ES2908854T3 - Método para producir un arenavirus antitumoral así como mutantes de arenavirus - Google Patents

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Abstract

Un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, en el que el mutante es capaz de experimentar una propagación más fuerte en una célula tumoral en comparación con la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende al menos una de las mutaciones Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met en comparación con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para producir un arenavirus antitumoral así como mutantes de arenavirus
Campo de la invención y antecedentes
La invención se refiere a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, en el que el mutante es capaz de experimentar una propagación más fuerte en una célula tumoral en comparación con la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende al menos una de las mutaciones Arg 185 —» Trp e Ile 181 — Met en comparación con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10. La invención también se refiere a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención para su uso en medicina. La invención también se refiere a un medicamento o composición farmacéutica que comprende un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención.
La divulgación se refiere además a un método para la preparación de un arenavirus antitumoral, mutantes de arenavirus, proteínas o péptidos aislados, en particular glicoproteínas aisladas, un arenavirus y ácidos nucleicos que codifican proteínas o péptidos correspondientes.
Los arenavirus pertenecen a la familia de los virus de ARN pleomórficos patógenos humanos. Las enfermedades con estos virus pertenecen a las zoonosis debido a su reservorio natural en animales, predominantemente roedores. Las zoonosis son enfermedades que pueden transmitirse de animales a seres humanos y viceversa de seres humanos a animales.
Se sabe que al menos ocho arenavirus causan una enfermedad en seres humanos, normalmente meningitis aséptica y fiebre hemorrágica. Los virus conocidos que pueden causar una enfermedad en seres humanos son el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus guanarito (GTOV), virus Junín (JUNV), virus Lassa (VLAS), virus Lujo (LUJV), virus machupo (MACV), virus sabia (SABV) y virus de arroyo de agua blanca (WWAV).
Los arenavirus con el género mammarenavirus se dividen en dos grupos, los arenavirus del viejo mundo y los arenavirus del nuevo mundo. Estos grupos difieren geográfica y genéticamente. Los arenavirus del viejo mundo, tales como el virus de la coriomeningitis linfocítica, se encontraron principalmente en países del hemisferio este, tales como europeos, asiáticos y africanos. Por el contrario, los arenavirus del nuevo mundo se han encontrado en países del hemisferio oeste tales como Argentina, Bolivia, Venezuela, Brasil y los Estados Unidos de América.
Los arenavirus se replican en la célula y entran en el espacio extracelular como viriones (partículas infecciosas). Los viriones tienen un pleomórfico, a menudo forma redonda con un diámetro de en su mayoría 110 nm a 130 nm hasta 50 nm a 300 nm. La cápside del virión está rodeada por una proteína de envoltura que consiste en una membrana lipídica doble y homotrímeros de glicoproteínas (GP1 y GP2) que sobresalen en forma de espículas. GP1 se dirige hacia fuera y se une al receptor celular durante la infección. GP2 se dirige en la dirección opuesta y media la fusión con la célula. Las proteínas Z se encuentran como un anillo debajo de la capa lipídica, ubicado dentro de la nucleocápside, los complejos de ribonucleoproteína (RNP) consisten cada uno en el segmento de ARN más corto (segmento S 3,5 kb) respectivamente el segmento de ARN más largo (segmento L 7,2 kb) y las nucleoproteínas. La proteína L, la polimerasa viral, está asociada con los complejos RNP. Los segmentos L y S llevan la información genética y el código para dos proteínas cada uno. Los ARN monocatenarios tienen una mezcla (es decir, polaridad de ambisentido), en sus extremos 3' no traducidos, las secuencias (aprox. 19-30 pb) están conservadas, también dentro de la familia de virus. En primer lugar, los ARNm de la nucleoproteína y la proteína L se transcriben, seguido de replicación y transcripción de ARNm de proteína Z y el precursor de glicoproteína, y finalmente seguido de traducción y modificación de las proteínas virales.
El uso de arenavirus como vectores de vacunación es bien conocido. Un ejemplo destacado es el virus de vacunación Candid n.° 1 usado contra la fiebre hemorrágica de Argentina. Esta es una variante de vacunación del virus Junín.
A partir del documento WO 2009/083210 A1 se conoce el uso de partículas de arenavirus (viriones) con replicación defectuosa, es decir modificadas genéticamente, entre otras cosas, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas tales como melanoma, carcinoma de próstata, carcinoma de mama y el carcinoma de pulmón. La publicación “Development of replication-defective lymphocytic choriomeningitis virus vectors for the induction of potent CD8+ T cell immunity” (Nature Medicine, vol. 16, n.° 3, marzo de 2010, p. 339-345; doi: 10.1038/nm.2104) menciona como un área de aplicación potencial para tales partículas de virus la inmunoterapia contra el cáncer.
Además, a partir del documento WO 2006/008074 A1 se conoce el uso de células de empaquetamiento que producen viriones pseudotipados tanto retrovirales como con glicoproteína arenaviral para la terapia génica de tumores sólidos.
Los métodos del estado de la técnica descritos anteriormente para el tratamiento de tumores se basan en el uso de partículas de virus que son muy complicadas de generar por medio de ingeniería genética. Además, en el caso de métodos de tratamiento de terapia génica, a menudo no se puede lograr la transducción suficiente, terapéuticamente eficaz del tejido tumoral con viriones modificados mediante ingeniería genética o células de empaquetamiento que producen viriones.
A partir del documento WO 2016/166285 A1, sin embargo, se conocen arenavirus para el tratamiento y/o prevención de tumores, en el que dichos arenavirus están libres de ARN genómico extraño. Adicionalmente, a partir del documento WO 2016/166285 A1 se conoce un método para la producción de arenavirus con propiedades regresivas tumorales.
No obstante, todavía existe la necesidad de arenavirus específicos y en particular terapéuticamente eficaces para su uso en el tratamiento y/o la prevención de tumores.
Objeto y solución
El objeto subyacente de la presente divulgación es producir arenavirus con propiedades antitumorales mejoradas. Además, el objeto subyacente de la invención es proporcionar mutantes de arenavirus correspondientes.
Los objetos anteriores se resuelven mediante un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica según la reivindicación independiente 1, tal mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica para su uso según la reivindicación independiente 14, y un medicamento o composición farmacéutica según la reivindicación 15. Las realizaciones preferidas del mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica son objeto de las reivindicaciones dependientes y de la presente descripción. Aspectos adicionales de la presente invención se describen en la descripción.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que ciertos mutantes de un arenavirus, en particular, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), pueden tener actividades antitumorales mejoradas en comparación con un virus de tipo natural.
Por consiguiente, la presente invención se refiere en general a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, en el que el mutante es capaz de experimentar una propagación más fuerte en una célula tumoral en comparación con la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende al menos una de las mutaciones Arg 185 ^ Trp e Ile 181 ^ Met en comparación con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.
La invención también se refiere a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención para su uso en medicina.
La invención también se refiere a un medicamento o composición farmacéutica que comprende un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención.
El mutante puede ser capaz de experimentar una propagación más fuerte en una célula tumoral, tal como una célula H1975, una célula HCC1954, una célula de cáncer pancreático murino, o una célula de melanoma humano, en comparación con la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural. El mutante también puede ser capaz de inducir una activación inmunitaria innata más fuerte que el tipo natural de LCMV-WE in vivo. El mutante también puede ser capaz de tener un efecto antitumoral in vivo más fuerte que el tipo natural de LCMV-WE. El mutante también puede ser capaz de aumentar la expansión de las células T CD8+ específicas de tumor en comparación con el tipo natural de LCMV-WE. El mutante también puede ser capaz de aumentar la función de las células T CD8+ específicas de tumor. El mutante también puede tener una mayor capacidad para estimular células T específicas de tumor en comparación con el tipo natural de LCMV-WE.
El mutante a del virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende al menos una mutación en las posiciones correspondientes a las posiciones 181 y 185 de la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10. Las mutaciones son Arg 185 ^ Trp y/o Ile 181 ^ Met (tal como Arg 185 ^ Trp solamente, Ile 181 ^ Met solamente, Arg 185 ^ Trp e Ile 181 ^ Met) en comparación con la secuencia de glicoproteína de tipo natural establecida en la SEQ ID NO: 10 y/o (a) proteína(s) respectiva(s) codificada(s) por el ácido nucleico. Si bien los ejemplos de la presente solicitud demuestran que la presencia de una cualquiera de las mutaciones ya puede ser suficiente para proporcionar una función mejorada sobre un virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, la presencia de ambas mutaciones mencionadas mejorará aún más la función del LCMV, que puede ser de manera aditiva o incluso de manera sinérgica. Por consiguiente, en una realización preferida, ambas mutaciones están presentes en el LCMV de la invención.
Sin desear limitarse a la teoría, se cree además que la presencia de la una o dos mutaciones mencionadas anteriormente en la glicoproteína puede mejorar la función del LCMV (por ejemplo, replicación o propagación en una célula tumoral, actividades antitumorales, y/o estimulación del sistema inmunitario como se describió anteriormente), independientemente de la presencia de otras mutaciones, en particular de otras mutaciones en otros genes o proteínas de LCMV. La suposición se basa en el hallazgo de que las mutaciones Arg 185 ^ T rp e Ile 181 ^ Met en la glicoproteína permanecen conservadas mientras que algunas otras mutaciones aparecen y desaparecen durante los pases en serie, y/o no están conservadas entre diferentes cepas mutantes. La suposición se basa además en el hecho de que la(s) glicoproteína(s) del LCMV forma(n) las espículas en la envoltura del virión, y, por lo tanto, se cree que desempeña(n) un papel predominante en la capacidad del virus para infectar una célula tumoral.
El mutante de LCMV de la invención comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que la glicoproteína tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10, y/o puede comprender (a) proteína(s) respectiva(s) codificada(s) por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que la glicoproteína comprende las mutaciones Arg 185 ^ Trp e Ile 181 ^ Met en comparación con la glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína tiene al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 26, 34, 42, 50 y 58, y/o puede comprender (a) proteína(s) respectiva(s) codificada(s) por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,6%, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, 25, 33, 41,49 y 57, y/o puede comprender (a) proteína(s) respectiva(s) codificada(s) por el ácido nucleico.
Como ya se indicó anteriormente, se cree que la(s) glicoproteína(s) de LCMV, que forma(n) las espículas en la envoltura del virión, desempeña(n) un papel predominante en la capacidad del virus para infectar células tumorales.
Sin embargo, otras proteínas están presentes preferiblemente en un LCMV.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína L que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un
98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99, preferiblemente al menos un 99,8 %, preferiblemente al menos un 99,9 % de identidad de secuencia con, o preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 24, 32, 40, 48, 56 y 64, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 253,
1512, 1513, 1758, 1995, 2094, 2115, 2141, 2175 y 2185 de la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en
SEQ ID NO: 16. Las realizaciones preferidas de mutaciones en estas posiciones son: Lys 253 ^ Arg; Lys 1512 ^
Met; Lys 1513 ^ G lu ; Ser 1758 ^ Phe; Phe 1995 ^ Ser; Ile 2094 ^ V a l; Lys 2115 ^ G lu ; Thr 2141 ^ A la ; Arg 2175
^ Lys; Thr 2185 ^ Ala en comparación con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico. Preferiblemente, el mutante de LCMV comprende 1, 2, 3, 4 o 5 de las mutaciones mencionadas anteriormente.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L comprende en comparación con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16 uno de los siguientes conjuntos de mutaciones: Ser 1758 ^ Phe (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P42); Phe 1995 ^ Ser, opcionalmente Ile 2094 ^ Val, y opcionalmente Thr 2141 ^ Ala (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P52, que es oligoclonal para las posiciones 2094 y 2141); Lys 1513 ^ Glu, Phe 1995 ^ Ser, y opcionalmente Arg 2175 ^ Lys (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P91, que es oligoclonal para la posición 2175); Lys 253 ^ Arg; Lys 1512 ^ Met; Lys 2115 ^ Glu; Thr 2185 ^ Ala (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P52-1); Phe 1995 ^ Ser (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P52-1.3); o Lys 2115 ^ Glu (correspondiente a las mutaciones de la cepa mutante P52-2.1), y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicho ácido nucleico tiene o es preferiblemente complementario a una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6%, preferiblemente al menos un 99,7%, preferiblemente al menos un 99,8%, preferiblemente al menos un 99,9 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15, 23, 31, 39, 47, 55 y 63, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína, en el que dicha nucleoproteína tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con o es idéntica a, una nucleoproteína expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 12, 20, 28, 36, 44, 52 y 60, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína, en el que dicho ácido nucleico tiene o es preferiblemente complementario a una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es idéntica a, una nucleoproteína expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 19, 27, 35, 43, 51 y 59, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína Z, en el que dicha proteína Z tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 14, 22, 30, 38, 46, 54 y 62, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
El mutante de LCMV de la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína Z, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,6%, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 13, 21, 29, 37, 45, 53 y 61, y/o puede comprender una proteína respectiva codificada por el ácido nucleico.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) glicoproteína(s) como se define en el presente documento, una proteína L preferiblemente como se define en el presente documento, una proteína Z preferiblemente como se define en el presente documento, y una nucleoproteína preferiblemente como se define en el presente documento. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una(s) glicoproteína(s) como se define en el presente documento, una proteína L preferiblemente como se define en el presente documento, una proteína Z preferiblemente como se define en el presente documento, y una nucleoproteína preferiblemente como se define en el presente documento.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 18, 20, 22 y 24, o proteínas que tienen al menos un 96%, preferiblemente al menos un 97%, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Ile 181 ^ Met. La proteína L puede comprender una mutación Ser 1758 ^ Phe. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17 y 21 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 y 23.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifican las proteínas de las SEQ ID NO: 26, 28, 30 y 32, o proteínas que tienen al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Ile 181 ^ Met y una mutación Arg 185 ^ Trp. La proteína L puede comprender las siguientes mutaciones Phe 1995 ^ Ser, opcionalmente Ile 2094 ^ Val, y opcionalmente Thr 2141 ^ Ala. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 25 y 29 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 27 y 31.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 34, 36, 38 y 40, o proteínas que tienen al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Ile 181 ^ Met y una mutación Arg 185 ^ Trp. La proteína L puede comprender las siguientes mutaciones Lys 1513 ^ Glu, Phe 1995 ^ Ser, y opcionalmente Arg 2175 ^ Lys. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 33 y 37 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 35 y 39.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 50, 52, 54 y 56, o proteínas que tienen al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Ile 181 ^ Met y una mutación Arg 185 ^ Trp. La proteína L puede comprender las siguientes mutaciones Lys 253 ^ Arg; Lys 1512 ^ Met; Lys 2115 ^ G lu ; Thr 2185 ^ Ala. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 41 y 45 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 43 y 47.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 58, 60, 62 y 64, o proteínas que tienen al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Arg 185 ^ Trp. La proteína L puede comprender una mutación Phe 1995 ^ Ser. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 49 y 53 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 51 y 55.
Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 66, 68, 70 y 72, o proteínas que tienen al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. La glicoproteína puede comprender una mutación Ile 181 ^ Met. La proteína L puede comprender una mutación Lys 2115 ^ Glu. Un mutante de LCMV de la invención puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 57 y 61 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 59 y 63.
Un LCMV de la divulgación puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) las proteínas de las SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 18, o proteínas que tienen al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con estas secuencias. Un LCMV de la divulgación puede comprender (a) ácido(s) nucleico(s) que comprende(n) una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 10 y 14 y que comprende(n) una secuencia que es complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12 y 16.
La presente invención también se refiere en general a un mutante de LCMV de la invención para su uso en terapia.
En particular, cuando se usa un mutante de LCMV de la invención, dicho uso puede comprender una propagación más fuerte del mutante de LCMV en un tumor (célula), en comparación con el uso de la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural. Tal uso también puede comprender inducir una activación inmune innata más fuerte en comparación con el uso de LCMV-WE de tipo natural in vivo. Tal uso también puede comprender promover un efecto antitumoral más fuerte in vivo en comparación con el uso de LCMV-WE de tipo natural. Tal uso también puede comprender el aumento de la expansión de las células T CD8+ específicas de tumor en comparación con el uso de LCMV-WE de tipo natural. El uso también puede comprender aumentar la función de las células T CD8+ específicas de tumor. El uso también puede comprender estimular células T específicas de tumor en mayor medida en comparación con el LCMV-WE de tipo natural.
El (mutante de) LCMV de la divulgación puede ser para su uso en el tratamiento y/o la prevención de un tumor. El tumor puede ser cualquier tumor divulgado en el presente documento. El tumor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma y sarcoma.
Según un primer aspecto, la divulgación se refiere a un método para la producción de un arenavirus antitumoral, es decir un arenavirus repulsivo o contra tumores (denominado arenavirus regresivo tumoral), en particular un arenavirus que tiene en comparación con un arenavirus original propiedades antitumorales mejoradas, es decir propiedades mejoradas de lucha contra tumores o repulsivas.
El método comprende las siguientes etapas:
a) colocar en placa células tumorales primarias en un medio nutritivo, preferiblemente medio nutritivo líquido, o colocar en placa células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 sobre y/o en un medio nutritivo, preferiblemente medio nutritivo líquido,
b) inocular las células tumorales primarias colocadas en placa con un arenavirus original o inoculación de las células colocadas en placa de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 con un arenavirus original,
c) incubar las células tumorales primarias inoculadas o incubar las células inoculadas de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2, es decir incubar las células tumorales primarias y el arenavirus original o incubar las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 y el arenavirus original en condiciones adecuadas para hacer que al menos una porción de las células tumorales primarias inoculadas o al menos una porción de las células inoculadas de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2, en particular solo parte de las células tumorales primarias inoculadas o solo parte de las células inoculadas de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 o todas las células tumorales primarias inoculadas o todas las células inoculadas de la línea celular H1975, c 643 o Trampa-C2, se infecten con el arenavirus original,
d) extraer un sobrenadante de cultivo celular que contiene arenavirus de un cultivo de células tumorales primarias incubadas, o extraer un sobrenadante de cultivo celular que contiene arenavirus de las células incubadas del cultivo celular que contiene la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2,
en el que la secuencia de etapas a) a d) se repite una pluralidad de veces, en el que las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 cuando se realiza la primera repetición de la secuencia de etapas a) a d), para realizar la etapa b) se inoculan con el sobrenadante de cultivo celular que contiene arenavirus o una parte del mismo extraído cuando se realiza la etapa d) antes de la primera repetición de la secuencia de etapa a) a d, y en el que las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 cuando se realiza cada repetición adicional de la secuencia de etapas a) a d), para realizar la etapa b) se inoculan con el sobrenadante de cultivo celular que contiene arenavirus o una parte del mismo extraído cuando se realiza la etapa d) de una repetición previa de la etapa de secuencia a) a d).
La primera realización de la secuencia de etapas a) a d) también se puede denominar “primer pase” dentro del significado de la presente divulgación. Por lo tanto, el primer pase se realiza con el arenavirus original como inóculo. Cada pase adicional se realiza luego con un sobrenadante de cultivo celular que contiene arenavirus o parte del mismo extraído en la etapa d) de un pase precedente, de manera preferida inmediatamente precedente. Desde la realización de un segundo pase en adelante, dicho pase puede denominarse “pase repetido”, dentro del significado de la presente divulgación.
El término “arenavirus original” en el contexto de la presente divulgación puede entenderse que significa un arenavirus que se usa antes de la primera repetición de la secuencia de etapas a) a d), es decir antes del primer pase para la inoculación de las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 (etapa b)). El “arenavirus original” puede referirse a, que se describe con más detalle a continuación, un arenavirus de tipo natural o un mutante del mismo. En particular, el término puede referirse a un arenavirus original sin propiedades antitumorales o con propiedades antitumorales.
Debe entenderse que el término “arenavirus de tipo natural” dentro del contexto de la presente divulgación significa un arenavirus con un genoma que se produce en la naturaleza en su forma genéticamente normal.
El término “células tumorales primarias” en el contexto de la presente divulgación debe entenderse que significa células tumorales no pasadas o sin pases, es decir células tumorales aisladas directamente de un tejido tumoral o células tumorales aisladas directamente de un tejido tumoral que se han pasado antes de realizar la etapa a) un máximo de 1000 veces, en particular un máximo de 100 veces, preferiblemente un máximo de 10 veces, o células tumorales primarias que se caracterizan por tener diferentes clones celulares. En el caso de estas últimas, la heterogeneidad puede demostrarse por diferente expresión de proteínas y por diferentes secuencias de ADN (huellas genéticas).
Debe entenderse que el término “ línea celular H1975” en el contexto de la presente divulgación significa una línea celular que se ha aislado de un adenocarcinoma humano y se deposita en la ATCC (American Type Culture Collection) bajo la designación NCI-H1975 (ATCC® CRL-5908®) y bajo el número de acceso o depósito c Vc L-1511.
Debe entenderse que el término “línea celular C643” en el contexto de la presente divulgación significa una línea celular que se ha aislado de carcinoma de tiroides anaplásico humano depositado con la designación C643 y con el número de acceso o depósito CVCL-5969 (ExPASy Cellosaurus).
Debe entenderse que el término “ línea celular Tramp-C2” en el contexto de la presente divulgación significa una línea celular aislada de un adenocarcinoma murino y depositada bajo la designación Tramp-C2 y bajo el número de acceso o depósito CVCL-3615 (ExPASy Cellosaurus).
Debe entenderse que el término “colocar en placa” en el contexto de la presente divulgación significa la siembra o introducción de células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Trampa-C2 sobre y/o en un medio de cultivo, preferiblemente un medio de cultivo líquido. En otras palabras, el término “colocar en placa” en el sentido de esta divulgación debe entenderse que significa el cultivo, en particular cultivo inicial, de células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 sobre y/o en un medio de cultivo, preferiblemente medio de cultivo líquido.
El término “cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica” puede referirse a la cepa LCMV-WE que se ha descrito por Seiler, P., et al., J. Immunol. 162 (8), 4536-4541 (1999). El término “cepa w E del virus de la coriomeningitis linfocítica”, como se usa en el presente documento, se refiere preferentemente a un LCMV que comprende glicoproteínas que tienen la secuencia de las posiciones 59-265 y 266-498 de la SEQ ID NO: 10, una nucleoproteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12; una proteína Z que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14; y/o una proteína L que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16. El término “cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica”, como se usa en el presente documento, también se refiere preferentemente a un LCMV que comprende una o más, preferiblemente dos moléculas de ácido nucleico, que comprenden secuencias que son o son complementarias a las secuencias de las SEQ ID NO: 9, 11, 13 y/o 15.
El término “mutante de arenavirus” o “mutante de un arenavirus” en el contexto de la presente invención debe entenderse que significa un arenavirus cuyo genoma y/o proteoma tiene al menos una mutación, en particular al menos una mutación puntual, con respecto al genoma y/o proteoma de su tipo natural. Preferiblemente, el término “mutante de arenavirus” o “mutante de un arenavirus” debe entenderse como un arenavirus con una proteína, en particular glicoproteína y/o proteína L, que tiene con respecto a una proteína correspondiente, en particular glicoproteína y/o proteína L de un arenavirus de tipo natural correspondiente, al menos una mutación, preferiblemente en forma de una sustitución de aminoácidos.
Por consiguiente, el término “mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica” debe entenderse como un mutante del virus de la coriomeningitis linfocítica, cuyo genoma y/o proteoma tiene con respecto al genoma y/o proteoma del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural al menos una mutación, en particular al menos una mutación puntual. Preferiblemente, el término “mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica” debe entenderse que significa un arenavirus con una proteína, en particular glicoproteína y/o proteína L, que tiene con respecto a una proteína correspondiente, en particular glicoproteína y/o proteína L, del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural al menos una mutación, preferiblemente en forma de una sustitución de aminoácidos.
Debe entenderse que el término “glicoproteína” en el contexto de la presente invención significa una macromolécula que consiste en una proteína, que en un cierto contexto también se puede denominar resto de proteína, o componente proteico y uno o más grupos de hidratos de carbono unidos covalentemente (grupos de azúcar), en particular grupos mono y/u oligo y/o polisacáridos.
El término “pase repetido” o “de paso repetido” en el contexto de la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, debe entenderse como un proceso único o repetido en el que las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 se tratan con arenavirus producidos a partir de células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2. Por lo tanto debe usarse un medio de cultivo para células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2, tal como DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) con suero fetal de bovino al 10% (SFB) y penicilina/estreptomicina/glutamina al 1 % (equivalente a 1 unidad/ml de penicilina, 100 microg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM). Células tumorales primarias no infectadas o células no infectadas de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 se colocan preferiblemente en placa de 0 a 7 días, en particular de 1 a 7 días, antes de la etapa de inoculación (etapa b). Preferiblemente, un medio de cultivo usado para la colocación en placa de células se reemplaza antes de la etapa de inoculación por un medio de cultivo nuevo. En algunos casos, el medio de cultivo puede extraerse 1, 10 o 100 minutos después de la etapa de inoculación (etapa b) y se sustituye con un medio de cultivo nuevo. Después de un período de incubación de 24, 48, 72 o 96 horas, se extrae un sobrenadante de cultivo celular que contiene una acumulación de arenavirus mutados. Parte de este sobrenadante se añade a nuevas células tumorales primarias no infectadas o células de las líneas celulares H1975, C643 o Tramp-C2.
El término “ácido nucleico” como se usa en el presente documento puede referirse generalmente a ADN o ARN. El ADN y el ARN difieren, entre otros, en sus nucleobases. La base complementaria a la adenina en el ADN es la timina, mientras que en ARN, es uracilo. En aras de la simplificación, la base correspondiente a adenina se indica como “t” en toda la solicitud, que - dependiendo de su contexto - puede referirse a timina (en ADN) o uracilo (en ARN).
El término “que codifica” o “codifica(n)” como se usa en el presente documento en el contexto de un ácido nucleico, se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia que puede traducirse en una secuencia de aminoácidos particular que está codificada por el ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede abarcar la secuencia de una cadena codificante, y también puede abarcar la secuencia de una cadena que es complementaria a la cadena codificante.
El “porcentaje (%) de identidad de secuencia” con respecto a las secuencias divulgadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos por pares a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como BLAST, ALIGN, o el software Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Lo mismo es cierto para las secuencias de nucleótidos divulgadas en el presente documento. Para determinar la identidad de secuencia, uracilo (por ejemplo en ARN) puede considerarse que es idéntico a timina (por ejemplo en ADN).
La divulgación también se basa en el sorprendente hallazgo de que a través del pase de células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Trampa-C2 infectadas con un arenavirus, un arenavirus con propiedades antitumorales, en particular, se puede producir un arenavirus con propiedades antitumorales mejoradas en comparación con el arenavirus que se usó. La producción de un arenavirus de este tipo se basa en el hecho de que el arenavirus original, normalmente un arenavirus de tipo natural, es difícil de proliferar en las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975. Se observó una proliferación igualmente limitada en las líneas celulares C643 y Tramp-C2. La proliferación limitada desencadena un aumento de la presión de selección o adaptación en el arenavirus durante la infección y replicación en las células tumorales primarias o en las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2. Los mutantes de virus que surgen aleatoriamente, que fueron capaces de proliferar en las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2, crecen en exceso con respecto al arenavirus original, generalmente el arenavirus de tipo natural. A través del pase, en particular un pase repetido (repetición múltiple de la secuencia de etapas a) a d)), preferiblemente se obtiene como resultado un enriquecimiento de un arenavirus, que tiene un efecto antitumoral con respecto a las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 o que tiene propiedades antitumorales mejoradas en comparación con el arenavirus original. El efecto antitumoral del mutante de arenavirus se basa en el hecho de que puede infectar las células mejor y replicarse mejor dentro de las células. Al hacerlo, el mutante de arenavirus puede diseminarse con más éxito en las células usadas en comparación con el arenavirus original y, en particular, promover una activación inmunitaria potenciada. Dado que muchas células tumorales no tienen ningún factor antiviral y, por lo tanto, muestran una resistencia viral limitada, el método según la divulgación puede ser particularmente ventajoso no solo para la producción de un arenavirus antitumoral, sino también para la producción de un arenavirus específico de tumor, es decir para la producción de un arenavirus antitumoral y específico de tumor.
Las células tumorales primarias, así como las células de las líneas celulares H1975, C643 y Tramp-C2 se identificaron por los inventores como células que sorprendentemente permiten solo una replicación reducida de arenavirus y que en el transcurso del pase desencadenan una presión de selección o compulsión de adaptación particularmente alta en arenavirus.
En un ejemplo de la divulgación, las células tumorales primarias se pasan antes de realizar la etapa a) como máximo 1000 veces, en particular como máximo 100 veces, preferiblemente como máximo 10 veces. El término “pase” se entenderá en este contexto como la dilución de las células en un cultivo celular, por lo tanto, la absorción de las células en una suspensión y la colocación en placa de una parte de las células (por ejemplo, el 50 %, 10 % o 1 %) en un nuevo medio nutritivo. Cuanto menos se pasan las células tumorales primarias antes de la etapa a), más se corresponden las células con las propiedades de las células tumorales de un paciente. En particular, grandes diferencias (heterogeneidad) entre células tumorales primarias individuales en la morfología, patrón de expresión de ARN, expresión de proteínas y mapeo de secuencias de ADN de células tumorales in vivo. De este modo, se puede producir un arenavirus de una manera ventajosa, que es particularmente adecuado para un tratamiento terapéutico de pacientes con tumores respectivos, en particular grupos de pacientes del mismo.
En particular, las células tumorales primarias pueden no someterse antes de la etapa a) a ningún pase. En otras palabras, para realizar la etapa a) pueden usarse células tumorales primarias sin pasar, es decir no sometidas a pases. De este modo, el arenavirus original o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o una parte del mismo se fuerza a adaptarse a células que representan las células tumorales de un paciente particularmente bien. Al hacerlo, es posible generar arenavirus particularmente adecuados para el tratamiento terapéutico de pacientes con tumores respectivos, en particular grupos de pacientes del mismo.
Las células ya sometidas a pases a menudo de las líneas celulares H1975, C643 y Tramp-C2 se identificaron por los inventores como células igualmente adecuadas, aunque ya se han pasado in vitro durante años.
En un ejemplo adicional de la divulgación, la etapa c) se realiza durante un período de 1 hora a 1000 horas, en particular de 3 horas a 300 horas, preferiblemente de 12 horas a 96 horas. Se ha demostrado que los períodos de tiempo divulgados en este párrafo son particularmente beneficiosos para una incubación eficiente y, por consiguiente, infectar las células tumorales primarias inoculadas o las células inoculadas de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 con el arenavirus original o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o parte del mismo.
En un ejemplo adicional de la divulgación, la etapa (b) y/o la etapa (c) se realizan a una temperatura de 4 °C a 50 °C, en particular de 20 °C a 42 °C, preferiblemente 34 °C a 39 °C. Se ha encontrado que los intervalos de temperatura divulgados en este párrafo son particularmente ventajosos para una inoculación y/o incubación eficaz (y, por consiguiente, infección) de las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 con el arenavirus original o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o parte del mismo.
En un ejemplo adicional de la divulgación, la etapa a) y/o la etapa b) y/o la etapa c) y/o la etapa d) se realizan en un medio nutritivo seleccionado preferentemente del grupo que consiste en RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) e iMd M (medio de Dulbecco modificado por Iscove). El medio nutritivo puede contener adicionalmente suero (0,1 - 20%), tal como suero bovino fetal y/o suero humano, y/o aminoácidos, tales como glutamato y/o glutamina, y/o antibióticos. Un medio de cultivo permite el cultivo de las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2. En particular, un medio de cultivo favorece con ventaja particular el crecimiento y/o división celular de las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2. Los medios de cultivo mencionados en este párrafo son particularmente adecuados para el cultivo de células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2.
En una realización adicional de la divulgación, la etapa a) y/o la etapa b) y/o la etapa c) se realizan en una atmósfera de dióxido de carbono (atmósfera de CO2) del 0 % al 20 %, en particular del 0,1 % al 20 %, preferiblemente del 2 % al 10 %, más preferiblemente del 4 % al 6 %. Esto permite que el pH de un medio nutritivo usado para la etapa a) y/o la etapa b) y/o la etapa c) se mantenga constante. Esto permite una colocación en placa y/o inoculación y/o incubación eficiente (y, por consiguiente, infección) de las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 con el arenavirus original, respectivamente, el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o parte del mismo.
Preferiblemente, la etapa a) y/o la etapa b) y/o la etapa c) se realizan en una incubadora, por medio de la cual pueden crearse condiciones externas controladas para el crecimiento y/o la división celular de las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2.
En el ejemplo adicional de la divulgación, la secuencia de etapas a) a d) se repite de 3 veces a 1000 veces, en particular de 10 veces a 100 veces, preferiblemente de 20 veces a 50 veces. Una repetición múltiple de la secuencia de etapas a) a d), en particular como se divulga en este párrafo, se ha demostrado que es particularmente beneficioso en vista del desarrollo de mutaciones beneficiosas con respecto a las propiedades antitumorales, en particular mutaciones puntuales, y por consiguiente a la producción de un arenavirus antitumoral.
En el ejemplo adicional de la divulgación, el medio nutritivo se reemplaza por un medio nutritivo nuevo o fresco antes de realizar la etapa b). A través de esta etapa, las condiciones de infección pueden estandarizarse ventajosamente.
En un ejemplo adicional de la divulgación, el medio de cultivo se reemplaza por un medio de cultivo nuevo o fresco en el intervalo de un período de 0,1 minuto a 600 minutos, en particular de 1 minuto a 30 minutos, preferiblemente de 5 minutos a 15 minutos después de la etapa b). Esta etapa aumenta ventajosamente la presión de selección de la infección, ya que el tiempo de infección es limitado.
En un ejemplo adicional de la divulgación, se realizan múltiples cambios en el medio nutritivo. Por ejemplo, el medio nutritivo puede reemplazarse por un medio nutritivo nuevo o fresco antes de la etapa b) y este último puede reemplazarse por un medio nutritivo nuevo o fresco en el intervalo de un período de 0,1 minutos a 600 minutos, en particular de 1 minuto a 30 minutos, preferiblemente de 5 minutos a 15 minutos después de realizar la etapa b). En un ejemplo adicional de la divulgación, las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 y/o el arenavirus original y/o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o parte del mismo se tratan con al menos un agente antineoplásico antes de realizar la etapa d), en particular antes de realizar la etapa c), en particular antes de realizar la etapa b), en particular antes de realizar la etapa a). De este modo, pueden simularse células tumorales que ya han sido tratadas quimioterapéuticamente. Esto permite ventajosamente la producción de un arenavirus que es particularmente adecuado para el tratamiento de pacientes con tumores que ya han sido tratados con quimioterapia y/o que se considera que ya se han sometido a todas las opciones de terapia. En el ejemplo adicional de la divulgación, el arenavirus original y/o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o una parte del mismo se trata antes de realizar la etapa b) con al menos un agente antineoplásico. De este modo, la tasa de mutación natural en el arenavirus puede aumentar ventajosamente y acelerar de ese modo su adaptación a las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2. El al menos un agente antineoplásico puede seleccionarse en particular del grupo que consiste en alquilantes, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores mitóticos, antimetabolitos, antibióticos, inhibidores de cinasa, derivados de talidomida, inductores de apoptosis celular, agentes terapéuticos biológicos tales como agentes citostáticos biológicos, compuestos que contienen isótopos, hormonas, antagonistas hormonales, inhibidores de histona desacetilasa y otros agentes citostáticos.
Los agentes alquilantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en oxazafosforinas, derivados N-lost, sulfonatos de alquilo, hidrazinas, sustancias que contienen platino, antraciclinas y mezclas de al menos dos de los agentes alquilantes anteriores.
Las oxazafosforinas pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en ciclofosfamida, ifosfamida y mezclas de las mismas.
Los derivados N-lost pueden seleccionarse del grupo que consiste en clorambucilo, melfalán y mezclas de los mismos. Los sulfonatos de alquilo pueden ser, por ejemplo, husulfano.
Las hidrazinas pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en temozolomida, dacarbazina, procarbazina y mezclas de al menos dos de las hidrazinas anteriores.
Las sustancias que contienen platino pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, oxaliplatino y mezclas de al menos dos de dichas sustancias que contienen platino.
Las antraciclinas pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, elirrubicina y mezclas de al menos dos de dichas antraciclinas.
Los inhibidores de topoisomerasa mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II (etopósido) y mezclas de los mismos.
Por ejemplo, los inhibidores de topoisomerasa I pueden seleccionarse del grupo que consiste en irinotecán, topotecán y mezclas de los mismos.
Los inhibidores de la topoisomerasa II pueden ser etopósidos, por ejemplo.
Los inhibidores de la mitosis o antimetabolitos mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en alcaloides de la vinca, taxanos, antagonistas del ácido fólico, antagonistas de pirimidina, antagonistas de purina, inhibidores de la ribonucleótido reductasa y mezclas de al menos dos de los inhibidores de la mitosis o antimetabolitos mencionados anteriormente.
Por ejemplo, los alcaloides de la vinca pueden seleccionarse del grupo que consiste en vincristina, vinblastina y mezclas de las mismas.
Los taxanos pueden seleccionarse del grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel y mezclas de los mismos.
Por ejemplo, los antagonistas del ácido fólico pueden seleccionarse del grupo que consiste en metotrexato, pemetrexed y mezclas de los mismos.
Los antagonistas de pirimidina pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en citarabina, 5 fluorouracilo, gemcitabina, capecitabina y mezclas de al menos dos de dichos antagonistas de pirimidina.
Los antagonistas de purina pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en 5-azacitidina, azatioprina, 6-mercaptopurina, fludarabina y mezclas de al menos dos de dichos antagonistas de purina.
Por ejemplo, el inhibidor de la ribonucleótido reductasa puede ser hidroxiurea.
Los antibióticos anteriores pueden seleccionarse del grupo que consiste en bleomicina, actinomicina D, mitomicina y mezclas de al menos dos de los antibióticos anteriores.
Los inhibidores de cinasa mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en afatinib, alectinib, axitinib, crizotinib, cobimetinib, dasatinib, dabrafenib, erlotinib, gefitinib, imatinib, Ixazomib, lenvatinib, nilotinib, osimertinib, palbociclib, pazopanib, ponatinib, regorafenib, sunitinib, vemurafenib, trametinib, everolimus y mezclas de al menos dos de dichos inhibidores de cinasa.
Los derivados de talidomida mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en lenalidomida, pomalidomida y mezclas de las mismas.
Los inductores de apoptosis celular mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en metoxales, venetoclax y mezclas de los mismos.
Los agentes terapéuticos biológicos mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en rituximab, trastuzumab, cetuximab, panitumumab, ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, nivolumab, olaratumab, ramucirumab y mezclas de al menos dos de los agentes terapéuticos biológicos mencionados anteriormente.
Las hormonas y/o antagonistas hormonales mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en buserelina, goserelina, leuprorelina, triptorelina, estramustina, tamoxifeno, inhibidores de aromatasa tales como anastrozol, antiandrógenos tales como enzalutamida, flutamida, bica-lutamida, progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, glucocorticoides y mezclas de al menos dos de las hormonas y/o antagonistas hormonales mencionados anteriormente.
Los otros agentes citostáticos mencionados anteriormente pueden seleccionarse del grupo que consiste en bexaroteno, afatinib, crizotinib erlotinib, gefitinib, lapatinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, ponatinib, regorafenib, sonidegib, hidroxicarbamida, trametinib, tretininoína, isotretinoína, alitretinoína, MAOP (éster metílico del ácido 5-amino-4-oxopentanoico) y mezclas de al menos dos de los otros agentes citostáticos anteriores.
Además, las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 y/o el arenavirus original y/o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o una parte del mismo, antes de realizar la etapa d), en particular antes de realizar la etapa c), en particular antes de realizar la etapa b), en particular antes de realizar la etapa a), puede tratarse con radiación, en particular seleccionada del grupo que consiste en rayos ultravioleta (UV), en particular rayos UVA y/o rayos UVB, rayos alfa, rayos beta, rayos gamma y rayos X. De este modo, las células tumorales pueden simularse ventajosamente que ya se han sometido a radiación terapéutica. Esto permite ventajosamente la producción de un arenavirus, que puede usarse especialmente para el tratamiento de pacientes con tumores que ya han sido tratados con radioterapia.
Además, el arenavirus original y/o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o parte del mismo antes de realizar la etapa b) puede tratarse con radiación, en particular seleccionada del grupo que consiste en rayos ultravioleta (UV), en particular rayos UVA y/o rayos UVB, rayos alfa, rayos beta, rayos gamma y rayos X. De este modo, la tasa de mutación natural en el arenavirus y, por lo tanto, su adaptación a las células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 pueden aumentarse ventajosamente.
En otro ejemplo de la divulgación, se usan células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 que sean resistentes a al menos un agente antineoplásico. Por ejemplo, se pueden usar células tumorales primarias resistentes a paclitaxel y/o trametinib. De este modo, las células tumorales de un paciente pueden simularse ventajosamente, que sean resistentes a al menos un agente antineoplásico durante el tratamiento tumoral. El ejemplo de la divulgación descrito en este párrafo representa así posibilidades adicionales para la producción de un potente arenavirus antitumoral.
En un ejemplo adicional de la divulgación, las células tumorales primarias o las células de la línea celular H1975, C643 o Tramp-C2 y/o el arenavirus original y/o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o una parte del mismo se tratan antes de realizar la etapa d), en particular antes de realizar la etapa c), en particular antes de realizar la etapa b), en particular antes de realizar la etapa a) con al menos un compuesto antivírico, en particular con interferón alfa y/o interferón gamma. De este modo, el arenavirus original o el arenavirus contenido en el sobrenadante de cultivo celular extraído o en una parte del mismo puede forzarse ventajosamente a adaptarse en un entorno antiviral, por lo que se puede producir un arenavirus antitumoral que exhibe resistencia al mismo tiempo. Tal arenavirus es particularmente eficaz desde un punto de vista terapéutico, ya que también se puede usar para combatir el tejido tumoral que puede exhibir resistencia viral.
Además, el método puede comprender una etapa adicional e) aislar y/o identificar un arenavirus antitumoral, en particular un arenavirus, que tiene propiedades antitumorales mejoradas con respecto al arenavirus original, del sobrenadante de cultivo celular extraído o una parte del mismo por medio de clonación y/o PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y/o secuenciación.
Las células tumorales primarias usadas preferiblemente son células tumorales malignas primarias, en particular células de carcinoma primario, células de melanoma primario, células de blastoma primario, células de linfoma primario o células de sarcoma primario.
En otros ejemplos de la divulgación, las células tumorales primarias son células de melanoma coroideo primario, células de carcinoma anal primario, células de angiosarcoma primario, células de astrocitoma primario, células de carcinoma de células basales primarias, células de carcinoma de cuello uterino primario, células de condrosarcoma primarias, células de carcinoma coriónico primario, células de carcinoma de células escamosas dérmicas primarias, células de carcinoma de intestino delgado primario, células de carcinoma endometrial primario, células de sarcoma de Ewing primario, células de fibrosarcoma primario, células de carcinoma primario de vesícula biliar, células de carcinoma primario del conducto biliar, células de glioblastoma primario, células de carcinoma de vejiga primario, células de carcinoma de uréter primario, células de carcinoma uretral primario, células de carcinoma hepatocelular primario, células tumorales testiculares primarias, células de carcinoma hipofaríngeo primario, células de carcinoma pituitario primario, células de sarcoma de Kaposi primario, células de carcinoma bronquial primario de células pequeñas, células de carcinoma de colon primario, células de carcinoma colorrectal primario, células de carcinoma laríngeo primario, células de leiomiosarcoma primario, células de liposarcoma primario, células de carcinoma gástrico primario, células de histiocitoma fibroso maligno primario, células de carcinoma de mama primario, células de meduloblastoma primario, células de melanoma primario, células de carcinoma del suelo oral primario, células de carcinoma de seno primario, células de carcinoma nasofaríngeo primario, células de carcinoma de corteza suprarrenal primario, células de carcinoma paratiroideo primario, células de sarcoma neurogénico primario, células de carcinoma bronquial no microcítico primario, células de carcinoma renal primario, células de carcinoma orofaríngeo primario, células de osteosarcoma primario, células de carcinoma de ovario primario, células de tumor pancreático primario, células de carcinoma de pene primario, células de feocromocitoma primario, células de mesotelioma pleural primario, células de carcinoma de próstata primario, células de carcinoma rectal primario, células de retinoblastoma primario, células de rabdomiosarcoma primario, células de carcinoma de tiroides primario, células de carcinoma de glándula salival primario, células de carcinoma esofágico primario, células de carcinoma de amígdala primaria, células de carcinoma vaginal primario, células de carcinoma vulvar primario, células de tumor de Wilms primario, células primarias de tumores neuroendocrinos o células de carcinoma de lengua primario.
Particularmente preferidas son las células de melanoma primario, células de carcinoma de pulmón primario, células de carcinoma pancreático primario, células de carcinoma de colon primario, células de carcinoma gástrico primario, células de carcinoma faríngeo primario, células de carcinoma laríngeo primario, células de carcinoma de células renales primarias se prefieren particularmente como células tumorales primarias, células de carcinoma de ovario primario, células de carcinoma endometrial primario, células de carcinoma de tiroides primario, células de carcinoma de próstata primario, células de carcinoma hepático primario o células de sarcoma primario, tales como células de sarcoma neurogénico primario, células de osteosarcoma primario o células de rabdomiosarcoma primario.
En un ejemplo adicional de la divulgación, un arenavirus de tipo natural, es decir un denominado arenavirus de tipo natural, se usa como el arenavirus original.
En un ejemplo adicional de la divulgación, se usa un arenavirus del viejo mundo como el arenavirus original. El arenavirus del viejo mundo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en el virus Catarina, virus Danfenong, virus Ippy (IP-PYV), virus Kodoko, virus Lassa (VLAS), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Morogoro, virus Mobala (MOBV), virus Gairo y virus Mopeia (MOPV), virus Pinhal, virus Skinner Tank.
Se prefiere como arenavirus original el virus de la coriomeningitis linfocítica, en particular un tipo natural del virus de la coriomeningitis linfocítica. Por ejemplo, una cepa del virus de la coriomeningitis linfocítica, en particular seleccionado del grupo que consiste en WE, Armstrong, Clon 13 (Clon 13) y Docile, se puede usar como el arenavirus original.
Particularmente preferido es el virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, es decir un virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural que comprende una proteína L que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 7, y/o un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ácido ribonucleico, preferiblemente secuencia de ácido L-ribonucleico, que es complementario a una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 8.
Además, se puede usar un arenavirus del nuevo mundo como arenavirus original. El arenavirus del nuevo mundo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en el virus Allpahuayo (ALLV), virus Amapari (AMAV), virus Bear Canyon (BCNV), virus Chapare, virus Cupixi (CPXV), virus Flexal (FLEV), virus Guanarito (GTOV), virus Junín (JUNV), Candid #1 (Candid N.° 1).), virus Latino (LATV), virus Machupo (Ma CV), virus Oliveros (OLVV), virus Parana (PARV), virus Pichinide (PICV), virus Pirital (PIRV), virus Sabia (SAbV), virus Tacaribe (TCRV), virus Tamiami (TAMV) y virus de arroyo de agua blanca (WWAV).
Además, se puede usar un arenavirus sin propiedades antitumorales como el arenavirus original.
Alternativamente, se puede usar un arenavirus original con propiedades antitumorales.
Según un segundo aspecto, la invención se refiere a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, es decir un mutante del virus de la coriomeningitis linfocítica.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende una proteína o péptido, en particular una glicoproteína. La proteína o péptido comprende una mutación, en particular una mutación puntual. La mutación, en particular mutación puntual, es diferente de las secuencias AJ297484, AJ233196 y la secuencia de referencia LCMV, (cepa WE-Essen).
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica tiene una glicoproteína, en particular un componente proteico o un resto proteico de una glicoproteína, con al menos una mutación, en el que la al menos una mutación es una sustitución de aminoácidos de la isoleucina en la posición 181 de la glicoproteína por metionina, y/o una sustitución de aminoácidos de la arginina en la posición 185 de la glicoproteína por triptófano.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende preferiblemente una proteína L con al menos una mutación, en el que la al menos una mutación es una sustitución de aminoácidos de la lisina en la posición 1513 de la proteína L por otro aminoácido, preferiblemente glutamato, y/o una sustitución de aminoácidos de la fenilalanina en la posición 1995 de la proteína L por otro aminoácido, preferiblemente serina, y/o una sustitución de aminoácidos de isoleucina en la posición 2094 de la proteína L por otro aminoácido, preferiblemente valina, y/o una sustitución de aminoácidos de treonina en la posición 2141 de la proteína L por otro aminoácido, preferiblemente alanina, y/o una sustitución de aminoácidos de arginina en la posición 2175 de la proteína L por otro aminoácido, preferiblemente lisina.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende preferiblemente una proteína o péptido, en particular una glicoproteína, en particular un componente proteico o un resto proteico de una glicoproteína, o una proteína L, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 64. Las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 58 son preferiblemente secuencias de aminoácidos de una glicoproteína del mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ iD NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 64 son preferiblemente la secuencia de aminoácidos de una proteína L del mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende preferiblemente un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, que codifica una proteína o péptido, en particular una glicoproteína o proteína L, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la s Eq ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 64.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende preferiblemente un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ácido ribonucleico, o consiste en una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ácido ribonucleico, que es complementario a una secuencia de ácido nucleico según la SEQ iD NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 63.
Sorprendentemente, se descubrió que un mutante respectivo/mutantes respectivos del virus de la coriomeningitis linfocítica, como se describe en los párrafos anteriores, tiene/tienen una competencia de replicación mejorada en células tumorales primarias o células de la línea celular H1975, así como propiedades antitumorales o antitumorales mejoradas, en particular con respecto al tipo natural del virus de la coriomeningitis linfocítica.
Además, se prefiere que el codón para isoleucina en la posición 181 de la glicoproteína se reemplace por un codón para metionina.
Además, se prefiere que el codón para arginina en la posición 185 de la glicoproteína se reemplace por un codón para triptófano.
Además, se prefiere que el codón para histidina en la posición 155 de la glicoproteína se reemplace por otro codón, preferiblemente un codón para tirosina.
Además, se prefiere que el codón para arginina en la posición 358 de la glicoproteína se reemplace por otro codón, preferiblemente por un codón para lisina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de nucleótidos de adenina en la posición 4537 del ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, por guanina.
Además, se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que codifica una proteína L que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de aminoácidos de la lisina en la posición 1513 de la proteína L, por otro aminoácido, preferiblemente por glutamato.
Además, se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular un ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que codifica una proteína L que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de aminoácidos de la fenilalanina en la posición 1995 de la proteína L, por otro aminoácido, preferiblemente por una serina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de nucleótidos de timina en la posición 5984 del ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, preferiblemente por el nucleótido citosina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que codifica una proteína L que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de aminoácidos de la isoleucina en la posición 2094 de la proteína L, por otro aminoácido, preferiblemente por valina.
Además, se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de nucleótidos de adenina en la posición de nucleótido 6280 del ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, por otro nucleótido, preferiblemente guanina.
Además, se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que codifica una proteína L que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 2141 de la proteína L, por otro aminoácido, preferiblemente por alanina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de nucleótidos de adenina en la posición 6421 del ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, preferiblemente por otro nucleótido, preferiblemente guanina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que codifica una proteína L que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de aminoácidos de arginina en la posición 2175 de la proteína L, preferiblemente por lisina.
Además, también se prefiere que el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprenda un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, que comprende una mutación, en el que la mutación es una sustitución de nucleótidos de guanina en la posición 6524 del ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, preferiblemente ácido L-ribonucleico, por el nucleótido adenina.
En otra realización de la invención, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica es un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica de la invención para su aplicación o uso en medicina.
Preferiblemente, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica es un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica para su aplicación o uso en el tratamiento y/o la prevención de un tumor.
El tumor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma y sarcoma.
Debe entenderse que el término “carcinoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen epitelial.
Debe entenderse que el término “sarcoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen mesodérmico.
Debe entenderse que el término “melanoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen melanocítico.
Debe entenderse que el término “linfoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen linfocítico.
Debe entenderse que el término “blastoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen embrionario.
El carcinoma se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en carcinoma anal, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmón, carcinoma endometrial, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma rectal, carcinoma laríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de ovario, carcinoma pancreático, carcinoma faríngeo, carcinoma orofaríngeo, carcinoma de próstata, carcinoma de tiroides y carcinoma de cuello uterino.
El sarcoma puede seleccionarse del grupo que consiste en angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, liposarcoma, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma neurogénico, osteosarcoma y rabdomiosarcoma.
Además, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica puede prepararse o usarse para la administración local, en particular intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.
Alternativamente, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica puede prepararse o usarse para administración sistémica, en particular intravenosa.
Para características y beneficios adicionales del mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, se hace referencia completa a la descripción anterior y a la siguiente.
Según un tercer aspecto, la invención se refiere a un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica que comprende una proteína o péptido, en particular glicoproteína, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 58.
Alternativamente o en combinación, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica comprende un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, en el que el ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, comprende una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ácido ribonucleico, o consiste en una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ácido ribonucleico, que es o es complementaria a una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 57.
Preferiblemente, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica es un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica para su aplicación o uso en medicina.
El mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica es en particular preferentemente un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica para su uso o aplicación en el tratamiento y/o la prevención de un tumor.
El tumor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma y sarcoma. Debe entenderse que el término “carcinoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen epitelial.
Debe entenderse que el término “sarcoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen mesodérmico.
Debe entenderse que el término “melanoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen melanocítico.
Debe entenderse que el término “linfoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen linfocítico.
Debe entenderse que el término “blastoma” en el contexto de la presente invención significa una neoplasia maligna de origen embrionario.
El carcinoma se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en carcinoma anal, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmón, carcinoma endometrial, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma rectal, carcinoma laríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de ovario, carcinoma pancreático, carcinoma faríngeo, carcinoma orofaríngeo, carcinoma de próstata, carcinoma de tiroides y carcinoma de cuello uterino.
El sarcoma puede seleccionarse del grupo que consiste en angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, liposarcoma, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma neurogénico, osteosarcoma y rabdomiosarcoma.
Además, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica puede prepararse o usarse para la administración local, en particular intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.
Alternativamente, el mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica puede prepararse o usarse para administración sistémica, en particular intravenosa.
Con respecto a otras características y ventajas del mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, para evitar repeticiones, también se hace referencia completa a la descripción anterior, en particular a las declaraciones hechas en el contexto del segundo aspecto de la invención. Las características y ventajas descritas en el mismo, en particular con respecto al mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, la proteína o péptido, en particular glicoproteína, y el ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, también se aplican mutatis mutandis al mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica según el tercer aspecto de la invención.
Según un cuarto aspecto, la invención se refiere a un fármaco o medicamento que comprende un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica según el segundo o tercer aspecto de la invención.
El fármaco o medicamento puede comprender además un bloqueador de puntos de control, tal como PD-1 (proteína de muerte celular programada 1), y/o un modulador de apoptosis, en particular un inhibidor de la apoptosis, tal como mimético de SMAC (LCL-161).
El fármaco o medicamento preferiblemente comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. El portador puede seleccionarse del grupo que consiste en agua, solución salina acuosa, solución tampón acuosa, medio de cultivo celular y combinaciones de al menos dos de los vehículos anteriores.
Con respecto a otras características y ventajas del fármaco o medicamento, para evitar repeticiones, se hace referencia completa a la descripción anterior, en particular a las declaraciones hechas en el contexto del segundo y tercer aspectos de la invención. Las características y ventajas descritas en los mismos, en particular con respecto al mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, también se aplican mutatis mutandis al fármaco o medicamento al que se hace referencia en el cuarto aspecto de la invención.
Según un quinto aspecto, la divulgación se refiere a una proteína o péptido, que es preferiblemente una proteína o péptido aislado, en particular una glicoproteína o una proteína L, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 64. La divulgación también se refiere a una proteína o péptido aislado que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 64.
Las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 son preferiblemente la secuencia de aminoácidos de una glicoproteína, en particular un componente proteico o un resto proteico de una glicoproteína, de un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica. La secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 5 es preferiblemente la secuencia de aminoácidos de una proteína L de un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 es preferiblemente la secuencia de aminoácidos de una proteína L de un virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural.
La divulgación también se refiere a una proteína o péptido, que es preferiblemente una proteína o péptido aislado, en particular una nucleoproteína o una proteína Z, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 62. La divulgación también se refiere a una proteína o péptido aislado que tiene al menos al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%,
preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %,
preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con la SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID
NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 62.
Con respecto a otras características y ventajas de la proteína o péptido, para evitar repeticiones, también se hace
referencia completa a la descripción anterior, en particular a las declaraciones hechas en el segundo y tercer aspectos
de la invención. Las ventajas y características descritas en los mismos, en particular con respecto a la proteína o
péptido, en particular glicoproteína, también se aplican mutatis mutandis a la proteína o péptido aislado según el quinto
aspecto de la divulgación.
Según un sexto aspecto, la divulgación se refiere a un ácido nucleico, que es preferiblemente un ácido nucleico aislado,
en particular ácido ribonucleico, que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico, en particular
secuencia de ácido ribonucleico, según o complementaria a la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:
57, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 63. La divulgación
también se refiere a una proteína o péptido aislado que tiene al menos al menos un 95 %, preferiblemente al menos
un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %,
preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3%, preferiblemente al menos un 99,4%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,6%, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID
NO: 57, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 63 o una
secuencia complementaria respectiva.
La divulgación también se refiere a un ácido nucleico, que es preferiblemente un ácido nucleico aislado, en particular
ácido ribonucleico, que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de
ácido ribonucleico, según o complementaria a la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 61. La divulgación también se refiere a una proteína o péptido aislado
que tiene al menos al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %,
preferiblemente al menos un 98% preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente al menos un 99,1%,
preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, SEQ ID
NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID
NO: 53 o SEQ ID NO: 61 o una secuencia complementaria respectiva.
Cada una de las secuencias de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 preferiblemente codifica una
glicoproteína, en particular un componente proteico o un resto proteico de una glicoproteína, de un mutante de virus
de la coriomeningitis linfocítica.
La secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 6 preferiblemente codifica una proteína L de un mutante de virus
de la coriomeningitis linfocítica.
La secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 preferiblemente codifica una proteína L de un virus de la
coriomeningitis linfocítica de tipo natural.
Con respecto a otras características y ventajas del ácido nucleico aislado, para evitar repeticiones, también se hace
referencia completa a la descripción anterior, en particular a las declaraciones hechas en el contexto del segundo y
tercer aspectos de la invención. Las características y ventajas descritas en los mismos, en particular con respecto al
ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, también se aplican mutatis mutandis al ácido nucleico aislado según
el sexto aspecto de la divulgación.
Según un séptimo aspecto, la divulgación se refiere a un grupo de genes u operón aislados que contiene al menos un
ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, según el quinto aspecto de la divulgación.
Con respecto a otras características y ventajas del grupo de genes u operón, para evitar repeticiones, también se hace
referencia completa a la descripción anterior, en particular a las declaraciones hechas en el contexto del sexto aspecto
de la divulgación. Las características y ventajas descritas en el mismo, en particular con respecto al ácido nucleico,
en particular ácido ribonucleico, también se aplican mutatis mutandis al grupo de genes u operón aislados según el
séptimo aspecto de la divulgación.
Según un octavo aspecto, la divulgación se refiere a un vector de expresión que contiene al menos un ácido nucleico
según el sexto aspecto de la divulgación o un grupo de genes u operón según el séptimo aspecto de la divulgación.
Con respecto a otras características y ventajas del vector de expresión, para evitar repeticiones, también se hace referencia completa a la descripción, en particular a las declaraciones hechas en el sexto y séptimo aspectos de la divulgación. Las características y ventajas descritas en los mismos, en particular con respecto al ácido nucleico y el grupo de genes u operón, también se aplican mutatis mutandis al vector de expresión según el octavo aspecto de la divulgación.
Según un noveno aspecto, la divulgación se refiere a un organismo, un virus, un vector o un plásmido que expresa o contiene una proteína o péptido según el quinto aspecto de la divulgación y/o que contiene un ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, según el sexto aspecto de la divulgación.
El organismo puede ser una célula hospedadora, un hongo o una bacteria.
La célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una célula eucariota o procariota. Además, la célula hospedadora puede ser una célula que puede usarse para la producción de organismos y/o vectores y/o plásmidos.
La bacteria puede ser, por ejemplo, un vector de vacuna u otra bacteria terapéutica.
El virus puede ser, por ejemplo, un vector de vacuna u otro virus terapéutico.
Con respecto a otras características y ventajas de la célula hospedadora, para evitar repeticiones, también se hace referencia completa a la descripción, en particular a las declaraciones hechas en el quinto y sexto aspectos de la divulgación. Las características y ventajas descritas allí, en particular con respecto a la proteína o péptido, en particular glicoproteína, y el ácido nucleico, en particular ácido ribonucleico, también se aplican mutatis mutandis a la célula hospedadora según el noveno aspecto de la divulgación.
Otras características y ventajas de la invención resultan de la siguiente descripción de realizaciones preferidas en forma de ejemplos, las figuras correspondientes y las reivindicaciones. Las realizaciones descritas a continuación solo pretenden proporcionar una descripción adicional y una mejor comprensión de la invención y de ninguna manera deben interpretarse como limitativos.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un mutante de LCMV de la invención. La composición puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además un bloqueador de punto de control, tal como PD-1 (proteína de muerte celular programada 1), y/o un modulador de apoptosis, en particular un inhibidor de la apoptosis, tal como mimético de SMAC (LCL-161). La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. El portador puede seleccionarse del grupo que consiste en agua, solución salina acuosa, solución tampón acuosa, medio de cultivo celular y combinaciones de al menos dos de los vehículos anteriores.
La presente divulgación también se refiere al uso de un LCMV de la divulgación, preferiblemente un mutante de LCMV de la divulgación para la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para el tratamiento de un tumor. El medicamento puede ser un medicamento según el cuarto aspecto de la invención.
La presente divulgación también se refiere a un método para tratar un tumor, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un LCMV de la divulgación, preferiblemente un mutante de LCMV de la divulgación, o un medicamento de la divulgación o una composición farmacéutica de la divulgación.
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término “al menos” que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento en la serie.
El término “y/o” siempre que se use en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.
El término “alrededor de” o “aproximadamente” como se usa en el presente documento significa dentro del 20 %, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. Incluye, sin embargo, también el número concreto, por ejemplo, aproximadamente 20 incluye 20.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, el término “que comprende” puede sustituirse por el término “que contiene” o “que incluye” o, a veces, cuando se usa en el presente documento, con el término “que tiene”.
Cuando se usa en el presente documento “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa, o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.
En cada caso en el presente documento, cualquiera de los términos “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” pueden reemplazarse por cualquiera de los otros dos términos. Por ejemplo, el término “que comprende” pretende proporcionar soporte explícito también para “que consiste esencialmente en” y “que consiste en”, el término “que consiste esencialmente en” pretende proporcionar soporte explícito también para “que comprende” y “que consiste en”, el término “que consiste en” pretende proporcionar soporte explícito también para “que consiste esencialmente en” y “que comprende”.
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, material, reactivos y sustancias, etc., descritos en el presente documento y como tal puede variar. La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.
Ejemplos
1. Métodos y materiales
1.1 Ratones
Para los análisis antitumorales in vivo, se usaron animales WT (en base a C57BL/6) o ratones NOD.SCID sin una cepa inmune adaptativa WE. Los ratones OT-1 portan un receptor de células T restringido por MHC-I específico de ovoalbúmina como transgén.
1.2 Líneas celulares
MC57 (CVCL_4985) es una línea celular de fibroblastos murinos en la que el arenavirus LCMV puede multiplicarse bien. C643 (CVCL_5969) es una línea celular de carcinoma de tiroides anaplásico humano. H1975 es una línea celular de carcinoma de pulmón humano (CVCL_1511, ATCC, CRL-5908, adenocarcinoma). TrampC2 es una línea celular de adenocarcinoma murino (CVCL_3615). MOPC es una línea celular orofaríngea murina. CMT167 (CVCL_2405) es una línea celular de carcinoma de pulmón murino. B16F10-OVA es una línea celular de melanoma murino (CVCL_0159) que expresa ovoalbúmina como un antígeno modelo. UKE-Mel-13a son células tumorales primarias aisladas de una metástasis de melanoma humano y se han sometido a pases menos de 100x. 511950 son células tumorales primarias aisladas de un carcinoma pancreático murino transgénico (Mazur PK et al Nat Med. 2015 Oct;21(10):1163-71.) y se han sometido a pases de menos de 20x. 511950R se originan a partir de células 511950 y se han sometido a pases menos de 100x bajo tratamiento con el inhibidor de MEK trametinib.
1.3 Virus
La cepa WE de LCMV se obtuvo del laboratorio del Prof. Zinkernagel (Inmunología experimental, Zurich, Suiza) y se ha propagado en células L929 o células BHK desde 2008. Los clones LCMV-P42, LCMV-P52 y LCMV-P91 se aislaron y se secuenciaron después de diferentes pases.
1.4 Reactivos
LCL161 (Selleckchem) y anti-PD1 (BioXcell) se sometieron a ensayo en combinación con LCMV y LCMV-P52, respectivamente, para determinar su actividad antitumoral.
1.5 Determinación de células infectadas por LCMV por inmunofluorescencia
Se usó inmunofluorescencia para detectar LCMV en células. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos, conteniendo cada una una cubierta de vidrio. Después de 24 horas, las células se infectaron con LCMV y se tiñeron 24 horas después con un anticuerpo anti-LCMV-NP marcado con fluorocromo (clon VL4), visualizado con un microscopio de fluorescencia y fotografiado con una cámara CCD integrada.
1.6 Determinación de LCMV en sobrenadante mediante ensayo de placa
Para determinar la producción de LCMV de células, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se infectaron con LCMV después de 24 horas. El sobrenadante se extrajo después de 24 horas. El sobrenadante se tituló en placas de 24 pocillos y células MC57 (150.000 células/pocillo). Se añadió metilcelulosa después de 4 horas. Después de otras 48 horas, el césped celular se analizó para detectar placas de LCMV con anticuerpos anti-LCMV-NP (clon KL53). Las placas se contaron para determinar el número de partículas infecciosas/ml en el sobrenadante.
1.7 Pases de virus
Para adaptar los virus a los tumores, diferentes células tumorales primarias o líneas celulares tumorales se infectaron con LCMV-WE. Las células se colocaron en placa en placas de 24 pocilios (aprox. 100.000 células/pocillo en 1 ml de medio). Después de 24 horas, se añadieron virus con una multiplicidad de infección (MOI) = 1 en 100 |il. Dependiendo del ajuste, el inóculo inicial se eliminó entre 1 - 30 minutos y se añadió medio nuevo. Después de 24 o 48 o 72 horas, el sobrenadante del cultivo celular se extrajo y se congeló para su posterior análisis. Las células recién colocadas en placa se infectaron con 100 microlitros del sobrenadante extraído. Este procedimiento se repitió entre 30 y 100 veces.
1.8 Secuenciación
Después de la transcripción inversa del ARN viral, el ADNc se amplificó con pares de cebadores específicos de secuencia (oligonucleótidos) en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los productos de PCR se purificaron, se secuenciaron por secuenciación cíclica (método de Sanger modificado), los productos se separaron por electroforesis capilar y la secuencia se registró como un electroferograma. La secuencia de ácido nucleico se tradujo para obtener la secuencia de proteína.
1.9 Activación inmune innata
La capacidad del LCMV para activar el sistema inmunitario innato se determinó mediante el biomarcador IFN-alfa usando ELISA de IFN-alfa murino (ThermoFisher).
1.10 Activación inmune adaptativa
La capacidad del LCMV para activar el sistema inmunitario adaptativo se sometió a ensayo mediante tinción con tetrámero (NIH, Tetramer Facility) de linfocitos activados.
1.11 Crecimiento tumoral y tratamientos
Para medir el efecto antitumoral, se inyectaron a ratones C57BL/6 o NOD.SCID (6-12 semanas de edad) 5 x 105 células tumorales (en 100 |il) por vía subcutánea en el flanco derecho o izquierdo. Después de que se formó un tumor visible, se trataron los animales y se determinó el diámetro tumoral medio o el volumen tumoral. Para un modelo de metástasis, las células B16F10-OVA se administraron por vía intravenosa.
1.12 Aislamiento y transferencia de células T CD8+ específicas de ovoalbúmina (tumor)
Para el análisis de células T CD8+ específicas de tumor, las células del bazo de ratones OT-1 se transfirieron a ratones C57BL/6 que portaban células tumorales que expresaban ovoalbúmina (B16F10-OVA). Los bazos se aplastaron mecánicamente. Después de la filtración, se inyectaron por vía intravenosa 107 células de bazo por ratón.
1.13 Medición de células T CD8+ específicas de tumor
Para analizar el número de células T CD8+ específicas de tumor, las células de la sangre se incubaron con tetrámeros de ovoalbúmina fluorescentes (cuatro moléculas de H-2 Kb MHC-I acopladas que portan el péptido SIINFEKL, NIH Tetramer Facility) y anticuerpos anti-CD8 acoplados a fluorocromo (eBioscience) y se analizaron después del lavado en un citómetro de flujo. Para el análisis de la función de las células T, se trituraron mecánicamente las células de bazo y se incubaron después de la filtración con Brefeldin A y con o sin péptido SIINFEKL. Después de seis horas, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes específicos para CD8 (anti-CD8, eBioscience) e interferón-gamma intracelular (anti-interferón-gamma, eBioscience). La frecuencia de las células productoras de IFN-gamma se analizó mediante citometría de flujo.
1.14 Análisis estadístico
Los valores medios se compararon usando una prueba t de Student de dos muestras no pareada. Los datos se presentan como media SEM. Se determinó que el nivel de significancia estadística era p <0,05.
1.15 Generación de LCMV-P42:
LCMV-WE se sometió a pases 42 veces en cultivos de células tumorales primarias (UKE-Mel-13a). Después de 42 pases, se detectó una mutación funcional en el nuevo virus (LCMV-P42). Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de LCMV-WE y P42 mutante se muestran en la figura 25 (A y B).
1.16 Generación de LCMV-P91, LCMV-P52 y sus subclones:
LCMV-WE se sometió a pases 52 veces en las líneas celulares tumorales H1975. Después de 52 pases, las mutaciones I181M, R185W se detectaron en la glicoproteína del nuevo virus. Además, se encontraron algunas mutaciones muy probablemente irrelevantes y/u oligoclonales (cuasiespecies). Este virus se denomina: “LCMV-P52”. Para determinar la estabilidad e importancia de las mutaciones I181M y R185W, el sobrenadante del pase P52 se sometió a pases 39 veces más. El virus derivado de este pase se denomina: “LCMV-P91” y todavía contenía las mutaciones I181M y R185W. El virus LCMV-P52 se subclonó por dilución limitativa. Este virus clonal se denomina: “LCMV-P52.1”. Las mutaciones I181M, R185W permanecieron estables. Las mutaciones consideradas irrelevantes y/u oligoclonales (cuasiespecies) mostraron algunos cambios. Para determinar el papel de las mutaciones individuales I181M y R185W, se analizaron algunos pases anteriores. El pase P29 contenía virus con mutaciones individuales I181M y R185W. Los virus del pase P29 se subclonaron por dilución limitativa. Un subclón con la mutación individual R185W se denominó: “LCMV-P52-1.3”; un subclón con la mutación individual I181M se denominó: “LCMV-P52-2.1”. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de mutantes de LCMV P52, P92, P52-1, P52-1.3 y P52-2.1 se muestran en la figura 25 (C-G). Las alineaciones de secuencias de ácido nucleico y aminoácidos LCMV-WE y mutantes P42, P52, P92, P52-1, P52-1.3 y P52-2.1 se muestran en la figura 26 (A-H).
2. Investigaciones
2.1 Líneas celulares tumorales MC57, C643, H1975 y cultivos de células tumorales primarias (UKE Mel-13a) se infectaron con LCMV (cepa WE, MOI 1). La replicación se midió después de 24 horas (n = 3).
De este modo se demostró que el LCMV (cepa WE) se propaga de manera diferente. En comparación con la línea celular tumoral MC57, la propagación se redujo en las líneas celulares C643 y H1975, así como en cultivos de células tumorales primarias (UKE-Mel-13a). Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 1.
Pueden observarse en blanco las células infectadas por LCMV en los cultivos con MC57, C643, H1975 y UKE-Mel-13a. 0 = sin infección, LCMV = infectado por LCMV.
2.2 Se infectaron la línea celular tumoral MC57 y cultivos de células tumorales primarias 511950 con LCMV (cepa WE, MOI 0,1) (gráfico izquierdo). Se infectaron las líneas celulares tumorales MC57, Tramp-C2 y cultivos de células tumorales primarias (511950 y 511950R) con LCMV (cepa WE, MOI 1) (gráfico derecho). El número de partículas de virus infecciosas se midió después de 24 horas en el sobrenadante.
De este modo, se demostró que el LCMV (cepa WE) prolifera menos en comparación con la línea celular tumoral MC57 en la línea celular Tramp-C2, así como en los cultivos de células tumorales primarias (511950 y 511950R). Los resultados se muestran en la figura 2.
La figura 2 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: Partículas de LCMV infecciosas en sobrenadante (UFP/ml),
Abscisas: Grupos de tratamiento; MC57, Tramp-C2, 511950, 511950R.
2.3 Se sometió a pases LCMV-WE 42 veces en cultivos de células tumorales primarias (UKE-Mel-13a). Después de 42 pases, se detectó una mutación funcional en el nuevo virus (LCMV-P42).
De este modo, pudo demostrarse que las células tumorales primarias son adecuadas para modificar arenavirus mediante pases. El procedimiento experimental se muestra en la figura 3.
2.4 Se sometió a pases LCMV-WE 52 veces en líneas celulares tumorales H1975. Después de 52 pases, se detectaron mutaciones funcionales en el nuevo virus LCMV-P52.
De este modo, usando el ejemplo de H1975, se demostró que las líneas celulares tumorales con replicación de LCMV reducida (en comparación con la línea celular MC57) son adecuadas para alterar arenavirus mediante pases. El procedimiento experimental se ilustra en la figura 4.
2.5 Se sometió a pases LCMV-P52 39 veces en las líneas celulares tumorales H1975. Después de 39 pases, se detectaron mutaciones funcionales adicionales en el nuevo virus LCMV-P91.
De este modo, se demostró que las células H1975 son capaces de alterar arenavirus mediante pases. El procedimiento experimental se muestra gráficamente en la figura 5.
2.6 Se infectaron líneas celulares H1975 se infectaron con LCMV-WE y LCMV-P52 (MOI 1). El virus se determinó después de 12 horas en el sobrenadante (n = 6).
De este modo, se demostró que LCMV-P52 se replica mejor que LCMV-WE en células H1975. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 6.
La figura 6 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: Partículas de LCMV infecciosas en el sobrenadante (UFP/ml),
Abscisas: Grupos de tratamiento; LCMV-WE o LCMV-P52
2.7 Se infectaron células dendríticas derivadas de médula ósea murina con LCMV-WE y LCMV-P52 (MOI 1). El virus se determinó después de 24 horas en el sobrenadante (n = 3).
De este modo, se demostró que LCMV-P52 se replica mejor que LCMV-WE en células presentadoras de antígeno. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 7.
La figura 7 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: Partículas de LCMV infecciosas en el sobrenadante (UFP/ml),
Abscisas: Grupos de tratamiento; LCMV-WE o LCMV-P52
2.8 Se infectó la línea celular tumoral H1975 con LCMV-WE o LCMV-P52 (MOI 1). La propagación del virus se midió por inmunofluorescencia después de 24 horas.
De este modo, se demostró que LCMV-P52 puede propagarse mejor en líneas celulares tumorales en comparación con LCMV WE usando el ejemplo de H1975. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 8. Se muestran en blanco las células infectadas por LCMV para un cultivo infectado con LCMV-WE o LCMV-P52.
2.9 Se infectaron células tumorales primarias (UKE-Mel-13a) con LCMV-WE o LCMV-P52 (MOI 1). La propagación de los virus se midió por inmunofluorescencia después de 24 horas.
De este modo, se demostró que LCMV-P52 puede propagarse mejor en células tumorales primarias en comparación con LCMV-WE. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 9.
Las células infectadas por LCMV para cultivos infectados con LCMV-WE o LCMV-P52 se muestran en blanco.
2.10 Se infectaron ratones C57BL/6 con LCMV-WE o LCMV-P52 (2x104 UFP por vía intravenosa). Un día después de la infección, se determinó la activación del sistema inmunitario innato midiendo IFN-alfa en suero.
De este modo, se demostró que LCMV-P52 causa una activación inmune innata más fuerte que LCMV-WE. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 10.
La figura 10 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: Concentración de IFN-alfa (ng/ml de suero)
Abscisas: Grupos de tratamiento; animales infectados por LCMV-WE o LCMV-P52.
2.11 Se infectaron ratones C57BL/6 con LCMV-WE o LCMV-P52 (2x104 UFP por vía intravenosa). La activación del sistema inmunitario adaptativo se determinó mediante citometría de flujo usando tetrámero (mediciones de células T CD8+ específicas de virus).
De este modo, se demostró que LCMV-P52 induce una activación inmune adaptativa más fuerte que LCMV-WE. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 11.
La figura 11 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: células T CD8+ específicas de virus (% de células T CD8+ totales en sangre),
Abscisas: Tiempo (días después de la infección)
2.12 Se trataron ratones NOD.SCID por vía subcutánea con 5 x 105 células H1975 (día -7). Los ratones se infectaron adicionalmente con 2 x 104 UFP de LCMV-WE o LCMV-P52 por vía intratumoral (día 0). Se analizó el crecimiento tumoral.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 tenía un efecto antitumoral más fuerte que el tratamiento con LCMV-WE. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 12.
La figura 12 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: diámetro medio del tumor (cm),
Abscisa: tiempo (días después del tratamiento con LCMV)
2.13 Se trataron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5 x 105 células MOPC (día -7). Un grupo de ratones se infectó adicionalmente con 2 x 104 UFP de LCMV-P52 por vía intravenosa (n=3, día 0). Se analizó el crecimiento tumoral.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 tenía un fuerte efecto antitumoral. Los resultados se muestran gráficamente en la figura 13.
La figura 13 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: volumen tumoral (mm3),
Abscisas: tiempo (días después del tratamiento con LCMV)
2.14 Se trataron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5 x 105 células CMT167 (día -7). Un grupo de ratones se infectó adicionalmente con 2 x 104 UFP de LCMV-P52 por vía intravenosa (n=3, día 0). Se analizó el crecimiento tumoral.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 tenía un fuerte efecto antitumoral. Los resultados se muestran en la figura 14.
La figura 14 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: volumen tumoral (mm3),
Abscisas: tiempo (días después del tratamiento con LCMV)
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 tenía un fuerte efecto antitumoral. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 15.
Se muestran en negro las células tumorales en el pulmón; 0 = sin infección
2.15 Se trataron ratones C57BL/6 por vía intravenosa con 5 x 105 células B16F10-OVA (día -7). Se transfirieron células T CD8+ específicas de tumor aisladas del bazo de un ratón OT-1 (día - 4). Un grupo de animales se trató adicionalmente con LCMV-P52 por vía intravenosa (2x104 UFP, n=4). En el día 9, se extrajeron los pulmones y se fotografiaron.
0 = animales control, 4 pulmones cada uno; LCMV-P52 = tratados con LCMV-P52, 4 pulmones cada uno.
2.16 Se trataron ratones C57BL/6 por vía intravenosa con 5 x 105 células B16F10-OVA (día -7). Se transfirieron células T CD8+ específicas de tumor aisladas del bazo de un ratón OT-1 (día - 4). Un grupo de animales se trató adicionalmente con LCMV-P52 por vía intravenosa (2x104 UFP, n=4). En el día 3, se determinó la frecuencia de células T CD8+ específicas de tumor en la sangre.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 aumenta la expansión de las células T CD8+ específicas de tumor. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 16.
La figura 16 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: Frecuencia de células T CD8+ específicas de tumor en la sangre (% de células T CD8+ totales), Abscisas: grupos de tratamiento 0 = sin infección LCMV-P52 = tratado con LCMV-P52
2.17 Se trataron por vía intravenosa ratones C57BL/6 con 5 x 105 células B16F10-OVA (día -7). Se transfirieron células T CD8+ específicas de tumor aisladas del bazo de un ratón OT-1 (día - 4). Un grupo de animales se trató adicionalmente con LCMV-P52 por vía intravenosa (2x104 UFP, n=4). En el día 9, la función de las células T CD8+ específicas de tumor en el bazo se determinó mediante reestimulación in vitro.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 aumenta la función de las células T CD8+ específicas de tumor. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 17.
La figura 17 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: frecuencia de células T CD8+ específicas de tumor productoras de IFN-gamma (% de células T CD8+ totales),
Abscisas: grupos de tratamiento; 0 : sin tratamiento con LCMV-P52; LCMV-P52: tratamiento con LCMV-P52; leyenda: -: sin antígeno; : reestimulación con antígeno (péptido SIINFEKL).
2.18 Se trataron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5 x 105 células B16F10-OVA (día - 7). Un grupo de animales no se trató adicionalmente (n = 3). Un grupo de animales se trató con el inhibidor LCL-161 (50 mg/kg de peso corporal oral) dos veces por semana desde el día 0. Un grupo se trató por vía intratumoral con LCMV-WE en el día 0 (2x104 UFP, n=4). Un grupo se trató con LCL-161 y LCMV. Se analizó el crecimiento tumoral.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-WE tiene un efecto sinérgico con LCL-161. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 18.
La figura 18 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: volumen tumoral (mm3),
Abscisas: tiempo (días después de la administración de LCMV)
2.19 Se trataron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5 x 105 células B16F10-OVA (día - 7). Un grupo de animales no se trató adicionalmente (n = 3). Un grupo de animales se trató con el inhibidor LCL-161 (50 mg/kg de peso corporal oral) dos veces por semana desde el día 0. Un grupo se trató por vía intratumoral con LCMV-WE en el día 0 (2x104 UFP, n=4). Un grupo se trató con LCL-161 y LCMV. Se analizó la supervivencia de los animales.
Pudo demostrarse que el tratamiento con LCMV-WE tiene un efecto sinérgico con LCL-161. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 19.
La figura 19 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: supervivencia de los animales (%),
Abscisas: tiempo (días después de la administración de LCMV)
2.20 Se trataron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5 x 105 células B16F10-OVA (día - 9). Un grupo de animales no se trató adicionalmente (n = 3). Un grupo se trató por vía intratumoral con LCMV-P52 en el día 0 (2x104 UFP, n=6-8). Un grupo de animales se trató con el bloqueador de punto de control anti-PD-1 (200 |ig, intraperitoneal) en los días 1, 5 y 8. Un grupo se trató con bloqueador de punto de control anti-PD-1 y LCMV-P52. Se analizó el crecimiento tumoral.
De este modo, se demostró que el tratamiento con LCMV-P52 tiene un efecto sinérgico con bloqueadores de punto de control (por ejemplo, anti-PD-1). Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en la figura 20.
La figura 20 tiene la siguiente leyenda:
Ordenadas: volumen tumoral (mm3),
Abscisas: tiempo (días después del tratamiento con LCMV)
Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico mencionadas en la presente descripción corresponden a las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico divulgadas en el siguiente listado de secuencias.
2.21 Se sembraron 105 células H1975 en placas de 24 pocillos. Después de 24 horas, las células se infectaron con los virus LCMV-WE, LCMV-P52.1 (I181M, R185W), LCMV-P52-1.3 (R185W) y LCMV-P52-2.1 (I181M) con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1. El virus se analizó en el sobrenadante después de 24 horas. Los resultados se muestran en la figura 21 (media SEM, n = 6, *p < 0,05, prueba de t).
Los datos muestran que las mutaciones I181M y R185W aumentan la propagación viral en células tumorales por separado.
La figura 21 tiene la siguiente leyenda:
Eje X: diferentes virus
Eje Y: LCMV en el sobrenadante (log-10 UFP/ml)
2.22 Se sembraron 2,5x105 células HCC1954 en placas de 24 pocillos, seguido de infección de LCMV-WE, LCMV-P52.1 (I181M, R185W), LCMV-P52-1.3 (R185W) y LCMV-P52-2.1 (I181M) con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. El virus se analizó en el sobrenadante después de 48 horas. Los resultados se muestran en la figura 22 (las

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica, en el que el mutante es capaz de experimentar una propagación más fuerte en una célula tumoral en comparación con la cepa WE del virus de la coriomeningitis linfocítica de tipo natural, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende al menos una de las mutaciones Arg 185 ^ Trp e Ile 181 ^ Met en comparación con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.
2. El mutante según la reivindicación 1, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína que tiene al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99.2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,5%, preferiblemente al menos un 99,7% de identidad de secuencia con la secuencia de glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.
3. El mutante según la reivindicación 1 o 2, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína comprende las mutaciones Arg 185 ^ Trp e Ile 181 ^ Met en comparación con la glicoproteína de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 10.
4. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicha glicoproteína tiene al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 26, 34, 42, 50 y 58.
5. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, 25, 33, 41, 49 y 57.
6. El mutante según la reivindicación 1, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99.3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16.
7. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 %, preferiblemente al menos un 99,8 %, preferiblemente al menos un 99,9 % de identidad de secuencia con, o es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 24, 32, 40, 48, 56 y 64.
8. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las siguientes mutaciones: Lys 253 ^ Arg; Lys 1512 ^ Met; Lys 1513 ^ Glu; Ser 1758 ^ Phe; Phe 1995 ^ Ser; Ile 2094 ^ Val; Lys 2115 ^ Glu; Thr 2141 ^ Ala; Arg 2175 ^ Lys; Thr 2185 ^ Ala en comparación con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16.
9. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicha proteína L comprende uno de los siguientes conjuntos de mutaciones:
(a) Ser 1758 ^ Phe;
(b) Phe 1995 ^ Ser; opcionalmente Ile 2094 ^ Val; y opcionalmente Thr 2141 ^ Ala;
(c) Lys 1513 ^ Glu; Phe 1995 ^ Ser; y opcionalmente Arg 2175 ^ Lys;
(d) Lys 253 ^ Arg; Lys 1512 ^ Met; Lys 2115 ^ Glu; opcionalmente Thr 2141 ^ A la ; Thr 2185 ^ Ala
(e) Phe 1995 ^ Ser; o
(f) Lys 2115 ^ Glu,
en comparación con la secuencia de proteína L de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 16.
10. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L, en el que dicho ácido nucleico es complementario a una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99.4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7%, preferiblemente al menos un 99,8%, preferiblemente al menos un 99,9% de identidad de secuencia con, o que es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15, 23, 31, 39, 47, 55 y 63.
11. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína, en el que dicha nucleoproteína tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99.5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o que es preferiblemente idéntica a, una nucleoproteína expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 12, 20, 28, 36, 44, 52 y 60.
12. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína, en el que dicho ácido nucleico es complementario a una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o que es preferiblemente idéntica a, una nucleoproteína expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 19, 27, 35, 43, 51 y 59.
13. El mutante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína Z, en el que dicha proteína Z tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2 %, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o que es preferiblemente idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 14, 22, 30, 38, 46, 54 y 62, o en el que el mutante comprende un ácido nucleico que codifica una proteína Z, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 % preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,1 %, preferiblemente al menos un 99,2%, preferiblemente al menos un 99,3 %, preferiblemente al menos un 99,4 %, preferiblemente al menos un 99,5 %, preferiblemente al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,7 % de identidad de secuencia con, o que es idéntica a, una secuencia expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 13, 21,29, 37, 45, 53 y 61.
14. Un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en medicina, en particular para su uso en el tratamiento y/o la prevención de un tumor, preferiblemente un tumor seleccionado del grupo que consiste en carcinoma anal, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmón, carcinoma endometrial, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, tumor de la vejiga, carcinoma rectal, carcinoma laríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de ovario, carcinoma pancreático, carcinoma faríngeo, carcinoma orofaríngeo, carcinoma de próstata, carcinoma de tiroides, cáncer de cuello uterino, angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, liposarcoma, leiomiosarcoma, fibrosis maligna, histiocitoma, linfoma, leucemia, sarcoma neurogénico, osteosarcoma y rabdomiosarcoma.
15. Un medicamento o composición farmacéutica que comprende un mutante de virus de la coriomeningitis linfocítica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, opcionalmente caracterizado porque el medicamento comprende además un bloqueador de punto de control, tal como PD-1, y/o un modulador de apoptosis, en particular, un modulador de apoptosis, tal como un mimético de SMAC.
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