CN101688182A

CN101688182A - 永生化禽细胞系

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Publication number: CN101688182A
Application number: CN200880023138A
Authority: CN
Inventors: P·埃尔布; M·卡普弗; N·西尔韦斯特雷
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2010-03-31
Also published as: AU2008270317A1; US8361788B2; KR20100035650A; EP2176398A1; KR101528379B1; JP5421250B2; CA2691868A1; RU2010102668A; US8809056B2; US20100197010A1; BRPI0811787A2; ES2618490T3; US20130244246A1; ZA201000251B; AU2008270317B2; TWI614342B; WO2009004016A1; CR11221A; TW200911994A; BRPI0811787B1

Abstract

本发明涉及永生化禽细胞，以及这些细胞制备病毒的用途。本发明的细胞具体用于制备重组病毒载体，所述病毒载体可用于制备治疗动物更具体是人的治疗和/或预防组合物。

Description

永生化禽细胞系

本发明涉及永生化禽细胞系，以及这些细胞在制备病毒中的用途。本发明的细胞具体可用于制备重组病毒载体，其可用于制备治疗动物更具体是人的治疗和/或预防组合物。

真核细胞系是制备病毒疫苗和许多生物技术产品的基础。细胞培养物中的生物产品包括酶，激素，免疫生物物质(单克隆抗体，白介素，淋巴因子)，和抗癌剂。尽管许多更简单的蛋白可利用细菌细胞产生，更复杂的糖基化蛋白质目前必须在真核细胞中制备。

禽细胞多年来已经用于制备病毒载体。例如，用于制备治疗痘症的预防组合物的痘苗病毒在鸡胚纤维母细胞(CEF)上培养。禽细胞非常有用，这是由于许多用于药物组合物中的病毒能在其上复制。更值得注意的是，多种病毒仅能在禽细胞上生长。例如哺乳动物安卡拉病毒(MVA)，其不能在哺乳动物细胞上生长。这种痘病毒通过将痘苗病毒在CEF上传代500次获得，用于17世纪早期对免疫缺陷人群进行接种以对抗痘症。现在MVA主要用作基因治疗目的的载体。例如，MVA用作MUC1基因的载体用于接种病人对抗表达该抗原的肿瘤(Scholl et al.，2003，J Biomed Biotechnol.，2003，3，194-201)。携带编码HPV抗原的基因的MVA也用作载体用于治疗禽肉瘤。最近，MAV作为可选载体来制备针对新出现的疾病或可能的生物武器诸如西尼罗河病毒和炭疽的预防性治疗。

因此，对病毒制备的需要不断增长。目前，最有用的MVA生产方法包括在CEF上的病毒复制步骤。但是CEF的应用有很多困难。首先，CEF的制备包括很多必须人工进行的步骤。

此外，该病毒制备方法有赖于卵的可用性，在繁殖污染的情况下可能完全破坏。这个问题与禽流感播散越来越相关。

此外，许多CEF具有逆转录酶活性(RT)。RT是逆转录酶复制所需的酶。逆转录病毒见于许多不同物种。RT在人或动物中不是感染性的，并且不导致人中的任何不良健康影响。利用高度敏感的基于聚合酶链式反应(PCR)的测定法，在利用鸡胚纤维母细胞生产的疫苗中检测到微量的RT活性。该酶的来源很可能是编码RT的部分病毒基因组，据信在数百甚至数千年之前整合到鸡细胞中。产生这种酶的禽逆转录病毒不影响人。虽然人免疫缺陷病毒(HIV，导致AIDS的病毒)是逆转录病毒，疫苗中检测的RT活性绝对不是源自HIV的。此外，RT的检测不能确定逆转录病毒的存在。然而，没有内源性RT活性的细胞系是感兴趣的。

为了使得病毒制备过程不受CEF使用的约束，需要允许病毒复制和产生的禽细胞系。永生化细胞系可在生产位点在不同批次中保持或冷冻，并总是可用于新的制备过程。此外，它们还局限在生产工厂，不容易收到外源污染物的污染。它们的使用允许制备过程所需的人工操作明显减少。所有这些性质导致价格降低、生产持续时间缩短以及潜在污染减少。

最后，细胞系可充分表征并且由此完全符合良好的实验室操作以及不同药剂的要求。

不同禽细胞系已经被描述。例如DF1(US5,879,924)，是自发永生化鸡细胞系，其衍生自10日龄East Lansing Line(ELL-0)卵。所述细胞可用作病毒增殖，重组蛋白表达和重组病毒产生的基质。然而，该细胞系容易被多种病毒感染，所述病毒诸如Meleagrid疱疹病毒1(火鸡疱疹病毒)，鸡痘病毒，呼肠病毒，禽肉瘤白血病病毒和劳斯肉瘤病毒。

永生禽细胞也可通过逐步从生长因子和喂养层分开而衍生自胚胎干细胞，由此保持生长特征以及模糊的未分化干细胞的寿命特征。该方法衍生的唯一的可得禽细胞系是Ebx鸡细胞系(WO2005007840)，其与鼠源喂养层接触，导致另外的调节问题诸如鼠病毒污染和鸡细胞中内源逆转录病毒序列的存在。此外，该细胞系在一些条件下不稳定并且易于分化。

鸭胚永久细胞系，不包含内源性禽逆转录病毒，也被建立。该细胞系称为DEC 99(Ivanov et al.Experimental Pathology And Parasitology，4/2000Bulgarian Academy of Sciences)，已经连续培养超过140代，并且对于鸟类而言是非致瘤性的。DEC 99细胞系是研究用标准细胞培养系统，可用于生物技术中。该细胞系是研究细胞生物学，病毒需，免疫学，毒理学的标准模型，并用于制备诊断剂和疫苗。永久鸭胚细胞系(CL)DEC 99对胚-适应禽痘病毒(embryo-adapted avian poxvirus)(APV)疫苗株的易感性已经被研究(Ivanov et al.Experimental Pathology.And Parasitology，4/6 2001 BulgarianAcademy of Sciences)。禽和鸽子来源的FK和Dessau疫苗株已被使用。病毒株在原代鸭胚细胞培养物(CC)上连续传代(13代)。适应的病毒株在DEC99细胞系的CC上进一步传代(12代)，观察到典型的细胞病变效应(CPE)。感染性病毒粒子的产生通过接种11-日龄白色来亨鸡胚来检查，在绒毛尿囊膜(CAMs)上形成典型的痘增殖。在DEC 99细胞中，FK株导致早期CPE，与Dessau株形成对比，并达到滴度106,25CCID50/ml。接种2月龄雏鸡后，DEC 99-适应的病毒株诱导常见的表皮病变(“takes”)。因此DEC 99作为标准CC系统适合抗禽痘疫苗的制备。但是这种具体的细胞系在第40代之后生长缓慢并不能悬浮生长。

人腺病毒5的早期区域的核酸序列已经用于体外转化一些特定的人细胞(293和PER.C6细胞系；Fallaux，F.J.et al.，Hum.Gene Ther.9：1909-17(1998)；Graham，F.L.et al.，J.Gen.Virol.36：59-74(1977))。

通常而言，腺病毒基因组由大约36kb的双链线性DNA分子组成，其中包含编码超过30个蛋白的序列。在每个末端，根据血清型不同，存在作为100-150个核苷酸的短反向序列的ITR(反向末端重复)。ITR参与腺病毒基因组复制。大约300个核苷酸的衣壳化区域位于基因组5’末端紧接着5’ITR之后。

早期基因分布在分散于腺病毒基因中的4个区域中，称为E1-E4(E表示早期)。早期区域包含至少6个转录单位，其具有自己的启动子。早期基因的表达是自我调节的，一些基因在其他之前表达。三个区域E1，E2和E4，对于病毒复制必不可少。因此，如果腺病毒的一个或这些功能有缺陷，意味着其不能产生至少一种这些区域之一编码的蛋白，该蛋白将需要反式供给该病毒。

E1早期区域位于腺病毒基因组5’末端，含有2个病毒转录单元，分别为E1A和E1B。该区域编码非常早地参与病毒循环并对于腺病毒的几乎所有其他基因的表达必不可少的蛋白。具体地，E1A转录单元编码反式激活其他病毒基因的转录的蛋白，包括自E1B，E2A，E2B和E4区域的启动子的转录。

Guilhot et al.(Guilhot，C.et al.，Oncogene 8：619-24(1993))显示，Ad5的E1A的12S蛋白的逆转录病毒转导可导致鹌鹑细胞的永生。但是，WO2005042728公开了不可能在E1A基因通过裸露DNA的转染取代逆转录病毒转染而导入时永生化禽细胞。WO2005042728中还称：”经由逆转录病毒感染的极其有效和稳定的转导产生大到足以容纳具有自发基因组改变的单个细胞的细胞池，所述改变阻断了在视网膜母细胞瘤失活时通常诱导的凋亡.”(第10页)。

逆转录病毒序列在Guilhot等所得细胞中的存在阻碍了所述的细胞在制备生物产品更具体为治疗性化合物中的用途。

发明人吃惊地发现禽细胞具体是番鸭(cairina moschata)细胞可有效通过非病毒载体的E1A转染永生化。

为了解决与CEF使用和/或之前可得细胞系的使用有关的不同问题，本发明提供了包含E1A核酸序列的永生化禽细胞，所述细胞通过包括用非病毒载体转染细胞的步骤的方法获得，所述载体包含所述E1A核酸序列，并且其中所述细胞不包含E1B核酸序列。

本发明还涉及永生化禽细胞的方法，包括用非病毒载体转染所述细胞的步骤，所述载体包含E1A核酸序列，并且所述方法不包括用E1B核酸序列转染所述细胞的步骤。

永生化细胞，如本发明所述，指能在培养中生长超过35代的细胞。

术语传代数指细胞群体从培养容器中取出并经过传代培养从而使得细胞密度足够低以刺激进一步的生长的次数。

本发明中所用术语“一个”和“一种”指所述的组分或步骤为“至少一个”，“至少第一个”，“一或多个”或“多个”，除非另有明确说明。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

术语“和/或”在使用时包括“和”，“或”，以及“所有或任何其他与该术语相关元素的组合”。

本发明术语“包含”意图指所述产品，组合物和方法包括参考的组分或步骤，但不排除其他。“基本上由......组成”用于限定产品，组合物和方法时，表示排除任何必不可少的其他组分或步骤。因此基本上由所述组分组成的组合物不排除微量污染物以及可药用载体。“由......组成”表示排除超过微量的其他组分或步骤。

本发明术语“E1A核酸序列”指腺病毒E1A区域的所有基因产物的核酸序列，包括编码两种主要RNA：13S和12S的核酸序列。

术语“E1A核酸序列”指下述核酸序列，其包含与SEQ ID NO：1具有至少60％氨基酸序列相同性的核酸序列。本发明优选实施方案中，E1A指这样的核酸序列，其包含与SEQ ID NO：1具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％核酸序列相同性的核酸序列。更优选的实施方案中，E1A指核酸序列SEQ ID NO：1。

本发明术语“E1B核酸序列”指腺病毒E1B区域的所有核酸序列，包括编码19kd和55kd的三种主要多肽的核酸序列。

本发明术语“基本相同的核酸序列”指与参比多核苷酸具有足够相同性的核酸分子，从而其将在中度严格杂交条件下与参比核苷酸杂交。一个实施方案中，核酸分子具有与参照核苷酸序列SEQ ID NO：1基本相同核苷酸序列。

杂交指核酸互补链通过氢键相互结合(即有义：反义链或探针：靶DNA)，所述的氢键类似染色体DNA中天然存在的键合。杂交给定探针与靶DNA的严格程度可由本领域技术人员轻易确定。

术语“严格杂交”指使得多聚核酸杂合子稳定的条件。本领域技术人员已知，杂合子的稳定性受杂合子熔解温度(Tm)的影响。通常，杂合子稳定性是钠离子浓度和温度的函数。通常，杂合反应在低严格条件下进行，然后在可变但较高的严格条件下洗涤。杂合严格度也涉及所述洗涤条件。

本发明术语“中度严格杂交”指允许靶-DNA结合互补核酸的条件，所述核酸与靶DNA具有大约60％相同性，优选大约75％相同性，更优选大约85％相同性，特别优选与靶DNA具有大约90％相同性。优选的高度严格条件是等同在50％甲酰胺，5*Denhart′s溶液，5*SSPE，0.2％SDS中，在42℃杂交，然后在0.2*SSPE，0.2％SDS，在65℃洗涤的条件。

本发明术语“非病毒载体”指质粒来源的载体，可选所述载体与一或多种改善转染效率和/或所述载体稳定性和/或针对宿主生物体免疫系统的对所述载体的体内保护的物质组合。这些物质在本领域已知的文献中广泛记载(见例如Feigner et al.，1987，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121；Hodgson and Solaiman，1996，Nature Biotechnology 14，339-342；Remy et al.，1994，Bioconjugate Chemistry 5，647-654)。作为举例而非限制，它们可以是多聚物，脂质，具体是阳离子脂质，脂质体，核蛋白或中性脂质。这些物质可单独使用或组合使用。所述化合物的例子具体见于专利申请WO 98/08489，WO 98/17693，WO 98/34910，WO 98/37916，WO 98/53853，EP 890362或WO 99/05183。已知的组合例如质粒重组载体与阳离子脂质(DOGS，DC-CHOL，spermine-chol，spermidine-chol等)和中性脂质(DOPE)的组合。

用于本发明的质粒的选择很广泛。它们可以是克隆和/或表达载体。通常，其为本领域已知的并且多数是可购得的，但可构建它们或通过遗传工程化技术修饰它们。例如，衍生自pBR322(Gibco BRL)，pUC(Gibco BRL)，pBluescript(Stratagene)，pREP4，pCEP4(Invitrogene)或p Poly(Lathe et al.，1987，Gene 57，193-201)的质粒。优选，本发明的质粒含有保证在制备细胞和/或宿主细胞中复制开始的复制起点(例如，ColE1起点可根据意图在大肠杆菌中制备的质粒选择，并且如果需要在哺乳动物宿主细胞中自主复制可选择oriP/EBNA1系统，Lupton and Levine，1985，Mol.Cell.Biol.5，2533-2542；Yates et al.，Nature 313，812-815)，其可包含额外的改善其在给定细胞中的保持和/或稳定性的元件(cer sequence which promotes themonomeric maintenance of a plasmid(Summers and Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103，sequences for integration into the cell genome)。

术语“非病毒载体”排除了病毒载体，诸如例如来自痘病毒(痘苗病毒，具体是MVA，金丝雀痘等)、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、甲病毒、泡沫病毒或腺伴随病毒的载体。

本发明还涉及衍生自本发明细胞的细胞。术语“衍生”指从本发明的细胞发展或分化而来或其祖先为本发明的细胞的细胞。

本发明术语“转染的”是指本发明细胞的稳定转染或瞬时转染。

术语“稳定转染”或“稳定转染的”指外来核酸序列导入和整合进入转染细胞的基因组。术语“稳定转染物”具有稳定整合入基因组DNA的外来DNA的细胞。

根据本发明优选的实施方案，本发明的禽细胞源自鸭科或雉科的细胞。在鸭科中，优选番鸭(Cairina)或鸭(Anas)。更优选，本发明的细胞属于番鸭(Cairina moschata)或绿头鸭(Anas platyrhynchos)。

优选，本发明的细胞取自胚生物体。允许从存活生物体分离细胞的方法是本领域已知的。例如，使用实施例2中公开的方法。根据本发明的优选实施方案，原代细胞分离自鸭科的胚胎，其为1-20日龄，优选5-15日龄，更优选11-14日龄。

根据本发明的优选实施方案，E1A核酸序列插入本发明细胞的靶DNA序列。

本发明术语″靶DNA序列″是细胞基因组内预先确定的区域，其被靶向以通过与载体的同源重组进行修饰。靶DNA序列包括结构基因(即在真核细胞的情况下编码包含内含子和外显子的编码多肽的DNA序列)，调节序列诸如增强子序列，启动子等以及目的基因组中的其他区域。靶DNA序列也可为在被载体靶向时对于宿主基因组功能没有影响的序列。

术语“插入靶DNA序列”广泛指同源重组过程，其导致永生化基因的插入被引入靶DNA序列的缺失或断裂中。

为了产生E1A核酸序列被插入靶DNA序列中的永生化禽细胞，本发明过程中所用载体还可包含两个能与靶DNA序列的区域同源重组的同源序列，其对于所述细胞基因组的基因组而言是天然的。

所述同源序列的存在允许本发明核酸分子通过同源重组位点特异性插入靶DNA序列中。

术语“同源重组”指两个DNA分子在基本相同的核苷酸序列的位点的DNA片段交换。根据本发明的具体实施方案，载体内包含与靶DNA序列中所含许乐部分同源的序列。本发明的优选实施方案中，转移载体中的同源序列与靶序列的区域百分之百同源。然而，可使用较低的序列同源性。因此，可使用低如80％的序列同源性。

转移载体中的同源序列包含至少25bp，优选更长的区域，至少500bp，更优选至少5000bp。

根据本发明更加优选的实施方案，核酸分子被载体中的同源序列包围。

本发明中“包围”指同源序列之一位于本发明核酸分子上游，并且同源序列之一位于本发明核酸分子的下游。本发明中“包围的”不一定指两个同源序列直接连于永生化基因的3’或5’末端，所述永生化基因和同源序列可被非限制数目的核苷酸分离。

本领域技术人员能选择适当的同源序列以将特定DNA分子定向于待永生化细胞的基因组中。例如，一个同源序列可与靶向序列的部分同源，其中另外的同源序列与位于靶序列上游或下游的DNA序列同源。根据另一实例，同源序列之一与靶DNA序列上游的DNA序列同源，其中另外的同源序列与位于靶DNA下游的DNA序列同源。另一实例中，两条同源序列均与位于靶DNA序列中的序列同源。

根据本发明的优选实施方案，靶DNA序列是HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)基因。

包含HPRT启动子和番鸭HPRT基因的基因组序列示于SEQ ID NO：2。编码HPRT的序列起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置8695中的ATG密码子，该ATG密码子上游序列是HPRT启动子序列。

本领域技术人员能选择E1A核酸序列整合入HPRT基因所需的同源序列。在某一科的各个成员中，编码HPRT的基因组序列高度同源，本领域技术人员也能涉及将HPRT基因靶向每个禽细胞所需的同源序列。

根据本发明更优选的实施方案，同源序列经定制以将E1A核酸序列插入细胞HPRT启动子下游。该具体实施方案中，本发明的核酸分子可操作连接于细胞内源HPRT启动子。“可操作连接于”指E1A核酸序列以允许其在细胞中表达的方式连接于所述启动子。

根据该具体的实施方案，本发明核酸分子上游的同源序列优选具有这样的核酸序列，其与起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置1核苷酸、终止于位置8694的核酸序列的至少500连续bp更优选至少5000连续bp同源，前提是所述同源序列不与起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置8695核苷酸、终止于位置26916的核酸序列同源。此外，该上游同源序列优选直接连接于E1A核酸序列的起始密码子。根据本发明更加优选的实施方案，本发明核酸分子上游的同源序列由起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置1核苷酸、终止于位置8694核苷酸的核酸序列组成。位于E1A核酸序列下游的同源序列，优选具有与起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置10580核苷酸、终止于位置18009核苷酸的核酸序列的至少500连续bp同源、更优选至少5000连续bp同源的核酸序列。更优选，所述位于E1A核酸序列下游的同源序列由起始于SEQ ID NO：2所示核酸序列的位置10580核苷酸、终止于位置18009核苷酸的核酸序列组成。

因此，本发明还涉及包含E1A核酸序列的禽细胞，所述细胞通过包括用包含所述E1A核酸序列的非病毒载体转染细胞的步骤的方法获得，其中所述细胞不包含E1B核酸序列并且其中所述E1A核酸序列可操作连接于细胞内源HPRT启动子。

根据优选的实施方案，本发明方法中所用载体包含第一选择标记，其中哦咯所述第一选择标记是阳性选择标记并且其中所述第一选择标记被包含在所述载体中的同源序列包围。在该方面，出现于所述载体和所述细胞的基因之间的同源重组过程导致E1A核酸序列和第一选择标记的整合。当转移载体是环状时，“包围的”意指所述第一选择标记和E1A核酸序列位于载体的相同部分中，所述部分被同源序列限定。

术语阳性选择标记意指编码仅能使携带所述基因的细胞存活和/或在特定条件下生长的产物的基因。常见选择标记编码赋予抗生素或其他毒素例如氨苄西林、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，互补营养缺陷型缺陷或提供复合培养基不能提供的关键营养的蛋白。本发明优选实施方案中，第一选择标记编码赋予抗生素抗性的蛋白。

第一选择标记的整合允许选择已经掺入E1A核酸序列的细胞。因此，部分的方法可进一步包含这样的步骤，其中所述细胞培养在仅允许包含所述第一选择标记的细胞生长的培养基中。例如，在包含抗生素的培养基中。

根据本发明更优选的实施方案，载体中的第一选择标记被允许其抑制的序列包围。所述允许已知第一选择标记的序列不包围E1A核酸序列。当载体为环状是，允许第一选择标记已知的序列，第一选择标记和E1A核酸序列位于转移载体的相同部分，所述部分通过同源序列限定。

允许核酸序列片段已知的序列是本领域已知的(Nunes-Duby，S.et al(1998)Nucleic Acids Res.26：391-406)。这些序列可被一或多个特异性酶识别，其诱导包含在所述序列之间的核酸的抑制，这些酶称为“重组酶”。例如，三种允许核酸片段抑制的已知重组酶是FLP，ISCE1和Cre重组酶。

常见的位点特异性重组酶是Cre重组酶。Cre是噬菌体P1的cre(环化重组)基因的38-kDa产物，并且是Int家族的位点特异性DNA重组酶。Sternberg，N.et al.(1986)J.Mol.Biol.187：197-212。Cre识别P1基因组上的称为loxP的34-bp位点(P1的X-over的基因座)并有效催化loxP位点之间的相互保守DNA重组。loxP位点由两个侧接8-bp非重复核心区域的13-bp倒置重复组成。两个直接重复loxP位点之间的Cre介导的重组导致它们中间的DNA作为共价闭合环被切除。方向倒置的loxP位点对之间的Cre-介导的重组将导致插入DNA的倒转而非切除。DNA的断裂和连接限制于核心区域中的离散位置并且与通过酶的瞬时磷酸酪氨酸DNA-蛋白连接每次同时发生而进行下去。

另一种位点特异性重组酶是I-SceI。其他内含子归巢内切核酸酶，例如I-TliI，I-CeuI，I-CreI，I-PpoI和PI-PspI，也可替代本发明方法中的I-SceI。许多在Belfort and Roberts((1997)Nucleic Acids Research 25：3379-3388)中列出。这些内切核酸酶中的许多源自细胞器基因组，其中密码子使用与标准细胞核密码子使用不同。为使用所述基因从而对其内切核酸酶进行细胞核表达，可能需要改变编码序列来匹配细胞核基因的编码序列。I-SceI是双链内切核酸酶，其在DNA识别位点内进行切割。I-SceI产生4bp交错切割物，其具有3′OH突出端。

酶I-SceI具有已知的识别位点。I-SceI的识别位点是非对称序列，长度超过18bp。

5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′

3′ATCCCTATTGTCCCATTA5′

另一位点特异性重组酶是FLP重组酶。Flp重组酶识别独特的34-bp最小位点，其仅仅耐受其识别序列的有限简并(Jayaram，1985；Senecoffet al.，1988)。已经检测了Flp重组酶和FRT序列之间的相互作用(Panigrahi et al.，1992)。变体FRT序列的实例见于Jayaram(1985)and Senecoffet al.(1988)，不同基质上Flp介导的重组的测定见于Snaith et al.(1996)。

因此，本发明的方法还可包括抑制来自所述原代细胞基因组的第一选择标记的步骤。为了已知所述第一选择标记，用编码允许抑制所述第一选择标记的序列的特异性重组酶的基因转染细胞。能将所述基因转染进入细胞的方法和载体是本领域已知的，例如，本发明实施例4中公开的方法可使用。之前描述的载体也可使用。

根据优选实施方案，用于该方法的载体包含第二选择标记，其不被所述同源序列包围，其中所述第二选择标记是阴性选择标记。所述第二选择标记在根据本发明的方法中使用的载体是环形时尤其有用。所述第二选择标记的存在允许破坏细胞，其中同源重组过程导致转移载体中不包含E1A核酸序列的部分的引入。当所述载体是环形时，第二选择载体不被所述同源序列包围的事实意味着所述第二选择载体和E1A核酸序列不位于所述转移载体的相同部分中，所述部分被所述同源序列所限定。

因此，本发明的方法还可包含其中将细胞培养在仅允许不包含所述第二选择标记的细胞生长的培养基中的步骤。所述步骤可与将所述原代细胞培养在仅允许包含所述第一选择标记的细胞生长的培养基中的步骤同时或分开进行。

根据本发明的一个优选实施方案，所述载体包含第三选择标记，其中所述第三选择标记是阴性选择标记并且其中所述第三选择标记位于允许抑制所述第一选择标记的序列之间。这表明抑制第一选择标记的步骤将也导致抑制第三选择标记。第三选择标记的存在允许破坏其中存在第一选择标记的细胞。当载体是环形时，第三选择标记位于允许抑制第一选择标记的序列之间的事实意味着所述第三选择标记和第一选择标记位于转移载体的相同部分，所述部分通过允许抑制第一选择标记的序列限定。

本发明术语阴性选择标记意指编码在一定条件下杀死携带该基因的细胞的产物的基因。这些基因包含“自杀基因”。这些基因编码的产物能转化细胞毒化合物中的前药。多种自杀基因/前药对是目前已知的。具体如下：

-I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-1 TK)和阿昔洛韦或更昔洛韦(GCV)(Caruso et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7024-7028；Culver et al.，1992，Science 256，1550-1552；Ram et al.，1997，Nat.Med.3，1354-1361)；

-细胞色素p450和环磷酰胺(Wei et al.，1994，Human Gene Therapy 5，969-978)；

-大肠杆菌(E.coli)嘌呤核苷酸磷酸化酶和6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷(Sorscher et al.，1994，Gene Therapy 1，233-238)；

-大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和6-硫代黄嘌呤(Mzoz and Moolten，1993，Human Gene Therapy 4，589-595)和

-胞嘧啶脱氨酶(CDase)和5-氟胞嘧啶(5FC)；

-FCU1和5-氟胞嘧啶(5FC)(WO9954481)；

-FCU1-8和5-氟胞嘧啶(5FC)(WO2005007857)。

所述第三选择标记允许选择其中发生第一选择标记抑制的细胞。因此，本发明的方法还可包含将所述细胞培养在不允许包含第三选择标记的细胞生长的培养基中的步骤。例如，不允许包含作为第三选择标记的FCU1的细胞生长的培养基包含5-氟胞嘧啶。

所述第一、第二和第三选择标记可分开使用。例如用于本发明方法中的载体可包含所述第一和第三选择标记但不包含第二选择标记，或包含第二和第三选择标记但不包含第一选择标记。

根据本发明优选的实施方案，E1A核酸序列，第一、第二和/或第三选择标记在它们的表达在细胞中永生化所需的元件的控制下。

表达所需的元件由一组允许核苷酸序列转录为RNA以及mRNA翻译成多肽的元件组成，具体是在所述细胞中有效的启动子序列和/或调节序列，可选允许分泌到所述多肽的靶细胞表面或在所述表面表达的序列。这些元件可调节或为构成型的。当然，所述启动子经改造适合选定的载体和宿主细胞。例如，下述基因的真核启动子：PGK(Phospho Glycerate Kinase)，MT(metallothionein；Mclvor et al.，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)，α-1抗胰蛋白酶，CFTR，下述物质的启动子：编码肌肉肌酸激酶的基因，肌动蛋白肺表面活性剂，免疫球蛋白或β3-肌动蛋白(Tabin et al.，1982，Mol.Cell Biol.2，416-436)，SRα(Takebe et al.，1988，Mol.Cell.8，466-472)，SV40病毒(猿猴病毒)早期启动子，RSV(劳斯肉瘤病毒)LTR，MPSV启动子，TK-HSV-1启动子，CMV病毒(巨细胞病毒)早期启动子。巨细胞病毒(CMV)早期启动子尤其优选。

本发明更具体涉及，但不限于永生化细胞的方法，包括以下步骤：

-将载体转移入禽细胞中，其中所述载体包含：

■同源序列包围的E1A核酸序列，

■第一选择标记，其中所述第一选择标记是阳性选择标记且其中所述第一选择标记被所述同源序列包围，

■允许抑制所述第一选择标记的序列，

■第二选择标记，其不被所述同源序列包围，其中所述选择标记是阴性选择标记，

■第三选择标记，其中所述第三选择标记是阴性选择标记和其中所述第三选择标记位于允许抑制所述第一选择标记的序列之间，

-在仅允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养所述细胞，

-在不允许包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养所述细胞，

-将所述第一选择标记从所述细胞的基因组去除，

-在不允许包含第三选择标记的细胞生长的培养基中培养所述细胞。

本发明的细胞还可包含允许缺陷病毒增殖的一或多个核酸序列。“缺陷病毒”指其中一或多个复制必须的病毒基因被缺失或被无功能化的病毒。术语“允许缺陷病毒增殖的核酸序列”指反式提供允许缺陷病毒复制的功能的核酸序列。换言之，所述核酸序列编码所述缺陷病毒复制和衣壳化所需的蛋白。

本发明的细胞还可包含编码目的物质的核酸序列。本发明中目的物质可包括但不限于药物活性蛋白，例如生长因子，生长调节子，抗体，抗原，其用于免疫或接种的衍生物等，白介素，胰岛素，G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF或其组合，干扰素，例如干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，凝血因子，例如因子VIII，因子IX，或tPA或其组合。“目的物质”也指工业用酶，例如用于纸浆和纸，纺织品改性，或乙醇制备。最后“目的物质”还指蛋白补充剂或动物饲料的增值(value-added)产品。

根据本发明的优选实施方案，本发明的细胞还包含编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列，更优选，所述重组端粒酶逆转录酶描述于EP 06 360047.2。EP 06 36 0047.2描述的更优选的实施方案中，编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列与EP 06 36 0047.2的核酸序列SEQ ID NO：2具有至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％核酸序列相同性。EP 06 36 0047.2中优选编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列是EP 06 36 0047.2的SEQ ID NO：2。EP 06 36 0047.2中的端粒酶逆转录酶核酸序列SEQ ID NO：2对应本发明的端粒酶逆转录酶核酸序列SEQ ID NO：3。因此，根据本发明的优选实施方案，本发明的细胞也包含编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列，更优选编码与SEQ ID NO：3具有至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％核酸序列相同性的重组端粒酶逆转录酶的核酸序列。更优选，编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列是SEQ ID NO：3(dTERT)。

本发明的方法获得的细胞，本发明的细胞和衍生自所述细胞的细胞可用于病毒复制。所述病毒可为活、减毒、重组或非重组的病毒。更优选，所述细胞尤其可用于痘病毒(痘苗病毒，具体是MVA，金丝雀痘病毒等)，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，甲病毒，泡沫病毒或腺伴随病毒的复制。

逆转录病毒具有感染性质，在大多数情况下整合进入分裂中的细胞，并且在该方面尤其适合用于癌症相关用途。重组逆转录病毒通常包含LTR序列，衣壳化区和本发明的核苷酸序列，其位于逆转录病毒LTR或内部启动子诸如下述那些的控制之下。逆转录病毒载体可包含修饰，具体在LTR(用真核启动子取代启动子区域)或衣壳化区(用异源衣壳化区域取代，例如VL30型)中(见法国申请94 08300和97 05203)。

腺病毒载体可缺乏所有或部分复制必需的至少一个区域，其选自E1，E2，E4和L1 L5区。E1区的缺失是优选的。然而，其可与其他修饰/缺失组合，具体是所有或部分E2，E4和/或L1 L5区。例如，E1区的主要部分和E4转录单元的缺失非常有利。为了增加克隆能力，腺病毒载体还可缺失所有或部分非必需E3区。根据另一方案，可使用最小腺病毒载体，其保持衣壳化必需的序列，即5′和3′ITR(反向末端重复)，和衣壳化区。各种腺病毒载体，以及制备它们的方法，是已知的(见例如，Graham and Prevect，1991，inMethods in Molecular Biology，Vol 7，p 109128；Ed：E.J.Murey，The HumanPress Inc)。

痘病毒科包含Chordopoxvirus和昆虫痘病毒亚科的病毒。其中，本发明的痘病毒优选选自以下病毒组成的组：正痘病毒，副痘病毒，鸡痘病毒，骆驼痘病毒(capripoxviruses)，兔痘病毒，猪痘病毒(Suipoxviruses)，软疣痘病毒(Molluscipoxviruses)，亚塔痘病毒(Yatapoxviruses)。根据更优选的实施方案，本发明的痘病毒是正痘病毒。

正痘病毒优选是痘苗病毒并且优选是修饰的痘苗病毒安卡拉株(MVA)，具体是MVA 575(ECACC V00120707)和MVA-BN(ECACCV00083008)。

术语“重组病毒”指其基因组中包含插入的外源序列的病毒。本发明中，外源序列指不天然存在亲代病毒中的核酸。

一个实施方案中，外源序列编码具有直接或间接细胞毒性功能的分子。“直接或间接”细胞毒性意指外源序列编码的分子自身可具有毒性(例如蓖麻蛋白，肿瘤坏死因子，白介素-2，干扰素-gamma，核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，假单胞菌外毒素A)或其可被代谢形成毒性产物，或其可作用于其他物质形成毒性产物。蓖麻蛋白cDNA序列公开于Lamb et al(Eur.J.Biochem.，1985，148，265-270)，包含在内作为参考。

本发明的一个优选实施方案中，外源序列是自杀基因。自杀基因编码能将相对无毒的前药转化为毒性药物的蛋白。例如，胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5FC)转化为5-氟尿嘧啶(5FU)(Mullen et al(1922)PNAS 89，33)；单纯疱疹胸苷激酶使得细胞对利用抗病毒剂更昔洛韦(GCV)或阿昔洛韦的治疗敏感(Moolten(1986)Cancer Res.46，5276；Ezzedine et al(1991)New Biol3，608)。任何生物体例如大肠杆菌或酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶可使用。

因此，本发明更优选的实施方案中，所述基因编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白，更优选专利申请WO2005007857和WO9954481所述的蛋白。

另一实施方案中，所述外源基因编码能裂解靶向RNA或DNA的核酶。待裂解的靶向RNA或DNA可为对于细胞功能必不可少的RNA或DNA并且其裂解导致细胞死亡，或待裂解RNA或DNA可为编码不需要的蛋白的RNA或DNA，例如癌基因产物，该RNA或DNA的裂解可防止细胞癌变。

另一实施方案中，外源基因编码反义RNA。

“反义RNA”意指这样的RNA分子，其与与编码蛋白的mRNA分子杂交并干扰自所述mRNA分子的表达，或者其与细胞内的其他RNA分子诸如前-mRNA或tRNA或rRNA杂交，或与基因杂交并干扰其表达。

本发明的其他实施方案中，外源序列取代靶细胞中缺陷基因的功能。哺乳动物包括人有数千种遗传基因病，其由缺陷基因导致。所述基因疾病的实例包括囊性纤维化，其已知存在CFTR基因中的突变；Duchenne肌营养不良症，其已知在肌营养不良蛋白基因中存在突变；镰状细胞病，其已知存在HbA基因中的突变。许多类型的癌症由缺陷基因导致，具体是原癌基因，以及经历突变的肿瘤抑制基因。

原癌基因的实例是ras，src，bcl等；肿瘤抑制基因的实例是p53和Rb。

本发明的另一实施方案中，外源序列编码肿瘤相关抗原(TAA)。TAA指以在肿瘤细胞中检出的频率或密度高于相同组织类型的非肿瘤细胞中的情况的分子。TAA的实例包括但不限于CEA，MART-1，MAGE-1，MAGE-3，GP-100，MUC-1，MUC-2，点突变的ras癌基因，正常或点突变的p53，过表达的p53，CA-125，PSA，C-erb/B2，BRCA I，BRCA II，PSMA，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，NY-ESO-1，TAG72，KSA，HER-2/neu，bcr-abl，pax3-fkhr，ews-fli-1，surviving和LRP。更优选的实施方案中TAA是MUC1。

重组病毒可包含超过一个外源序列，每个外源序列可编码超过一个分子。例如，可在相同的重组痘病毒中将编码TAA的外源序列与编码细胞因子的外源序列相连。

本发明另一实施方案中，所述外源基因编码抗原。“抗原”在这里指可与抗体结合的配体；抗原本身不必是免疫原性的。

优选抗原来自病毒诸如HIV-1，(诸如gp 120或gp 160)，猫免疫缺陷病毒、人或动物疱疹病毒中任一种，诸如gD或其衍生物或立即早期蛋白诸如ICP27，其来自HSV1或HSV2，巨细胞病毒(诸如gB或其衍生物)，水痘带状疱疹病毒(诸如gpI，II或III)，或来自肝炎病毒诸如乙型肝炎病毒例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(优选来自基因型1b株ia的非结构蛋白)和戊型肝炎病毒，或来自其他病毒致病原，诸如呼吸道合胞病毒，人乳头瘤病毒(优选HPV16株的E6和E7蛋白)或流感病毒，或来自细菌致病原诸如沙门菌，奈瑟球菌，疏螺旋体(例如OspA或OspB或其衍生物)，或衣原体，或博德特菌例如P.69，PT和FHA，或来自寄生虫诸如疟原虫或弓形虫。

图1：包含编码E1A核酸序列的基因的载体。

图2：E1A核酸序列向HPRT基因中的位点特异性插入的图示。

图3：从本发明方法获得的永生化细胞的基因组去除第一和第三选择标记的图示。

图4：包含编码番鸭端粒酶逆转录酶基因和E1A核酸序列的基因的载体。

实施例：

实施例1：建立包含E1A核酸序列的永生化禽细胞系

A.质粒构建体

A-1.用于随机插入的质粒构建体

A与番鸭基因组无共同特定同源序列的质粒(质粒E1A)被用于该目的(图1).

A-2.用于靶向插入的质粒构建体

A构建质粒，其包含包围E1A核酸序列(SEQ ID NO：1)的与番鸭HPRT基因同源的两个5kb片段和两个选择标记。编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶的HPRT基因被选择作为组成型表达E1A核酸序列的合适位点。

所述两个选择标记是CMV启动子(Thomsen et al.P.N.A.S.1984.81.3：659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et al.Cancer Res.2000.15.60.：3813-22)和SV40启动子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。新霉素(或嘌呤霉素)抗性和FCU-1表达盒被Scel裂解位点包围，其允许选择盒从最终细胞系的去除。HPRT基因臂之外插入了编码RSV启动子驱动的HSVTK的选择标记(图2)。

B.从番鸭卵制备CEC批次和亚群的描述

B.1从12日龄番鸭卵制备CEC批次和亚群的描述

25个受精SPF卵保温在37.5℃。卵在根据已知方案保温12日后打开。

将23个胚胎切碎，在磷酸缓冲盐水-Dulbecco(PBS)中洗涤一次，在TrypLE Select(Invitrogen)中室温解离5小时。

低速离心之后，细胞重悬于基础Eagle培养基(MBE)，其中补充有10％胎牛血清(FCS)，庆大霉素0.04g/L，在500cm² triple瓶中接种，37℃5％CO₂下保温。

24h后，汇合细胞利用TrypLE Select(5mL/triple瓶)从瓶中取出，部分细胞再接种于175cm²瓶中二次传代。余下细胞在10⁷细胞/mL在适宜培养基中浓缩(60％BME，30％FCS和10％DMSO)，在异丙基醇调节的容器(NALGENE.

“Mr.Frosty”1℃ frezing.Container)中在-80℃冷冻，然后转移到液氮中长期储存，形成初始细胞库(50x1，5.10⁷细胞/瓶，44x1.10⁷细胞/瓶)。

培养中保存的细胞常规传代到第18代，前3代中非结合细胞通过低速离心调节的培养基收集，再接种并以相同方式作为初始培养物再传代。

显示特征性不同形态学特征的亚群在培养基寿命中重复分离。

B.2.从19日龄番鸭卵制备CEC批次和亚群的描述

得自AFFSSA Ploufragan的29个受精SPF番鸭卵在潮湿环境下保温在37.5℃。

19日后打开卵并无菌取出胚胎。20个胚胎经去头、去肢体处理并且肝用于其他细胞制备。胚胎躯干部分被切碎，在PBS Dulbecco(Sigma，Réf.D8537，Lot 46K2428)中洗涤一次，在500mL TrypLE Select(Gibco，Réf.12563，Lots 1319986 and 1339844)中37℃解离2小时。

5分钟2000rpm离心后，细胞重悬于BME(Basal Medium Eagle，Gibco，Réf.41010，Lot 8270)，其中补充有10％胎牛血清(JRH，Réf.12003-1000M，Lot.5A0102，Code TG P4001Q)，庆大霉素0.04g/L和L-谷氨酰胺4mM。终体积1.5L(1.9.10⁶细胞/mL)悬液接种在10个triple瓶(500cm²)中并在37℃5％CO₂保温。

24h后，汇合细胞利用TrypLE Select(5mL/triple瓶)从瓶中取出。细胞经计数，在2000rpm离心4-5分钟。沉淀物以5.10⁶或10⁷细胞/mL在适宜培养基(60％BME，30％FCS和10％DMSO)中浓缩。悬液充满cryovials(Nunc)并在-80℃冷冻，同时在-20℃进行2h的步骤，然后转移到液氮中长期储存，形成CETC19p1初始细胞库(110cryovials，10⁷细胞/瓶)(鸭躯干胚细胞，19日龄胚胎，第1代)。

本发明的优选实施方案中，从番鸭卵制备CEC批次根据备选方案B.2.进行(从19日龄番鸭卵)。

C.转染方法

大量转染方法是本领域已知的，其引入能指导目的核苷酸序列的表达的载体。这些方法的非限制性举例如下：CaPO₄沉淀，电穿孔，lipofectin转染发。给出的实例基于CaPO₄沉淀法。

细胞为大约80-50％汇合。培养基在加入CaPO₄/DNA之前每2小时更换。30μg DNA重悬于31μl 2M CaCl₂-161.3mM Tris pH 7.6。加入H₂O使得终体积为0.5ml。

随后，2个供选方案：

a)每次转染，将0.5ml 2X HEBS分散在15ml无菌Falcon管中，将DNA溶液逐滴加入同时温和涡旋或气泡使得DNA溶液分散开。溶液变为乳状。混合物在室温保持10-30分钟。在组织培养箱中用无菌移液管吸取并放回液体一次从而破坏薄片状物，逐滴施加于细胞。细胞随后在37℃保温6小室到过夜。细微的沉淀物会覆盖细胞表面。为了完成转染，将甘油休克溶液升温至37℃。培养基被吸出，加入5ml BME洗涤细胞层，随后吸出培养基，加入1ml甘油休克溶液2分钟或更短。随后轻柔加入10mlBME稀释甘油，完全去除BME-甘油。随后加入10ml所需培养基，在适宜温度保温板。

或

b)每次转染，将0.5ml 2X HEBS分散在15ml无菌Falcon管中，将DNA溶液逐滴加入同时温和涡旋或气泡使得DNA溶液分散开。溶液变为乳状。混合物在室温保持10-30分钟。在组织培养箱中用无菌移液管吸取并放回液体一次从而破坏薄片状物，逐滴施加于细胞。细微的沉淀物会覆盖细胞表面。细胞随后在37℃保温6小室到过夜。

本发明的优选实施方案中，转染(CaPO₄沉淀)根据方案b)进行。

D.选择方法

D-1.选择随机插入的方法：

转染后施加选择压力48-72小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种于BME，其具有FCS 10％和G418 800μg/mL，优选500μg/mL(并任选更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL)。

细胞连续传代指导单独生长的克隆可被分离。

D-2.选择靶向插入的方法：

转染后施加选择压力48-72小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种于BME，其具有FCS 10％，更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL；和G418 800μg/mL，优选500μg/mL(或嘌呤霉素0.5μg/mL)。

细胞连续传代指导单独生长的克隆可被分离。

细胞克隆随后用大范围核酸酶I-SceI表达质粒根据下述方法转染。

为了消除选择标记，转染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种于具有10^-3-10^-7M的5-FC的培养基中，并保持G418(或嘌呤霉素)/更昔洛韦选择(BME with FCS 10％；5-FC更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL；和G418 800μg/mL，优选500μg/mL(或嘌呤霉素0.5μg/mL)(图3)。

实施例2：建立包含E1A核酸序列和重组端粒酶逆转录酶核酸序列的永生化禽细胞系

A.质粒构建体.

A-1.用于随机插入的质粒构建体

A与番鸭基因组无共同特定同源序列的质粒被用于该目的

A-2.用于靶向插入的质粒构建体

A构建质粒(质粒dTERT-E1A)，其包含包围端粒酶逆转录酶基因(SEQID NO：3)的与番鸭HPRT基因同源的两个5kb片段，E1A核酸序列(SEQ IDNO：1)和两个选择标记。编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶的HPRT基因被选择作为组成型表达E1A核酸序列的合适位点。

所述两个选择标记是CMV启动子(Thomsen et al.P.N.A.S.1984.81.3：659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et.al.Cancer Res.2000.15.60.：3813-22)和SV40启动子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。嘌呤霉素抗性和FCU-1表达盒被Scel裂解位点包围，其允许选择盒从最终细胞系的去除。HPRT基因臂之外插入了编码RSV启动子驱动的HSVTK的选择标记(图4)。

B.从19日龄番鸭卵制备CEC批次和亚群的描述

19日后打开卵并无菌取出胚胎。20个胚胎经去头、去肢体处理并且肝用于其他细胞制备。胚胎躯干部分被切碎，在PBS Dulbecco(Sigma，Réf.D8537，Lot 46K2428)中洗涤一次，在500mL TrypLE Select(Gibco，Réf.12563，Lots 1319986and 1339844)中37℃解离2小时。

C.转染方法

大量转染方法是本领域已知的，其引入能指导目的核苷酸序列的表达的载体。这些方法的非限制性举例如下：CaPO₄沉淀，电穿孔，lipofectin转染发。给出的实例基于电穿孔。

转染利用Amaxa’s Nucleofector装置和Basic Fibroblast kit(Amaxa，CatNO VPI-1002)进行。细胞在700rpm(100g)离心10分钟，重悬于BasicNucleofector溶液(100μL per 10⁶cells)；100μL悬液与3-6μg DNA混合并转移到置于Nucleofector(U-12program)中的样品池中。电穿孔后，样品转移到6cm培养皿，充满5mL培养基，在37℃/5％CO₂保温箱中重平衡。在37℃5％CO₂下保温过夜后，更新培养基继续保温。

D.选择方法

D-1.选择随机插入的方法：

转染后施加选择压力48-72小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种于BME，其具有FCS 10％；更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL和G418 800μg/mL，优选500μg/mL。

细胞连续传代指导单独生长的克隆可被分离。

D-2.选择靶向插入的方法：

转染后施加选择压力48-72小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种于BME，其具有FCS 10％，更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL；和嘌呤霉素0.5μg/mL。

细胞连续传代指导单独生长的克隆可被分离。

为了消除选择标记，转染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小时：细胞用TrypLE select解离，低速离心并再接种具有10^-3-10^-7M的5-FC的培养基中，并保持嘌呤霉素/更昔洛韦选择(BME，具有FCS 10％；5-FC更昔洛韦25μg/mL，优选10μg/mL；和嘌呤霉素0.5μg/mL)。

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cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 180

cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 240

gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 300

cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 360

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gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 480

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aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 600

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atcacctgtg tctagagaat gcaatagtag tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa 840

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agttggtggg cgtcgccagg ctgtggaatg tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca 960

acctttggac ttgagctgta aacgccccag gccataaggt gtaaacctgt gattgcgtgt 1020

gtggtta 1027

<210>2

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<212>DNA

<213>Cairina moschata

<400>2

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caggaggttc tacgataaag ctccagtagg agttgtacca gcgtaattcc tggagggcag 180

caataagtcc accatctaca ctccacaaag tctgatcttt aggtacaaag agctgtgctg 240

atctagaatg atgtggttag actgaatctg gctctaaatt tctgttatta gagtattatg 300

tattattaag taagaggcct tgcttcttac tgctgcctaa atgaagatta actttacagt 360

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caaaggggag gggagtcctg atgggcagtt ccctcccagc ctggcatgcg cttcgtgtct 6000

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tagtgctttt atattaatag gaaactgaac agcaaaataa ttacggaagt tttaattctc 14280

tttttgtagt aagaaggagt aaacaaagag aaaagcagag aaatttacac agaaaggagt 14340

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caaacaatct tttatctgaa ataccatctt tcagtttgat tacttgtaat ttcttagtta 17580

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caaaacaaaa ccaaaaaaaa aaaaaacacc aaagaaccaa ataattagag ttttagaaag 17940

gaaaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaactgta gtgtttcatt taaaatttag gttagaggtt 18000

ggacttgatg atcttgaggt ctcttccaac ctagaaattc tgtgattctg tgattctgta 18060

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aaagagagta gcgttactta ttactgtgtt ggtgtttcat tgcaatagtg aacagagttg 18300

gtactgtcta gacatataac ttgcaggtta gggaataagg gtcctgttac aggcaatgaa 18360

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ggtgtgacaa gacagtacat aactttatag tatgacattc tctgcattat aagaatttaa 18600

aggccacttt gtactcagca tgagatgttg aggcaagtct cattgtcaac taattgtcat 18660

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gactggcaaa agaccttaaa cagaagttgg ttttaagtca gaaatcctac agtttctggt 18960

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catctctgtg tacagtttct ttacaggcat ggagaatgtt gattcctaat ttgcattttg 19380

ataatgctta attcccattt ctctatcttg tcgtggttct ttgatactag gtacaataca 19440

cttcagtctg atttcctagt agctactgtt gcttaaatct tgcttccata cctctttgat 19500

gaacgatgtt gcttacattc agtaagtatg acttttacaa aggatgatct agaataagat 19560

cgctaacttg aggttggcaa agcagaagta ctaaacagga aaaatgaatg tatagaagta 19620

ataatgtctt cagactccaa atagtggaaa tggctttgtc cataagctat ggcaactgat 19680

tcagacacca aatgaaagga tgtttccttc tgtcattaaa tgtgtttttt ttatgtacgt 19740

ctttttttaa tttgagaagg ttatattatt ccataggaaa cacttttgac ctaaactgtt 19800

ttagttcagt tctaaaactc ctaccaaact agtatgtata cagcagtcat ctgtgtgacc 19860

ggtggcgtcc tttgaagtgt atttgcttca gataggcaga tgcatttaat tacgtatctg 19920

ctccatttca gatgaatgta tgtcttcaaa gtcccaggca gctaagtagg ttagtttctc 19980

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ttttgactgt tgtgatcact ttactgagca taattgctta agcacaatat agcgttatgt 20640

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cactaacgct tttgaaaaga cctcagctgg tctggctaga tcccaagttg tcacctcttt 22620

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ctattctcta taccaagggc ttggcactta cagcgtgttg ctctgcagag ctgtcccgca 24480

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tgtggcagtc tgtatgaagt ttcttatctt accagacata tctgcaagaa acaagtgcat 25440

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gaattatcca ccccccttgt catatgctta ctataactta ttgcatgtac aatatacaaa 25980

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ggatagttgc acctttgggt gttataaaac atgaggagca gccagttaca gtatctgtaa 26340

tcaccaagga gctgattcaa gcctcctgga gttgccttat cgctgtaaaa gtccgggtaa 26400

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aagcagaatg tttaaaatct agtttaagtt gagctattca tttcttttgg attttttctt 26520

taaaaatacc catcagacag tgaaattgcc ttttaaattt aaacaatttt aatatatttt 26580

tgaagaagta ttgtaatgtt tactttataa gatctaaaaa acaaaaagta ctttaaataa 26640

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ctcttgaaat tttcttagta atatttttca taagtgtttc tgacagtgaa ggcagactct 26760

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<210>3

<211>3915

<212>DNA

<213>Cairina moschata

<400>3

atggcgggcg cggagccctt cggcgccgtg ctgggcgccc tgcgggactg ctacgcgcag 60

gcggccccgc tggagacctt cctccggggg ctgggggaga gcggcgccga ggaagccgag 120

gtggtgcggg acgacgacgc cgcctgctac cgcaccttcg tgtcccagtg cgtggtgtgt 180

gtcccccacg gcgcccgcga catcccccgg cccttcagct tggagcagtt atctagtcag 240

agcgaagtca tctcaagagt catgcagagg ctgtgtggga aaaagaagaa gaacatcctc 300

acatatggat actccttgct ggatgaaaac agttctcact tccaaatcat gccgctctca 360

aacgtgtaca gctacctgcc caacaccgca acagaaacca tgcgtatcag tggcctctgg 420

gaaacgctgc tgagcaggat aggggatgac gtgatgatgt atttattgga gcactgtgca 480

atctttatgc tggttccccc tagtaactgt taccaagtct gtgggcaacc aatttatgaa 540

cttatttcgc aaaatgtaga atcagcccca gcgtttgtta aacaacggct ttcaaagcac 600

aaacgtagta gcttgcttaa gtatacgcag aaaaggctaa cgtttcacag acagtatctt 660

tcaaagtcac gtcagtcgaa acgcaggcaa agacttgaag ctaatgtctc cagcatgaga 720

aataaaacca gcaataatat acaaagccta gggtccgctg ctctggaaaa acagagtagc 780

tccaatgcag gtttgtcagc tacagcacca tccttaaaaa ggaagcttgc tagggaacaa 840

ctggaagtca cggctaagag agcaagatta gaagagaaag agagggagga acaggcttgt 900

aatactgctc ctaatgtaaa ccagagtatt cccaagaggt atggaaccag ctgtgtagca 960

tcacgttctg taagtcttat taaagaaaaa tacatttctc aaagaagtaa cagtgatatg 1020

tctcgtcctt ctttagttca caattctcat catgggaaga agtctgtggc agacaaaagc 1080

tctttcctgc aaggagctga gagtaacaga catttaaag cccagcattga aatgcaagca 1140

ggatccagca ggaagagagt agagatacac aggcctatac ctcggttgga ttggatacca 1200

atcgaaccgg cggaaagtag ttcttcagga cacaaaaagc aggaaagtcc cctagctcat 1260

ctggcagagg agttaccaaa tagggttttg ccatctacaa tatacattga caggaagttt 1320

cttctgtatt ctcgcaggta ctggggggaa cgtttcccaa aatccttcct attgaatcgc 1380

ctgaagggta gtgaggcagg tgtaaagcga ctaatagaaa cgatattctt aagccaaaat 1440

ccgtttgggc aaaagcgcaa ccaaggtctg ccacagaaaa aatggagaaa gaagaagctt 1500

cccaaacgct tctggagaat gagaagtacg tttcaaaaac tcttaaagaa tcatggaaag 1560

ttcccttacg tagctttctt gagacaaaat tgccctcttc ggatatctga aaccattttg 1620

ggaaaagcca agctgctcag tcgggcacct ttgcctgggc aagcagaggc tcacaagcaa 1680

gcagaacagc ttgggaagga gcctgctaag cgtgtggcaa gcagcagatg cgaatctggt 1740

cacaccaacg tgcccagcag cgtacgcgct cctctcgcag catctgcgtg cgtggagcca 1800

gggggggagg agcagatccc tgcagaggcg tctgattcag tcctcaggga gcttctcaag 1860

gagcactgca gccacttcca ggtgtacctc tttgtgaggg agtgcgtgga gcgggtgatc 1920

cccgccgagc tctggggttc aaaccataac aagcgccggt tcttcaagaa cgtgaaagca 1980

ttcatttcca tggggaagta cgctaagctt tccttgcagg tgttgatgtg gaagatgaga 2040

gtaaatgact gcatgtggct tcgtctggcc aaaggtaatc actttgttcc tgcctctgaa 2100

caccgttacc gtgaagaaat tttggctaaa ttcctatact ggctgatgga tacgtatgtt 2160

gttgagttgc tcagatcatt tttctatatc accgagacca tgttccagaa aaatatgctt 2220

ttctactacc gaaagtgtat ttgggccaag ttacaggaca ttggaattag aaagcatttt 2280

gccaaagtac agctacgtcc tttaactgca gaggagatgg aagcgatcca tcagaaaaaa 2340

taccttccta tggcatcaaa gctccgtttc attcccaaag tcagtggact aagacccatc 2400

gtcagaatga gcggtgttgt tgaagcacaa acgttgagca aggaaagcag agcaaagaag 2460

atgaatcact acaacatgca actgaaaaat ctatttagtg tgttaaatta tgaacgaact 2520

ataaacacca gttacatcgg ctcttcagtg tttgggagag atgatatcta caagaagtgg 2580

aagacatttg ttaaaaaggt tcttaaatca gatggtgaaa ttcctcattt ctactatgta 2640

aaggccgatg tgtccagggc ttttgatagc attcctcacg ataaacttgt ggaagtgatt 2700

tcacaggtct taaaacctga gaaaaaaact gtctactgca tacggcgcta tgcagtggtt 2760

atgatcactg gaagtggaaa aaccaggaag ttatacagga gacatgtttc tactttcaag 2820

gattttatgc cagacatgaa gcagtttgtg tcccggcttc atgagagtac ctcattgcga 2880

gatgcaataa tagttgaaca gagcttaact ttcaatgaga caagtgccag tctatttaat 2940

ttttttcttc aaatgctaaa taataacatc ctggaaattg agcgcagcta ctacttacag 3000

tgctctggaa ttccacaggg ctcccttttg tcaaccttgc tttgcagctt gtgctatgga 3060

gacatggaaa acaaattatt cagtggggta cagaaggatg gagtcctgat ccgtctcatt 3120

gatgactttt tgcttgttac accacactta acgcatgcaa gaactttcct aaggactcta 3180

gcaatgggca ttcctgagta tggctttttg ataaacccca aaaagacggt ggtgaatttt 3240

tctgttgacg atatcccaga gtgttccgaa tttaaacagc tgccaaactg tcgtttgatc 3300

ccatggtgtg gcttattatt ggatacacag acacttgagg tttactgtga ttactccagc 3360

tattcctgta cttctatcag atcaagtctt tccttcaatt caaacagaac agctgggaaa 3420

aacatgaaac acaaattggt tgcagtcctt aaactgaaat gccatggctt gtttcttgat 3480

ttacagatca atagcgttaa aacagttttc attaatgtct acaagatatt tttacttcag 3540

gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattca accagaaagt taggaacaat 3600

cctgatttct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctattc tatgctgaaa 3660

gctaaaaatc cagggtttac tttaggtaac agaggtgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720

gcagcagagt ggctctgcta tcatgccttc actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780

tacaaatgct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840

aaggatacta aggcactact gaagacagtg acagaaccat ctatttgtca agatttcaaa 3900

gctatcctgg actga 3915

Claims

1.包含E1A核酸序列的永生化禽细胞，其特征在于所述细胞通过包含用含有所述E1A核酸序列的非病毒载体转染所述细胞的步骤的方法获得，并且其中所述细胞不包含E1B核酸序列。

2.权利要求1的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列被插入所述禽细胞的HPRT基因。

3.权利要求2的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列可操作连接于所述细胞的内源HPRT启动子。

4.权利要求1-3之一的永生化细胞，其中所述细胞源自属于鸭科的动物。

5.权利要求4的永生化细胞，其中所述动物属于番鸭种。

6.权利要求4的永生化细胞，其中所述动物属于绿头鸭种。

7.权利要求1-6之一的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列与SEQID NO：1具有至少60％核酸序列相同性。

8.权利要求1-6之一的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列与SEQID NO：1具有至少70％核酸序列相同性。

9.权利要求1-8之一的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列与SEQID NO：1具有至少80％核酸序列相同性。

10.权利要求1-6之一的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列与SEQID NO：1具有至少90％核酸序列相同性。

11.权利要求1-6之一的永生化细胞，其中所述E1A核酸序列为SEQID NO：1。

12.权利要求1-11之一的永生化细胞，其中其还包含编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列。

13.权利要求12的永生化细胞，其中所述编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列与SEQ ID NO：3具有至少70％，更优选至少90％，和更优选至少95％核酸序列相同性。

14.权利要求12的永生化细胞，其中所述编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列是SEQ ID NO：3。

15.权利要求1-14之一的永生化细胞，其中其还包含编码目的物质的核酸序列。

16.权利要求1-14之一的永生化细胞，其中其还包含允许缺陷病毒增殖的互补盒。

17.权利要求1-16之一的永生化细胞在病毒复制中的用途。

18.权利要求17的用途，其中所述病毒选自下组：牛痘病毒，鼠痘病毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒和MVA。

19.权利要求1-16之一的永生化细胞在制备目的物质中的用途。

20.权利要求1-16之一的永生化细胞在制备病毒中的用途。

21.权利要求20的用途，其中所述病毒是痘病毒。

22.权利要求21的用途，其中所述病毒是痘苗病毒。

23.权利要求22的用途，其中所述痘苗病毒是MVA。

24.权利要求1-16之一的永生化细胞在制备重组病毒中的用途。

25.使禽细胞永生化的方法，包括用包含E1A核酸序列的非病毒载体转染所述细胞的步骤，其中所述方法不包括用E1B核酸序列转染所述细胞的步骤。

26.权利要求25的方法，其中所述载体包含与所述细胞基因组中存在的序列同源的两个序列。

27.权利要求26的方法，其中所述E1A核酸序列被所述同源序列包围。

28.权利要求26或27的方法，其中所述载体还包含第一选择标记，其中所述第一选择标记是阳性选择标记并且其中所述第一选择标记被所述同源序列包围。

29.权利要求28的方法，其中所述第一选择标记被允许抑制该标记的序列包围。

30.权利要求26-28之一的方法，其中所述载体包含不被所述同源序列包围的第二选择标记，其中所述选择标记是阴性选择标记。

31.权利要求29或30的方法，其中所述载体包含第三选择标记，其中所述第三选择标记是阴性选择标记并且其中所述第三选择标记位于允许抑制所述第一选择标记的序列之间。

32.权利要求28-31之一的方法，其特征在于其还包括在仅允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养所述细胞的步骤。

33.权利要求30-32之一的方法，其特征在于其还包括在不允许包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养所述细胞的步骤。

34.权利要求31-33之一的方法，其中所述方法还包括将第一选择标记从所述细胞基因组去除的步骤。

35.权利要求34的方法，其中在将第一选择标记从所述细胞基因组去除的步骤之后获得的细胞被培养在不允许包含所述第三选择标记的细胞生长的培养基中。

36.权利要求25-35之一的方法，其中所述细胞得自属于鸭科的生物体。

37.权利要求36的方法，其中所述生物体属于番鸭种。

38.权利要求36的方法，其中所述生物体属于绿头鸭种。

39.权利要求25-38之一的方法，其中所述E1A核酸序列被插入所述细胞的靶DNA序列。

40.权利要求39的方法，其中所述靶DNA序列是HPRT基因。

41.权利要求25-40之一的方法，其中所述载体还包含编码重组端粒酶逆转录酶的核酸序列。