ES2692389T3 - Terapia antitumoral mejorada mediante virus oncolíticos dirigidos a células madre tumorales - Google Patents

Terapia antitumoral mejorada mediante virus oncolíticos dirigidos a células madre tumorales Download PDF

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ES2692389T3 ES12706618.1T ES12706618T ES2692389T3 ES 2692389 T3 ES2692389 T3 ES 2692389T3 ES 12706618 T ES12706618 T ES 12706618T ES 2692389 T3 ES2692389 T3 ES 2692389T3
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Abstract

Un virus oncolítico que comprende un dominio de unión recombinante específico de un marcador de célula madre tumoral, en donde el marcador de célula madre 5 tumoral es CD 133, en donde el virus tiene una especificidad disminuida por su(s) receptor(es) original(es) utilizado(s) para la entrada en la célula, en donde el dominio de unión recombinante comprende un fragmento variable monocatenario (scFv), y en donde el virus proviene de la familia Paramyxoviridae, del género Morbillivirus.

Description

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DESCRIPCION
Terapia antitumoral mejorada mediante virus oncollticos dirigidos a celulas madre tumorales Campo de la invencion
La invencion se refiere a virus oncollticos recombinantes que se dirigen a celulas madre tumorales y a los diversos usos de estos virus recombinantes.
Antecedentes de la invencion
Se piensa que los tumores comprenden una poblacion celular tumoral heterogenea que difiere en el grado de diferenciacion de las celulas. Se constituye una pequena fraccion de la poblacion de celulas tumorales de un tumor determinado denominada celulas madre tumorales. Se mostro que dichas celulas madre tumorales tenlan una capacidad mas pronunciada para propagarse y/o generar nuevos tumores que la mayorla de las otras celulas tumorales diferenciadas de un tumor determinado. Dichas celulas madre tumorales pueden identificarse por sus marcadores de superficie, por ejemplo, CD133.
La glucoprotelna CD133 se expresa principalmente en celulas indiferenciadas tales como celulas madre y celulas precursoras. La expresion de CD133 se ha mostrado en diversas celulas madre tales como celulas madre hematopoyeticas, celulas madre endoteliales y celulas madre neuronales y en diversos tumores.
La fraccion de celulas tumorales positivas a CD133 dentro de un tumor determinado es muy baja, sin embargo estas celulas son la fuente principal de nuevos tumores, resistentes a quimioterapia y representan un alto potencial regenerativo.
Por lo tanto, muchos tipos de cancer son aun no curables y existe una necesidad de nuevas terapias.
Publicaciones previas han propuesto al virus del sarampion como una terapia para el cancer. El documento WO 03/093431 desvela un virus del sarampion que esta modificado por ingenierla genetica para anular la entrada dependiente de SLAM y para dirigirse a celulas positivas a CD38. Asimismo, Peng et al. desvelan un virus del sarampion que muestra union reducida a sus receptores naturales y especificidad por CD38.
Sumario de la invencion
El alcance de la invencion se define en las reivindicaciones que se adjuntan. La presente invencion se basa en el sorprendente hallazgo de que los virus oncollticos recombinantes que comprenden un dominio de union especlfico para un marcador celular para una celula madre tumoral puede utilizarse para dirigirse/atacar especlficamente celulas madre tumorales comprendidas en un tumor, inhibiendo por tanto el crecimiento y/o la metastasis posterior del tumor. Incluso mas sorprendentemente, se ha descubierto que dichos virus oncollticos modificados recombinantes exhiben un potencial oncolltico significativamente aumentado en comparacion con sus homologos originales no modificados.
Por tanto, la presente invencion proporciona un tratamiento mejorado de diversos tipos de cancer, e incluso es posible el tratamiento de dichos tipos que aun no se han considerado curables.
La invencion se refiere a un virus oncolltico que comprende un dominio de union recombinante especlfico de CD133+ que es un marcador de celula madre tumoral.
La expresion virus oncolltico significa que comprende cualquier virus que infecte/entre y produzca la lisis de las celulas cancerosas. El virus oncolltico ideal elimina de un modo eficaz una fraccion cllnicamente relevante de las celulas de cancer de un paciente mediante citolisis directa con una destruccion minima de tejido no neoplasico. La entrada dirigida de celulas tumorales y la especificidad de replicacion son deseables. Asimismo, los virus deben ser inocuos y apatogenos cuando se aplican en pacientes. Los virus oncollticos procedentes de muchos tipos de virus diferentes han sido descritos por Liu et al. (Liu et al., Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007). Entre estos virus con envoltura, tales como el virus del herpes simple (HSV), el virus de la variolovacuna (VV) y los paramixovirus, tales como el virus del sarampion (MeV, measles virus), el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) o el virus de la estomatitis vesicular (VSV) similar a rabdovirus, son los mas destacados. Ademas de la aplicacion de virus de tipo silvestre no modificados, la modificacion por ingenierla genetica puede mejorar adicionalmente la seguridad y eficacia de los virus oncollticos. La modificacion por ingenierla genetica de las protelnas con envoltura puede restringir la infeccion por virus en las celulas tumorales y la insercion de genes suicida puede potenciar los efectos terapeuticos (Nakamura et al., Expert Opin. Bio. Ther. 4: (10): 1685-1692, 2004); Liu et al, Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007).
El virus oncolltico de la invencion es un virus con envoltura procedente de la familia Paramyxoviridae, del genero Morbillivirus, mas preferentemente, es un virus del sarampion (MeV) o una cepa vacunal del MeV, tal como la cepa Edmonston (MeVEdm). El MeV utiliza dos glucoprotelnas con envoltura (la protelna de fusion (F) y la protelna de hemaglutinina (H)) para aumentar la entrada en la celula diana. La protelna F es una protelna transmembrana de tipo I, mientras que la protelna H es un dominio transmembrana de tipo II, es decir, su extremo amino esta expuesto directamente a la region citoplasmatica. Por tanto, ambas protelnas comprenden una region transmembrana y una
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region citoplasmatica. Una funcion conocida de la protelna F es actuar como mediadora en la fusion de membranas vlricas con las membranas celulares de la celula hospedadora. Las funciones atribuidas a la protelna H incluyen el reconocimiento del receptor en la membrana diana y el soporte de la protelna F en su funcion de fusion de membrana. La fusion de la membrana directa y muy eficaz en la membrana de la superficie celular es una propiedad particular del virus del sarampion y de los virus del genero Morbillivirus, diferenciandose as! ellos mismos de muchos otros virus con envoltura que comienzan a endocitosizarse y solo se fusionaran despues de un descenso del pH tras la endocitosis. Ambas protelnas se organizan en la superficie vlrica en una matriz regular de puntas estrechamente compactadas, tetrameros H y trlmeros F (Russell et al., Virology 199: 160-168, 1994).
La cepa Edmonston del MeV (MeVEdm) utiliza una sola protelna como su receptor principal, concretamente, la protelna conocida por ser el regulador del factor de activacion del complemento, CD46 (Gerlier et al., Trends Microbiol. 3: 338-345, 1995). CD46 se expresa en todas las celulas humanas nucleadas. Sin embargo, la mayorla de los aislados cllnicos del virus del sarampion no pueden utilizar de un modo eficaz CD46 como receptor. La SLAM (del ingles signaling lymphocytes activation molecule, molecula de activacion de linfocitos de senalizacion; tambien conocida como CDw150) humana, es una glucoprotelna de membrana recientemente descubierta que se expresa en algunos linfocitos T y B, y tambien se descubrio que actuaba como un receptor celular de MeV, incluyendo la cepa Edmonston (Tatsuo et al., Nature 406 (6798): 893-7, 2000). Las funciones biologicas exactas y las interacciones de las protelnas H y F de MeV permanecen aun sin aclarar.
La expresion dominio de union recombinante significa que comprende cualquier dominio del virus que permite que el virus aumente la entrada en la celula diana y que no esta presente en el virus de origen natural. El dominio de union de la invencion comprende un fragmento variable monocatenario (scFv, single-chain Fv). El dominio de union comprende un scFv y es especlfico para el marcador CD133 de celulas madre tumorales.
La expresion especffico para un marcador de celula madre tumoral debe entenderse como la capacidad del dominio de union recombinante para interaccionar con el marcador de celulas madre tumorales. Preferentemente, esta interaccion es una union del dominio de union con dicho marcador. Mas preferentemente, esta union se realiza por interacciones entre protelnas. Incluso mas preferentemente, el dominio de union actua como un ligando, aunque el marcador de celulas madre tumorales actua como un receptor. El concepto de interacciones ligando y receptor es muy conocido por el experto en la tecnica. La expresion marcador celular como se utiliza en la presente invencion, se refiere a una molecula presente en la superficie de una celula. Dichas moleculas pueden ser, entre otras, peptidos o protelnas que pueden comprender cadenas de azucar o llpidos, antlgenos, grupos de diferenciacion (CD, cluster of differentiation), anticuerpos o receptores. Po tanto, dado que no todas las poblaciones de celulas expresan los mismos marcadores celulares, un marcador celular puede utilizarse para identificar, seleccionar o aislar una poblacion determinada de celulas que expresan un marcador celular especlfico. Como ejemplo, CD4 es un marcador celular expresado por linfocitos T auxiliares, linfocitos T reguladores y celulas dendrlticas. Por tanto, los linfocitos T auxiliares, los linfocitos T reguladores y las celulas dendrlticas pueden identificarse, seleccionarse o de otra manera aislarse, entre otros, mediante una clasificacion celular FACS, por medio del marcador celular CD4. Del mismo modo, CD133 se expresa en la superficie de las celulas madre tumorales. El marcador celular de la presente invencion es un marcador de celulas madre tumorales, es decir especlfico para celulas madre tumorales. El marcador de celulas madre tumorales es CD133.
El virus oncolltico de la invencion tiene una especificidad disminuida por su receptor o receptores originales utilizados para la entrada en la celula. En esta realizacion, el virus oncolltico de la presente invencion se modifica ademas preferentemente ya que el ligando o ligandos que se utilizan naturalmente por el virus para aumentar la entrada a su celula hospedadora tienen una especificidad disminuida por su receptor o receptores. Preferentemente, el ligando o los ligandos que se utilizan de manera natural por el virus para aumentar la entrada en su celula hospedadora estan modificados para no tener especificidad o sustancialmente ninguna especificidad por su receptor o receptores. Dicha modificacion se realiza preferentemente mediante una mutacion de los ligandos originales, mas preferentemente mediante al menos una mutacion puntual dentro del ligando o ligandos. El experto en la tecnica sera capaz de introducir facilmente mutaciones tales como, por ejemplo, adiciones y deleciones, en una secuencia de acidos nucleicos o de aminoacidos determinada. Dichas tecnologlas conocidas se desvelan, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989). En una realizacion especialmente preferida en la que el virus oncolltico es MeV, se introduce al menos al menos una mutacion puntual en la protelna H utilizada para la entrada en la celula.
La mutacion de la protelna H del MeV, generalmente elimina interacciones productivas de la protelna Hmut resultante con CD46 y SLAM, respectivamente. En una realizacion, esta mutacion se introduce por las mutaciones puntuales Y481A y R533A de la protelna H del MeV. En otra realizacion, la protelna Hmut tambien incluye las mutaciones S548L y/o F549S, que conducen a una eliminacion mas completa de la infectividad residual mediante CD46. Ademas, la mutacion de los restos V451 e Y529 elimina la interaccion productiva con CD46 y SLAM. Anteriormente se han descrito mutaciones alternativas para eliminar/impedir la interaccion de la protelna H con CD46. Todas estas mutaciones, que se introducen en las protelnas H para eliminar el uso de receptores naturales, se localizan en el ectodominio de la protelna H del MeV. Para impedir la interaccion de la protelna H con SLAM, uno o mas de los siguientes restos puede reemplazarse con otro aminoacido, en particular, alanina: 1194, D530, Y553, T531, P554, F552, D505, D507 (vease: Vongpunsawad et al. (2004) J Virol 78 (1) pags. 302-313); Masse et al. (2004) J Virol 78 (17) pags. 9051-9063).
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El dominio de union recombinante del virus oncolltico es especlfico para CD133 (glioma, adenocarcinoma pancreatico etc.). El marcador celular CD133 es una glucoprotelna de cinco dominios transmembrana (5-TM) que inicialmente se mostro que se expresaba en poblaciones celulares primitivas, incluyendo celulas progenitoras y madre hematopoyeticas CD34+ y otras celulas primitivas tales como las de la retina y retinoblastoma y desarrollo del epitelio. El antlgeno CD133 pertenece a una familia molecular recientemente caracterizada de protelnas 5-TM. Ningun ligando natural se ha demostrado aun para la molecula CD133 y su funcion exacta en el tejido hematopoyetico se desconoce.
El dominio de union recombinante comprende un scFv. Preferentemente, dicho scFv es especlfico para CD133. En la realization mas preferida el dominio de union comprende un scFv procedente de la llnea celular de hibridoma depositada en la ATCC como HB-12346. La generation de un scFv a partir de una llnea celular de hibridoma es una tecnica conocida por el experto en la materia y se ilustra en los ejemplos que se adjuntan (vease el Ejemplo 1).
En una realizacion adicional de la presente invention, el virus oncolltico comprende adicionalmente al menos un gen suicida. Un gen suicida es un concepto conocido por el experto en la materia. Generalmente, despues de su expresion, causara la muerte de una celula, preferentemente por apoptosis. En una realizacion adicional se utiliza un gen suicida para hacer que una celula tumoral sea mas sensible a quimioterapia. Dicha estrategia implica preferentemente un gen suicida que esta codificando un metabolito toxico y/o una enzima no encontrada en el hospedador de la celula tumoral que puede convertir una sustancia inocua (profarmaco) en un metabolito toxico. Un transgen suicida preferible codifica la SuperCD, una protelna de fusion compuesta por citosina desaminasa y uracil- ribosil-transferasa de levadura. Cuando se expresa a partir de un virus oncolltico en celulas tumorales, convertira el profarmaco no toxico 5-fluorocitosina, en el compuesto altamente toxico 5-fluorouracilo (Graepler et al., World J. Gastroenterol. 11: 6910-6919, 2005).
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al virus oncolltico de la invencion como un medicamento. Preferentemente, el virus oncolltico segun la invencion esta comprendido en una composition farmaceutica.
Las composiciones farmaceuticas basadas en los virus oncollticos de la presente invencion, pueden formularse de cualquier manera convencional utilizando uno o mas transportadores o excipientes fisiologicamente aceptables. Por tanto, los virus oncollticos de la presente invencion pueden formularse para su administration, por ejemplo, por inyeccion, inhalation o insulation (bien a traves de la boca o de la nariz) o por administracion oral, bucal, parenteral o rectal.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden formularse para diversos modos de administracion, incluyendo la administracion sistemica, topica o localizada. Pueden encontrarse tecnicas y formulaciones, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para la administracion sistemica, se prefiere la inyeccion, incluyendo la intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutanea. Para los fines de inyeccion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden formularse en soluciones llquidas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles, tales como solution de Hank o solucion de Ringer. Ademas, las composiciones farmaceuticas pueden formularse en forma solida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. Las formas liofilizadas de las composiciones farmaceuticas son tambien adecuadas.
Para la administracion por via oral, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden tener forma, por ejemplo, de comprimidos o capsulas, preparados por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de malz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sllice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato sodico de almidon); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sodico). Los comprimidos tambien pueden cubrirse por metodos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones llquidas para administracion oral pueden tener forma, por ejemplo, de soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto deshidratado para su constitution con agua u otro vehlculo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones llquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arabiga); vehlculos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleaginosos, alcohol etllico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes, segun sea apropiado.
Las composiciones farmaceuticas pueden formularse para administracion parenteral por inyeccion, por ejemplo, por inyeccion en embolada o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante opcionalmente anadido. Las composiciones farmaceuticas pueden formularse adicionalmente como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehlculos oleaginosos o acuosos y pueden contener otros agentes incluyendo agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes.
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Adicionalmente, las composiciones farmaceuticas tambien pueden formularse como una preparacion de tipo deposito. Estas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse por implantacion (por ejemplo, por via subcutanea o intramuscular) o por inyeccion intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Otros sistemas de suministro adecuados incluyen microesferas, que ofrecen la posibilidad de un suministro de farmacos local, no invasivo, durante un perlodo de tiempo prolongado. Esta tecnologla puede incluir microesferas que tienen un tamano precapilar, que pueden inyectarse mediante un cateter coronario en cualquier parte seleccionada de un organo, sin causar inflamacion o isquemia. El agente terapeutico administrado se libera despues lentamente de las microesferas y es absorbido por las celulas circundantes presentes en el tejido seleccionado.
La administracion sistemica tambien puede ser por medios transmucosos o transdermicos. Para la administracion transmucosa o transdermica, en la formulacion se utilizan penetrantes apropiados para filtrarse en la barrera. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion transmucosa, sales biliares y derivados de acido fusldico. Ademas, para facilitar la filtracion pueden utilizarse detergentes. La administracion transmucosa puede producirse utilizando pulverizadores nasales o supositorios. Para la administracion topica, las partlculas vectoriales de la invention pueden formularse en pomadas, balsamos, geles o cremas, como se sabe generalmente en la tecnica. Tambien puede utilizarse por via local una solution de lavado para tratar una lesion o inflamacion para acelerar la cicatrization.
En una realization adicional, la invencion se refiere al virus oncolltico de la invencion para el tratamiento o la prevention de cancer, incluyendo, pero sin limitation, neoplasias, tumores, metastasis o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, y particularmente, formas de los mismos resistentes a farmacos multiples. El cancer puede ser un tumor multifocal. Como ejemplos de tipos de canceres y trastornos proliferativos a tratar con los agentes terapeuticos de la invencion se incluyen, pero sin limitacion, leucemia (por ejemplo, mieloblastica, promielocltica, mielomonocltica, monocltica, eritroleucemia, leucemia mielocltica cronica (granulocltica) y leucemia linfocltica cronica), linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de celulas renales, hepatoma, tumor de Wilms, cancer de cuello uterino, cancer uterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcltico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, oligodendroglioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, displasia e hiperplasia. En una realizacion particular, el compuesto terapeutico de la invencion se administra a pacientes que tienen cancer de prostata (por ejemplo, prostatitis, hipertrofia prostatica benigna, hiperplasia prostatica benigna (BPH), paraganglioma prostatico, adenocarcinoma de prostata, neoplasia intraepitelial prostatica, fistulas prostatorrectales y lesiones estromales prostaticas atlpicas). En una realizacion especialmente preferida, los medicamentos de la presente invencion se utilizan para el tratamiento de cancer, glioma, carcinoma de hlgado y/o carcinoma de colon. El tratamiento y/o la prevencion del cancer incluye, pero sin limitacion, el alivio de los slntomas asociados a cancer, la inhibition del avance del cancer, la promotion de la regresion del cancer y la promotion de la respuesta inmunitaria.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse solas o en combination con otros tipos de estrategias para el tratamiento del cancer (por ejemplo, radioterapia, quimioterapia, hormonoterapia, inmunoterapia y agentes antitumorales). Como ejemplos de agentes antitumorales se incluyen, pero sin limitacion, cisplatino, ifosfamida, paclitaxel, taxanos, inhibidores de topoisomerasa I (por ejemplo, CPT-11, topotecan, 9-AC y GG-211), gemcitabina, vinorrelbina, oxaliplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, vinorrelbina, temodal y taxo.
En las reivindicaciones y en la description detallada de la invencion se describen realizaciones adicionales de la presente invencion.
Descripcion detallada de la invencion Breve descripcion de las figuras
Fig. 1: ofrece una vision global sobre la donation de MV-CD133, una celula madre tumoral especlfica y un virus oncolltico del sarampion recombinante segun la invencion.
Fig. 2: muestra los resultados de experimentos FACS e inmunotincion para verificar la selectividad de las celulas
madre tumorales de MV-CD133.
Fig. 3: muestra la selectividad de MV-CD133 por celulas CD133+ en cultivos de celulas CD133+ y CD133-
mezcladas.
Fig. 4: muestra los resultados de un analisis FACS de la expresion de CD133 y GFP y de un analisis de la
viabilidad de celulas infectadas con MV-CD133.
Fig. 5: muestra el potencial oncolltico de MV-CD133 en ratones inmunodeficientes (NOD/SCID).
Fig. 6: muestra la elimination eficaz de tumores multifocales mediante MV-CD133
Figs. 7/8: muestra la infection de esferas tumorales de Glioma mediante MV-CD133.
Fig. 9: muestra la eficacia in vivo de MV-CD133 en un modelo de glioma con esferas tumorales infectadas con
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MV-CD133.
Ejemplos
La protelna H de envoltura del virus del sarampion se modified para utilizar CD133 humano como un receptor para la entrada en la celula y para no unirse mas a SLAM ni a CD46. El virus reeombinante resultante es un virus oneolltieo que se dirige a celulas madre tumorales.
Ejemplo 1: Aislamiento y clonacion de scFv especffico de CD133 y produccion del virus del sarampion reeombinante
Para la generacion de MV-CD133, ARN preparado a partir del hibridoma HB-12346 productor del anticuerpo AC141.7 generado como se describe en Yin et al., Blood, 90: 5002-5012.1997 se retrotranscribio para amplificar las regiones codificantes de las cadenas pesada y ligera variables de IgG. Para la PCR con transcripcion inversa se utilizo una mezcla de cebadores degenerados (Heavy Primer Mix, n.° 27-1586-01; Light Primer Mix, n.° 27-1583-01; GE Healthcare). Los fragmentos resultantes de la PCR se subclonaron en el vector de clonacion pJET1.2/Blunt (Fermentas) y despues se amplificaron para insertar secuencias codificantes para los sitios de restriccion Sfil y Notl y el enlazador (G4S)3 utilizando las secuencias cebadoras de CD133-VH y CD133-VL indicadas en la Tabla 1. Los fragmentos resultantes de la PCR que codifican las cadenas pesada o ligera se digirieron con Taul y Sfil, o con Taul y Notl, respectivamente y se insertaron mediante ligamiento triple en una estructura pCG-Hmut digerida con Sfil y Notl dando como resultado pCG-Hmut-CD133scFv que ahora codifica la protelna Hmut citoplasmatica con truncamiento en la cola ligada al scFv especlfico de CD133 (Funke et al., Mol.Ther. 16: 1427-1436, 2008; Anliker et al., Nat.Methods 7: 929-935, 2010)
A continuacion, el fragmento de pCG-Hmut-CD133scFv, digerido con Pacl/Spel, se inserto en los sitios correspondientes de pMeGFPNV (MVeGFP), que codifica un clon infeccioso de longitud completa marcado con GFP del virus del sarampion de la estirpe Edmonston (Duprex et al., J. Virol. 73: 9568-9575, 1999) (Fig. 1A). Para el rescate de MV-CD133, se utilizo la etiqueta de hexahistidina (His6) y el sistema de redireccionamiento como se ha descrito anteriormente (Nakamura et al., Nat. Biotechnol. 23: 209-214, 2005) (Fig. 1A). Se generaron reservas de virus despues de infeccion de celulas Vero-anti-His (anti-His) a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 0,03, y los virus asociados a celulas se recogieron mediante ciclos de congelacion y descongelacion multiples.
Tabla 1: secuencias cebadoras de CD133-VHy CD133-VL
Cebador
Secuencia
CD133-VH directol
5'-GGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGG-3'
CD133-VH inversol
5'-GCCGCCACCTCCAGAGCCACCACCTCCCGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3'
CD133-VL directo1
5'-GCGGCAGT GGT GGTGGAGGATCCGACATT GTCCT GACCCAGT CTCCA-3'
CD133-VL inverso1
5'-TGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3'
Para analizar la capacidad de propagacion de MV-CD133 redirigido en las celulas tumorales a lo largo del tiempo, se realizo un ensayo de propagacion de virus en celulas HuH7. Las celulas HuH7 se infectaron con MV-Nse no dirigido o con los MV redirigidos a CD133 a una MOI de 0,005 y se cultivaron a 37 °C para la propagacion del virus. El numero de celulas positivas a GFP se determino a las 24, 48, 72, 96 y 120 h despues de la infeccion. MV-CD133 mostro la misma cinetica de propagacion que la de la cepa MV-Nse precursora (Fig. 1B), demostrando que el virus redirigido no tiene ninguna ventaja en su propagacion a traves de celulas HuH7 en comparacion con la cepa vacunal precursora.
Ejemplo 2: Verificacion de la selectividad de celulas madre tumorales
Las celulas HuH7, Vero o HT1080 se analizaron para determinar la expresion de CD133 mediante citometrla de flujo aplicando el anticuerpo anti CD133/1-PE humano (clon AC133, Miltenyi). Se utilizaron controles de isotipo apropiados segun las instrucciones del fabricante.
El 90 % de las celulas HuH7 fueron positivas a CD133 mientras que las celulas HT1080 y las celulas Vero fueron negativas a CD133 (Fig. 2A).
La expresion de CD133 de las celulas HuH7 se confirmo por tincion con inmunofluorescencia utilizando, como anticuerpo primario, un anticuerpo de raton anti CD133 humano, y utilizando, como anticuerpo secundario, un anticuerpo de burro anti IgG de raton Cy3 (Dianova) (Fig. 2B).
Las celulas HuH7, Vero y HT1080 (1x104 celulas/placa de 24 pocillos), se incubaron en medio Opti-MEM con MV- CD133 o MV-Nse a una MOI de 1 a 37 °C. Despues de 72 horas de infeccion, las celulas se observaron con microscopla fluorescente. Aunque MV-Nse infecto a todos los tipos de celulas, MV-CD133 infecto solo a las celulas HuH7 positivas a CD133. Las celulas Vero y HT1080, que era negativas a CD133, no se infectaron con MV-CD133
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(Fig. 2C). Por tanto, MV-CD133 es muy selectivo para las celulas madre tumorales positivas a CD133.
Ejemplo 3: Infeccion especffica de celulas CD133+ por MV-CD133 en cultivos de celulas CD133+ y CD133- mezcladas
La especificidad dirigida de MV-CD133 se determino adicionalmente en un experimento de cocultivo de celulas CD133+ (celulas HT1080 modificadas geneticamente que expresan CD133) y celulas CD133- (celulas HT1080 de tipo silvestre). Para distinguir entre ambos tipos de celulas, las celulas CD133- se modificaron geneticamente para expresar la protelna fluorescente roja (RFP, red fluorescent protein). Por tanto, si estas celulas (HT1080) comienzan a infectarse con un virus del sarampion que codifica la GFP se volveran amarillas mientras que las celulas CD133+ (HT1080-CD133) se volveran verdes. Ambos tipos de celulas se mezclaron en una proporcion de 1:1 y se infectaron con MV-CD133 o MV-Nse a una MOI de 0,5, respectivamente. Mientras que las celulas HT1080-CD133 solo se infectaron con MV-CD133 (Fig. 3A, panel de la derecha), los dos tipos de celulas se infectaron con MV-Nse, dando como resultado senales de color amarillo (Fig. 3A panel central). En la Figura 3A de las imagenes microscopicas, ambos canales de color se muestran superpuestos, en la Fig. 3B-C, los canales de GFP (C) y RFP (B) se muestran por separado, permitiendo la inspeccion de la Figura sin color. Las flechas senalan celulas CD133-. Las llneas discontinuas indican areas de sincitios causadas por infeccion con MV-CD133, que solo aparecen en el canal de GFP proporcionando de este modo la especificidad de MV-CD133 (Fig. 3C). En la Fig. 3D se muestran imagenes de campo brillante. Esto muestra que MV-CD133 es capaz de distinguir entre celulas CD133+ y CD133 incluso cuando estan en contacto cercano como en el tejido tumoral.
Ejemplo 4: Viabilidad de celulas infectadas con MV-CD133
Celulas HuH7 infectadas con MV-CD133 y MV-Nse se analizaron con respecto a la expresion de CD133 y GFP mediante analisis FACS. Para ello, las celulas HuH7 se infectaron con una MOI de 1 y dos dlas despues las celulas se digirieron con tripsina y se tineron con respecto a la expresion de CD133 con un anticuerpo humano anti CD133/1-PE y se analizaron las celulas positivas a GFP. Con MV-CD133 aproximadamente el 80 % de las celulas se hablan vuelto positivas a GFP, con MV-Nse aproximadamente el 60 % de las celulas. La infeccion con MV- CD133 dio como resultado una ligera regulacion negativa de la expresion de CD133 en la superficie celular (Fig. 4A).
Para determinar la viabilidad de las celulas infectadas, se utilizo el ensayo que emplea bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Kit de Proliferacion Celular I (MTT); Roche, Indianapolis, IN). Las celulas crecieron en placas de microtitulacion de 96 pocillos (1x104 celulas/pocillo) en el medio de cultivo recomendado.
Las infecciones fueron a una MOI de 0 (simulada), 0,01, 0,1 o 1. Noventa y seis (96) horas despues de la infeccion la viabilidad celular se midio a traves de la absorbancia de colorante, determinada por una medicion de densidad optica a 595 nm en un lector automatico de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. La viabilidad de las celulas se calculo como la media de los valores de densidad optica cuadruplicados, dividido entre la media de los valores de densidad optica cuadruplicados de celulas cultivadas del mismo modo sin virus (que sirvio como celulas de control) y se expreso como un porcentaje de celulas de control.
Comparadas con las celulas HuH7 tratadas de manera simulada, las celulas HuH7 infectadas con MV-CD133 mostraron una viabilidad celular solo del 10 % despues de infeccion a una MOI de 1. En el caso de las celulas HuH7 infectadas con MV-Nse, un 20 % de las celulas fueron viables. Tambien a MOI inferiores de 0,1 y 0,01, las celulas HuH7 se destruyeron con MV-CD133 de un modo mas eficaz que con MV-Nse (Fig. 4B).
Ejemplo 5: Potencial oncolftico de MV-CD133 en un modelo de ratones NOD/SCID.
Para determinar el potencial oncolltico de MV-CD133, por via subcutanea, se implantaron celulas HuH7 (5 x106 celulas en 100 pl) en el costado derecho de ratonas diabeticas no obesas/con inmunodeficiencia grave combinada (NOD/SCID) de 6 semanas de vida (Jackson Labs).
Despues de 10 a 14 dlas aproximadamente, cuando los tumores midieron 0,5-0,6 cm de diametro, las ratonas recibieron cuatro inyecciones intratumorales (una al dla) de TCID50 (dosis infectiva media de cultivo tisular) 1x106 en medio Opti-MEM 100 pl de MV-Nse o MV-CD133. Los animales de control (grupos con terapia simulada) recibieron inyecciones con los mismos volumenes de Opti-MEM sin virus. Despues, se realizo un seguimiento del crecimiento tumoral a lo largo del tiempo.
Las ratonas tratadas con MV-CD133 mostraron una reduccion sustancial en el crecimiento tumoral y un perlodo de supervivencia significativamente prolongado en comparacion con los animales tratados con MV-Nse o con ratonas de control (Fig. 5).
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Ejemplo 6: Eliminacion eficaz de tumores multifocales mediante MV-CD133
Para evaluar el potencial antitumoral de MV-CD133 en un modelo tumoral multifocal con nodulos que crecen en sitios dispersos, se inyectaron celulas HuH7 modificadas geneticamente para expresar luciferasa (celulas HuH7-luc) por via intraperitoneal en ratones lampinos atlmicos (n= 4-5) y el crecimiento tumoral se controlo los dlas 5, 19 y 47 mediante obtencion de imagenes in vivo de la actividad de luciferasa utilizando el sistema de obtencion de imagenes Spectrum IVIS. Siete dlas despues de la administracion de las celulas, los focos tumorales multiples eran visibles y los ratones se infectaron con MV-CD133 o MV-Nse por via intraperitoneal. Los grupos de control recibieron solo medio de cultivo celular. Cada animal recibio en total tres inyecciones de virus, en dlas alternos, y la formacion de tumor se monitorizo tres veces por semana durante un perlodo de varias semanas. La intensidad de senal se cuantifico como la media de todos los recuentos detectados dentro de la region de interes despues de restar el fondo. Los ratones de control mostraron proliferacion celular tumoral potenciada a lo largo del tiempo, mientras que se observo un crecimiento tumoral reducido en los animales tratados con MV-Nse precursor el dla 19 (Fig. 6A). El efecto antitumoral fue incluso mas pronunciado en los ratones tratados con MV-CD133. Se descubrio que durante un largo periodo de tiempo estos animales no tenlan tumores (Fig. 6A).
En la Fig. 6B se muestran los datos cuantitativos de las intensidades de bioluminiscencia de luciferasa de los tumores infectados con MV-CD133 (clrculos), MV-Nse (cuadrados) o controles (triangulos). Las barras de error representan una media de intervalos de confianza del 95 %. Las flechas representan los puntos temporales de la inyeccion del virus. Los animales tratados con MV-CD133 mostraron regresion de tumores despues de 3 semanas del primer tratamiento. Los tumores inyectados con MV-Nse demostraron una ligera reduccion tumoral en las primeras semanas despues del tratamiento, pero se produjo gradualmente recrecimiento tumoral a partir del dla 40 en delante durante todo el perlodo de tratamiento. A diferencia de esto, los animales tratados con control mostraron un crecimiento progresivo del tumor a lo largo del tiempo hasta que los ratones tuvieron que sacrificarse debido a una perdida de peso significativa. Por otra parte, los ratones tratados con MV-CD133 mostraron una supervivencia significativamente mas prolongada en comparacion con los animales de control o tratados con MV-Nse (Fig. 6C). Un raton del grupo tratado con MV-CD133 murio accidentalmente (se indica con #).
Resumiendo, MV-CD133 fue capaz de reducir sustancialmente la carga tumoral no solo en un modelo subcutaneo sino tambien en un modelo tumoral multifocal. Lo que es mas importante, su actividad oncolltica mejoro significativamente en comparacion con la del virus MV-Nse no dirigido que normalmente se aplica en ensayos cllnicos.
Ejemplo 7: Infeccion con MV-CD133 de esferas tumorales de glioma
El MV-CD133 se sometio a ensayo con respecto a la infeccion de esferas tumorales de glioma de dos pacientes diferentes (644 o 421K) (Fig. 7 y 8). Para ello, se incubaron esferas tumorales (1x104 celulas/placa de 24 pocillos) con virus (MV-CD133 o MV-Nse) a una MOI de 1 en medio Opti-MEM a 37 °C. En el intervalo de 48 a 72 horas despues de la infeccion, se tomaron fotos de las celulas con un microscopio de fluorescencia.
Ambas llneas de esferas tumorales fueron positivas a CD133 (Fig. 7A y 8A) y rapidamente se infectaron con MV- CD133 y MV-Nse.
En el caso de infeccion con MV-CD133, se produjo una fuerte formacion de sincicios. MV-Nse tambien pudo infectar esferas tumorales pero a un nivel mucho mas reducido (Fig. 7B y 8B). El analisis de celulas sobre la expresion de GFP mediante microscopla se correlaciono bien con los datos obtenidos mediante el analisis FACS.
Ambas llneas de esferas tumorales mostraron niveles de expresion de GFP altos despues de la infeccion con MV- CD133 y niveles de expresion de GFP bajos despues de la infeccion con MV-Nse (Fig. 7C y 8C).
Ejemplo 8: Actividad oncolltica de MV-CD133 en un modelo ortotopico en esferas tumorales de glioma primario
Para evaluar la actividad oncolltica de MV-CD133 en un entorno cercano a la situacion cllnica de pacientes con glioma, celulas tumorales primarias se desarrollaron como esferas tumorales. Despues de infeccion con MV-CD133 o MV-Nse (MOI de 0,5), las celulas tumorales se implantaron en el hemisferio derecho de ratones NOD/SCID (n = 5) 16 h despues de la infeccion. La supervivencia de los animales tratados se siguio a lo largo del tiempo. Los ratones que recibieron celulas tumorales tratadas con control murieron al cabo de 30 dlas despues de la implantacion, mientras que los animales que hablan obtenido celulas de glioma tratadas con MV-CD133 o MV-Nse, sobrevivieron durante un periodo de tiempo de 70 a 90 dlas (Fig. 9). Curiosamente, algunos de los ratones inyectados con celulas tumorales tratadas con MV-Nse, murieron considerablemente antes que los ratones inyectados con celulas tumorales tratadas con MV-CD133, pero en general esta diferencia en la supervivencia entre ambos grupos no fue significativa. Sin embargo, tambien en este modelo tumoral, MV-CD133 fue al menos tan eficaz como el virus del sarampion no dirigido.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Prasidenten des Paul-Ehrlich-Instituts, Prof. Dr. Klaus Cichutek BUCHHOLZ, Christian BACH, Patricia ABEL, Tobias
<120> Terapia tumoral mejorada mediante virus oncollticos dirigidos a celulas madre tumorales
<130> 141-007P
<150> EP11156842.4 <151 >
<160>4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211 > 42 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo
<400> 1
ggcccagccg gccatggccc aggtccagct gcaggagtct gg 42
<210>2 <211 > 49 <212> ADN
<213> Secuencia de ADN artificial <220>
<223> Cebador inverso <400>2
gccgccacct ccagagccac cacctcccga ggagacggtg accgtggtc 49
<210>3 <211 > 47 <212> ADN
<213> Secuencia de ADN artificial <220>
<223> Cebador directo <400>3
gcggcagtgg tggtggagga tccgacattg tcctgaccca gtctcca 47
<210> 4 <211 > 33 <212> ADN
<213> Secuencia de ADN artificial <220>
<223> Cebador inverso <400>4
tgcggccgcc cgttttattt ccagcttggt ccc 33

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un virus oncolltico que comprende un dominio de union recombinante especlfico de un marcador de celula madre tumoral,
    en donde el marcador de celula madre tumoral es CD 133,
    en donde el virus tiene una especificidad disminuida por su(s) receptor(es) original(es) utilizado(s) para la entrada en la celula,
    en donde el dominio de union recombinante comprende un fragmento variable monocatenario (scFv), y en donde el virus proviene de la familia Paramyxoviridae, del genero Morbillivirus.
  2. 2. El virus oncolltico segun la reivindicacion 1, en el que el scFv procede de la llnea celular de hibridoma ATCC HB- 12346.
  3. 3. El virus oncolltico segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un gen suicida.
  4. 4. El virus oncolltico segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el virus es un virus del sarampion (MeV).
  5. 5. El virus oncolltico segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como un medicamento.
  6. 6. El virus oncolltico segun el uso de la reivindicacion 5, para el tratamiento o la prevencion del cancer, en donde, opcionalmente, el cancer es un tumor multifocal.
  7. 7. El virus oncolltico segun el uso de reivindicacion 6, en donde el cancer es glioma, carcinoma de hlgado y/o carcinoma de colon.
  8. 8. El virus oncolltico segun el uso de las reivindicaciones 6 o 7, para su uso en combinacion con otros tipos de estrategias de tratamiento del cancer.
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