ES2905478T3 - Virus oncolíticos y moléculas terapéuticas - Google Patents

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Abstract

Un poxvirus oncolítico defectuoso en el locus J2R que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de citidina desaminasa (CDAsa), preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID y proteínas similares a la citidina desaminasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Virus oncolíticos y moléculas terapéuticas
Campo técnico de la invención
La presente invención pertenece al campo de los virus oncolíticos y genes terapéuticos. La invención proporciona virus oncolíticos que comprenden uno o más genes terapéuticos. Más precisamente, los genes terapéuticos de la invención son moduladores de agrupaciones de nucleósidos. Más particularmente, los moduladores de agrupaciones de nucleósidos de la invención son citidina desaminasas o tienen una actividad citidina desaminasa. La combinación de los virus oncolíticos y uno o más genes terapéuticos tal como se define en el presente documento confiere a los virus oncolíticos una eficacia antitumoral aumentada. La invención finalmente proporciona virus oncolíticos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades proliferativas. Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y a métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal (véase el art. 53(c) del CPE) debe reformularse según el artículo 54(4) o (5) del CPE.
Técnica anterior
Los virus oncolíticos son una clase de agentes terapéuticos que tienen la propiedad única de autoperpetuación dependiente de tumor (Hermiston et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):322-30). El beneficio de usar estos virus es que a medida que se replican, lisan sus células huésped. Los virus oncolíticos pueden replicarse selectivamente en células en división (por ejemplo, células cancerosas) sin dañar las células que no están en división (por ejemplo, células normales). A medida que las células en división infectadas son destruidas por lisis, liberan nuevas partículas infecciosas para infectar las células en división circundantes. Por tanto, los virus oncolíticos ofrecen una nueva área para el tratamiento del cáncer, opcionalmente en asociación con los tratamientos convencionales para el cáncer (Fisher et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):301-13). Las células cancerosas son huéspedes ideales para muchos virus ya que tienen la ruta del interferón antiviral inactivada o tienen genes supresores de tumores mutados que permiten que la replicación viral se desarrolle sin obstáculos (Chernajovsky et al., 2006, BMJ, 332(7534):170-2). Varios virus, incluyendo adenovirus, reovirus, sarampión, herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle y virus de la vaccinia, se han probado clínicamente como agentes oncolíticos.
Algunos virus son oncolíticos por naturaleza y tienen una capacidad innata para infectar y destruir selectivamente las células tumorales. Sin embargo, los virus oncolíticos también pueden diseñarse por ingeniería modificando los virus que se producen de manera natural. Para este fin, las principales estrategias usadas actualmente para modificar los virus incluyen: deleciones funcionales en genes virales, el uso de promotores específicos de tumores o tejidos para controlar la expresión de estos genes virales, modificación del tropismo para redirigir el virus a la superficie de la célula cancerosa, entre muchas otras posibilidades.
Entre los virus oncolíticos por naturaleza, los virus de la vaccinia (un Poxviridae) poseen muchos de los atributos clave necesarios para una estructura principal viral ideal para su uso en viroterapia oncolítica. Estos incluyen un ciclo de vida corto, con una rápida propagación de célula a célula, una fuerte capacidad lítica, una gran capacidad de clonación y una biología molecular bien definida. Además, aunque pueden replicarse en células humanas, no se consideran un problema de salud natural y están especialmente bien caracterizados por haberse suministrado a millones de personas durante la campaña de erradicación de la viruela. Los primeros resultados clínicos que usaron o bien cepas de la vaccinia o bien cepas de la vaccinia modificadas genéticamente han demostrado efectos antitumorales (Thorne et al., 2005, Curr. Opin. Mol. Ther., 7(4):359-65).
Pueden practicarse modificaciones virales del virus con el fin de mejorar la capacidad de los virus para infectar y lisar el 100% de las células tumorales, lo que es difícil de conseguir en un contexto in vivo. Por tanto, los virus oncolíticos a menudo están “armados” con un sistema enzima-profármaco que mejora la eficacia oncolítica de la terapia con virus ejerciendo un fuerte efecto por vecindad y permitiendo así la eliminación de las células tumorales vecinas no infectadas. Por ejemplo, el armamento con el denominado gen suicida FCU1, que codifica para una proteína quimérica bifuncional que combina las actividades enzimáticas de FCY1 y FUR1, catalizó eficazmente la conversión directa de 5-fluorocitosina (5-FC), un agente antifúngico no tóxico, en los metabolitos tóxicos 5-fluorouracilo (5-FU) y 5-fluorouridina-5'-monofosfato (5-FUMP), evitando así la resistencia natural de determinadas células tumorales humanas al 5-fluorouracilo (Erbs et al., 2000, Cancer Res., 60(14):3813-22).
Las modificaciones de virus también pueden usarse para aumentar la seguridad. En este sentido, se demostró que el virus con deleción de timidina cinasa (TK) tiene una patogenia disminuida en comparación con el virus silvestre, pero se conservó la replicación en las células tumorales (Buller et al., 1985, Nature, 317(6040):813-5). Foloppe et al. mostraron que un VACV con deleción del gen TK que expresa el gen FCU1 tiene un potente efecto antitumoral tanto in vitro como in vivo en un modelo murino de un tumor de colon humano (Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15:1361-71).
Es evidente que existe una necesidad importante de desarrollar enfoques eficaces para el tratamiento del cáncer. Se han desarrollado cepas de virus oncolíticos atenuados para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico y están evaluándose en estudios clínicos. Sin embargo, los métodos para atenuar los virus oncolíticos conducen a una disminución de su eficacia. Desde un punto de vista terapéutico, esta disminución de la eficacia puede dar como resultado una disminución de la respuesta global, una disminución de la supervivencia del paciente, un aumento de la mortalidad, resistencias patológicas... Como resultado, existe la necesidad de un nuevo virus oncolítico seguro, que debería ser más eficaz.
En el contexto de la presente invención, los inventores han sometido a prueba virus oncolíticos que comprenden uno o más genes terapéuticos. Más particularmente, los genes terapéuticos son nucleósido desaminasas. Incluso más particularmente, los genes terapéuticos son citidina desaminasa.
La citidina desaminasa (CDAsa), también denominada desoxicitidina desaminasa o citidina aminohidrolasa, es un modulador de agrupaciones de nucleósidos implicado en la ruta de rescate de pirimidina y, por consiguiente, implicado en el equilibrio de los desoxirribonucleótidos (dNTP).
Un equilibrio adecuado de dNTP es esencial para la fidelidad de la replicación del ADN. De hecho, parece que la modulación del equilibrio de las agrupaciones de dNTP tiene consecuencias sobre la integridad del ADN, la estabilidad del genoma y puede provocar daños genotóxicos. Las dos hebras del ADN del genoma nuclear tienen un riesgo similar de experimentar mutaciones como resultado de este desequilibrio de las agrupaciones de dNTP, y este riesgo no se suprime por completo ni siquiera cuando los dos principales mecanismos de corrección de errores de replicación están genéticamente intactos. (Buckland et al., diciembre de 2014, PLoS Genet., 10(12):e1004846). Si bien se sabe que una reducción o un desequilibrio en los dNTP da como resultado genotoxicidad y una mayor mutagénesis, un aumento en los dNTP a menudo da como resultado una replicación incontrolada del ADN con una fidelidad reducida que puede contribuir al desarrollo del cáncer (Kohnken et al., 2015, Mol. Cancer; 14:176).
Pueden usarse agentes terapéuticos que se dirigen a la síntesis y el metabolismo de dNTP en el tratamiento de varios tipos de cáncer. A pesar de varios estudios, los mecanismos moleculares que regulan los niveles intracelulares de dNTP y mantienen su homeostasis no se comprenden completamente. (Kohnken et al. 2015, Mol. Cancer; 14:176)
Se ha notificado que la deficiencia en CDAsa conduce a un exceso de desoxicitidina-trifosfato (dCTP). La replicación del ADN en células deficientes en CDAsa no tiene éxito debido a la inhibición parcial de la actividad basal de poli-ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP-1). De hecho, la acumulación intracelular de dCTP inhibe la actividad de PARP-1, lo que compromete la activación de la cinasa del punto de control 1 y la eficiencia de los puntos de control aguas abajo, lo que permite la acumulación posterior de ADN no replicado en la mitosis. Este ADN no replicado conduce a la formación de puentes de anafase ultrafinos (UFB) entre cromátidas hermanas en sitios “difíciles de replicar” tales como centrómeros y sitios frágiles. (Gemble et al., 2015, PLoS Genet, 11(7) e1005384)
Se sabe que las CDAsas tienen un efecto antiviral. APOBEC3G, una CDAsa que desamina las citidinas complejadas, es una proteína de defensa innata que muestra actividad contra retrovirus y retrotransposones (Oliva et al., 2016, Immunol. Cell. Biol. 94:689-700). El papel de las proteínas APOBEC3 en la inhibición de la infección viral se describió por primera vez para el VIH-1. Sin embargo, muchos estudios también han mostrado evidencias de la acción de APOBEC3 sobre otros virus asociados con enfermedades humanas, incluyendo VLTH, VHC, VHB, VPH, VHS-1 y VEB. La APOBEC3G inhibe estos virus a través de una serie de mecanismos independientes y dependientes de la edición. Muchos virus han desarrollado mecanismos para contrarrestar los efectos de APOBEC, y las estrategias que mejoran la actividad de APOBEC3 constituyen un nuevo enfoque para el desarrollo de fármacos antivirales. (Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013:ID 683095).
Se ha notificado que APOBEC es un factor de restricción para múltiples virus que contienen ADN (Moris et al., 2014, Front Microbiol, 5:534). Sin embargo, se ha demostrado que los miembros de la familia APOBEC3 no son factores de restricción para la replicación del virus de la vaccinia, un poxvirus, y que el virus de la vaccinia no puede degradar APOBEC3G (Kremer et al., 2006, Virol. J 3:86).
Se ha notificado que el gen APOBEC se sobreexpresa en cánceres de pulmón de células no pequeñas. APOBEC3G puede ser el origen de grupos de mutación en diversos cánceres, tales como el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello. La tasa de APOBEC de ARNm se ha comparado en tejidos pulmonares cancerosos y normales, y parece que APOBEC de ARNm estaba significativamente más elevado en tejidos cancerosos que en tejidos normales (Hidefumi et al., 2014, Biomed. Rep., 2(3):392-395).
Además, se llevó a cabo un estudio sobre la influencia de la actividad enzimática de la CDAsa en el problema clínico de los pacientes con NSCLC tratados con platino-gemcitabina. Se notificó que la actividad enzimática de la CDAsa, detectada mediante HPLC, se correlacionó tanto con la actividad como con la eficacia de la terapia con platinogemcitabina. Más precisamente, los pacientes con una actividad CDAsa baja tuvieron una mejor tasa de respuesta, un mejor beneficio clínico, un mejor tiempo de progresión y una mejor supervivencia global que los pacientes con una actividad CDAsa alta. Otro estudio preliminar en 40 pacientes con cáncer de páncreas notificó una correlación similar entre la actividad CDAsa alta y la progresión después de los tratamientos basados en gemcitabina. Los autores sugirieron el uso de la actividad enzimática CDAsa como biomarcador de actividad y eficacia en pacientes tratados con regímenes de platino-gemcitabina (Tibaldi et al., 2012, Ann. Oncol., 23:670-677).
Se han notificado algunos problemas cuando se usan citidina desaminasa o moduladores de agrupaciones de nucleósidos que tienen actividad citidina desaminasa. Con una serie de mecanismos independientes y dependientes de la edición, APOBEC3 inhibe los virus, pero también representa una fuente de diversificación y evolución de la genética viral. Muchos virus desarrollaron nuevos mecanismos para contrarrestar los efectos de APOBEC (Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013, ID de artículo 683095). Además, tal como se mencionó anteriormente, la CDAsa puede inhibir algunos tratamientos contra el cáncer. Los documentos WO2010118013 y WO2010118010 se refieren a la combinación de inhibidores de CDAsa y fármacos antineoplásicos basados en citidina, tales como decitabina, gemcitabina, ara-C y 5-azacitidina. De hecho, la CDAsa desamina los fármacos basados en citidina y, por consiguiente, reduce sus efectos. Estas solicitudes también se refieren al uso de estas combinaciones para el tratamiento de cánceres. El estudio de eficacia in vivo de un inhibidor de CDAsa (ER-876437) y gemcitabina en el modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario humano A2780 mostró que mientras que ER-876437 solo y gemcitabina sola no tuvieron ningún efecto sobre el crecimiento del tumor, la administración de ER-87643730 minutos antes de la gemcitabina condujo a una remisión completa y una remisión parcial del tumor en el 10% y el 30% de los ratones evaluados, respectivamente.
En el contexto de la presente invención, los inventores han descubierto, contra todas las expectativas, que los virus oncolíticos diseñados por ingeniería para expresar una citidina desaminasa tienen una eficacia mejorada. La viroterapia antitumoral que comprende la administración de virus de la vaccinia oncolíticos que expresan citidina desaminasa da como resultado una reducción significativa de la progresión tumoral. Además, a diferencia de otros moduladores de agrupaciones de nucleósidos tales como la citosina desaminasa, el efecto antitumoral proporcionado por el virus oncolítico que expresa CDAsa no requiere la adición de ningún profármaco, lo que también contribuye a la facilidad de uso y seguridad de la presente invención.
Basándose en estos resultados, puede anticiparse que los virus oncolíticos de la invención pueden usarse con éxito como alternativa a los otros virus oncolíticos existentes y pueden tener un mejor perfil de eficacia. Los virus oncolíticos de la invención también pueden aprovecharse en combinación con terapias contra el cáncer adicionales.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a los siguientes puntos.
1. Un poxvirus oncolítico defectuoso en el locus J2R que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de citidina desaminasa (CDAsa), preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID y proteínas similares a la citidina desaminasa.
2. El poxvirus oncolítico según el punto 1, en el que dicha APOBEC se selecciona del grupo que consiste en APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H y APOBEC4, y preferiblemente en el que dicha APOBEC es APOBEC2.
3. El poxvirus oncolítico según el punto 1, en el que dicha CDAsa es una citidina desaminasa de levadura (CDD1), preferiblemente una CDD1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID. NO:1, o una citidina desaminasa humana (hCD), preferiblemente una hCD que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:2.
4. El poxvirus oncolítico según el punto 2, en el que dicha APOBEC2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:3.
5. El poxvirus oncolítico según cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que dicho polipéptido de CDAsa cataliza la desaminación de componentes basados en citidina, preferiblemente componentes basados en citidina que están libres o complejados, para dar componentes basados en uridina, tales como citidina para dar uridina y desoxicitidina (dC) para dar desoxiuridina (dU).
6. El poxvirus oncolítico según el punto 1, en el que dicho poxvirus es un poxvirus que pertenece al género Orthopoxvirus, en el que dicho poxvirus pertenece preferiblemente a la especie del virus de la vaccinia (VV), preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en Copenhaguen, Wyeth y Western Reserve (WR), o a la especie del virus de la viruela vacuna.
7. El poxvirus oncolítico según el punto 1, en el que dicho virus es además defectuoso en el locus I4L y/o F4L.
8. El poxvirus oncolítico según el punto 7, en el que dicho poxvirus es un virus de la vaccinia defectuoso en las actividades codificadas por TK y RR virales que codifica para una CDAsa humana o de levadura.9
9. El poxvirus oncolítico según cualquiera de los puntos 6 a 8, en el que dicho virus comprende además uno o más ácidos nucleicos de interés, codificando dicho ácido nucleico de interés preferiblemente para un polipéptido inmunoestimulador, un antígeno o una permeasa.
10. El poxvirus oncolítico según cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que dicho virus comprende además los elementos necesarios para la expresión de dicha citidina desaminasa y dicho uno o más ácidos nucleicos de interés.
11. Un procedimiento para preparar un poxvirus oncolítico, procedimiento en el que:
(i) se introduce un poxvirus oncolítico según uno cualquiera de los puntos 1 a 10 en una célula productora;
(ii) se cultiva dicha célula productora en condiciones que son apropiadas para permitir que se produzca dicho poxvirus oncolítico, y;
(iii) dicho poxvirusis oncolítico recuperado a partir del cultivo celular.
12. Una composición que comprende el poxvirus oncolítico según uno cualquiera de los puntos 1 a 10, o preparado según el punto 11, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha composición comprende preferiblemente una dosis de virus oncolítico comprendida entre 106 y 5*109 UFP, y en la que dicho virus oncolítico se formula preferiblemente para la administración por vía parenteral con una preferencia por la vía intravenosa o intratumoral.
13. El poxvirus oncolítico según uno cualquiera de los puntos 1 a 10, o preparado según el punto 11, o la composición según el punto 12, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado patológico en un sujeto que lo necesita.
14. El poxvirus oncolítico según uno cualquiera de los puntos 1 a 10, o preparado según el punto 11, o la composición según el punto 12, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad proliferativa, seleccionándose dicha enfermedad proliferativa preferiblemente del grupo que consiste en cáncer, tumor y reestenosis, en el que dicho cáncer es preferiblemente un cáncer gastrointestinal, comprendiendo preferiblemente un cáncer de esófago, vesícula biliar, hígado, páncreas, estómago, intestino delgado, intestino (intestino grueso o colon y recto) o ano.
15. El poxvirus oncolítico para su uso según el punto 14, que comprende además la administración de una o más sustancias eficaces en la terapia contra el cáncer.
Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a un poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de citidina desaminasa (CDAsa).
En una realización, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención es un poxvirus que pertenece a Orthopoxvirus y especialmente a un virus de la vaccinia o un virus de la viruela vacuna.
El poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención es defectuoso en el locus J2R que codifica para la timidina cinasa (TK-).
En aún otra realización, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención es defectuoso en el locus I4L y/o F4L (alternativamente o en combinación con un locus TK- defectuoso).
En una realización adicional, dicho poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente comprende además un ácido nucleico de interés, en particular un gen que codifica para una molécula terapéutica diferente de la CDAsa, tal como un polipéptido inmunoestimulador, un antígeno, una permeasa o cualquier otra molécula de interés.
En otro aspecto, la presente invención proporciona además una composición que comprende el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el virus oncolítico se formula preferiblemente para administración intravenosa o intratumoral.
En un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente, que comprende al menos las etapas de introducir dicho virus oncolítico en una célula productora, cultivar la célula productora en condiciones que son apropiadas para permitir la producción de dicho virus oncolítico y recuperar el virus producido a partir del cultivo celular. Opcionalmente, el virus oncolítico recuperado puede purificarse al menos parcialmente.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención proporciona el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente o la composición de la invención, para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad. En una realización, dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa tal como cánceres, tumores y reestenosis. Dicho cáncer se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de ovario y glioblastoma, y especialmente los metastásicos. En otra realización, dicha enfermedad es una enfermedad asociada con un aumento de la actividad de los osteoclastos, tal como artritis reumatoide y osteoporosis.
También se da a conocer un método para tratar una enfermedad que comprende la administración, a un organismo huésped que lo necesita, de una cantidad terapéuticamente eficaz del virus oncolítico o de la composición de la invención. Dicho método de tratamiento puede usarse junto con una o más terapias adicionales tales como las seleccionadas del grupo que consiste en cirugía, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia o terapia con citocinas.
Tal como se da a conocer en el presente documento, la citidina desaminasa se usa como gen terapéutico, y no como gen suicida, en la medida en que no se requiera profármaco para obtener un efecto terapéutico en presencia de citidina desaminasa. Específicamente, la capecitabina (Xeloda®) se transforma en 5'-DFCR (desoxi-5-fluorocitidina), que luego se transforma mediante citidina desaminasa en 5'-DFUR (5'-desoxi-5-fluorouridina), que finalmente se transforma en 5-FU (5-fluoro-uracilo) tóxico. Esta cascada de reacción no es necesaria para obtener la actividad citolítica del poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención. Por consiguiente, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención no se usa en combinación con capecitabina y el método de tratamiento según la presente invención no comprende ninguna etapa de administración de un precursor de un fármaco tal como capecitabina. Habitualmente, se usan moduladores de agrupaciones de nucleósidos distintos de CDAsa en combinación con un profármaco que se transforma en un fármaco citotóxico por la acción de dichos moduladores de agrupaciones de nucleósidos. Una transformación enzimática de este tipo contribuye generalmente al efecto antitumoral. Por ejemplo, un método de tratamiento que se basa en un virus oncolítico que codifica para una citosina desaminasa proporciona un efecto antitumoral eficaz cuando se administra junto con la 5-fluorocitosina (5-FC) que se transforma en 5-fluorouracilo (5-FU) citotóxico en las células infectadas y contribuye a su lisis.
Descripción de las figuras
Figura 1. Detección específica de la proteína CDA (citidina desaminasa) en inmunotransferencias de tipo Western mediante anticuerpos contra CDA humana (hCD).
Se infectaron células MIA PaCa-2 y LoVo con VVTK-RR- y VV-TK-RR-/hCD. Se indica la presencia de hCD (16 kDa) (flecha).
Figura 2. Supresión del crecimiento de tumores LoVo colorrectales humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP o VVTK-RR-/CDD1.
Abreviaturas: GFP: proteína verde fluorescente; CDD1: citidina desaminasa de levadura
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 1*107 UFP del virus de la vaccinia oncolítico (indicado por una flecha). Se trataron los ratones que portaban xenoinjertos s.c. de LoVo con una administración por vía i.v. (en la vena de la cola) en el día 11 con vehículo solo (^: control) o con un virus defectuoso en TK y RR que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) (□: VVTK-RR-/GFP) o que expresa la CDAsa de levadura (■: VVTK-RR-/CDD1). Los datos representan la media de 12 animales.
Figura 3. Supresión del crecimiento de tumores HCT-116 colorrectales humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP o VVTK-RR-/CDD1.
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 1*105 UFP del virus de la vaccinia oncolítico (indicado por una flecha). Se trataron los ratones que portaban xenoinjertos s.c. de HCT-116 con una administración por vía i.v. (en la vena de la cola) en el día 16 con vehículo solo (^: control) o con un virus defectuoso en TK y RR que expresa GFP (□: VVTK-RR-/GFP) o que expresa la CDAsa de levadura (■: VVTK-RR-/CDD1). Los datos representan la media de 12 animales.
Figura 4. Supresión del crecimiento de tumores OE-19 de esófago humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP o VVTK-RR-/CDD1.
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 1*106 UFP del virus de la vaccinia oncolítico (indicado por una flecha). Se trataron ratones que portaban xenoinjertos s.c. de OE-19 con una administración por vía i.v. (en la vena de la cola) en el día 13 con vehículo solo (^: control) o con un virus defectuoso en TK y RR que expresa GFP (□: VVTK-RR-/GFP) o que expresa la CDAsa de levadura (■: VVTK-RR-/CDD1). Los datos representan la media de 12 animales.
Figura 5. Supresión del crecimiento de tumores OE-19 de esófago humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP o VVTK-RR-/hCD.
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 5*105 UFP del virus de la vaccinia oncolítico (indicado por una flecha). Se trataron ratones que portaban xenoinjertos s.c. de OE-19 con una administración por vía i.v. (por la vena de la cola) en el día 14 con vehículo solo (^ : control) o con un virus defectuoso en TK y RR que expresa GFP (□: VVTK-RR-/GFP) o que exprese la CDAsa humana (■: VVTK-RR-/hCD). Los datos representan la media de 12 animales.
Figura 6. Supresión del crecimiento de tumores LoVo colorrectales humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR- o VVTK-RR-/FCU1
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 1*107 UFP del virus de la vaccinia oncolítico (indicado por una flecha). Se trataron ratones que portaban xenoinjertos s.c. de LoVo con una administración por vía i.v. (por la vena de la cola) en el día 27 con vehículo solo (O: control) o con un virus defectuoso en TK y RR no recombinante (•: VVTK-RR-) o uno defectuoso en TK y RR que expresa citosina desaminasa y UPRTasa (A: VVTK-RR-FCU1). Los datos representan la media de 12 animales.
Figura 7. Supresión del crecimiento de tumores HCT-116 colorrectales humanos implantados s.c. después de una inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP o VVTK-RR-/APOBEC2.
Volumen tumoral medio después del tratamiento sistémico con 1*105 UFP del virus de la vaccinia en replicación (indicado por una flecha). Se trataron ratones que portaban xenoinjertos s.c. de HCT-116 con una administración por vía i.v. (por la vena de la cola) en el día 17 con vehículo solo (O: control) o con el virus indicado (□: VVTK-RR-/GFP;
■ : VVTK-RR-/APOBEC2). Los datos representan la media de 9 animales.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Tal como se usa en toda la solicitud, los términos “un/o” y “una” se usan en el sentido de que significan “al menos uno”, “al menos un primero”, “uno o más” o “una pluralidad” de los componentes o las etapas, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un virus oncolítico” incluye una pluralidad de virus oncolíticos, incluyendo mezclas de los mismos.
El término “uno o más” se refiere o bien a uno o bien a un número superior a uno (por ejemplo, 2, 3, 4, etc.).
El término “y/o” siempre que se use en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.
El término “alrededor de” o “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento significa dentro del 20%, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado.
Tal como se usa en el presente documento, cuando se usa para definir productos y composiciones, los términos “que comprende” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son de extremo abierto y no excluyen otros elementos o etapas de método adicionales que no se hayan enumerado. La expresión “que consiste esencialmente en” significa que excluye otros componentes o etapas de cualquier importancia esencial. Por tanto, una composición que consiste esencialmente en los componentes enumerados no excluiría trazas, contaminantes y portadores farmacéuticamente aceptables. “Que consiste en” significa excluir más de los oligoelementos de otros componentes o etapas.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se refieren a polímeros de residuos de aminoácido que comprenden al menos nueve o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. El polímero puede ser lineal, ramificado o cíclico y puede comprender análogos de aminoácidos y/o que se producen de manera natural y puede estar interrumpido por componentes distintos de aminoácidos. Como indicación general, si el polímero de aminoácidos tiene más de 50 residuos de aminoácido, se denomina preferiblemente polipéptido o proteína, mientras que si tiene 50 aminoácidos de longitud o menos, se denomina “péptido”.
Dentro del contexto de la presente invención, los términos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido” y “secuencia de nucleótidos” se usan de manera intercambiable y definen un polímero de cualquier longitud de polidesoxirribonucleótidos (ADN) (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, plásmidos, vectores, genomas virales, ADN aislado, sondas, cebadores y cualquier mezcla de los mismos) o polirribonucleótidos (ARN) (por ejemplo, ARNm, ARN antisentido, ARNip) o polirribo-polidesoxirribonucleótidos mixtos. Abarcan polinucleótidos mono o bicatenarios, lineales o circulares, naturales o sintéticos, modificados o no modificados. Además, un polinucleótido puede comprender nucleótidos que se producen de manera no natural y puede estar interrumpido por componentes distintos de nucleótidos.
El término “análogo”, “mutante” o “variante” tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula (polipéptido o ácido nucleico) que presenta una o más modificaciones con respecto al homólogo nativo. Puede contemplarse cualquier modificación, incluyendo la sustitución, inserción y/o deleción de uno o más residuos de nucleótido/aminoácido. Cuando se contemplan varias mutaciones, pueden referirse a residuos consecutivos y/o residuos no consecutivos. Se prefieren los análogos que conservan un grado de identidad de secuencia de al menos el 80%, ventajosamente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, e incluso más preferiblemente al menos el 98% de identidad con la secuencia del homólogo nativo. Para fines ilustrativos, “al menos el 80% de identidad” significa el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%. De manera general, el término “identidad” se refiere a una correspondencia de aminoácido a aminoácido, o de nucleótido a nucleótido, entre dos polipéptidos o secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos que deben introducirse para una alineación global óptima y la longitud de cada hueco. Se encuentran disponibles en la técnica varios programas informáticos y algoritmos matemáticos para determinar el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos después del alineamiento global, tales como, por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsh, J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970, y el programa Blast disponible en NCBI o ALIGN en Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, supl., 3:482-9). Los programas para determinar la identidad entre secuencias de nucleótidos también están disponibles en una base de datos especializada (por ejemplo, Genbank, el paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, y el software Needle disponible en ebi.ac.uk en todo el mundo con el nombre de «Align»).
Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” debe entenderse ampliamente sin ninguna limitación con respecto a la organización particular en tejido, órgano o células aisladas. Tales células pueden ser de un tipo único de células o de un grupo de diferentes tipos de células, tales como líneas celulares cultivadas, células primarias y células en división. En el contexto de la invención, el término “células huésped” incluye células procariotas, células eucariotas inferiores tales como levadura, y otras células eucariotas tales como células de insectos, células vegetales y de mamíferos (por ejemplo, humanas o no humanas), así como células que pueden producir el virus oncolítico de la invención. Este término también incluye células que pueden ser o han sido receptoras del virus descrito en el presente documento, así como la progenie de tales células.
Los términos “virus”, “partícula viral”, “vector viral” y “virión” se usan de manera intercambiable y deben entenderse ampliamente como un vehículo que comprende al menos un elemento de un genoma de virus silvestre y puede empaquetarse en una partícula viral o con una partícula viral. Aunque las partículas virales pueden contener o no ácido nucleico (es decir, el genoma viral), se prefiere que un virus comprenda un genoma viral de ADN o ARN empaquetado en una partícula viral (o virión) y sea infeccioso (es decir, que pueda infectar y entrar en una célula huésped o en un sujeto). De manera deseable, el virus de esta invención está asociado con un genoma de ADN y más preferiblemente con un genoma de ADN bicatenario. En el contexto de la presente divulgación, un “virus” incluye virus silvestres y diseñados por ingeniería.
El término “que se produce de manera natural” o “silvestre” o “nativo” se usa para describir una molécula biológica o un organismo que puede encontrarse en la naturaleza a diferencia de los producidos artificialmente por el hombre. Por ejemplo, un virus que puede aislarse de una fuente en la naturaleza es silvestre. La presente invención también abarca virus silvestres que pueden obtenerse de colecciones específicas (por ejemplo, ECCAC, ATCC, CNCM, etc.). Una molécula biológica o un organismo que haya sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos representativos de virus que no se producen de manera natural incluyen, entre muchos otros, virus recombinantes diseñados por ingeniería mediante la inserción de uno o más genes de interés en el genoma viral y virus mutados diseñados por ingeniería mediante la deleción total o parcial de un gen viral para producir el virus modificado defectuoso para el producto génico codificado (por ejemplo, virus tk-), así como virus quiméricos que contienen fragmentos genómicos obtenidos de diferentes orígenes de virus.
El término “obtenido de”, “que se origina” u “originado” se usa para identificar la fuente original de un componente (por ejemplo, polipéptido, molécula de ácido nucleico, virus, etc.) pero no pretende limitar el método por el cual se produce el componente, que puede ser, por ejemplo, mediante síntesis química o medios recombinantes.
Tal como se usa en el presente documento, el término “virus oncolítico” se refiere a cualquier virus, que se produce de manera natural, diseñado por ingeniería o modificado de otra manera, que puede replicarse selectivamente en células en división (por ejemplo, una célula proliferativa tal como una célula cancerosa) con el objetivo de ralentizar el crecimiento y/o lisar dicha célula en división, o bien in vitro o bien in vivo, mientras que muestra una replicación nula o mínima en las células que no están en división (por ejemplo, células primarias).
Los términos “replicación” y “propagación” se usan de manera intercambiable y se refieren a la capacidad de un virus para reproducirse y proliferar. La replicación del virus puede cuantificarse a nivel de ácido nucleico o a nivel de partícula viral infecciosa usando ensayos convencionales en la técnica y descritos en el presente documento, tales como un ensayo de título de virus, ensayo de placa, absorbancia, detección de fluorescencia, espectrometría de masas, etc.
El término “gen terapéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un producto, también denominado “molécula terapéutica”, que puede proporcionar una actividad biológica cuando se administra de manera apropiada a un sujeto, especialmente a un paciente que padece una enfermedad o un estado patológico o que debe estar protegido contra esta enfermedad o este estado. Se espera que esta actividad biológica provoque un efecto beneficioso en el transcurso o un síntoma del estado patológico que va a tratarse, o bien potenciando la eficacia antitumoral o bien reforzando la naturaleza oncolítica del virus.
El término “tratamiento” (y cualquier forma de tratamiento tal como “que trata”, “tratar”) tal como se usa en el presente documento abarca la profilaxis (por ejemplo, medida preventiva en un sujeto en riesgo de padecer el estado patológico que va a tratarse) y/o terapia (por ejemplo, en un sujeto diagnosticado con el estado patológico), opcionalmente en asociación con modalidades terapéuticas convencionales. El resultado del tratamiento es ralentizar, curar, mejorar o controlar la progresión del estado patológico seleccionado como objetivo. Por ejemplo, un sujeto se trata con éxito de un cáncer si después de la administración de un virus oncolítico tal como se describe en el presente documento, solo o en combinación, el sujeto muestra una mejora observable de su estado clínico.
El término “administrar” (o cualquier forma de administración, tal como “administrado”) tal como se usa en el presente documento se refiere al suministro de un agente terapéutico a un sujeto, tal como el virus oncolítico descrito en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad proliferativa” abarca cualquier enfermedad o estado resultante del crecimiento y la diseminación celular descontrolados, incluyendo cánceres, tumores y algunas enfermedades cardiovasculares (reestenosis que resulta de la proliferación de las células del músculo liso de la pared de los vasos sanguíneos, etc.). El término “cáncer” puede usarse de manera intercambiable con cualquiera de los términos “tumor”, “tumor maligno”, “neoplasia”, etc. Estos términos pretenden incluir cualquier tipo de tejido, órgano o célula, cualquier estadio del tumor maligno (por ejemplo, desde una lesión previa hasta el estadio IV). Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad asociada con un aumento de la actividad de los osteoclastos” abarca cualquier enfermedad o estado que dé como resultado resorción o destrucción ósea (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoporosis, etc.).
El término “sujeto” se refiere generalmente a un organismo para el cual cualquier producto y método de la invención es necesario o puede ser beneficioso. Normalmente, el organismo es un mamífero, particularmente un mamífero seleccionado del grupo que consiste en animales domésticos, animales de granja, animales deportivos y primates. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano a quien se le ha diagnosticado que padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad proliferativa tal como un cáncer. Los términos “sujeto” y “pacientes” pueden usarse de manera intercambiable cuando se refieren a un organismo humano y abarcan hombres y mujeres. El sujeto que va a tratarse puede ser un recién nacido, un bebé, un adulto joven, un adulto o un anciano.
Los términos “tratamiento de combinación”, “terapia de combinación”, “tratamiento combinado” o “tratamiento combinatorio” pueden usarse de manera intercambiable y se refieren a un tratamiento de un sujeto con al menos dos agentes terapéuticos diferentes. En una realización, uno de los agentes terapéuticos es dicho virus oncolítico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente terapéutico clínicamente establecido, en particular uno seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia, terapia con citocinas, terapia dirigida contra el cáncer, terapia génica, terapia fotodinámica, trasplante, etc. Un tratamiento combinatorio puede incluir un tercer agente terapéutico o incluso más. Para el tratamiento de combinación, se aprecia que el experto en la técnica puede determinar la concentración óptima de cada componente de la combinación. En una realización específica, el virus oncolítico de la invención (por ejemplo, virus oncolítico silvestre o un virus oncolítico derivado modificado) puede suministrarse en combinación con citidina desaminasa, en el que dicha citidina desaminasa no está codificada por el virus oncolítico. La citidina desaminasa puede estar en forma de un polipéptido (por ejemplo, una citidina desaminasa producida de manera recombinante, o un análogo de la misma) o de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, portada por un vector diseñado por ingeniería para expresar tal(es) citidina desaminasa(s)), así como una mezcla de polipéptido(s) y molécula(s) de ácido nucleico (por ejemplo, citidina desaminasa(s) y vector(es) de expresión).
Virus oncolíticos
El “virus oncolítico” tal como se da a conocer en el contexto de la presente invención puede obtenerse de cualquier miembro de virus identificado en la actualidad siempre que sea oncolítico por una mayor propensión a replicarse en y destruir células en división en comparación con las células que no están en división. Puede ser un virus nativo que es oncolítico por naturaleza o puede diseñarse por ingeniería modificando uno o más genes virales para aumentar la selectividad tumoral y/o la replicación preferencial en las células en división, tales como los involucrados en la replicación del ADN, el metabolismo de ácidos nucleicos, el tropismo del huésped, la adherencia superficial, la virulencia, la lisis y la diseminación (véase, por ejemplo, Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781; Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106). También puede contemplarse colocar uno o más genes virales bajo el control de elementos reguladores específicos de tejido o acontecimiento (por ejemplo, promotor).
Los virus oncolíticos a modo de ejemplo tal como se dan a conocer en el presente documento incluyen, sin limitación, reovirus, virus del valle de Séneca (VVS), virus de la estomatitis vesicular (VEV), virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), virus del herpes simple (VHS), Morbillivirus, adenovirus, poxvirus, retrovirus, virus del sarampión, espumavirus, virus alfa, lentivirus, virus de la gripe, virus Sindbis, virus del mixoma, rabdovirus, picornavirus, virus de Coxsackie, parvovirus o similares.
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un reovirus. Un ejemplo representativo incluye Reolysin (en desarrollo por Oncolytics Biotech; NCT01166542).
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un virus del valle de Séneca. Un ejemplo representativo incluye NTX-010 (Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4):888-95).
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un virus de la estomatitis vesicular (VEV). En la bibliografía se describen ejemplos representativos (por ejemplo, Stojdl et al., 2000, Nat. Med.
6(7): 821-5; Stojdl et al., 2003, Cáncer Cell 4(4): 263-75).
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un virus de la enfermedad de Newcastle. Los ejemplos representativos incluyen, sin limitación, las cepas 73-T PV701 y HDV-HUJ, así como las descritas en la bibliografía (por ejemplo, Phuangsab et al., 2001, Cancer Lett. 172(1):27-36; Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2):157-67; Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1):221-8).
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un virus del herpes. Los Herpesviridae son una gran familia de virus de ADN que comparten una estructura común y se componen de genomas de ADN lineales bicatenarios relativamente grandes que codifican para 100-200 genes encapsidados dentro de una cápside icosaédrica que está envoltura en una membrana de bicapa lipídica. Aunque el virus del herpes oncolítico puede derivarse de diferentes tipos de VHS, se prefieren particularmente VHS1 y VHS2. El virus del herpes puede modificarse genéticamente para restringir la replicación viral en tumores o reducir su citotoxicidad en células que no están en división. Por ejemplo, puede inactivarse cualquier gen viral involucrado en el metabolismo de ácidos nucleicos, tal como la timidina cinasa (Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6), ribonucleótido reductasa (RR) (Boviatsis et al., Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66) o uracil-N-glicosilasa (Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72). Otro aspecto involucra mutantes virales con defectos en la función de genes que codifican para factores de virulencia tales como el gen ICP34.5 (Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5). Los ejemplos representativos de virus del herpes oncolítico incluyen NV1020 (por ejemplo, Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28) y T-VEC (Harrington et al., 2015, Expert Rev. Anticancer Ther. 15(12):1389-1403).
El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un Morbillivirus que puede obtenerse de la familia Paramyxoviridae, con una preferencia específica por el virus del sarampión. Los ejemplos representativos de virus del sarampión oncolíticos incluyen, sin limitación, MV-Edm (McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84) y HMWMAA (Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42) El virus oncolítico tal como se da a conocer en el presente documento puede obtenerse de un adenovirus. Hay métodos disponibles en la técnica para diseñar por ingeniería adenovirus oncolíticos. Una estrategia ventajosa incluye el reemplazo de promotores virales por promotores selectivos de tumores o modificaciones del/de los producto(s) génico(s) adenoviral(es) E1 para inactivar su función de unión con p53 o proteína de retinoblastoma (Rb) que están alteradas en células tumorales. En el contexto natural, el gen E1B55kDa de adenovirus coopera con otro producto adenoviral para inactivar p53 (p53 se desregula con frecuencia en las células cancerosas), impidiendo de ese modo la apoptosis. Los ejemplos representativos de adenovirus oncolíticos incluyen ONYX-015 (por ejemplo, Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85) y H101 también denominado Oncorine (Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70).
El virus oncolítico de la presente invención es un poxvirus. Tal como se usa en el presente documento, el término “poxvirus” o “vector poxviral” se refiere a un virus que pertenece a la familia Poxviridae, con una preferencia específica por un poxvirus que pertenece a la subfamilia Chordopoxviridae y más preferiblemente al género Orthopoxvirus. Las secuencias del genoma de diversos poxvirus, por ejemplo, los genomas del virus de la vaccinia, virus de la viruela vacuna, virus de la viruela del canario, virus de la viruela del ratón, virus del mixoma están disponibles en la técnica y bases de datos especializadas tales como Genbank (número de registro NC_006998, NC_003663 o AF482758.2, NC_005309, NC_004105, NC_001132, respectivamente).
Ventajosamente, el poxvirus oncolítico es un virus oncolítico de la viruela vacuna y puede derivar de cualquier cepa de la viruela vacuna, tal como, por ejemplo, CPXV_GER1980_EP4 (Genbank hQ420895), CPXV_GER2002_m Ky (Genbank HQ420898), CPXV_GER1991_375_420, CPXV_GER1991_3 (Genbank DQ 437593), CPXV_FRA2001_NANCY (Genbank HQ420894), CPXV_GER1990_2 (Genbank HQ420896), CPXV_UK2000_K2984 (Genbank HQ420900), CPXV_BR (Genbank AF482758.2 o NC 003663) y CPXV_NOR1994-MAN (Genbank HQ420899), CPXV_GER1998_2 (Genbank HQ420897), CPXV_gri (Genbank X94355), CPXV_FIN2000_MAN (Genbank HQ420893) y CPXV_AUS1999_867 (Genbank HQ407377).
De manera deseable, el poxvirus oncolítico es un virus de la vaccinia oncolítico. Los virus de la vaccinia son miembros de la familia de los poxvirus caracterizados por un genoma de ADN bicatenario de 200 kb que codifica para numerosos factores y enzimas virales que permiten que el virus se replique independientemente de la maquinaria de la célula huésped. La mayoría de las partículas del virus de la vaccinia son intracelulares (VMI para virión maduro intracelular) con una sola envoltura lipídica y permanece en el citosol de las células infectadas hasta la lisis. La otra forma infecciosa es una partícula de doble envoltura (VEE para virión con envoltura extracelular) que brota de la célula infectada sin lisarla.
Aunque puede derivar de cualquier cepa del virus de la vaccinia, se prefieren particularmente las cepas Elstree, Wyeth, Copenhaguen y Western Reserve. La nomenclatura génica usada en el presente documento es la de la cepa de la vaccinia Copenhaguen. También se usa en el presente documento para los genes homólogos de otros Poxviridae, a menos que se indique lo contrario. Sin embargo, la nomenclatura génica puede ser diferente según la cepa de la viruela, pero la correspondencia entre Copenhaguen y otras cepas de la vaccinia está generalmente disponible en la bibliografía.
Preferiblemente, el virus de la vaccinia oncolítico de la presente invención se modifica alterando uno o más genes virales. Dicha(s) modificación/modificaciones conduce(n) preferiblemente a la síntesis de una proteína defectuosa que no puede garantizar la actividad de la proteína producida en condiciones normales por el gen no modificado (o ausencia de síntesis). Las modificaciones abarcan la deleción, mutación y/o sustitución de uno o más nucleótidos (contiguos o no) dentro del gen viral o sus elementos reguladores. Puede(n) realizarse una(s) modificación/modificaciones de varias formas conocidas por los expertos en la técnica usando técnicas recombinantes convencionales. En la bibliografía se dan a conocer modificaciones a modo de ejemplo con una preferencia específica por aquellas que alteran los genes virales implicados en el metabolismo del ADN, la virulencia del huésped, la ruta del IFN (véase, por ejemplo, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608) y similares.
El poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención se modifica alterando el gen que codifica para la timidina cinasa (locus J2R). La enzima TK está implicada en la síntesis de desoxirribonucleótidos. La TK es necesaria para la replicación viral en células normales, ya que estas células tienen generalmente una baja concentración de nucleótidos, mientras que es prescindible en células en división que contienen una alta concentración de nucleótidos.
Alternativamente, o en combinación, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención se modifica alterando al menos un gen o ambos genes que codifican para la ribonucleótido reductasa (RR). En el contexto natural, esta enzima cataliza la reducción de ribonucleótidos para dar desoxirribonucleótidos, que representa una etapa crucial en la biosíntesis del ADN. La enzima viral es similar en cuanto a estructura de subunidades a la enzima de mamífero, componiéndose de dos subunidades heterólogas, designadas R1 y R2, codificadas respectivamente por el locus I4L y F4L. Las secuencias para los genes I4L y F4L y sus ubicaciones en el genoma de diversos poxvirus están disponibles en bases de datos públicas, por ejemplo, a través del número de registro DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, AF482758.2, NC_003389, NC_003310, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, L22579, NC_006998, DQ121394 y NC_008291. En el contexto de la invención, pueden inactivarse o bien el gen I4L (que codifica para la subunidad grande R1) o bien el gen F4L (que codifica para la subunidad pequeña R2), o ambos.
Alternativamente, o en combinación, también pueden seguirse otras estrategias para aumentar adicionalmente la especificidad de tumor del virus. Un ejemplo representativo de modificación adecuada incluye la alteración del gen que codifica para VGF del genoma viral. VGF (para el factor de crecimiento VV) es una proteína secretada que se expresa poco después de la infección celular y su función parece importante para la propagación del virus en las células normales. Otro ejemplo es la alteración del gen A56R que codifica para la hemaglutinina, opcionalmente en combinación con la deleción de TK (Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67:10038-46). La alteración del/de los gen(es) modulador(es) de interferón también puede ser ventajosa (por ejemplo, el gen B8R o B18R) o el gen B13R del inhibidor de caspasa-1. Otra modificación adecuada comprende la alteración del gen F2L que codifica para la dUTPasa viral implicada tanto en mantener la fidelidad de la replicación del ADN como en proporcionar el precursor para la producción de TMP por la timidilato sintasa (Broyles et al., 1993, Virol. 195: 863-5). La secuencia del gen F2L del virus de la vaccinia está disponible en Genbank a través del número de registro M25392 y un poxvirus defectuoso en el locus F2L está disponible en el documento WO2009/065547.
El virus oncolítico de esta invención es un poxvirus defectuoso en el locus J2R que resulta de mutaciones inactivadoras, de modo que carece de actividad TK viral. En otra realización preferida, el virus oncolítico de esta invención es un poxvirus defectuoso en las actividades tanto TK como RR que resultan de mutaciones inactivadoras tanto en el locus J2R como en al menos uno de los locus I4L y/o F4L que codifican para RR portados por el genoma viral (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2009/065546 y Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71).
En otra realización, el virus oncolítico de esta invención es un poxvirus defectuoso para dUTPasa que resulta de mutaciones inactivadoras en el gen F2L (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2009/065547), opcionalmente en combinación con la alteración de al menos una de las actividades TK y RR, o ambas (dando como resultado un virus con mutaciones inactivadoras en el gen F2L; F2L y J2R; F2L e I4L; o F2L, J2R e I4L).
Modulador de agrupaciones de nucleósidos y citidina desaminasa
El término “nucleósido” se refiere a cualquiera de diversos compuestos que consisten en un azúcar, normalmente ribosa o desoxirribosa, y una base de purina o pirimidina. Más precisamente, el término “ribonucleósido” designa cualquier base de purina o pirimidina unida a una ribosa. De manera similar, el término “desoxirribonucleósido” se refiere a cualquier base de purina o pirimidina unida a una desoxirribosa. Como resultado, la expresión “nucleósido” designa tanto ribonucleósidos como desoxirribonucleósidos. Ejemplos de nucleósidos son citidina y desoxicitidina. El término “nucleótido” se refiere a cualquiera de diversos compuestos que consisten en un nucleósido y uno o más fosfatos. La expresión “nucleótido” designa tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Ejemplos de nucleótidos son citidina-monofosfato, citidina-difosfato o citidina-trifosfato.
Tal como se usa en el presente documento, el término “modulador de agrupaciones de nucleósidos” o “modulador de una agrupación de nucleósidos” se refiere a cualquier componente que actúa directa o indirectamente sobre la agrupación de nucleósidos, de manera negativa o positiva. De manera similar, el término “modulador de agrupaciones de nucleótidos” o “modulador de una agrupación de nucleótidos” se refiere a cualquier componente que actúa directa o indirectamente sobre la agrupación de nucleótidos de manera negativa o positiva. El término “modulador” significa modulador(es) completo(s), partes (por ejemplo, truncadas) y análogos de los mismos. El término “moduladores” abarca moduladores “celulares” que están presentes de manera natural en una célula huésped, tal como en seres humanos, animales, insectos o microorganismos (por ejemplo, virus, bacterias). La expresión de moduladores de agrupaciones de nucleósidos celulares puede aumentarse en células en división (De Pas et al., 2008, J. Clin. Oncol., 20; 26:14644). En el contexto de la presente invención, tal(es) “modulador(es)” incluye(n) moduladores que aumentan la agrupación de nucleósidos/nucleótidos así como aquellos que disminuyen la agrupación de nucleósidos/nucleótidos. Tal(es) modulador(es) puede(n) actuar directa o indirectamente sobre la agrupación de nucleósidos o nucleótidos. Los nucleósidos y nucleótidos de la invención pueden ser endógenos (por ejemplo, biosíntesis de novo, ruta de rescate) o exógenos (por ejemplo, degradación de alimentos o fármacos). También pueden estar libres (por ejemplo, en el citoplasma) o complejados (por ejemplo, en el ADN). En una realización, los nucleósidos y nucleótidos de la invención están fluorados.
Ventajosamente, tales moduladores de agrupaciones de nucleósidos o nucleótidos son nucleósido o nucleótido desaminasas. Las desaminasas son enzimas que catalizan la reacción de desaminación, que es la retirada de un grupo amina de una molécula. Las nucleósido desaminasas catalizan la reacción de desaminación de los nucleósidos. Preferiblemente, el modulador de agrupaciones de nucleósidos para su uso en la invención tiene actividad citidina desaminasa. Más preferiblemente, es una citidina desaminasa que se produce de manera natural o un análogo de la misma. El término “citidina desaminasa” o “CDAsa” tal como se usa en el presente documento designa citidina desaminasa y cualquier análogo de la misma, siempre que dicho análogo conserve una actividad enzimática citidina desaminasa sustancial (al menos el 50% del homólogo silvestre). El término análogo abarca un fragmento de CDAsa (por ejemplo, una CDAsa truncada) así como una CDAsa mutada que comprende una o más modificaciones de aminoácidos preferiblemente fuera del sitio catalítico. En la bibliografía, la citidina desaminasa también se denomina “desoxicitidina desaminasa” y “citidina aminohidrolasa”.
Las citidina desaminasas pertenecen a la familia de enzimas de múltiples subunidades que catalizan la desaminación hidrolítica de su sustrato para dar un producto de uracilo correspondiente (Somasekaram et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (40):28405-12). Las CDAsas desempeñan un papel importante en el rescate de nucleósidos y nucleótidos de pirimidina. Más precisamente, las CDAsas catalizan la desaminación de componentes basados en citidina para dar componentes basados en uridina, tales como, por ejemplo, citidina (C) para dar uridina (U) y desoxicitidina (dC) para dar desoxiuridina (dU) (Demontis et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. 1443: 323-33). Esta desaminación puede dirigirse a otros componentes basados en citidina. Por ejemplo, la desaminación de dC y 5-metil-2'-desoxicitidina (5mdC) por CDAsas da como resultado dU y timidina (T), que son el precursor normal para la síntesis de timina-trifosfato. Otro ejemplo es la conversión de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (5hmdC) y 5-formil-2'-desoxicitidina (5fdC) en variantes de uridina, respectivamente 5hmdU y 5fdU, que son tóxicas para las células cuando se incorporan al ADN, ya que se reconocen como bases dañadas (Zauri et al., 2015, Nature, 524:114-118). Otro ejemplo es la desaminación de análogos de nucleósido quimioterápicos tales como Ara-C, 5-azacitidina y 2,2-difluorodesoxicitidina (gemcitabina), que da como resultado una pérdida de su actividad citotóxica y antitumoral (Fitzgerald etal., 2006, Hum. Genet., 119(3):276-83).
Las dos familias de citidina desaminasas presentan diferentes funciones biológicas, desaminando o bien las citidinas libres, tal como realiza la citidina desaminasa (CDA o CDD; EC 3.5.4.5), o bien desaminando las citidinas incorporadas dentro de los polímeros de ADN o ARN, tal como realizan las proteínas AID/APOBEC (desaminasa inducida por activación y de tipo polipéptido catalítico de edición de ARNm de apolipoproteína B) (Mameri et al., 2016, Clin. Cancer. Res. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-16-0626; Conticello etal., 2005, Mol. Biol. Evol. 22: 367-77).
Pueden usarse diversas citidina desaminasas en el contexto de la presente invención, incluyendo citidina desaminasas de mamíferos (por ejemplo, seres humanos), bacterianas o eucariotas inferiores. En una realización, el virus oncolítico de la presente invención codifica para o se usa en combinación con una CDAsa de origen humano. Los ejemplos representativos de citidina desaminasas humanas incluyen, sin limitación, CDA humana, también denominada hCD (registro de GenBank n.°: NM_001785; NP_001776), citidina desaminasa inducida por activación (AID o AICDA, registro de GenBank n.°: NM_020661; EAW88615.1; BAB12721), miembros de la familia de proteínas APOBEC (APOBEC1 (registro de GenBank n.°: NM_001644; BAA23882), APOBEC2 (registro de GenBank n.°: NM_006789; AF161698_1), APOBEC3A (registro de GenBank n.°: KM_266646; AKE33285), APOBEC3B (registro de GenBank n.°: NM_004900; AAH53859), APOBEC3C (registro de GenBank n.°: NM_014508), APOBEC3D (registro de GenBank n.°: NM_152426), APOBEC3E (registro de GenBank n.°: NM_152426), APOBEC3F (registro de GenBank n.°: NM_145298) APOBEC3G (registro de GenBank n.°: NM_021822; AAH61914.1), APOBEC3H (registro de GenBank n.°: n M_001166003), APOBEC4 (registro de GenBank n.°: NM_203454.2)) y proteínas similares a la citidina desaminasa.
La citidina desaminasa también puede originarse a partir de microorganismos, tales como hongos, levaduras, virus o bacterias. Los ejemplos de citidina desaminasa no humana se originan a partir de levadura (por ejemplo, CDD1: registro de GenBank n.°: NM_001182132; EDN59461), Candida glabrata (registro de GenBank n.°: KTB24532), Arabidopsis thaliana (registro de Genbank n.°: AJ005687), E. coli (registro de GenBank n.°: NP_416648), etc.
En una realización, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente codifica para un polipéptido de CDAsa seleccionado del grupo que consiste en CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID y proteínas similares a la citidina desaminasa.
En una realización preferida, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención codifica para la citidina desaminasa de levadura (CDD1), en el que dicha CDD1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con la SEQ ID NO:1.
En otra realización, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención codifica para la citidina desaminasa humana (hCD), en el que dicha hCD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:2.
En todavía otra realización preferida, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención codifica para la APOBEC2 humana, en el que dicha APOBEC2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con s Eq ID NO:3. La presente invención se refiere preferiblemente a un poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente que comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para citidina desaminasa. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican para citidina desaminasa de levadura (CDD1) y citidina desaminasa humana (hCD) pueden insertarse en el genoma viral (por ejemplo, en diferentes ubicaciones) bajo el control de elementos reguladores apropiados tal como se describe a continuación en el presente documento. La(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) para CDAsa puede(n) insertarse en cualquier ubicación del genoma viral, con una preferencia específica por un locus no esencial. Por ejemplo, el gen TK, el gen RR o las zonas intergénicas son particularmente apropiados para la inserción en el virus de la vaccinia oncolítico. En una realización preferida, la presente invención se refiere a un virus de la vaccinia atenuado defectuoso en las actividades codificadas por TK y RR virales y que codifica para una CDAsa humana o de levadura, tal como VVTK-RR-/CDD1, VVTK-RR-/hCD o VVTK-RR-/APOBEC2 ilustradas en la sección de ejemplos.
La “molécula de ácido nucleico que codifica para citidina desaminasa” puede obtenerse fácilmente mediante clonación, mediante PCR o mediante síntesis química basándose en la información proporcionada en el presente documento y el conocimiento general del experto. La molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa para su uso en el presente documento puede ser secuencias que codifican para CDAsa nativas (por ejemplo, ADNc) o un análogo de las mismas derivado de esto último mediante la mutación, deleción, sustitución y/o adición de uno o más nucleótidos. Además, la molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa puede optimizarse para proporcionar un alto nivel de expresión en una célula huésped o sujetos particulares tal como se describe a continuación en el presente documento.
Ácido(s) nucleico(s) de interés
Según una realización específica, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención puede comprender además, insertados en su genoma, uno o más ácidos nucleicos de interés diferentes de la molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa. Según la invención, el/los ácido(s) nucleico(s) de interés puede(n) ser homólogo(s) o heterólogo(s) del organismo huésped en el que se introduce(n). Más específicamente, puede ser de origen humano o no (por ejemplo, de origen bacteriano, de levadura o viral). Ventajosamente, dicho ácido nucleico de interés codifica para la totalidad o parte de un polipéptido. Se entiende que un polipéptido es cualquier producto de traducción de un polinucleótido independientemente de su tamaño, y de si está glicosilado o no, e incluye péptidos y proteínas.
En el contexto de la invención puede contemplarse un gran número de ácidos nucleicos de interés, tales como aquellos que codifican para polipéptidos que se espera que provoquen un efecto beneficioso en el transcurso o un síntoma del estado patológico que va a tratarse, tales como polipéptidos que pueden compensar proteínas defectuosas o deficientes en el sujeto, o aquellos que actúan a través de efectos tóxicos para limitar o eliminar células dañinas del cuerpo o aquellos que codifican para polipéptidos que confieren inmunidad (por ejemplo, polipéptidos inmunoestimuladores y/o antígenos para inducir o activar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular), o permeasa para aumentar la agrupación de nucleósidos/nucleótidos celular, entre muchos otros. Tales ácidos nucleicos de interés pueden obtenerse a partir de una secuencia que se produce de manera natural o modificarse mediante la mutación, deleción, sustitución y/o adición de uno o más nucleótidos.
En el contexto de la invención, el ácido nucleico de interés puede originarse a partir de procariotas (que comprenden los reinos Bacteria, Archaea), acariotas (que comprenden los virus) o eucariotas (que comprenden los reinos Protista, Fungi, Plantae, Animalia).
En la siguiente lista se dan ejemplos de ácidos nucleicos de interés adecuados: el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención puede portar además un ácido nucleico que codifica para polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en enzimas (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, óxido nítrico sintasa NOS, SOD, catalasa, hialuronidasa...), inhibidores de enzimas (alfal-antitripsina, antitrombina III, inhibidor de proteasa viral, inhibidor del activador del plasminógeno PAI-1), proteínas, antígenos CMH de clase I o II, polipéptidos que pueden modular/regular la expresión de genes celulares, polipéptido que puede inhibir una infección bacteriana, parasitaria o viral o su desarrollo (polipéptidos antigénicos, epítopos antigénicos, variantes transdominantes que inhiben la acción de una proteína nativa por competencia...), inductores o inhibidores de la apoptosis (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid y Bim, inhibidor de Bax, inhibidor de Bak, inhibidor de Bok, inhibidor de Bad, inhibidor de Bid, inhibidor de Bim, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Nr13, inhibidor de Bcl2, inhibidor de Bcl-xL, inhibidor de Bcl-w, inhibidor de Nr13), agentes citostáticos (p21, p16, Rb...), apolipoproteínas (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), inhibidores de la angiogénesis (angiostatina, endostatina...), anticuerpos anti-VEGF o scFv, eliminadores de radicales de oxígeno, polipéptidos con efecto antitumoral, anticuerpos, toxinas, inmunotoxinas, marcadores (beta-galactosidasa, luciferasa...) o cualquier otro ácido nucleico de interés que se reconocen en la técnica como útiles para el tratamiento o la prevención de un estado clínico. Los ácidos nucleicos antitumorales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican para genes supresores de tumores (por ejemplo, Rb, p53, DCC, NF-1, tumor de Wilms, NM23, BRUSH-1, p56, p73, así como sus respectivos mutantes), anticuerpos, polipéptidos que inhiben la división celular o señales de transducción.
Polipéptido inmunoestimulador
En otra realización de la invención, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención puede comprender además un polipéptido inmunoestimulador. Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido inmunoestimulador” se refiere a un polipéptido, o a una proteína, que tiene la capacidad de estimular el sistema inmunitario, de una manera específica o inespecífica. Se conocen en la técnica un gran número de proteínas por su capacidad para ejercer un efecto inmunoestimulador. Los ejemplos de proteínas inmunoestimuladoras adecuadas en el contexto de la invención incluyen, sin limitación, inhibidores del punto de control inmunitario, incluyendo, pero sin limitarse a, anti-PD1, anti-PDL1, anti-PDL-2, anti-CTLA4, anti-Tim3, anti-LAG3, anti-BTLA; citocinas, tales como interferón alfa, beta o gamma, interleucina (en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12) o factor de necrosis tumoral (TNF); agentes que afectan a la regulación de los receptores de superficie celular, tales como, por ejemplo, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (en particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, gefitinib, erlotinib o lapatinib) o inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (en particular trastuzumab); agentes que afectan a la angiogénesis, tales como, por ejemplo, inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (en particular, bevacizumab o ranibizumab); agentes que estimulan las células madre para producir granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), macrófagos tales como, por ejemplo, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...)) y proteínas B7 (B7.1, B7.2 y similares).
Antígenos
El término “antígeno” se refiere generalmente a una sustancia que es reconocida y unida selectivamente por un anticuerpo o por un receptor antigénico de células T, con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria. Se contempla que el término antígeno abarca antígeno nativo así como un fragmento (por ejemplo, epítopos, dominios inmunogénicos, etc.) y derivado del mismo, siempre que tal fragmento o derivado pueda ser la diana de una respuesta inmunitaria. Los antígenos adecuados en el contexto de la invención son preferiblemente polipéptidos (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, polipéptidos modificados de manera posterior a la traducción, etc.) que incluyen uno o más epítopos de células B o uno o más epítopos de células T o ambos epítopos de células B y T y que pueden generar una respuesta inmunitaria, preferiblemente, una respuesta humoral o celular que puede ser específica para ese antígeno. Normalmente, el uno o más antígenos se seleccionan en relación con la enfermedad a tratar. Los antígenos preferidos para su uso en el presente documento son antígenos de cáncer y antígenos de patógenos inductores de tumores.
En determinadas realizaciones, el/los antígeno(s) contenido(s) en o codificado(s) por el virus oncolítico es/son antígeno(s) de cáncer (también denominados antígenos asociados a tumores) que está(n) asociado(s) con y/o sirve(n) como marcadores para cánceres. Los antígenos de cáncer abarcan diversas categorías de polipéptidos, por ejemplo, los que normalmente son silenciosos (es decir, no se expresan) en células normales, los que se expresan sólo en niveles bajos o en determinadas etapas de diferenciación y los que se expresan temporalmente, tales como los antígenos embrionarios y fetales, así como los que resultan de la mutación de genes celulares, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), protooncogenes (por ejemplo, familia ErbB) o proteínas resultantes de translocaciones cromosómicas. Los antígenos de cáncer también abarcan antígenos codificados por organismos patógenos (bacterias, virus, parásitos, hongos, viroides o priones) que pueden inducir un estado maligno en un sujeto (especialmente en un sujeto infectado crónicamente), tales como virus tumorales de ARN y ADN (por ejemplo, VPH, VHC, VEB, etc.) y bacterias (por ejemplo, Helicobacterpylori).
Algunos ejemplos no limitativos de antígenos de cáncer incluyen, sin limitación, MART-1/Melan-A, gp100, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno asociado a tumor colorrectal (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno prostático específico (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC (por ejemplo, MUC1, MUC16, etc.; véanse, por ejemplo, los documentos US 6.054.438; WO98/04727; o WO98/37095), HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfa-fetoproteína, E-cadherina, alfa-catenina, beta-catenina y gamma-catenina, p120ctn, gp100.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo de Ig, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, familia Smad de antígenos de cáncer, glicógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2 y antígenos virales tales como los antígenos E6 y E7 de VPH-16 y VPH-18 y el antígeno nuclear codificado por VEB (EBNA)-1.
Otros antígenos adecuados para su uso en esta invención son los antígenos marcadores (beta-galactosidasa, luciferasa, proteínas verdes fluorescentes, etc.).
La presente invención también abarca poxvirus oncolíticos tal como se definieron anteriormente que expresan dos o más polipéptidos de interés tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, al menos dos antígenos, al menos un antígeno y una citocina, al menos dos antígenos y una citocina, etc.
Permeasas
Según otra realización, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención puede comprender además al menos un ácido nucleico de interés que es una permeasa.
Tal como se usa en el presente documento, el término “permeasa” se refiere a una proteína transmembranosa implicada en la translocación de nucleósidos y bases nitrogenadas. Ejemplos de permeasas que están implicadas en la translocación de nucleósidos, análogos de nucleósido y bases nitrogenadas son hCNT1, hCNT2, hCNT3, hENT1 y hENT2. Las proteínas hCNT1, hCNT2 y hCNT3 translocan nucleósidos de manera acoplada a Na+ con alta afinidad y algo de selectividad de sustrato, prefiriendo hCNT1 y hCNT2 a pirimidina y purina, respectivamente, y transportador de selectividad externa de hCNT3. hENT1 y hENT2 están inequívocamente implicadas en la translocación de nucleósidos y bases nitrogenadas (Pastor-Anglada et al., 2015, Front. Pharmacol., 6(13):1-14). Otros ácidos nucleicos de interés:
El poxvirus oncolítico de la invención puede comprender además al menos un ácido nucleico de interés, incluyendo, pero sin limitarse a:
- ácido nucleico que codifica para endonucleasa, tal como enzimas de restricción (por ejemplo, enzimas de restricción de tipo I, II, III, IV o V, enzimas de restricción artificiales tales como nucleasas efectoras similares a activador de la transcripción (TALEN) o nucleasa con dedos de zinc), CRISPR/Cas9;
- ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, miARN, ARNhc, ARNip específicos de la diana.
Las secuencias de ácidos nucleicos de interés pueden obtenerse fácilmente mediante clonación, mediante PCR o mediante síntesis química usando técnicas convencionales. Además, sus secuencias están ampliamente descritas en la bibliografía que pueden consultar los expertos en la técnica. En cuanto a la molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa, el/los ácido(s) nucleico(s) de interés puede(n) insertarse en cualquier ubicación del genoma viral, con una preferencia específica por un locus no esencial. Por ejemplo, el gen TK, el gen RR o las zonas intergénicas son particularmente apropiados para la inserción en el virus de la vaccinia oncolítico.
Expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa y del/de los ácido(s) nucleico(s) de interés Tal como se mencionó anteriormente, la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) para CDAsa y/o el/los ácido(s) nucleico(s) de interés que se inserta(n) en el genoma del poxvirus oncolítico de la presente invención puede(n) optimizarse para proporcionar un alto nivel de expresión en una célula huésped o un sujeto particular. De hecho, se ha observado que los patrones de uso de codones de los organismos son altamente no aleatorios y el uso de codones puede ser notablemente diferente entre diferentes huéspedes. Como tal(es) ácido(s) nucleico(s) puede(n) ser de origen bacteriano o eucariota inferior, pueden tener un patrón de uso de codones inadecuado para una expresión eficaz en células eucariotas superiores (por ejemplo, humanas). Normalmente, la optimización de codones se realiza reemplazando uno o más codones “nativos” (por ejemplo, bacterianos o de levadura) correspondientes a un codón usado con poca frecuencia en el organismo huésped de interés por uno o más codones que codifican para el mismo aminoácido que se usa con más frecuencia. No es necesario reemplazar todos los codones nativos correspondientes a los codones usados con poca frecuencia, ya que puede lograrse una mayor expresión incluso con un reemplazo parcial.
Además de la optimización del uso de codones, la expresión en la célula huésped o el sujeto puede mejorarse adicionalmente a través de modificaciones adicionales de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, puede ser ventajoso evitar la agrupación de codones raros no óptimos que están presentes en áreas concentradas y/o suprimir o modificar elementos de secuencia “negativos” que se espera que influyan negativamente en los niveles de expresión. Tales elementos de secuencia negativos incluyen, sin limitación, las regiones que tienen un contenido en GC muy alto (>80%) o muy bajo (<30%); tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC; secuencias repetidas directas o invertidas inestables; y/o elementos reguladores crípticos internos tales como cajas TATA internas, sitios chi, sitios de entrada al ribosoma y/o sitios donantes/aceptores de corte y empalme.
Según la presente invención, el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente comprende los elementos necesarios para la expresión del/los ácido(s) nucleico(s) de interés. Más precisamente, la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) para CDAsa y/o el/los ácido(s) nucleico(s) de interés insertados en el genoma del virus oncolítico de la invención está(n) operativamente unido(s) a elementos reguladores adecuados para su expresión en una célula huésped o un sujeto. Tal como se usa en el presente documento, el término “elementos reguladores” o “secuencia reguladora” se refiere a cualquier elemento que permite, contribuye o modula la expresión en una célula huésped o un sujeto dado, incluyendo replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción, estabilidad y/o transporte del/de los ácido(s) nucleico(s) o su derivado (es decir, ARNm). Tal como se usa en el presente documento, “operativamente unido” significa que los elementos que se unen están dispuestos de modo que funcionen en coordinación para los fines previstos. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una molécula de ácido nucleico si el promotor efectúa la transcripción desde el inicio de la transcripción hasta el terminador de dicha molécula de ácido nucleico en una célula huésped permisiva.
Los expertos en la técnica apreciarán que la elección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la propia molécula de ácido nucleico, el virus en el que se inserta, la célula huésped o el sujeto, el nivel de expresión deseado, etc. El promotor es de especial importancia. En el contexto de la invención, puede ser constitutivo que dirija la expresión del producto codificado (por ejemplo, CDAsa y/o molécula terapéutica) en muchos tipos de células huésped o específico de determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del hígado) o regulado en respuesta a acontecimientos específicos o factores exógenos (por ejemplo, por temperatura, aditivo de nutrientes, hormona, etc.) o según la fase de un ciclo viral (por ejemplo, tardío o temprano). También pueden usarse promotores que se reprimen durante la etapa de producción en respuesta a acontecimientos específicos o factores exógenos, con el fin de optimizar la producción de virus y evitar la toxicidad potencial del/de los polipéptido(s) expresado(s).
Aunque pueden usarse promotores convencionales tales como el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) (documento US 5.168.062), el promotor del VSR, el promotor tardío principal del adenovirus, el promotor de fosfoglicero cinasa (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), el promotor de la timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS)-1 y el promotor de la polimerasa T7 (documento WO98/10088) en el contexto de la presente invención. Los promotores del virus de la vaccinia están particularmente adaptados para la expresión en poxvirus oncolíticos. Los ejemplos representativos incluyen, sin limitación, el promotor de vaccinia 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28), TK, p28, p11, Pr13.5 (documento WO2014/063832), pB8R, pF11L, pA44L, pC11R (documento WO2011/128704) y K1L, así como promotores sintéticos tales como los descritos en Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques, 23: 1094-7); Hammond et al., 1997, J. Virol. Methods, 66: 135-8; y Kumar y Boyle, 1990, Virology, 179: 151-8), así como promotores quiméricos tempranos/tardíos (por ejemplo, documentos US 8.394.385; US 8.772.023). Los promotores de la viruela vacuna también son adecuados (por ejemplo, el promotor ATI). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de CDAsa se inserta en el locus TK del virus oncolítico de la invención y se coloca bajo el control del promotor de vaccinia p11.5K.
Los expertos en la técnica apreciarán que los elementos reguladores que controlan la expresión de ácidos nucleicos pueden comprender además elementos adicionales para el inicio, la regulación y/o terminación adecuados de la transcripción (por ejemplo, una secuencia de terminación de la transcripción), el transporte de ARNm (por ejemplo, secuencias señal de localización nuclear), el procesamiento (por ejemplo, señales de corte y empalme) y la estabilidad (por ejemplo, intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes), la traducción (por ejemplo, un iniciador Met, secuencias líder tripartitas, sitios de unión al ribosoma IRES, péptidos señal, etc.), secuencias de direccionamiento, secuencias de transporte, señal de secreción y secuencias implicadas en la replicación o integración. Dichas secuencias se han notificado en la bibliografía y pueden obtenerlas fácilmente los expertos en la técnica.
Procedimiento de preparación de un virus oncolítico.
La invención también se refiere a un procedimiento para preparar un poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la invención, procedimiento en el que:
(i) se introduce un poxvirus oncolítico de la invención en una célula productora,
(ii) se cultiva dicha célula productora en condiciones que son apropiadas para permitir que se produzca dicho poxvirus oncolítico, y
(iii) se recupera dicho poxvirus oncolítico a partir del cultivo celular.
Normalmente, el poxvirus oncolítico de la presente invención se produce en una línea celular huésped adecuada usando técnicas convencionales que incluyen el cultivo de la célula huésped transfectada o infectada en condiciones adecuadas para permitir la producción de partículas virales infecciosas y recuperar las partículas virales infecciosas producidas a partir del cultivo de dicha célula y opcionalmente purificar dichas partículas virales infecciosas recuperadas. Las células huésped adecuadas para la producción del virus oncolítico incluyen, sin limitación, líneas celulares humanas tales como HeLa (ATCC), células 293 (Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17), células de mono tales como las líneas celulares Vero (ATCC CCL-081), CV1 (ATCC CCL-70) y BSC1 (ATCC CCL-26), células aviares tales como las descritas en los documentos WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075, etc.), líneas celulares de hámster tales como BHK-21 (ATCC CCL-10) así como fibroblastos de embriones de pollo primarios (CEF) preparados a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados. Las células huésped se cultivan preferiblemente en un medio libre de productos derivados de animales o seres humanos, usando un medio químicamente definido sin productos de origen animal o humano. El cultivo se lleva a cabo a una temperatura, un pH y un contenido de oxígeno adecuados para la célula productora. Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica. Si hay presentes factores de crecimiento, preferiblemente se producen de manera recombinante y no se purifican a partir de material animal. Los medios adecuados sin componentes animales están disponibles comercialmente, por ejemplo, medio VP-SFM (Invitrogen) para cultivar células productoras de CEF. Las células productoras se cultivan preferiblemente a una temperatura comprendida entre 30°C y 38°C (más preferiblemente a aproximadamente 37°C) durante entre 1 y 8 días (preferiblemente de 1 a 5 días para CEF y de 2 a 7 días para células inmortalizadas) antes de la infección. Si es necesario, pueden realizarse varios pases de 1 a 8 días para aumentar el número total de células.
Las células productoras son infectadas por el virus oncolítico con una multiplicidad de infección (MOI) apropiada, que puede ser tan baja como de 0,001 (más preferiblemente entre 0,05 y 5) para permitir una infección productiva.
En la etapa ii), las células productoras infectadas se cultivan luego en condiciones apropiadas bien conocidas por los expertos en la técnica hasta que se produce la progenie del vector viral. El cultivo de células productoras infectadas también se realiza preferiblemente en un medio químicamente definido (que puede ser el mismo o diferente del medio usado para el cultivo de células productoras y/o para la etapa de infección) libre de productos derivados de animales o seres humanos a un temperatura entre 30°C y 37°C, durante de 1 a 5 días.
En la etapa iii), las partículas virales pueden recogerse del sobrenadante del cultivo y/o de las células productoras. La recuperación a partir de las células productoras (y opcionalmente también a partir del sobrenadante del cultivo) puede requerir una etapa que permita la rotura de la membrana de la célula productora para permitir la liberación del virus a partir de las células productoras. La rotura de la membrana de la célula productora puede inducirse mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, congelación/descongelación, lisis hipotónica, sonicación, microfluidización u homogeneización a alta velocidad.
El poxvirus oncolítico recuperado, tal como se definió anteriormente, puede purificarse al menos parcialmente antes de usarse según la presente invención. Pueden contemplarse diversas etapas de purificación, incluyendo clarificación, tratamiento enzimático (por ejemplo, endonucleasa tal como benzonasa, proteasa), ultracentrifugación (por ejemplo, gradiente de sacarosa o gradiente de cloruro de cesio), etapas cromatográficas y de filtración. En la técnica se describen métodos apropiados (por ejemplo, documentos WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).
Composición de virus oncolítico
La invención también se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente de la presente invención o preparada según el procedimiento descrito en el presente documento. Preferiblemente, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” corresponde a la cantidad de cada uno de los agentes activos comprendidos en la composición de la invención que es suficiente para producir uno o más resultados beneficiosos. Una cantidad terapéuticamente eficaz de este tipo puede variar en función de diversos parámetros, por ejemplo, el modo de administración; el estado patológico; la edad y el peso del sujeto; la capacidad del sujeto para responder al tratamiento; tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; y/o la necesidad de prevención o terapia. Cuando se trata de uso profiláctico, la composición de la invención se administra en una dosis suficiente para prevenir o retrasar el inicio y/o establecimiento y/o la recidiva de un estado patológico (por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como cáncer), especialmente en un sujeto en riesgo. Para uso “terapéutico”, la composición de la invención se administra a un sujeto diagnosticado con un estado patológico (por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como cáncer) con el objetivo de tratar la enfermedad, opcionalmente en asociación con una o más modalidades terapéuticas convencionales. En particular, una cantidad terapéuticamente eficaz podría ser la cantidad necesaria para provocar una mejora observable del estado clínico con respecto al estado inicial o sobre con respecto al estado esperado si no se trata, tal como se describe a continuación en el presente documento. Una mejora del estado clínico puede evaluarse fácilmente mediante cualquier medición clínica relevante que usen normalmente los médicos y el personal sanitario cualificado. Por ejemplo, pueden usarse técnicas habitualmente usadas en los laboratorios (por ejemplo, citometría de flujo, histología, técnicas de obtención de imágenes, etc.) para realizar la vigilancia de tumores. Una cantidad terapéuticamente eficaz también podría ser la cantidad necesaria para provocar el desarrollo de una respuesta antitumoral inespecífica (innata) y/o específica eficaz. Normalmente, el desarrollo de una respuesta inmunitaria, en particular la respuesta de células T, puede evaluarse in vitro, en modelos animales adecuados o usando muestras biológicas recogidas del sujeto. También pueden usarse diversos anticuerpos disponibles para identificar diferentes poblaciones de células inmunitarias involucradas en la respuesta antitumoral que están presentes en los sujetos tratados, tales como células T citotóxicas, células T citotóxicas activadas, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos citolíticos naturales activados.
La dosificación apropiada del virus oncolítico puede adaptarse en función de diversos parámetros y puede determinarse de manera rutinaria por un médico a la luz de las circunstancias relevantes. De manera adecuada, las dosis individuales para el poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente pueden variar dentro de un intervalo que se extiende desde aproximadamente 103 hasta aproximadamente 1012 pv (partículas virales), ui (unidad infecciosa) o UFP (unidades formadoras de placa) según el virus y la técnica cuantitativa usada. Con fines ilustrativos, una dosis adecuada del virus de la vaccinia oncolítico para su uso en seres humanos está comprendida entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1011 UFP, preferiblemente entre aproximadamente 105 UFP y aproximadamente 1010 UFP; siendo particularmente preferidas dosis de aproximadamente 106 UFP a aproximadamente 5*109 UFP (por ejemplo, una dosis de 106, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6*10®, 7*10®, 8*10®, 9x10®, 107, 2*107, 3*107, 4*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*10 8*108, 9*108, 109, 2*109, 3*109, 4*109 o 5*109 UFP). La cantidad de virus presente en una muestra puede determinarse mediante técnicas de titulación rutinarias, por ejemplo, contando el número de placas después de la infección de células permisivas (por ejemplo, BHK-21 o c Ef ), inmunotinción (por ejemplo, usando anticuerpos antivirales; Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211), midiendo la absorbancia A2®0 (títulos de pv), o incluso mediante inmunofluorescencia cuantitativa (títulos de ui).
El término “vehículo farmacéuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los portadores, disolventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de absorción y similares compatibles con la administración en mamíferos y en particular en sujetos humanos.
El poxvirus oncolítico de la invención puede colocarse independientemente en un disolvente o diluyente apropiado para su uso en seres humanos o animales. El disolvente o diluyente es preferiblemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja. Los ejemplos representativos incluyen agua estéril, solución salina fisiológica (por ejemplo, cloruro de sodio), solución de Ringer, disoluciones de glucosa, trehalosa o sacarosa, solución de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiológicamente equilibradas (véase, por ejemplo, la edición más actual de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins).
En otras realizaciones, los poxvirus oncolíticos están adecuadamente tamponados para su uso en seres humanos.
Los tampones adecuados incluyen, sin limitación, tampón fosfato (por ejemplo, PBS), tampón bicarbonato y/o tampón Tris que pueden mantener un pH fisiológico o ligeramente básico (por ejemplo, de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9).
La composición de la invención también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables, incluyendo, por ejemplo, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución de la formulación, modificación o mantenimiento de la liberación o absorción en un sujeto humano o animal, fomento del transporte a través de la barrera sanguínea o penetración en un órgano particular.
En una realización adicional, la composición de la invención puede adyuvarse para potenciar adicionalmente la inmunidad (especialmente una inmunidad mediada por células T) o facilitar la infección de las células tumorales tras la administración. Los ejemplos representativos de adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, alumbre, emulsión de aceite mineral tal como Freund completo e incompleto (IFA), lipopolisacárido o un derivado del mismo
(Ribi et al., 198®, Plenum Publ. Corp., 407-419), saponinas tales como QS21 (Sumino et al., 1998, J.Virol. 72: 4931; documento WO98/5®415), compuestos de imidazoquinolina tales como imiquimod (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43: T®), S-27®09 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324) y compuestos relacionados tales como los descritos en el documento WO2007/147529, polisacáridos tales como Adjuvax y escualenos, emulsiones de aceite en agua tales como MF59, análogos de ARN bicatenario tales como poli(I:C), oligodesoxinucleótidos de citosinafosfato-guanosina monocatenarios (CpG) (Chu et al., 1997, J. Exp. Med., 18®: 1®23; Tritel et al., 2003, J. Immunol.,
171: 2358) y péptidos catiónicos tales como IC-31 (Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life
Sci., 822: 2®3-70).
En una realización, la composición de la invención puede formularse con el objetivo de mejorar su estabilidad, en particular en las condiciones de fabricación y almacenamiento a largo plazo (es decir, durante al menos ® meses, con preferencia de durante al menos dos años) a temperaturas de congelación (por ejemplo, -70°C, -20°C), refrigeradas (por ejemplo, 4°C) o ambientales. Diversas formulaciones de virus están disponibles en la técnica en forma liofilizada o forma líquida congelada (por ejemplo, documentos WO98/02522, Wo 01/®®137, WO03/0534®3, WO2007/05®847 y WO2008/114021, etc.). Las composiciones sólidas (por ejemplo, en polvo seco o liofilizadas) pueden obtenerse mediante un procedimiento que implica secado a vacío y secado por congelación. Con fines ilustrativos, las formulaciones tamponadas que incluyen NaCl y/o azúcar están particularmente adaptadas a la conservación de los virus (por ejemplo, Tris 10 mM pH 8 con sacarosa al 5% (p/v), glutamato de sodio 10 mM y NaCl
50 mM o solución salina tamponada con fosfato con glicerol (al 10%) y NaCI).
La composición de poxvirus oncolítico se formula preferiblemente de una manera adaptada al modo de administración para garantizar una distribución y liberación adecuadas in vivo. Por ejemplo, las cápsulas y los gránulos gastrorresistentes son particularmente apropiados para la administración oral, los supositorios para la administración rectal o vaginal, opcionalmente en combinación con potenciadores de la absorción útiles para aumentar el tamaño de poro de las membranas mucosas. Tales potenciadores de la absorción son normalmente sustancias que tienen similitudes estructurales con los dominios fosfolipídicos de las membranas mucosas (tales como desoxicolato de sodio, glicocolato de sodio, dimetil-beta-ciclodextrina, lauril-1-lisofosfatidilcolina). Otro ejemplo particularmente apropiado es una formulación adaptada a la administración mediante microagujas (por ejemplo, parches transcutáneos o intradérmicos). Una formulación de este tipo puede comprender la resuspensión del producto inmunoterapéutico en solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de endotoxinas.
Administración
El poxvirus oncolítico tal como se definió anteriormente, o la composición de la invención, puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis. Si se contemplan múltiples dosis, las administraciones pueden realizarse mediante la misma o diferentes vías y pueden tener lugar en el mismo sitio o en sitios alternativos. Los intervalos entre cada administración pueden ser desde varias horas hasta 8 semanas (por ejemplo, 24 h, 48 h, 72 h, semanalmente, cada dos o tres semanas, mensualmente, etc.). Los intervalos también pueden ser irregulares. También es posible proceder mediante ciclos secuenciales de administraciones que se repiten después de un periodo de reposo (por ejemplo, ciclos de 3 a 6 administraciones semanales seguidos de un periodo de reposo de 3 a 6 semanas). La dosis puede variar para cada administración dentro del intervalo descrito anteriormente.
Cualquiera de las vías de administración convencionales es aplicable en el contexto de la invención, incluyendo las vías parenteral, tópica o mucosa. Las vías parenterales están destinadas a la administración como una inyección o infusión y abarcan las vías sistémicas así como las locales. Los tipos comunes de inyección parenteral son intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intradérmica (en la dermis), subcutánea (debajo de la piel), intramuscular (en el músculo) e intratumoral (en un tumor o en su proximidad). Normalmente, las infusiones se administran por vía intravenosa. La administración tópica puede realizarse usando medios transdérmicos (por ejemplo, un parche y similares). Las administraciones mucosas incluyen, sin limitación, la vía oral/alimentaria, intranasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal o intrarrectal. En el caso de las vías intranasal, intrapulmonar e intratraqueal, es ventajoso que la administración se realice mediante un aerosol o mediante instilación. Las vías de administración preferidas para el poxvirus oncolítico de la invención incluyen las vías intravenosa e intratumoral. Las administraciones pueden usar jeringas y agujas convencionales (por ejemplo, agujas de inyección Quadrafuse) o cualquier compuesto o dispositivo disponible en la técnica que puede facilitar o mejorar el suministro del/de los agente(s) activo(s) en el sujeto. Los sistemas transdérmicos también son apropiados, por ejemplo, usando microagujas sólidas, huecas, recubiertas o solubles (véase, por ejemplo, Van der Maaden et al., 2012, J. Control release 161: 645-55) y se prefieren los parches de microagujas de silicio y sacarosa (véase, por ejemplo, Carrey et al., 2014, Sci Rep 4: 6154 doi 10.1038; y Carrey etal., 2011, PLoS ONE, 6(7) e22442).
Una composición particularmente preferida comprende de 106 UFP a 5*109 UFP de un poxvirus oncolítico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa y preferiblemente un virus de la vaccinia oncolítico defectuoso en el locus J2R (TK-), en el locus I4L y/o F4L (RR-) o tanto en el locus J2R (TK-) como en el locus I4L/F4L (TK-RR-), con una preferencia específica por un virus de la vaccinia que tiene la molécula de ácido nucleico de CDAsa insertada en lugar del locus Tk y colocada bajo el promotor p11.5K, tal como VVTK-RR-/CDD1 o VVTK-RR-/hCD descritos en el presente documento; formulada para administración intravenosa o intratumoral. Métodos y uso
En otro aspecto, la presente invención proporciona un poxvirus oncolítico o una composición del mismo para su uso para tratar o prevenir una enfermedad o un estado patológico en un sujeto que lo necesita. También se da a conocer un método de tratamiento que comprende administrar el virus oncolítico o la composición del mismo en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o un estado patológico en un sujeto que lo necesita.
Una “enfermedad” (y cualquier forma de enfermedad tal como “trastorno” o “estado patológico”) se caracteriza normalmente por síntomas identificables.
Los ejemplos de enfermedades que pueden prevenirse o tratarse usando el poxvirus oncolítico de la invención o la composición del mismo incluyen enfermedades proliferativas, tales como cánceres, tumores o reestenosis, y enfermedades asociadas con una actividad de osteoclastos aumentada, tales como artritis reumatoide y osteoporosis.
La presente invención es particularmente adecuada para tratar o prevenir cánceres, y particularmente carcinoma adrenocortical, cáncer de corteza suprarrenal, cáncer anal, tumores carcinoides gastrointestinales (por ejemplo, cáncer de apéndice y tumor carcinoide), cáncer de vías biliares (por ejemplo, colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, cáncer de hueso (por ejemplo, sarcoma de Ewing, histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma), tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas, tumores embrionarios, tumores de células germinales, tumor teratoide/rabdoide atípico del sistema nervioso central, craneofaringioma, ependimoma, gliomas y glioblastoma) cáncer de mama (por ejemplo, carcinoma ductal in situ), tumores bronquiales, carcinoma de tumores primarios desconocidos, tumores cardíacos (de corazón), cáncer de cuello uterino, cordoma, neoplasias mieloproliferativas crónicas, cáncer colorrectal (por ejemplo, cáncer de recto), estesioneuroblastoma, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de testículo, enfermedad trofoblástica gestacional, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cáncer de hipofaringe, cáncer de faringe, cáncer de laringe, cáncer de labio y cavidad bucal, cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, cáncer de boca, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer de nasofaringe, cáncer de glándulas salivales, cáncer de garganta, cáncer de esófago), cáncer hepatocelular (de hígado), histiocitosis, células de Langerhans, cáncer de riñón (por ejemplo, tumor de Wilms, cáncer de células renales, cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter), histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe y papilomatosis, leucemia (por ejemplo, tricoleucemia, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA)), cáncer de hígado, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas), linfoma (por ejemplo, linfoma relacionado con el sida, linfoma primario del SNC, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma primario, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin, macroglobulinemia, Waldenstrom, linfoma primario del sistema nervioso central (SNC), síndrome de Sézary, linfoma de células T), melanoma intraocular, mesotelioma, carcinoma del tracto de línea media que involucra el gen NUT, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, síndromes mielodisplásicos de neoplasias de células plasmáticas/mieloma múltiple, neoplasias mieloproliferativas crónicas, neuroblastoma, cáncer de ovario (por ejemplo, cáncer peritoneal primario y cáncer de las trompas de Falopio), cáncer de páncreas y tumores neuroendocrinos de páncreas (tumores de células de los islotes), papilomatosis, paraganglioma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumores vasculares, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células basales, melanoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células de Merkel), cáncer de intestino delgado, sarcoma de partes blandas (por ejemplo, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), cánceres relacionados con el sida, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Kaposi y rabdomiosarcoma), cáncer de estómago (gástrico), cáncer de testículo, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de endometrio y útero, cáncer de vagina y cáncer de vulva. La presente invención también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos.
En una realización preferida, el poxvirus oncolítico o una composición de la invención se usa para tratar cánceres gastrointestinales, que comprenden cánceres de esófago, vesícula biliar, hígado, páncreas, estómago, intestino delgado, intestino (intestino grueso o colon y recto) y ano. Un método particularmente preferido comprende de 1 a 6 administraciones intravenosas o intratumorales del poxvirus oncolítico de la invención o de la composición del mismo administradas a intervalos semanales a mensuales con una preferencia específica por 3 administraciones quincenales (por ejemplo, aproximadamente a D1, D14 y D29) de una composición que comprende 106-5*109 UFP de un virus de la vaccinia oncolítico que comprende, insertado en su genoma, una molécula de ácido nucleico que codifica para CDAsa (por ejemplo, colocada bajo el promotor p11.5K), preferiblemente defectuosa en el locus J2R (TK-), en el locus I4L y/o F4L (RR-) o tanto en el locus J2R (TK-) como en el locus I4L/F4L (TK-RR-), tal como VVTK-RR-/CDD1 o VVTK-RR-/hCD.
Los efectos beneficiosos proporcionados por los métodos de la presente invención pueden resultar evidentes por una mejora observable del estado clínico con respecto al estado inicial o con respecto al estado esperado si no se trata según las modalidades descritas en el presente documento. Una mejora del estado clínico puede evaluarse fácilmente mediante cualquier medición clínica relevante que usen normalmente los médicos y el personal sanitario cualificado. En el contexto de la invención, el beneficio terapéutico puede ser transitorio (durante uno o un par de meses después del cese de la administración) o sostenido (durante varios meses o años). Dado que el curso natural del estado clínico puede variar considerablemente de un sujeto a otro, no es necesario que se observe el beneficio terapéutico en cada sujeto tratado, sino en un número significativo de sujetos (por ejemplo, las diferencias estadísticamente significativas entre dos grupos pueden determinarse mediante cualquier prueba estadística conocida en la técnica, tal como la prueba paramétrica de Tukey, la prueba de Kruskal-Wallis, la prueba U según Mann y Whitney, la prueba de la t de Student, la prueba de Wilcoxon, etc.).
En una realización particular, como los métodos según la presente invención son particularmente apropiados para tratar el cáncer, tales métodos pueden correlacionarse con uno o más de los siguientes: inhibir o ralentizar el crecimiento, la proliferación y la metástasis tumorales, prevenir o retrasar la invasión tumoral (diseminación de células tumorales en tejidos vecinos), reducir el número de tumores; reducir el tamaño del tumor, reducir el número o la extensión de las metástasis, proporcionar una tasa de supervivencia global (SG) prolongada, aumentar la supervivencia libre de progresión (SLP), aumentar la duración de la remisión, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado patológico, proporcionar una mejor respuesta al tratamiento convencional, mejorando la calidad de vida y/o inducir una respuesta antitumoral (por ejemplo, inespecífica (innata) y/o específica tal como una respuesta de células T citotóxicas) en el sujeto tratado según la presente invención.
Las mediciones adecuadas que pueden usarse para evaluar un beneficio clínico, tales como análisis de sangre, análisis de fluidos biológicos y biopsias, así como técnicas de obtención de imágenes médicas, se evalúan de manera rutinaria en laboratorios médicos y hospitales, y hay una gran cantidad de kits disponibles comercialmente.
Pueden realizarse antes de la administración (nivel inicial) y en diversos momentos durante el tratamiento y después del cese del tratamiento.
También se da a conocer un método para tratar una enfermedad o un estado patológico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar el poxvirus oncolítico o la composición de la presente invención, o preparados según el procedimiento descrito en el presente documento. Dicha enfermedad puede ser una enfermedad proliferativa, tal como cánceres, tumores y reestenosis. Dicha enfermedad puede ser una enfermedad asociada con una actividad de osteoclastos aumentada, tal como artritis reumatoide y osteoporosis. Más precisamente, se da a conocer un método para inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo que comprende administrar un virus oncolítico o una composición del mismo a un sujeto que lo necesita para inhibir el crecimiento de un tumor. Como guía general, la inhibición del crecimiento de células tumorales puede evaluarse de manera rutinaria, por ejemplo, mediante medios radiográficos. La(s) administración/administraciones del virus oncolítico o de una composición del mismo da(n) como resultado de manera deseable una disminución de al menos el 10% de la masa tumoral.
Terapia de combinación
El poxvirus oncolítico o la composición puede administrarse en asociación con cualquier modalidad terapéutica convencional que esté disponible para tratar o prevenir la enfermedad o el estado patológico seleccionado como objetivo. Los ejemplos representativos de terapias convencionales incluyen, sin limitación, cirugía, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia, terapia con citocinas, trasplante (por ejemplo, células madre), hipertermia y terapia fotodinámica. Tal(es) terapia(s) convencional(es) se administra(n) al sujeto según la práctica convencional antes de, después de, de manera esencialmente simultánea o intercalada con el virus oncolítico o la composición del mismo.
En una realización, el poxvirus oncolítico o la composición según la invención puede usarse en asociación con radioterapia. Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente protocolos y parámetros de radioterapia apropiados (véase, por ejemplo, Perez y Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2a ed. JB Lippincott Co; usando adaptaciones y modificaciones apropiadas tal como resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica). Los tipos de radiación que pueden usarse se conocen bien en la técnica e incluyen haces de electrones, fotones de alta energía de un acelerador lineal o de fuentes radiactivas tales como cobalto o cesio, protones y neutrones. Los médicos pueden definir intervalos de dosificación para radioisótopos dependiendo de la semivida del isótopo, la intensidad y el tipo de radiación emitida y la captación por parte de las células neoplásicas. La presente invención contempla dosis regulares de rayos X durante periodos de tiempo prolongados (de 3 a 6 semanas) o dosis únicas elevadas.
El poxvirus o la composición tal como se definió anteriormente puede usarse junto con cirugía. Por ejemplo, el poxvirus oncolítico o la composición del mismo puede administrarse tras la extirpación del tumor (por ejemplo, mediante aplicación local dentro de la zona extirpada, por ejemplo).
El poxvirus oncolítico o la composición del mismo puede usarse en combinación con una o más sustancias eficaces en la terapia contra el cáncer, tales como fármacos quimioterápicos o productos inmunoterápicos.
En una realización específica, el poxvirus oncolítico o la composición de la invención puede usarse junto con fármacos quimioterápicos que se usan actualmente para tratar el cáncer. Aunque puede usarse cualquier fármaco quimioterápico contra el cáncer en combinación con el poxvirus oncolítico de la presente invención o la composición del mismo, pueden mencionarse más específicamente agentes alquilantes, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, derivados de platino, inhibidores de los receptores de tirosina cinasa, antimetabolitos y agentes antimitóticos.
En todavía realizaciones adicionales, el poxvirus oncolítico o la composición de la invención puede usarse junto con inmunoterapia, y especialmente con anticuerpos antineoplásicos así como ARNip y polinucleótidos antisentido. Los ejemplos representativos incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales que bloquean el punto de control inmunitario (por ejemplo, ipilimumab, tremelimumab pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, AMP-224MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, etc.), interferón alfa, beta o gamma, interleucina (en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12) o factor de necrosis tumoral; agentes que afectan a la regulación de los receptores de superficie celular tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que bloquean el receptor del factor de crecimiento epidérmico (en particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, trastuzumab (Herceptin™), gefitinib, erlotinib, lapatinib, etc.) y anticuerpos monoclonales que bloquean el factor de crecimiento endotelial vascular (en particular, bevacizumab y ranibizumab). Otros ejemplos representativos de tales productos inmunoterápicos adecuados para su uso en la presente invención son vector de ADN plasmídico, virus de la vaccinia (por ejemplo, Copenhaguen, WR, Wyeth, MVA, etc.), adenovirus, lentivirus, virus del herpes, polipéptidos recombinantes, entre muchos otros. Otro aspecto, tal como se da a conocer en el presente documento, se refiere a la combinación de un poxvirus oncolítico (por ejemplo, poxvirus oncolítico silvestre o virus oncolítico derivado modificado) con al menos una citidina desaminasa, en el que dicha citidina desaminasa no está codificada por el poxvirus oncolítico. Citidina desaminasa, en la que dicha citidina desaminasa no está codificada por el virus oncolítico. La citidina desaminasa puede estar codificada por otro vector, tal como, por ejemplo, moléculas de ADN (plásmidos, vectores virales no oncolíticos, cósmidos y cromosomas artificiales), moléculas de ARN, nanopartículas, etc. La citidina desaminasa también puede estar en su forma polipeptídica. El polipéptido puede ser de cualquier origen, por ejemplo, humano, humanizado, animal, de insectos, de microorganismos o quimérico. Además, el polipéptido puede estar glicosilado o no glicosilado.
El poxvirus oncolítico o la composición del mismo también puede usarse en combinación con sustancias que potencian la actividad citidina desaminasa (por ejemplo, potenciadores de la expresión de citidina desaminasa, inhibidores de la metilación del ADN, tales como 5-Aza-dZ).
Puede proporcionársele al sujeto el poxvirus oncolítico y la terapia contra el cáncer adicional de manera secuencial o intercalada, pero también se contemplan administraciones concomitantes de ambas terapias dentro del mismo periodo de tiempo. El curso del tratamiento puede determinarlo de manera rutinaria un médico y la presente invención abarca diversos protocolos. Por ejemplo, pueden intercalarse de 1 a 10 administraciones del poxvirus oncolítico (por ejemplo, de 3 a 6 inyecciones quincenales) en una o múltiples administraciones de la terapia contra el cáncer adicional (por ejemplo, la quimioterapia puede administrarse en uno o más ciclos de una o varias semanas). Además, después de un curso de tratamiento, se contempla que haya un periodo de tiempo en el que no se administre ningún tratamiento contra el cáncer antes de la repetición del/de los ciclo(s) de tratamiento.
Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones. Los siguientes ejemplos se incorporan para demostrar realizaciones preferidas de la invención.
Ejemplos
MATERIALES Y MÉTODOS
Virus y células
Todos los virus recombinantes usados en este estudio son virus de la vaccinia con doble deleción de timidina cinasa (J2R) y ribonucleótido reductasa (I4L) derivados de la cepa Copenhaguen. VVTK-RR-/GFP es el virus de la vaccinia con doble deleción que expresa el marcador génico GFP (para proteína verde fluorescente). VVTK-RR-/CDD1 es el virus de la vaccinia con doble deleción que expresa el gen CDD1 de citidina desaminasa de levadura (Kurtz et al., 1999, Curr. Genet., 36(3):130-6). VVTK-RR-/hCD es el virus de la vaccinia con doble deleción que expresa ADNc de citidina desaminasa humana CDA (Laliberté y Momparler, 1994, Cancer Res., 54(20):5401-7). VVTK-RR-/APOBEC2 es el virus de la vaccinia con doble deleción que expresa el gen APOBEC2 humano. Los genes GFP, CCD1, hCD y APOBEC2 se insertan en el locus de la timidina cinasa y se colocan bajo el control del promotor p11K.5. Las estructuras del virus se confirmaron mediante múltiples PCR. Los virus de la vaccinia recombinantes finales se amplificaron en fibroblastos de embriones de pollo primarios (CEF) y las reservas de virus se titularon en CEF mediante ensayo de placa.
Las líneas celulares de cáncer de colon humano LoVo (ATCC CCL-229), MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420) y HCT-116 (ATCC CCL-247) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). La línea celular de cáncer de esófago humano OE-19 se obtuvo de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC 96071721). Todas las líneas de células tumorales humanas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal (FCS) al 10%. Se usaron fibroblastos de embriones de pollo primarios (CEF) para la recombinación, amplificación y titulación de vectores virales. Se prepararon células CEF a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados (Charles River SPAFAS) previamente incubados 11 ó 12 días a 37°C en una atmósfera húmeda. Se diseccionaron los embriones de pollo y se trataron con una disolución al 2,5% (p/v) de tripsina. Las células CEF se mantuvieron en medio basado en Eagle (MBE) complementado con suero bovino fetal al 5%.
Análisis de inmunotransferencia de tipo Western
Se infectaron células MIA PaCa-2 de carcinoma pancreático tumoral humano y células LoVo de carcinoma colorrectal humano mediante VVTK-RR- y VV-TK-RR-/hCD a una MOI de 0,1 y se incubaron durante 24 horas. Se procesaron treinta |ig de proteínas de lisado celular en un gel de SDS/PAGE al 10% en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se incubó la membrana con hCD humana de anticuerpo policlonal de conejo (Abcam), se lavó y se incubó con peroxidasa de rábano picante acoplada con anticuerpo secundario (Amersham). Se realizó la detección de señales mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham).
Actividad antitumoral in vivo
Se obtuvieron ratones desnudos Swiss hembras de Charles River Laboratories. Los animales usados en los estudios eran uniformes en cuanto a edad (6 semanas) y peso corporal (20-23 g).
Para evaluar la actividad terapéutica de los vectores de vaccinia en un modelo de tumor de xenoinjerto humano, se inyectaron 5*10® células cancerosas humanas (LoVo, HCT-116 u OE-19) por vía subcutánea (s.c.) en el costado de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 70-100 mm3, los ratones se aleatorizaron de manera ciega y se trataron con los vectores indicados.
Se infectaron ratones desnudos que portaban tumores LoVo s.c. establecidos una vez por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1*107 UFP.
Se infectaron ratones desnudos que portaban tumores HCT-116 s.c. establecidos una vez por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1*105 UFP.
Se infectaron ratones desnudos que portaban tumores OE-19 s.c. establecidos una vez por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1*106 UFP o 5*105 UFP.
El tamaño del tumor se midió dos veces por semana usando compás calibradores. Los volúmenes tumorales se calcularon en mm3 usando la fórmula (rc/6) (largo*ancho2).
Análisis de cromatografía de líquidos de alta resolución-espectrometría de masas
Este estudio lo realizó “Hospices Civils de Lyon” para la cuantificación de nucleótidos y nucleósidos intracelulares en células tumorales HCT-116 y LoVo humanas. La metodología analítica y la metodología para la preparación de las muestras se describen en Machon et al., 2015, J. Chromatogr. A.; 1405:116-25 y en Machon et al., 2014, Anal. Bioanal. Chem.; 406(12):2925-41. El espectrómetro de masas usado fue un aparato Q Exactive™ Plus (ThermoFicher), un detector de alta resolución y de tipo Orbitrap.
Se infectaron 1,5*10® células HCT-116 y LoVo sembradas en placa en matraces T-25 con VVTK-RR-/GFP y VVTK-RR-/hCD a una MOI de 0,01, y se incubaron a 37°C en presencia del 5% de CO2.36 horas después para HCT-116 y 60 horas después para LoVo, se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células tres veces con PBS frío antes de añadir 3 ml de metanol/agua frío (70/30, v/v). Después de 5 min de incubación, se almacenó el sobrenadante a -80°C hasta el análisis.
Se evaluaron las concentraciones de nucleótidos y nucleósidos 36 horas tras la infección en HCT-116 y 60 horas tras la infección en LoVo. Se cuantificaron citidina y uridina.
RESULTADOS
Diseño por ingeniería del virus
La expresión de la proteína CDA humana (hCD) en el virus de la vaccinia se confirmó mediante inmunotransferencia de tipo Western usando la CDA humana de anticuerpo policlonal de conejo (figura 1). La inmunotransferencia de tipo Western muestra que VVTK-RR-/hCD expresó la CDA de 16 kDa esperada en células MiaPaca-2 y LoVo.
Actividad antitumoral en múltiples modelos tumorales de citidina desaminasa que expresa VVTK-RR-Se examinó la capacidad de la citidina desaminasa que expresa VVTK-RR- para funcionar como virus oncolítico en diferentes modelos de cánceres humanos.
En primer lugar se comparó la actividad oncolítica del virus con doble deleción que expresa GFP y el virus con doble deleción que expresa CDD1 en el modelo de LoVo colorrectal, un modelo que es débilmente permisivo a la oncólisis por el virus de la vaccinia. Se inyectaron ratones que portaban tumores LoVo por vía i.v. con ambos virus a 1*107 UFP. Tal como se muestra en la figura 2, una única inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control (vehículo solo). Además, la actividad antitumoral del virus que expresa la citidina desaminasa fue significativamente superior a la actividad antitumoral del virus que expresa el gen marcador GFP, lo que indica que el gen de la citidina desaminasa de levadura mejora la eficacia terapéutica del virus de la vaccinia oncolítico.
Para caracterizar adicionalmente la eficacia antitumoral de VVTK-RR-/CDD1, se sometió a prueba la actividad oncolítica de este virus, en comparación con VVTK-RR-/GFP, en xenoinjertos de modelo de tumor humano que son más sensibles a la oncólisis por el VV. Ambos virus se inyectaron una vez por vía i.v. a 1*105 UFP y 1*106 UFP en los modelos de HCT-116 y OE-19, respectivamente. Tal como se muestra en la figura 3 y en la figura 4, en ambos modelos, una única inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP indujo un efecto antitumoral débil en comparación con el control y este efecto aumentó drásticamente con una única inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/CDD1.
El efecto antitumoral del virus de la vaccinia con doble deleción que expresa el gen de la citidina desaminasa humana (VVTK-RR-/hCD) también se evaluó en el modelo de OE-19. Se realizó una única inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/hCD y VVTK-RR-/GFP a 5*105 UFP. Tal como se muestra en la figura 5, una única inyección por vía i.v. del virus que expresa el gen de la citidina desaminasa humana también dio como resultado una fuerte inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el virus que expresa el marcador génico GFP.
Estos datos indicaron que las citidina desaminasas de diferente origen (de levadura y humana) aumentan la actividad antitumoral de los vectores de vaccinia oncolíticos.
Actividad antitumoral en el modelo de tumor LoVo de FCU1 que expresa VVTK-RR
La actividad antitumoral proporcionada por la enzima CDAsa codificada se comparó con la proporcionada por otro modulador de agrupaciones de nucleósidos en el mismo contexto. En este caso, el producto usado para la comparación es un virus de la vaccinia con doble deleción de TK y RR (VVTK-RR-FCU1) que codifica para un gen FCU1. El denominado gen FCU1 se obtiene de la fusión de las secuencias de citosina desaminasa de levadura y uracilo fosforribosiltransferasa. La citosina desaminasa, que es un modulador de agrupaciones de nucleósidos, cataliza la transformación del profármaco 5-FC para dar 5-FU tóxico. Se evaluó VVTK-RR-FCU1 en el modelo de tumor LoVo, así como en el control VVTK-RR-. Tal como se muestra en la figura 6, una única inyección por vía i.v. de virus VVTK-RR- o VVTK-RR-FCU1 sin la administración de 5-FC (profármaco) dio como resultado una inhibición similar y débil del crecimiento tumoral en comparación con el vehículo solo. Esto indica que, sin tratamiento con profármacos, los moduladores de agrupaciones de nucleósidos de citosina desaminasa y uracilo fosforribosiltransferasa codificadas por FCU1 no provocan un efecto antitumoral al menos en el modelo de tumor LoVo. Por el contrario, el virus de la vaccinia que expresa citidina desaminasa no requiere ninguna administración de profármaco para ser eficaz en la protección antitumoral.
Actividad antitumoral in vivo de APOBEC2 que expresa VVTK-RR-Se ha comparado la actividad oncolítica del virus con doble deleción que expresa GFP y el virus con doble deleción que expresa APOBEC2 en el modelo de HCT-116 colorrectal. Se inyectaron ratones que portaban tumores HCT-116 por vía i.v. con ambos virus a 1*105 UFP. Tal como se muestra en la figura 7, una única inyección por vía i.v. de VVTK-RR-/GFP dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control (vehículo solo). Además, la actividad antitumoral del virus que expresa APOBEC2 fue significativamente superior a la actividad antitumoral del virus que expresa el gen marcador GFP, lo que indica que el gen APOBEC2 mejora la eficacia terapéutica del virus de la vaccinia oncolítico.
Cuantificación de citidina y uridina intracelulares en células tumorales HCT-116 y LoVo humanas.
Tabla 1: Cuantificación de nucleósidos intracelulares 36 horas después de la infección en HCT-116
Figure imgf000024_0001
Los resultados representan la razón de superficie de picos cromatográficos entre la citidina o uridina endógena y los patrones internos correspondientes. Los resultados se expresan por 1 millón de células.
Esta evaluación muestra que, en células infectadas con el control o con el virus vacío (VVTK-RR-), los niveles de razón C/U, comprendidos entre 1,60 y 1,88, son similares. En comparación, las células infectadas con el virus que codifica para citidina desaminasa (VVTK-RR-/hCD) muestran un nivel anómalo de razón C/U (0,204). Esta baja razón indica que VVTK-RR-/hCD provoca un desequilibrio de las agrupaciones de nucleósidos.
Tabla 2: Cuantificación de nucleósidos intracelulares 60 horas tras la infección en LoVo
Figure imgf000024_0002
Los resultados representan la razón de superficie de picos cromatográficos entre la citidina o uridina endógena y los patrones internos correspondientes. Los resultados se expresan por 1 millón de células. No se detectó citidina en las células LoVo 36 h después de la infección con VVTK-RR-/hCD.
Esta evaluación muestra que, en células infectadas con el control o con el virus vacío (VVTK-RR-), los niveles de razón C/U, comprendidos entre 2,44 y 2,67, son similares. En comparación, no se detectó citidina en células LoVo infectadas con el virus que codifica para citidina desaminasa (VVTK-RR-/hCD). Considerando un límite de detección de 0,02 (el nivel más bajo de citidina detectado en los presentes experimentos, véase la tabla 1), la razón C/U sería de menos de 0,51. Esta baja razón confirma que VVTK-RR-/hCD provoca un desequilibrio de las agrupaciones de nucleósidos.
Referencias bibliográficas
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un poxvirus oncolítico defectuoso en el locus J2R que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de citidina desaminasa (CDAsa), preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID y proteínas similares a la citidina desaminasa.
  2. 2. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 1, en el que dicha APOBEC se selecciona del grupo que consiste en APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H y APOBEC4, y preferiblemente en el que dicha APOBEC es APOBEC2.
  3. 3. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 1, en el que dicha CDAsa es una citidina desaminasa de levadura (CDD1), preferiblemente una CDD1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:1, o una citidina desaminasa humana (hCD), preferiblemente una hCD que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:2.
  4. 4. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 2, en el que dicha APOBEC2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95% con SEQ ID NO:3.
  5. 5. El poxvirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido de CDAsa cataliza la desaminación de componentes basados en citidina, preferiblemente componentes basados en citidina que están libres o complejados, para dar componentes basados en uridina, tales como citidina para dar uridina y desoxicitidina (dC) para dar desoxiuridina (dU).
  6. 6. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 1, en el que dicho poxvirus es un poxvirus que pertenece al género Orthopoxvirus, en el que dicho poxvirus pertenece preferiblemente a especies del virus de la vaccinia (VV), preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en Copenhaguen, Wyeth y Western Reserve (WR), o a las especies del virus de la viruela vacuna.
  7. 7. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 1, en el que dicho virus es además defectuoso en el locus I4L y/o F4L.
  8. 8. El poxvirus oncolítico según la reivindicación 7, en el que dicho poxvirus es un virus de la vaccinia defectuoso en las actividades codificadas por TK y RR virales que codifica para una CDAsa humana o de levadura.
  9. 9. El poxvirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho virus comprende además uno o más ácidos nucleicos de interés, codificando dicho ácido nucleico de interés preferiblemente para un polipéptido inmunoestimulador, un antígeno o una permeasa.
  10. 10. El poxvirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho virus comprende además los elementos necesarios para la expresión de dicha citidina desaminasa y dichos uno o más ácidos nucleicos de interés.
  11. 11. Un procedimiento para preparar un poxvirus oncolítico, procedimiento en el que:
    (i) se introduce un poxvirus oncolítico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en una célula productora;
    (ii) se cultiva dicha célula productora en condiciones que son apropiadas para permitir que se produzca dicho poxvirus oncolítico, y;
    (iii) dicho poxvirusis oncolítico recuperado a partir del cultivo celular.
  12. 12. Una composición que comprende el poxvirus oncolítico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o preparado según la reivindicación 11, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha composición comprende preferiblemente una dosis de virus oncolítico comprendida entre 106 y 5*109 UFP, y en la que dicho virus oncolítico se formula preferiblemente para administración por vía parenteral con una preferencia por la vía intravenosa o intratumoral.
  13. 13. El poxvirus oncolítico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o preparado según la reivindicación 11, o la composición según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado patológico en un sujeto que lo necesita.
  14. 14. El poxvirus oncolítico según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, o preparado según la reivindicación 11, o la composición según la reivindicación 12, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad proliferativa, seleccionándose dicha enfermedad proliferativa preferiblemente del grupo que consiste en cáncer, tumor y reestenosis, en el que dicho cáncer es preferiblemente un cáncer gastrointestinal, comprendiendo preferiblemente un cáncer de esófago, vesícula biliar, hígado, páncreas, estómago, intestino delgado, intestino (intestino grueso o colon y recto) o ano.
  15. 15. El poxvirus oncolítico para su uso según la reivindicación 14, que comprende además la administración de una o más sustancias eficaces en la terapia contra el cáncer.
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