JP5421250B2 - トリ不死化細胞株 - Google Patents
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Description
5' TAGGGATAACAGGGTAAT 3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA 5'
-単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-1 TK)およびアシクロビルまたはガンシクロビル(GCV)(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361)
-チトクロムp450およびシクロホスホファミド(Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978)
-大腸菌(E.coli)由来プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび6-メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1 , 233-238)
-大腸菌由来グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよび6-チオキサンチン(MzozおよびMoolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595)
-シトシンデアミナーゼ(CDase)および5-フルオロシトシン(5FC)
-FCU1および5-フルオロ-シトシン(5FC)(WO9954481)
-FCU1-8および5-フルオロ-シトシン(5FC)(WO2005007857)
相同配列に囲まれているE1A核酸配列、
正の選択マーカーであり、前記相同配列に囲まれている、第1の選択マーカー、
第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列、
負の選択マーカーであり、前記相同配列に囲まれていない、第2の選択マーカー、
負の選択マーカーであり、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間にある、第3の選択マーカー
を含むベクターを、トリ細胞に導入する工程、
第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において、前記細胞を培養する工程、
第2の選択マーカーが組み込まれている細胞を増殖させない培地において、前記細胞を培養する工程、
前記細胞のゲノムから第1の選択マーカーを排除する工程、
第3の選択マーカーを含む細胞を増殖させない培地において、前記細胞を培養する工程。
[本発明1001]
E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする工程を含む方法によって得られ、E1B核酸配列を含まないことを特徴とする、E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞。
[本発明1002]
E1A核酸配列がHPRT遺伝子に挿入されている、本発明1001の不死化細胞。
[本発明1003]
E1A核酸配列が内因性HPRTプロモーターに機能的に連結されている、本発明1002の不死化細胞。
[本発明1004]
カモ(Anatidae)科に属する動物に由来する、本発明1001〜1003のいずれかの不死化細胞。
[本発明1005]
動物がノバリケン(cairina moschata)種に属する、本発明1004の不死化細胞。
[本発明1006]
動物がマガモ(Anas platyrhynchos)種に属する、本発明1004の不死化細胞。
[本発明1007]
E1A核酸配列が、SEQ ID NO:1に対し少なくとも60%の核酸配列同一性を有する、本発明1001〜1006のいずれかの不死化細胞。
[本発明1008]
E1A核酸配列が、SEQ ID NO:1に対し少なくとも70%の核酸配列同一性を有する、本発明1001〜1006のいずれかの不死化細胞。
[本発明1009]
E1A核酸配列が、SEQ ID NO:1に対し少なくとも80%の核酸配列同一性を有する、本発明1001〜1008のいずれかの不死化細胞。
[本発明1010]
E1A核酸配列が、SEQ ID NO:1に対し少なくとも90%の核酸配列同一性を有する、本発明1001〜1006のいずれかの不死化細胞。
[本発明1011]
E1A核酸配列がSEQ ID NO:1に示されるものである、本発明1001〜1006のいずれかの不死化細胞。
[本発明1012]
組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかの不死化細胞。
[本発明1013]
組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:3に対し少なくとも70%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の核酸配列同一性を有する、本発明1012の不死化細胞。
[本発明1014]
組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列がSEQ ID NO:3に示されるものである、本発明1012の不死化細胞。
[本発明1015]
関心対象の物質をコードする核酸配列をさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの不死化細胞。
[本発明1016]
欠損ウイルスの増殖を可能にする相補カセットをさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの不死化細胞。
[本発明1017]
ウイルスを複製するための、本発明1001〜1016のいずれかの不死化細胞の使用。
[本発明1018]
ウイルスが、牛痘(Cowpox)ウイルス、エクトロメリア(Ectromelia)ウイルス、サル痘(Monkeypox)ウイルス、ワクシニア(Vaccinia)ウイルス、痘瘡(Variola)ウイルス、およびMVAからなる群より選択される、本発明1017の使用。
[本発明1019]
関心対象の物質を産生するための、本発明1001〜1016のいずれかの不死化細胞の使用。
[本発明1020]
ウイルスを作製するための、本発明1001〜1016のいずれかの不死化細胞の使用。
[本発明1021]
ウイルスがポックスウイルスである、本発明1020の使用。
[本発明1022]
ウイルスがワクシニアウイルスである、本発明1021の使用。
[本発明1023]
ワクシニアウイルスがMVAである、本発明1022の使用。
[本発明1024]
組換えウイルスを作製するための、本発明1001〜1016のいずれかの不死化細胞の使用。
[本発明1025]
トリ細胞を、E1A核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含み、トリ細胞をE1B核酸配列でトランスフェクトする工程を含まない、トリ細胞を不死化する方法。
[本発明1026]
ベクターが、細胞ゲノムに存在する配列と相同な2つの配列を含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
E1A核酸配列が前記相同配列に囲まれている、本発明1026の方法。
[本発明1028]
ベクターが第1の選択マーカーをさらに含み、第1の選択マーカーが正の選択マーカーであり、第1の選択マーカーが前記相同配列に囲まれている、本発明1026または1027の方法。
[本発明1029]
第1の選択マーカーが、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列に囲まれている、本発明1028の方法。
[本発明1030]
ベクターが、前記相同配列に囲まれていない第2の選択マーカーを含み、該選択マーカーが負の選択マーカーである、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
ベクターが第3の選択マーカーを含み、第3の選択マーカーが負の選択マーカーであり、第3の選択マーカーが、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間に位置する、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
第2の選択マーカーが組み込まれている細胞を増殖させない培地において細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする、本発明1030〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
細胞ゲノムから第1の選択マーカーを排除することを含む工程をさらに含む、本発明1031〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
細胞ゲノムから第1の選択マーカーを排除することを含む工程の後に得られた細胞を、第3の選択マーカーを含む細胞を増殖させない培地において培養する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
細胞がカモ科に属する生物から採取される、本発明1025〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
生物がノバリケン種に属する、本発明1036の方法。
[本発明1038]
生物がマガモ種に属する、本発明1036の方法。
[本発明1039]
E1A核酸配列が細胞の標的DNA配列に挿入される、本発明1025〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
標的DNA配列がHPRT遺伝子である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
ベクターが、組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列をさらに含む、本発明1025〜1040のいずれかの方法。
実施例1:E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞株の樹立
A.プラスミド構築物
A-1.ランダム挿入用のプラスミド構築物
この目的のために、ノバリケンゲノムと相同性のある特定の配列を共有しないプラスミド(プラスミドE1A)を使用した(図1)。
E1A核酸配列(SEQ ID NO:1) および2つの選択マーカーを取り囲む、ノバリケンHPRT遺伝子と相同な2つの5kb断片を含むプラスミドを構築した。ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼをコードするHPRT遺伝子を、E1A核酸配列の構成的発現に適した部位として選択した。
B.1 12齢ノバリケン卵からのCECバッチの調製および亜集団の説明
25個のSPF受精卵を37.5℃で保温する。利用可能なプロトコールに従って、卵を12日間保温した後に、卵を開ける。
AFFSSA Ploufraganから入手した、29個のSPFノバリケン受精卵を、湿度の高い雰囲気中で37.5℃で保温する。
関心対象のヌクレオチド配列を発現することができるベクターを導入するために、多数のトランスフェクション法が当技術分野において公知である。これらの方法の非限定的なリストを以下に列挙する:CaPO4沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクチントランスフェクション法。ある特定の例はCaPO4沈殿法に基づいている。
D-1.ランダム挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS10%およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mL(任意で、ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL)を含むBMEに再播種する。
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS10%;ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mL(またはピューロマイシン0.5μg/mL)を含むBMEに再播種する。
A.プラスミド構築物
A-1.ランダム挿入用のプラスミド構築物
この目的のために、ノバリケンゲノムと相同性のある特定の配列を共有しないプラスミドを使用した。
ノバリケンテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(SEQ ID NO:3)、E1A核酸配列(SEQ ID NO:1)、および2つの選択マーカーを取り囲む、ノバリケンHPRT遺伝子と相同な2つの5kb断片を含むプラスミド(プラスミドdTERT-E1A)を構築した。ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼをコードするHPRT遺伝子を、E1A核酸配列の構成的発現に適した部位として選択した。
AFFSSA Ploufraganから入手した、29個のSPFノバリケン受精卵を、湿度の高い雰囲気中で37.5℃で保温する。
関心対象のヌクレオチド配列を発現することができるベクターを導入するために、多数のトランスフェクション法が当技術分野において公知である。これらの方法の非限定的なリストを以下に列挙する:CaPO4沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクチントランスフェクション法。ある特定の例は、エレクトロポレーションに基づいている。
D-1.ランダム挿入のための選択方法:
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS10%、ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびG418 800μg/mL、好ましくは、500μg/mLを含むBMEに再播種する。
トランスフェクションして48〜72時間後に選択圧を加える。細胞を、TrypLE selectを用いて分離し、低速遠心分離し、FCS10%;ガンシクロビル25μg/mL、好ましくは、10μg/mL;およびピューロマイシン0.5μg/mLを含むBMEに再播種する。
Claims (39)
- E1A核酸配列を含むトリ不死化細胞であって、SEQ ID NO:1に対し少なくとも90%の核酸配列同一性を有するE1A核酸配列を含む非ウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする工程を含む方法によって得られ、E1B核酸配列を含まず、SEQ ID NO:3に対し少なくとも90%の核酸配列同一性を有する組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする、不死化細胞。
- E1A核酸配列がHPRT遺伝子に挿入されている、請求項1記載の不死化細胞。
- E1A核酸配列が内因性HPRTプロモーターに機能的に連結されている、請求項2記載の不死化細胞。
- カモ(Anatidae)科に属する動物に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の不死化細胞。
- 動物がノバリケン(Cairina moschata)種に属する、請求項4記載の不死化細胞。
- 動物がマガモ(Anas platyrhynchos)種に属する、請求項4記載の不死化細胞。
- E1A核酸配列がSEQ ID NO:1に示されるものである、請求項1〜6のいずれか一項記載の不死化細胞。
- 組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:3に対し少なくとも95%の核酸配列同一性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の不死化細胞。
- 組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列がSEQ ID NO:3に示されるものである、請求項8記載の不死化細胞。
- 関心対象の物質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の不死化細胞。
- 欠損ウイルスの増殖を可能にする相補カセットをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の不死化細胞。
- 非ウイルスベクターがプラスミド由来のベクターである、請求項1〜11のいずれか一項記載の不死化細胞。
- ウイルスを複製するための、請求項1〜12のいずれか一項記載の不死化細胞の使用。
- ウイルスが、牛痘(Cowpox)ウイルス、エクトロメリア(Ectromelia)ウイルス、サル痘(Monkeypox)ウイルス、ワクシニア(Vaccinia)ウイルス、痘瘡(Variola)ウイルス、およびMVAからなる群より選択される、請求項13記載の使用。
- 関心対象の物質を産生するための、請求項1〜12のいずれか一項記載の不死化細胞の使用。
- ウイルスを作製するための、請求項1〜12のいずれか一項記載の不死化細胞の使用。
- ウイルスがポックスウイルスである、請求項16記載の使用。
- ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項17記載の使用。
- ワクシニアウイルスがMVAである、請求項18記載の使用。
- 組換えウイルスを作製するための、請求項1〜12のいずれか一項記載の不死化細胞の使用。
- トリ細胞を、SEQ ID NO:1に対し少なくとも90%の核酸配列同一性を有するE1A核酸配列、およびSEQ ID NO:3に対し少なくとも90%の核酸配列同一性を有する組換えテロメラーゼ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む非ウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含み、トリ細胞をE1B核酸配列でトランスフェクトする工程を含まない、トリ細胞を不死化する方法。
- ベクターが、細胞ゲノムに存在する配列と相同な2つの配列を含む、請求項21記載の方法。
- E1A核酸配列が前記相同配列に囲まれている、請求項22記載の方法。
- ベクターが第1の選択マーカーをさらに含み、第1の選択マーカーが正の選択マーカーであり、第1の選択マーカーが前記相同配列に囲まれている、請求項22または23記載の方法。
- 第1の選択マーカーが、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列に囲まれている、請求項24記載の方法。
- 第1の選択マーカーが、抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする、請求項24または25記載の方法。
- ベクターが、前記相同配列に囲まれていない第2の選択マーカーを含み、該選択マーカーが負の選択マーカーである、請求項24〜26のいずれか一項記載の方法。
- ベクターが第3の選択マーカーを含み、第3の選択マーカーが負の選択マーカーであり、第3の選択マーカーが、第1の選択マーカーの抑制を可能にする配列の間に位置する、請求項25〜27のいずれか一項記載の方法。
- 負の選択マーカーが、以下からなる群より選択される自殺遺伝子である、請求項27または28記載の方法;
単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ、チトクロムp450、大腸菌(E.coli)由来プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、大腸菌由来グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、シトシンデアミナーゼ(CDase)、FCU1、およびFCU1-8遺伝子。 - 第1の選択マーカーが組み込まれている細胞のみを増殖させる培地において細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項24〜29のいずれか一項記載の方法。
- 第2の選択マーカーが組み込まれている細胞を増殖させない培地において細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
- 細胞ゲノムから第1の選択マーカーを排除することを含む工程をさらに含む、請求項28〜31のいずれか一項記載の方法。
- 細胞ゲノムから第1の選択マーカーを排除することを含む工程の後に得られた細胞を、第3の選択マーカーを含む細胞を増殖させない培地において培養する、請求項32記載の方法。
- 細胞がカモ科に属する生物から採取される、請求項21〜33のいずれか一項記載の方法。
- 生物がノバリケン種に属する、請求項34記載の方法。
- 生物がマガモ種に属する、請求項34記載の方法。
- E1A核酸配列が細胞の標的DNA配列に挿入される、請求項21〜36のいずれか一項記載の方法。
- 標的DNA配列がHPRT遺伝子である、請求項37記載の方法。
- 細胞が35回超の継代培養で増殖することができる、請求項21〜38のいずれか一項記載の方法。
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