JP7110203B2 - 腫瘍溶解性ウイルスおよび治療用分子 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍溶解性ウイルスおよび治療用遺伝子の分野に関する。本発明は、１以上の治療用遺伝子を含んでなる腫瘍溶解性ウイルスを提供する。より正確には、本発明の治療用遺伝子は、ヌクレオシドプール調節因子である。より詳しくは、本発明のヌクレオシドプール調節因子は、シチジンデアミナーゼである、またはシチジンデアミナーゼ活性を有する。本明細書に定義される腫瘍溶解性ウイルスと１以上の治療用遺伝子の組合せは、腫瘍溶解性ウイルスに抗腫瘍効果の増加をもたらす。本発明は最後に、増殖性疾患の予防および／または処置のための腫瘍溶解性ウイルスを提供する。

腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍依存性の自己永続化という独特な特性を有する治療薬のクラスである(Hermiston et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):322-30)。これらのウイルスを使用することの利益は、これらのウイルスは複製するため、それらの宿主細胞を溶解するということである。腫瘍溶解性ウイルスは、非分裂細胞（例えば、正常細胞）に危害を加えることなく、分裂細胞（例えば、癌細胞）における選択的複製が可能である。感染した分裂細胞は溶解によって破壊されると、新たな感染粒子を放出し、周囲の分裂細胞を感染させる。従って、腫瘍溶解性ウイルスは、所望により、従来の癌治療法と組み合わせて、癌の処置のための新たな領域をもたらす(Fisher et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):301-13)。癌細胞は、不活性化された抗ウイルスインターフェロン経路を有する、または、ウイルス複製を妨げられずに進行させることを可能とする変異腫瘍抑制遺伝子を有するため、多くのウイルスにとって理想的な宿主である(Chernajovsky et al., 2006, BMJ, 332(7534):170-2)。アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、ニューカッスル病ウイルスおよびワクシニアウイルスを含むいくつかのウイルスが、現在、腫瘍溶解剤として臨床で試験されている。

一部のウイルスは、天然的に腫瘍溶解性であり、腫瘍細胞を選択的に感染および死滅できる生得的な能力を有する。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在するウイルスを改変することにより、設計することもできる。この目的のために、ウイルスを改変するために現在使用されている主な戦略には、他の多くの可能性の中でも、ウイルス遺伝子の機能欠失、これらのウイルス遺伝子の発現を制御するための腫瘍または組織特異的プロモーターの使用、癌細胞表面にウイルスを向け直すための指向性改変が含まれる。

天然的な腫瘍溶解性ウイルスのうち、ワクシニアウイルス（ポックスウイルス科）は、腫瘍溶解性ウイルス療法に使用するための理想的なウイルス骨格に必要な重要な特質の多くを有する。これらには、細胞間伝播が迅速な短いライフスタイル、強力な溶解力、大きなクローニング能力および明確な分子生物学が含まれる。さらに、ヒト細胞において複製が可能であるものの、それらは自然的な健康問題とはみなされておらず、痘瘡根絶キャンペーン中に数百万人に送達されている、特に十分に特徴付けられたものである。ワクチン株または遺伝子改変ワクシニア株のいずれかを用いた早期の臨床結果は、抗腫瘍効果を実証している(Thorne et al., 2005, Curr. Opin. Mol. Ther., 7(4):359-65)。

ｉｎ ｖｉｖｏの状況では達成が困難である、１００％の腫瘍細胞を感染させ、溶解するウイルスの能力を亢進するために、このウイルスのウイルス改変を実施することができる。従って、腫瘍溶解性ウイルスはしばしば、強力な傍観者効果を発揮し、それにより隣接する非感染腫瘍細胞の排除を可能とすることにより、ウイルス療法の腫瘍溶解性効果を高める酵素プロドラッグ系を「備えて」いる。例えば、ＦＣＹ１とＦＵＲ１の酵素活性を組み合わせる二機能性キメラタンパク質をコードする、いわゆるＦＣＵ１自殺遺伝子を備えた装備は、無毒の抗真菌薬である５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）の毒性のある代謝産物５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）および５－フルオロウリジン－５’一リン酸（５－ＦＵＭＰ）への直接変換を効率的に触媒することにより、特定のヒト腫瘍細胞の５－フルオロウラシルに対する自然抵抗性をバイパスした(Erbs et al., 2000, Cancer Res., 60(14):3813-22)。

ウイルス改変はまた、安全性を高めるために使用され得る。この点において、チミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損ウイルスは、野生型ウイルスと比較して低下した病原性を有することが示されたが、腫瘍細胞における複製は維持された(Buller et al., 1985, Nature, 317(6040):813-5)。Foloppeらは、ヒト結腸腫瘍のネズミモデルにおいて、ＦＣＵ１遺伝子を発現するＴＫ遺伝子欠損ＶＡＣＶが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において強力な抗腫瘍効果を有することを示した(Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15:1361－71)。

癌の処置に対する有効なアプローチを開発するという重要なニーズが明らかに存在する。弱毒腫瘍溶解性ウイルス株が、治療および診断用途で開発されており、臨床試験において評価中である。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスを弱毒化する方法により、それらの有効性の低下が生じている。治療的観点では、この有効性の低下は、全奏効の減少、患者の生存率の減少、死亡率の増加、病理抵抗性などをもたらし得る。その結果、より効果的であろう新たな安全な腫瘍溶解性ウイルスのニーズが存在している。

本発明において、本発明者らは、１以上の治療用遺伝子を含んでなる腫瘍溶解性ウイルスを試験している。より詳しくは、治療用遺伝子はヌクレオシドデアミナーゼである。さらにより詳しくは、治療用遺伝子はシチジンデアミナーゼである。

シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡｓｅ）－デオキシシチジンデアミナーゼまたはシチジンアミノヒドロラーゼとも呼ばれる－は、ピリミジンサルベージ経路に関与し、結果的にデゾキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の均衡に関与するヌクレオシドプール調節因子である。

ｄＮＴＰの適当な均衡は、ＤＮＡ複製の忠実度に不可欠である。実際に、ｄＮＴＰプールの均衡の調節は、ＤＮＡの完全性、ゲノム安定性に影響を及ぼし、遺伝毒性損傷をもたらし得ると思われる。核ゲノムの２本のＤＮＡ鎖は、このｄＮＴＰプールの不均衡に起因する突然変異の同様のリスクにあり、このリスクは、両方の主な複製エラー修正機構が遺伝的に無傷である場合ですら、完全には抑制されない。(Buckland et al., 2014 Dec, PLoS Genet., 10(12):e1004846)。ｄＮＴＰの減少または不均衡は、遺伝毒性および突然変異誘発の増加に至ることが知られているが、ｄＮＴＰの増加はしばしば、癌の発生に寄与し得る忠実度の減少を伴った制御されないＤＮＡ複製に至る(Kohnken et al., 2015, Mol. Cancer; 14:176)。

ｄＮＴＰの合成および代謝を標的とする治療薬は、いくつかの種類の癌の処置に使用することができる。いくつかの試験にもかかわらず、細胞内ｄＮＴＰレベルを調整し、それらのホメオスタシスを維持する分子機構は、完全には理解されていない。(Kohnken et al. 2015, Mol. Cancer; 14:176)

ＣＤＡｓｅの欠乏は、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）の過剰に至ることが報告されている。ＣＤＡｓｅ欠損細胞におけるＤＮＡ複製は、基礎となるポリ－ＡＤＰ－リボースポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ－１）活性の部分的阻害のために、不成功となる。実際に、ｄＣＴＰの細胞内蓄積はＰＡＲＰ－１活性を阻害し、チェックポイントキナーゼ１の活性化および下流のチェックポイントの効率を損ない、有糸分裂における非複製ＤＮＡのその後の蓄積を可能とする。この非複製ＤＮＡは、セントロメアおよび脆弱部位などの「複製困難」部位での姉妹染色分体間の超微細分裂後期ブリッジ(ultrafine anaphase bridge)（ＵＦＢ）の形成をもたらす。(Gemble et al., 2015, PLoS Genet, 11(7) e1005384)

ＣＤＡｓｅは、抗ウイルス効果を有することで知られる。複合型シチジンを脱アミノ化するＣＤＡｓｅであるＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、レトロウイルスおよびレトロトランスポゾンに対する活性を示す先天性の防御タンパク質である(Oliva et al., 2016, Immunol. Cell. Biol. 94:689-700)。ウイルス感染の阻害におけるＡＰＯＢＥＣ３タンパク質の役割は、最初にＨＩＶ－１に対して記述された。しかしながら、多くの試験では、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ－１、およびＥＢＶを含む、ヒト疾患に関連する他のウイルスに対するＡＰＯＢＥＣ３作用の証拠も示している。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、一連の編集依存的および非依存的な機序を通じて、これらのウイルスを阻害する。多くのウイルスがＡＰＯＢＥＣ作用に対抗する機序を進化させており、ＡＰＯＢＥＣ３活性を亢進させる戦略が、抗ウイルス薬の開発に向けた新たなアプローチを構成している。(Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013:ID 683095)。

ＡＰＯＢＥＣは、複数のＤＮＡ含有ウイルスに対するであることが報告されている(Moris et al., 2014, Front Microbiol, 5:534)。しかしながら、ＡＰＯＢＥＣ３ファミリーメンバーは、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスの複製に対する制限因子ではないこと、およびワクシニアウイルスはＡＰＯＢＥＣ３Ｇを分解できないことが示されている(Kremer et al., 2006, Virol. J., 3:86)。

ＡＰＯＢＥＣ遺伝子は、非小細胞肺癌において過剰発現することが報告されている。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、乳癌、肺癌、頭頸部癌などの種々の癌において突然変異のクラスターの起源であり得る。ｍＲＮＡ ＡＰＯＢＥＣの割合は、癌組織と正常肺組織において比較されており、ｍＲＮＡ ＡＰＯＢＥＣは、正常組織よりも癌組織において有意に上昇していたようである(Hidefumi et al., 2014, Biomed. Rep., 2(3):392-395)。

さらに、白金(platine)－ゲムシタビンで処置されたＮＳＣＬＣ患者の臨床的問題に対するＣＤＡｓｅの酵素活性の影響に関して、試験が実施された。ＨＰＬＣで検出されたＣＤＡｓｅの酵素活性は、白金－ゲムシタビン療法の活性および有効性の両方と相関していたことが報告された。より正確には、低ＣＤＡｓｅ活性を示した患者は、高ＣＤＡｓｅ活性を示した患者よりも、良好な奏効率、良好な臨床的利益(clinical benefice)、良好な無増悪期間および良好な全生存期間を示した。膵臓癌患者４０例を対象とした別の予備試験は、高ＣＤＡｓｅ活性とゲムシタビンに基づいた処置後の増悪との間の類似した相関を報告した。著者らは、ＣＤＡｓｅ酵素活性の使用を、白金－ゲムシタビンレジメンで処置された患者における活性および有効性のバイオマーカーとして示唆した(Tibaldi et al, 2012, Ann. Oncol., 23:670－677)。

シチジンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ活性を有するヌクレオシドプール調節因子を使用した場合、いくつかの問題が報告されている。一連の編集依存的および非依存的な機序を用いて、ＡＰＯＢＥＣ３はウイルスを阻害するが、ウイルス遺伝学の多様化および進化の源をも表す。多くのウイルスが、ＡＰＯＢＥＣ作用に対抗するための新たな機序を生み出した(Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013, Article ID 683095)。さらに、前述のように、ＣＤＡｓｅは一部の癌の処置を阻害し得る。ＷＯ２０１０１１８０１３およびＷＯ２０１０１１８０１０は、ＣＤＡｓｅ阻害剤と、デシタビン、ゲムシタビン、シタラビンおよび５－アザシチジンなどのシチジン系抗悪性腫瘍薬との組合せに関する。実際に、ＣＤＡｓｅはシチジン系薬を脱アミノ化し、結果としてそれらの効果を減少させる。これらの出願はまた、癌の処置のためのこれらの組合せの使用にも関する。Ａ２７８０ヒト卵巣癌異種移植モデルにおけるＣＤＡｓｅ阻害剤（ＥＲ－８７６４３７）およびゲムシタビンのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験は、ＥＲ－８７６４３７単独およびゲムシタビン単独は腫瘍増殖に効果を示さなかったが、ゲムシタビンの前にＥＲ－８７６４３７の３０分間投与により、評価したマウスの１０％および３０％においてそれぞれ完全退縮および部分腫瘍退縮がもたらされたことを示した。

本発明の文脈において、本発明者らは、予期に反して、シチジンデアミナーゼを発現するよう設計された腫瘍溶解性ウイルスが、改善された有効性を有することを発見した。シチジンデアミナーゼ発現腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与を含んでなる抗腫瘍ウイルス療法は、腫瘍進行の有意な減少をもたらす。さらに、シトシンデアミナーゼなどの他のヌクレオシドプール調節因子とは異なり、ＣＤＡｓｅ発現腫瘍溶解性ウイルスにより提供される抗腫瘍効果は、いずれのプロドラッグの追加も必要とせず、このことは、本発明の使いやすさおよび安全性にも寄与している。

これらの結果に基づくと、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、他の既存の腫瘍溶解性ウイルスの代替として成功裏に使用され得、かつ、良好な効率プロファイルを有し得ることが予想され得る。本発明の腫瘍溶解性ウイルスはまた、追加の１つ／複数の抗癌療法と組み合わせて利用することもできる。

本発明の一つの態様は、シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡｓｅ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる腫瘍溶解性ウイルスに関する。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、オルソポックスウイルスに属するポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスまたは牛痘ウイルスである。

別の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードするＪ２Ｒ遺伝子座を欠損している。

さらに別の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子座（代わりに、または欠損ＴＫ遺伝子座と組み合わせて）を欠損している。

さらなる実施態様では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、目的の核酸、特に、免疫刺激性ポリペプチド、抗原、透過酵素または他の目的のいずれかの分子など、ＣＤＡｓｅと異なる治療用分子をコードする遺伝子をさらに含んでなる。

別の態様において、本発明は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学上許容されるビヒクルを含んでなる組成物をさらに提供する。一つの実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは静脈内または腫瘍内投与のために製剤化される。

さらなる態様において、本発明はまた、前記腫瘍溶解性ウイルスをプロデューサー細胞に導入する工程、前記プロデューサー細胞を、前記腫瘍溶解性ウイルスの産生を可能にするのに適当な条件下で培養する工程、および産生されたウイルスを細胞培養物から回収する工程を少なくとも含んでなる、腫瘍溶解性ウイルスを製造する方法に関する。所望により、回収された腫瘍溶解性ウイルスを少なくとも部分的に精製することができる。

なおさらなる態様において、本発明は、疾患の予防および／または処置に使用するための、本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物を提供する。一つの実施態様では、前記疾患は、癌、腫瘍および再狭窄などの増殖性疾患である。前記癌は、好ましくは、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌および膠芽腫、ならびに特に転移性癌からなる群から選択される。別の実施態様では、前記疾患は、関節リウマチおよび骨粗鬆症などの破骨細胞活性増加に関連する疾患である。

なおさらなる態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物をそれを必要とする宿主生物体に投与することを含んでなる、疾患を処置する方法を提供する。前記処置方法は、手術、放射線療法、化学療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法またはサイトカイン療法からなる群から選択されるものなど、１以上の追加の療法と組み合わせて使用してもよい。

特定の実施態様では、シチジンデアミナーゼの存在下で治療効果を得るためにプロドラッグを必要としない限り、シチジンデアミナーゼは、自殺遺伝子としてではなく、治療用遺伝子として使用される。具体的には、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））が５’－ＤＦＣＲ（デオキシ－５－フルオロシチジン）に変換され、次にこれがシチジンデアミナーゼにより５’－ＤＦＵＲ（５’－デオキシ－５－フルオロウリジン）に変換され、これが最後に毒性のある５－ＦＵ（５－フルオロ－ウラシル）に変換される。この反応カスケードは、本発明の腫瘍溶解性ウイルスの細胞溶解活性を得るためには必要とされない。よって、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、カペシタビンと組み合わせて使用されず、本発明による処置方法は、カペシタビンなど薬剤の前駆体を投与するいずれの工程も含まない。通常、ＣＤＡｓｅ以外のヌクレオシドプール調節因子は、前記ヌクレオシドプール調節因子の作用により細胞傷害性薬剤において変換されるプロドラッグと組み合わせて使用される。このような酵素変換反応は一般に、抗腫瘍効果に寄与する。例えば、シトシンデアミナーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスに頼る処置方法は、感染細胞において細胞傷害性５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換され、それらの溶解に寄与する５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）と組み合わせて投与する場合、有効な抗腫瘍効果を提供する。

ヒトＣＤＡ（ｈＣＤ）に対する抗体によるウエスタンブロットでのＣＤＡ（シチジンデアミナーゼ）タンパク質の特異的検出。 ＭＩＡ ＰａＣａ－２およびＬｏＶｏ細胞を、ＶＶＴＫ－ＲＲ－およびＶＶ－ＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤに感染させた。ｈＣＤ（１６ｋＤａ）の存在が示されている（矢印）。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１の１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト結腸直腸ＬｏＶｏ腫瘍の増殖抑制。 略語：ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質；ＣＤＤ１：酵母シチジンデアミナーゼ。 １×１０^７ＰＦＵの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＬｏＶｏ皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇ {Kurtz, 1999 #109} {Kurtz, 1999 #109}：対照）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する（□：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰ）もしくは酵母ＣＤＡｓｅを発現する（黒四角：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１）ＴＫおよびＲＲ欠損ウイルスを用いて、１１日目に１回の静脈内投与（尾静脈に）で処置した。データは、１２匹の平均を表す。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１の１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト結腸直腸ＨＣＴ－１１６腫瘍の増殖抑制。 １×１０^５ＰＦＵの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＨＣＴ－１１６皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇：対照）またはＧＦＰを発現する（□：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰ）もしくは酵母ＣＤＡｓｅを発現する（黒四角：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１）ＴＫおよびＲＲ欠損ウイルスを用いて、１６日目に１回の静脈内投与（尾静脈に）で処置した。データは、１２匹の平均を表す。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１の１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト食道ＯＥ－１９腫瘍の増殖抑制。 １×１０^６ＰＦＵの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＯＥ－１９皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇：対照）またはＧＦＰを発現する（□：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰ）もしくは酵母ＣＤＡｓｅを発現する（黒四角：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１）ＴＫおよびＲＲ欠損ウイルスを用いて、１３日目に１回の静脈内投与（尾静脈に）で処置した。データは、１２匹の平均を表す。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤの１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト食道ＯＥ－１９腫瘍の増殖抑制。 ５×１０^５ＰＦＵの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＯＥ－１９皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇：対照）またはＧＦＰを発現する（□：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰ）もしくはヒトＣＤＡｓｅを発現する（黒四角：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤ）ＴＫおよびＲＲ欠損ウイルスを用いて、１４日目に１回の静脈内投与（尾静脈で）で処置した。データは、１２匹の平均を表す。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－またはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＦＣＵ１の１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト結腸直腸ＬｏＶｏ腫瘍の増殖抑制 １×１０^７ＰＦＵの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＬｏＶｏ皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇：対照）または非組換えＴＫおよびＲＲ欠損ウイルス（●：ＶＶＴＫ－ＲＲ－）もしくは酵母シトシンデアミナーゼおよびＵＰＲＴａｓｅを発現するＴＫおよびＲＲ欠損（Δ：ＶＶＴＫ－ＲＲ－ＦＣＵ１）を用いて、２７日目に１回の静脈内投与（尾静脈で）で処置した。データは、１２匹の平均を表す。 ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＡＰＯＢＥＣ２の１回の静脈内注射後に皮下移植したヒト結腸直腸ＨＣＴ－１１６腫瘍の増殖抑制。 １×１０^５ＰＦＵの複製ワクシニアウイルスで全身処置した（矢印で示す）後の平均腫瘍容積。ＨＣＴ－１１６皮下異種移植片を有するマウスを、ビヒクル単独（◇：対照）または示したウイルス（□：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰ；黒四角：ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＡＰＯＢＥＣ２）を用いて、１７日目に１回の静脈内投与（尾静脈で）で処置した。データは、９匹の平均を表す。

発明の具体的説明

定義
本出願全体で使用する場合、用語「１つ」は、前後関係から明らかでない限り、「少なくとも１つの」、「少なくとも第１の」、「１以上の」または「複数の」言及される成分または工程を意味するという意味で使用される。例えば、用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、その混合物を含む複数の腫瘍溶解性ウイルスを含む。

用語「１以上の」は、１または１より大きい数字（例えば、２、３、４など）のいずれかを意味する。

用語「および／または」は、本明細書で使用する場合は常に、「および」、「または」および「前記用語で連結される要素の総てまたはその要素の他のいずれかの組合せ」の意味を含む。

本明細書で使用される用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。

本明細書で使用する場合、製品および組成物の定義に使用される場合、用語「含んでなる(comprising)」（ならびに「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprises)」などの「含んでなる(comprising)」のいずれかの形態）、「有する(having)」（ならびに「有する(have)」および「有する(has)」などの「有する(having)」のいずれかの形態）、「含む(including)」（ならびに「含む(includes)」および「含む(include)」などの「含む(including)」のいずれかの形態）または「含有する(containing)」（ならびに「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などの「含有する(containing)」のいずれかの形態）は、非限定的であり、追加の列挙されていない要素または方法の工程を排除しない。表現「から実質的になる」は、いずれかの実質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味する。よって、列挙される成分から実質的になる組成物は、微量成分、汚染物質および薬学上許容される担体を排除しないであろう。「からなる」は、他の成分または工程の微量を超える要素を排除することを意味するものとする。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して結合した少なくとも９個以上のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖、分岐または環式であり得、かつ、天然に存在する類似体および／またはアミノ酸類似体を含んでなり得、かつ、非アミノ酸により割り込まれ得る。一般的な指標として、アミノ酸ポリマーが５０個を超えるアミノ酸残基である場合、好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれるが、５０アミノ酸長以下の場合は、「ペプチド」と呼ばれる。

本発明の文脈内において、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離されたＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびいずれかのその混合物）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ）または混合ポリリボ－ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのポリマーを定義するものである。それらは、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成、修飾または非修飾ポリヌクレオチドを包含する。さらに、ポリヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドを含んでなり得、かつ、非ヌクレオチド成分により割り込まれ得る。

本明細書で使用される用語「類似体」、「変異株」または「変異体」は、天然の対応物に関して１以上の改変を呈する分子（ポリペプチドまたは核酸）を意味する。１以上のヌクレオチド／アミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失を含むいずれの改変も想定され得る。いくつかの突然変異が企図される場合、それらは連続残基および／または非連続残基に関するものであり得る。好ましくは、天然の対応物の配列と少なくとも８０％、有利には、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、およびさらにより好ましくは、少なくとも９８％の同一性という配列同一性の程度を有する類似体である。例示的目的で、「少なくとも８０％の同一性」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を意味する。一般的には、用語「同一性」は、２個のポリペプチドまたは核酸配列間でのアミノ酸とアミノ酸、またはヌクレオチドとヌクレオチドの対応を意味する。２個の配列間の同一性のパーセンテージは、最適なグローバルアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される同一の位置の数の関数である。グローバルアラインメント後のアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを決定するために、種々のコンピュータープログラムおよび数学アルゴリズムが当技術分野で利用可能であり、例えば、Needleman et Wunsh, J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970のアルゴリズム、およびAtlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9)におけるＮＣＢＩまたはＡＬＩＧＮにて入手可能なブラストプログラムなどが挙げられる。ヌクレオチド配列間の同一性を決定するためのプログラムは、専門データベース（例えば、ジェンバンク、ウィスコンシン配列解析パッケージ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム、ならびに<<Ａｌｉｇｎ>>の名称でワールドワイドでebi.ac.ukから入手可能なニードルソフトウエア）において入手可能である。

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、組織、器官、または単離された細胞における特定の機構に関して何の制限もなく、広く理解されるべきである。このような細胞は、独特の種類の細胞または培養細胞株、初代細胞および分裂細胞などの異なる種類の細胞の群であり得る。本発明の文脈において、用語「宿主細胞」は、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、ならびに昆虫細胞、植物および哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞などのその他の真核細胞、ならびに本発明の腫瘍溶解性ウイルスを産生可能な細胞を含む。この用語はまた、本明細書に記載のウイルスのレシピエントになり得るまたはなっている細胞、ならびにこのような細胞の後代も含む。

用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ウイルスベクター」および「ビリオン」は、互換的に使用され、野生型ウイルスゲノムの少なくとも１つの要素を含んでなり、かつ、ウイルス粒子の中にまたはウイルス粒子に対して封入され得るビヒクルを意味するものとして広く理解されるべきである。ウイルス粒子は、核酸（すなわち、ウイルスゲノム）を含有してもしていなくてもよいが、ウイルスは、ウイルス粒子（またはビリオン）の中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノムを含んでなり、かつ、感染性である（すなわち、宿主細胞または被験体を感染できるおよびそれらに侵入できる）ことが好ましい。望ましくは、本発明のウイルスは、ＤＮＡゲノムと関連するものであり、最も好ましくは、二本鎖ＤＮＡゲノムである。本開示の文脈において、「ウイルス」は、野生型および改変ウイルスを含む。

用語「天然に存在する」または「野生型」または「天然」は、人によって人工的に産生されるものとは違って、自然の中で発見され得る生体分子または生物体を記載するのに使用される。例えば、自然の中での資源から単離され得るウイルスは、野生型である。本発明は、特定のコレクション（例えば、ＥＣＣＡＣ、ＡＴＣＣ、ＣＮＣＭなど）から得ることができる野生型ウイルスも包含する。研究室で人によって意図的に修飾されている生体分子または生物体は、天然に存在するものではない。天然に存在しないウイルスの代表的な例としては、とりわけ、ウイルスゲノムに目的の１以上の遺伝子を挿入することにより設計された組換えウイルス、および改変ウイルスがコードされた遺伝子産物を欠損するように、ウイルス遺伝子の完全または部分欠失により設計された変異ウイルス（例えば、ｔｋ－ウイルス）、ならびに異なるウイルス起源から得たゲノム断片を含有するキメラウイルスが挙げられる。

用語「から得た」、「由来する(originatingまたはoriginate)」は、成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子、ウイルスなど）の起源を特定するのに使用されるが、例えば、化学合成または組換え法によりなされ得る、成分の作製方法を限定することを意図するものではない。

本明細書で使用する場合、用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、分裂細胞（例えば、癌細胞などの増殖細胞）において、成長を遅くさせるおよび／または前記分裂細胞を溶解する目的で、選択的に複製できるが、非分裂細胞（例えば、初代細胞）においては複製を示さないか最小限の複製を示す、天然に存在する、設計された、または別に改変されたいずれかのウイルスを意味する。

用語「複製」および「増殖」は、互換的に使用され、ウイルスが複製および増殖できる能力を意味する。ウイルス複製は、ウイルス力価アッセイ、プラークアッセイ、吸光度、蛍光検出、質量分析などの当技術分野で標準のおよび本明細書に記載のアッセイを用いて、核酸レベルでまたは感染性ウイルス粒子レベルで定量化することができる。

本明細書で使用される用語「治療用遺伝子」は、被験体、特に、疾患もしくは病態に罹患している患者、またはこの疾患もしくは病態から保護すべき患者に対して適切に投与した場合に生物活性を提供できる産物（「治療用分子」とも呼ばれる）をコードする核酸配列を意味する。この生物活性は、抗腫瘍効果を増強するか、ウイルスの腫瘍溶解性の性質を強化することにより、処置される病状の経過または症状に対して有益な効果を生じることが期待される。

本明細書で使用される用語「処置」（および「処置する(treating、treat)」などの「処置」のいずれかの形態）は、所望により、従来の治療様式と関連した、予防（例えば、処置される病状を有するリスクにある被験体における予防措置）および／または治療（例えば、病状を有すると診断された被験体において）を包含する。処置の結果は、標的の病状の進行を減速、治癒、改善または制御することである。例えば、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを単独でまたは組み合わせて投与した後、被験体がその臨床状態の観察可能な改善を示した場合は、被験体は癌に対する処置が成功したことになる。

本明細書で使用される用語「投与する」（または「投与された」などの「投与」のいずれかの形態）は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスなどの治療薬を被験体に送達することを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「増殖性疾患」は、癌、腫瘍および一部の心血管疾患（血管壁の平滑筋細胞の増殖に起因する再狭窄など）を含む、制御されない細胞の増殖および伸展に起因するいずれかの疾患または状態を包含する。用語「癌」は、用語「腫瘍」、「悪性腫瘍」、「新生物」などのいずれかと互換的に使用され得る。これらの用語は、いずれの種類の組織、器官または細胞、いずれの病期の悪性腫瘍（例えば、前病変～病期ＩＶ）も含むことを意図する。

本明細書で使用する場合、用語「破骨細胞活性増加に関連する疾患」は、骨吸収または骨破壊に至るいずれかの疾患または状態（例えば、関節リウマチ、骨粗鬆症など）を包含する。

用語「被験体」は、一般に、本発明のいずれかの製品および方法が必要である、または有益であり得る生物体を意味する。一般に、生物体は、哺乳類、特に、飼育動物、農用動物、競技動物、および霊長類からなる群から選択される哺乳類である。好ましくは、被験体は、癌などの増殖性疾患を有するまたは有するリスクにあると診断されているヒトである。用語「被験体」および「患者」は、ヒト生物体に言及する場合、互換的に使用され得、男性および女性を包含する。処置される被験体は、新生児、乳児、若年成人、成人または高齢者であり得る。

用語「併用処置」、「併用療法」、「複合処置」または「コンビナトリアル処置」は、互換的に使用され得、少なくとも２種の異なる治療薬で被験体を処置することを意味する。一つの実施態様では、治療薬の１つは、前記腫瘍溶解性ウイルスである。２番目の治療薬は、いずれかの臨床的に確立された治療薬、特に、手術、放射線療法、化学療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法、サイトカイン療法、標的癌療法、遺伝子療法、光線力学療法、移植などからなる群から選択される１種であり得る。コンビナトリアル処置は、３番目のまたはさらなる治療薬を含み得る。併用処置に関しては、組合せの各成分の最適濃度は、当業者によって決定され得ることが認識される。特定の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、野生型腫瘍溶解性ウイルス、または改変誘導体腫瘍溶解性ウイルス）は、シチジンデアミナーゼと組み合わせて送達してもよく、ここで、前記シチジンデアミナーゼは腫瘍溶解性ウイルスによりコードされない。シチジンデアミナーゼは、ポリペプチド（例えば、組換えで作製されたシチジンデアミナーゼ、もしくはその類似体）または核酸分子（例えば、このような１つまたは複数のシチジンデアミナーゼを発現するように設計されたベクターにより運搬された）、ならびに１つまたは複数のポリペプチドと１つまたは複数の核酸分子の混合物（例えば、１つまたは複数のシチジンデアミナーゼと１つまたは複数の発現ベクター）の形態であり得る。

腫瘍溶解性ウイルス
本発明の「腫瘍溶解性ウイルス」は、非分裂細胞と比較して、分裂細胞において複製し、分裂細胞を死滅させる傾向が高いことにより、それが腫瘍溶解性であるならば、現時点で同定されるウイルスのいずれかのメンバーから得ることができる。これは、天然的に腫瘍溶解性である天然ウイルスであってもよく、または、ＤＮＡ複製、核酸代謝、宿主指向性、表面接着、ビルレンス、溶解および伝播に関与するものなど、分裂細胞における腫瘍選択性および／または優先的複製を高めるために、１以上のウイルス遺伝子を改変することにより設計されてもよい（例えば、Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781; Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106参照）。１以上のウイルス遺伝子を、イベントまたは組織特異的調節要素（例えば、プロモーター）の制御下におくことも想定され得る。

例示的腫瘍溶解性ウイルスとしては、限定されることなく、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス(Sinbis virus)、粘液腫ウイルス、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスなどが挙げられる。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、レオウイルスから得られる。代表的な例としては、レオライシン（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより開発中；ＮＣＴ０１１６６５４２）が挙げられる。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、セネカバレーウイルスから得られる。代表的な例としては、ＮＴＸ－０１０が挙げられる（Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95）。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られる。代表的な例は、文献に記載されている（例えば、Stojdl et al., 2000, Nat. Med. 6(7): 821-5; Stojdl et al., 2003, Cancer Cell 4(4): 263-75）。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ニューカッスル病ウイルスから得られる。代表的な例としては、限定されることなく、７３－Ｔ ＰＶ７０１およびＨＤＶ－ＨＵＪ株ならびに文献に記載のものが挙げられる（例えば、Phuangsab et al., 2001, Cancer Lett. 172(1):27-36; Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2):157-67; Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1):221-8）。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスから得られる。ヘルペスウイルス科は、共通の構造を総てが共有するＤＮＡウイルスの大きなファミリーであり、脂質二重膜に包まれた正二十面体キャプシド内に包まれた１００～２００の遺伝子をコードする、比較的大きな二本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムから構成される。腫瘍溶解性ヘルペスウイルスは、異なる種類のＨＳＶに由来し得るが、特に好ましくはＨＳＶ１およびＨＳＶ２である。ヘルペスウイルスは、腫瘍におけるウイルス複製を制限するため、または非分裂細胞におけるその細胞傷害性を減少させるために、遺伝子改変され得る。例えば、チミジンキナーゼ(Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6)、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）(Boviatsis et al., Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66)、またはウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ(Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72)など、核酸代謝に関与するいずれのウイルス遺伝子も不活性化され得る。別の態様は、ＩＣＰ３４．５遺伝子など、病原性因子をコードする遺伝子の機能を欠損しているウイルス変異株に関する（Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5）。腫瘍溶解性ヘルペスウイルスの代表的な例としては、ＮＶ１０２０（例えば、Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28）およびＴ－ＶＥＣ（Harrington et al., 2015, Expert Rev. Anticancer Ther. 15(12):1389-1403）が挙げられる。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルス科ファミリーから得ることができるモルビリウイルス、特に好ましくは麻疹ウイルスから得られる。腫瘍溶解性麻疹ウイルスの代表的な例としては、限定されることなく、ＭＶ－Ｅｄｍ（McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84）およびＨＭＷＭＡＡ（Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42）が挙げられる。

一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルスから得られる。腫瘍退縮アデノウイルスを設計するための方法は、当技術分野で利用可能である。有利な戦略には、ウイルスプロモーターと腫瘍選択的プロモーターとの置換、または、腫瘍細胞において変化するｐ５３もしくは網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質との結合機能を不活性化するようにＥ１アデノウイルス遺伝子産物を改変することが含まれる。自然の文脈では、アデノウイルスＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子は、別のアデノウイルス産物と協力して、ｐ５３を不活性化することにより（ｐ５３は、癌細胞においてしばしば調節不全になる）、アポトーシスを防止する。腫瘍退縮アデノウイルスの代表的な例としては、ＯＮＹＸ－０１５（例えば、Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85）およびオンコリンとも呼ばれるＨ１０１（Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70）が挙げられる。

好ましい一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスである。本明細書で使用する場合、用語「ポックスウイルス」または「ポックスウイルスベクター」は、ポックスウイルス科ファミリーに属するウイルス、特に好ましくは、コードポックスウイルス亜科サブファミリー、より好ましくは、オルソポックスウイルス属に属するポックスウイルスを意味する。種々のポックスウイルスのゲノム、例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、粘液腫ウイルスのゲノムの配列は、当技術分野およびジェンバンクなどの専門データベースで入手可能である（それぞれ受託番号ＮＣ＿００６９９８、ＮＣ＿００３６６３またはＡＦ４８２７５８．２、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００４１０５、ＮＣ＿００１１３２）。

有利には、腫瘍溶解性ポックスウイルスは、腫瘍溶解性牛痘ウイルスであり、例えば、ＣＰＸＶ＿ＧＥＲ１９８０＿ＥＰ４（ジェンバンクＨＱ４２０８９５）、ＣＰＸＶ＿ＧＥＲ２００２＿ＭＫＹ（ジェンバンクＨＱ４２０８９８）、ＣＰＸＶ＿ＧＥＲ１９９１＿３（ジェンバンクＤＱ４３７５９３）、ＣＰＸＶ＿ＦＲＡ２００１＿ＮＡＮＣＹ（ジェンバンクＨＱ４２０８９４）、ＣＰＸＶ＿ＧＥＲ１９９０＿２（ジェンバンクＨＱ４２０８９６）、ＣＰＸＶ＿ＵＫ２０００＿Ｋ２９８４（ジェンバンクＨＱ４２０９００）、ＣＰＸＶ＿ＢＲ（ジェンバンクＡＦ４８２７５８．２またはＮＣ００３６６３）およびＣＰＸＶ＿ＮＯＲ１９９４－ＭＡＮ（ジェンバンク ＨＱ４２０８９９）、ＣＰＸＶ＿ＧＥＲ１９９８＿２（ジェンバンクＨＱ４２０８９７）、ＣＰＸＶ＿ｇｒｉ（ジェンバンクＸ９４３５５）、ＣＰＸＶ＿ＦＩＮ２０００＿ＭＡＮ（ジェンバンクＨＱ４２０８９３）およびＣＰＸＶ＿ＡＵＳ１９９９＿８６７（ジェンバンクＨＱ４０７３７７）などの、いずれかの牛痘株に由来し得る。

望ましくは、腫瘍溶解性ポックスウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルスは、多数のウイルス酵素およびウイルスが宿主細胞機構から独立に複製することを可能にする因子をコードする２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とするポックスウイルスファミリーのメンバーである。ワクシニアウイルス粒子の大部分は、単一の脂質エンベロープを有する細胞内のものであり（細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ））、溶解するまで感染細胞のサイトゾル内にとどまる。他の感染型は、それを溶解することなく感染細胞から出芽する二重のエンベロープを有する粒子（細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ））である。

これはいずれかのワクシニアウイルス株に由来し得るが、エルストリー、ワイス、コペンハーゲンおよびウエスタンリザーブ株が特に好ましい。本明細書で使用される遺伝子命名法は、コペンハーゲンワクシニア株のものである。これは、特に断りのない限り、他のポックスウイルス科の相同遺伝子に対しても本明細書で使用される。しかしながら、遺伝子命名法はポックス株によって異なり得るが、コペンハーゲン株と他のワクシニア株との間の対応は、一般に文献において確認可能である。

好ましくは、本発明の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１以上のウイルス遺伝子を変化させることにより改変される。前記改変は、好ましくは、非改変遺伝子による通常の条件下で産生されたタンパク質の活性を確認できない欠損タンパク質の合成（または合成の欠如）をもたらす。改変は、ウイルス遺伝子またはその調節要素内での（近接した、またはしない）１以上のヌクレオチドの欠失、突然変異および／または置換を包含する。改変は、従来の組換え技術を用いて、当業者に既知の多数の方法で行うことができる。例示的改変は、文献において開示されており、ＤＮＡの代謝、宿主のビルレンス、ＩＦＮ経路（例えば、Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608参照）などに関与するウイルス遺伝子を変化させるものが特に好ましい。

より好ましくは、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼをコードする遺伝子（遺伝子座Ｊ２Ｒ）を変化させることにより改変される。ＴＫ酵素は、デオキシリボヌクレオチドの合成に関与する。正常細胞は一般に低濃度のヌクレオチドを有するため、ＴＫは正常細胞におけるウイルス複製に必要であるが、高濃度のヌクレオチドを含有する分裂細胞においてはＴＫは不要である。

あるいは、または組み合わせて、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）をコードする少なくとも１つの遺伝子または両方の遺伝子を変化させることにより改変される。自然の文脈では、この酵素は、ＤＮＡ生合成における重大な段階であるリボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒する。このウイルス酵素は、哺乳類酵素とサブユニット構造が類似しており、それぞれＩ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子座によりコードされたＲ１およびＲ２と呼ばれる２個の異種サブユニットから構成されている。Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子の配列ならびに種々のポックスウイルスのゲノムにおけるそれらの位置は、公開データベース、例えば、受託番号ＤＱ４３７５９４、ＤＱ４３７５９３、ＤＱ３７７８０４、ＡＨ０１５６３５、ＡＹ３１３８４７、ＡＹ３１３８４８、ＮＣ＿００３３９１、ＡＦ４８２７５８．２、ＮＣ＿００３３８９、ＮＣ＿００３３１０、ＡＹ２４３３１２、ＤＱ０１１１５７、ＤＱ０１１１５６、ＤＱ０１１１５５、ＤＱ０１１１５４、ＤＱ０１１１５３、Ｙ１６７８０、ＡＦ４３８１６５、Ｕ６０３１５、ＡＦ４１０１５３、ＡＦ３８０１３８、Ｌ２２５７９、ＮＣ＿００６９９８、ＤＱ１２１３９４およびＮＣ＿００８２９１を介して確認可能である。本発明の文脈において、Ｉ４Ｌ遺伝子（Ｒ１大サブユニットをコードする）もしくはＦ４Ｌ遺伝子（Ｒ２小サブユニットをコードする）のいずれか、または両方は、不活性化され得る。

あるいは、または組み合わせて、ウイルス腫瘍特異性をさらに増加させるために、他の戦略を探究してもよい。好適な改変の代表的な例としては、ウイルスゲノム由来のＶＧＦをコードする遺伝子の破壊が挙げられる。ＶＧＦ（ＶＶ増殖因子に対する）は、細胞感染後の早期に発現する分泌タンパク質であり、その機能は、正常細胞におけるウイルス伝播にとって重要であるように思われる。別の例は、所望によりＴＫ欠失と組み合わせた、血球凝集素をコードするＡ５６Ｒ遺伝子の破壊である（Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67:10038-46）。インターフェロン調節遺伝子の破壊も有利であり得る（例えば、Ｂ８ＲもしくはＢ１８Ｒ遺伝子）またはカスパーゼ－１阻害剤Ｂ１３Ｒ遺伝子。別の好適な改変は、ＤＮＡ複製の忠実度の維持およびチミジル酸シンターゼによるＴＭＰの産生のための前駆体の提供の両方に関与するウイルスｄＵＴＰａｓｅをコードするＦ２Ｌ遺伝子の破壊を含んでなる（Broyles et al., 1993, Virol. 195: 863-5）。ワクシニアウイルスＦ２Ｌ遺伝子の配列は、受託番号Ｍ２５３９２を介してジェンバンクにおいて確認可能であり、Ｆ２Ｌ遺伝子座を欠損したポックスウイルスは、ＷＯ２００９／０６５５４７から確認可能である。

好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスのＴＫ活性を欠損させるために、突然変異を不活性化することにより生じた、Ｊ２Ｒ遺伝子座を欠損したポックスウイルスである。別の好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、Ｊ２Ｒ遺伝子座と、ウイルスゲノムにより保有されるＲＲをコードするＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子座のうち少なくとも１つの両方における突然変異を不活性化することにより生じた、ＴＫおよびＲＲ活性の両方を欠損したポックスウイルスである（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４６およびFoloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71に記載のとおり）。

別の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、所望により、ＴＫおよびＲＲ活性のうち少なくとも１つまたはその両方の破壊と組み合わせた（Ｆ２Ｌ；Ｆ２ＬおよびＪ２Ｒ遺伝子；Ｆ２ＬおよびＩ４Ｌ；またはＦ２Ｌ、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌにおける突然変異を不活化させたウイルスに至る）、Ｆ２Ｌ遺伝子における突然変異を不活化することにより生じたｄＵＴＰａｓｅを欠損したポックスウイルスである（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４７に記載のとおり）。

ヌクレオシドプール調節因子およびシチジンデアミナーゼ
用語「ヌクレオシド」は、糖、通常はリボースまたはデオキシリボース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる種々の化合物のいずれかを意味する。より正確には、用語「リボヌクレオシド」は、リボースと連結したいずれかのプリンまたはピリミジン塩基を指す。同様に、用語「デオキシリボヌクレオシド」は、デオキシリボースと連結したいずれかのプリンまたはピリミジン塩基を意味する。その結果、表現「ヌクレオシド」は、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの両方を指す。ヌクレオシドの例は、シチジンおよびデオキシシチジンである。

用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドおよび１以上のリン酸塩からなる種々の化合物のいずれかを意味する。表現「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を指す。ヌクレオチドの例は、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸またはシチジン三リン酸である。

本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシドプール調節因子」または「ヌクレオシドプールの調節因子」は、ネガティブまたはポジティブな様式でヌクレオシドプールに直接的または間接的に作用するいずれかの成分を意味する。同様に、用語「ヌクレオチドプール調節因子」または「ヌクレオチドプールの調節因子」は、ネガティブまたはポジティブな様式でヌクレオチドプールに直接的または間接的に作用するいずれかの成分を意味する。用語「調節因子」は、調節因子全体、部分（例えば、末端切断型）およびその類似体を意味する。用語「調節因子」は、ヒト、動物、昆虫または微生物（例えば、ウイルス、細菌）などの宿主細胞において天然に存在する「細胞」調節因子を包含する。細胞ヌクレオシドプール調節因子の発現は、分裂細胞において増加し得る（De Pas et al., 2008, J. Clin. Oncol., 20;26:14644）。本発明の文脈において、このような「調節因子」は、ヌクレオ／チドのプールを増加させる調節因子、およびヌクレオ／チドのプールを減少させる調節因子を含む。このような調節因子は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのプールに対して直接的または間接的に作用し得る。本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、内因性（例えば、デノボ生合成、サルベージ経路）または外因性（例えば、食物または薬物の分解）であり得る。それらは、遊離型（例えば、細胞質において）または複合型（例えば、ＤＮＡにおいて）でもあり得る。一つの実施態様では、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、フッ素化される。

有利には、このようなヌクレオシドまたはヌクレオチドプール調節因子は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドデアミナーゼである。デアミナーゼは、分子からアミン基を除去する脱アミノ化反応を触媒する酵素である。ヌクレオシドデアミナーゼは、ヌクレオシドでの脱アミノ化反応を触媒する。好ましくは、本発明において使用するためのヌクレオシドプール調節因子は、シチジンデアミナーゼ活性を有する。より好ましくは、これは、天然に存在するシチジンデアミナーゼまたはその類似体である。本明細書で使用される用語「シチジンデアミナーゼ」または「ＣＤＡｓｅ」は、シチジンデアミナーゼおよびそのいずれかの類似体（このような類似体が実質的なシチジンデアミナーゼ酵素活性（野生型の対応物の少なくとも５０％）を保持するならば）を指す。用語「類似体」は、ＣＤＡｓｅ（例えば、末端切断型ＣＤＡｓｅ）および好ましくは触媒部位の外側に１以上のアミノ酸修飾を含んでなる変異ＣＤＡｓｅの断片を包含する。文献では、シチジンデアミナーゼは、「デオキシシチジンデアミナーゼ」および「シチジンアミノヒドロラーゼ」とも呼ばれる。

シチジンデアミナーゼは、対応するウラシル産物への基質の加水分解的脱アミノ化を触媒する多サブユニット酵素のファミリーに属する（Somasekaram et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (40):28405－12）。ＣＤＡｓｅは、ピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオチドサルベージにおいて主要な役割を果たす。より正確には、ＣＤＡｓｅは、例えば、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）、およびデオキシシチジン（ｄＣ）からデオキシウリジン（ｄＵ）など、シチジン系成分からウリジン系成分への脱アミノ化を触媒する（Demontis et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. 1443:323-33）。この脱アミノ化は、他のシチジン系成分に向けられることもある。例えば、ＣＤＡｓｅによるｄＣおよび５－メチル－２’－デオキシシチジン(5-methyl-2’-deoxicytidine)（５ｍｄＣ）の脱アミノ化は、チミン三リン酸の合成のための通常の前駆体であるｄＵおよびチミジン（Ｔ）を生じさせる。別の例は、５－ヒドロキシメチル－２’デオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）および５－ホルミル－２’デオキシシチジン(5-formy-2'deoxycytidine)（５ｆｄＣ）の、ウリジンの変異体、それぞれ５ｈｍｄＵおよび５ｆｄＵへの変換があるが、５ｈｍｄＵおよび５ｆｄＵは、ＤＮＡに組み込まれると、損傷塩基として認識されるため、細胞に対して毒性である（Zauri et al., 2015, Nature, 524:114-118）。さらなる例は、シタラビン、５－アザシチジンおよび２，２－ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）などの化学療法ヌクレオシド類似体の脱アミノ化があり、それらの細胞傷害性および抗腫瘍活性の喪失が生じる（Fitzgerald et al., 2006, Hum. Genet., 119(3):276-83）。

シチジンデアミナーゼの２つのファミリーは、シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡもしくはＣＤＤ；ＥＣ３．５．４．５）により行われるいずれかの遊離型シチジンの脱アミノ化、またはＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ（活性化誘導デアミナーゼ、およびアポリポタンパク質Ｂ－ｍＲＮＡ編集触媒ポリペプチド様）タンパク質により行われるＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー内に組み込まれたシチジンの脱アミノ化という、異なる生物学的機能を発揮する（Mameri et al., 2016, Clin. Cancer. Res. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-16-0626; Conticello et al., 2005, Mol. Biol. Evol. 22:367-77）。

哺乳類（例えば、ヒト）、昆虫、細菌または下等真核生物のシチジンデアミナーゼを含む、種々のシチジンデアミナーゼを本発明の文脈において使用することができる。一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヒト起源のＣＤＡｓｅをコードする、またはそれと組み合わせて使用される。ヒトシチジンデアミナーゼの代表的な例としては、限定されることなく、ヒトＣＤＡ（ｈＣＤとも呼ばれる）（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１７８５；ＮＰ＿００１７７６）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤまたはＡＩＣＤＡ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０２０６６１；ＥＡＷ８８６１５．１；ＢＡＢ１２７２１）、ＡＰＯＢＥＣタンパク質ファミリーのメンバー（ＡＰＯＢＥＣ１（ジェンバンク受託番号ＮＭ００１６４４；ＢＡＡ２３８８２）、ＡＰＯＢＥＣ２（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００６７８９；ＡＦ１６１６９８＿１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ジェンバンク受託番号ＫＭ＿２６６６４６；ＡＫＥ３３２８５）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００４９００；ＡＡＨ５３８５９）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０１４５０８）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿１５２４２６）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿１５２４２６）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿１４５２９８）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０２１８２２；ＡＡＨ６１９１４．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１１６６００３）、ＡＰＯＢＥＣ４（ジェンバンク受託番号ＮＭ－２０３４５４．２））およびシチジンデアミナーゼ様タンパク質が挙げられる。

シチジンデアミナーゼは、真菌、酵母、ウイルスまたは細菌などの微生物にも由来し得る。非ヒトシチジンデアミナーゼの例は、酵母（例えば、ＣＤＤ１：ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１１８２１３２；ＥＤＮ５９４６１）、カンジダ・グラブラータ（ジェンバンク受託番号ＫＴＢ２４５３２）、シロイヌナズナ（ジェンバンク受託番号ＡＪ００５６８７）、大腸菌（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿４１６６４８）などに由来する。

一つの実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤＡ、ＣＤＤ、ＥＣ３．５．４．５、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤおよびシチジンデアミナーゼ様タンパク質からなる群から選択されるＣＤＡｓｅポリペプチドをコードする。

好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、酵母シチジンデアミナーゼ（ＣＤＤ１）をコードし、ここで、前記ＣＤＤ１は、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

別の好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトシチジンデアミナーゼ（ｈＣＤ）をコードし、ここで、前記ｈＣＤは、配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

さらに別の好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトＡＰＯＢＥＣ２をコードし、ここで、前記ＡＰＯＢＥＣ２は、配列番号３と少なくとも８０％、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明は、好ましくは、核酸分子をコードする１以上のシチジンデアミナーゼを含んでなる腫瘍溶解性ウイルスに関する。例えば、酵母シチジンデアミナーゼ（ＣＤＤ１）およびヒトシチジンデアミナーゼ（ｈＣＤ）をコードする核酸分子は、以下に記載する適当な調節要素の制御下で、ウイルスゲノムに（例えば、異なる位置で）挿入することができる。ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子は、ウイルスゲノムのいずれかの位置に、特に好ましくは非必須遺伝子座に挿入することができる。例えば、ＴＫ遺伝子、ＲＲ遺伝子または遺伝子間領域が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスへの挿入にとって特に適当である。好ましい実施態様では、本発明は、実施例の項で示されるＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＡＰＯＢＥＣ２などの、ウイルスＴＫおよびＲＲにコードされる活性を欠損し、ヒトまたは酵母ＣＤＡｓｅをコードする弱毒ワクシニアウイルスに関する。

「シチジンデアミナーゼをコードする核酸分子」は、本明細書で提供される情報および当業者の一般知識に基づいて、クローニング、ＰＣＲまたは化学合成により容易に得ることができる。本明細書で使用するためのＣＤＡｓｅをコードする核酸分子は、天然のＣＤＡｓｅをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）、または１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により後者に由来するその類似体であり得る。さらに、ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子は、以下に記載するように、特定の宿主細胞または被験体において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。

目的の核酸
特定の実施態様によれば、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに挿入された、ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子とは異なる目的の１以上の核酸をさらに含んでなってもよい。本発明によれば、目的の核酸は、それが導入される宿主生物体と同種または異種であり得る。より具体的には、それは、ヒト起源であってもなくてもよい（例えば、細菌、酵母またはウイルス起源）。有利には、前記目的の核酸は、ポリペプチドの総てまたは一部をコードする。ポリペプチドは、大きさにかかわらず、およびグリコシル化されているか否かを問わず、ポリヌクレオチドのいずれかの翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を含む。

本発明の文脈においては、膨大な数の目的の核酸を想定することができ、例えば、とりわけ、被験体において欠損もしくは欠乏タンパク質を補償できるポリペプチドなど、処置される病状の経過もしくは症状に対して有益な効果を引き起こすことが期待されるポリペプチドをコードするもの、または毒性作用を通じて身体から有害な細胞を制限もしくは除去するように作用するもの、または免疫性を与えるポリペプチドをコードするもの（例えば、体液性および／もしくは細胞性免疫応答を誘導もしくは活性化するための免疫刺激性ポリペプチドおよび／もしくは抗原）、または細胞ヌクレオ／チドプールを増加させる透過酵素が挙げられる。このような目的の核酸は、天然に存在する配列から得てもよいし、１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により修飾してもよい。

本発明の文脈において、目的の核酸は、原核生物（細菌界、古細菌界を含んでなる）、無核細胞（ウイルスを含んでなる）または真核生物（原生生物界、真菌界、植物界、動物界を含んでなる）に由来し得る。

好適な目的の核酸の例を、以下の一覧に示す。本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、一酸化窒素シンターゼＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ヒアルロニダーゼ、．．．）、酵素阻害剤（α１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤ＰＡＩ－１）、タンパク質、クラスＩまたはＩＩのＭＨＣ抗原、細胞遺伝子の発現を調節／制御できるポリペプチド、細菌、寄生虫もしくはウイルス感染またはその発生を阻害できるポリペプチド（抗原ポリペプチド、抗原エピトープ、競合により天然タンパク質の作用を阻害するトランスドミナント変異体．．．．）、アポトーシス誘導物質または阻害剤、（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ ｅｔ Ｂｉｍ、Ｂａｘ阻害剤、Ｂａｋ阻害剤、Ｂｏｋ阻害剤、Ｂａｄ阻害剤、Ｂｉｄ阻害剤、Ｂｉｍ阻害剤、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－ｗ、Ｎｒ１３、Ｂｃｌ２阻害剤、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ－ｗ阻害剤、Ｎｒ１３阻害剤）、細胞増殖抑制剤（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ．．．）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ．．．）、血管新生阻害剤（アンギオスタチン、エンドスタチン．．．）、抗ＶＥＧＦ抗体またはｓｃＦｖ、酸素ラジカルスカベンジャー（oxygen radical scaveyer）、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、マーカー（β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ．．．．）または臨床状態の処置もしくは予防に有用であると当技術分野で認識される他のいずれかの目的の核酸からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸をさらに保有してもよい。好適な抗腫瘍核酸は、限定されるものではないが、腫瘍抑制遺伝子（例えば、Ｒｂ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＮＦ－１、ウィルムス腫瘍、ＮＭ２３、ＢＲＵＳＨ－１、ｐ５６、ｐ７３およびそれらの各変異株）、抗体、細胞分裂または形質導入シグナルを阻害するポリペプチドをコードするものを含む。

免疫刺激性ポリペプチド
本発明の別の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激性ポリペプチドをさらに含んでなってもよい。本明細書で使用する場合、用語「免疫刺激性ポリペプチド」は、特異的または非特異的な様式で免疫系を刺激できる能力を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。膨大な数のタンパク質が、免疫刺激性効果を発揮できる能力について当技術分野で公知である。本発明の文脈における好適な免疫刺激性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤＬ－２、抗ＣＴＬＡ４、抗Ｔｉｍ３、抗ＬＡＧ３、抗ＢＴＬＡを含む免疫チェックポイント阻害剤；α、βまたはγインターフェロン、インターロイキン（特に、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０もしくはＩＬ－１２）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；例えば、上皮細胞増殖因子受容体の阻害剤（特に、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブもしくはラパチニブ）またはヒト上皮細胞増殖因子受容体－２の阻害剤（特に、トラスツズマブ）などの、細胞表面受容体の調節に作用する薬剤；例えば、血管内皮増殖因子の阻害剤（特に、ベバシズマブもしくはラニビズマブ）などの血管新生に作用する薬剤；幹細胞を刺激し、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｃ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ．．．））などのマクロファージ、およびＢ７タンパク質（Ｂ７．１、Ｂ７．２など）を産生する薬剤が、限定されることなく挙げられる。

抗原
用語「抗原」は一般に、免疫応答を惹起するために、抗体またはＴ細胞抗原受容体により認識され、選択的に結合される物質を意味する。用語「抗原」は、天然抗原ならびに断片（例えば、エピトープ、免疫原性ドメインなど）およびその誘導体を包含することが企図される（このような断片または誘導体が、免疫応答の標的となることができるならば）。本発明の文脈における好適な抗原は、好ましくは、１以上のＢ細胞エピトープまたは１以上のＴ細胞エピトープまたは両方のＢおよびＴ細胞エピトープを含み、かつ、免疫応答、好ましくは、その抗原に対して特異的であり得る体液性応答または細胞応答を生じさせることができるポリペプチド（例えば、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチドなど）である。一般に、１以上の抗原は、処置する疾患に関連して選択される。本明細書で使用するための好ましい抗原は、癌抗原および腫瘍誘発病原体の抗原である。

特定の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスに含有されるまたはコードされる抗原は、癌に対するマーカーと関連するおよび／またはそれの役割を果たす癌抗原（腫瘍関連抗原とも呼ばれる）である。癌抗原は、種々のカテゴリーのポリペプチド、例えば、正常細胞において通常はサイレントである（すなわち、発現しない）もの、低レベルでまたは特定の分化段階でのみ発現するもの、ならびに胚抗原および胎児性抗原などの時間的に発現するもの、ならびに癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、癌原遺伝子（例えば、ＥｒｂＢファミリー）、または染色体転座に起因するタンパク質など、細胞遺伝子の突然変異に起因するものを包含する。癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス（例えば、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶなど）ならびに細菌（例えば、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pilori)）など、被験体（特に、慢性的に感染した被験体）における悪性病態を誘発できる病原生物（細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、ウイロイドまたはプリオン）によりコードされる抗原も包含する。

癌抗原の一部の限定されない例としては、限定されることなく、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ－１およびＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、およびＰＳＡ－３、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６など；例えば、ＵＳ６，０５４，４３８；ＷＯ９８／０４７２７；またはＷＯ９８／３７０９５参照）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、αフェトプロテイン、Ｅカドヘリン、αカテニン、βカテニンおよびγカテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、癌抗原のＳｍａｄファミリー、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１およびＣＴ－７、ならびにｃ－ｅｒｂＢ－２、ならびにＨＰＶ－１６およびＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７抗原などのウイルス抗原、ならびにＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）－１が挙げられる。

本発明における使用に好適な他の抗原は、マーカー抗原（β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質など）である。

本発明はまた、本明細書に記載の２以上の目的のポリペプチド、例えば、少なくとも２つの抗原、少なくとも１つの抗原と１つのサイトカイン、少なくとも２つの抗原と１つのサイトカインなどを発現する腫瘍溶解性ウイルスも包含する。

透過酵素
別の実施態様によれば、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、透過酵素である少なくとも１つの目的の核酸をさらに含んでなってもよい。

本明細書で使用する場合、用語「透過酵素」は、ヌクレオシドおよび核酸塩基のトランスロケーションに関与する膜貫通タンパク質を意味する。ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体および核酸塩基のトランスロケーションに関与する透過酵素の例は、ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２、ｈＣＮＴ３、ｈＥＮＴ１およびｈＥＮＴ２である。ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２およびｈＣＮＴ３タンパク質は、Ｎａ＋共役様式でヌクレオシドを移動させるが、高親和性および多少の基質選択性をもって行われ、ｈＣＮＴ１およびｈＣＮＴ２はそれぞれピリミジン－およびプリン－が好ましく、ｈＣＮＴ３は広い選択性トランスポーターである。ｈＥＮＴ１およびｈＥＮＴ２は、ヌクレオシドおよび核酸塩基のトランスロケーションと明確に関連付けられている（Pastor-Anglada et al, 2015, Front. Pharmacol., 6(13):1-14）。

その他の目的の核酸:
一つの実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、限定されるものではないが、
－ 制限酵素（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型の制限酵素、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの人工制限酵素）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
－ 限定されるものではないが、標的特異的ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ
を含む少なくとも１つの目的の核酸をさらに含んでなってもよい。

目的の核酸の配列は、従来の技術を用いて、クローニング、ＰＣＲまたは化学合成により容易に得ることができる。さらに、それらの配列は、当業者が調べることができる文献において広範に記載されている。ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子に関しては、目的の核酸は、ウイルスゲノムのいずれかの位置に、特に好ましくは非必須遺伝子座に挿入することができる。例えば、ＴＫ遺伝子、ＲＲ遺伝子または遺伝子間領域が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスへの挿入にとって特に適当である。

ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子および目的の核酸の発現
前述のように、本発明の腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに挿入されるＣＤＡｓｅをコードする核酸分子および／または目的の核酸は、特定の宿主細胞または被験体において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。生物体のコドン使用頻度パターンは非常に非ランダムであり、コドンの使用は異なる宿主間で著明に異なり得ることが、実際に観察されている。このような核酸は、細菌または下等真核生物に由来し得るため、それらは、より高等の真核細胞（例えば、ヒト）における効率的な発現にとって不適当なコドン使用頻度パターンを有し得る。一般に、コドンの最適化は、目的の宿主生物体において使用頻度の低いコドンに対応する１以上の「天然」（例えば、細菌または酵母）コドンを、より使用頻度の高い同じアミノ酸をコードする１以上のコドンと置換することによって行われる。発現の亢進は部分置換でも達成することができるため、使用頻度の低いコドンに対応する総ての天然コドンを置換する必要はない。

コドン使用頻度の最適化に加えて、宿主細胞または被験体における発現は、核酸配列のさらなる改変を通じてさらに改善することができる。例えば、濃縮領域に存在している希な非最適なコドンのクラスター化を防止すること、および／または、発現レベルに負の影響を及ぼすことが予想される「ネガティブ」配列要素を抑制または改変することは、有利であり得る。このようなネガティブ配列要素は、限定されることなく、非常に高い（８０％超）または非常に低い（３０％未満）ＧＣ含量を有する領域；ＡＴリッチもしくはＧＣリッチ配列ストレッチ；不安定な直列もしくは逆方向反復配列；ならびに／または、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、および／もしくはスプライシングドナー／アクセプター部位などの内部潜在調節要素を含む。

本発明においては、腫瘍溶解性ウイルスは、目的の核酸の発現に必要な要素を含んでなる。より正確には、本発明の腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに挿入されるＣＤＡｓｅをコードする核酸分子および／または目的の核酸は、宿主細胞または被験体におけるその／それらの発現にとって好適な調節要素と動作可能に連結される。本明細書で使用する場合、用語「調節要素」または「調節配列」は、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含む、所与の宿主細胞または被験体における発現を許可、発現に寄与または発現を調節するいずれかの要素を意味する。本明細書で使用する場合、「動作可能に連結される」は、連結されている要素が、それらの意図する目的のために機能できるよう配置されることを意味する。例えば、プロモーターが許容宿主細胞における転写開始から核酸分子のターミネーターまでの転写に作用する場合は、前記プロモーターは前記核酸分子に動作可能に連結されている。

当業者ならば、調節配列の選択は、核酸分子自体、それが挿入されるウイルス、宿主細胞または被験体、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを認識するであろう。プロモーターは、特別重要である。本発明の文脈において、それは、多くの種類の宿主細胞における、もしくは特定の宿主細胞（例えば、肝臓特異的調節配列）に特異的な、コードされる産物（例えば、ＣＤＡｓｅおよび／もしくは治療用分子）の構成的誘導発現（constitutive directing expression)であり得、あるいは、特定のイベントもしくは外因性因子（例えば、温度、栄養添加剤、ホルモンなどによる）に反応して、またはウイルス周期の相（例えば、後期もしくは早期）に従って、制御され得る。ウイルス産生を最適化するため、かつ、発現したポリペプチドの潜在毒性を回避するために、イベントまたは外因性因子に反応して産生工程中に抑制されるプロモーターを使用してもよい。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター（ＵＳ５，１６８，０６２）、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＴ７ポリメラーゼプロモーター（ＷＯ９８／１００８８）などの従来のプロモーターが、本発明の文脈において使用され得るが。ワクシニアウイルスプロモーターが、腫瘍溶解性ポックスウイルスにおける発現には特に適合される。代表的な例としては、限定されることなく、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５（Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28）、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１ Ｐｒ１３．５（ＷＯ２０１４／０６３８３２）、ｐＢ８Ｒ、ｐＦ１１Ｌ、ｐＡ４４Ｌ、ｐＣ１１Ｒ（ＷＯ２０１１／１２８７０４）およびＫ１Ｌプロモーター、ならびにＣｈａｋｒａｂａｒｔｉらに記載のものなどの合成プロモーター（1997, Biotechniques, 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol. Methods, 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology, 179: 151-8）ならびに初期／後期キメラプロモーター（例えば、ＵＳ８，３９４，３８５；ＵＳ８，７７２，０２３）が挙げられる。牛痘プロモーターも同様に好適である（例えば、ＡＴＩプロモーター）。好ましい実施態様では、ＣＤＡｓｅ核酸分子は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスのＴＫ遺伝子座に挿入され、かつ、ワクシニアｐ１１．５Ｋプロモーターの制御下におかれる。

当業者ならば、核酸の発現を制御する調節要素は、転写の適切な開始、調節および／または終結（例えば、転写終結配列）、ｍＲＮＡの輸送（例えば、核局在シグナル配列）、プロセシング（例えば、スプライシングシグナル）、ならびに安定性（例えば、イントロンならびに非コード５’および３’配列）、翻訳（例えば、イニシエーターＭｅｔ、三分節リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、シグナルペプチドなど）、標的配列、輸送配列、分泌シグナル、ならびに複製または統合に関与する配列のためのさらなる要素をさらに含んでなってもよいことを認識するであろう。前記配列は、文献において報告されており、当業者により容易に得ることができる。

腫瘍溶解性ウイルスを製造する方法
本発明はまた、腫瘍溶解性ウイルスを製造する方法であって、
（ｉ）本発明の腫瘍溶解性ウイルスがプロデューサー細胞に導入され、
（ｉｉ）前記プロデューサー細胞が、前記腫瘍溶解性ウイルスの産生を可能にするのに適当な条件下で培養され；そして
（ｉｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスが細胞培養物から回収される、方法に関する。

一般に、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、感染性ウイルス粒子の産生を可能にするために、好適な条件下でトランスフェクトまたは感染した宿主細胞を培養すること、および産生された感染性ウイルス粒子を前記細胞の培養物から回収すること、および所望により、前記回収された感染性ウイルス粒子を精製することを含む従来の技術を用いて、好適な宿主細胞株中に産生される。腫瘍溶解性ウイルスの産生に好適な宿主細胞は、限定されることなく、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）、２９３細胞（Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72）、ＨＥＲ９６、ＰＥＲ－Ｃ６（Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17）などのヒト細胞株、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－０８１）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）およびＢＳＣ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２６）細胞株などのサル細胞、ＷＯ２００５／０４２７２８、ＷＯ２００６／１０８８４６、ＷＯ２００８／１２９０５８、ＷＯ２０１０／１３０７５６、ＷＯ２０１２／００１０７５など）に記載のものなどの鳥類細胞、ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）などのハムスター細胞株、ならびに受精卵から得たニワトリ胚から調製された一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を含む。宿主細胞は、好ましくは、動物またはヒト由来の製品を含まない合成培地を用いて、動物またはヒト由来の製品を含まない培地で培養する。培養は、プロデューサー細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で行う。このような培養条件は、当業者の専門技術の範囲内である。増殖因子が存在する場合は、それらは好ましくは、組換えで産生されたものであり、動物材料から精製されたものではない。好適な動物質を含まない培地(animal-free medium media)は市販されており、例えば、ＣＥＦプロデューサー細胞の培養用ＶＰ－ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。プロデューサー細胞は、好ましくは、感染前に、＋３０℃～＋３８℃の間に含まれる温度（より好ましくは、約＋３７℃）で、１～８日間（好ましくは、ＣＥＦでは１～５日間および不死化細胞では２～７日間）培養する。必要な場合、細胞の総数を増やすために、１～８日の数継代を行ってもよい。

プロデューサー細胞は、適当な多重感染度（ＭＯＩ）で腫瘍溶解性ウイルスにより感染されるが、ＭＯＩは、増殖性感染を可能にするために０．００１と低くすることができる（より好ましくは、０．０５～５の間）。

工程ｉｉ）において、感染プロデューサー細胞を、次に、後代ウイルスベクターが産生されるまで、当業者に周知の適当な条件下で培養する。感染プロデューサー細胞の培養はまた、好ましくは、動物またはヒト由来製品を含まない合成培地（プロデューサー細胞の培養および／または感染工程で使用した培地と同じでもよいし、異なっていてもよい）において、＋３０℃～＋３７℃の間の温度で、１～５日間行う。

工程ｉｉｉ）において、ウイルス粒子は、培養上清および／またはプロデューサー細胞から回収し得る。プロデューサー細胞からの（および所望により、培養上清からの）回収は、プロデューサー細胞からのウイルスの遊離を可能にするためのプロデューサー細胞膜の破壊を可能とさせる工程を必要とし得る。プロデューサー細胞膜の破壊は、当業者に周知の種々の技術により誘導することができ、それには、限定されるものではないが、凍結／融解、低張溶解、音波処理、顕微溶液化、または高速ホモジナイゼーションが含まれる。

回収した腫瘍溶解性ウイルスは、本発明に従って使用する前に、少なくとも部分的に精製することができる。清澄化、酵素処理（例えば、ベンゾナーゼ、プロテアーゼなどのエンドヌクレアーゼ）、超遠心分離（例えば、スクロース勾配または塩化セシウム勾配）、クロマトグラフィーおよびろ過工程を含む、種々の精製工程が想定され得る。適当な方法は、当技術分野で記載されている（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８；ＷＯ２００８／１３８５３３、ＷＯ２００９／１００５２１、ＷＯ２０１０／１３０７５３、ＷＯ２０１３／０２２７６４）。

腫瘍溶解性ウイルス組成物
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の腫瘍溶解性ウイルスを含んでなる、または本明細書に記載の方法に従って製造された組成物に関する。好ましくは、組成物は、薬学上許容されるビヒクルをさらに含んでなる。

「治療上有効な量」は、１以上の有益な結果を生じるのに十分な本発明の組成物に含まれる各活性薬剤の量に相当する。このような治療上有効な量は、種々のパラメーター、例えば、投与方法；病状；被験体の年齢および体重；被験体が処置に反応できる能力；併用処置の種類；処置の頻度；および／または予防もしくは治療法の必要性、の関数として変動し得る。予防的使用が関係する場合、本発明の組成物は、特にリスクにある被験体において、病態（例えば、癌などの増殖性疾患）の発症および／または確立および／または再発を予防または遅延させるのに十分な用量で投与される。「治療的」使用に関しては、本発明の組成物は、所望により、１以上の従来の治療様式と組み合わせて、疾患を処置することを目的として、病状（例えば、癌などの増殖性疾患）を有すると診断された被験体に投与される。特に、治療上有効な量は、以下に記載するように、ベースラインの状態を上回る、または処置されない場合に予想される状態を上回る臨床状態の観察可能な改善をもたらすのに必要な量であり得る。臨床状態の改善は、一般に医師および熟練の医療従事者により使用されるいずれかの関連する臨床的測定により、容易に評価することができる。例えば、研究室で慣例的に使用される技術（例えば、フローサイトメトリー、組織学的検査、撮像技術など）を使用して、腫瘍監視を行ってもよい。治療上有効な量は、有効な非特異的な（先天性の）および／または特異的な抗腫瘍応答の発生を引き起こすのに必要な量でもあり得る。一般に、免疫応答、特にＴ細胞応答の発生は、好適な動物モデルにおいて、または被験体から採取した生体サンプルを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができる。細胞傷害性Ｔ細胞、活性化細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および活性化ナチュラルキラー細胞など、処置される被験体に存在する抗腫瘍応答に関与する異なる免疫細胞集団を同定するために、種々の利用可能な抗体を使用してもよい。

腫瘍溶解性ウイルスの適当な用量は、種々のパラメーターの関数として適合することができ、関連する状況に照らして、実務家により慣例的に決定され得る。好適には、腫瘍溶解性ウイルスの個々の用量は、使用されるウイルスおよび定量的技術に依存して、およそ１０^３～およそ１０^１２ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはＰＦＵ（プラーク形成単位）に及ぶ範囲内で変動し得る。例示的目的で、ヒトに使用するための腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの好適な用量は、およそ１０^４～およそ１０^１１ＰＦＵの間、好ましくは、およそ１０^５ＰＦＵ～およそ１０^１０ＰＦＵの間に含まれ；およそ１０^６ＰＦＵ～およそ５×１０^９ＰＦＵの用量が特に好ましい（例えば、１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９または５×１０^９ＰＦＵの用量）。サンプル中に存在するウイルスの量は、慣例的な滴定技術、例えば、許容細胞（例えば、ＢＨＫ－２１またはＣＥＦ）感染後のプラーク数の計数、免疫染色（例えば、抗ウイルス抗体を用いた；Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211）、Ａ２６０吸光度の測定（ｖｐ力価）、またはさらに定量的免疫蛍光（ｉｕ力価）により、決定することができる。

用語「薬学上許容されるビヒクル」は、哺乳類および特にヒト被験体における投与と適合するあらゆる担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、吸収剤などを含むものとする。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトまたは動物への使用に適当な溶媒または希釈剤に独立に入れることができる。溶媒または希釈剤は、好ましくは、等張、低張または弱高張であり、比較的低いイオン強度を有する。代表的な例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、およびその他の生理的平衡塩水溶液が挙げられる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkinsの最新版を参照）。

他の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトへの使用のために好適に緩衝される。好適なバッファーは、限定されることなく、生理的ｐＨまたはわずかに塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７～およそｐＨ９）を維持できるリン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはトリスバッファーを含む。

本発明の組成物はまた、例えば、浸透圧、粘稠性、透明性、色調、無菌性、安定性、処方物の溶解速度を含む所望の薬学的または薬力学的特性を提供するため、ヒトまたは動物の被験体への放出または吸収を調整または維持するため、血液関門を通る輸送または特定器官における浸透を促進するための、他の薬学上許容される賦形剤を含有し得る。

さらなる実施態様では、本発明の組成物は、免疫性（特にＴ細胞性免疫）をさらに亢進するため、または投与時に腫瘍細胞の感染を促進するために、アジュバントされ得る。好適なアジュバントの代表的な例としては、限定されることなく、ミョウバン、フロイント完全および不完全（ＩＦＡ）などの鉱油エマルジョン、リポ多糖類またはその誘導体（Ribi et al., 1986, Plenum Publ. Corp.,407-419）、ＱＳ２１などのサポニン（Sumino et al., 1998, J.Virol. 72: 4931;ＷＯ９８／５６４１５）、イミキモドなどのイミダゾキノリン化合物（Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6）、Ｓ－２７６０９（Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324）およびＷＯ２００７／１４７５２９に記載のものなどの関連化合物、Ａｄｊｕｖａｘおよびスクアレンなどの多糖類、ＭＦ５９などの水中油エマルジョン、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡ類似体、一本鎖シトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）（Chu et al., 1997, J. Exp. Med., 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol., 171: 2358）ならびにＩＣ－３１などのカチオン性ペプチド（Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 822: 263-70）が挙げられる。

一つの実施態様では、本発明の組成物は、特に、凍結温度（例えば、－７０℃、－２０℃）、冷蔵温度（例えば、４℃）または周囲温度で、製造および長期保存（すなわち、少なくとも６ヵ月間、好ましくは少なくとも２年間）の条件下で、その安定性を改善する目的で処方され得る。種々のウイルス処方物が、凍結、液体形態または凍結乾燥形態のいずれかで当技術分野で入手可能である（例えば、ＷＯ９８／０２５２２、ＷＯ０１／６６１３７、ＷＯ０３／０５３４６３、ＷＯ２００７／０５６８４７およびＷＯ２００８／１１４０２１など）。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥が関与する工程により得ることができる。例示的目的で、ＮａＣｌおよび／または糖を含むバッファー処方物は、ウイルスの保存に対して特に適合される（例えば、サッカロース５％（Ｗ／Ｖ）を有するトリス１０ｍＭ ｐＨ８、グルタミン酸ナトリウム１０ｍＭ、ならびにＮａＣｌ ５０ｍＭまたはグリセロール（１０％）およびＮａＣｌを有するリン酸バッファー生理食塩水）。

腫瘍溶解性ウイルス組成物は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏでの適切な分布および放出を保証するための投与方法に適合した様式で、処方される。例えば、所望により、粘膜の孔径を増加させるのに有用な吸収促進剤と組み合わせて、胃耐性カプセル剤および顆粒剤が経口投与に特に適当であり、座剤が直腸投与または膣内投与に特に適当である。このような吸収促進剤は一般に、粘膜のリン脂質ドメインと構造的類似性を有する物質である（例えば、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル－β－シクロデキストリン、ラウリル－１－リゾホスファチジルコリン）。別の特に適当な例は、顕微針の手段を通じた投与に適合された処方物である（例えば、経皮または皮内パッチ）。このような処方物は、内毒素フリーのリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）への免疫療法製品の再懸濁を含んでなり得る。

投与
腫瘍溶解性ウイルス、または本発明の組成物は、単一の用量または複数の用量で投与し得る。複数の用量を企図する場合は、投与は、同一経路または異なる経路で行ってよく、同一部位または代替部位で行ってよい。各投与間の間隔は、数時間～８週間であり得る（例えば、２４時間、４８時間、７２時間、週１回、２～３週に１回、月１回など）。間隔は不規則でもあり得る。休薬期間後に繰り返す投与の連続周期を通じて進めることも可能である（例えば、３～６週に１回の投与に次いで、３～６週間の休薬期間の周期）。用量は、各投与について上記の範囲内で変動し得る。

非経口、局所または粘膜経路を含む、いずれかの従来の投与経路が本発明の文脈において適用可能である。非経口経路は、注射または注入としての投与を意図するものであり、全身経路および局所経路を包含する。一般的な非経口注射の種類は、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、皮内（真皮の中）、皮下（皮膚の下）、筋肉内（筋肉の中）および腫瘍内（腫瘍の中またはその近傍）である。注入は一般に、静脈内経路で行われる。局所投与は、経皮的な手段（例えば、パッチなど）を用いて行うことができる。粘膜投与は、限定されることなく、経口／食事、鼻腔内、気管内、肺内、腟内または直腸内経路を含む。鼻腔内、肺内および気管内経路の場合は、エアゾールの手段または点滴注入の手段により投与を行うことが有利である。本発明の腫瘍溶解性ウイルスの好ましい投与経路は、静脈内および腫瘍内経路を含む。

投与は、被験体において活性薬剤の送達を促進または改善できる当技術分野で利用可能な従来のシリンジおよび針（例えば、Ｑｕａｄｒａｆｕｓｅ注射針）またはいずれかの化合物もしくは装置を使用し得る。経皮システムも適当であり、例えば、中実、中空、コーティングまたは溶解性顕微針が用いられ（例えば、Van der Maaden et al., 2012, J. Control release 161: 645-55参照）、好ましくは、シリコンおよびスクロース顕微針パッチである（例えば、Carrey et al., 2014, Sci Rep 4: 6154 doi 10.1038; and Carrey et al., 2011, PLoS ONE, 6(7) e22442参照）。

特に好ましい組成物は、静脈内または腫瘍内投与用に製剤化された、１０^６ＰＦＵ～５×１０^９ＰＦＵの、ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子を含んでなる腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、Ｊ２Ｒ遺伝子座（ＴＫ－）、Ｉ４Ｌおよび／もしくはＦ４Ｌ遺伝子座（ＲＲ－）またはＪ２Ｒ遺伝子座（ＴＫ－）とＩ４Ｌ／Ｆ４Ｌ遺伝子座（ＴＫ－ ＲＲ－）の両方を欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、特に好ましくは、本明細書に記載のＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１またはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤなどの、ＴＫ遺伝子座の代わりに、ｐ１１．５Ｋプロモーター下に挿入されたＣＤＡｓｅ核酸分子を有するワクシニアを含んでなる。

方法および使用
別の態様において、本発明は、それを必要とする被験体における疾患または病態の処置または予防に使用するための、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験体における疾患または病態を処置または予防するのに十分な量で、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を投与することを含んでなる処置方法に関する。

「疾患」（および「障害」または「病状」などの疾患のいずれかの形態）は一般に、同定可能な症状を特徴とする。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を用いて予防または処置され得る疾患の例としては、癌、腫瘍または再狭窄などの増殖性疾患ならびに関節リウマチおよび骨粗鬆症などの破骨細胞活性増加に関連する疾患が挙げられる。

本発明は、癌、特に、副腎皮質癌腫、副腎癌、肛門癌、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、虫垂癌およびカルチノイド腫瘍）、胆管癌(bile duct cancer)（例えば、胆管癌(cholangiocarcinoma)）、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫）、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、神経膠腫および膠芽腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌）、気管支腫瘍、原発不明の癌腫、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌（例えば、直腸癌）、感覚神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部癌（例えば、下咽頭癌、咽頭癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、原発不明の転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、鼻腔癌および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、唾液腺癌、咽喉癌、食道癌）、肝細胞性（肝臓）癌、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、腎臓癌（例えば、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、腎盂および尿管の移行上皮癌）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌および乳頭腫症、白血病（例えば、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ））、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、原発性リンパ腫、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、セザリー症候群、Ｔ細胞リンパ腫）、眼内黒色腫、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線癌腫、多発性内分泌腺腫症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、慢性骨髄増殖性新生物、神経芽腫、卵巣癌（例えば、原発性腹膜癌および卵管癌）、膵臓癌および膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和性細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、血管腫瘍、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、黒色腫、扁平上皮癌およびメルケル細胞癌）、小腸癌、軟組織肉腫（例えば、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、ＡＩＤＳ関連癌、カポジ肉腫、カポジ肉腫および横紋筋肉腫）、胃癌、精巣癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜肉腫および子宮肉腫、膣癌および外陰癌の処置または予防に特に適している。本発明はまた、転移性癌の処置に有用である。

好ましい実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物は、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、腸（大腸または結腸および直腸）、および肛門の癌を含んでなる消化管癌の処置に使用される。特に好ましい方法は、週１回～月１回の間隔で行われる本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物の１～６回の静脈内または腫瘍内投与、特に好ましくは、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１またはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤなどの、そのゲノムに挿入された、ＣＤＡｓｅをコードする核酸分子（例えば、ｐ１１．５Ｋプロモーター下におかれた）を含んでなる、好ましくは、Ｊ２Ｒ遺伝子座（ＴＫ－）、Ｉ４Ｌおよび／もしくはＦ４Ｌ遺伝子座（ＲＲ－）またはＪ２Ｒ遺伝子座（ＴＫ－）とＩ４Ｌ／Ｆ４Ｌ遺伝子座（ＴＫ－ ＲＲ－）の両方を欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルス１０^６～５×１０^９ＰＦＵを含んでなる組成物の３回の隔週投与（例えば、およそ１日目、１４日目および２９日目に）を含んでなる。

本発明の方法により提供される有益な効果は、ベースラインの状態を上回る、または本明細書に記載の様式に従って処置されない場合に予想される状態を上回る臨床状態の観察可能な改善によって、証明され得る。臨床状態の改善は、一般に医師および熟練の医療従事者により使用されるいずれかの関連する臨床的測定により、容易に評価することができる。本発明の文脈においては、治療的利益は、一過性（投与中止後１ヵ月間もしくは数ヵ月間）または持続性（数ヵ月間もしくは数年間）であり得る。臨床状態の自然経過は、被験体毎にかなり変わり得るため、治療的利益は各被験体で認められる必要はないが、有意な数の被験体で認められる必要がある（例えば、２群間の統計的有意差は、テューキーパラメトリック検定、クラスカル・ウォリス検定、マン・ホイットニーのＵ検定、スチューデントのｔ検定、ウィルコクソン検定などの当技術分野で公知のいずれかの統計的検定により決定することができる）。

特定の実施態様では、本発明による方法は癌の処置に特に適当であるため、このような方法は、本発明に従って処置される被験体における、腫瘍の成長、増殖および転移を阻害するまたは遅くすること、腫瘍浸潤（隣接組織における腫瘍細胞の伝播）を防止するまたは遅延させること、腫瘍の数を減らすこと、腫瘍の大きさを減少させること、転移の程度の数を減らすこと、全生存率（ＯＳ）の延長をもたらすこと、無増悪生存期間（ＰＦＳ）を増加させること、寛解の長さを増加させること、疾患の状態を安定化する（すなわち、悪化させない）こと、標準治療に対する良好な反応をもたらすこと、生活の質を改善すること、ならびに／または抗腫瘍応答（例えば、非特異的な（先天性の）および／もしくは傷害性Ｔ細胞応答などの特異的な）を誘導すること、のうち１つ以上と相関し得る。

血液検査、生体液および生検の分析ならびに医用画像技術など、臨床的利益の評価に使用できる適当な測定は、医学研究室および病院において慣例的に評価され、多数のキットが市販されている。それらは、投与前（ベースライン）、ならびに処置中および処置の中止後の様々な時点で実施することができる。

本発明はまた、本発明の、または本明細書に記載の方法に従って製造された腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物を投与することを含んでなる、それを必要とする被験体における疾患または病態を処置する方法に関する。一つの実施態様では、前記疾患は、癌、腫瘍および再狭窄などの増殖性疾患である。別の実施態様では、前記疾患は、関節リウマチおよび骨粗鬆症などの破骨細胞活性増加に関連する疾患である。より正確には、本発明は、腫瘍の増殖を阻害するために、それを必要とする被験体において腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を投与することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。一般的な指針のために、腫瘍細胞増殖の阻害は、例えば、Ｘ線撮影の手段により慣例的に評価することができる。腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物の投与は、望ましくは、腫瘍量の少なくとも１０％の減少をもたらす。

併用療法
本発明によるいずれの方法においても、腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物は、標的とする疾患または病状を処置または予防するために利用可能ないずれかの従来の治療様式と組み合わせて投与することができる。従来の療法の代表的な例としては、限定されることなく、手術、放射線療法、化学療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法、サイトカイン療法、移植（例えば、幹細胞）、温熱療法および光線力学療法が挙げられる。このような従来の療法は、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物の投与の前、後、基本的に同時に、または間欠的に、標準技法に従って被験体に施行される。

一つの実施態様では、本発明による腫瘍溶解性ウイルス、組成物または方法は、放射線療法と組み合わせて使用することができる。当業者ならば、適当な放射線療法のプロトコールおよびパラメーターを容易に作成することができる（例えば、Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co参照；当業者には容易に明らかであろう適当な改変および修正を用いて）。使用され得る放射線の種類は、当技術分野で周知であり、電子線、直線加速器または放射能源からの高エネルギー光子、例えば、コバルトまたはセシウム、プロトン、および中性子を含む。放射性同位体の線量範囲は、同位体の半減期、放射される放射線の強度および種類、ならびに新生細胞による取り込みに応じて、実務家により定義することができる。長期間（３～６週間）の通常のＸ線の線量、または単一の高線量が、本発明により企図される。

他の実施態様では、方法は、手術と組み合わせて使用され得る。例えば、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、腫瘍の切除時に投与され得る（例えば、切除された領域内への局所適用により）。

本発明のいずれかの方法のさらなる実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、化学療法薬または免疫療法製品など、抗癌療法において有効な１以上の物質と組み合わせて使用され得る。

特定の実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物は、癌の処置に現在用いられている化学療法薬と組み合わせて使用され得る。いずれの抗癌化学療法薬も本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物と組み合わせて使用され得るが、より具体的には、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、白金誘導体、チロシンキナーゼ受容体の阻害剤、代謝拮抗物質および細胞分裂抑制薬が挙げられる。

なおさらなる実施態様では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物は、免疫療法、特に、抗新生物抗体ならびにｓｉＲＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチドと組み合わせて使用され得る。代表的な例としては、とりわけ、免疫チェックポイントを遮断するモノクローナル抗体（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ－２２４ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ－９３６５５９など）、α、βもしくはγインターフェロン、インターロイキン（特に、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０もしくはＩＬ－１２）または腫瘍壊死因子；例えば、上皮細胞増殖因子受容体を遮断するモノクローナル抗体（特に、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブなど）ならびに血管内皮増殖因子を遮断するモノクローナル抗体（特に、ベバシズマブおよびラニビズマブ）など、細胞表面受容体の調節に作用する薬剤が挙げられる。本発明における使用に好適なこのような免疫療法製品の他の代表的な例としては、とりわけ、プラスミドＤＮＡベクター、ワクシニアウイルス（例えば、コペンハーゲン、ＷＲ、ワイス、ＭＶＡなど）、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、組換えポリペプチドが挙げられる。

本発明の別の態様は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、野生型腫瘍溶解性ウイルス、または改変誘導体腫瘍溶解性ウイルス）と、少なくとも１つのシチジンデアミナーゼとの組合せに関し、ここで、前記シチジンデアミナーゼは、腫瘍溶解性ウイルスによりコードされない。シチジンデアミナーゼは、例えば、ＤＮＡ分子（プラスミド、非腫瘍溶解性ウイルスベクター、コスミドおよび人工染色体）、ＲＮＡ分子、ナノ粒子などの別のベクターによりコードされ得る。シチジンデアミナーゼは、そのポリペプチド型でもあり得る。ポリペプチドは、例えば、ヒト、ヒト化、動物、昆虫、微生物またはキメラなど、いずれの起源でもあり得る。さらに、ポリペプチドは、グリコシル化でもよく、または非グリコシル化でもよい。

さらなる実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、シチジンデアミナーゼ活性を亢進する物質（例えば、シチジンデアミナーゼの発現のエンハンサー、５－Ａｚａ－ｄＺなどのＤＮＡメチル化の阻害剤）と組み合わせても使用され得る。

被験体に対して、腫瘍溶解性ウイルスおよび追加の抗癌療法を連続してまたは間欠的に提供してもよいが、同一期間内での両療法の併用も企図される。処置の過程は、実務家により慣例的に決定してよく、種々のプロトコールが本発明によって包含される。例えば、腫瘍溶解性ウイルスの１～１０回の投与（例えば、３～６回の隔週注射）を、追加の抗癌療法の１回または複数回の施行内に割り込ませてもよい（例えば、１または数週間の１以上の周期で化学療法を施行してもよい）。さらに、処置の過程の後、処置周期が繰り返される前に抗癌処置が実施されない期間があることが企図される。

上記に引用した特許の開示、出版物およびデータベース記載項目の総ては、具体的に引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。本発明のその他の特徴、目的および利点は、明細書、図面および特許請求の範囲から明らかであろう。本発明の好ましい実施態様を実証するために、以下の実施例を組み込む。しかしながら、本開示を踏まえ、当業者ならば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施態様に変更を行えることが分かるはずである。

材料および方法
ウイルスおよび細胞
本試験に用いた総ての組換えウイルスは、コペンハーゲン株に由来する二重欠損チミジンキナーゼ（Ｊ２Ｒ）およびリボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）ワクシニアウイルスである。ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰは、遺伝子マーカーＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する二重欠損ワクシニアウイルスである。ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１は、酵母シチジンデアミナーゼＣＤＤ１遺伝子を発現する二重欠損ワクシニアウイルスである（Kurtz et al., 1999, Curr. Genet., 36(3):130-6）。{Kurtz, 1999 #109}{Kurtz, 1999 #109}{Kurtz, 1999 #109}{Kurtz, 1999 #109}ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤは、ヒトシチジンデアミナーゼＣＤＡ ｃＤＮＡを発現する二重欠損ワクシニアウイルスである（Laliberte et Momparler, 1994, Cancer Res., 54(20):5401-7）。ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＡＰＯＢＥＣ２は、ヒトＡＰＯＢＥＣ２遺伝子を発現する二重欠損ワクシニアウイルスである。ＧＦＰ、ＣＣＤ１、ｈＣＤおよびＡＰＯＢＥＣ２遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子座に挿入し、ｐ１１Ｋ．５プロモーターの制御下におく。ウイルス構造は、複数回のＰＣＲにより確認した。最後の組換えワクシニアウイルスを一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中で{Myers, 2016 #90;Pol, 2016 #91;Fend, 2016 #92;Fonteneau, 2016 #93;Pol, 2014 #94;Kaufmann, 2013 #95;Lusky, 2010 #96;Quirin, 2011 #97;Dias, 2010 #98;Breton, 2010 #99;Tosch, 2009 #100;Foloppe, 2008 #101;Erbs, 2008 #102;Rittner, 2007 #103;Slos, 2004 #104;Ceraline, 2004 #105;Ceraline, 2003 #106;Kurtz, 2002 #107;Erbs, 2000 #108;Kurtz, 1999 #109;Ador, 1999 #110;Leroy, 1998 #111;Bernard, 1997 #112;Erbs, 1997 #113;Yi, 1991 #114}増幅し、ウイルスストックをプラーク{Kurtz, 1999 #109}アッセイによりＣＥＦ上で滴定した。

ヒト結腸癌細胞株ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２９）、ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４２０）およびＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から得た。ヒト食道癌細胞株ＯＥ－１９を、欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ９６０７１７２１）から得た。総てのヒト腫瘍細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ウイルスベクターの組換え、増幅および滴定に用いた。湿潤雰囲気下にて３７℃で先に１１または１２日間インキュベートした受精卵から得たニワトリ胚（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳ）から、ＣＥＦ細胞を調製した。ニワトリ胚を解剖し、トリプシンの２．５％（ｗ／ｖ）溶液で処理した。ＣＥＦ細胞を、５％ウシ胎児血清を添加したイーグル基礎培地（ＭＢＥ）で維持した。

ウエスタンブロット解析
ヒト腫瘍膵癌ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞およびヒト結腸直腸癌ＬｏＶｏ細胞を、０．１のＭＯＩでＶＶＴＫ－ＲＲ－およびＶＶ－ＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤに感染させ、２４時間インキュベートした。細胞ライセートタンパク質３０μｇを、還元条件下で１０％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で走らせ、ニトロセルロース膜に移した。この膜をウサギポリクローナル抗体ヒトｈＣＤ（Ａｂｃａｍ）でインキュベートし、洗浄し、二次抗体結合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でインキュベートした。増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、シグナル検出を行った。

ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
雌スイスヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。試験に用いた動物は、年齢（６週齢）および体重（２０～２３ｇ）において均一であった。

ヒト異種移植腫瘍モデルにおけるワクシニアベクターの治療活性を評価するため、５×１０^６個のヒト癌細胞（ＬｏＶｏ、ＨＣＴ－１１６またはＯＥ－１９）をマウスの側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が直径７０～１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを盲検的に無作為化し、示したベクターで処置した。

確立された皮下ＬｏＶｏ腫瘍を有するヌードマウスを、１×１０^７ＰＦＵの用量で、示したベクターに静脈内に１回感染させた（尾静脈注射）。

確立された皮下ＨＣＴ－１１６腫瘍を有するヌードマウスを、１×１０^５ＰＦＵの用量で、示したベクターに静脈内に１回感染させた（尾静脈注射）。

確立された皮下ＯＥ－１９腫瘍を有するヌードマウスを、１×１０^６ＰＦＵまたは５×１０^５ＰＦＵの用量で、示したベクターに静脈内に１回感染させた（尾静脈注射）。

腫瘍の大きさを、ノギスを用いて週２回測定した。腫瘍容積は、式（Π／６）（長さ×幅^２）を用いて、単位ｍｍ^３で算出した。

液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析
本試験は、ヒトＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ腫瘍細胞における細胞内ヌクレオチドおよびヌクレオシドの定量化のために、「Ｈｏｓｐｉｃｅｓ Ｃｉｖｉｌｓ ｄｅ Ｌｙｏｎ」により実施された。分析法およびサンプルの調製方法は、Machon et al., 2015, J. Chromatogr. A. ; 1405:116-25およびMachon et al., 2014, Anal. Bioanal. Chem. ; 406(12):2925-41に記載されている。使用した質量分析計は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｃｈｅｒ）、高分解能およびオービトラップ型検出器であった。

Ｔ－２５フラスコに播種した１．５×１０^６個のＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を、０．０１のＭＯＩでＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰおよびＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤに感染させ、５％ＣＯ_２の存在下で３７℃でインキュベートした。ＨＣＴ－１１６では３６時間後、ＬｏＶｏでは６０時間後に、培養培地を除去し、冷メタノール／水（７０／３０、ｖ／ｖ）３ｍｌを加える前に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。５分間のインキュベーション後、上清を分析まで－８０℃で保存した。

ヌクレオチドおよびヌクレオシドの濃度を、ＨＣＴ－１１６では感染の３６時間後、ＬｏＶｏでは感染の６０時間後に評価した。シチジンおよびウリジンを定量化した。

結果
ウイルス工学
ワクシニアウイルスにおけるヒトＣＤＡ（ｈＣＤ）タンパク質の発現を、ウサギポリクローナル抗体ヒトＣＤＡを用いたウエスタンブロットにより確認した（図１）。ウエスタンブロットは、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤが、ＭｉａＰａｃａ－２およびＬｏＶｏ細胞上に期待された１６ｋＤａのＣＤＡを発現したことを示している。

シチジンデアミナーゼを発現するＶＶＴＫ－ＲＲ－の複数の腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性
シチジンデアミナーゼを発現するＶＶＴＫ－ＲＲ－が腫瘍溶解性ウイルスとして機能できる能力を、ヒト癌の異なるモデルにおいて調べた。

我々は最初に、ワクシニアウイルスの腫瘍崩壊に対して弱許容的なモデルである結腸直腸ＬｏＶｏモデルにおいて、ＧＦＰを発現する二重欠損ウイルスとＣＤＤ１を発現する二重欠損ウイルスの腫瘍溶解活性を比較した。ＬｏＶｏ腫瘍を有するマウスを、１×１０^７ＰＦＵの両ウイルスで静脈内注射した。図２に示されるように、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰの単回静脈内注射により、対照群（ビヒクル単独）と比較して、腫瘍増殖の阻害がもたらされた。さらに、シチジンデアミナーゼを発現するウイルスの抗腫瘍活性は、マーカー遺伝子ＧＦＰを発現するウイルスの抗腫瘍活性よりも有意に優れており、酵母シチジンデアミナーゼ遺伝子は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療効力を改善することが示された。

ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１の抗腫瘍効果をさらに特徴付けるため、我々は、ＶＶ腫瘍崩壊に対してより感受性が高いヒト腫瘍モデル異種移植片において、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰと比較したこのウイルスの腫瘍溶解性活性を試験した。両ウイルスを、ＨＣＴ－１１６およびＯＥ－１９モデルにおいて、それぞれ１×１０^５ＰＦＵおよび１×１０^６ＰＦＵで１回静脈内投与した。図３および図４に示されるように、両モデルにおいて、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰの単回静脈内注射は、対照に比べて弱い抗腫瘍効果を誘導し、この効果は、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１の単回静脈内注射により劇的に増加した。

ヒトシチジンデアミナーゼ遺伝子を発現する二重欠損ワクシニアウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤ）の抗腫瘍効果も、ＯＥ－１９モデルにおいて評価した。我々は、５×１０^５ＰＦＵでのＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤおよびＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰの単回静脈内注射を行った。図５に示されるように、ヒトシチジンデアミナーゼ遺伝子を発現するウイルスの単回静脈内注射は、遺伝子マーカーＧＦＰを発現するウイルスと比較して、腫瘍増殖の強力な阻害ももたらした。

これらのデータは、異なる起源（酵母およびヒト）のシチジンデアミナーゼは、腫瘍溶解性ワクシニアベクターの抗腫瘍活性を増加させることを示した。

ＦＣＵ１を発現するＶＶＴＫ－ＲＲ－のＬｏＶｏ腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性
コードされたＣＤＡｓｅ酵素により提供される抗腫瘍活性を、同じ文脈において別のヌクレオシドプール調節因子により提供されるものと比較した。ここで、比較に用いた製品は、ＦＣＵ１遺伝子をコードするＴＫおよびＲＲ二重欠損ワクシニアウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－ＦＣＵ１）である。いわゆるＦＣＵ１遺伝子は、酵母シトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの配列の融合物から得られる。ヌクレオシドプール調節因子であるシトシンデアミナーゼは、５－ＦＣプロドラッグから毒性のある５－ＦＵへの変換を触媒する。ＶＶＴＫ－ＲＲ－ＦＣＵ１をＬｏＶｏ腫瘍モデルにおいて評価するとともに、ＶＶＴＫ－ＲＲ－対照も評価した。図６に示されるように、５－ＦＣ（プロドラッグ）を投与せずに、ＶＶＴＫ－ＲＲ－またはＶＶＴＫ－ＲＲ－ＦＣＵ１ウイルスの単回静脈内注射により、ビヒクル単独と比較して、腫瘍増殖の同程度の弱い阻害がもたらされた。このことは、プロドラッグによる処置なしでは、ＦＣＵ１によりコードされるシトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼヌクレオシドプール調節因子は、少なくともＬｏＶｏ腫瘍モデルにおいては、抗腫瘍効果を生じないことを示している。対照的に、シチジンデアミナーゼを発現するワクシニアウイルスは、抗腫瘍保護において有効となるために、いずれのプロドラッグの投与も必要としない。

ＡＰＯＢＥＣ２を発現するＶＶＴＫ－ＲＲ－のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
我々は、結腸直腸ＨＣＴ－１１６モデルにおいて、ＧＦＰを発現する二重欠損ウイルスとＡＰＯＢＥＣ２を発現する二重欠損ウイルスの腫瘍溶解活性を比較した。ＨＣＴ－１１６腫瘍を有するマウスを、１×１０^５ＰＦＵの両ウイルスで静脈内注射した。図７に示されるように、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＧＦＰの単回静脈内注射により、対照群（ビヒクル単独）と比較して、腫瘍増殖の阻害がもたらされた。さらに、ＡＰＯＢＥＣ２を発現するウイルスの抗腫瘍活性は、マーカー遺伝子ＧＦＰを発現するウイルスの抗腫瘍活性よりも有意に優れており、ＡＰＯＢＥＣ２遺伝子は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療効力を改善することが示された。

ヒトＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ腫瘍細胞における細胞内シチジンおよびウリジンの定量化

結果は、内因性シチジンまたはウリジンと対応する内部標準との間のクロマトグラフィーピーク面積比を表す。結果は、細胞１００万個あたりで示す。

この評価は、対照または空ウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－）で感染させた細胞において、１．６０～１．８８の間に含まれるＣ／Ｕ比のレベルは同程度であることを示す。比較すると、シチジンデアミナーゼをコードするウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤ）で感染させた細胞は、異常なレベルのＣ／Ｕ比（０．２０４）を示す。この低い比は、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤがヌクレオシドプールの不均衡を誘発することを示す。

結果は、内因性シチジンまたはウリジンと対応する内部標準との間のクロマトグラフィーピーク面積比を表す。結果は、細胞１００万個あたりで示す。ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤ感染の３６時間後のＬｏＶｏ細胞においては、シチジンは検出されなかった。

この評価は、対照または空ウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－）で感染させた細胞において、２．４４～２．６７の間に含まれるＣ／Ｕ比のレベルは同程度であることを示す。比較すると、シチジンデアミナーゼをコードするウイルス（ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤ）で感染させたＬｏＶｏ細胞において、シチジンは検出されなかった。０．０２という検出限界（本実験で検出されたシチジンの最低レベル、表１参照）を考慮すると、Ｃ／Ｕ比は０．５１未満であろう。この低い比は、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤがヌクレオシドプールの不均衡を誘発することを確認するものである。

参考文献

Claims (31)

1. シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡｓｅ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスがポックスウイルスであり、かつＪ２Ｒ遺伝子座を欠損している、腫瘍溶解性ウイルス。
2. 前記ＣＤＡｓｅポリペプチドが、ＣＤＡ、ＣＤＤ、ＥＣ３．５．４．５、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤおよびシチジンデアミナーゼ様タンパク質からなる群から選択され、前記シチジンデアミナーゼ様タンパク質が、対応するウラシル産物への基質の加水分解的脱アミノ化を触媒するタンパク質である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
3. 前記ＡＰＯＢＥＣが、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４からなる群から選択される、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
4. 前記ＡＰＯＢＥＣがＡＰＯＢＥＣ２である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
5. 前記ＣＤＡｓｅが酵母シチジンデアミナーゼ（ＣＤＤ１）またはヒトシチジンデアミナーゼ（ｈＣＤ）である、請求項１または２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
6. 前記ＣＤＤ１が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
7. 前記ＣＤＤ１が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
8. 前記ｈＣＤが、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
9. 前記ｈＣＤが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
10. 前記ＡＰＯＢＥＣ２が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３または４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
11. 前記ＡＰＯＢＥＣ２が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３または４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
12. 前記ＣＤＡｓｅポリペプチドが、シチジンからウリジン、およびデオキシシチジン（ｄＣ）からデオキシウリジン（ｄＵ）のように、シチジン系成分からウリジン系成分への脱アミノ化を触媒する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
13. 前記シチジン系成分が遊離型または複合型である、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
14. 前記ウイルスが、オルソポックスウイルス属に属するポックスウイルスである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
15. 前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス（ＶＶ）種または牛痘ウイルス種に属する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
16. 前記ワクシニアウイルスが、コペンハーゲン、ワイスおよびウエスタンリザーブ（ＷＲ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
17. 前記ウイルスがＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子座を欠損している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
18. 前記ウイルスが、ウイルスＴＫおよびＲＲにコードされる活性を欠損し、ヒトまたは酵母ＣＤＡｓｅをコードするワクシニアウイルスである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
19. 前記ウイルスが、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＣＤＤ１、ＶＶＴＫ－ＲＲ－／ｈＣＤまたはＶＶＴＫ－ＲＲ－／ＡＰＯＢＥＣ２である、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
20. 前記ウイルスが、目的の１以上の核酸をさらに含んでなる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
21. 前記目的の核酸が、免疫刺激性ポリペプチド、抗原または透過酵素をコードする、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
22. 前記ウイルスが、前記シチジンデアミナーゼおよび前記１以上の目的の核酸の発現に必要な要素をさらに含んでなる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
23. 腫瘍溶解性ウイルスを製造する方法であって、
    （ｉ）請求項１～２２のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスがプロデューサー細胞に導入され；
    （ｉｉ）前記プロデューサー細胞が、前記腫瘍溶解性ウイルスの産生を可能にするのに適当な条件下で培養され；そして
    （ｉｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスが細胞培養物から回収される、方法。
24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、または請求項２３に従って製造された腫瘍溶解性ウイルスを含んでなり、薬学上許容されるビヒクルをさらに含んでなる、組成物。
25. 前記組成物が、１０^６～５×１０^９ＰＦＵの間の腫瘍溶解性ウイルスの用量を含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、静脈内または腫瘍内経路を優先とした非経口経路投与のために製剤化されている、請求項２４または２５に記載の組成物。
27. 増殖性疾患の予防または処置に使用するための、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記増殖性疾患が癌、腫瘍または再狭窄である、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記癌が、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、腸（大腸または結腸および直腸）、および肛門の癌を含む消化管癌である、請求項２８に記載の組成物。
30. 抗癌療法において有効な１以上の物質と組み合わせて用いるための、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の組成物。
31. シチジンデアミナーゼ活性を亢進する１以上の物質と組み合わせて用いるための、請求項３０に記載の組成物。

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