では「アミノ酸置換(amino acid substitution)」とも表記され得る。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」という用語は、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及び/又はA9L遺伝子産物のアミノ酸配列内で起こるアミノ酸改変を指すが、本明細書で使用される「アミノ酸付加」という用語は、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及び/又はA9L遺伝子産物のN末端又はC末端で起こるアミノ酸改変を指す。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
第10の態様では、本発明は、MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞に関する。
細胞は、
(i)A3L遺伝子及びA9L遺伝子、
(ii)A3L遺伝子及びA34R遺伝子、
(iii)A9L遺伝子及びA34R遺伝子、又は
(iv)A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子を含むことが好ましい。
(i)A3L遺伝子及びA9L遺伝子、
(ii)A3L遺伝子及びA34R遺伝子、
(iii)A9L遺伝子及びA34R遺伝子、又は
(iv)A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子を含むことが好ましい。
前記細胞はまた、リコンビナント細胞とも表記され得る。特に、前記遺伝子は、MVAウイルス/MVAウイルスゲノムから単離される(すなわち、前記遺伝子は、MVAウイルス/MVAウイルスゲノム内に/その一部に含まれない)。
前記細胞は、MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子でトランスフェクションされ得る。MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子は、前記細胞内で安定的に維持され得るか、又は前記細胞内に一時的に存在し得る。好ましくは、MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子は、前記細胞内で安定的に維持される。
A3L遺伝子は配列番号7の核酸配列を有し得、A34R遺伝子は配列番号8の核酸配列を有し得、及び/又はA9L遺伝子は配列番号9の核酸配列を有し得る。
細胞は、第9の態様のMVAウイルスをさらに含むことが好ましい。前記細胞は、第9の態様のMVAウイルスの機能欠失遺伝子(すなわち、A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子)の遺伝子産物(すなわち、A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物)をin transで提供することができる。例えば、(i)A3L遺伝子が第9の態様のMVAウイルスで機能欠失している場合、A3L遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、A3L遺伝子産物をin transで提供することができ、(ii)A9L遺伝子が第9の態様のMVAウイルスで機能欠失している場合、A9L遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、A9L遺伝子産物をin transで提供することができ、及び/又は(iii)A34R遺伝子が第9の態様のMVAウイルスで機能欠失している場合、A34R遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する細胞は、A34R遺伝子産物をin transで提供することができる。
A3L遺伝子産物は配列番号1のアミノ酸配列を有し得、A34R遺伝子産物は配列番号2のアミノ酸配列を有し得、及び/又はA9L遺伝子産物は配列番号3のアミノ酸配列を有し得る。
(i)MVAウイルスのA3L遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことがさらに好ましい。
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子は、前記遺伝子産物の少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含むことがさらに好ましい。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸置換)であり得る。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
従って、前記細胞は、第9の態様のMVAウイルスの機能欠失遺伝子(すなわち、A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子)の遺伝子産物(すなわち、A3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物)をin transで提供することができるだけではない(上記を参照のこと)。それはまた(あるいは)、第9の態様のMVAウイルスの機能欠失遺伝子(すなわち、A3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子)の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変を有する遺伝子産物(すなわち、A3L遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む、1つの/少なくA9L遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む、A34R遺伝子産物、ここで、遺伝子産物は1つの/少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸改変)を含む、をin transで提供することができる。従って、前記細胞は、アミノ酸配列改変を有しないA3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/若しくはA34R遺伝子産物を含む(非突然変異)MVAウイルスを生産するためのものであるか、又はアミノ酸配列改変を有するA3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/若しくはA34R遺伝子産物を含む(突然変異)MVAウイルスを生産するためのものである。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
前記細胞は、ヒト細胞若しくは霊長類細胞などの哺乳類細胞又は鳥類細胞であり得る。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞(例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)である。前記鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)は、一次細胞(又は一次細胞培養物由来の細胞)、二次細胞(又は二次細胞培養物由来の細胞)又は不死化細胞(又は細胞株由来の細胞)であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第1の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、CR又はCR.pIX細胞株に由来する。CR及びCR.pIX細胞株は、不死化バリケン網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来する。CR.pIX細胞株は、アデノウイルスpIXタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞である。前記細胞は一次細胞である。
第11の態様では、本発明は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたMVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む核酸分子に関する。本発明の一実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子を含む。本発明の別の実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子を含む。本発明のさらなる実施態様では、核酸分子は、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子を含む。
核酸分子は、
(i)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、
(ii)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子、
(iii)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子、又は
(iv)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子を含むことが好ましい。
(i)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、
(ii)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子、
(iii)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子、又は
(iv)好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA3L遺伝子、好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA9L遺伝子、及び好ましくは異種核酸配列に作動可能に連結されたA34R遺伝子を含むことが好ましい。
核酸分子は、リコンビナント核酸分子とも表記され得る。特に、上記遺伝子は、MVAウイルス/MVAウイルスゲノムから単離される(すなわち、前記遺伝子は、MVAウイルス/MVAウイルスゲノム内に/その一部に含まれない)。
A3L遺伝子は配列番号7の核酸配列を有し得、A34R遺伝子は配列番号8の核酸配列を有し得、及び/又はA9L遺伝子は配列番号9の核酸配列を有し得る。
「作動可能に連結された」という用語は、例えば、フレームシフト若しくは終止コドンを回避することによって、又はmRNAの5’キャップ構造とは独立して翻訳の開始を可能にする内部リボソーム侵入部位を介して異種核酸を分離することによって、対応する構築物のインフレーム発現が実行され得るように、A3L遺伝子、A9L遺伝子又はA34R遺伝子が異種核酸配列に連結されていることを意味する。このような内部リボソーム侵入部位は当技術分野で公知であり、例えば、ポリオウイルス又は脳心筋炎ウイルスのゲノムRNAに由来し得る。
「異種核酸配列」という用語は、上で定義されている。好ましくは、異種核酸配列は、抗原、エピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される。より好ましくは、異種核酸配列は、診断用化合物をコードする配列である。診断用化合物は、診断効果を有する任意の化合物であり得る。例えば、治療用化合物は、マーカー/レポータータンパク質、例えば抗体、GFP、EGFP、β−ガラクトシダーゼ、又は抗生物質耐性付与タンパク質、例えばアンピシリンに対するbla(β−ラクタマーゼ)、若しくはネオマイシン若しくはG418に対するnpt(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)であり得る。前記マーカー/レポータータンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション技術、蛍光顕微鏡法又はELISAアッセイを使用することによってウイルスを同定又は単離するのに使用され得る。加えて、ウイルスに含まれる抗生物質耐性付与タンパク質は、抗生物質選択に対する耐性を感染細胞に付与する。抗原、エピトープ又は治療用化合物の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
好ましくは、
(i)MVAウイルスのA3L遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む。
(i)MVAウイルスのA3L遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子は、前記遺伝子産物の1つの/少なくとも1つのアミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ又は3つのアミノ酸配列改変)をもたらす少なくとも1つの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つの突然変異)を含む。
前記アミノ酸配列改変(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸改変)は、アミノ酸欠失(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸欠失)、アミノ酸挿入(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸挿入)、アミノ酸付加(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸付加)及び/又はアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又は9つのアミノ酸置換)であり得る。アミノ酸改変の好ましい実施態様については、本発明の第1の態様を参照のこと。
第12の(twelth)態様では、本発明は、リコンビナントMVAウイルスを生産するための方法であって、
(i)細胞を提供する工程、
(ii)第9の態様のMVAウイルス及び第11の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
(iii)該MVAウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントMVAウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
(i)細胞を提供する工程、
(ii)第9の態様のMVAウイルス及び第11の態様の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
(iii)該MVAウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントMVAウイルスを得る工程
を含む方法に関する。
前記細胞は、ヒト細胞若しくは霊長類細胞などの哺乳類細胞又は鳥類細胞であり得る。前記鳥類細胞は、好ましくは、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞(例えば、アヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)である。前記鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞、ウズラ細胞、ガチョウ細胞又はアヒル細胞、例えばアヒル体節細胞又はアヒル網膜細胞)は、一次細胞(又は一次細胞培養物由来の細胞)、二次細胞(又は二次細胞培養物由来の細胞)又は不死化細胞(又は細胞株由来の細胞)であり得る。「一次細胞」、「一次細胞培養物」、「二次細胞」、「二次細胞培養物」、「不死化細胞」又は「不死化細胞培養物」という用語の定義については、本発明の第1の態様を参照のこと。本発明の好ましい実施態様では、細胞は、CR又はCR.pIX細胞株に由来する。CR及びCR.pIX細胞株は、不死化バリケン網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来する。CR.pIX細胞株は、アデノウイルスpIXタンパク質をコードする遺伝子がそのゲノムにさらに安定的に組み込まれており、前記遺伝子を発現する。本発明の他の好ましい実施態様では、細胞は、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞である。前記細胞は一次細胞である。
好ましくは、第9の態様のMVAウイルスを前記細胞に感染させ、及び/又は第11の態様の核酸分子で前記細胞をトランスフェクションする。当業者であれば、リコンビナントMVAウイルスを得るための、MVAウイルスの核酸配列と核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件を認識している。加えて、当業者であれば、相同組換えが成功したかを評価するための実験試験を認識している。
本発明の様々な改変及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施態様に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、記載されている本発明の実施態様の様々な改変であって、関連分野の当業者に明らかな改変は、本発明によって包含されることを意図する。
以下の図面及び実施例は本発明の単なる例示であり、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈すべきである。
実施例
実施例1:化学的に定義された懸濁培養液におけるMVAの連続単離株
本実施例では、本発明者らは、このウイルスに対して既に完全に許容性の細胞株において、連続世代のMVAの特性を調査した。化学的に定義された培地及びビリオン安定化成分(例えば、孵化卵の最小限精製溶解物に含まれる豊富な細胞外タンパク質及び脂質、又は脊椎動物細胞培養物に一般的に見られるウシ血清サプリメント)の非存在によって、選択的環境を課す。
実施例1:化学的に定義された懸濁培養液におけるMVAの連続単離株
本実施例では、本発明者らは、このウイルスに対して既に完全に許容性の細胞株において、連続世代のMVAの特性を調査した。化学的に定義された培地及びビリオン安定化成分(例えば、孵化卵の最小限精製溶解物に含まれる豊富な細胞外タンパク質及び脂質、又は脊椎動物細胞培養物に一般的に見られるウシ血清サプリメント)の非存在によって、選択的環境を課す。
DNAウイルスから予想される安定性を確認するために、本発明者らは、CR細胞株でMVAを継代した。実験のために、本発明者らは、アクセッションナンバーAY603355(バージョンAY603355.1及びGI:47088326)のMVA株を使用した。用いた懸濁培養液及び化学的に定義された手順は、規制当局が提案する制約の十分に範囲内であり、以前に開発及び提示したものである(Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)。ここで簡潔に説明すれば、超弱毒化ポックスウイルスを高力価に生産するために、CD−U3培地中のCR又はCR.pIX懸濁培養物を細胞4×10^6個/mLに増殖させた。1容量のCD−VP4ウイルス生産培地を追加し、示されている感染多重度(MOI)(通常は0.01〜0.1の範囲内)までウイルスと共に培養物をインキュベーションした。CR及びCR.pIX細胞株は不死化バリケン網膜細胞(Jordan, et al. 2009 in Vaccine 27, 748-756)に由来し、ワクチン生産のために設計した。CD−U3培地(PAA, catalog #T1250,3001)は改良型のCD−U2細胞増殖培地であり、CD−VP4(Biochrom catalog #F9127)は、ウイルス複製中にこの増殖培地を補完するために開発されたウイルス生産培地である(Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)。以下の実施例に記載されている全ての培養を、8%CO2富化雰囲気中、37℃で実施した。振幅5cm並びに180rpm(振盪チューブの場合)及び150rpm(振盪フラスコの場合)の振盪インキュベータ(Infors)内で、懸濁培養物をインキュベーションした。
規定の間隔で懸濁培養物からサンプルを取り出し、出力10%で3.2mmソニファアーチップに電力供給するBranson S250-Dユニットを用いて45秒間超音波処理することによって、その中の感染性ウイルスを通常通り放出させた。
5%FCSを含有するDMEM:F12培地(Gibco)中の80%コンフルエントVero単層に系列希釈のウイルス調製物を追加することによって、感染単位数を決定した。MVAはVero細胞内では複製することができないので、このような基質を使用してインプットウイルスのみを厳密に定量することが可能になる。48時間後、メタノールで細胞を固定し、1%ウシ胎児血清を含有するPBSで1:1000希釈したポリクローナルワクシニアウイルス抗体(Quartett Immunodiagnostika, Berlin, Germany)と共にインキュベーションした。0.05%Tween20を含有するPBSで2回の洗浄工程を実施し、ワクシニア特異的抗体に対する二次抗体を1:1000で追加する。この二次抗体は、AEC試薬(3−アミノ−9−エチル−カルバゾール;0.015%H2O2を含有する0.3mg/mlの0.1M酢酸緩衝液(pH5.0))と共にインキュベーションすると呈色反応を触媒するペルオキシダーゼ酵素にカップリングされている。光学顕微鏡検査によって感染フォーカスを同定し、陽性色素反応をもたらす最大希釈のMVA懸濁液からプラーク形成単位/mlを計算する。全ての滴定を並列反復で実施した(1サンプル当たり合計4つの滴定値が得られる)。
一次ニワトリ細胞における増殖に既に適合されたMVAを不死(一次ではない)培養物(これは同時に、ニワトリに由来しない鳥類生産基質である)に連続曝露したのはこれが最初である。さらに、本発明者らは、血清、アルブミン、又はウイルスを安定化すると予想される他の成分を追加せずに、化学的に定義された培養培地中で継代を実施した。
図1A/3Aに示されているように、継代の増加と共に産生量が徐々に増加している。直前の各世代からのウイルス産生量が推定されるようにこの最初の実験を実施し、この推定値を用いて、本発明者らは、0.01〜0.1のMOIで次の培養物に感染させようとした。滴定を評価することができるまでに必要な時間が原因で、真のMOIは継代によって異なっており、本発明者らの場合(継代がウイルス複製に対する弱毒化効果又は抑制効果も有し得る)では、継代の増加と共に産生量及びMOIが増加した。完全に許容性の細胞株におけるMVAの驚くべき潜在的な継代効果を発見した後、本発明者らは、よりストリンジェントな条件下で実験を繰り返した。
前の各継代の感染48時間後に単離したウイルスを用いて各継代のMOIを0.05に調整することによって、図1B〜1Cに示されているデータを得た。図1A/3Aの最初の実験の最後から2番目の継代14のウイルスを高継代参照として使用した。従って、この繰り返し実験では、MVA特性の任意の変化が確認される。
図1Bは、様々な継代の速度を重ね合わせて示す。各実験について、低継代MVA及び高継代MVAから開始して、独立したデュプリケイトの2回の独立した平行感染を定量した。低継代ウイルスで開始した継代10及び11のスレッドでは、本発明者らは、10^8pfu/mL〜10^9pfu超/mLの範囲内の(既に高い)産生量からの強い変化に注目した。
効果をより良く可視化するために、図1Cは、継代数に対する48時間のピークウイルス力価のみを示す。継代14から開始したMVA継代は約3.4×10^9pfu/mL前後であるのに対して、10未満のMVA継代は3.8×10^8pfu/mLの範囲内である。継代10及び11のウイルスは、3.66×10^9pfu/mLの平均ピーク値まで急に複製する。ウイルス力価の決定は変動を伴うので、図1D/3Dは、特定の各継代に関する低継代ウイルスと高継代ウイルスとの比を示す。高継代ウイルスの複製特性は依然として安定であるので、このアプローチは、力価の偏差に対して標準化する。大きな数字は高継代ウイルスの利点を示し、1という比は、低継代ウイルス及び高継代ウイルスの特性が非常に類似するか又は同一であることを示す。
図1Dのデータは、低継代ウイルスの各世代の産生量が高継代ウイルスの産生量に近づいていることを示す。実験開始時には20倍超の量の高継代ウイルスが放出されるのに対して、継代10の後にはこの数が同等まで減少する。この特定の実験では、高継代表現型へのさらなる工程が継代8で開始する。安定した超高産生量のウイルスが継代10で得られ、継代11で維持されていることが示されている。継代14から開始する独立参照系統から開始して8継代にわたって、全体的な安定性が実証されている。
実施例2:MVAゲノムDNAの配列決定
本発明者らは次に、選択したウイルス継代のDNA配列を決定した:記載されているように(Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)、CD−U3及びCD−VP4培地の1:1混合物中、細胞2×10^6個/mLのAGE1.CR培養物100mLにMVAを0.01のMOIで感染させた。48時間後、200×gで遠心分離することによって、感染細胞を除去した。ポリエチレングリコールを澄明上清に(13%w/vストック純水溶液から)8%まで追加した。氷上で30分間インキュベーションした後、懸濁液を6600×gで60分間遠心分離し、ウイルス粒子を含有する半透明のペレットを500μLのPBSに再懸濁した。
本発明者らは次に、選択したウイルス継代のDNA配列を決定した:記載されているように(Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)、CD−U3及びCD−VP4培地の1:1混合物中、細胞2×10^6個/mLのAGE1.CR培養物100mLにMVAを0.01のMOIで感染させた。48時間後、200×gで遠心分離することによって、感染細胞を除去した。ポリエチレングリコールを澄明上清に(13%w/vストック純水溶液から)8%まで追加した。氷上で30分間インキュベーションした後、懸濁液を6600×gで60分間遠心分離し、ウイルス粒子を含有する半透明のペレットを500μLのPBSに再懸濁した。
製造業者の説明書に従って、8単位のTurbo DNase (Ambion)で余分なウイルスDNAを消化し、次いで、DNA blood mini preparation kit (Qiagen)を用いて全DNA(大部分がウイルスゲノム)を単離した。
予想産生量を計算するために、178kbpのMVAゲノム及び660g/mol/DNA bpが、1.17×10^8gのDNA/ウイルスmolに対応する。6.02×10^23/molをNAで割ると、1.95×10^(−16)gのDNA/MVA粒子となる。産生量を10^8pfu/mLと仮定すると、1.95×10^(−8)gのウイルスDNA/mL又は19.5ng/mLと予想され得る。
本発明者らはこの調製で約8μgの全DNAを得、多重qPCRを実施して、ウイルスゲノムDNAと細胞DNAとの比をさらに推定した。CgTTTTgCATCATACCTCCATCTT(配列番号13)、6FAM−AggCATAAACgATTgCTgCTgTTCCTCTgT−BHQ1(配列番号14)及びgCgggTgCTggAgTgCTT(配列番号15)を用いて、細胞内成熟ウイルスの膜タンパク質MVA128Lの遺伝子(GenBank#U94848のbp120811〜120898)に対するqPCRによって、MVAレベルを定量した。細胞DNAの検出のために、TgACTCCggTCCTTCTAACACA(配列番号16)、YAK−CCCggTggTCCCgCTgTgC−BHQ1(配列番号17)及びTCACggCAACTggTTTAATgg(配列番号18)を用いて、E1Aトランス遺伝子を定量した。25μLの最終反応容量中、100nMプライマー及び80nMプローブを200μM dNTP及び1×濃縮Taq Man Universal PCR Master Mix (#4324018, Applied Biosystems)と混合した。ABI Prism 7000において、50℃で2分間、95℃で10分間、並びに95℃で15秒間及び60℃で1分間を40サイクルの熱サイクルを実施した。典型的なCt値は、MVAについては16であり、細胞DNAについては33であった。Ct値の差異は相対分子濃度の差異を示すので、ウイルスDNAと宿主DNAとの比は、ゲノム全体の配列決定に適切な2^(33−16)又は130000:1である。
Roche/454 GS FLX+技術を用いて、配列を得た。各ゲノムの50倍の被覆度で継代2、7及び11のゲノムウイルスDNA(図1に示されている)を配列決定し、非強制的(ガイド配列なし)アルゴリズムを使用してアセンブルした。3つの継代のアライメントにより、ポックスウイルスから予想されるように極めて高い配列保存性が明らかになった。ヌクレオチドリピート中の単一塩基欠失の数は、配列決定用人工物(例えば、tttttat−aaaataa対tttttataaaaataa)を表している可能性が高いので、さらなる分析に含めなかった。
非人工物の定義に適合する点突然変異はわずか3つであり、検討継代11のウイルスゲノムでこれらを発見した。3つの点突然変異は全てがコード領域内にあり、それぞれが異なる構造タンパク質に影響を与え、それぞれがアミノ酸組成を変化させた。本発明者らは、これらの変化を非常に重要で完全に予想外のものであると考える。このように、本発明者らは新規MVA株を回収し、残りの本文では本発明者らはこれをMVA−CRと称する。
MVA−CRで発見した3つの突然変異の第1は、配向目的でここで使用したCVA株(GeneBank#AM501482)のbp 111561位にある。この突然変異は、一般的なポックスウイルスゲノムの表記法の1つ(Meyer, et al. 1991 in J Gen Virol 72 ( Pt 5), 1031-1038; Rosel et al. 1986 in J Virol 60, 436-449)によれば、A3Lと称される遺伝子のコード配列中のヌクレオチド1915におけるCからTへのトランジション(C1915Tと略される)である。遺伝子産物は、主なコアタンパク質P4b前駆体である。C1915T突然変異は、アミノ酸配列において、コドン639のHis(CAU)からTyr(UAU)への変化を引き起こす。ポックスウイルスゲノムでは、A3L遺伝子はアンチセンス方向にあるので、コード配列におけるC1915TがCVAのゲノムDNAにおけるG111561Aに対応することに留意する。
第2の突然変異は、A9Lによってコードされる10.6kビリオン膜タンパク質のコード配列におけるA223Gトランジションであり、CVAのゲノムDNAにおけるT119151Cトランジションである。A223G突然変異は、コドン75をLys(AAG)からGlu(GAG)に変化させる。
第3の突然変異は、A34RによってコードされるEEV膜糖タンパク質のコード配列におけるG256Tトランスバージョンであり、CVAのゲノムDNAにおけるG144417Tトランスバージョンである。G256T突然変異は、コドン86をAsp(GAT)からTyr(UAU)に変化させる。
本実験で使用したMVAのゲノム(アクセッションナンバーAY603355(バージョンAY603355.1及びGI:47088326))における位置:A3L、相補鎖のbp 100334〜bp 102268;A9L、相補鎖のbp 107855〜bp 108139;及びA34R、ゲノム鎖の129078..129584。使用した株は、番号#VR−1508でAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能なウイルスである。
3つの突然変異は全て、感染性粒子の成分であるMVAのタンパク質に影響を与える。影響を受けるタンパク質のより詳細な機能は、以下のとおりである:
A3L遺伝子産物:A3L遺伝子産物P4bは、3つの主なコアタンパク質の1つであり、球状の非感染性未成熟ビリオン(IV)が細胞内成熟ビリオン(IMV)に成熟する間に、I7Lコードウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる(Byrd et al. 2002 in J Virol 76, 8973-8976)。P4bタンパク質は、非常に初期の段階におけるビリオンの形態形成に寄与する。それは、感染性IMVへの移行における正確な凝縮及び膜再構成に関与する(Heljasvaara et al. 2001 in J Virol 75, 5778-5795; Kato et al. 2004 in Virology 330, 127-146)。
A9L遺伝子産物:P4bに類似するこの遺伝子産物は、MVA成熟の初期段階に関与する。それは、IMVのコアの正確な凝縮に重要な因子である(Yeh et al. 2000 in J Virol 74, 9701-9711)。
A34R遺伝子産物:細胞外エンベロープウイルス(EEV)は、ウイルスが遠位部位に拡散するのを可能にするビヒクルとして進化してきた。EEVのさらなる膜は、ターゲット細胞との融合を媒介するために備わっているのではなく、IMV(ワクシニアウイルスの実際の感染単位)を放出するためには破壊されなければならない。A34R欠失突然変異体を用いた研究では、EEVの外膜を不安定化することによって、この因子が、細胞外空間における感染活性及びワクシニアウイルスの拡散に極めて重要であることが実証された(Husain et al. 2007 in Virology 366, 424-432)。A34Rタンパク質は、A33Rタンパク質及びB5Rタンパク質と共に(Blasco et al. 1993 in J Virol 67, 3319-3325; Katz et al. 2002 in J Virol 76, 11637-11644; Meiser et al. 2003 in J Gen Virol 84, 1383-1392)、細胞結合エンベロープウイルス(CEV)が産生細胞から離れる速度をモデュレーションする。
上記突然変異を有するMVAウイルスは、以前に全く記載されていない。従って、安定鳥類細胞株の化学的に定義された懸濁培養液中でMVAを継代することにより、2つの内在性タンパク質(A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物)が変化して実際の感染実体(成熟ウイルス)が改善された。これらの変化は感染力を増加させ、成熟速度を改善し、及び/又は血清の予想安定化成分が含まれない環境における安定性を増加させる。加えて、細胞外形態のウイルスの特性をモデュレーションするA34R遺伝子産物において、点突然変異が検出された。この変化は脱離速度を増加させ、成熟粒子の感染力を遮蔽する外側のウイルスエンベロープの安定性を減少させる。
実施例3:確認実験
本発明者らの予想外の発見の原因が配列決定用人工物であることを排除するために、本発明者らは確認実験を実施した。調製物中のMVA−CRの存在を確認するために、本発明者らは、さらなる配列決定反応用に、影響を受ける全てのオープンリーディングフレームを増幅するためのプライマーを設計した。KOD HiFi DNA polymerase (TOYOBO Novagen)を用いて、55℃で20秒間のアニーリング、72℃で60秒間の増幅(A3Lの場合には120秒間)及び94℃で20秒間の変性を36サイクル行うPCRを実施した。A9Lのコード配列を増幅するためのプライマー(f=フォワード及びr=リバース)は、GCAAACGCGATAAGGATACG(a9lf)(配列番号19)及びAAGCGGATGCAGAATAGACG(a9lr)(配列番号20)であり、A34Rのコード配列を増幅するためのプライマーは、gCggAATCATCAACACTACCC(a34rf)(配列番号21)及びTAATAACAAACgCggCgTCCATggC(a34rr)(配列番号22)であった。かなり大きなA3Lオープンリーディングフレームの配列決定は、いくつかのプライマーを用いて行った:GCAGAAGAACACCGCTTAGG(a3lf)(配列番号23)及びATGGAAGCCGTGGTCAATAG(a3lr)(配列番号24)を用いて増幅を実施し、TGAGAGCTCGCATCAATC(a3lf2)(配列番号25)、ATCGGACTGTCGGATGTTGTG(a3lf3)(配列番号26)及びCTAGAATCGGTGACCAACTC(a3lr3)(配列番号27)を用いて配列決定を実施した。
本発明者らの予想外の発見の原因が配列決定用人工物であることを排除するために、本発明者らは確認実験を実施した。調製物中のMVA−CRの存在を確認するために、本発明者らは、さらなる配列決定反応用に、影響を受ける全てのオープンリーディングフレームを増幅するためのプライマーを設計した。KOD HiFi DNA polymerase (TOYOBO Novagen)を用いて、55℃で20秒間のアニーリング、72℃で60秒間の増幅(A3Lの場合には120秒間)及び94℃で20秒間の変性を36サイクル行うPCRを実施した。A9Lのコード配列を増幅するためのプライマー(f=フォワード及びr=リバース)は、GCAAACGCGATAAGGATACG(a9lf)(配列番号19)及びAAGCGGATGCAGAATAGACG(a9lr)(配列番号20)であり、A34Rのコード配列を増幅するためのプライマーは、gCggAATCATCAACACTACCC(a34rf)(配列番号21)及びTAATAACAAACgCggCgTCCATggC(a34rr)(配列番号22)であった。かなり大きなA3Lオープンリーディングフレームの配列決定は、いくつかのプライマーを用いて行った:GCAGAAGAACACCGCTTAGG(a3lf)(配列番号23)及びATGGAAGCCGTGGTCAATAG(a3lr)(配列番号24)を用いて増幅を実施し、TGAGAGCTCGCATCAATC(a3lf2)(配列番号25)、ATCGGACTGTCGGATGTTGTG(a3lf3)(配列番号26)及びCTAGAATCGGTGACCAACTC(a3lr3)(配列番号27)を用いて配列決定を実施した。
偶然にも、A34Rにおける突然変異D86Yは、AccI制限酵素のターゲット部位を導入する:ccggatactからccG/TATACtに(太字は突然変異であり、大文字は制限ターゲット部位である)。同時に、野生型のBsaWI部位は、agA/CCGGAtからagaccgtatへの突然変異D86Yによって失われる。772bpのA34RアンプリコンをAccIで消化すると、親MVAの場合には399及び373bpが生じ、MVA−CRの場合には399、316及び57bpが生じる。逆に、BsaWIで消化すると、親MVAの場合には452及び320bpが生じ、MVA−CRの場合には772bp全体が生じる。TAE緩衝液中、3%アガロースゲル電気泳動によって、フラグメントを分離した。
図3Dは、A34RにおけるD86Y変異がMVA−CR11集団の一部であることを示す。それは、X14系統でも独立して得られた。この結果は、ここで発見された突然変異が偶然の出来事ではなく、実際にはウイルス複製中の環境に関連することを裏付けている。
本発明者らはまた、増幅フラグメントの従来の配列決定によってこれらの驚くべき結果を確認した。サブクローニングせずに精製PCR反応物で配列決定を意図的に直接実施したので、図4に示されているクロマトグラムは、平均的な配列(すなわち、最も豊富な配列だけではなく配列変異の存在も)を反映すると予想される。アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分離し、単一の顕著なシグナルを含有するゲルスライスを切り出し、製造業者の説明書に従ってQIAquick Gel Extraction kit (Qiagen)を使用してその中のDNA混合物を単離することによって、PCR反応物の精製を実施した。増幅にも使用したのと同じプライマーを用いて、配列決定を実施した。
本発明者らは、MVA−CR11及び独立X14系統において、観察された3つの突然変異の全てが存在することを確認した。
実施例4:新規MVA−CR株の単離及び精製
純粋なMVA−CRウイルスを得るために、本発明者らは次に、プラーク精製を実施した:5%FCS(Biochrom)を含有するDMEM:F12培地中の6ウェルプレートの1ウェル当たり1×10^6個の接着CR細胞を播種した。24時間後、合計でわずか10^4pfuのMVA−CR16(これは、化学的に定義されたCR懸濁培養液中でさらに5世代にわたって継代したMVA−CR11の子孫である)を追加した。少数の感染単位を感染させることにより、十分に分離したプラークを得ることが可能になる。30分後、5%FCSを含有するDMEM:F12培地中の0.8%の低ゲル化アガロース(Sigma #A9045)と培養培地を交換した。アガロースオーバーレイは、個々のプラークが互いに混入しないように、感染単層によって放出される子孫ウイルスの拡散を防止する。オーバーレイはまた、中空針を用いて小さな(約2mmの直径)アガロースコアを再生することによって、子孫ウイルスの単離を可能にする。細胞変性効果のフォーカスからこのようなアガロースコアを採取し、12ウェルプレートにおける最大培養密度80%の新鮮接着細胞単層に移し、各アガロースコアを別個のウェルに入れた。ウイルスはアガロースコアから拡散し、ウェル中の細胞に感染し、この手順によって得られたウイルスは、(理論的には)単一の初期プラークに由来するので精製されたと考えられる。しかしながら、一部のウイルスは凝集する傾向があり、ポックスウイルスでは問題も発生するので、特定の宿主培養物はウイルス混合物に感染している可能性がある。図4に示されているように、MVA−A2から17世代離れたこの調製物の単離株#9(従って、MVA−CR17*と称される。アスタリスクは、さらなる操作としてのプラーク精製を意味する)を純粋であると考え、さらなるプラーク精製のために選択した。第2ラウンドにより、所望のA34R遺伝子型が得られた。この第2ラウンドの単離株#1を選択し、化学的に定義されたCR培養液中で増幅した。フラグメントをサブクローニングせずにPCRからA3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子を直接配列決定したところ、純粋でユニークな新規集団が明らかになった。
純粋なMVA−CRウイルスを得るために、本発明者らは次に、プラーク精製を実施した:5%FCS(Biochrom)を含有するDMEM:F12培地中の6ウェルプレートの1ウェル当たり1×10^6個の接着CR細胞を播種した。24時間後、合計でわずか10^4pfuのMVA−CR16(これは、化学的に定義されたCR懸濁培養液中でさらに5世代にわたって継代したMVA−CR11の子孫である)を追加した。少数の感染単位を感染させることにより、十分に分離したプラークを得ることが可能になる。30分後、5%FCSを含有するDMEM:F12培地中の0.8%の低ゲル化アガロース(Sigma #A9045)と培養培地を交換した。アガロースオーバーレイは、個々のプラークが互いに混入しないように、感染単層によって放出される子孫ウイルスの拡散を防止する。オーバーレイはまた、中空針を用いて小さな(約2mmの直径)アガロースコアを再生することによって、子孫ウイルスの単離を可能にする。細胞変性効果のフォーカスからこのようなアガロースコアを採取し、12ウェルプレートにおける最大培養密度80%の新鮮接着細胞単層に移し、各アガロースコアを別個のウェルに入れた。ウイルスはアガロースコアから拡散し、ウェル中の細胞に感染し、この手順によって得られたウイルスは、(理論的には)単一の初期プラークに由来するので精製されたと考えられる。しかしながら、一部のウイルスは凝集する傾向があり、ポックスウイルスでは問題も発生するので、特定の宿主培養物はウイルス混合物に感染している可能性がある。図4に示されているように、MVA−A2から17世代離れたこの調製物の単離株#9(従って、MVA−CR17*と称される。アスタリスクは、さらなる操作としてのプラーク精製を意味する)を純粋であると考え、さらなるプラーク精製のために選択した。第2ラウンドにより、所望のA34R遺伝子型が得られた。この第2ラウンドの単離株#1を選択し、化学的に定義されたCR培養液中で増幅した。フラグメントをサブクローニングせずにPCRからA3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子を直接配列決定したところ、純粋でユニークな新規集団が明らかになった。
要約すると、化学的に定義された過程から得られたウイルスを不死化細胞株で繰り返し単離することによって、本発明者らは、新規ワクシニアウイルス株を取得してさらに精製した。微生物学的定義による株は、「純粋培養における単一単離の子孫であって、[...]他の単離株と[...]表現型特徴及び遺伝子型特徴によって区別され得る子孫」を意味する(van Belkum et al. 2007 in Clin Microbiol Infect 13 Suppl 3, 1-46)。本発明者らは、これを株MVA−CRと称する。この株の十分に精製された最初の実際的なメンバーはMVA−CR19であり、区別可能な特徴は、A3L遺伝子におけるC1915T、A9L遺伝子におけるA223G、及びA34R遺伝子におけるG256T(数字は全て、コード鎖に関するものである)からなる群より選択される突然変異の少なくとも1つである。
実施例5:MVA−CRの特性(産生量)
MVA−CRを含有する調製物の産生量は、親株を含有する集団と比較してほぼ10倍大きい。これは、極めて重要な特性である。MVAベースのワクチンの超弱毒化は重要な安全特徴であるが、投与コスト要件を犠牲にする:ワクチン接種1回当たり10^8感染単位のMVAが、免疫系の効率的な刺激に必要であると推定され(Coulibaly et al. 2005 in Virology 341, 91-101; Gilbert, et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561)、感染性疾患に対する世界的なプログラムのために、高度弱毒化ポックスウイルスの数億回の投与が毎年必要とされ得る。比較のために、鳥類細胞でも生産される複製能が制限された低度弱毒化株としては、はしか、おたふく風邪及び黄熱病に対するワクチンが挙げられる;これらは、1用量当たり10^3〜5.5×10^4感染単位しか必要としない(Sanofi PasteurのYF-VAX(登録商標)及びMerckのM-M-R(登録商標)IIの添付文書からの情報)。天然痘に対するルーチンなワクチン接種におけるワクシニア株Dryvaxの防御用量は、2.5×10^5感染単位であり(Rotz et al. 2001 in MMWR Recomm Rep 50, 1-25; quiz CE21-27)、MVAベースのワクチンの推奨用量よりも400倍少ない。従って、全ての目的のワクチンを得るためには、MVAベースのワクチンのための高効率でロバストな新規生産系が必要であり、技術進歩を補完するために新規MVA株が必要である。
MVA−CRを含有する調製物の産生量は、親株を含有する集団と比較してほぼ10倍大きい。これは、極めて重要な特性である。MVAベースのワクチンの超弱毒化は重要な安全特徴であるが、投与コスト要件を犠牲にする:ワクチン接種1回当たり10^8感染単位のMVAが、免疫系の効率的な刺激に必要であると推定され(Coulibaly et al. 2005 in Virology 341, 91-101; Gilbert, et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561)、感染性疾患に対する世界的なプログラムのために、高度弱毒化ポックスウイルスの数億回の投与が毎年必要とされ得る。比較のために、鳥類細胞でも生産される複製能が制限された低度弱毒化株としては、はしか、おたふく風邪及び黄熱病に対するワクチンが挙げられる;これらは、1用量当たり10^3〜5.5×10^4感染単位しか必要としない(Sanofi PasteurのYF-VAX(登録商標)及びMerckのM-M-R(登録商標)IIの添付文書からの情報)。天然痘に対するルーチンなワクチン接種におけるワクシニア株Dryvaxの防御用量は、2.5×10^5感染単位であり(Rotz et al. 2001 in MMWR Recomm Rep 50, 1-25; quiz CE21-27)、MVAベースのワクチンの推奨用量よりも400倍少ない。従って、全ての目的のワクチンを得るためには、MVAベースのワクチンのための高効率でロバストな新規生産系が必要であり、技術進歩を補完するために新規MVA株が必要である。
実施例6:MVA−CRの特性(宿主細胞からの脱出)
等しく重要な別の特性は、ウイルス調製物の純度に関する。連続細胞株由来の任意のワクチンについて、宿主細胞由来の成分を枯渇させるための調製物の精製が必要とされる。残存DNAに関して、1用量当たり10ngの最大レベル(Hess et al. 2012 in Vaccine 30, 2715-2727)が許容可能であると考えられる。従来のMVAのかなりの割合は、非常に細胞結合性である。本発明者らが同定した新規突然変異は、宿主細胞からのウイルスの放出及び解離を促進する。EEVの外膜を不安定化すると、細胞外容積に存在するウイルス(IMVに対応するビリオン)の実際の感染単位の量が多くなった。
等しく重要な別の特性は、ウイルス調製物の純度に関する。連続細胞株由来の任意のワクチンについて、宿主細胞由来の成分を枯渇させるための調製物の精製が必要とされる。残存DNAに関して、1用量当たり10ngの最大レベル(Hess et al. 2012 in Vaccine 30, 2715-2727)が許容可能であると考えられる。従来のMVAのかなりの割合は、非常に細胞結合性である。本発明者らが同定した新規突然変異は、宿主細胞からのウイルスの放出及び解離を促進する。EEVの外膜を不安定化すると、細胞外容積に存在するウイルス(IMVに対応するビリオン)の実際の感染単位の量が多くなった。
確認のために、非弱毒化ワクシニアウイルスについて以前に記載されている「コメットアッセイ」(McIntosh and Smith 1996 in J Virol 70, 272-281)を行った。このようなアッセイにより、ウイルスが宿主細胞から脱出する能力が可視化される:円形のプラークは強力な細胞結合を示すのに対して、細長いコメット様のプラークは、子孫ウイルスが宿主細胞から解離して、より遠位部位で感染を開始することを示唆している。本発明者らの実験では、1×10^6個の接着CR細胞又は1.5×10^6個のR05T細胞をT25フラスコに播種した。R05Tは、Egyptian rousette由来の一次細胞の不死化によって得られた細胞株である。これは、非常に数少ないMVA許容性の哺乳類細胞株の1つであり(Jordan, et al. 2009 in Virus Res 145, 54-62)、ここに記載されている実験では参照としての役割を果たす。24時間後、50000pfuのMVA−A2又はMVA−CR19を追加した。フラスコをインキュベータに入れ、少なくとも72時間静置して、放出されたウイルスがごく近傍で確実に再感染して、主なプラークと依然として結合し得るようにした。0.2容量の10%ホルムアルデヒドのPBS溶液を培地に直接追加することによって、細胞単層を固定した。図5に示されているように、0.05%クリスタルバイオレット(Sigma)水溶液で染色した後、様々なプラーク形態のMVA−A2及びMVA−CR19が肉眼でも見える。
図6は、MVA−A2、MVA−CR11又はMVA−CR19を感染させたCR細胞及びR05T細胞の単層における典型的なプラークを40倍初期倍率で示す。この高倍率において、本発明者らは、R05TではMVA−CR19の弱毒化がより大きいことをより明確に観察し、CR細胞ではMVA−CR19によって引き起こされた顕著なプラークが存在することを確認した。
本発明者らは次に、接着培養物におけるプラーク表現型が、化学的に定義された感染細胞培養物内でもウイルス移動性がより大きいことの指標であるかを調べた。従って、本発明者らは、今回は無細胞上清(「SN」と略される)を得るためにサンプルを200×gで5分間遠心分離した以外は実施例1に記載されているように、単離株MVA−A2及びMVA−CR19をCR.pIX懸濁培養物に感染させた。細胞ペレットを廃棄し、感染力を増加させるために、SN中のウイルスを3回の凍結/解凍サイクル(−85℃/37℃)に供してEEVの外膜を破裂させた。
さらに、本発明者らは、CD−VP4ウイルス生産培地を追加せずにCD−U3細胞増殖培地のみの単相プロセスにおいてもウイルス複製を試験した。本発明者らは、CD−VP4を感染時に追加する二相プロセスが、超弱毒化ポックスウイルスの産生量を有意に増加させることを以前に示した(Jordan, et al. 2011 in Biologicals 39, 50-58)。この理由により、図7Aに示されている複製速度の比較が、単離株MVA−CR19が単相プロセスにおいて二相環境と同様に効率的に複製することを示すことは非常に驚くべきことであった(灰色の曲線)。MVA−A2については、予想された少なくとも10倍の差異が確認された(黒色の曲線、単相プロセスについては白色の記号)。
従って、本発明者らは、宿主細胞からのMVAの放出を促進する機能獲得型突然変異を得た。これは、図7(本発明者らは、上清(SN)及び完全溶解物中の感染単位を比較している)に示されているデータでも確認される。パネルBのチャートについては、感染48時間後において、SNだけではなく完全細胞懸濁液の超音波処理溶解物由来のウイルスもアッセイした。無細胞区画(単相プロセスでは74.0%、二相プロセスでは37.5%)では、感染性MVA−CR19ウイルスの割合がMVA−A2(それぞれ3.6%及び4.9%)と比較して高い。
ウイルス生産培地の存在下では、より多くのMVA−CR19ウイルスが宿主細胞内で捕捉されるという事実は、細胞凝集を誘導してウイルスの細胞間拡散を促進するという本発明者らの意図と一致する。この観察結果は、図8(顕著な差異はほとんどないが、全ての試験した培養物においてMVA−CR19の放出がMVA−A2と比較して促進されている)に示されている接着培養物でも確認される。前述のように、EEVの外膜はMVAの感染力に干渉するので、MVA−CRの細胞外感染力の増加の理由の1つは、この成分の安定性の減少によるものである。撹拌せず、ビリオンを安定化するウシ胎児血清の存在下では、MVA−CR19のこの外膜はより長い時間間隔にわたって保持されて、MVA−CR19のこの潜在的な利点が平準化される。さらに、これらは細胞接着を促進することが公知であるように(Attramadal 1969 in J Periodontal Res 4, 166)、接着培養物用に設計した培地中では、二価陽イオンの濃度が上昇している。Mg2+及びCa2+濃度の増加は、おそらくは原形質膜に対するウイルスエンベロープの結合を増強して、化学的に定義された懸濁培養液中のMVA−CRについて本発明者らが観察した利点がやはり平準化される。
従って、MVA−CR19は、宿主細胞からの脱出能力が増加している。しかしながら、完全に予想外で驚くべきことは、(本発明者らが単離株MVA−CR19を用いて得た)MVA−CR株の純度の増加と共に、R05T細胞株における弱毒化が高まる(これは、この細胞株中の完全に閉じ込められた小さなフォーカスによって明らかになる)と思われる明らかな傾向である。この特性は極めて有益である:新規MVA−CR株は依然として高度に弱毒化されていると同時に、産生細胞からより容易に脱出する。全細胞溶解物の代わりに無細胞上清をハーベストバルクとして使用し得るので、細胞外ウイルスの割合の増加は精製を非常に容易にする。さらに、真の単相生産プロセスが可能である:細胞増殖にも使用されるのと同じ培養培地中で、MVA−CRを高力価に生産し得る。グルコース及び他の栄養素を提供するため、又はpHをレギュレーションするために少量(培養容積の5〜20%未満)のフィードを追加する以外は、ウイルス生産培地はもはや必要とされない。
実施例7:MVA−CRの特性(化学的に定義されたプロセスに対する特異性)
株MVA−CRの出現を駆動する選択圧をさらに特性決定するために、本発明者らはまた、実施例1に記載されている最初の実験に酷似する実験において、接着CR及びR05T細胞株から連続世代のMVAを単離した。接着CR細胞株を使用して、MVA−CRの出現が、培養条件に加えて宿主細胞の特徴によっても影響を受けるかを調べた。選択の特異性及び親MVAの安定性の試験と同じく、MVA許容性の哺乳類細胞株であるR05Tは参照としての役割を果たす。
株MVA−CRの出現を駆動する選択圧をさらに特性決定するために、本発明者らはまた、実施例1に記載されている最初の実験に酷似する実験において、接着CR及びR05T細胞株から連続世代のMVAを単離した。接着CR細胞株を使用して、MVA−CRの出現が、培養条件に加えて宿主細胞の特徴によっても影響を受けるかを調べた。選択の特異性及び親MVAの安定性の試験と同じく、MVA許容性の哺乳類細胞株であるR05Tは参照としての役割を果たす。
本実験のために、1.5×10^6個のCR.pIX細胞及び1×10^6個のR05T細胞を各世代のT25フラスコに播種した。0.1の推定MOIまで感染を実施した。後の段階で滴定によって決定した実際のインプットウイルスを図9Aに示す。連続ウイルス世代について、完全な細胞変性効果を有するCR培養物を感染48時間〜72時間後に回収し、R05T培養物を72時間〜96時間に回収した。実施例1に記載されているように、超音波処理によって、溶解物からウイルスを放出させた。
図9Bは、それぞれ懸濁CR培養物、接着CR培養物又は接着R05T培養物から得られた各世代のインプットウイルスと放出された子孫ウイルスとの比によって、ウイルスの増幅を示す。実施例1に記載されている第1の実験から、懸濁液における増幅を計算するためのデータを得る。3回の実験の線形回帰直線は、ウイルス複製効率が世代数と共に増加することを示しているが、これは、3つの系の全てにおいてMVAのいくらかの適合を示唆している。MVAの同族ニワトリ宿主から最も離れた哺乳類R05T細胞において、この効果は最大であると思われる。
しかしながら、この研究の真に驚くべきかつ極めて強力な確証は、MVAは血清依存性培養物に適合されるが、これら2つの系のいずれにおいても、A34RにおけるG256T遺伝子型は出現も蓄積もしないという事実である。これは、最終的には、実施例3で確立したのと同じ方法によって図9のパネルCに示されている。
A3L遺伝子、A9L遺伝子及びA34R遺伝子の配列決定によって、図9Cに示されている観察結果を確認した。図10に示されているように、アヒル又はフルーツコウモリ由来の接着細胞株で継代したウイルスでは、新規MVA−CR遺伝子型が出現又は蓄積する兆候は全くない。
増幅速度の連続増加は、R05T由来のMVAで最大である。さらに、感染単位の決定において、本発明者らは、MVA−R株、例えば図11に示されているMVA−R18単離株が、並行して単離したMVA−B20と比較して強いシグナルと、多くの場合には複数の細胞が関与するフォーカスとを発生することを観察した(CR細胞ではMVAの複製がより速い結果、12週間の実験の終了時点では2世代先行している)。いくつかの細胞が関与するフォーカス及びより強い染色から、通常の非許容性Vero指標細胞株では複製が制限されるという結論が導かれる。ここで調べた全てのCR由来の株(MVA−B、MVA−X、MVA−Y及びMVA−CRプロパ)とは対照的に、MVA−R株は、哺乳類系ではほとんど弱毒化されていないと思われる。このようなウイルスは、株MVA−CR以外にも他の望ましい特性を有し得る:それは、感染部位における複製が制限されるのでより免疫原性であり得、それは、動物(特に、狂犬病ワクチン接種のために触れるのが困難な翼手類)におけるベクター化ワクチンの骨格として極めて適切であり得る。
要約すると、化学的に定義された懸濁培養液におけるMVAの複製は、MVA−CR出現の主な駆動力である。通常、寄生虫(ウイルス)及び宿主の相互作用は、選択的環境を形成する。しかしながら、ここでは、人工的な化学的に定義された培地、懸濁培養液又は両方の組み合わせ(これは、工業的なワクチン生産の要件を最も満たす)は明らかに、最初の野生型MVA遺伝子型のMVA−CRへのトランスフォーメーションの主な駆動力である。
実施例8:MVA−CRの特性:弱毒化
弱毒化は、親集団と比較したウイルス集団の複製能の喪失を表す。ワクシニアウイルスと比較して、MVAは、ほとんどの哺乳類細胞、特に霊長類(ヒトを含む)細胞における複製能を喪失している。この特性は、免疫不全ヒトレシピエントにおいてもMVAをワクチンベクターとして適用することを可能にする重要な特徴である。
弱毒化は、親集団と比較したウイルス集団の複製能の喪失を表す。ワクシニアウイルスと比較して、MVAは、ほとんどの哺乳類細胞、特に霊長類(ヒトを含む)細胞における複製能を喪失している。この特性は、免疫不全ヒトレシピエントにおいてもMVAをワクチンベクターとして適用することを可能にする重要な特徴である。
MVA−CRの弱毒化が維持されているかを試験するために、本発明者らは、MVA−A2、MVA−CR11及びMVA−CR19をCR細胞株、Vero細胞株及びR05T細胞株の接着単層に感染させた。6ウェルプレートの1ウェル当たりそれぞれ5×10^5個(CR)、2×10^5個(R05T)及び1×10^5個(R06E及びVero)で細胞を播種し、MVAを0.1のMOIまで追加した。プレートを凍結し、示されている時点でその解凍溶解物を超音波処理することによって、細胞溶解物を調製した。全てのサンプルを−85℃で保存し、実験終了時に、上記のようにVero細胞におけるマイクロフォーカスアッセイで一緒に滴定した。図12における複製データは、株MVA−CRが完全に弱毒化されてVeroでは複製せず、R06E(Egyptian rousette由来の細胞株でもある)では非常に遅く複製し、R05Tでは中程度に複製し、CR培養物では非常に高い産生力で複製することを裏付けている。MVA−A2については、類似の複製表現型を以前に確認した(Jordan et al. 2012 in Viruses 4, 889-900)。
Claims (40)
- A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列を含む改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスであって、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルス。
- 核酸配列がA9L遺伝子産物をさらにコードし、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1に記載のMVAウイルス。
- (i)MVAウイルスが、A3L遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含むか、又は
(ii)MVAウイルスが、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、請求項2に記載のMVAウイルス。 - MVAウイルスが、A3L遺伝子産物、A34R遺伝子産物及びA9L遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、請求項2に記載のMVAウイルス。
- (i)アミノ酸配列改変が、配列番号1のA3L遺伝子産物のアミノ酸位置634〜644又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、
(ii)アミノ酸配列改変が、配列番号2のA34R遺伝子産物のアミノ酸位置81〜91又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にあり、及び/又は
(iii)アミノ酸配列改変が、配列番号3のA9L遺伝子産物のアミノ酸位置70〜80又はそれに対応するアミノ酸位置に及ぶ領域内にある、請求項1〜4に記載のMVAウイルス。 - (i)アミノ酸配列改変が、A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(ii)アミノ酸配列改変が、A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iii)アミノ酸配列改変が、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、
(iv)アミノ酸配列改変が、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にあり、及び/又は
(v)アミノ酸配列改変が、A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置にある、請求項5に記載のMVAウイルス。 - アミノ酸配列改変がアミノ酸欠失又はアミノ酸置換であり、
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639若しくはそれに対応するアミノ酸位置のHが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638若しくはそれに対応するアミノ酸位置のRが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86若しくはそれに対応するアミノ酸位置のDが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、正のアミノ酸、好ましくはR、H若しくはK、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されており、並びに/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74若しくはそれに対応するアミノ酸位置のKが欠失しているか、又は疎水性アミノ酸、好ましくはA、V、I、L、M、F、Y若しくはW、負のアミノ酸、好ましくはD若しくはE、又は極性非荷電アミノ酸、好ましくはS、T、N若しくはQで置換されている、請求項5又は6に記載のMVAウイルス。 - アミノ酸置換が
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置638又はそれに対応するアミノ酸位置のRのYによるアミノ酸置換(R638Y A3L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(iv)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、及び/又は
(v)A9L遺伝子産物のアミノ酸位置74又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(K74E A9L遺伝子産物突然変異体)である、請求項7に記載のMVAウイルス。 - アミノ酸置換が
(i)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R遺伝子産物突然変異体)、
(ii)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、
(iii)A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)、又は
(iv)A3L遺伝子産物のアミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置のHのYによるアミノ酸置換、A34R遺伝子産物のアミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置のDのYによるアミノ酸置換、及びA9L遺伝子産物のアミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置のKのEによるアミノ酸置換(H639Y A3L/D86Y A34R/K75E A9L遺伝子産物突然変異体)である、請求項7又は8に記載のMVAウイルス。 - (i)H639Y突然変異を有するA3L遺伝子産物が配列番号4のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも95%同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置639又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Yを含むこと、
(ii)D86Y突然変異を有するA34R遺伝子産物が配列番号5のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも95%同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置86又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Yを含むこと、及び/又は
(ii)K75E突然変異を有するA9L遺伝子産物が配列番号6のアミノ酸配列を有するか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも95%同一のその変異体であって、前記変異体が、アミノ酸位置75又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸Eを含むこと、を特徴とする、請求項7〜9に記載のMVAウイルス。 - 異種核酸配列をさらに含む、請求項1〜10に記載のMVAウイルス。
- 異種核酸配列が、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される、請求項11に記載のMVAウイルス。
- 鳥類細胞内で生産的に複製可能な、請求項1〜12に記載のMVAウイルス。
- 霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞内では生産的に複製不可能な、請求項1〜13に記載のMVAウイルス。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルスのゲノム。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルス又は請求項15に記載のゲノムを含む、細胞。
- 非接着/懸濁細胞である、請求項16に記載の細胞。
- 鳥類細胞である、請求項16又は17に記載の細胞。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルスを培養するための方法であって、
(i)請求項16〜18に記載の細胞を提供する工程、
(ii)該細胞を培養する工程、及び
(iii)該MVAウイルスを単離する工程
を含む、方法。 - 細胞を細胞増殖培地中で培養し、続いてウイルス生産培地中で培養するか、又は細胞を細胞増殖培地中でのみ培養する、請求項19に記載の方法。
- 無細胞上清及び/又は細胞溶解物からMVAウイルスを単離する、請求項19又は20に記載の方法。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルスを生産するための方法であって、
(i)MVAウイルスを細胞に感染させる工程、
(ii)該細胞を培養する工程、
(iii)該MVAウイルスを単離する工程、及び
(iv)A3L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含むMVAウイルスが検出されるまで、工程(iii)で単離されたMVAウイルスを用いて工程(i)〜(iii)を繰り返す工程
を含む、方法。 - A9L遺伝子産物をさらにコードする核酸配列であって、前記遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む核酸配列を含むMVAウイルスが検出されるまで、工程(i)〜(iii)を繰り返す、請求項22に記載の方法。
- 細胞をウイルス生産培地中で培養する、請求項22又は23に記載の方法。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルス又は請求項15に記載のゲノムと、1つ以上の薬学的に許容しる賦形剤、希釈剤及び/又は担体とを含む、医薬組成物。
- 請求項1〜14に記載のMVAウイルス又は請求項15に記載のゲノムを含む、ワクチン。
- 医薬に使用するための、請求項1〜14に記載のMVAウイルス又は請求項15に記載のゲノム。
- ワクチン接種に使用するための、請求項27に記載のMVAウイルス又はゲノム。
- 核酸配列を含むMVAウイルスであって、A3L遺伝子及び/又はA9L遺伝子が機能欠失している、MVAウイルス。
- A34R遺伝子がさらに機能欠失している、請求項29に記載のMVAウイルス。
- 機能欠失遺伝子が異種核酸配列で置換されている、請求項29又は30に記載のMVAウイルス。
- 異種核酸配列が、抗原、特に抗原のエピトープ、診断用化合物又は治療用化合物をコードする配列から選択される、請求項31に記載のMVAウイルス。
- 好ましくはアミノ酸配列改変を含むA3L遺伝子産物、A9L遺伝子産物及び/又はA34R遺伝子産物を含む、請求項29〜32に記載のMVAウイルス。
- MVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む細胞であって、前記遺伝子を発現する、細胞。
- (i)MVAウイルスのA3L遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含み、
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、請求項34に記載の細胞。 - 請求項29〜33に記載のMVAウイルスをさらに含む、請求項34又は35に記載の細胞。
- 鳥類細胞である、請求項34〜36に記載の細胞。
- 異種核酸配列に作動可能に連結されたMVAウイルスのA3L遺伝子、A9L遺伝子及び/又はA34R遺伝子を含む、核酸分子。
- (i)MVAウイルスのA3L遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含み、
(ii)MVAウイルスのA9L遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含み、及び/又は
(iii)MVAウイルスのA34R遺伝子が、遺伝子産物のアミノ酸配列改変をもたらす少なくとも1つの突然変異を含む、請求項38に記載の核酸分子。 - リコンビナントMVAウイルスを生産するための方法であって、
(i)細胞を提供する工程、
(ii)請求項29〜33に記載のMVAウイルス及び請求項38又は39に記載の核酸分子を該細胞に導入する工程、及び
(iii)該MVAウイルスの核酸配列と該核酸分子との間の相同組換えを可能にする条件下で該細胞を培養し、それにより該リコンビナントMVAウイルスを得る工程
を含む、方法。
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