JP2013529921A

JP2013529921A - トリ不死化細胞株

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Publication number: JP2013529921A
Application number: JP2013517283A
Authority: JP
Inventors: フィリップエルプス; マリーナカプファー; ナタリーシルベストル
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2013-07-25
Also published as: US20110008872A1; MX2013000136A; AU2011273520A1; BR112012033538A2; CA2803509A1; WO2012001075A3; US8513018B2; US8357531B2; KR20130030298A; EP2588596A2; US20120238000A1; CN103328628A; WO2012001075A2; RU2013103535A

Abstract

本発明は、アクセッション番号09070701、09070702、および09070703にてECACCに寄託されたものを含むトリ不死化細胞、ならびにこれらの細胞をウイルス作製に使用することに関する。本発明の細胞は、動物、より具体的にはヒトを処置するための治療用組成物および/または予防用組成物の調製に使用することができる組換えウイルスベクターを作製するのに特に有用である。

Description

1. 発明の技術分野
本発明は、トリ不死化細胞、ならびにこれらの細胞をウイルス作製に使用することに関する。本発明の細胞は、動物、具体的には、ヒトを処置するための治療用組成物および/または予防用組成物の調製に使用することができる組換えウイルスベクターの作製に特に有用である。

2. 背景および/または関連技術の記載
真核細胞株は、ウイルスワクチンおよび多くのバイオテクノロジー製品の製造に必須である。細胞培養において作製される生物製剤には、酵素、ホルモン、免疫生物製剤(モノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン)、ならびに抗癌剤が含まれる。多くの単純なタンパク質は細菌細胞を用いて作製できるが、グリコシル化された、より複雑なタンパク質は、現在、真核細胞において作製しなければならない。

トリ細胞は、ウイルスベクターの作製に何年も用いられてきた。例えば、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)上で、痘瘡処置用の予防用組成物の調製に用いられるワクシニアウイルスが培養された。薬学的組成物に用いられる多くのウイルスがトリ細胞上で複製できるので、トリ細胞は特に有用である。さらに注目に値するのは、様々なウイルスがトリ細胞上でしか増殖できないことである。これは、例えば、哺乳動物細胞上では増殖できない哺乳動物ウイルスアンカラ(Ankara)(MVA)の場合である。このポックスウイルスは、ワクシニアウイルスをCEF上で500超継代することによって得られ、痘瘡に対する免疫を持たない人にワクチン接種するために17世紀初頭に用いられた。現在、MVAは、遺伝子療法用のベクターとして主に用いられている。例えば、MVAは、MUC1遺伝子を発現する腫瘍のワクチンを患者に接種するために、この抗原の遺伝子のベクターとして用いられている(Scholl et al., 3 J BIOMED BIOTECHNOL. 194-201 (2003)（非特許文献1）)。HPV抗原をコードする遺伝子を運ぶMVAも卵巣癌腫治療用のベクターとして用いられている。つい最近まで、MVAは、新たに現れつつある疾患、または西ナイルウイルスおよび炭疽菌などの推定される生物兵器の予防療法薬を調製するためのえり抜きのベクターであった。

これに関して、ウイルス作製がますます必要とされている。今のところ、最も用いられているMVA作製プロセスは、CEF上でのウイルス複製工程を含む。しかしながら、CEFの使用は様々な困難と関連している。第一に、CEFの調製は、手作業で行わなければならない多くの工程を含んでいた。

さらに、このウイルス作製プロセスは卵を入手できるかどうかに依存しており、卵は、血統が汚染された場合、全て破棄しなければならないことがある。この問題は、トリインフルエンザの蔓延とますます関連してきている。

さらに、多くのCEFは逆転写酵素活性(RT)を有する。RTは、レトロウイルスが複製するのに必要な酵素である。レトロウイルスは多くの異なる種において見られる。RTはヒトにも動物にも感染性は無く、ヒトにおいて健康上の有害作用を引き起こすことは示されていない。高感度のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイを用いて、ニワトリ胚線維芽細胞を用いて製造されたワクチンの中に、微量のRT活性があることが検出されている。この酵素の供給源は、おそらく、数百年前または数千年前にニワトリ細胞に組み込まれたと考えられる、RTをコードする部分ウイルスゲノムである。このRTを産生するトリレトロウイルスは、ヒトに影響を及ぼすことは分かっていない。ヒト免疫不全症ウイルス(HIV、AIDSにつながるウイルス)はレトロウイルスであるが、ワクチン中に検出されるRT活性は、明らかに、HIVに由来するものではない。さらに、RTの存在はレトロウイルスの存在を裏付けるものではない。それにもかかわらず、内因性RT活性の無い細胞株が関心対象となっている。

ウイルス作製プロセスからCEFの使用を除くために、ウイルスの複製および作製を可能にするトリ細胞株がますます必要とされている。不死化細胞株は製造箇所でバッチごとに維持または凍結することができ、新たな作製プロセスのために常に利用することができる。さらに、不死化細胞株は製造プラントに限定されるので、外因性汚染物質による汚染を受けにくい。不死化細胞株を使用すると、作製プロセスに必要な手作業での操作が劇的に少なくなる。これらの特性は全て価格の低下および作製プロセス期間の短縮、ならびに潜在的な汚染の減少につながる。

最後に、細胞株は十分に特徴付けることができ、従って、良好な実験室での業務および様々な医療機関の要求と全面的に合致している。

様々なトリ細胞株が既に述べられている。例えば、DF1(米国特許第5,879,924号（特許文献1）)は、10日齢East Lansing Line(ELL-0)卵から得られる自然不死化ニワトリ細胞株である。この細胞は、ウイルス増殖、組換えタンパク質発現、および組換えウイルス作製の培養基(substrate)として有用である。しかしながら、この細胞株は、七面鳥ヘルペスウイルス1(七面鳥のヘルペスウイルス)、鶏痘ウイルス、レオウイルス、トリ肉腫白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどの様々なウイルスに対する感受性がある。トリ不死細胞はまた、増殖因子およびフィーダー層から連続して分離することによって、胚性幹細胞から得ることもでき、従って、未分化な幹細胞の増殖特性および無限寿命の特徴を維持している。このプロセスによって得られる唯一利用可能なトリ細胞株は、Ebxニワトリ細胞株(WO 2005/007840（特許文献2）)である。この細胞株はマウス由来のフィーダー層と接触されており、このため、マウスウイルスによる汚染およびニワトリ細胞における内因性レトロウイルス配列の存在のような、さらなる規制上の問題が提起されている。さらに、この細胞株は、ある条件では、不安定であり、かつ分化を起こしやすいと述べられている。

内因性トリレトロウイルスを含まないアヒル胚永久細胞株も樹立されている。この細胞株はDEC99(Ivanov et al. EXPERIMENTAL PATHOLOGY AND PARASITOLOGY, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences（非特許文献2）)と名付けられ、140回の連続継代にわたって培養され、トリの場合には腫瘍化しない。DEC99細胞株は、研究に用いられてきた標準的な細胞培養系であり、バイオテクノロジーのニーズに合わせて用いることができる。この細胞株は、細胞生物学、ウイルス学、免疫学、毒物学の分野における研究、ならびに診断薬およびワクチンの製造に適したモデルである。胚に適応させたトリポックスウイルス(APV)ワクチン株による感染に対する、アヒル胚永久細胞株(CL)DEC99の感受性が研究されている(Ivanov et al. EXPERIMENTAL PATHOLOGY AND PARASITOLOGY, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences（非特許文献3）)。家禽由来のFKワクチン株およびハト由来のDessauワクチン株が用いられている。これらのウイルス株は、初代アヒル胚細胞培養(CC)において連続継代された(13継代)。適応ウイルス株はDEC99細胞株のCCにおいてさらに継代されており(12継代)、典型的な細胞変性効果(CPE)が観察された。感染性ビリオンの生成は11日齢White Leghorn胚に接種することによってチェックし、漿尿膜 (CAM)上に典型的なポックス増殖が形成した。DEC99細胞において、FK株はDessau株と比較して早期にCPEを引き起こし、力価が106.25 CCID50/mlに達した。DEC99に適応させたウイルス株は、2ヶ月齢のニワトリにワクチン接種された後、典型的な皮膚「善感(take)」を誘導した。従って、DEC99は標準的なCC系として、鶏痘ワクチンの作製に適しているように見える。それにもかかわらず、この特定の細胞株は40回の継代後に増殖が遅くなり、懸濁液中で増殖することができない。

ヒトアデノウイルス5の初期領域由来の核酸配列は、一部の特定のヒト細胞をインビトロで形質転換するのに既に用いられている(293細胞株およびPER.C6細胞株;Fallaux,F. J. et al., 9 HUM. GENE THER. 1909-17(1998)（非特許文献4）; Graham, F. L. et al., 36 J. GEN. VIROL. 59-74(1977)（非特許文献5）)。

一般的に、アデノウイルスゲノムは、30種類を超えるタンパク質をコードする配列を含む、約36kb長の線状二本鎖DNA分子からなる。各末端には、血清型に応じて、ITR(逆位末端配列)と名付けられた100〜150ヌクレオチドの短い逆配列が存在する。ITRはアデノウイルスゲノムの複製に関与している。約300ヌクレオチドのキャプシド形成領域が5'ITRの直後にあるゲノム5'末端に位置している。

初期遺伝子は、E1〜E4(Eは「初期(early)」を表している)と名付けられた、アデノウイルスゲノム内に分散した4つの領域に分布している。初期領域は少なくとも6個の転写単位を含み、これら転写単位はそれ自身のプロモーターを有する。初期遺伝子の発現は自己調節され、ある遺伝子は他の遺伝子より前に発現される。3つの領域、E1、E2およびE4は、それぞれ、ウイルス複製に必須である。従って、アデノウイルスのこれらの機能の1つに欠損があれば、すなわち、アデノウイルスが、これらの領域の1つがコードする少なくとも1つのタンパク質を産生できなければ、このタンパク質はアデノウイルスにトランスで供給しなければならない。

E1初期領域はアデノウイルスゲノムの5'末端に位置しており、2個のウイルス転写単位、それぞれ、E1AおよびE1Bを含有する。この領域は、ウイルスサイクルのかなり初期に関与し、アデノウイルスの他のほぼ全ての遺伝子の発現に必須のタンパク質をコードする。特に、E1A転写単位は、他のウイルス遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質をコードし、E1B、E2A、E2B、およびE4領域のプロモーターからの転写を誘導する。

Guilhot et al.(Guilhot, C. et al., 8 ONCOGENE : 619-24(1993)（非特許文献6）)によって、Ad5に由来するE1A 12Sタンパク質をレトロウイルスによって形質導入するとウズラ細胞が不死化することが示された。しかしながら、WO 2005/042728（特許文献3）は、レトロウイルス感染の代わりに裸のDNAのトランスフェクションによってE1A遺伝子が導入された時には、トリ細胞は不死化できないことを開示した。さらに、WO 2005/042728（特許文献3）は、「レトロウイルス感染による極めて効率的かつ安定した形質導入が、網膜芽細胞腫(Retinoblastoma)不活化の際に通常誘導されるアポトーシスをブロックする自然ゲノム変化のある細胞を有するのに十分大きな細胞プールを作り出す」と述べている(10頁)。

Guilhot et al.（非特許文献6）によって得られる細胞内のレトロウイルス配列の存在は、生物製剤、具体的には、治療用化合物を作製するために、このような細胞を用いることを妨げる。

米国特許第5,879,924号 WO 2005/007840 WO 2005/042728

Scholl et al., 3 J BIOMED BIOTECHNOL. 194-201 (2003) Ivanov et al. EXPERIMENTAL PATHOLOGY AND PARASITOLOGY, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences Ivanov et al. EXPERIMENTAL PATHOLOGY AND PARASITOLOGY, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences Fallaux,F. J. et al., 9 HUM. GENE THER. 1909-17(1998) Graham, F. L. et al., 36 J. GEN. VIROL. 59-74(1977) Guilhot, C. et al., 8 ONCOGENE : 619-24(1993)

発明の簡単な概要
驚いたことに、本発明者らは、非ウイルスベクターを用いたE1Aトランスフェクションによって、トリ細胞、具体的には、ノバリケン(cairina moschata)細胞を効率的に不死化できることを発見した。CEFの使用および/または以前は入手可能であった細胞株の使用に関連した様々な問題を解決するために、本発明は、E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞を提供する。前記細胞は、前記細胞を、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含むプロセスによって得られ、E1B核酸配列を含まないことを特徴とする。

本発明はまた、トリ細胞を不死化するためのプロセスであって、前記細胞を、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含み、前記細胞をE1B核酸配列でトランスフェクトする工程を含まないプロセスについて言及する。

本発明は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(European Collection of Cell Cultures)(ECACC)にアクセッション番号09070701、09070702、および09070703で寄託されたトリ不死化細胞株ならびにその派生株を含む。トリ不死化細胞は、欠損ウイルスの増殖を可能にする1つまたは複数の核酸配列をさらに含んでもよい。トリ不死化細胞は、関心対象の物質をコードする核酸をさらに含んでもよい。トリ不死化細胞株は、生ウイルス、弱毒化ウイルス、または組換えウイルスを含むウイルスの複製に使用することができる。トリ不死化細胞株を用いて複製しようとするウイルスは、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA))、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペルウイルス(herpervirus)、アルファウイルス、フォーミーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、フラビウイルス、およびインフルエンザウイルスでもよい。

本発明の他の特徴、局面、および利点は以下の詳細な説明に示される。

E1A核酸配列をコードする遺伝子を含むベクター。 HPRT遺伝子へのE1A核酸配列の部位特異的挿入の模式図。本発明のプロセスによって得られた不死化細胞のゲノムからの第1の選択マーカーおよび第3の選択マーカーの排除の模式図。ノバリケンテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子をコードする遺伝子およびE1A核酸配列を含むベクター。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070701(継代21)の光学顕微鏡イメージング。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702(継代24)の光学顕微鏡イメージング。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070703(継代28)の光学顕微鏡イメージング。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703の増殖曲線。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070703(図9A)、ECACC 09070701(図9B)、およびECACC 09070702(図9C)の集団倍加時間進化。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703における改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)の産生(MOI 0.05)。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702におけるVV-COPの産生。ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702におけるインフルエンザA/パナマ(Panama)/2007/99 H3N2ウイルス株の産生ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702におけるインフルエンザB/ブリスベン(Brisbane)/60/2008ウイルスの産生。

驚いたことに、本発明者らは、非ウイルスベクターを用いたE1Aトランスフェクションによって、トリ細胞、具体的には、ノバリケン細胞を効率的に不死化できることを発見した。

CEFの使用および/またはこれまでに利用可能な細胞株の使用に関連する様々な問題を解決するために、本発明は、トリ細胞を、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含む方法によって得られ、E1B核酸配列を含まないことを特徴とする、E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞を提供する。

本発明はまた、トリ細胞を、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含み、トリ細胞をE1B核酸配列でトランスフェクトする工程を含まない、トリ細胞を不死化する方法に関する。

本発明は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070701、09070702、および09070703で寄託されたトリ不死化細胞株ならびにその派生株を含む。トリ不死化細胞は、欠損ウイルスの増殖を可能にする1つまたは複数の核酸配列をさらに含んでもよい。トリ不死化細胞は、関心対象の物質をコードする核酸をさらに含んでもよい。トリ不死化細胞株は、生ウイルス、弱毒化ウイルス、または組換えウイルスを含むウイルスの複製に使用することができる。トリ不死化細胞株を用いて複製しようとするウイルスは、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA))、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペルウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、フラビウイルス、およびインフルエンザウイルスでもよい。

本明細書で使用する「不死化細胞」とは、35回超の継代培養で増殖することができる細胞を指す。

継代数という用語は、さらなる増殖を刺激するのに十分に低い密度に細胞を保つために、細胞集団が培養容器から取り出され、継代培養(継代)プロセスを受けた回数を指す。

本願全体を通じて用いられるように、「1つの(a)」および「1つの(an)」という用語は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り、「少なくとも1つの」、「少なくとも第1の」、「1つまたは複数の」、または「複数の」言及された成分または工程を指すという意味で用いられる。例えば、「1個の細胞」という用語は、複数の細胞を、その混合物を含めて含む。

「および/または」という用語は、本明細書のどこで用いられても、「および」、「または」、ならびに「これらの用語がつなぐ要素の全ての組み合わせ、もしくは他の任意の組み合わせ」の意味を含む。

本明細書で使用する「含む(comprising)」という用語は、生成物、組成物、および方法が、言及された成分または工程を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。「から本質的になる(consisting essentially of)」が、生成物、組成物、および方法を規定するときに用いられる時には、本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味するものとする。従って、記載された成分から本質的になる組成物は、微量の汚染物質および薬学的に許容される担体を排除しない。「からなる(consisting of)」は、他の成分または工程の非常に微量の要素を排除することを意味するものとする。

本明細書で使用する「E1A核酸配列」という用語は、2つの主要なRNAである13Sおよび12Sをコードする核酸配列を含む、アデノウイルスE1A領域の全ての遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。

好ましくは、「E1A核酸配列」という用語は、SEQ ID NO:1に対し少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を指す。本発明のより好ましい態様において、E1Aは、SEQ ID NO:1に対し少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を指す。さらに好ましい態様において、E1Aは、SEQ ID NO:1に示した核酸配列を指す。

本明細書で使用する「E1B核酸配列」という用語は、19kdおよび55kdの3つの主要なポリペプチドをコードする核酸配列を含めて、アデノウイルスE1B領域の全ての核酸配列を指す。

本明細書において使用する「実質的に同じ核酸配列」という用語は、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように、参照ポリヌクレオチドと十分な同一性を有する核酸分子を指す。1つの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO:1に示した参照ヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する。

ハイブリダイゼーションは、核酸の相補鎖(すなわち、センス:アンチセンス鎖またはプローブ:標的DNA)が、染色体DNAにおいて天然に起こる結合と同様に、水素結合を介して互いに結合することを指す。所定のプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションに用いられるストリンジェンシーレベルは、当業者によって容易に変更することができる。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という句は、ポリ核酸ハイブリッドが安定する条件を指すために本明細書において用いられる。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度(Tm)に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、低いストリンジェンシーの条件下で行われ、その後に、さらに高い様々なストリンジェンシーの洗浄が行われる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーについての言及は、このような洗浄条件に関連する。

本明細書で使用する「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という句は、標的DNAが、標的DNAと約60％の同一性、好ましくは約75％の同一性、より好ましくは約85％の同一性を有する相補核酸に結合する条件を指す。標的DNAとの同一性が約90％を超えることが特に好ましい。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、50％ホルムアミド、5xデンハルト液、5xSSPE、0.2％SDS中、42℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、0.2xSSPE、0.2％SDSによる65℃での洗浄に相当する条件である。

本明細書で使用する「非ウイルスベクター」という表現は、特に、プラスミド由来のベクターを指す。任意で、このようなベクターは、トランスフェクション効率、および/または前記ベクターの安定性、および/またはインビボでの宿主生物免疫系からの前記ベクターの保護を改善する1種類または複数の種類の物質と組み合わされる。これらの物質は、当業者が入手可能な文献において広く述べられている(例えば、Felgner et al., 32, PROC. WEST. PHARMACOL. SOC. 115-121 (1987); Hodgson and Solaiman, 14 NATURE BIOTECHNOLOGY 339-342 (1996); Remy et al., 5 BIOCONJUGATE CHEMISTRY 647-654 (1994)を参照されたい)。例示として、これらの物質は、ポリマー、脂質、特に、カチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質、または中性脂質でもよいが、それに限定されるわけではない。これらの物質は単独で、または組み合わせて使用することができる。このような化合物の例は、特に、WO98/08489、WO98/17693、WO98/34910、WO98/37916、WO98/53853、EP890362、またはWO99/05183において利用可能である。想定され得る組み合わせは、カチオン性脂質(DOGS、DC-CHOL、スペルミン-chol、スペルミジン-cholなど)および中性脂質(DOPE)と組み合わされたプラスミド組換えベクターである。

本発明の状況において使用することができるプラスミドの選択肢は膨大である。これらは、クローニングベクターおよび/または発現ベクターでもよい。一般的に、これらは当業者に公知であり、多くが市販されているが、遺伝子工学技法によって構築または改変することも可能である。例として、pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)、またはp Poly(Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)に由来するプラスミドについて述べることができる。好ましくは、本発明の状況において用いられるプラスミドは、産生細胞および/または宿主細胞における複製の開始を確実にする複製起点を含有する(例えば、大腸菌において産生されることが意図されるプラスミドの場合、ColE1起点が選択されてもよく、哺乳動物宿主細胞において自己複製することが望ましければ、oriP/EBNA1系が選択されてもよい。Lupton and Levine, 5 MOL. CELL. BIOL. 2533-2542 (1985); Yates et al., 313 NATURE 812-815 (1985))。プラスミドは、所定の細胞における維持および/または安定性を改善する、さらなる要素を含んでもよい(プラスミドの単量体維持を促進するcer配列(Summers and Sherrat, 36 CELL 1097-1103 (1984))、細胞ゲノムへの組み込むための配列)。

「非ウイルスベクター」という用語は、ウイルスベクター、例えば、ポックスウイルス(ワクシニアウイルス、特に、MVA、カナリアポックスなど)、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを排除する。

本発明はまた本発明の細胞に由来する細胞に関する。本明細書で使用する「由来する」という用語は、本発明の細胞から発生もしくは分化した細胞、または本発明の細胞を祖先として有する細胞を指す。

本明細書で使用する、「トランスフェクトされた」という用語は、本発明の細胞の安定トランスフェクションまたは一過的トランスフェクションを指す。

「安定トランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされる細胞のゲノムに外来核酸配列が導入および組み込まれたことを指す。「安定トランスフェクタント」という用語は、外来DNAがゲノムDNAに安定に組み込まれた細胞を指す。

本発明の好ましい態様によれば、本発明のトリ細胞は、カモ(Anatidae)科またはキジ(Phasianidae)科の細胞に由来する。カモ科の中で、ノバリケン(Cairina)属またはアナス(Anas)属に属する細胞が特に好ましい。さらにより好ましくは、本発明の細胞は、ノバリケンまたはマガモ(Anas platyrhynchos)種に属する。

好ましくは、本発明の細胞は胚性生物から採取される。生物から細胞を単離する方法は当業者に周知である。例えば、実施例2に開示される方法を使用することができる。本発明の好ましい態様によれば、0〜20日齢、より好ましくは5〜15日齢、さらにより好ましくは11〜14日齢のカモ科に属する胚から初代細胞が単離される。

本発明の好ましい態様によれば、E1A核酸配列は、本発明の細胞の標的DNA配列に挿入される。

本明細書で使用する「標的DNA配列」は、ベクターを用いた相同組換えによる改変の標的となる、細胞ゲノム内の予め決定された領域である。標的DNA配列には、構造遺伝子(すなわち、ポリペプチドをコードするDNA配列。真核生物の場合、イントロンおよびエキソンを含む)、調節配列、例えば、エンハンサー配列、プロモーターなど、および関心対象のゲノム内の他の領域が含まれる。標的DNA配列はまた、ベクターの標的となっている時に、宿主ゲノムの機能に影響を及ぼさない配列でもよい。

本明細書で使用する「標的DNA配列に挿入される」は、不死化遺伝子の挿入につながる相同組換えプロセスが、標的DNA配列に欠失を導入するか、または標的DNA配列を破壊することを広く意味している。

E1A核酸配列が標的DNA配列に挿入されたトリ不死化細胞を作製するために、本発明の方法において用いられるベクターは、細胞ゲノムのゲノムに天然にある標的DNA配列の領域との相同組換えが可能な2つの相同配列をさらに含んでもよい。

相同配列の存在は、相同組換えによって本発明の核酸分子を標的DNA配列に部位特異的に挿入するのを可能にする。

「相同組換え」という用語は、2つのDNA分子の、本質的に同一のヌクレオチド配列の部位間でのDNA断片の交換を指す。本発明のこの特定の態様によれば、ベクター内には、標的DNA配列の中に含まれる配列部分と相同の配列がある。本発明の好ましい態様において、トランスファーベクター内の相同配列は、標的配列の領域と100パーセント相同である。しかしながら、それより低い配列相同性を使用することができる。従って、約80％と低い配列相同性を使用することができる。

トランスファーベクター内の相同配列は少なくとも25bpからなる。少なくとも500bp、より好ましくは少なくとも5000bpの、さらに長い領域が好ましい。

本発明のより好ましい態様によれば、核酸分子はベクター内で相同配列に囲まれている。

本明細書で使用する「囲まれている」は、相同配列の1つが本発明の核酸分子の上流に位置し、相同配列の1つが本発明の核酸分子の下流に位置することを意味する。本明細書で使用する「囲まれている」は、2つの相同配列が不死化遺伝子の3'末端または5'末端に直接連結していることを必ずしも意味しない。不死化遺伝子および相同配列は、無制限の数のヌクレオチドによって分けることができる。

当業者であれば、不死化しようとする細胞のゲノムに特定のDNA配列を標的化するために、適切な相同配列を選択することができる。例えば、一方の相同配列は標的配列の一部と相同でもよく、他方の相同配列は標的配列の上流または下流に位置するDNA配列と相同である。別の例によれば、一方の相同配列は標的DNA配列の上流に位置するDNA配列と相同でもよく、他方の相同配列は標的DNA配列の下流に位置するDNA配列と相同である。別の例では、相同配列は両方とも、標的DNA配列の内部に位置する配列と相同である。

本発明の好ましい態様によれば、標的DNA配列は、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子である。

ノバリケンのHPRTプロモーターおよびHPRT遺伝子を含むゲノム配列をSEQ ID NO:2に示した。HPRTのコード配列は、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置8695にあるATGコドンから始まり、このATGコドンの上流にある配列がHPRTプロモーター配列である。

当業者であれば、E1A核酸配列をHPRT遺伝子に組み込むのに必要な相同配列を選択することができる。科の様々なメンバー間では、HPRTをコードするゲノム配列の相同性は高いので、当業者であれば、全てのトリ細胞のHPRT遺伝子を標的化するのに必要な相同配列を設計することもできる。

本発明のより好ましい態様によれば、相同配列は、細胞のHPRTプロモーターの下流にE1A核酸配列を挿入するようにカスタマイズされる。この特定の態様では、本発明の核酸は、細胞の内因性HPRTプロモーターと機能的に連結される。「機能的に連結された」は、E1A核酸配列が細胞内で発現するようにプロモーターと連結していることを意味することが意図される。

特定の態様によれば、本発明の核酸分子の上流にある相同配列は、好ましくは、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置1のヌクレオチドから位置8694のヌクレオチドまでの核酸配列の少なくとも500の連続したbp、より好ましくは少なくとも5000の連続したbpと相同の核酸配列を有する。但し、前記の相同配列は、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置8695のヌクレオチドから位置26916のヌクレオチドまでの核酸配列と相同でない。さらに、この上流相同配列は、好ましくは、E1A核酸配列の開始コドンと直接連結している。本発明のさらにより好ましい態様によれば、本発明の核酸分子の上流にある相同配列は、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置1のヌクレオチドから位置8694のヌクレオチドまでの核酸配列にある。E1A核酸配列の下流にある相同配列は、好ましくは、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置10580のヌクレオチドから位置18009のヌクレオチドまでの核酸配列の少なくとも500の連続したbp、より好ましくは少なくとも5000の連続したbpと相同の核酸配列を有する。より好ましくは、E1A核酸配列の下流にある相同配列は、SEQ ID NO:2に示した核酸配列の位置10580のヌクレオチドから位置18009のヌクレオチドまでの核酸配列にある。

従って、本発明はまた、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトリ細胞をトランスフェクトする工程を含む方法によって得られることを特徴とする、E1A核酸配列を含むトリ細胞に関する。前記細胞はE1B核酸配列を含まず、E1A核酸配列は、細胞の内因性HPRTプロモーターと機能的に連結される。

好ましい態様によれば、本発明の方法において用いられるベクターは第1の選択マーカーを含む。第1の選択マーカーは正の選択マーカーであり、この第1の選択マーカーはベクター内に含まれる相同配列に囲まれている。これに関して、ベクターと細胞ゲノムとの間で起こる相同組換えプロセスは、E1A核酸配列および第1の選択マーカーの組込みにつながる。トランスファーベクターが環状の場合、「囲まれている」は、第1の選択マーカーおよびE1A核酸配列がベクターの同じ区画に配置されており、この区画は相同配列によって区切られていることを意味する。

本明細書で使用する、正の選択マーカーという用語は、特に、ある特定の条件下で、遺伝子を担持する細胞のみが生存および/または増殖するのを可能にする産物をコードする遺伝子を指す。典型的な選択マーカーは、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補うタンパク質、または複合培地から利用できない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードする。本発明の好ましい態様において、第1の選択マーカーは、抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする。

第1の選択マーカーが組み込まれると、E1A核酸配列が組み込まれている細胞を選択できるようになる。従って、本発明の方法は、第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において、例えば、抗生物質を含む培地において、前記細胞を培養する工程をさらに含んでもよい。

本発明のより好ましい態様によれば、ベクター内の第1の選択マーカーは、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列に囲まれている。第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列は、E1A核酸配列を囲んでいない。ベクターが環状の場合、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列、第1の選択マーカー、およびE1A核酸配列は、トランスファーベクターの同じ区画に配置されており、この区画は相同配列によって区切られている。

核酸断片の抑制を可能にする配列は当業者に周知である(Nunes-Duby, S. et al 26 NUCLEIC ACIDS RES. 391-406 (1998))。これらの配列は、配列間に含まれる核酸の抑制を誘導する1つまたは複数の特定の酵素によって認識され、これらの酵素は「リコンビナーゼ」と呼ばれる。例えば、核酸断片の抑制を可能にする3つの周知のリコンビナーゼは、FLP、ISCE1、およびCreリコンビナーゼである。

典型的な部位特異的リコンビナーゼはCreリコンビナーゼである。Creは、バクテリオファージP1のcre(環化組換え)遺伝子の38kDa産物であり、Intファミリーの部位特異的DNAリコンビナーゼである。Sternberg, N. et al. 187 J. MOL. BIOL. 197-212 (1986)。Creは、loxP(P1のX-over遺伝子座)と呼ばれるP1ゲノム上にある34bp部位を認識し、一対のloxP部位の間での保存的DNA相互組換えを効率的に触媒する。loxP部位は、8bp非パリンドロームコア領域に隣接する2つの13bp逆方向反復からなる。2つの直接反復loxP部位間のCreを介した組換えによって、これらの部位の間にあるDNAが共有結合により閉じた環として切り出される。一対の逆方向loxP部位間のCreを介した組換えによって、間にあるDNAは切り出されるのではなく逆位になる。DNAの切断および接合はコア領域内の別々の位置に限定され、酵素による一過的なホホチロシンDNA-タンパク質結合を介して同時に鎖上で進行する。

別の部位特異的リコンビナーゼはI-SceIである。I-SceIの代わりに、他のイントロンホーミング(intron homing)エンドヌクレアーゼ、例えば、I-TliI、I-CeuI、I-CreI、I-PpoI、およびPI-PspIも本発明の方法において使用することができる。多くが、Belfort and Roberts(25 NUCLEIC ACIDS RESEARCH 3379-3388 (1997)に列挙されている。これらのエンドヌクレアーゼの多くは、コドン使用頻度が標準的な核コドン使用頻度とは異なる細胞小器官ゲノムに由来する。このような遺伝子を用いてエンドヌクレアーゼを核で発現させるためには、コード配列を核遺伝子に合うように変えることが必要な場合がある。I-SceIは、その認識部位内でDNAを切断する二本鎖エンドヌクレアーゼである。I-SceIは、3'OHオーバーハングを有する4bp付着末端切断を生じる。

酵素I-SceIは公知の認識部位を有する。I-SceIの認識部位は、18bpに及ぶ非対称配列である。
5' TAGGGATAACAGGGTAAT 3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA 5'

別の部位特異的リコンビナーゼはFLPリコンビナーゼである。Flpリコンビナーゼは、認識配列の限られた縮重のみを許容する特異な34bp最小部位を認識する(Jayaram, 82 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 5875-9 (1985); Senecoff et al., 201 J. MOL. BIOL. 405-21 (1988))。FlpリコンビナーゼとFRT配列との相互作用が調べられている(Panigrahi et al., 20 NUCLEIC ACIDS RES. 5927-35 (1992))。Jayaram (1985)およびSenecoff et al. (1988)によって、変異体FRT配列の例が示されており、Snaith et al. 180 GENE 225-7 (1996)によって、様々な基質に対するFlpを介した組換えのアッセイが述べられている。

従って、本発明の方法は、初代細胞ゲノムから第1の選択マーカーを抑制することを含む工程をさらに含んでもよい。第1の選択マーカーを抑制するために、細胞は、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列に特異的なリコンビナーゼをコードする遺伝子によってトランスフェクトされる。前記の遺伝子を細胞に導入することができる方法およびベクターは当業者に周知であり、例えば、本願の実施例4に開示される方法を使用することができる。以前に述べられているベクターも使用することができる。

好ましい態様によれば、本発明の方法において用いられるベクターは、相同配列に囲まれていない第2の選択マーカーを含む。第2の選択マーカーは負の選択マーカーである。本発明の方法において用いられるベクターが環状の場合、第2の選択マーカーは特に有用である。第2の選択マーカーが存在すると、相同組換えプロセスによって、E1A核酸配列を含まないトランスファーベクターの区画が導入された細胞を破壊することができる。ベクターが環状の場合、第2の選択マーカーが相同配列に囲まれていないということは、第2の選択マーカーおよびE1A核酸配列がトランスファーベクターの同じ区画に配置されておらず、この区画が相同配列によって区切られていることを意味する。

従って、本発明の方法は、第2の選択マーカーが組み込まれていない細胞のみを増殖させる培地において細胞を培養する工程をさらに含んでもよい。前記の工程は、第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において、初代細胞を培養する工程と同時に、または別々に行われてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、ベクターは第3の選択マーカーを含む。第3の選択マーカーは負の選択マーカーであり、この第3の選択マーカーは第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間に位置する。このことは、第1の選択マーカーの抑制にある工程が第3の選択マーカーの抑制にもつながることを意味している。第3の選択マーカーの存在は、第1の選択マーカーが存在する細胞の破壊を可能にする。ベクターが環状の場合、第3の選択マーカーが、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間に位置しているということは、第3の選択マーカーおよび第1の選択マーカーがトランスファーベクターの同じ区画に配置されており、この区画が、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列によって区切られていることを意味する。

本明細書で使用する、負の選択マーカーという用語は、特に、ある特定の条件下で、遺伝子を担持する細胞を死滅させる産物をコードする遺伝子を指す。これらの遺伝子は、特に、「自殺遺伝子」を含む。これらの遺伝子によってコードされる産物は、プロドラッグを細胞傷害性化合物に変えることができる。非常に多くの自殺遺伝子/プロドラッグ対が現在利用可能である。具体的には、以下の対について述べることができる。
-単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-1 TK)およびアシクロビルまたはガンシクロビル(GCV)(Caruso et al., 90 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 7024-7028 (1993); Culver et al., 256 SCIENCE 1550-1552 (1992); Ram et al., 3 NAT. MED. 1354-1361 (1997))
-チトクロムp450およびシクロホスホファミド(Wei et al., 5 HUMAN GENE THERAPY 969-978 (1994))
-大腸菌(E.coli)由来プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび6-メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1 GENE THERAPY 233-238 (1994))
-大腸菌由来グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよび6-チオキサンチン(MzozおよびMoolten, 4 HUMAN GENE THERAPY 589-595 (1993))
-シトシンデアミナーゼ(CDase)および5-フルオロシトシン(5FC)
-FCU1および5-フルオロ-シトシン(5FC)(WO 99/54481)
-FCU1-8および5-フルオロ-シトシン(5FC)(WO 2005/007857)

第3の選択マーカーは、第1の選択マーカーが抑制されている細胞の選択を可能にする。従って、本発明の方法は、第3の選択マーカーを含む細胞を増殖させない培地において、前記の細胞を培養する工程をさらに含んでもよい。例えば、第3の選択マーカーとしてFCU1を含む細胞を増殖させない培地は、5-フルオロシトシンを含む。

第1の選択マーカー、第2の選択マーカー、および第3の選択マーカーは別々に使用することができる。例えば、本発明の方法において用いられるベクターは、第1の選択マーカーおよび第3の選択マーカーを含むが、第2の選択マーカーを含まなくてもよく、第2の選択マーカーおよび第3の選択マーカーを含むが、第1の選択マーカーを含まなくてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、E1A核酸配列、第1の選択マーカー、第2の選択マーカー、および/または第3の選択マーカーは、不死化しようとする細胞において、これらを発現するのに必要なエレメントの制御下に配置される。

発現に必要なエレメントは、ヌクレオチド配列からRNAへの転写およびmRNAからポリペプチドへの翻訳を可能にするエレメント、特に、前記細胞において有効なプロモーター配列および/または調節配列、任意で、前記ポリペプチドの排出または標的細胞表面での発現に必要な配列のセットからなる。これらのエレメントは調節可能なエレメントでもよく、構成的なエレメントでもよい。もちろん、プロモーターは、選択されたベクターおよび宿主細胞に適合される。例として、遺伝子PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、MT(メタロチオネイン; Mclvor et al., 7 MOL. CELL BIOL. 838-848 (1987))、α-1アンチトリプシン、CFTRの真核生物プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ、アクチン肺表面活性物質、免疫グロブリン、またはβ-アクチン(Tabin et al., 2 MOL. CELL BIOL. 416-436 (1982))、SRα(Takebe et al., 8 MOL. CELL. 466-472 (1988))をコードする遺伝子のプロモーター、SV40ウイルス(シミアンウイルス)初期プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTR、MPSVプロモーター、TK-HSV-1プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーターについて言及することができる。CMV初期プロモーターが最も特に好ましい。

本発明は、具体的には、以下の工程を含む細胞を不死化する方法に関するが、これに限定されない。
- 相同配列に囲まれているE1A核酸配列、
- 正の選択マーカーであり、前記相同配列に囲まれている、第1の選択マーカー、
- 第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列、
- 負の選択マーカーであり、前記相同配列に囲まれていない、第2の選択マーカー、
- 負の選択マーカーであり、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間にある、第3の選択マーカー
を含むベクターを、トリ細胞に導入する工程；
第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において、前記細胞を培養する工程；
第2の選択マーカーが組み込まれている細胞を増殖させない培地において、前記細胞を培養する工程；
前記細胞のゲノムから第1の選択マーカーを排除する工程；
第3の選択マーカーを含む細胞を増殖させない培地において、前記細胞を培養する工程。

特定の態様によれば、本発明はまた、SEQ ID NO:1に示したE1A核酸配列およびSEQ ID NO:3に示した組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列を含むトリ不死化細胞株であって、以下:
ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070701で寄託されたトリ不死化細胞株、
ECACCにアクセッション番号09070702で寄託されたトリ不死化細胞株、
ECACCにアクセッション番号09070703で寄託されたトリ不死化細胞株、および
その派生株
からなる群において選択されるトリ不死化細胞株に関する。

本発明の寄託されたノバリケントリ不死化細胞株の派生株は、例えば、
-前記の寄託されたノバリケントリ不死化細胞株(ECACC 09070701、ECACC 09070702、またはECACC 09070703)のサブクローニング;
-特定の培地(例えば、懸濁状態で細胞株の増殖を可能にする培地)および/または特定の培養条件(例えば、温度;％CO₂)への、前記の寄託されたノバリケントリ不死化細胞株(ECACC 09070701、ECACC 09070702またはECACC 09070703)の順応;
-非フコシル化タンパク質、特に、非フコシル化抗体を産生するための、糖類フコース修飾に関与する1つまたは複数のノバリケン遺伝子(HARUE IMAI-NISHIYA et al., BMC BIOTECHNOLOGY(2007))の欠失または変異。好ましい態様によれば、寄託されたノバリケントリ不死化細胞株の前記派生株は、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)および/またはGDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子の欠失または変異によって得られる;
-細胞株の免疫応答を弱めるための、インターフェロン耐性に関与する1つまたは複数のノバリケン遺伝子の欠失または変異。好ましい態様によれば、寄託されたノバリケントリ不死化細胞株の前記派生株は、STAT1遺伝子、STAT2遺伝子、STAT3遺伝子、およびSTAT5遺伝子からなる群において選択される遺伝子の欠失または変異によって得られる;
-培養条件に対する細胞株の耐性を高めるための、特に、コンフルエンスを維持するために培養条件に対する細胞株の耐性を高めるための、1つもしくは複数のノバリケン抗アポトーシス遺伝子の過剰発現または1つもしくは複数の外因性抗アポトーシス遺伝子を用いた形質転換。好ましい態様によれば、抗アポトーシス遺伝子は、p19E1Bヒトアデノウイルス遺伝子、bcl-2遺伝子、mcl-1遺伝子、Bcl-xL遺伝子、Bcl-w遺伝子、a1遺伝子、ICP34.5単純ヘルペスウイルス遺伝子、およびp35バキュロウイルス遺伝子からなる群において選択される;
-増殖速度を速めるのに適したベクターを用いた、細胞周期制御に関与する1つまたは複数のノバリケン遺伝子の過剰発現。好ましい態様によれば、細胞周期制御に関与する前記遺伝子は、p53遺伝子、p21遺伝子、p27遺伝子、およびp57遺伝子からなる群において選択される;
-これらのウイルスを増やすことを目的とした、関心対象のウイルスの受容体をコードする1つまたは複数の遺伝子を用いた形質転換による細胞株のウイルス感受性スペクトルの改変。好ましい態様によれば、関心対象のウイルスの受容体をコードする前記遺伝子は、はしかウイルスCD46受容体をコードする遺伝子である
によって得られた、寄託された細胞から得られたノバリケントリ不死化細胞株を指す。

本発明の細胞は、欠損ウイルスの増殖を可能にする1つまたは複数の核酸配列をさらに含んでもよい。「欠損ウイルス」は、ウイルスの複製に必要な1つまたは複数のウイルス遺伝子が欠失しているか、または機能しないウイルスを指す。「欠損ウイルスの増殖を可能にする核酸配列」という用語は、欠損ウイルスの複製を可能にする機能をトランスで供給する核酸配列を指す。言い換えると、この核酸配列は、欠損ウイルスの複製およびキャプシド形成に必要なタンパク質をコードする。

本発明の細胞はまた、関心対象の物質をコードする核酸配列を含んでもよい。本明細書で使用する関心対象の物質には、薬学的に活性なタンパク質、例えば、増殖因子、増殖制御因子、抗体、抗原、その免疫化もしくはワクチン接種などに有用な誘導体、インターロイキン、インシュリン、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSFもしくはその組み合わせ、インターフェロン、例えば、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、血液凝固因子、例えば、第VIII因子、第IX因子、もしくはtPAまたはその組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。「関心対象の物質」はまた、産業用酵素、例えば、パルプおよび紙、織物の改良、またはエタノール製造に用いられる産業用酵素も指す。最後に、「関心対象の物質」はまた、動物飼料用のタンパク質補助剤または付加価値製品も指す。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の細胞はまた、組換えテロメラーゼ逆転写酵素、より好ましくは、EP-06360047.2に記載の組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む。EP-06360047.2に記載の、本発明の好ましい態様において、組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列は、EP-06360047.2のSEQ ID NO:2に示した核酸配列に対し少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の核酸配列同一性を有する。EP-06360047.2に記載の組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする好ましい核酸配列は、EP-06360047.2のSEQ ID NO:2に示されている。EP-06360047.2に記載のテロメラーゼ逆転写酵素の核酸配列SEQ ID NO:2は、本発明のテロメラーゼ逆転写酵素の核酸配列SEQ ID NO:3に対応する。結果として、本発明の好ましい態様によれば、本発明の細胞はまた、組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列、より好ましくは、SEQ ID NO:3に対し少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の核酸配列同一性を有する組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列も含む。より好ましくは、組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列は、SEQ ID NO:3に示されている(dTERT)。

本発明の方法によって得られる細胞、本発明の細胞、およびこれに由来する細胞は、ウイルスの複製に特に有用である。前記ウイルスは生きていてもよく、弱毒化されてもよく、組換えでもよく、そうでなくてもよい。より好ましくは、前記細胞は、ポックスウイルス(ワクシニアウイルス、特に、MVA、カナリアポックスウイルスなど)、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、フラビウイルス、またはインフルエンザウイルスの複製に特に有用である。

レトロウイルスは、分裂細胞に感染し、多くの場合、分裂細胞に組み込むという特性を有し、これに関して、癌に関連する使用に特に適している。組換えレトロウイルスは、一般的に、LTR配列、キャプシド形成領域、および本発明のヌクレオチド配列を含有し、本発明のヌクレオチド配列はレトロウイルスLTRまたは内部プロモーター、例えば、下記のものの制御下に配置される。レトロウイルスベクターは、改変、特に、LTRの改変(プロモーター領域の真核生物プロモーターへの置換)またはキャプシド形成領域の改変(異種キャプシド形成領域、例えば、VL30型への置換)(FR-9408300およびFR-9705203を参照されたい)を含有してもよい。

アデノウイルスベクターは、複製に必須であり、かつE1、E2、E4、およびL1 L5領域より選択される少なくとも1つの領域の全てまたは一部を欠いてもよい。E1領域の欠失が好ましい。しかしながら、これは、他の改変/欠失、特に、E2、E4および/またはL1 L5領域の全てまたは一部に影響を及ぼす他の改変/欠失と組み合わせることができる。例示として、E1領域およびE4転写単位の主要部の欠失が特に有利である。クローニング能を高めるために、アデノウイルスベクターは非必須E3領域の全てまたは一部をさらに欠いてもよい。別の選択肢によれば、キャプシド形成に必須の配列、すなわち、5'ITR(逆位末端配列)および3'ITRならびにキャプシド形成領域を保持している最小アデノウイルスベクターを使用することが可能である。様々なアデノウイルスベクターおよびこれらを調製する技法が公知である(例えば、Graham and Prevect, 7 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY 109-128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc (1991)を参照されたい)。

ポックスウイルスファミリーは、コードポックスウイルス(Chordopoxvirus)およびエントモポックスウイルス(Entomopoxvirus)亜科のウイルスを含む。これらのうち、本発明におけるポックスウイルスは、好ましくは、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス(Parapoxvirus)、トリポックスウイルス(Avipoxvirus)、カプリポックスウイルス(Capripoxvirus)、レポリポックスウイルス(Leporipoxvirus)、スイポックスウイルス(Suipoxvirus)、モルシポックスウイルス(Molluscipoxvirus)、およびヤタポックスウイルス(Yatapoxvirus)を含む群より選択される。より好ましい態様によれば、本発明のポックスウイルスはオルトポックスウイルスである。様々なポックスウイルス科(Poxiviridae)のゲノム配列が本技術分野において入手可能であり、例えば、VVウエスタンリザーブ、VVコペンハーゲン（VV-COP; GOEBEL et al. (1990)）、改変ワクシニアウイルスアンカラ、ウシポックスウイルス（Cowpoxvirus）、カナリアポックスウイルス（Canarypoxvirus）、エクトロメリアウイルス（Ectromelia virus）、粘液腫ウイルス（Myxoma virus）のゲノムがGenbankにて入手可能である（それぞれアクセッション番号NC_006998、M35027、U94848、NC_003663、NC_005309、NC_004105、NC_001132）。オルトポックスウイルスは、好ましくは、ワクシニアウイルスであり、より好ましくは、改変ワクシニアウイルスアンカラ株(MVA)、特に、MVA 575(ECACC V00120707)およびMVA-BN(ECACC V00083008)である。

「組換えウイルス」という用語は、外因性配列がゲノムに挿入されているウイルスを指す。本明細書で使用する、外因性配列は、親ウイルスに天然には存在しない核酸を指す。

1つの態様において、外因性配列は、直接的または間接的な細胞傷害機能を有する分子をコードする。「直接的または間接的な」細胞傷害性とは、外因性配列によってコードされる分子それ自体が毒性であってもよく(例えば、リシン、腫瘍壊死因子、インターロイキン-2、インターフェロン-γ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、シュードモナス属(Pseudomonas)エキソトキシンA)、外因性配列によってコードされる分子が代謝されて毒性産物を形成してもよく、何か他のものに作用して毒性産物を形成してもよいことを意味する。リシンcDNAの配列は、参照により本明細書に組み入れられる、Lamb et al (148 EUR. J. BIOCHEM. 265-270 (1985))に開示される。

本発明の好ましい態様において、外因性配列は自殺遺伝子である。自殺遺伝子は、比較的毒性のないプロドラッグを毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする。例えば、酵素シトシンデアミナーゼは、5-フルオロシトシン(5FC)を5-フルオロウラシル(5FU)に変換し(Mullen et al. 89 PNAS 33 (1922))、単純ヘルペス酵素チミジンキナーゼは、抗ウイルス剤ガンシクロビル(GCV)またはアシクロビルによる処理に対して細胞を感受性にする(Moolten 46 CANCER RES. 5276 (1986); Ezzedine et al 3 NEW BIOL 608 (1991))。どの生物、例えば、大腸菌またはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のシトシンデアミナーゼも使用することができる。

従って、本発明のさらに好ましい態様において、遺伝子は、シトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードし、さらにより好ましくは、WO 2005/007857およびWO 99/54481に記載のタンパク質をコードする。

さらなる態様において、外因性遺伝子は、標的のRNAまたはDNAを切断することができるリボザイムをコードする。切断しようとする標的のRNAまたはDNAは、細胞の機能に必須のRNAまたはDNAでもよく、切断されると細胞死が起こる。または、切断しようとするRNAまたはDNAは、望ましくないタンパク質、例えば、癌遺伝子産物をコードするRNAまたはDNAでもよく、このRNAまたはDNAが切断されると細胞が癌化しないようにすることができる。

なおさらなる態様において、外因性遺伝子はアンチセンスRNAをコードする。

「アンチセンスRNA」とは、本発明者らは、タンパク質をコードするmRNA分子または細胞内の別のRNA分子、例えば、pre-mRNAもしくはtRNAもしくはrRNAにハイブリダイズし、これらからの発現を妨害するか、あるいは遺伝子にハイブリダイズし、遺伝子からの発現を妨害するRNA分子を意味する。

本発明の別の態様において、外因性配列は、標的細胞内の欠損遺伝子の機能に取って代わる。ヒトを含めて哺乳動物には、欠損遺伝子によって引き起こされる数千種類の遺伝病がある。このような遺伝病の例には、CFTR遺伝子の変異であることが知られている嚢胞性線維症;ジストロフィン遺伝子の変異であることが知られているデュシェンヌ型筋ジストロフィー;HbA遺伝子の変異であることが知られている鎌状赤血球症が含まれる。多くのタイプの癌が、欠損遺伝子、特に、変異を起こした癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子によって引き起こされる。

癌原遺伝子の例は、ras、src、bclなどである。腫瘍抑制遺伝子の例はp53およびRbである。

本発明のさらなる態様において、外因性配列は腫瘍関連抗原(TAA)をコードする。TAAは、同じ組織タイプの非腫瘍細胞より高い頻度または密度で腫瘍細胞において検出される分子を指す。TAAの例には、CEA、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、MUC-1、MUC-2、点変異ras癌遺伝子、正常p53または点変異p53、過剰発現p53、CA-125、PSA、C-erb/B2、BRCAI、BRCAII、PSMA、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、survivinおよびLRPが含まれるが、これに限定されない。より好ましい態様によれば、TAAはMUC1である。

組換えウイルスは複数の外因性配列を含んでもよく、各外因性配列は複数の分子をコードしてもよい。例えば、同じ組換えポックスウイルスの中で、TAAをコードする外因性配列とサイトカインをコードする外因性配列を結合することが有用な場合がある。

本発明の別の態様において、外因性遺伝子は抗原をコードする。本明細書で使用する「抗原」は、抗体が結合できるリガンドを指す。抗原それ自体に免疫原性がある必要はない。

好ましくは、抗原は以下に由来する：ウイルス、例えば、HIV-1(例えば、gp120もしくはgp160)、任意のネコ免疫不全症ウイルス、ヒトもしくは動物のヘルペスウイルス、例えば、gDもしくはその誘導体、または最初期タンパク質、例えば、HSV1もしくはHSV2に由来するICP27、サイトメガロウイルス(例えば、gBもしくはその誘導体)、水痘帯状疱疹ウイルス(例えば、gpI、II、もしくはIII)、または肝炎ウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス、例えば、B型肝炎表面抗原もしくはその誘導体、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス(優先的に、遺伝子型1b株、例えばJA株に由来する非構造タンパク質)、およびE型肝炎ウイルス、または他のウイルス病原体、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス(優先的に、HPV16株に由来するE6およびE7タンパク質)、またはインフルエンザウイルス、あるいは細菌病原体、例えば、サルモネラ属(Salmonella)、ナイセリア属(Neisseria)、ボレリア属(Borrelia)(例えばOspAもしくはOspBもしくはその誘導体)、またはクラミジア属(Chlamydia)、またはボルデテラ属(Bordetella)、例えば、P.69、PTおよびFHA、あるいは寄生生物、例えば、プラスモジウム属(Plasmodium)またはトキソプラズマ属(Toxoplasma)。

さらに、本発明は、ウイルスおよびタンパク質を含む生物製剤の産生および関連方法のための、前記の寄託されたノバリケントリ不死化細胞株(ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703)のいずれか、ならびにその任意の派生株の使用に関する。

1つの態様によれば、本発明は、ウイルスを産生するための方法であって、前記トリ不死化細胞株に、産生しようとするウイルスを感染させる工程;前記感染細胞株を、ウイルス増幅が可能な条件下で培養する工程;および産生されたウイルスを回収する工程を含む方法に関する。前記トリ不死化細胞株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070701で寄託された不死化細胞株、ECACCにアクセッション番号09070702で寄託された不死化細胞株、およびECACCにアクセッション番号09070703で寄託された不死化細胞株、ならびにその派生株からなる群において選択される。前記方法はまた、回収されたウイルスの精製などの、さらなる工程を含んでもよい。

好ましい態様において、産生しようとするウイルスは、ポックスウイルス科またはインフルエンザウイルスである。前記ポックスウイルス科は、好ましくは、ワクシニアウイルスコペンハーゲン(Copenhagen)株(VV-COP)および改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)からなる群より選択されるオルトポックスウイルス属である。前記インフルエンザウイルスは、好ましくはA型またはB型である。

本発明の好ましい方法において、不死化細胞株に30℃〜37℃の温度、より好ましくは37℃で感染させる。感染は、増幅工程の間に後で用いられる培地と同じでもよく、または増幅工程の間に後で用いられる培地とは異なってもよい適切な細胞培地中で行われる。適切な培養培地には、例えば、血清(例えば、ウシ胎児血清(FCS))および/またはアミノ酸(例えば、L-グルタミン)を任意で添加してもよい、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM, Invitrogen)またはイーグル基礎培地(BME, Invitrogen)が含まれる。細胞培地はまた、動物製品を含まない培地でもよい。動物製品を含まない多くの培地が既に説明されており、これらの一部、例えば、293 SFM II;293-F Cells, SFM Adapted;293-H Cells, SFM Adapted;293fectin(商標)Transfection Reagent;CD 293 AGT(商標);CD 293 Medium;FreeStyle(商標)293 Expression System;Freestyle(商標)293 Medium;FreeStyle(商標)293-F Cells, SFM Adapted;VP-SFM;VP-SFM AGT(商標); Adenovirus Expression Medium (AEM) Growth Medium for PER.C6(登録商標)Cells;CD 293 AGT(商標);CD 293 Medium;SFM Adapted;EPISERF(登録商標)Medium;OptiPro(登録商標)SFM(全てInvitrogenから入手可能)は市販されている。

次いで、感染細胞株を、ウイルス増幅が可能な条件下で培養する。ウイルス増幅とは、ウイルスゲノムが転写され、ウイルスタンパク質に翻訳され、感染性ウイルス粒子の中にパッケージングされることを意味する。好ましくは、感染したら、感染細胞株を1〜7日間培養する。感染細胞株を、担体の存在下または非存在下で、表面への付着細胞として培養してもよく、懸濁培養してもよい。細胞培養は、例えば、ディッシュ、ローラーボトルの中で、またはバッチ、フェドバッチ、連続システム、中空糸などを用いたバイオリアクターの中で行われてもよい。

次いで、産生されたウイルスを上清および/または細胞から回収する。産生されたウイルスが細胞から(すなわち、細胞のみから、または細胞から、および上清から)回収された時に、産生されたウイルスを回収する工程は細胞膜を破壊する工程を含んでもよい。この工程によって細胞からウイルスが遊離される。細胞膜の破壊は当業者に周知の様々な技法によって誘導することができる。これらの技法は、凍結/融解、低浸透圧による溶解、界面活性剤による溶解、(ソニケーターを用いた)超音波処理、および(マイクロフルイダイザーを用いた)マイクロフルイダイゼーションを含むが、これに限定されない。ソニケーターは、例えば、Heraeus PSP、Biologics、Misonix、またはGlenMillsから市販されている。本発明に従って用いられる好ましいソニケーターは、SONITUBE 20kHzタイプSM 20-120-3およびSONITUBE 35kHzタイプSM 35-400-3 (Heraeus PSP)である。マイクロフルイダイザーは、例えば、Microfluidics Corporationから市販されている。トリ細胞膜は、SLM Amincoフレンチプレスを用いて破壊することもできる。細胞膜は、高速ホモジナイザーを用いて破壊することもできる。高速ホモジナイザーは、例えば、Silverson MachinesまたはIka-Labotechnikから市販されている。

本発明の特定の態様によれば、回収されたウイルスを精製することができる。産生されたウイルスの精製は、例えば、以下の工程:例えば、適切な条件下で細胞破片の除去を可能にする清澄化工程(清澄化は、例えば、深層濾過によって行うことができる)、例えば、精密濾過もしくは限外濾過によって行うことができる濃縮工程、および/または例えば、イオン交換吸着剤、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイトなどを使用し、陰イオン交換が特に好ましいクロマトグラフィー工程の1つまたは複数を、このような工程の順序がどのようなものでも含んでもよい。陰イオン交換吸着剤の官能基は、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、または四級アミノ基、例えば、ジメチルアミノエチル(DMAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、トリメチルアミノエチル(TMAE)、トリエチルアミノエチル(TEAE)、基-R-CH(OH)-CH₂-N+-(CH₃)₃(Q基とも呼ばれる;Streamline(登録商標)樹脂,Pharmaciaを参照されたい)でもよい。

本発明はまた、オルトポックスウイルス属を産生するための方法であって、(a)本発明のトリ不死化細胞株にオルトポックスウイルス属を感染させる工程;(b)感染トリ細胞株を、ウイルス増幅が可能な条件下で培養する工程;(c)培養上清および/またはパッケージング細胞から前記オルトポックスウイルス属を回収する工程;ならびに(d)任意で、回収されたオルトポックスウイルス属を精製する工程を含む方法に関する。

実施例4および実施例5に記載のように、本発明のトリ細胞株を用いたオルトポックスウイルス属の産生に用いられる好ましい細胞培地は、FCSおよびL-グルタミンを添加したBME(Invitrogen)である。感染は好ましくは低MOIで行われ、MOIは好ましくは約0.0001〜0.1である。特に、産生されるポックスウイルス科がVV-COPである場合、MOIは、より好ましくは、実施例5に記載のように約0.0001である。産生されるポックスウイルス科がMVAである場合、MOIは、より好ましくは、実施例4に記載のように約0.05である。好ましくは、オルトポックスウイルス属を回収する前に、感染細胞は1種類または複数種のヌクレアーゼの存在下でインキュベートされる。ヌクレアーゼ活性を阻害するために、回収されたオルトポックスウイルス属に一価塩を適切な条件下で添加する。次いで、当技術分野において公知の任意の方法に従って、例えば、クロマトグラフィー法、特に、陰イオン交換クロマトグラフィーと清澄化、ダイアフィルトレーションなどによって、産生されたオルトポックスウイルス属を精製することができる。

本発明はまた、インフルエンザウイルスを産生するための方法であって、(a)トリ不死化細胞株にインフルエンザウイルスを感染させる工程;(b)感染トリ細胞株を、ウイルス増幅が可能な条件下で培養する工程;(c)培養上清および/またはパッケージング細胞から前記インフルエンザウイルスを回収する工程;(d)任意で、回収された前記インフルエンザウイルスを精製する工程を含む方法に関する。

前記インフルエンザウイルス(インフルエンザ(Flu)ウイルスとも呼ばれる)は、任意の型(例えば、A、B、またはC)および任意のサブタイプでよい。「インフルエンザA型ウイルスのサブタイプ」は、可能性のあるHAタンパク質およびNAタンパク質の異なる組み合わせを含む。インフルエンザA型ウイルスでは、19種類のNAタンパク質(H1〜H15に分類される)および9種類のNAタンパク質(N1〜N9に分類される)が特定されている。例として、インフルエンザA型ウイルスのサブタイプは、H1N1ウイルス、H1N2ウイルス、H3N2ウイルス、H3N8ウイルス、H5N1ウイルス、H7N2ウイルス、H7N3ウイルス、H7N7ウイルス、およびH9N2ウイルスでもよい。インフルエンザウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関するさらなる情報は、公的にアクセス可能な遺伝子データベース、例えば、www.flugenome.org/から入手することができる。インフルエンザA型ウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関するさらなる情報もまた、公的にアクセス可能な遺伝子データベース、例えば、GenBank、EMBL、またはLANL:例えば、J02144;J02146;J02148;J02151;V00603;V01099;V01104;V01106から入手することができる。インフルエンザB型ウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関するさらなる情報もまた、公的にアクセス可能な遺伝子データベース、例えば、GenBank、EMBL、またはLANL:例えば、J02094;J02095;J02096;K00423;K01395;M20168;M20170;M20172から入手することができる。インフルエンザC型ウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関するさらなる情報もまた、公的にアクセス可能な遺伝子データベース、例えば、GenBank、EMBL、またはLANL:例えば、K01689;M10087;M17700から入手することができる。弱毒インフルエンザウイルスワクチンに関するさらなる情報は、HICKLING J.(A review of production for influenza virus vaccines, and their suitability for deployment in developing countries for influenza pandemic preparedness, Initiative for vaccine research, World Health Organisation(WHO)(2006);www.who.int/vaccine)およびRUDENKO L.G. et al.(Vaccine 19(2-3), 308-318(2000))において見られる。低温適応性および温度感受性の弱毒インフルエンザウイルスワクチン、例えば、FluMist(登録商標)(MedImmune Vaccines)に関するさらなる情報は、GLEZEN W.(Expert Rev. Vaccines 3(2):131-9(2004))において見られる。

実施例6は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号070970702で寄託された細胞株からインフルエンザウイルスを産生するための好ましい方法について述べている。

本発明およびその利点をさらに例示するために、以下の具体例が示されるが、例示にすぎず、限定を目的としないことが理解される。以下の実施例では、全ての部およびパーセントは特に定めのない限り重量によって示される。

実施例1:E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞株の樹立
A. プラスミド構築物
A-1. ランダム挿入用のプラスミド構築物
この目的のために、ノバリケンゲノムと相同性のある特定の配列を共有しないプラスミド(プラスミドE1A)を使用した(図1)。

A-2. 標的挿入用のプラスミド構築物
E1A核酸配列(SEQ ID NO:1) および2つの選択マーカーを取り囲むノバリケンHPRT遺伝子と相同な2つの5kb断片を含むプラスミドを構築した。E1A核酸配列の構成的発現に適した部位として、ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼをコードするHPRT遺伝子を選択した。

これらの2つの選択マーカーは、CMVプロモーター(Thomsen et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA..81. 3:659-631984)の制御下にあるFCU1遺伝子(Erbs et al. Cancer Res. 2000. 15. 60. :3813-22)、およびSV40プロモーターの制御下に配置されたネオマイシン(またはピューロマイシン)耐性遺伝子である。ネオマイシン(またはピューロマイシン)耐性およびFCU-1発現カセットは、最終細胞株からの選択カセットの排除を可能にするSce1切断部位に囲まれている。HPRT遺伝子アームの外側には、RSVプロモーターによって駆動される、HSVTKをコードする選択マーカーが挿入されている(図2)。

B. ノバリケン卵からのCECバッチの調製および亜集団の説明
B.1 12齢ノバリケン卵からのCECバッチの調製および亜集団の説明
25個のSPF受精卵を37.5℃で保温する。利用可能なプロトコールに従って、卵を12日間保温した後に、卵を開ける。

23個の胚を切り刻み、リン酸緩衝食塩水-ダルベッコ(PBS)で1回洗浄し、TrypLE Select(Invitrogen)に入れて室温で5時間分離する。

低速遠心分離の後に、細胞を、10％ウシ胎児血清(FCS)、ゲンタマイシン0.04g/Lを添加したイーグル基本培地(MBE)に再懸濁し、500cm²トリプルフラスコに播種し、37℃、5％CO₂でインキュベートする。

24時間後に、TrypLE Select(5mL/トリプルフラスコ)を用いて、コンフルエントの細胞をフラスコから取り出し、2回目の継代のために、細胞の一部を175cm²フラスコに再播種した。残っている細胞を、適切な培地(60％ BME、30％ FCS、および10％ DMSO)に入れて10⁷細胞/mLに濃縮し、イソプロピルアルコールによって調整された容器(NALGENE(登録商標)「Mr.Frosty」1℃凍結容器)に入れて-80℃で凍結した後に、長期保管のために液体窒素の中に移した。これは、最初の細胞バンク(1.5x10⁷細胞/バイアルが50本, 1x10⁷細胞/バイアルが44本)を構成する。

培養状態で残っている細胞を18継代まで古典的に継代する。最初の3回の継代の間、付着しなかった細胞を、条件培地を低速遠心分離することによって収集し、再播種し、最初の培養と同様にさらに継代する。

特徴的な異なる形態学的特徴を示す亜集団が、培養物の寿命中に、再現性よく単離された。

B.2.19齢ノバリケン卵からのCECバッチの調製および亜集団の説明
AFFSSA Ploufraganから入手した、29個のSPFノバリケン受精卵を、湿度の高い雰囲気中で37.5℃で保温する。

19日後に卵を開け、胚を滅菌抽出する。20個の胚を断頭し、四肢を取り除き、他の細胞調製のために肝臓を使用する。胚の胴体を切り刻み、PBSダルベッコ(Sigma, Ref. D8537, Lot 46K2428)で1回洗浄し、500mLのTrypLE Select(Gibco, Ref. 12563, Lots 1319986および1339844)に入れて37℃で2時間分離する。

2000rpmで5分間遠心分離した後、細胞を、10％ウシ胎児血清(JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, Code TG P4001 Q)、ゲンタマイシン0.04g/L、およびL-グルタミン4mMを添加したBME(イーグル基本培地, Gibco, Ref. 41010, Lot 8270)に再懸濁する。最終体積1.5L(1.9x10⁶細胞/mL)の懸濁液を10個のトリプルフラスコ(500cm²)に播種し、37℃、5％ CO₂でインキュベートする。

24時間後に、コンフルエント細胞をPBSで洗浄し、TrypLE Selectを用いてフラスコから取り出す。細胞を計数し、2000rpmで4〜5分間遠心分離する。ペレットを、適切な培地(60％ BME、30％ FCS、および10％ DMSO)に入れて、5x10⁶または10⁷細胞/mLに濃縮する。懸濁液をクリオバイアル(cryovial)(Nunc)に充填し、-80℃で凍結する。途中、-20℃で2時間の工程がある。この後に、長期保管のために液体窒素の中に移す。これは、CETC19p1(アヒル胴体胚細胞,19日齢胚,継代1)の初代細胞バンク(110個のクリオバイアル,10⁷細胞/バイアル)を構成する。

本発明の好ましい態様では、ノバリケン卵からのCECバッチの調製は、選択肢B.2.に従って(19齢ノバリケン卵から)行う。

C.トランスフェクション法
関心対象のヌクレオチド配列を発現することができるベクターを導入するために、多数のトランスフェクション法が当技術分野において公知である。これらの方法の非限定的なリストを以下に列挙する:CaPO₄沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクチントランスフェクション法。ある特定の例はCaPO₄沈殿法に基づいている。

細胞は約80〜50％のコンフルエンシーでなければならない。CaPO₄/DNAを添加する2時間前に培地を交換する。30μgのDNAを31μlの2M CaCl₂、161.3mM Tris pH7.6に再懸濁する。H₂Oを最終体積0.5mlまで添加する。

次いで、以下の2つの選択肢がある。
a)トランスフェクション1回につき、0.5mlの2X HEBSを15ml滅菌Falconチューブに分配し、DNA溶液を穏やかにボルテックスしながら、または泡立たせながら滴下する。溶液は乳白色になるはずである。混合物を室温で10〜30分間放置する。次いで、組織培養キャビネットの中で、滅菌ピペットを用いて1回出し入れしてフレークをばらばらにし、細胞に滴下する。次いで、細胞を、6時間から一晩まで37℃でインキュベートする。微細な沈殿物が細胞表面を覆うはずである。トランスフェクション手順を完了するために、グリセロール保存液を37℃まで温める。培地を吸引し、細胞層を洗浄するために5ml BMEを添加し、次いで、培地を吸引し、1mlグリセロール保存液を2分未満で添加する。その後に、グリセロールを希釈するために10ml BMEを穏やかに添加し、BME-グリセロールを完全に除去する。次いで、所望の培地10mlを添加し、プレートを適切な温度でインキュベートする。
または、
b)トランスフェクション1回につき、0.5mlの2X HEBSを15ml滅菌Falconチューブに分配し、DNA溶液を穏やかにボルテックスしながら、または泡立たせながら滴下する。溶液は乳白色になるはずである。混合物を室温で10〜30分間放置する。次いで、組織培養キャビネットの中で、滅菌ピペットを用いて1回出し入れしてフレークをばらばらにし、細胞に滴下する。微細な沈殿物が細胞表面を覆うはずである。次いで、細胞を6時間から一晩まで37℃でインキュベートする。

本発明の好ましい態様では、トランスフェクション(CaPO₄沈殿)は選択肢b)に従って行う。

D. 選択方法
D-1. ランダム挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS 10％およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mL(任意で、ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL)を含むBMEに再播種する。

個々の増殖クローンが単離できるまで、細胞を連続継代する。

D-2. 標的挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS 10％;ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mL(またはピューロマイシン0.5μg/mL)を含むBMEに再播種する。

その後に、細胞クローンを、下記の方法に従って、メガヌクレアーゼI-SceI発現プラスミドでトランスフェクトする。

選択マーカーの排除の選択のために、トランスフェクションの48時間後に、5-フルオロシトシン(5-FC)を適用する。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、10^-3〜10^-7Mの5-FC濃度を含む培地に再播種し、G418(またはピューロマイシン)/ガンシクロビル選択(FCS 10％;5-FCガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mL(またはピューロマイシン0.5μg/mL)を含むBME)を維持する(図3)。

実施例2:E1A核酸配列および組換えテロメラーゼ逆転写酵素核酸配列を含むトリ不死化細胞株の樹立
A. プラスミド構築物
A-1. ランダム挿入用のプラスミド構築物
この目的のために、ノバリケンゲノムと相同性のある特定の配列を共有しないプラスミドを使用した。

A-2. 標的挿入用のプラスミド構築物
ノバリケンテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(SEQ ID NO:3)、E1A核酸配列(SEQ ID NO:1)、および2つの選択マーカーを取り囲むノバリケンHPRT遺伝子と相同な2つの5kb断片を含むプラスミド(プラスミドdTERT-E1A)を構築した。E1A核酸配列の構成的発現に適した部位として、ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼをコードするHPRT遺伝子を選択した。

これらの2つの選択マーカーは、CMVプロモーター(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-63)の制御下にあるFCU1遺伝子(Erbs et al. Cancer Res. 2000. 15. 60. :3813-22)、およびSV40プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子である。ピューロマイシン耐性およびFCU-1発現カセットは、最終細胞株からの選択カセットの排除を可能にするSce1切断部位に囲まれている。HPRT遺伝子アームの外側には、RSVプロモーターによって駆動される、HSVTKをコードする選択マーカーが挿入されている(図4)。

B. 19齢ノバリケン卵からのCECバッチの調製および亜集団の説明
AFFSSA Ploufraganから入手した、29個のSPFノバリケン受精卵を、湿度の高い雰囲気中で37.5℃で保温する。

2000rpmで5分間遠心分離した後、細胞を、10％ウシ胎児血清(JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, Code TG P4001 Q)、ゲンタマイシン0.04g/L、およびL-グルタミン4mMを添加したBME(イーグル基本培地, Gibco, Ref. 41010, Lot 8270)に再懸濁する。最終体積1.5L(1.9x10⁶細胞/mL)の懸濁液を10個のトリプルフラスコ(500cm²)に播種し、37℃、5％CO₂でインキュベートする。

24時間後に、コンフルエント細胞をPBSで洗浄し、TrypLE Selectを用いて、フラスコから取り出す。細胞を計数し、2000rpmで4〜5分間遠心分離する。ペレットを、適切な培地(60％ BME、30％ FCS、および10％ DMSO)に入れて、5x10⁶または10⁷細胞/mLに濃縮する。懸濁液をクリオバイアル(Nunc)に充填し、-80℃で凍結する。途中、-20℃で2時間の工程がある。この後に、長期保管のために液体窒素の中に移す。これは、CETC19p1(アヒル胴体胚細胞,19日齢胚,継代1)の初代細胞バンク(110個のクリオバイアル,10⁷細胞/バイアル)を構成する。

C. トランスフェクション法
関心対象のヌクレオチド配列を発現することができるベクターを導入するために、多数のトランスフェクション法が当技術分野において公知である。これらの方法の非限定的なリストを以下に列挙する:CaPO₄沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクチントランスフェクション法。ある特定の例は、エレクトロポレーションに基づいている。

トランスフェクションは、AmaxaのNucleofector装置およびBasic Fibroblastキット(Amaxa, カタログ番号VPI-1002)を用いて行う。細胞を700rpm(100g)で10分間遠心分離し、Basic Nucleofector Solution(100μL/10⁶細胞)に再懸濁する。懸濁液100μLをDNA 3〜6μgと混合し、Nucleofector(U-12プログラム)に入れたキュベットに移す。エレクトロポレーションの後、試料を6cm培養皿に移し、37℃/5％ CO₂インキュベーターに入れて予め平衡化しておいた培地5mlを充填する。5％ CO₂、37℃で一晩のインキュベーションの後、培地を新しくし、インキュベーションを続ける。

D. 選択方法
D-1. ランダム挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS 10％、ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mLを含むBMEに再播種する。

D-2. 標的挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS 10％;ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびピューロマイシン0.5μg/mLを含むBMEに再播種する。

選択マーカーの排除の選択のために、トランスフェクションの48時間後に、5-フルオロシトシン(5-FC)を適用する。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、10^-3〜10^-7Mの5-FC濃度を含む培地に再播種し、ピューロマイシン/ガンシクロビル選択(FCS 10％;5-FCガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびピューロマイシン0.5μg/mLを含むBME)を維持する。

実施例3:ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703不死化ノバリケン細胞株
実施例2に記載のように、プラスミドdTERT-E1Aを用いた標的挿入(エレクトロポレーション)によって、ノバリケン細胞株ECACC 09070701(T17-17703B)、ECACC 09070702(T17-17703B2)、およびECACC 09070703(T17-17703A)を初代胚ノバリケン細胞から得た。

これらの細胞株は、トランスフェクションの210日〜260日後、老化/クライシス期後、サブポピュレーションECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703が新たな連続した指数増殖期に入った時に生じた。対応する増殖曲線(図8)は、トランスフェクションの456日後までの集団進化を示す。この期間に計算された集団倍化数(PDL)(ECACC 09070703:138PDL;ECACC 09070701:131PDL;ECACC 09070702:166PDL)はヘーフリック限界をかなり超えている。その結果、ノバリケン細胞株ECACC 09070701(T17-17703B)、ECACC 09070702(T17-17703B2)、およびECACC 09070703(T17-17703A)は不死化細胞株とみなされた。

3種類のノバリケン細胞株は、異なる形態を示す別個の細胞株である。ノバリケンECACC 09070703細胞は上皮に似た形態を有するのに対して(図7)、ノバリケンECACC 09070701細胞およびECACC 09070702細胞は合胞体(syncitia)に似た層を形成する(それぞれ、図5および図6)。3種類の細胞株の細胞は小さな細胞であり、安定した静止単層をなして増殖する。

3種類のノバリケン細胞株はまた異なる世代時間を示す。集団倍加時間(PDT)の平均は、ECACC 09070702については30時間、ECACC 09070701については35時間、ECACC 09070703については47時間である(図9)。

3種類の細胞株の細胞はマイコプラズマ汚染陰性および微生物汚染陰性であった。

集団倍化数(PDL)は細胞世代(バイオマスの2倍の増加)の数を指す。PDL計算:PDL=Ln(最終細胞数/初期細胞数)/Ln(2);

集団倍加時間(PDT)は世代時間とも呼ばれ、ある集団が倍になるのに必要な時間である。PDT計算:PDT=Δt^*Ln(2)/Ln(最終細胞数/初期細胞数)。

実施例4:改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)の産生
ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703のMVA増幅能を評価し、MVA産生のための培養基として通常用いられる初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)と比較した。ウイルス増殖の経過観察およびタイトレーションを容易にするために、eGFPを発現するMVA(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)、寄託番号N602 I-721)を選択した。ノバリケントリ不死化細胞株であるECACC 09070701、ECACC 09070702、ECACC 09070703、およびCEFを2.10⁶個の細胞で25cm²のTフラスコに入れて播種し、加湿雰囲気中、37℃、5％CO₂で24時間、培養した。次いで、培地(10％ウシ胎児血清(FCS)および4mM L-グルタミンを添加したイーグル基礎培地(BME))を取り出し、PBS 1％カチオン、1％FCSで希釈したMVAウイルス500μLを細胞にMOI 0.05で感染させた。30分間の吸着工程後に、残っているウイルス懸濁液を除去し、細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、5mLのBME 10％FCSを、それぞれのフラスコに添加した。新鮮な培地を添加し、インキュベーターの中で細胞を交換した。37℃、5％CO₂で0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間感染させた後に、凍結融解工程によってウイルスを細胞および上清から回収した。凝集を避けるために、回収されたウイルス懸濁液を、タイトレーションの前に超音波処理した。6cm培養皿に播種し、対数ウイルス希釈液に感染させ、寒天で覆ったCEFに対してタイトレーションを3回繰り返して行った。eGFPを発現するMVAのプラーク形成単位を、蛍光双眼顕微鏡(fluorescent binocular)を用いて視覚化し、72時間後に計数した。

結果: 図10に示したように、ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070701、ECACC 09070702、およびECACC 09070703はMVAに対して許容性であり、古典的なCEF培養基を用いて得られたMVA増幅に匹敵するMVA増幅を可能にした。全ての試験トリ細胞株について、感染72時間後に最大ウイルス収率に達し、最大ウイルス収率は2,3.10⁷〜5,7.10⁷の全pfuであった。これと一致して、全ての細胞において、明らかな細胞変性効果が観察された(データ示さず)。

実施例5:ワクシニアウイルスコペンハーゲン株(VV-COP)の産生
ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702がVV-COPを増幅する能力を評価し、参照初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)と比較した。ウイルス増殖の経過観察およびタイトレーションを容易にするために、eGFPを発現するVV-COPを選択した。トリ細胞株ECACC 09070702(継代50)およびCEFを1.4x10⁷個の細胞でTフラスコ175に入れて播種し、37℃、5％CO₂雰囲気で24時間、培養した。次いで、培地(10％ウシ胎児血清(FCS)、4mM L-グルタミン、および0.04g/Lゲンタマイシンを添加したイーグル基礎培地(BME))を取り出し、1％FCSおよびカチオン(Merck混合物:酢酸マグネシウム100μg/mL、塩化カルシウム100μg/mL)を添加したPBSで希釈したウイルスを細胞に低MOI 0.0001で感染させた。室温で30分間の吸着後に、新鮮な培地を添加し、インキュベーター(37℃および5％CO₂)の中で細胞を交換した。その後に、24時間、48時間、72時間、および96時間感染させた後に細胞を凍結した。

0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間感染させた後、凍結融解工程後にウイルスを細胞および上清から回収した。タイトレーションの前にウイルス凝集物を解離するために、回収されたウイルス懸濁液をタイトレーションの前に超音波処理した。6ウェル培養プレート中でBHK21細胞に対してタイトレーションを3回繰り返して行った。細胞を2mLのDMEM(Gibco)、10％FCSに溶解して1ウェルあたり5x10⁵個の細胞で播種し、24時間インキュベートした。10^-2〜10^-6のVV溶液の連続希釈液を、PBS、1％FCS、およびカチオン(Merck)の混合物に溶解して作製した。1ウェルあたり250μLの各希釈液を添加し、ウイルス希釈液と細胞を室温で30分間、接触させた。その後に、1ウェルあたり2mLのDMEM 10％FCSを添加し、細胞を37℃、5％CO₂雰囲気中でインキュベートした。24時間後に、培地を除去し、細胞を、クリスタルバイオレット(10％;Sigma)およびレッドニュートラル(2g/L;Merck)の1:1vol/vol混合物1mLで覆った。室温で1時間染色した後に、eGFPを発現するVV-COPのプラーク形成単位(pfu)を視覚化し、蛍光双眼顕微鏡を用いて計数した。

図11に示したように、ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702はVV-COPに対して許容性であり、CEFを用いて得られたVV-COP増幅(6.8x10⁸pfu)に匹敵するレベルのVV-COP増幅(2.7x10⁸pfu)を可能にした。いずれの場合も、感染96時間後に最大ウイルス収率に達した。

本研究から、本発明のノバリケントリ不死化細胞株はMVAおよびVV-COPを産生するための優れた候補であることが分かった。

実施例6:インフルエンザウイルスの産生
ノバリケントリ不死化細胞株ECACC 09070702(T17-17703B2)がインフルエンザウイルスを産生する能力を評価した。いくつかのインフルエンザ株、インフルエンザA型(A/パナマ(Panama)/2007/99 H3N2株)およびインフルエンザB型(B/ブリスベン/60/2008)を試験した。ウイルス細胞内ノイラミニダーゼを定量することによって、感染およびT17細胞許容性を評価した。

ノイラミニダーゼアッセイ(NA)
T17細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり0.15x10⁵個の細胞で播種し、100％コンフルエンスまで感染培地(2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および0.5μg/mLトリプシンを添加したBME)の中で培養した。感染培地で希釈したウイルスを1ウェルあたり25μl添加することによって、MOI 1または0.1で細胞にインフルエンザウイルスを感染させた。75時間(MOI 0.1)および48時間(MOI 1)、37℃、5％CO₂で感染を進めた。この後に、ノイラミニダーゼ活性試験のために上清25μLを収集した。

NA活性をモニタリングするのに使用した標準的な蛍光エンドポイントアッセイは、ハイスループットスクリーニング試験においてインフルエンザウイルスを定量するのに適していることが最近示された(Virol J. 2008 5:109)。簡単に述べると、細胞上清(25μl)を黒色の96ウェルプレートに移し、75μlの2'-(4-メチルウンベリフェリル)-α-N-アセチルノイラミン酸(MUNANA, Sigma Chemical Co.)を最終濃度50μMまで添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートした後に、150μlの停止溶液(0.05Mグリシン, pH10.4)を各ウェルに添加し、355nmの励起フィルターおよび460nmの発光フィルターを備えるFluoStar Opima(BMG Labtech)において蛍光を読み取った。特定のブランク、すなわち、分子を含む培地または分子を含まない培地を差し引くことによって相対蛍光単位(RFU)を補正した。

DMEMで希釈したA/モスクワ(Moscow)/10/99(H3N2)ウイルスストック(107.8 TCID50/mL最終)を漸増濃度の試験分子(または対照の場合、DMEM)と室温で0.5時間インキュベートすることによって、NA酵素活性に対する試験分子の潜在的な干渉を試験した。それぞれの分子について特定のブランクを測定した。前記のようにNA試験のために25μLを使用し、結果を、試料の補正済みRFU:対照RFUの比として表した。2つの独立した実験を2回繰り返して行った。

結果
ノイラミニダーゼ活性の測定から、ECACC 09070702細胞株は、インフルエンザA型(A/パナマ/2007/99 H3N2株;図12)およびインフルエンザB型(B/ブリスベン/60/2008;図13)に対して許容性であることが分かった。ノイラミニダーゼ活性が検出されたことから、ECACC 09070702細胞株においてインフルエンザ複製は有効であり、ウイルスノイラミニダーゼは正しく処理され、機能していると解釈される。

本明細書において引用または指示された、それぞれの特許、特許出願、刊行物、教科書、および文献の記事/報告はその全体が、全ての目的のために参照により本明細書に明白に組み入れられる。

本発明は、様々な特定の態様および好ましい態様の点から説明されたが、当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略、および変更が加えられ得ることを理解するだろう。従って、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲の均等物を含む、以下の特許請求の範囲にのみ限定されることが意図される。

Claims

ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070701で寄託されたトリ不死化細胞株およびその派生株。
ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070702で寄託されたトリ不死化細胞株およびその派生株。
ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ(ECACC)にアクセッション番号09070703で寄託されたトリ不死化細胞株およびその派生株。
欠損ウイルスの増殖を可能にする1つまたは複数の核酸配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のトリ不死化細胞。
関心対象の物質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のトリ不死化細胞株。
請求項1〜3のいずれか一項記載のトリ不死化細胞を使用する工程を含む、ウイルスを複製するための方法。
前記ウイルスが生ウイルス、弱毒化ウイルス、または組換えウイルスである、請求項6記載の方法。
前記ウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペルウイルス（herpervirus）、アルファウイルス、フォーミーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、フラビウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項6記載の方法。
前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項8記載の方法。
前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項9記載の方法。
前記ウイルスが改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)である、請求項10記載の方法。
前記ウイルスがワクシニアウイルスコペンハーゲン株である、請求項10記載の方法。
前記インフルエンザウイルスがインフルエンザウイルスA型である、請求項8記載の方法。
前記インフルエンザウイルスA型がH1N1株およびH3N2株からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
前記インフルエンザウイルスがインフルエンザウイルスB型である、請求項8記載の方法。
前記インフルエンザウイルスB型がブリスベン株およびフロリダ株からなる群より選択される、請求項15記載の方法。