KR20130030298A - 불멸화 조류 세포주들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ECACC에서 수탁번호 제 09070701호, 제 09070702호, 및 제 09070703호 하로 기탁된 것들을 포함하는 불멸화 조류 세포들 (immortalized avian cells) 및 이들 세포들의 바이러스들의 생산을 위한 용도에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명에 따른 세포들은 동물들, 보다 상세하게는 인간들의 치료를 위한 치료적 및/또는 예방적 조성물들의 제조에 사용될 수 있는 재조합 바이러스성 벡터들의 생산에 유용하다.

Description

불멸화 조류 세포주들 {Immortalized avian cell lines}
본 발명은 불멸화 조류 세포들 (immortalized avian cells) 및 이들 세포들의 바이러스들의 생산을 위한 용도에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명에 따른 세포들은 동물들, 보다 상세하게는 인간들의 치료를 위한 치료적 및/또는 예방적 조성물들의 제조에 사용될 수 있는 재조합 바이러스성 벡터들의 생산에 유용하다.
진핵 세포주들은 바이러스성 백신들 및 생체기술 (biotechnology)의 많은 제품들의 제조를 위한 토대가 될 수 있다. 세포 배양에 생산되는 생물학적 제제들 (biologicals)로는 효소들, 호르몬들, 면역생물학적 산물들 (단일클론 항체들 , 인터루킨들 (interleukins), 림포카인들 (lymphokines)), 및 항암제들을 포함한다. 많은 더 단순한 단백질들이 박테리아 세포들을 사용하여 생산될 수 있지만, 당화된 (glycosylated) 더 복잡한 단백질들은 현재로서는 진핵세포들에서 제조되어야 한다.
조류 세포들 (avian cells)은 수년 간 바이러스 벡터들을 생산하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들어, 천연두 (Variola)의 치료를 위한 예방적 (prophylactic)조성물을 제조하는 데 사용되는 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus)는 닭 배아 섬유모세포 (CEF)에서 배양되었다. 조류 세포들은 약제학적 조성물에 사용되는 많은 바이러스들이 이들 세포 상에서 복제할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 보다 주목할만하게도, 다양한 바이러스들이 조류 세포들에서만 성장할 수 있다. 이것으로는 예를 들어 포유동물들 상에서는 성장할 수 없는 포유동물 바이러스 앙카라 (mammalian virus Ankara , MVA)를 들 수 있다. 이러한 폭스바이러스는 CEF에서 500회 이상 계대에 의해 백시니아 바이러스로부터 유래하여, 70년대 초반에 천연두에 대해 면역 결핍된 사람들을 백신접종하는 데 사용되었다. 현재, MVA는 유전자 요법의 목적을 위한 벡터로서 주로 사용되고 있다. 예를 들어, MVA는 MUC1 유전자를 위한 벡터로서 본 항원을 발현하는 종양에 대하여 환자들을 백신접종하는 데 사용되고 있다 (Scholl et al., 2003, J. Biomed. Biotechnol., 3, 194-201). HPV 항원들을 코딩하는 유전자를 운반하는 MVA도 역시 난소 암 (ovarian carcinoma)을 치료하기 위한 벡터로서 사용된다. 더욱 최근에는, MVA가 새로이 출현하는 질병 또는 웨스트 나일 바이러스 (west nile virus) 및 탄저균 (anthrax)과 같은 잠재적생물학적 무기에 대항하는 예방적 치료제 (prophylactic treatment)를 제조하기 위한 벡터로 선택되어 왔다.
이러한 관점에서, 바이러스 생산의 필요성이 절실해지고 있다. 현재, 가장 많이 사용되는 MVA 생산 방법은 CEF 상에서 바이러스를 복제하는 단계를 포함한다. 그러나 CEF의 사용은 다양한 문제점을 유발한다. 먼저, CEF의 제조 과정은 반드시 수작업으로 시행되어야 하는 많은 단계들을 포함한다.
또한, 본 바이러스 생산 방법은 교배번식의 오염의 경우에 전부 버려질 수 있는 달걀의 사용가능성 (availability)에 의존한다. 본 문제점은 조류 인플루엔자 (avian flu)의 전파로 점점 더 관련성이 커지고 있다.
추가적으로, 많은 CEFs는 역전사효소 활성 (RT)을 보유한다. RT는 레트로바이러스들이 복제하는 데 필요한 효소이다. 레트로바이러스는 많은 서로 다른 종들에서 발견된다. RT는 인간들 또는 동물들에서 감염성이 없고, 사람들에서 건강상 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되어 왔다. 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 기초로 하는 매우 민감한 분석법을 사용하여, RT 활성이 닭 배아 섬유모세포에서 생산되는 백신들에서 미량으로 검출되었다. 본 효소의 출처는 아마도 수백 또는 수천 년 전에 닭 세포에 삽입된 것으로 여겨지는, RT를 코딩하는 부분적인 바이러스 게놈이다. 본 RT를 생산하는 조류 레트로바이러스들은 인간들에게 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV, AIDS를 유발하는 바이러스)는 레트로바이러스인 반면, 백신들에서 검출되는 본 RT 활성은 반드시 HIV로부터 유래하지는 않는다. 또한, RT의 존재가 레트로바이러스의 존재를 입증하지는 못한다. 그럼에도 불구하고, 내인성 RT 활성이 없는 세포주는 흥미로울 수 있다.
CEF의 사용으로부터 바이러스 생산 방법을 개발하기 위하여, 바이러스의 복제와 생산을 허용하는 조류 세포주에 대한 필요성이 증가하고 있다. 불멸화 세포주들은 생산 장소에서 바로 각 회분 (batch)로 유지되거나 냉동될 수 있고, 언제나 새로운 생산 방법에 이용될 수 있다. 게다가 그들은 생산 공장 (production plant)에 구속되기 때문에, 외래 오염물질 (exogenous contaminant)에 의한 오염이 쉽지 않다. 그들의 사용은 본 생산 방법에 필요한 수동적 조작 (manual manipulation)의 극적인 감소를 허용한다. 이들 모든 특성들은 잠재적인 오염의 감소 뿐만 아니라 비용의 절감 및 생산 공정의 지속성을 유도한다.
마지막으로, 세포주들은 모든 특성이 분석될 수 있고 따라서 실험실 관행 및 여러 의료기관들의 요구사항들을 전적으로 따를 수 있다.
서로 다른 조류 세포주들이 이미 기재되어 왔다. 예를 들어, DF1 (미국 특허 제 US5,879,924호)은 10일 된 이스트 랜싱 계열 (East Lansing line) (ELL-0) 달걀들로부터 유래한 자발적으로 불멸화된 닭 세포주이다. 이 세포들은 바이러스 증식, 재조합 단백질 발현 및 재조합 바이러스 생산을 위한 기질로 유용하다. 그러나, 이 세포주는 멜리그리드 헤르페스바이러스 1 (Meleagrid herpesvirus 1) (터키의 헤르페스 바이러스), 조류 폭스 (fowlpox) 바이러스, 레오바이러스 (reovirus), 조류 육종 백혈병 바이러스 (avian sarcoma leukemia virus) 및 라루 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus)와 같은 다양한 바이러스들에 대해 취약하다.
또한 불멸하는 조류 세포들은 성장인자들 및 사료층으로부터 점진적인 단절에 의해 배아 줄기세포로부터 유래될 수 있고, 따라서 분화된 줄기세포에 특징적인 성장 특성들 및 무한한 수명을 유지시킨다. 본 방법에 의해 유래되는 유일하게 입수가능한 조류 세포주는 마우스 기원의 사료층과 접촉하였던 Ebx 닭 세포주 (국제특허출원 제 WO2005007840호)이고, 이는 마우스 바이러스 오염 및 내인성 레트로바이러스 서열들의 존재와 같은 추가적인 규제상의 의문점들을 불러일으킨다. 게다가 본 세포주들은 일정 조건들에서 불안정하고 분화-성향을 가지는 기술되어 왔다.
내인성 조류 레트로바이러스들이 없는 영구적인 (permanent) 오리 배아 세포주도 역시 확립되었다. 본 세포주는 DEC96 (Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 불가리아 과학 아카데미)라고 명명되고, 140회의 연속 계대를 통해 배양되었으며, 새들의 경우 종양을 유발하지 않는다. DEC 99 세포주는 연구에 사용되어 왔던 표준 세포 배양 시스템이고, 또한 생체기술의 필요성들을 위해 적용될 수 있다. 본 세포주는 세포 생물학 (cell biology), 바이러스학 (virology), 면역학 (immunology), 독성학 (toxicology)의 분야에서의 연구들 또한 진단제들 (diagnostics) 및 백신들의 생산에 적합한 모델이다. 영구적인 오리 배아 세포주 (CL) DEC 99는 배아-적응된 (embryo-adapted) 조류 폭스바이러스 (APV) 백신 균주들의 감염에 대한 취약성이 연구되어 왔다 (Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences). 닭과 비둘기 기원의 FK 및 데사우 (Dessau) 백신 균주들이 각각 사용되었다. 본 바이러스 균주들은 일차 오리 배아 세포 배양 (CCs)에서 연속적으로 계대되었다 (13회 계대들). 적응된 바이러스 균주들은 DEC99 세포주의 CCs에서 좀 더 계대되었고 (12회 계대들), 여기서 전형적인 세포 변성 (cytopathic) 효과 (CPE)가 관찰되었다. 감염성 비리온 (infectious virion)들의 생산이 11일 된 희색 레그혼 (White Leghorn) 배아들을 접종하여 조사되었고, 여기서 전형적인 폭스 증식이 융모요막 (CAMs) 상에서 형성되었다. DEC 99 세포에서 FK 균주가 데사우 균주와 대비하여 초기 CPE를 유발하고, 106,25 CCID50/ml의 역가에 도달하였다. DEC 99-적응된 바이러스 균주들은 2개월 된 닭의 백신접종 (vaccination) 이후에 전형적인 표피 “흔적 (takes)”을 유도하였다. 따라서, DEC 99는 표준 CC 시스템으로서, 닭 폭스에 대항하는 백신을 생산하는 데 적합한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고 본 특정한 세포주는 40회 계대 이후에 느리게 성장하고 현탁액에서는 성장할 수 없다.
인간 아데노바이러스 5의 초기 부위 (early region)로부터 나온 핵산 서열들은 일정 특이적 인간 세포들을 시험관내 (in vitro) 형질전환하는 데 이미 사용되어 왔다 (293 및 PER. C6 세포주들; Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene. Ther. 9: 1909-17 (1998); Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)).
일반적으로, 아데노바이러스 게놈은 30개 이상의 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하는 길이가 대략 36 kb가 되는 이중가닥의 선형 DNA 분자로 구성된다. 각 말단에는, ITR (inverted terminal repeat)라고 명명되고 혈청형 (serotype)에 의존하는 100 내지 150개 뉴클레오타이드들의 짧은 역배열 서열 (inverted sequence)이 존재한다. ITRs는 아데노바이러스 게놈의 복제에 관여한다. 대략 300개 뉴클레오타이드들로 된 캡시드 형성 (encapsidation) 부위는 게놈의 5' 말단에 5' ITR 바로 뒤에 위치한다.
초기 유전자들은 E1 내지 E4 (E는 초기를 의미함)로 명명되고 아데노바이러스 게놈 상에 분산된 4개 부위들에 분포한다. 초기 부위들은 자신들의 프로모터들을 소유하는 적어도 6개의 전사 단위들 (transcription units)을 포함한다. 본 초기 유전자들의 발현은 자가 조절되고, 일정 유전자들은 다른 유전자들에 앞서서 발현된다. 3개 부위들 E1, E2 및 E4는 각각 바이러스 복제에 필수적이다. 따라서, 아데노바이러스가 이들 기능들 중에 하나에 결함이 생길 경우, 즉 이들 부위 중 하나에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질을 생산할 수 없는 경우, 본 단백질은 외부에서 (in trans) 공급되어야 한다.
E1 초기 부위는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하고 2개의 바이러스 전사 단위들, E1A 및 E1B를 각각 포함한다. 본 부위는 바이러스 주기 (viral cycle)에 매우 초기에 관여하는 단백질들을 코딩하고 아데노바이러스의 나머지 거의 모든 단백질들의 발현에 필수적이다. 상세하게는, E1A 전사 단위가 나머지 바이러스 유전자들의 전사를 트랜스-활성화 (trans-activate)하는 단백질을 코딩하여, E1B, E1A, E2B 및 E4 부위들의 프로모터로부터의 전사를 유도한다.
길로트 등 (Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993))은 Ad5로부터 나온 E1A의 12S 단백질의 레트로바이러스 형질감염 (retroviral transduction)이 메추라기 세포의 불멸화 (immortalization)를 유도할 수 있는 점을 보여주었다. 그러나, 국제특허출원 제 WO2005042728호는 E1A 유전자가 레트로바이러스 감염 대신에 그대로의 DNA의 형질전환에 의해 도입될 때 조류 세포들을 불멸화하는 것이 불가능하다고 기재하였다. 또한, 국제특허출원 제 WO2005042728호에서는: "레트로바이러스 감염을 통한 극도로 효율적이고 안정한 형질감염 (transduction)은 정상적으로 망막모세포종 불활성화 시 유도되는 세포사멸을 차단하였던 자발적인 게놈 변화들을 가진 개별 세포들이 보유하기에 충분히 큰 세포 풀 (cell pool)을 만든다"고 진술하고 있다. (10페이지)".
길로트 등에 의해 획득된 세포들에서 레트로바이러스성 서열들의 존재는 생물학적 제품의 생산, 보다 상세하게는 치료적 화합물 (therapeutic compounds)을 위한 이러한 세포들의 용도를 방해한다.
본 발명자들은 놀랍게도 조류세포들, 보다 상세하게는 카이리나 모스카타 (cairina moschata) 세포들이 비-바이러스성 벡터로의 E1A 형질전환 (transfection)에 의해 효율적으로 불멸화될 수 있는 점을 발견하였다. CEF의 사용 및/또는 이전에 사용가능한 세포주들의 사용과 연관된 서로 다른 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 E1A 핵산 서열을 포함하는 비바이러스성 벡터로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 공정에 의해 획득되고, 또한 E1B 핵산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, E1A 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류세포를 제공한다.
본 발명은 E1B 핵산 서열로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하지 않는, E1A 핵산 서열을 포함하는 비바이러스성 벡터로 상기 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 조류세포를 불멸화하는 방법도 역시 언급하고 있다.
본 발명은 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070701호, 제 09070701호, 및 제 09070701호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주 및 그들의 유도체들을 포함한다. 불멸화 조류 세포들은 좀 더 나아가 결함성 바이러스의 증식을 허용하는 하나 이상의 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 불멸화 조류 세포들은 좀 더 나아가 관심있는 물질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 불멸화 조류 세포주들은 생, 약독화, 또는 재조합 바이러스들을 포함하는, 바이러스의 복제에 사용될 수 있다. 불멸화된 조류 세포주들을 사용하여 복제되는 바이러스는 (예로, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)와 같은 백시니아 바이러스와 같은) 폭스바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 거품형성 바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스, 플래비바이러스 및 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
본 발명의 기타 다른 특징들, 관점들, 및 장점들은 다음의 자세한 기술내용에서 설명된다.
본 발명자들은 놀랍게도 조류세포들, 보다 상세하게는 카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 세포들이 비-바이러스성 벡터로의 E1A 형질전환 (transfection)에 의해 효율적으로 불멸화될 수 있는 점을 발견하였다.
CEF의 사용 및/또는 이전에 사용가능한 세포주들의 사용과 연관된 서로 다른 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 E1A 핵산 서열을 포함하는 비바이러스성 벡터로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 공정에 의해 획득되고, 또한 E1B 핵산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, E1A 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류세포를 제공한다.
본 발명은 E1B 핵산 서열로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하지 않는, E1A 핵산 서열을 포함하는 비바이러스성 벡터로 상기 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 조류세포를 불멸화하는 방법도 역시 언급하고 있다.
본 발명은 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070701호, 제 09070701호, 및 제 09070701호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주 및 그들의 유도체들을 포함한다. 불멸화 조류 세포들은 좀 더 나아가 결함성 바이러스의 증식을 허용하는 하나 이상의 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 불멸화 조류 세포들은 좀 더 나아가 관심있는 물질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 불멸화 조류 세포주들은 생 (live), 약독화 (attenuated), 또는 재조합 (recombinant) 바이러스들을 포함하는, 바이러스의 복제에 사용될 수 있다. 불멸화된 조류 세포주들을 사용하여 복제되는 바이러스는 (예로, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (modified vaccinia virus Ankara, MVA)와 같은 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)와 같은) 폭스바이러스 (poxvirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 레트로바이러스 (reterovirus), 헤르페스바이러스 (herpesvirus), 알파바이러스 (alphavirus), 거품형성 바이러스 (foamy virus), 아데노바이러스-관련 바이러스 (adenovirus-related virus), 플래비바이러스 (flavivirus) 및 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 불멸화 세포는 35회 이상 계대들 동안 배양으로 성장할 수 있는 세포를 말한다.
용어 계대 수 (passage number)는 성장을 촉진하도록 세포를 충분히 낮은 밀도로 유지시키기 위하여, 세포 집단이 배양 용기로부터 제거되고 계대배양 (subculture) (계대 (passage)) 과정을 거쳤던 횟수를 말한다.
본 명세서 전체를 통해 사용되는 바, 용어 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 문맥상에서 명백하게 달리 진술되지 않는 경우라면 언급된 구성요소들 또는 단계들의 "적어도 하나 (at least one)", "적어도 첫 번째 (at least a first)", "하나 이상 (one or more)" 또는 "다수 (a plurality)"를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 용어 "세포 (a cell)"는 그의 혼합물을 포함하는, 다수의 세포들을 포함한다.
용어 "및/또는 (and/or)"는 본 명세서에서 사용될 때 "및", "또는" 또한 "모두 또는 상기 용어와 연결된 요소들의 기타 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "포함하는 (comprising)"은 산물들, 조성물들 및 방법들이 다른 것들을 배제하는 것은 아니지만 언급된 구성요소들 또는 단계들을 포함하는 것을 의미하도록 의도된다. "필수적으로 구성된 (consisting essentially)"은 산물들, 조성물들 및 방법들을 정의하는 데 사용될 때, 필수적으로 중요한 다른 구성요소들 또는 단계들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 재인용된 구성요소들로 필수적으로 구성된 조성물은 미량의 오염물질들 및 약제학적으로 허용가능한 담체들을 제외하려는 것은 아니다. "구성된 (consisting of)"은 다른 구성요소들 또는 단계들의 미량 요소들 이상을 배제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "E1A 핵산 서열 (E1A nucleic acid sequence)"은 2가지 주요 RNAs: 13S 및 12S를 코딩하는 핵산 서열을 포함하여, 아데노바이러스 E1A 부위의 모든 유전자 산물들을 코딩하는 핵산 서열을 말한다.
바람직하게는 용어 "E1A 핵산 서열"은 서열번호 1과 적어도 60%의 서열 일치도 (identity)를 가지는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, E1A는 서열번호 1과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 또한 보다 더 바람직하게는 적어도 90%의 핵산 서열 일치도를 가지는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 말한다. 더욱 바람직한 구현예에서, E1A는 서열번호 1에 표시된 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에서 사용하는 바, 용어 "E1B 핵산 서열"은 19kd 및 55kd의 3개 주요 폴리펩타이드들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 아데노바이러스 E1B 부위의 핵산 서열 모두를 말한다.
본 명세서에서 채택하는 바, "실질적으로 동일한 (substantially the same) 핵산 서열"은 기준 폴리뉴클레오타이드와 충분한 일치도를 가지고 있어서, 기준 뉴클레오타이드와 적당한 엄격도의 (moderately stringent) 혼성화 조건 하에서 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 한 가지 구현예로는, 서열번호 1에 표시된 기준 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자를 들 수 있다.
혼성화 (hybridization)은 핵산의 상보적인 가닥들 (예로, 센스 : 안티센스 가닥들 또는 프로브 : 표적-DNA)이 염색체 DNA에서 자연적으로 일어나는 결합들과 유사한 수소 결합들을 통해 서로 결합하는 것을 말한다. 표적 DNA와 주어진 프로브가 혼성화하는 데 사용되는 엄격도 수준들은 당업자라면 바로 다양하게 변화시킬 수 있다.
어구 표현 "엄격한 혼성화 (stringent hybridization)"는 폴리핵산 하이브리드들 (polynucelic acid hybrids)이 안정한 조건들을 말하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 당업자라면 숙지하고 있는 바와 같이, 하이브리드들의 안정도가 하이브리드들의 녹는점 (Tm)에서 반영된다. 일반적으로, 하이브리드의 안정도는 소듐 이온의 농도와 온도의 함수이다. 전형적으로, 혼성화 반응은 좀 더 낮은 엄격도의 조건들 하에서 수행되고, 변화되지만 좀 더 높은 엄격도의 세척 과정들이 이어진다. 혼성화 엄격도의 기준은 이러한 세척 조건들과 관련이 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 어구 표현 "적당한 엄격도의 혼성화"는 표적-DNA와 약 60%의 일치도, 바람직하게는 약 75% 일치도, 더욱 바람직하게는 약 85%의 일치도를 가지는; 표적-DNA와 약 90% 이상의 일치도가 특히 선호되는, 상보적인 핵산과 표적-DNA을 결합하도록 허용하는 조건들을 말한다. 바람직하게, 적당한 엄격도의 조건들은 42℃로 50% 포름아마이드, 5* 덴하르트 용액, 5* SSPE, 0.2% SDS에서의 혼성화, 이어지는 65℃로 0.2* SSPE, 0.2% SDS에서의 세척과 동등한 조건들이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 표현 "비바이러스성 벡터 (non-viral vector)"는 분명하게 플라스미드 기원의 벡터를 말하고, 임의적으로 상기 벡터의 형질전환 효율 및/또는 안정도 및/또는 숙주 생물의 면역 체계에 대한 상기 벡터의 생체내 (in vivo) 보호작용을 개선시키는 하나 이상의 물질들과 조합된 이러한 벡터를 말한다. 이들 물질들은 당업자들이라면 접근가능한 문헌에 광범위하게 기재되어 있다 (예로, Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654를 참조하라). 설명하자면 이에 제한되는 것은 아니지만, 이들은 중합체들, 지질들, 상세하게는 양이온성 지질들, 리포좀들, 핵 단백질들 또는 중성 지질들일 수 있다. 이들 물질들은 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 화합물들의 예들은 상세하게 국제특허출원 제 WO98/08489호, 제 WO98/17693호, 제 WO 98/34910호, 제 WO98/37916호, 제 WO98/53853호, 유럽 특허 제 EP 890362호 또는 국제특허출원 제 WO99/05183호에서 입수 가능하다. 예상할 수 있는 조합은 양이온성 지질들 (DOGS, DC-CHOL, 스퍼민-chol (spermine-chol), 스퍼미딘-chol (spermidine-chol) 등) 및 중성 지질들 (DOPE)과 조합된 플라스미드 재조합 벡터이다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 플라스미드들의 선택은 매우 광범위하다. 그들은 클로닝 및/또는 발현 벡터들일 수 있다. 일반적으로, 그들은 당업자라면 숙지하고 있고 많은 벡터들이 시판되고 있지만, 유전적 조작 기법들에 의해 이들을 제작하거나 변형하는 것도 역시 가능하다. 예들로서, pBR322 (집코 BRL), pUC (집코 BRL사), pBluescript (스트라타젠사), pREP4, pCEP4 (인비트로겐사) 또는 pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)로부터 유래한 플라스미드들이 언급될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 플라스미드는 세포 및/또는 숙주 세포를 생산하는 과정에서 복제의 개시를 유도하는 복제 원점 (replication origin)을 포함하는 것이 바람직하다 (예를 들어, ColE1 원점은 대장균에서 생산되도록 의도하는 플라스미드를 위해 선택될 수 있고, oriP/EBNA1 시스템은 포유동물 숙주세포에서 자가-복제하는 (self-replicating) 플라스미드가 요구되는 경우라면 선택될 수 있다. (Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). 이 플라스미드는 주어진 세포에서 유지 (maintenance) 및/또는 안정도를 개선시키는 부가적인 요소들 (플라스미드의 단량체 유지를 증진시키는 cer 서열)을 포함할 수 있다 (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, 세포 게놈 내로 통합을 위한 서열들).
용어 "비바이러스성 벡터 (non-viral vector)"는, 예를 들어 폭스바이러스 (백시니아 바이러스, 상세하게는 MVA, 카나리폭스 (canarypox) 등)로부터, 아데노바이러스로부터, 레트로바이러스로부터, 헤르페스바이러스로부터, 알파바이러스로부터, 거품형성 바이러스로부터 또는 아데노-관련 바이러스로부터, 플래비바이러스로부터, 또는 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 벡터와 같은 바이러스성 벡터들 (viral vectors)을 배제한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포로부터 유래하는 세포들에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "유래한 (derived)"은 본 발명에 따른 세포를 발생시키거나 이로부터 분화하거나 이를 조상 (ancestor)으로서 가지는 세포들을 말한다.
용어 계대 수 (passage number)는 성장을 좀 더 촉진하도록 세포를 충분히 낮은 밀도로 유지시키기 위하여, 세포 집단이 배양 용기로부터 제거되고 계대배양 (subculture) (계대 (passage)) 과정을 거쳤던 횟수를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "형질전환된 (transfected)"은 본 발명의 세포의 안정적 형질전환 (stable transfection) 또는 일시적 형질전환 (transient transfection)을 말한다.
용어 "안정적 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된 (stably transfected)"은 외래의 (foreign) 핵산 서열을 형질전환된 세포의 게놈 내로 도입 (introduction) 및 삽입 (integration)하는 것을 말한다. "안정한 형질전환체 (stable transfectant)"는 외래의 DNA를 게놈 DNA 내로 안정적으로 삽입한 세포를 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 조류 세포는 아나티대 과 (Anatidae family) 또는 파시아니대 과 (Pharsianidae family)의 세포로부터 유래한다. 상세하게는 아나티대 중에서, 카이리나 (Cairina) 또는 아나스 (Anas) 속 (genus)에 속하는 세포들이 바람직하다. 본 발명에 따른 세포들은 카이리나 모스카타 또는 아나스 플래티린코스 종에 속하는 것이 보다 더 바람직하다.
본 발명에 따른 세포는 배아적 (embryonic) 생물로부터 채취하는 것이 바람직하다. 살아있는 생물로부터 세포들을 분리하는 방법은 당업자라면 잘 숙지하고 있다. 예를 들어, 실시예 2에 기재된 방법들이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 일차 세포 (primary cell)는 아나티대 과에 속하는 10 내지 20일 사이, 더욱 바람직하게는 5 내지 15일 사이, 보다 더 바람직하게는 11 내지 14일 사이가 지난 배아로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, E1A 핵산 서열은 본 발명에 다른 세포의 표적 DNA 서열 내에 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 바, "표적 DNA 서열 (target DNA sequence)"은 벡터와의 상동적 재조합 (homologous recombination)에 의한 변형을 목표로 하는 세포의 게놈 내에 미리 정해진 부위이다. 표적 DNA 서열들은 구조 유전자들 (예로, 진핵세포의 경우 폴리펩타이드들을 인코딩하는 인트론들 및 엑손들을 포함하는 DNA 서열들), 인핸서 서열들, 프로모터들 등과 같은 조절 서열들, 또한 관심있는 게놈 (genome of interest) 내의 기타 부위들을 포함한다. 표적 DNA 서열은 또한 벡터에 의해 표적이 될 때, 숙주 게놈의 기능에 영향을 미치지 않는 서열일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "표적 DNA 서열 내에 삽입되는"은 불멸화하는 유전자 (immortalizing gene)의 삽입을 유도하는 상동적 재조합 과정이 표적된 DNA 서열 내에 결실 (deletion) 또는 파괴 (disruption)를 도입하는 것을 광범위하게 의미한다.
E1A 핵산 서열이 표적 DNA 서열 내에 삽입되는 불멸화 조류 세포를 생산하기 위하여, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 좀 더 나아가 상기 세포 게놈에게 고유한 (native) 표적 DNA 서열의 부위와 상동적 재조합을 할 수 있는 2개의 상동적인 서열들을 포함한다.
상기 상동성 서열의 존재는 상동적 재조합에 의해 표적 DNA 서열을 본 발명의 핵산 분자의 부위 특이적 (site specific) 삽입을 허용한다.
용어 "상동적 재조합 (homologous recombination)"은 필수적으로 일치하는 (essentially identical) 뉴클레오타이드 서열들의 부위에서 2개의 DNA 분자들간 DNA 단편들의 상호 교환을 말한다. 본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 표적 DNA 서열 내에 포함되는 서열 일부분들과 상동적인 서열들이 벡터 내에 존재한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전달 벡터 (transfer vector)의 상동적인 서열들은 표적 서열의 해당 부위와 100% 상동하다. 그러나, 더 낮은 상동성 (homology)도 사용될 수 있다. 따라서, 약 80% 정도의 낮은 서열 상동성도 사용될 수 있다.
전달 벡터에서 상동적인 서열들은 적어도 25개의 염기들을 포함한다. 더 긴 부위들로는 적어도 500개 염기들이 바람직하며 적어도 5000개 염기들이 더욱 바람직하다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 본 벡터에서 핵산 분자는 상동적인 서열에 의해 감싸인다.
본 명세서에서 사용되는 바, "감싸인 (surrounded)"은 상동적인 서열들의 하나가 본 발명의 핵산 분자의 상류 (upstream)에 위치하고 상동적인 서열들의 다른 하나는 본 발명의 핵산 분자의 하류 (downstream)에 위치하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "감싸인"은 2개의 상동한 서열들이 불멸화하는 유전자의 3' 또는 5' 말단에 직접적으로 연결되는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 불멸화하는 유전자 및 상동적인 서열들은 무제한적인 수의 뉴클레오타이드들에 의해 서로 분리되어 존재할 수 있다.
당업자라면 특이 DNA 서열 (specific DNA sequence)을 불멸화되는 세포의 게놈 내로 표적시키기 위해 적절히 상동적인 서열들을 선택할 수 있다. 예를 들어, 하나의 상동적인 서열은 표적되는 서열의 일부분과 상동하고, 나머지 상동적인 서열은 표적되는 서열의 상류 또는 하류에 위치하는 DNA 서열과 상동적일 수 있다. 또 다른 실시예에 따르면, 상동적인 서열들의 하나는 표적되는 DNA 서열의 상류에 위치하는 DNA 서열과 상동적이고, 나머지 상동적인 서열은 표적 DNA 서열의 하류에 위치하는 DNA 서열과 상동적일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상동적인 서열들 둘 다가 표적 DNA 서열 내에 위치하는 서열들과 상동적이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표적 DNA 서열은 HPRT (하이폭산틴 포스포리보실 전이효소) 유전자이다.
HPRT 프로모터 및 카이리나 모스카타의 HPRT 유전자를 포함하는 게놈 서열은 서열번호 2 에 표시된다. HPRT를 코딩하는 서열은 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 8695번 위치 (position)의 ATG 코돈에서 시작한다. 본 ATG 코돈의 상류 서열은 HPRT 프로모터 서열이다.
당업자라면 HPRT 유전자 내로 E1A 핵산 서열의 삽입에 필요한 상동적인 서열을 선택할 수 있다. 해당 과의 여러 구성원들 간과 같이, HPRT를 코딩하는 게놈 서열들은 매우 상동적이다. 당업자라면 모든 조류 세포들의 HPRT 유전자를 표적하는 데 필요한 상동적인 서열들도 역시 설계할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상동적인 서열들은 세포의 HPRT 프로모터의 하류에 E1A 핵산 서열을 삽입하도록 재단된다 (customized). 본 발명의 상세한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포의 내인성 HPRT 프로모터와 작동적으로 연결된다. "작동적으로 연결된 (operably linked)"은 본 E1A 핵산 서열이 세포에서 그의 발현을 허용하는 방식으로 프로모터와 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.
본 발명의 상세한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자의 상류에서 상동적인 서열은 바람직하게 적어도 500개 연속적 염기들 (contiguous bp)과 상동적인 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 또한 상기 상동적인 서열이 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열의 뉴클레오타이드 8695번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 26916번 위치에서 종결하는 핵산 서열과 상동적이지 않을 것을 조건으로 하여, 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 1번 위치로부터 시작하여 핵산 서열의 뉴클레오타이드 8694번 위치에서 종결하는 적어도 5000개의 연속적 염기들의 핵산 서열을 가지는 것은 더욱 바람직하다. 게다가, 본 상류의 상동적인 서열은 E1A 핵산 서열의 개시 코돈에 직접 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자의 상류에 상동적인 서열은 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 1번 위치에서 시작하여 핵산 서열의 8694번 위치에서 종결하는 핵산 서열로 구성된다. E1A 핵산 서열의 하류에 상동적인 서열은 상기 상동적인 서열이 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 10580번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 18009번 위치에서 종결하는 적어도 500개 연속적 염기들과 상동적인 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 적어도 5000개의 연속적 염기들의 핵산 서열을 가지는 것은 더욱 바람직하다. 또한, E1A 핵산 서열의 하류에 상기 상동적인 서열은 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 10580번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 18009번 위치에서 종결하는 핵산 서열로 구성되는 것은 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 조류 세포가 E1B 핵산 서열을 포함하지 않고, 상기 E1A 핵산 서열은 세포의 내인성 HPRT 프로모터와 작동적으로 연결되며, E1A 핵산 서열을 포함하는 비바이러스성 벡터로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 과정에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는, E1A 핵산 서열을 포함하는 조류 세포에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 첫 번째 선별 마커 (selective marker)를 포함하고, 본 첫 번째 선별 마커는 양성 (positive) 선별 마커이고, 또한 벡터 내에 포함되는 상동적인 서열들에 의해 감싸인다. 본 관점에서, 벡터와 세포 게놈 간에 일어나는 상동적인 재조합 과정은 E1A 핵산 서열 및 첫 번째 선별 마커의 삽입을 유도한다. 전달 벡터가 원형 (circular)일 때, "감싸인 (surrounded)"은 첫 번째 선별 마커 및 E1A 핵산 서열이 벡터의 동일한 영역 (section)에 위치하고, 상기 영역은 상동적인 서열들에 의해 구획되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 양성 선별 마커 (positive selection marker)는 명백하게 본 유전자를 가지는 세포들에서만 일정한 조건들 하에서 생존 및/또는 성장하게 하는 산물을 인코딩하는 유전자를 말한다. 전형적인 선별 마커들은 앰피실린 (ampicillin), 네오마이신 (neomycin), 메토트렉세이트 (methotrexate) 또는 테트라사이클린 (tetracyclin)과 같은 항생제 또는 다른 독성물질 (toxin)들에 대한 저항성, 보완적인 영양요구성 결함 (complement auxotrophic deficiency)들 또는 복합 배지로부터 입수가능하지 않은 공급 결정적인 영양분 (supply critical nutrient)들을 부여하는 단백질들을 인코드한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 첫 번째 선별 마커는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 인코딩한다.
첫 번째 선별 마커의 삽입은 E1A 핵산 서열을 삽입한 세포들의 선별을 하용한다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 상기 세포들이 첫 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항생제를 포함하는 배지에서이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따라, 상기 벡터에서 첫 번째 선별 마커는 그의 억제 (suppression)를 가능하게 하는 서열들로 감싸인다. 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 상기 서열들은 E1A 핵산 서열을 감싸지 않는다. 벡터가 원형일 때, 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들, 첫 번째 선별 마커 및 E1A 핵산 서열은 전달 벡터의 동일한 영역 (the same section)에 위치하고 상기 영역은 상동적인 서열들에 의해 한계가 정해진다.
핵산 단편의 억제를 가능하게 하는 서열들은 당업자라면 잘 숙지하고 있다 (Nunes-Duby, S. et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26: 391-406). 이들 서열들은 상기 서열들 간을 구성하는 핵산의 억제를 유발하는 하나 이상의 특이 효소 (specific enzyme)들에 의해 인지될 수 있다. 이들 효소들은 "재조합효소 (recombinase)"라고 불린다. 예를 들어, 핵산 단편의 억제를 가능하게 하는 3가지 잘 알려진 재조합효소는 FLP, ISCE1 및 Cre 재조합효소이다.
전형적인 부위-특이 재조합효소 (site-specific recombinase)는 Cre 재조합효소이다. Cre는 박테리오파지 P1의 cre (cyclization recombination) 유전자의 38 kDa 산물이고 Int 패밀리의 부위-특이 DNA 재조합효소이다 (Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212). Cre는 loxP 라고 불리는 P1 게놈 (P1의 X-오버의 유전자좌) 위에 34-bp 부위를 인지하고 loxP 부위들 쌍들 간 상호 보존적인 DNA 재조합 (reciprocal conservative DNA recombination)을 효율적으로 촉매한다. loxP 부위는 8-bp 비-반복 (nonpalindromic) 코아 부위가 끼어있는 2개의 13개 염기의 역배열 반복서열 (inverted repeat)들로 구성된다. 2개의 나란한 반복서열 (directly repeated) loxP 부위들 간 Cre-관여 재조합은 공유결합으로 닫힌 원형 (covalently closed circle)으로서 그들 간의 DNA 절단 (excision)을 초래한다. 역배열 방향에서 loxP 부위들 쌍들 간의 Cre-관여 재조합은 절단 보다는 중간이 낀 (intervening) DNA의 역전 (inversion)을 초래한다. DNA의 깨짐 (breaking)과 결합 (joining)이 제한적으로 일어나 코아 부위 내에 위치들을 구분시키고, 가닥 위에서 한 번에 일시적인 포스포타이로신 DNA-단백질 연결 (phosphotyrosine DNA-protein linkage)이 생겨서 진행된다.
또 다른 부위-특이 재조합효소는 I-Scel이다. 본 발명에 따른 제조방법에서 다른 인트론-호밍 엔도뉴클레아제 (intron-homing endonuclease), 예를 들어 I-Till, I-Ceul, I-Crel, I-Ppol 및 PI-PspI도 또한 I-Scel을 대체할 수 있다. 벨포트 및 로버트에 의해 많은 것들이 리스트로 만들어져 있다 (Belfort and Roberts (1997) Nucleic Acid Research 25: 3379-3388). 많은 이들 엔도뉴클레아제들이 코돈 사용도 (codon usage)가 표준 핵내 코돈 사용과 구별되는 세포소기관 게놈 (organelle genome)들로부터 나온다. 이러한 유전자들을 이들 엔도뉴클레아제들의 핵 발현 (nuclear expression)에 사용되기 위해서, 핵 유전자들의 코돈 사용을 맞추려고 코딩 서열을 변화시키는 것이 필요할 수 있다. I-Scel은 그의 인지 부위 내에 DNA를 절단하는 이중가닥 (double-stranded) 엔도뉴클레아제이다. I-Scel은 3'OH 끝자락 (overhangs)들을 가지는 4bp 교차된 절단 (staggered cut)을 생성한다.
I-Scel 효소는 알려진 인식 부위 (recognition site)를 가진다. I-Scel의 인식 부위는 18개 염기 이상 연장되는 비-대칭적인 (non-symmetrical) 서열이다.
5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'
3'-ATCCCTATTGTCCCATTA-3'
또 다른 부위-특이 재조합효소는 FLP 재조합효소이다. Flp 재조합은 이들 인식 서열의 제한된 중복성 (degeneracy)만을 견뎌내는 구분되는 34개 염기의 최소한 부위를 인지한다 (Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). Flp 재조합효소 및 FRT 서열 간의 상호작용이 연구되어 왔다 (Panigrahi et al., 1992). 다양한 FRT 서열들의 예들이 자야람 [Jayaram (1985)] 및 세네코프 등 [Senecoff et al. (1988)]에 의해 기재되었고, 서로 다른 기질들 상에서 Flp-매개 재조합이 스네이스 등 [Snaith et al. (1996)]에 의해 기술되어 있다.
따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 상기 일차 세포의 게놈으로부터 첫 번째 선별 마커를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 첫 번째 선별 마커를 억제하기 위해서, 세포는 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들에 특이한 재조합효소를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된다. 상기 유전자를 세포 내로 전달할 수 있는 방법들 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 출원의 실시예 4에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 이전에 기술된 벡터들도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제조방법에 사용되는 벡터는 상기 상동적인 서열들로 감싸이지 않은 두 번째 선별 마커를 포함하고 상기 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커이다. 상기 두 번째 선별 마커는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 벡터가 원형일 때 특히 유용하다. 상기 두 번째 선별 마커의 존재가 상동적인 재조합 과정이 E1A 핵산 서열을 포함하지 않는 전달 벡터의 영역을 도입 유도하는 세포들의 파괴를 허용한다. 본 벡터가 원형일 때, 두 번째 선별 마커가 상기 상동적인 서열에 의해 감싸이지 않는 점은 두 번째 선별 마커와 E1A 핵산 서열이 이 전달 벡터의 동일한 영역에 위치하지 않고 상기 영역은 상동적인 서열들에 의해 구획되는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 세포들이 두 번째 선별 마커를 삽입하지 않은 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계를 포함한다. 상기 단계는 상기 일차 세포가 첫 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계와 동시에 또는 별도로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 벡터는 세 번째 선별 마커를 포함하고, 상기 세 번째 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커이며, 상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제를 허용하는 서열들 사이에 위치한다. 이것은 첫 번째 선별 마커를 억제하는 단계도 역시 세 번째 선별 마커의 억제를 유도할 수 있는 점을 의미한다. 세 번째 선별 마커의 존재는 첫 번째 선별 마커가 존재하는 세포들이 파괴되게 한다. 본 벡터가 원형일 때, 세 번째 선별 마커가 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들 사이에 위치하는 점은 세 번째 선별 마커와 첫 번째 선별 마커가 전달 벡터의 동일한 영역에 위치하고 상기 영역은 첫 번째 선별 마커의 억제를 허용하는 서열들에 의해 구획되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 음성 선별 마커는 명백히 일정한 조건들 하에서 유전자를 보유하는 세포를 죽이는 산물을 인코딩하는 유전자를 말한다. 이들 유전자들은 명확하게 "자살 유전자 (suicide gene)"를 포함한다. 이들 유전자에 의해 인코드되는 산물들은 세포 독성 (cytotoxic) 화합물에서 프로드럭 (prodrug)을 변환시킬 수 있다. 다수의 자살 유전자/프로드럭 쌍들은 현재 사용 가능하다. 보다 상세하게 이들은 쌍들로는
- 헤르페스 심플렉스 바이러스 제 1형 티미딘 키나제 (HSV-1 TK) 및 어사이클로비르 (acyclovir) 또는 갱시클로비르 (ganciclovir; CGV)(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-2028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361);
- 사이토크롬 (cytochrome) p450 및 사이클로포스포아미드 (cyclophosphoamide)(Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
- 대장균 (E. coli)으로부터 나온 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 (purine nucleoside phosphorylase) 및 메틸퓨린 데옥시리보뉴클레오사이드 (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238)
- 대장균으로 나온 구아닌 포스포리보실 전이효소 (guanine phosphoribosyl transferase) 및 6-티오산틴 (6-thioxanthine)(Mzoz and Moolten, 1993, Huamn Gene Therapy 4, 589-595) 및
- 사이토신 디아미나제 (CDase) 및 5-플루오로사이토신 (5FC).
- FCU1 및 5-플루오로-사이토신 (5FC)(WO9954481).
- FCU1-8 및 5-플루오로-사이토신 (5FC) (WO2005007857):
가 언급될 수 있다.
상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제가 일어나는 세포들에서 선별을 허용한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 좀 더 나아가 상기 세포가 세 번째 선별 마커를 포함하는 세포의 성장을 허용하지 않는 배지에서 배양되는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세 번째 선별 마커로서 FCU1를 포함하는 세포의 성장을 허용하지 않는 배지는 5-플루오로사이토신을 포함한다.
첫 번째, 두 번째 및 세 번째 선별 마커는 별도로 분리되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 두 번째 마커를 제외한 첫 번째 및 세 번째 선별 마커로 또는 첫 번째 마커를 제외한 두 번째 및 세 번째 선별 마커를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, E1A 핵산 서열, 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 선별 마커는 불멸화되는 세포에서 그들의 발현에 필요한 요소들의 조절 하에 배열될 수 있다.
발현에 필요한 요소들은 뉴클레오타이드 서열이 RNA로의 전사 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독을 가능하게 하는 요소들의 세트, 상세하게는 상기 세포에서 효과적인 프로모터 서열들 및/또는 조절 서열들 또한 선택 사항으로 표적 세포들의 표면에 상기 폴리펩타이드의 분비 (excretion) 또는 발현하는 데 필요한 서열들을 포함한다. 이들 요소들은 조절가능 (regulatable)하거나 전신 발현 (constitutive)될 수 있다. 본 프로모터는 선택되는 벡터 및 숙주 세포에 당연하게 적응된다. 예로서, PGK (포스포 글리세레이트 키나제), MT (메탈로티오네인; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 안티트립신, CFTR 유전자들의 진핵세포 프로모터들, 근육 크레아틴 키나제, 액틴 호흡기 표면활성제 (pulmonary surfactant), 면역글로불린 또는 β-액틴 (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472)을 인코딩하는 유전자의 프로모터들, SV40 바이러스 (simian virus) 초기 프로모터, RSV (라우 육종 바이러스) LTR, MPSV 프로모터, TK-HSV-1 프로모터, CMV 바이러스 (cytomegalovirus) 초기 프로모터가 언급될 수 있다. 상세하게는, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 프로모터가 가장 바람직하다.
보다 상세하게, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니지만,
- 상동적인 서열들로 감싸인 E1A 핵산 서열;
- 양성 선별 마커이고, 상기 상동적인 서열들에 의해 감싸인 첫 번째 선별 마커;
- 첫 번째 선별 마커의 억제 (suppression)를 허용하는 서열들;
- 음성 선별 마커이고, 상기 상동적인 서열들에 의해 감싸이지 않은 두 번째 선별 마커; 또한
- 음성 선별 마커이고, 첫 번째 선별 마커의 억제를 허용하는 서열들 사이에 위치하는 세 번째 선별 마커:
를 포함하는 벡터를 조류세포 내로 전달하고;
상기 세포들을 첫 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장만을 허용하는 배지에서 배양하고;
상기 세포들을 두 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장을 허용하지 않는 배지에서 배양하고;
상기 세포의 게놈으로부터 첫 번째 선별 마커를 배제시키고; 또한
상기 세포를 세 번째 선별 마커를 포함하는 세포들의 성장을 허용하지 않는 배지에서 배양하는:
단계들을 포함하는, 세포를 불멸화하는 방법에 관한 것이다.
특정한 구현예에 따르면, 본 발명은 또한
유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070701호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주,
유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070702호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주,
유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070703호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주, 및
그들의 유도체들:
로 이루어진 그룹에서 선택되는, 서열번호 1에서 표시된 바와 같은 E1A 핵산 서열 및 서열번호 3에서 표시된 바와 같은 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 불멸화 조류 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 유도체들은, 예를 들어
- 상기 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 (ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 또는 ECACC 제 09070703호)의 서브클로닝;
- 상기 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 (ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 또는 ECACC 제 09070703호)의 특이적 배양 배지 (예로, 현탁액에서 세포주의 성장을 허용하는 배지) 및/또는 특이적 배양 조건들 (예로, 온도, %CO2)에 대한 적응;
- 비-퓨코스화된 단백질들, 보다 상세하게는 비-퓨코실화된 항체들을 생산하기 위하여 퓨코스 당 변형에 관여하는 카이리나 모스카타의 하나 이상의 유전자들의 결실 또는 돌연변이 (Harue Imai-Nishiya et al., BMC Biotechnology, 2007). 바람직한 구현예에 따르면, 상기 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 유도체들은 α1,6-퓨코실전이효소 (FUT8) 및/또는 GDP-만노스 4,6-탈수효소 (GMD) 유전자들의 결실 또는 돌연변이에 의해 획득된다;
- 세포주의 면역반응을 감소시키기 위하여 인터페론 저항성에 관여하는 카이리나 모스카타의 하나 이상의 유전자들의 결실 또는 돌연변이. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 유도체들은 STAT1 유전자, STAT2 유전자, STAT3 유전자 및 STAT5 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자(들)의 결실 또는 돌연변이에 의해 획득된다;
- 세포주를 배양 조건들에 대해 더욱 저항성으로 만들기 위하여, 상세하게는 충만도 (confluence)를 유지하기 위해 카이리나 모스카타의 하나 이상의 항-세포사멸 유전자(들)의 과다발현, 또는 하나 이상의 외인성 항-세포사멸 유전자(들)로의 형질전환. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-세포사멸 유전자(들)은 p91E1B 인간 아데노바이러스 유전자, bcl-2 유전자, mcl-1 유전자, Bcl-xL 유전자, Bcl-w 유전자, a1 유전자, ICP34.5 헤르페스 심플렉스 바이러스 유전자, 및 p35 배큘로바이러스 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된다;
- 증식율을 증가시키는 데 적합한 벡터들을 사용한 세포 주기를 조절하는 것에 관여하는 하나 이상의 카이리나 모스카타의 유전자들의 과다발현. 바람직한 구현예에 따르면, 세포 주기를 조절하는 것에 관여하는 상기 유전자(들)은 p53 유전자, p21 유전자, p27 유전자, 및 p57 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된다;
- 관심 있는 바이러스들에 대한 수용체들을 인코드하는 하나 이상의 유전자들로의 형질전환에 의해, 이들 바이러스들을 증식시키는 측면에서 세포주의 바이러스 민감도 스펙트럼을 변형하는 것. 바람직한 구현예에 따르면, 관심 있는 바이러스들에 대한 수용체들을 인코드하는 상기 유전자(들)은 홍역 바이러스 CD46 수용체를 인코드하는 유전자(들)이다:
에 의해 기탁된 세포들로부터 유래한 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주를 말한다.
본 발명에 따른 세포는 좀 더 나아가 결함성 바이러스의 증식을 허용하는 하나 이상의 핵산 서열(들)을 포함할 수 있다. "결함성 바이러스 (defective virus)"는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자가 결실되거나 비기능적이 된 (nonfunctional) 바이러스를 말한다. 용어 "결함성 바이러스의 증식을 허용하는 핵산 서열"은 결함성 바이러스의 복제를 허용하는 기능(들)을 외부에서 (in trans) 공급하는 핵산 서열을 말한다. 다시 말하자면, 상기 핵산 서열(들)은 상기 결함성 바이러스의 복제 및 캡시드 형성에 필요한 단백질(들)을 코딩한다.
본 발명에 따른 세포는 관심있는 물질을 코딩하는 핵산 서열로을 역시 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 바, 관심 있는 물질은 이에 제한되는 것은 아니지만 약제학적으로 활성을 가진, 예를 들어 성장인자들, 성장 조절인자들, 항체들, 항원들, 면역접종 또는 백신접종에 유용한 그들의 유도체들 등, 인터루킨들, 인슐린, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF 또는 그들의 조합들, 예를 들어 인터페론- α, 인터페론-β, 인터페론-γ과 같은 인터페론들, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX 또는 tPA와 같은 혈액 응고인자들 또는 그들의 조합들을 포함할 수 있다. "관심 있는 물질 (substance of interest)"은 또한 산업적인 효소들, 예를 들어 펄프 또는 종이에 관한 용도, 텍스타일 변형 또는 에탄올 생산을 위한 효소들도 말한다. 마지막으로, "관심 있는 물질"은 동물 사료를 위한 단백질 보충물 (supplement) 또는 부가가치가 있는 산물을 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 세포는 재조합 텔로머라제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase), 더욱 바람직하게는 EP 06 36 0047.2.에 기재된 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열도 역시 포함한다. EP 06 36 0047.2.에 기재된 본 발명의 바람직한 구현예에서, 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 유럽 특허 제 EP 06 36 0047.2.호의 서열번호 2에 표시된 핵산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 또한 가장 바람직하게는 적어도 95%의 핵산 서열 일치도를 가진다. 유럽 특허 제 EP 06 36 0047.2.호에 기재된 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 바람직한 핵산 서열은 유럽 특허 제 EP 06 36 0047.2.호의 서열번호 2에 표시된 바와 같다. 유럽 특허 제 EP 06 36 0047.2.호에 기재된 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열의 서열번호 2는 본 발명에서의 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열의 서열번호 3과 일치한다. 결론적으로, 본 발명의 바람직한 구현에에 따르면 본 발명에 따른 세포도 역시 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열, 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 핵산 서열 일치도를 가지는 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3에 표시된 바와 같다 (dTERT).
본 발명에 따른 제조방법에 의해 획득된 세포들, 본 발명의 세포 및 그들로부터 유래한 세포들은 바이러스의 복제에 명백하게 유용하다. 상기 바이러스들은 생바이러스 (live)이거나, 약하게 지속되거나 (attanuated) 또는 재조합 (recombinant)일 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 세포들은 상세하게는 폭스바이러스 (백시니아 바이러스, 상세하게는 MVA, 카나리폭스 바이러스 등), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 거품형성 바이러스 또는 아데노바이러스-관련 바이러스, 플래비바이러스 또는 인플루엔자 바이러스의 복제에 유용하다.
레트로바이러스들은 분열하는 세포들을 감염시키고 대부분의 경우들에서 이에 통합되는 특성을 가지며, 상세하게는 본 관점에서 암과 관련되어 사용하는 것이 적절하다. 일반적으로, 재조합 레트로바이러스는 LTR 서열들, 캡시드 형성 부위 (encapsidation region) 또한 레트로바이러스 LTR 또는 하기에 기술되는 것들과 같은 내부 프로모터의 조절 하에 위치하는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 레트로바이러스성 벡터는 상세하게 LTRs (프로모터 부위가 진핵세포 프로모터로 대체됨) 또는 캡시드 형성 부위 (이종유래 (heterologous) 캡시드 형성 부위로 대체됨, 예를 들어 VL30 유형)에서의 변형들을 포함한다 (프랑스 특허출원 제 FR-94 08300호 및 제 FR-97 05203호를 참조하라).
아데노바이러스성 벡터는 복제에 필수적이고 또한 E1, E2, E4 및 L1 L5 부위들로부터 선택되는 적어도 하나의 부위가 전부 또는 일부 결여될 수 있다. E1 부위의 결실이 바람직하다. 그러나 상세하게, E2, E4 및/또는 L1 L5 부위들의 전부 또는 일부에 영향을 주는 다른 변형(들)/결실(들)과 조합될 수 있다. 설명하자면, E1 부위 및 E4 전사 단위 (unit)의 주요 부분의 결실은 매우 특별하게 유익하다. 클로닝 능력들을 증가시키려는 목적으로, 아데노바이러스성 벡터는 추가적ㅇ으로 비-필수적인 E3 부위의 전부 또는 일부이 결여될 수 있다. 또 다른 대안에 따르면, 캡시드 형성에 필수적인 서열들, 즉 5' 및 3' ITRs (inverted terminal repeat) 및 캡시드 형성 부위를 보유하는 최소의 아데노바이러스성 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 다양한 아데노바이러스 벡터들 및 이들의 제조 기법들은 알려져 있다 (예를 들어, Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc를 참조하라).
폭스바이러스 과 (poxvirus family)는 코르도폭스 바이러스 (chordopoxvirus) 및 엔토모폭스바이러스 (entomopoxvirus) 아과 (subfamily)의 바이러스들이다. 이들 중에서, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 오르토폭스 바이러스 (orthopoxvirus)들, 파라폭스 바이러스 (parapoxvirus)들, 조류폭스 바이러스 (avipoxvirus)들, 카프리폭스 바이러스 (capripoxvirus)들, 레포리폭스 바이러스 (leporipoxvirus)들, 수이폭스 바이러스 (suipoxvirus)들, 몰루스키폭스 바이러스 (molluscipoxvirus)들, 야타폭스 바이러스 (yatapoxvirus)들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스이다. 오르토폭스바이러스는 바람직하게 백시니아 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 상세하게 MVA 575 (ECACC 제 V00120707호) 및 MVA-BN (ECACC 제 V00083008호)이다.
용어 "재조합 바이러스 (recombinant virus)"는 게놈 내에 삽입된 외인성 서열 (exogenous sequence)을 포함하는 바이러스를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 외인성 서열은 자연적으로 부모 바이러스에 존재하지 않는 핵산을 말한다.
한 가지 구현예에서, 외인성 서열은 직접적 또는 간접적으로 세포독성 기능을 가지는 분자를 인코드한다. "직접적 또는 간접적으로 (directly or indirectly)" 세포독성에 의해, 외인성 서열에 의해 인코딩되는 분자는 스스로 독성을 가질 수 있거나 (예를 들어, 라이신 (ricin), 종양괴사인자, 인터루킨-2, 인터페론-감마, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 슈도모나스 엑소톡신 A), 대사되어 독성 산물을 형성할 수 있거나, 기타 다른 것에 작용하여 독성 산물을 형성할 수 있다. 라이신 cDNA의 서열은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 램 등에 기재되어 있다 (Lamb et al., Eur J. Biochem., 1985, 148, 265-270).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 외인성 서열은 자살 유전자 (suicide gene)이다. 자살 유전자는 비교적 비-독성인 프로드러그 (prodrug)을 독성 약물로 전환시킬 수 있는 단백질을 인코드한다. 예를 들어, 효소 사이토신 탈아민효소 (cytosine deaminase)는 5-플루오로사이토신 (5FC)를 5-플루오로우라실 (5FU)로 전환시킨다 (Mullen et al. (1922) PNAS 89, 33); 헤르페스 심플렉스 효소 티미딘 키나제는 세포들을 항바이러스제인 갱시클로비르 (GCV) 또는 아시클로비르로의 처리에 대해 민감하게 한다 (Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al. (1991) New Biol. 3, 608). 생물이라면 모두, 예를 들어 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)의 사이토신 탈아민효소가 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 유전자는 사이토신 탈아민효소 활성을 가지는 단백질, 보다 더 바람직하게는 국제특허출원 제 WO2005007857호 및 제 WO9954481호에 기재된 바와 같은 단백질을 인코드한다.
좀 더 다른 구현예에서, 외인성 유전자는 표적된 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임 (ribozyme)을 인코드한다. 절단될 표적된 RNA 또는 DNA는 세포의 기능에 필수적인 RNA 또는 DNA일 수 있어 그들의 절단이 세포사 (cell death)를 유발하거나, 절단될 RNA 또는 DNA가 원치 않는 단백질, 예를 들어 종양원성 유전자 (oncogene) 산물을 인코드하는 RNA 또는 DNA가 될 수 있어 본 RNA 또는 DNA의 절단이 세포가 암화 (cancerous)되는 것을 예방할 수 있다.
보다 좀 더 나아간 구현예에서, 외인성 유전자는 안티센스 RNA를 인코드한다.
"안티센스 RNA (antisense RNA)"에 의하여, 우리는 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자와 혼성화하고 mRNA로부터의 발현과 간섭하거나, 프리-mRNA 또는 tRNA 또는 rRNA와 같이 세포 내에서 또 다른 RNA 분자와 혼성화하거나, 유전자와 혼성화하거나 유전자로부터의 발현과 간섭하는 RNA 분자를 의미한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 외인성 서열은 표적 세포에서 결함성 유전자의 기능을 대체한다. 인간들을 포함하여 포유동물들의, 결함성 유전자들로부터 초래되는 수천 가지의 유전되는 유전적 질환들이 존재한다. 이러한 유전적 질환들의 예들로는 CFTR 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 낭포성 섬유종 (cystic fibrosis); 디스트로핀 (dystrophin)유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 듀첸 근육 위축증 (Duchenne muscular dystrophy); HbA 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 빈혈 (sickle cell disease)을 포함한다. 많은 유형들의 암은 결함성 유전자들, 특히 원시종양원성 유전자들 (protooncogene) 및 돌연변이를 겪은 종양-억제 유전자들 (tumor-suppressor gene)에 의해 유발된다.
원시종양원성 유전자들의 예들로는 ras, src, bcl 등을 들 수 있고; 종양-억제 유전자들로는 p53 및 Rb를 들 수 있다.
본 발명의 좀 더 나아간 구현예에서, 외인성 서열은 종양 관련 항원 (tumor associated antigen, TAA)을 인코드한다. TAA는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포들에서보다 더 높은 빈도 또는 밀도로 검출되는 분자를 말한다. TAA의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, 점 돌연변이된 ras 종양원성 유전자, 정상 또는 점 돌연변이된 p53, 과다발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나제 (tyrosinase), TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 서바이빈 (survivin) 및 LRP를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에 따르면, TAA는 MUC1 이다.
재조합 바이러스는 하나 이상의 외인성 서열을 포함할 수 있고, 각 외인성 서열은 하나 이상의 분자를 인코드할 수 있다. 예를 들어, 이것은 동일한 재조합 폭스바이러스에서 TAA를 코딩하는 외인성 서열을 사이토카인을 코딩하는 외인성 서열과 연결하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 외인성 유전자는 항원을 인코드한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드를 말하고; 항원은 스스로 면역원성일 필요는 없다.
바람직하게, 항원은 예를 들어 HIV-1, (gp 120 또는 gp160과 같음), gD 또는 그의 유도체들와 같은 고양이 면역결핍 바이러스라면 모두, gD 또는 그의 유도체와 같은 인간 또는 동물 헤르페스 바이러스 또는 HSV1 또는 HSV2로부터 나온 ICP27과 같은 초기 단백질 (immediate early protein), 사이토메갈로바이러스 (gB 또는 그의 유도체들과 같음), 배리셀라 조스터 바이러스 (Varicella zoster virus)(gpI, II 또는 III와 같음)와 같은 바이러스로부터, 또는 B형 간염 표면 항원 또는 그의 유도체와 같은 B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 (바람직하게는 균주 JA와 같은 유전형 1b 균주로부터 나온 비-구조 단백질) 및 간염 E형 바이러스와 같은 간염 바이러스로부터, 또는 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytium virus), 인간 파필로마 바이러스 (선호하기로는 HPV16 균주로부터 나온 E6 및 E7 단백질) 또는 인플루엔자 바이러스와 같은 다른 바이러스 병원균들로부터 유래하거나, 또는 살모넬라 (Salmonella), 나이세리아 (Neisseria), 보렐리아 (Borellia) (예를 들어 OspA 또는 OSPG 또는 그들의 유도체들) 또는 클라미디아 (Chlamydia)와 같은 박테리아 병원균들, 또는 보르드텔라 (Bordetella) (예를 들어 P.69, PT 및 FHA)로부터 유래하거나, 플라스모듐 (Plasmodium) 또는 톡소플라스마 (Toxoplasma)와 같은 기생충들로부터 유래한다.
본 발명은 좀 더 나아가 상기 기탁된 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 (ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 및 ECACC 제 09070703호)이라면 모두 및 그들의 유도체라면 모두의 바이러스들 및 단백질들을 포함하는 생물제제들을 생산하는 용도 및 관련 방법들에 관한 것이다.
한 가지 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 불멸화 조류 세포주를 생산될 바이러스로 감염시키고; 상기 감염된 세포주를 바이러스 증폭을 가능하게 하는 조건들 하에서 배양하고; 또한 생산된 바이러스들을 회수하는 단계들을 포함하고; 상기 불멸화 조류 세포주는 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070701호 하로 기탁된 불멸화 조류 세포주, ECACC에서 수탁번호 제 09070702호 하로 기탁된 불멸화 조류 세포주, 및 ECACC에서 수탁번호 제 09070702호 하로 기탁된 불멸화 조류 세포주 또한 그들의 유도체들로 이루어진 그룹에서 선택되는, 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 회수된 바이러스들의 정제와 같은 추가적인 단계(들)도 역시 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 생산되는 바이러스는 폭스비리대 (Poxviridae) 또는 인플루엔자 바이러스이다. 상기 폭스비리대는 바람직하게 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 (VV-COP) 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 오르토폭스바이러스이다. 상기 인플루엔자 바이러스는 바람직하게 A형 또는 B형이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 불멸화된 세포주는 30℃ 및 37℃ 사이에 포함되는 온도, 바람직하게는 37℃에서 감염시킨다. 감염은 증폭 단계 동안 연속하여 사용되는 배양 배지와 동일하거나 다를 수 있는 적당한 세포 배양 배지에서 수행된다. 적합한 배양 배지는 임의적으로 예로, 혈청 (예로, 우태아 혈청 (FCS)) 및/또는 아미노산(들) (예로, L-글루타민)으로 보충될 수 있는 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM, 인비트로겐사) 또는 기본 이글 배지를 포함한다. 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 배지일 수 있다. 동물 산물이 없는 많은 배지들이 이미 기술되어 왔으며, 예를 들어 293 SFM II; SFM 적응된 293-F 세포; SFM 적응된 293-H 세포; 293펙틴TM 형질전환 시약; CD 293 AGTTM; CD 293 배지; 프리스타일TM 293 발현 시스템; 프리스타일TM 293 배지; SFM 적응된 프리스타일TM 293-F 세포; VP-SFM; VP-SFM AGTTM;아데노바이러스 발현 배지 (AEM) PER.C6
Figure pct00001
세포를 위한 성장 배지; CD 293 AGTTM; CD 293 배지; SFM 적응된 에피설프
Figure pct00002
(EPISERF
Figure pct00003
) 배지; 옵티프로TM SFM (OptiProTM SFM)과 같은 그들의 일부가 시판되어 입수가능하다.
다음으로 감염된 세포주는 바이러스 게놈이 전사되고 바이러스성 단백질들로 해독되고 감염성 바이러스 입자들 내로 포장되는 것을 의미하는 바이러스 증폭을 가능하게 하는 조건들 하에서 배양된다. 바람직하게, 감염된 세포주는 일단 감염된 경우라면 1 및 7일 사이로 배양된다. 감염된 세포주는 표면에 부착된 세포들로서 또는 현탁액에서, 담체들의 존재 또는 부재 시 배양될 수 있다. 세포 배양은 예를 들어, 접시들, 회전병들, 또는 생물반응기들에서 회분식, 사료첨가-회분식, 연속식 시스템들, 및 빈 섬유 등에서 시행될 수 있다.
다음으로 생산된 바이러스들은 상청액 및/또는 세포들로부터 회수된다. 생산된 바이러스들이 세포들로부터 (예로, 세포들만으로부터, 또는 세포들로부터 및 상청액으로부터) 회수된 때, 생산된 바이러스들의 회수 단계는 세포막의 파괴를 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 본 단계는 세포들로부터 바이러스들의 유리 (liberation)를 유도한다. 세포막의 파괴는 당업자라면 잘 숙지하고 있는 다양한 기법들에 의해 유도될 수 있다. 이들 기법들은 이제 제한되는 것은 아니지만 냉동/해동, 저장성 용해, 계면활성제-매개성 용해, (초음파 파쇄기를 사용하여) 초음파 파쇄 (sonication) 또한 (미세유동화 기기를 사용하여) 미세유동화 (microfluidization)을 포함한다. 초음파 파쇄기들은 예로 헤레우스 PSP사 (Heraeus PSP), 바이올로직스사 (Biologics), 미소닉스사 (Misonix) 또는 글렌밀스사 (GlenMills)로부터 시판되고 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 파쇄기는 소니튜브 (SONITUBE) 20 kHz 타입 SM 20-120-3, 및 소니튜브 35 kHz 타입 SM 35-400-3 (헤레우스 PSP사)이다. 미세유동화 기기는 예로 마이크로플루이딕스사 (Microfluidics Corporation)로부터 시판되고 있다. 또한 조류 세포막은 SLM 아민코 프렌치 프레스기 (SLM Aminco French press)를 사용하여 파괴될 수 있다. 또한 세포막은 고속 균질화 기기 (high speed homogenizer)를 사용하여 파괴될 수 있다. 고속 균질화 기기는 예로 실버슨 머신사 (Siverson Machines) 또는 이카-라보테크닉사 (Ika-Labotechnik)로부터 시판되고 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 회수된 바이러스들은 정제될 수 있다. 생산된 바이러스들의 정제는 예를 들어 하나 이상의 다음의 단계들을, 세포성 잔여물의 제거를 적합한 조건들 하에서 허용하는 정화 단계 (상기 정화 단계는 예로 심화 여과에 의해 수행될 수 있다), 미세여과 또는 초여과에 의해 수행될 수 있는 농축 단계; 및/또는 음이온 교환에 특이적 선호로로 예로 이온 교환 흡착제, 젤 여과, 하이드록시아파타이드 등을 사용하는 크로마토그래피 단계와 같은 이러한 단계들의 순서와는 상관없이 포함할 수 있다. 음이온 교환 흡착제의 기능기들은 예를 들어 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 (TMEA), 트리에틸아미노에틸 (TEAE), -R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3 그룹 (Q 그룹이라고도 명명됨; 파마시아사의 스트림라인? (Streamline?) 레진들을 참조하라)과 같은 일차, 이차, 삼차 또는 사차 아미노기일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 본 발명의 불멸화 조류 세포주를 오르토폭스바이러스로 감염시키고; (b) 감염된 조류 세포주를 바이러스 증식을 가능하게 하는 조건들 하에서 배양하고; (c) 상기 오르토폭스바이러스를 배양 상청액 및/또는 패키징 세포들로부터 회수하고; 또한 (d) 임의적으로 상기 회수된 오르토폭스바이러스를 정제하는 단계들을 포함하는, 오르토폭스바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
실시예들 4 및 5에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 조류 세포주들을 사용하는 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 바람직한 세포 배양 배지는 FCS 및 L-글루타민이 보충된 BME (인비트로겐사)이다. 감염은 바람직하게 약 0.0001 및 0.1 사이에 포함되는 낮은 MOI에서 수행되는 것이 바람직하다. 보다 상세하게, 생산된 폭스비리대가 VV-COP일 때, MOI는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 약 0.0001이 더욱 바람직하다. 바람직하게, 오르토폭스바이러스들을 회수하기 이전에 감염된 세포들은 하나 이상의 핵산분해효소들의 존재 시 배양된다. 단가 염들이 회수된 오르토폭스바이러스들에 핵산분해효소(들) 활성을 저해하는 적합한 조건들 하에서 첨가된다. 다음으로 생산된 오르토폭스바이러스들은 당해 기술분야에 알려져 있는 방법이라면 모두를 따라, 예를 들어 크로마토그래피 방법, 특히 정화, 투석 등과 연관된 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 본 발명의 불멸화 조류 세포주를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고; (b) 감염된 조류 세포주를 바이러스 증식을 가능하게 하는 조건들 하에서 배양하고; (c) 상기 인플루엔자 바이러스를 배양 상청액 및/또는 패키징 세포들로부터 회수하고; 또한 (d) 임의적으로 상기 회수된 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계들을 포함하는, 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 인플루엔자 바이러스 (플루 (Flu) 바이러스들이라고도 불림)는 유형이라면 모두 (예로, A형, B형 또는 C형) 및 아형이라면 모두일 수 있다. "인플루엔자 A형 바이러스의 아형들"은 가능한 HA 및 NA 단백질들의 서로 다른 조합을 포함한다. HA 단백질들 (H1 내지 H15로 분류됨)의 19개 클래스들 및 NA 단백질들 (N1 내지 N9으로 분류됨)의 9개 클래스들이 인플루엔자 A형 바이러스들에서 확인되었다. 예들로서, 인플루엔자 A형 바이러스의 아형들은 HIN1 바이러스, HIN2 바이러스, H3N2 바이러스, H3N8 바이러스, H5N1 바이러스, H7N2 바이러스, H7N3 바이러스, H7N7 바이러스 및 H9N2 바이러스일 수 있다. 플루 바이러스들의 게놈들의 뉴클레오타이드 서열들에 관한 좀 더 나아간 정보는 www.flugenome.org/와 같은 공개적으로 접근가능한 유전자 데이타베이스들로부터 획득될 수 있다. 인플루엔자 A형 바이러스들의 게놈들의 뉴클레오타이드 서열들에 관한 좀 더 나아간 정보도 역시 진뱅크, EMBL 또는 LANL: 예로, J02144; J02146; J02148; J02151; V00603; V01099; V01104; V01106와 같은 공개적으로 접근가능한 유전자 데이타베이스들로부터 획득될 수 있다. 인플루엔자 C형 바이러스들의 게놈들의 뉴클레오타이드 서열들에 관한 좀 더 나아간 정보도 역시 진뱅크, EMBL 또는 LANL: 예로, K01689; M10087; M17700와 같은 공개적으로 접근가능한 유전자 데이타베이스들로부터 획득될 수 있다. 약독화 플루 바이러스 백신들에 관한 좀 더 나아간 정보는 히클링 J. (Hickling J., 인플루엔자 바이러스 백신의 생산 및 인플루엔자 유행병 준비를 위한 개발도상국들에서 전개에 대한 그들의 적합성의 검토, 백신 연구를 위한 선도, 세계보건기구 (WHO), 2006; www.who.int/vaccine) 또한 루덴코 등 (Rudenko L. G., et al., Vaccine, 19(2-3), 308-318, 2000)에서 확인될 수 있다. 예를 들어 플루미스트? (FluMist?) (메드이뮨 백신사)와 같은 약독화 저온-적응성 및 온도-민감성 플루 바이러스 백신에 관한 좀 더 나아간 정보는 글리젠 W.에서 확인될 수 있다 (Glezen W., Expert Rev. Vaccines 3(2): 131-9, 2004).
실시예 6은 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070702호 하로 기탁된 세포주로부터 인플루엔자 바이러스들을 생산하는 바람직한 방법을 기술하고 있다.
도 1은 E1A 핵산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 E1A 핵산 서열의 HPRT 유전자 내로 부위 특이적 삽입의 모식적 재연을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 획득된 불멸화 세포의 게놈으로부터 첫 번째 및 세 번째 선별 마커의 제거의 모식적 재연을 나타낸 것이다.
도 4는 카이리나 모스카타 텔로머라제 역전사효소 유전자 및 E1A 핵산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070701호 (계대 21)의 광학현미경 영상화를 나타낸 것이다.
도 6은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070702호 (계대 24)의 광학현미경 영상화를 나타낸 것이다.
도 7은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070703호 (계대 28)의 광학현미경 영상화를 나타낸 것이다.
도 8은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 및 ECACC 제 09070703호의 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 9는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070701호 (도 9A), ECACC 제 09070702호 (도 9B), 및 ECACC 제 09070703호 (도 9C)의 집단 배가시간 진행을 나타낸 것이다.
도 10은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 및 ECACC 제 09070703호에서 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)의 생산 (MOI 0.05)을 나타낸 것이다.
도 11은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070702호에서 VV-COP의 생산을 나타낸 것이다.
도 12는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070702호에서 인플루엔자 A형/파나마/2007/99 H3N2 바이러스 균주의 생산을 나타낸 것이다.
도 13은 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 ECACC 제 09070702호에서 인플루엔자 B형/브리스반/60/2008 바이러스의 생산을 나타낸 것이다.
본 발명 및 그의 장점들을 좀 더 설명하기 위하여, 다음의 상세한 실시예들이 주어지고, 이것은 동일한 것이 단지 설명으로서 의도되고 제한하려는 것이 아니라고 이해된다. 다음의 실시예들에서 모든 부분들 및 백분율들은 달리 표시되지 않는 경우라면 무게로 주어진다.
실시예들
실시예 1: E1A 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류 세포주의 확립
A. 플라스미드 제작물들
A-1. 무작위 삽입을 위한 플라스미드 제작물들
카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 게놈과 상동성을 가지는 특이적 서열을 공유하지 않는 플라스미드 (플라스미드 E1A)가 본 목적으로 사용되었다 (도 1).
A-2. 표적된 삽입을 위한 플라스미드 제작물들
E1A 핵산 서열 (서열번호 1)을 감싸는 카이리나 모스카타 HPRT 유전자와 상동적인 2개의 5kb 단편들 또한 2개의 선별 마커들을 포함하는 플라스미드가 제작되었다. 하이폭산틴 구아닌 포스포릴전이효소 (hypoxanthine guanine phosphoryl transferase)를 인코딩하는 HPRT 유전자는 E1A 핵산 서열의 전신적 발현 (constititive expression)에 적당한 부위로서 선택되었다.
이들 2개 선별 마커는 CMV 프로모터 (Thomsen et al. PNAS, 1884, 81. 3:659-63)의 조절 하에 FCU1 유전자 (Erbs et al. Cancer Res. 2000, 15.60.:3813-22) 및 SV40 프로모터의 조절 하에 배치된 네오마이신 (또는 퓨로마이신) 저항성 유전자이다. 네오마이신 (또는 퓨로마이신) 저항성 및 FCU-1 발현 카세트는 최종 세포주로부터 선별 카세트의 제거를 허용하는 Sce1 절단 부위들에 의해 감싸여 있다. HPRT 유전자 팔들 (arms)의 외부에 RSV 프로모터에 의해 유도되는 HSVTK를 코딩하는 선별 마커가 삽입되어 있다 (도 2).
B. 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 회분의 제조 및 소집단들 기재
B.1 12일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 배치의 제조 및 소집단들 기재.
25개의 SPF 수정란들이 37.5℃에서 배양된다. 달걀들은 12일 배양 이후에 사용가능한 프로토콜에 따라 개봉된다.
23개의 배아들을 곱게 갈고 (mince), 포스페이트 완충 식염수-둘베코 (PBS)로 한 번 세척한 다음 TrypLE 셀렉트 (인비트로겐)로 상온에서 5시간 동안 분해시킨다.
저속으로 원심분리 이후에 세포들은 10% 우태아 혈청 (FBS), 0.04 g/L의 젠타마이신이 보충된 기본 이글 배지 (basal medium Eagle, MBE)에 재현탁되고, 500 cm2 삼중 플라스크들에 접종되어 37℃, 5% CO2에서 배양되었다.
24시간 후, 충만 배양된 (confluent) 세포들은 TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 제거되고, 세포 일부는 2번째 계대를 위해 175 cm2 플라스크들에 재접종되었다. 남아있는 세포들은 적당한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 107 세포/mL 농도로 농축되었고, 장기간 보관을 위해 액체 아조트 (liquid azote)로 이동시키기 이전에 이소프로필 알코올 조절된 용기 (NALGENE
Figure pct00004
"미스터 프로스티" 1℃ 냉동 용기)에서 -80℃로 냉동되었고, 초기의 세포 뱅크 (initial cell bank) (50 x 1, 5.107 세포들/바이알, 44 x 1.107 세포들/바이알)를 구성하였다.
배양액에 남아있는 세포들은 고전적으로 80회 계대들까지 계대되고, 처음 3회 계대 동안은 미부착 세포들을 조정된 배지 (conditioned)를 낮게 원심분리하여 수집되고 재접종되어 초기 배양과 동일한 방식으로 좀 더 계대된다.
서로 다른 형태학적 특성을 나타내는 소집단 (subpopulation)들은 배양 기간 (lifespan) 동안 계속 (reproducibly) 분리되었다.
B.2 19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 회분의 제조 및 소집단들 기재.
AFFSSA 플루프라간사 (Floufragan)으로부터 얻은 29개의 SPF AFFSSA 플루프라간 (Floufragan)으로부터 얻은 29개의 SPF 수정란들이 37.5℃에서 습한 환경하에서 배양된다.
달걀들은 19일 이후에 개봉되고 배아들은 무균적으로 적출된다. 20개의 배아들은 목을 떼어내고 다른 세포의 제조물에 사용되는 간뿐만 아니라 다리들을 제거한다. 배아 반시체들 (torsi)은 갈아지고 PBS 둘베코 용액 (시그마, Ref. D8537, Lot 46K2428)으로 한 번 세척한 다음 500 mL TrypLE 셀렉트 (집코, Ref 12563, Lots 1319986 및 1339844)로 37℃에서 2시간 분해시킨다.
5분 동안 2000 rpm으로 원심분리 이후에, 세포들은 10% 우태아 혈청 (JRH, 제품번호 12003-1000M, 로트번호 5A0102, 코드 TG P4001Q), 0.04 g/L의 젠타마이신 및 4 mM L-글루타민으로 보충된 기본 이글 배지 (basal medium Eagle, 집코, Ref. 41010, Lot 8270)에 재현탁된다. 최종 부피 1.5 L (1.9.106 세포/mL)의 현탁액이 10개의 삼중 플라스크 (500 cm2)들에 접종되어 37℃, 5% CO2에서 배양되었다.
24시간 후 충만 배양된 세포들은 PBS로 세척되고, TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 제거된다. 세포들은 계수되고 2000 rpm에서 4 내지 5분 동안 원심분리된다. 세포 펠렛은 적당한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 5.106 또는 107 세포/mL 농도로 농축된다. 세포 현탁액은 동결건조 바이알 (cryovial)(Nunc)들에 채우고, 장기간 보관을 위해 액체 질소로 이동시키기 이전에, -20℃에서 중간 2시간 단계를 거쳐 -80℃로 냉동시키고 CETC19p1 (오리 반시체 배아 세포들, 19일 된 배아들, 계대 1회)의 일차 세포 뱅크 (primary cell bank) (110개 동결건조 바이알들, 107 세포들/바이알)를 구성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 카이리나 모스카나 달걀들로부터 얻은 CEC 회분의 제조는 대안의 B.2 (19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 나옴)에 따라 수행된다.
C. 형질전환 방법들
관심 있는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 도입하기 위하여 많은 수의 형질전환 방법들이 당해 기술분야에 알려져 있다. 이들 방법들의 무제한적인 리스트가 하기에 나열되어 있다: CaPO4 침전법 (CaPO4 precipitation), 전기천공법 (electroporation), 리포펙틴 형질전환 방법 (lipofectin transfection method). 주어진 실시예는 CaPO4 침전법 절차를 기초로 하고 있다.
세포들은 약 80 내지 50% 정도의 충만도 (confluency)를 유지해야 한다. 배지는 CaPO4 /DNA 첨가 이전 2시간에 교환된다. 30μg의 DNA가 31μl의 2M CaCl2 - 161.3 mM 트리스 pH 7.6에서 재현탁된다. 최종 부피 0.5 ml로 물이 첨가된다.
다음으로, 2가지 대안들으로:
a) 형질전환 시마다, 0.5 ml의 2x HEBS를 15 ml 무균의 팔콘 튜브에 넣고 DNA 용액을 가만히 볼텍싱하거나 거품을 내어 한 방울씩 첨가한다. 용액은 유백색이 되어야 한다. 혼합물은 상온에서 10 내지 30분 동안 세워둔다. 다음으로 무균의 피펫으로 조직 배양 용기를 한 번 안팎으로 이동시켜서 세포 덩어리들을 부수고 세포들에 이를 한 방울씩 떨어뜨린다. 다음으로 세포들은 6시간 내지 하룻밤 동안 37℃에서 배양된다. 미세한 침전물 (fine precipitate)이 세포 표면을 덮어야 한다. 형질전환을 완성하기 위하여, 글리세롤 충격 용액을 37℃로 데운다. 배지는 아스피레이션으로 제거되고 5 mL의 BME가 세포층을 세척하도록 첨가되고 다음으로 배지는 제거되며 1 mL의 글리세롤 충격 용액이 2분 이하 동안 첨가된다. 연속하여 10 mL의 BME가 글리세롤을 희석시키도록 가만히 첨가되고 BME-글리세롤은 완벽하게 제거된다. 다음으로 10 mL의 원하는 배지가 첨가되고 플레이트들은 적당한 온도에서 배양된다.
또는
b) 형질전환 시마다, 0.5 ml의 2x HEBS를 15 ml 무균의 팔콘 튜브에 넣고 DNA 용액을 가만히 볼텍싱하거나 거품을 내어 한 방울씩 첨가한다. 용액은 유백색이 되어야 한다. 혼합물은 상온에서 10 내지 30분 동안 세워둔다. 다음으로 무균의 피펫으로 조직 배양 용기를 한 번 안팎으로 이동시켜서 세포 덩어리들을 부수고 세포들에 이를 한 방울씩 떨어뜨린다. 미세한 침전물이 세포 표면을 덮어야 한다. 다음으로 세포들은 6시간 내지 하룻밤 동안 37℃에서 배양된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 형질전환 (CaPO4 침전법)이 대안 b)에 따라 수행된다.
D. 선별 방법들
D-1. 무작위 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력이 형질전환 이후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 분해되고 저속으로 원심분리되며 10% FCS 및 800μg/mL 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또한 임의적으로 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르)을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 개별적 성장 클론들이 분리될 수 있을 때까지 일련으로 계대된다 (serially passaged).
D-2. 표적된 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력이 형질전환 이후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 분해되고, 저속으로 원심분리되며 10% FCS; 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르; 및 800μg/mL, 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또는 0.5μg/mL의 퓨로마이신)을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 개별적 성장 클론들이 분리될 수 있을 때까지 일련으로 계대된다.
세포 클론들은 이후 연속하여 메가뉴클레아제 (meganuclease) I-Scel 발현 플라스미드로 하기에 기술된 방법에 따라 형질전환된다.
선별 마커들의 제거를 선택하기 위하여, 5-플루오로사이토신 (5-FC)가 형질전환 이후 48시간 동안 처리된다: 세포들은 TrypLE 셀렉트를 사용하여 분해되고, 저속으로 원심분리되며 10-3 내지 10-7 M 농도 범위의 5-FC를 가진 배지에 재접종되고 G418 (또는 퓨로마이신)/갱시클로비르 선별 (10% FCS; 5-FC, 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 800μg/mL, 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또는 0.5μg/mL의 퓨로마이신)을 첨가한 BME 배지)에 의해 유지된다 (도 3).
실시예 2: E1A 핵산 서열 및 재조합 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류 세포주의 확립
A. 플라스미드 제작물들
A-1. 무작위 삽입을 위한 플라스미드 제작물들
카이리나 모스카타 게놈과 상동성을 가지는 특이적 서열을 공유하지 않는 플라스미드가 본 목적으로 사용되었다.
A-2. 표적된 삽입을 위한 플라스미드 제작물들
카이리나 모스카타 텔로머라제 역전사효소 유전자 (서열번호 3)를 감싸는 카이리나 모스카타 HPRT 유전자와 상동적인 2개의 5kb 단편들, E1A 핵산 서열 (서열번호 1) 또한 2개의 선별 마커를 포함하는 플라스미드가 제작되었다. 하이폭산틴 구아닌 포스포릴 전이효소를 인코딩하는 HPRT 유전자는 E1A 핵산 서열의 전신적 발현에 적당한 부위로 선택되었다.
이들 2가지 선별 마커는 CMV 프로모터 (Thomsen et al. PNAS, 1884, 81. 3:659-63)의 조절 하의 FCU1 유전자 (Erbs et al. Cancer Res. 2000, 15.60.:3813-22) 및 SV40 프로모터의 조절 하의 퓨로마이신 저항성 유전자이다. 퓨로마이신 저항성 및 FCU-1 발현 카세트는 최종 세포주로부터 선별 카세트의 제거를 허용하는 Sce1 절단 부위들에 의해 감싸여 있다. HPRT 유전자 팔들의 외부에 RSV 프로모터에 의해 유도되는 HSVTK를 코딩하는 선별 마커가 삽입되어 있다 (도 4).
B. 19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 회분의 제조 및 소집단들 기재.
AFFSSA 플루프라간사 (Floufragan)로부터 얻은 29개의 SPF 카이리나 모스카타 수정란들이 37.5℃로 습한 환경 하에서 배양된다.
달걀들은 19일 이후에 개봉되고 배아들은 무균적으로 적출된다. 20개의 배아들은 목을 떼어내고 다른 세포의 제조에 사용되는 간뿐만 아니라 다리들을 제거한다. 배아 반시체들은 갈아지고 PBS 둘베코 용액 (시그마, Ref. D8537, Lot 46K2428)으로 한 번 세척한 다음 500 mL의 TrypLE 셀렉트 (집코, Ref 12563, Lots 1319986 및 1339844)로 37℃에서 2시간 분해된다.
5분간 2000 rpm으로 원심분리한 다음, 세포들은 10% 우태아 혈청 (JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, 코드 TG P4001Q), 0.04 g/L의 젠타마이신 및 4 mM L-글루타민을 첨가한 BME (집코, 제품번호 41010, 로트번호 8270)에 재현탁한다. 최종 부피 1.5 L (1.9.106 세포/mL)의 현탁액은 10개의 삼중 플라스크 (500 cm2)들에 접종하여 37℃, 5% CO2에서 배양되었다.
24시간 후 충만 배양된 세포들은 PBS로 세척되고, TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 분해된다. 세포들은 계수되고 2000 rpm에서 4 내지 5분 동안 원심분리된다. 세포 펠렛은 적당한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 5.106 또는 107 세포/mL 농도로 농축된다. 세포 현탁액은 동결건조 바이알 (cryovial)(Nunc)들에 채우고, 장기간 보관을 위해 액체 질소로 이동시키기 이전에, CETC19p1 (오리 반시체 배아 세포들, 19일 된 배아들, 계대 1)의 일차 세포 뱅크 (primary cell bank) (110개 냉동 바이알들, 107 세포들/바이알)를 구성하면서, -20℃에서 중간 2시간 단계를 거쳐 -80℃로 냉동된다.
C. 형질전환 방법들
당해 분야에서 관심있는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 도입하기 위해 많은 수의 형질전환 방법들이 알려져 있다. 이들 방법들의 무제한적 리스트가 하기에 나열되어 있다: CaPO4 침전법, 전기천공법, 리포펙틴 형질전환 방법. 주어진 실시예는 전기천공법을 기초로 하고 있다.
형질전환은 아마사사의 뉴클레오펙터 (Amaxa's Nucleofector) 장치 및 기본 섬유아세포 키트 (basic fibroblast kit, Amaxa, Cat NO. VPI-1002)를 사용하여 수행된다. 세포들은 700 rpm (100g)으로 10분 동안 원심분리되고 기본 뉴클레오펙터 용액 (basic Nucleofector solution, 106 세포들 당 100μl)에 재현탁된다. 100μL 현탁액은 3 내지 6μg의 DNA와 혼합되고 뉴클레오펙터 (U-12 프로그램) 내에 놓인 큐벳으로 옮겨진다. 전기천공 이후에 시료는 6 cm 배양 디쉬로 옮겨지고 37℃/5% CO2 배양기에서 미리 평형유지된 (preequilibrated) 5 ml의 배양 배지가 채운다. 37℃ 5% CO2에서 밤샘 배양 이후에 배양 배지를 새로 교환해주고 계속 배양된다.
D. 선별 방법들
D-1. 무작위 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력이 형질전환 이후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 분해되고 저속으로 원심분리되며 10% FCS, 25μg/mL 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 800μg/mL 바람직하게는 500μg/mL의 G418을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 개별적 성장 클론들이 분리될 수 있을 때까지 연속적으로 계대된다.
D-2. 표적된 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력은 형질전환 후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고 낮은 속도로 원심분리되며 10% FCS, 25μg/mL 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 0.5μg/mL의 퓨로마이신을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 각 개체 성장 클론들이 분리될 때까지 연속적으로 계대된다.
세포 클론들은 이후 계속하여 메가뉴클레아제 I-Scel 발현 플라스미드로 하기 기술한 방법에 따라 형질전환된다.
선별 마커들의 제거를 선택하기 위하여, 5-플루오로사이토신 (5-FC)가 형질전환 이후 48시간 동안 처리된다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 분해되고 저속으로 원심분리되며 10-3 내지 10-7 M 농도 범위의 5-FC를 가진 배지에 재접종되고 퓨로마이신/갱시클로비르 선별 (10% FCS; 5-FC, 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 10μg/mL, 바람직하게는 0.5μg/mL의 퓨로마이신을 첨가한 BME 배지)에 의해 유지된다.
실시예 3: ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 및 ECACC 제 09070703호의 불멸화 카이리나 모스카타 세포주들
카이리나 모스카타 세포주들 ECACC 제 09070701호 (T17-17703B), 제 09070702호 (T17-17703B2) 및 제 09070701호 (T17-17703A)은 실시예 2에서 기술된 바와 같은 일차 배아 카이리나 모스카타 세포들로부터 플라스미드 dTERT-E1A로의 표적 삽입 (전기천공)에 의해 획득되었다.
세포주들은 형질전환 이후 210일 및 260일 사이에서, 노화/정점 단계 이후에 소집단들 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호 및 ECACC 제 09070703호가 새로운 지수적 성장기에 들어가면서 발생하였다. 해당하는 성장 곡선들 (도 8)은 형질전환 이후 456일까지 집단들의 발생을 보여준다. 본 기간 동안 계산된 집단 배가들 (PDL)의 횟수들은 (ECACC 제 09070701호: 138 PDL; ECACC 제 09070702호 131 PDL; ECACC 제 09070703호 166 PDL) 헤이플릭 한계를 훨씬 초과한다. 결론적으로 카이리나 모스카타 세포주들 ECACC 제 09070701호 (T17-17703B), 제 09070702호 (T17-17703B2) 및 제 09070701호 (T17-17703A)는 불멸화 세포주들로서 주장된다.
세 가지의 카이리나 모스카타 세포주들은 서로 다른 형태들을 보여주는 구별되는 세포주들이다. 카이리나 모스카타 ECACC 제 09070703호 세포들은 표피세포 유사 형태를 가지는 한편 (도 7), 카이리나 모스카타 ECACC 제 09070701호 및 ECACC 제 09070702호는 합포체 유사 층들을 형성한다 (각각 도 5 및 도 6). 세 가지 세포주들의 세포들은 안정한 정적 단일층으로 성장하는 작은 세포들이다.
세 가지의 카이리나 모스카타 세포주들은 서로 다른 세대 시간도 역시 보여준다. 평균 집단 배가 시간 (PDT)는 ECACC 제 09070702호의 경우 30시간, ECACC 제 09070701호의 경우 35시간 및 ECACC 제 09070703호의 경우 47시간이다 (도 9).
세 가지 세포주들의 세포들은 마이코플라스마 및 미생물 오염들에 대해 음성으로 테스트되었다.
집단 배가 시간 (PDL)은 세포 세대들의 횟수를 말한다 (생체량의 2배 증가). PDL 계산: PDL = Ln (최종/초기 세포수)/Ln(2);
세대 시간이라고도 불리는 집단 배가 시간 (PDL)은 한 번의 집단 배가를 위해 필요한 시간이다. PDL 계산: PDL = △t * Ln(2)/Ln(최종/초기 세포수).
실시예 4: 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 ( MVA )의 생산
카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, 및 ECACC 제 09070703호의 MVA 증폭 능력들이 평가되었고, 보통 MVA 생산을 위한 기질로서 사용되는 일차 닭배아 섬유모세포들 (CEFs)과 비교되었다. eGFP를 발현하는 MVA (국립 미생물배양 수집기관 (CNCM)의 수탁번호 N602 I-721 하)가 바이러스 증식 추적 및 역가측정을 용이하게 하기 위하여 선택되었다. 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, ECACC 제 09070703호 및 CEFs는 25 cm2의 T-플라스크에서 2.106개 세포들의 농도로 접종되었고 37℃, 5% CO2로 습한 환경에서 24시간 동안 배양되었다. 다음으로 배양 배지 (10% 우태아 혈청 (FCS) 및 4 mM L-글루타민이 보충된 기본 이글 배지 (BME))는 제거되었고 세포들은 PBS 1% 음이온들, 1% FCS로 희석된 500 μL MVA 바이러스를 사용하여 MOI 0.05로 감염시켰다. 흡착 단계 30분 이후에, 남아있는 바이러스 현탁액은 제거되었고, 세포들은 PBS로 한 번 세척되었고 다음으로 5 mL BME 10% FCS가 각 플라스크에 첨가되었다. 신선한 배양 배지가 첨가되었고 세포들은 배양기로 옮겼다. 바이러스는 37℃, 5% CO2에서 감염 0, 24, 48, 72 및 96시간 이후에 냉동-해동 단계에 의하여 세포들 및 상청액로부터 회수되었다. 회수된 바이러스 현택액들은 응집물들을 피하기 위하여 역가측정 이전에 초음파 파쇄되었다. 역가측정들은 6 cm 배양 접시들에 접종된 CEFs 상에서 세 벌로 수행되었고, 대수적 바이러스 희석물들로 감염되었으며 아가로 오버레이 되었다. eGFP를 발현하는 MVA의 플라크 형성 단위들은 형광 양안 관찰 (binocular)로 확인되었고 72시간 이후에 계수되었다.
결과: 도 10에서 나타난 바와 같이, 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070701호, ECACC 제 09070702호, ECACC 제 09070703호는 MVA를 허용하였고 고전적인 CEF 기질로 획득된 것과 비교가능한 MVA 증폭을 가능하게 하였다. 모든 테스트된 조류 세포주들의 경우, 최대 바이러스 수득은 감염 이후 72시간에 도달하였고 전체 pfu가 2,3.107로부터 5,7.107개까지의 범위이었다. 일치하게도, 명백한 세포변성 효과가 모든 세포들에서 관찰되었다 (결과 미도시)
실시예 5: 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 ( VV - COP )의 생산
카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070702호의 VV-COP 증폭 능력이 평가되었고, 보통 MVA 생산을 위한 기질로서 사용되는 일차 닭배아 섬유모세포들 (CEFs)과 비교되었다. eGFP를 발현하는 MVA가 바이러스 증식 추적 및 역가측정을 용이하게 하기 위하여 선택되었다. 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070702호 (계대 50회에서) 및 CEFs는 T-플라스크 175에서 1.4 x 107개 세포들의 농도로 접종되었고 37℃, 5% CO2 대기 환경에서 24시간 동안 배양되었다. 다음으로 배양 배지 (10% 우태아 혈청 (FCS), 4 mM L-글루타민 및 0.04 g/L 젠타마이신이 보충된 기본 이글 배지 (BME))는 제거되었고 세포들은 1% FCS 및 음이온들이 보충된 PBS (머크 혼합물: 마그네슘 아세테이트 100 μg/mL, 염화칼슘 100 μg/mL)로 희석된 바이러스를 사용하여 MOI 0.0001로 감염시켰다. 상온에서 30분 흡착 이후에, 신선한 배지가 첨가되었고 세포들은 배양기로 옮겼다 (37℃ 및 5% CO2에서). 세포들은 감염 24, 28, 72 및 96시간 이후에 연속하여 냉동되었다.
바이러스들은 감염 0, 24, 48, 72 및 96시간 이후에 세포들 및 상청액으로부터 냉동-해동 단계를 따라 회수되었다. 회수된 바이러스 현택액들은 응집물들을 피하기 위하여 역가측정 이전에 초음파 파쇄되었다. 역가측정들은 6웰 배양 플레이트들에 넣은 BHK21 상에서 세 벌로 수행되었다. 세포들은 3 mL DMEM (집코사), 10% FCS에 넣어 웰 당 5 x 105개 세포들로 접종되었고 24시간 동안 배양되도록 두었다. 10-2부터 10-6까지 범위의 VV 용액들의 일련 희석액들이 2 mL DMEM, 1% FCS 및 음이온들 (머크 혼합물)에서 만들어졌다. 250 μL의 각 희석액이 웰 당 첨가되었고 바이러스 희석액들 및 세포들 간의 접촉이 상온에서 30분 동안 허용되었다. 웰당 2 mL의 DMEM 10% FCS가 연속하여 첨가되었고 세포들은 37℃로 5% CO2 대기 환경에서 배양되었다. 24시간 이후에, 배지는 제거되었고 세포들은 크리스탈 바이올렉 (10%, 시그마사) 및 중성 레드 (2 g/L,머크사)의 1 : 1 (부피/부피) 혼합물 1 mL로 오버레이 되었다. 상온에서 1시간 염색 이후에, eGFP를 발현하는 VV-COP의 플라크 형성 단위 (pfu)가 확인되었고 형광 양안 관찰 (binocular)로 계수되었다.
도 11에서 나타난 바와 같이, 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070702호는 VV-COP를 허용하였고 CEF 기질로 획득된 것과 비교가능한 수준으로 그의 증폭을 가능하게 하였다 (각각 2.7 x 108개 pfu 및 6.8 x 108개 pfu). 모든 경우들에서, 최대의 바이러스 수득은 감염 이후 96시간에 도달하였다.
본 연구는 본 발명의 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들이 MVA 및 VV-COP 둘 다의 생산을 위한 좋은 후보들인 점을 보여주었다.
실시예 6: 플루 바이러스의 생산
카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주들 ECACC 제 09070702호 (T17-17703B2)의 능력이 인플루엔자 바이러스들의 생산에 대해 평가되었다. 여러 인플루엔자 균주들, 인플루엔자 A형 (A/파나마/2007/99 H3N2 균주) 및 인플루엔자 B형 (B/브리스반/60/2008)이 테스트되었다. 감염 및 T17 세포 허용도 (cell permissivity)가 바이러스성 세포내 뉴라미니다제의 정량에 의해 평가되었다.
뉴라미니다제 검정 (NA)
T17 세포들은 웰 당 0.15 x 105개 세포들로 96-웰 플레이트들 내에 접종되었고 100% 충만도까지 감염 배지 (2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 0.5 μg/mL 트립신이 보충된 BME)에서 배양되었다. 세포들은 웰 당 25 μL의 감염 배지로 희석된 바이러스를 첨가하여 MOI 1 또는 0.1에서의 인플루엔자 바이러스들로 감염되었다. 감염은 37℃, 5% CO2 에서 75시간 (MOI 0.1) 및 48시간 (MOI 1) 동안 진행하도록 허용되었고 이후에 25 μL의 상청액이 뉴라미니다제 활성 테스트를 위해 수집되었다.
NA 활성을 감시하는 데 사용되는 표준 형광측정 종점 검정법들 (fluorometric endpoint assays)은 최근에 대용량 검색 (high-throughput screening) 테스트로 인플루엔자 바이러스를 정량하는 데 적합한 것으로 확인되었다 (Virol. J. 2008, 5: 109). 간략하게, 세포 상청액들 (25 μL)은 검정 96-웰 플레이트로 옮겨지고 75 μL의 2'-(4-메틸엄베리페릴)-알파-N-아세틸뉴라민산 (MUNANA, 시그마 케미칼사)이 최종 농도 50 μM로 첨가되었다. 37℃에서 1시간 동안 플레이트의 배양 이후에, 150 μL의 정지 용액 (0.05 M 글리신, pH 10.4)가 각 웰에 첨가되었고 각각 350 nm 및 460 nm의 여기 및 방출 필터들을 가진 플루오스타 옵티마 (BMG 랩테크사) 상에서 형광이 리딩되었다. 상대적 형광 단위들 (RFU)는 특이적 공시료들, 예로 분자들이 있거나 없는 배지를 차감하여 교정되었다.
NA 효소적 활성 상의 테스트 분자들의 잠재적인 간섭은 DMEM (최종 107.8 TCID50/mL)로 희석된 A/모스크바/10/99 (H3N2) 바이러스 스톡을 테스트 분자 (또는 대조군의 경우 DMEM)의 농도들을 증가시키면서 상온에서 0.5시간 동안 배양하여 테스트되었다. 특이적 공시료들은 각 분자에 대해 특정되었다. 상기 기술된 바와 같이 25μL가 NA 테스트에 사용되었고 결과들은 대조군들의 RFU에 대한 시료의 교정된 RFU의 비율로서 표현되었다. 두 번의 독립적인 실험들이 두 벌씩 수행되었다.
결과
뉴라미니다제 활성의 측정은 ECACC 제 09070702호 세포주가 인플루엔자 A형 (A/파나마/2007/99 H3N2 균주; 도 12) 및 인플루엔자 B형 (B/브리스반/60/2008; 도 13)에 대해 허용하는 점을 보여주었다. 뉴라미니다제 활성의 검출은 인플루엔자 복제가 ECACC 제 09070702호 세포주에서 효과적이고 바이러스 뉴라미니다제가 정확하게 가공되고 기능적인 점 둘 다를 해석하였다.
본 명세서에서 인용되거나 표시되는 각 특허, 특허출원, 출판물, 교과서 및 문헌 기사/보고서는 이에 의해 모든 목적을 위해 그의 내용 전부가 참고문헌으로 명백하게 통합된다.
본 발명은 다양한 특이적 및 바람직한 구현예들의 견지에서 기술되었으며, 당업자라면 다양한 변형들, 치환들, 생략들, 및 변화들이 그의 정신을 벗어나지 않고도 만들어질 수 있는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 그의 등등물들을 포함하는 다음의 청구항들의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
European Collection of Cell Cultures (ECACC) 09070701 20090707 European Collection of Cell Cultures (ECACC) 09070702 20090707 European Collection of Cell Cultures (ECACC) 09070703 20090707
SEQUENCE LISTING <110> Transgene SA <120> Immortalized avian cell lines. <130> 358689D26692 <150> US 12/829,773 <151> 2010-07-02 <160> 3 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1027 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 1 ccgggactga aaatgagaca tattatctgc cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc 60 gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg ataatcttcc acctcctagc 120 cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 180 cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 240 gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 300 cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 360 ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat 420 gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 480 tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 540 aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 600 gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 660 gtattgtgat 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cagctcttca caaagagccc agttgggctt 24660 gcacacctgt agttttgagg gagctgagag ctgaacctat ctgctcgtta tcccagaggt 24720 gaccttactt atagctgtgc ccaaggcgag ggcacactca cacaggtgcc accttttgaa 24780 taatactgtg agggtgacaa ctaaaacaaa ataaaatgct actgcttggg aaccagtaag 24840 taaatctatt tcattttgtt ttagttgaat taaatcaaca aatagagtta gaccattaac 24900 tagcttgaat attaatctcg ggatacttga atggaagaaa tgaaatgtta tgcttatatg 24960 tctataaaat tctagattct ctctgtaaaa aggtctagtg aactctagga agttcttttc 25020 taacatactg atgacttatg ttctttttca gttgttggat ttgaagtgcc agacaaattt 25080 gttgtgggat acgccctaga ttacaatgaa tacttcagag atttgaatgt aagtaacttt 25140 tcccgtatgt ttttgtccat ttaaaactag ggaggaggaa ggaagggaag tctcctcgca 25200 tcactctttc tcttctgtgt aaatcacagc tcatgtgcaa gcctgttcca ttagtgatgc 25260 aacgacgaga gcaaaggcta gaccagcaca acagtgtttt ggagctcata tgaaactaac 25320 ttttgttttg cttcatgcag aatggaggta ttctgcatga agctgtcagc tttgaaatac 25380 tgtggcagtc tgtatgaagt ttcttatctt accagacata tctgcaagaa acaagtgcat 25440 ttccttagtt acatcaaaat 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acctttgggt gttataaaac atgaggagca gccagttaca gtatctgtaa 26340 tcaccaagga gctgattcaa gcctcctgga gttgccttat cgctgtaaaa gtccgggtaa 26400 aaaaaatctt ttttttttta atttttttta ttttttgagc taaaaggaga tggaatgaca 26460 aagcagaatg tttaaaatct agtttaagtt gagctattca tttcttttgg attttttctt 26520 taaaaatacc catcagacag tgaaattgcc ttttaaattt aaacaatttt aatatatttt 26580 tgaagaagta ttgtaatgtt tactttataa gatctaaaaa acaaaaagta ctttaaataa 26640 aggctgtctc tttaaaataa gccccataca tctatgccac tcattctgta tattaaagtg 26700 ctcttgaaat tttcttagta atatttttca taagtgtttc tgacagtgaa ggcagactct 26760 acgtttgtta tctttgtaga gcctttagtc agtattgtgc catctacaag agatgataaa 26820 ggcctgaggg aaagctatcg aaatacttgc gtattctata accaaactgg atttcagaga 26880 aaatgcacta agtagtgtcc cgtattctgt tttggc 26916 <210> 3 <211> 3915 <212> DNA <213> Cairina moschata <400> 3 atggcgggcg cggagccctt cggcgccgtg ctgggcgccc tgcgggactg ctacgcgcag 60 gcggccccgc tggagacctt cctccggggg ctgggggaga gcggcgccga ggaagccgag 120 gtggtgcggg acgacgacgc cgcctgctac cgcaccttcg tgtcccagtg cgtggtgtgt 180 gtcccccacg gcgcccgcga catcccccgg cccttcagct tggagcagtt atctagtcag 240 agcgaagtca tctcaagagt catgcagagg ctgtgtggga aaaagaagaa gaacatcctc 300 acatatggat actccttgct ggatgaaaac agttctcact tccaaatcat gccgctctca 360 aacgtgtaca gctacctgcc caacaccgca acagaaacca tgcgtatcag tggcctctgg 420 gaaacgctgc tgagcaggat aggggatgac gtgatgatgt atttattgga gcactgtgca 480 atctttatgc tggttccccc tagtaactgt taccaagtct gtgggcaacc aatttatgaa 540 cttatttcgc aaaatgtaga atcagcccca gcgtttgtta aacaacggct ttcaaagcac 600 aaacgtagta gcttgcttaa gtatacgcag aaaaggctaa cgtttcacag acagtatctt 660 tcaaagtcac gtcagtcgaa acgcaggcaa agacttgaag ctaatgtctc cagcatgaga 720 aataaaacca gcaataatat acaaagccta gggtccgctg ctctggaaaa acagagtagc 780 tccaatgcag gtttgtcagc tacagcacca tccttaaaaa ggaagcttgc tagggaacaa 840 ctggaagtca cggctaagag agcaagatta gaagagaaag agagggagga acaggcttgt 900 aatactgctc ctaatgtaaa ccagagtatt cccaagaggt atggaaccag ctgtgtagca 960 tcacgttctg taagtcttat taaagaaaaa tacatttctc aaagaagtaa 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gcttctcaag 1860 gagcactgca gccacttcca ggtgtacctc tttgtgaggg agtgcgtgga gcgggtgatc 1920 cccgccgagc tctggggttc aaaccataac aagcgccggt tcttcaagaa cgtgaaagca 1980 ttcatttcca tggggaagta cgctaagctt tccttgcagg tgttgatgtg gaagatgaga 2040 gtaaatgact gcatgtggct tcgtctggcc aaaggtaatc actttgttcc tgcctctgaa 2100 caccgttacc gtgaagaaat tttggctaaa ttcctatact ggctgatgga tacgtatgtt 2160 gttgagttgc tcagatcatt tttctatatc accgagacca tgttccagaa aaatatgctt 2220 ttctactacc gaaagtgtat ttgggccaag ttacaggaca ttggaattag aaagcatttt 2280 gccaaagtac agctacgtcc tttaactgca gaggagatgg aagcgatcca tcagaaaaaa 2340 taccttccta tggcatcaaa gctccgtttc attcccaaag tcagtggact aagacccatc 2400 gtcagaatga gcggtgttgt tgaagcacaa acgttgagca aggaaagcag agcaaagaag 2460 atgaatcact acaacatgca actgaaaaat ctatttagtg tgttaaatta tgaacgaact 2520 ataaacacca gttacatcgg ctcttcagtg tttgggagag atgatatcta caagaagtgg 2580 aagacatttg ttaaaaaggt tcttaaatca gatggtgaaa ttcctcattt ctactatgta 2640 aaggccgatg tgtccagggc ttttgatagc attcctcacg ataaacttgt 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tttacttcag 3540 gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattca accagaaagt taggaacaat 3600 cctgatttct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctattc tatgctgaaa 3660 gctaaaaatc cagggtttac tttaggtaac agaggtgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720 gcagcagagt ggctctgcta tcatgccttc actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780 tacaaatgct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840 aaggatacta aggcactact gaagacagtg acagaaccat ctatttgtca agatttcaaa 3900 gctatcctgg actga 3915

Claims (16)

  1. 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070701호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주 및 그의 유도체들.
  2. 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070702호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주 및 그의 유도체들.
  3. 유럽 세포배양의 수집기관 (ECACC)에서 수탁번호 제 09070703호 하로 기탁된 바와 같은 불멸화 조류 세포주 및 그의 유도체들.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기에 더하여 결함성 바이러스의 증식을 허용하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 불멸화 조류 세포주.
  5. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기에 더하여 관심 있는 물질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 불멸화 조류 세포주.
  6. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 불멸화 조류 세포주를 사용하는 것을 포함하는, 바이러스를 복제하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 바이러스는 생바이러스, 약독화 바이러스, 또는 재조합 바이러스인, 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 바이러스는 폭스바이라스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 거품형성 바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스, 플래비바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 바이러스는 폭스바이러스인, 방법
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 바이러스는 백시니아 바이러스인, 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)인, 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 바이러스는 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐인, 방법
  13. 제 8항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스는 A형인. 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 A형 인플루엔자 바이러스는 H1N1 및 H3N2 균주들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제 8항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스는 B형인. 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 B형 인플루엔자 바이러스는 브리스반 및 플로리다 균주들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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