CN101365789A - 鸟类端粒酶反转录酶 - Google Patents

Abstract

本发明特别地涉及新的重组端粒酶反转录酶、其编码核酸分子、包含所述的核酸分子的细胞以及用这些细胞生产所需的物质的用途。

Description

鸟类端粒酶反转录酶

本发明特别地涉及新的重组端粒酶反转录酶、编码它们的核酸分子、包含所述的核酸分子的细胞以及这些细胞用于生产所需的物质的用途。

在1965年，L，Hayflick发现细胞具有程序性死亡时刻。作为衰老的一种解释，他提出人类细胞可以分裂的次数是有限的(Exp Cell Res，1965 Mar；37：614-36)。现在，这被认为是由端粒在细胞分裂时缩短引起的。染色体被由保守的、衔接重复的、非编码的，六聚体DNA序列组成的并和单链及双链接和蛋白连接的端粒盖帽。端粒负责基因组稳定性功能，特别是染色体末端的复制。成功的染色体末端复制同时依赖于独特的端粒结构和专门的酶端粒酶反转录酶，其为一种具有反转录酶酶活性的核蛋白质。端粒酶反转录酶能延长端粒重复阵列，允许互补子链的延长复制。在缺少端粒酶反转录酶的细胞中，端粒DNA在连续分裂中缩短，因为一旦起始RNA引物被除去后，DNA合成酶不能完全复制染色体的末端。许多研究报道了所谓的“端粒钟”是一个人类细胞寿命的重要特征。细胞衰老的端粒假说提出端粒的缩短与端粒酶反转录酶剩余活性的缺少有关，并引起染色体不稳定性，导致衰老、凋亡相关。端粒酶反转录酶活性在体内发育期间在体细胞谱系中和在与体外端粒缩短相关的原代细胞中下调。相反，端粒酶反转录酶活性的上调或紊乱发生在转化细胞和肿瘤中。克隆和研究了来自几种哺乳动物和一种两栖动物的端粒酶反转录酶(TERT)cDNA(Nakamura等人，1997，Science 277，955-959；Greenberg等人，1998，Oncogene16，1723-1730)。

因为TERT在细胞中的过表达会引起所述的细胞无限增殖，人们提出了TERT用于产生细胞系的用途(McSharry等人，2001 J Gen Virol，82，855-63)。然而，TERT的活性是受物种限制的。例如，人类的TERT和鸟的端粒维持装置是不相容的(Michailidis等人，2005，BiochemBiophys Res Commun，335(1)，240-6)。因此，为了研究鸟类和更多特别是鸭科细胞系，需要可在这些特定细胞中执行功能的TERT。

真核细胞系是用于制备病毒疫苗和许多生物技术产品的基础。在细胞培养中产生的生物制品包括酶、激素、免疫生物制品(单克隆抗体、白细胞介素、淋巴因子)和抗癌剂。尽管许多较简单的蛋白可以使用细菌细胞生成，更复杂的糖基化蛋白目前必须在真核细胞中制备。

鸟类细胞系特别有用，因为在药物合成中所用的许多病毒能够在其中复制。更值得注意的是，多种病毒只能在鸟类细胞中生长。例如修饰的安卡拉病毒(Modified Virus Ankara，MVA)，其不能在大多数哺乳动物细胞中生长。七十年代早期，这个来源于痘苗病毒通过超过500次在CEF中传代的痘病毒就被用于预防接种免疫缺陷型人群以抗天花。现在，MVA主要用作基因治疗和免疫治疗目的的载体。例如，MVA用作MUCI基因的载体，用于预防接种患者以抗表达该抗原的肿瘤(Scholl等人，2003，J Biomed Biotechnol，2003，3，194-201)。载有编码HPV抗原基因的MVA还被用作高度宫颈损伤治疗性处理的载体。近来，MVA已成为用于制备对新出现疾病的预防性处理剂或可能的生物武器比如西尼罗河病毒和炭疽的备选载体。

因此，需要一种新的能无限增殖鸟类细胞特别是鸭科细胞的端粒酶反转录酶。

在整个申请中使用的“一个(种)”意思是“至少一个(种)”、“至少第一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”所提及的组分或步骤，除非内容另有清楚地规定。例如，“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

本文中任何部分所用的“和/或”包括含义“和”、“或”和“所有由该词语连接的要素的所有或任何其他的组合”。

本文使用的“包括”和“包含”指产品、组合物和方法包括提及组分或步骤，但并不排除其他的。当使用“基本上由……组成”来定义产品、组合物和方法时，是指排除其他任何具有实质意义的组分或步骤。因此，基本上由所述的组分组成的组合物并不排除痕量污染物和药用载体。“由……组成”指排除高于痕量的其他组分或步骤。

本发明涉及一种分离的，和/或重组多肽，其包括具有与SEQ IDNO：1至少60％的氨基酸序列同一性(identity)的氨基酸序列。在本发明一个更优选的实施方案中，本发明中的多肽包含与SEQ ID NO：1至少有70％、优选地至少80％、甚至更优选地至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包括SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的多肽具有TERT活性，和在本发明的更优选的实施方案中，本发明的多肽的表达可使属于鸭科的细胞无限增殖(immortalization)。

本文使用的“分离的”和/或“重组”意思是所指的核酸分子、DNA、RNA、多肽或蛋白质由人类以该形式制备，从而它们自然的体内细胞环境中分离。由于人工干预，本发明的重组DNA、RNA、多肽和蛋白质在本文描述的方式下具有它们自然存在的DNA、RNA、多肽和蛋白质所没有的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的多肽的分离的核酸分子。

在本发明的一个优选的实施方案中，编码本发明的多肽的核酸分子包括与如在SEQ ID NO：2中列出的基本上相同的核苷酸序列。编码本发明的多肽的优选的核酸分子包括与如在SEQ ID NO：2中列出的相同的核苷酸序列。

本文使用的“基本上相同的核苷酸序列”指与所指的多核苷酸具有足够同一性的核酸分子，其在中等严谨的杂交条件下会与所指的核苷酸杂交。在一个实施方案中，具有基本上与所指的核苷酸序列相同的核酸分子编码与SEQ ID NO：1中列出的基本上相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，具有基本上与所指的核苷酸序列相同的核酸分子与在SEQ ID NO：2中列出的核苷酸序列具有至少70％、更优选至少90％、更加优选至少95％的同一性。

杂交指核酸的互补链(即，正义链：反义链或探针：目标DNA)彼此通过类似于染色体DNA中自然存在的键的氢键结合。本领域技术人员可以容易地改变使目标DNA与指定探针杂交的严谨水平。

本文使用的“严谨的杂交”指一些条件，在该条件下聚核酸杂交体是稳定的。如本领域技术人员熟知的，杂交体的稳定性反映在杂交体的解链温度(Tm)。通常，杂交体的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。典型地，所述的杂交反应在较低严谨的条件下进行，然后在改变的、较高严谨的条件下洗涤。所述的杂交严谨性是指这样的洗涤条件。

本文使用的术语“中等严谨的杂交”是指一些条件，该条件允许目标DNA与具有与该目标DNA约60％的同一性，优选约75％的同一性，更优选为约85％的同一性的互补核酸结合；与目标DNA具有大于约90％的同一性是特别优选的。优选地，中等严谨的条件是相当于在42℃下，在50％甲酰胺、5*Denhart′s溶液、5*SSPE、0.2％SDS下杂交，接着在65℃下，在0.2*SSPE，0.2％SDS下洗涤的条件。

本发明的核酸分子可以是RNA、cDNA或基因组序列或混合型。当适当时，为了增强在宿主细胞中的表达，其可以包含一个或多个天然的、异源的(例如兔-球蛋白基因的内含子等)或合成来源的内含子。

本发明还涉及载有本发明的核酸分子的载体。

本文使用的术语“载体”应理解为质粒或病毒源的载体，并且任选地这样的载体与一种或多种改善所述的载体的转染效率和/或稳定性和/或保护体内所述的载体抵御宿主生物免疫系统的物质组合。这些物质广泛地记载在文献中，是本领域技术人员容易得到的(参见例如Felgner等人，1987，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121；Hodgson和Solaiman，1996，Nature Biotechnology 14，339-342；Remy等人，1994，Bioconjugate Chemistry 5，647-654)。作为例证，但不受限制，它们可以是聚合物、脂质、特别是阳离子脂质、脂质体、核或病毒蛋白质或中性类脂。这些物质可以单独或组合使用。这些化合物的实例特别地在专利申请WO 98/08489、WO 98/17693、WO 98/34910、WO 98/37916、WO 98/53853、EP 890362或WO 99/05183中可找到。一个可以想到的组合是质粒重组体载体与阳离子脂质(DOGS、DC-CHOL、精胺-胆固醇、精脒-胆固醇等)和中性类脂(DOPE)的组合。

在本发明的内容中可使用的质粒的选择相当多。它们可以是克隆载体和/或表达载体。通常，它们是本领域技术人员已知的，且其中很多是市售获得的，但是也有可能通过基因工程技术构建或修饰它们。可以提及，例如，来源于pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)或p Poly(Lathe等人，1987，Gene 57，193-201)的质粒。优选的，在本发明的内容中所用的质粒包含复制起点，以保证引发生产细胞和/或宿主细胞中的复制(例如，对于要在大肠杆菌中产生的质粒可以选择ColEl起点，如果期望在哺乳动物宿主细胞中自我复制，可以选择oriP/EBNAl体系，Lupton和Levine，1985，Mol.Cell.Biol.5，2533-2542；Yates等人，Nature 313，812-815)。其可包括包括在指定细胞中改善其保持和/或其稳定性的另外的元件(促进质粒单一性保持的cer序列(Summers和Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103)，整合入细胞基因组的序列)。

至于病毒载体，可以想到其来源于下述的载体：痘病毒(痘苗病毒，特别是MVA、金丝雀痘等)、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、α病毒、泡沫病毒或腺伴随病毒。优选地使用不可复制的载体。从这点考虑，腺病毒载体最特别适于进行本发明。

根据本发明的一个优选的实施方案，根据本发明的载体进一步包含在宿主细胞中表达本发明的核酸分子所需元件。

用于表达所需元件包含一组可以允许将核苷酸序列转录为RNA以及将mRNA翻译成多肽的元件，特别是在所述的细胞中有效的启动子序列和/或调节序列，和任选的对于所述的多肽在目标细胞表面分泌或表达所需的序列。这些元件可能是可调型的或组成型的。当然，所述的启动子适于选定的载体及宿主细胞。可以提及，例如PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金属硫蛋白；McIvor等人，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、α-1-抗胰蛋白酶、CFTR基因的真核启动子，编码肌肉肌酸激酶、肌动蛋白肺表面活性物质、免疫球蛋白或β-肌动蛋白基因的启动子(Tabin等人，1982，Mol.Cell Biol.2，416-436)，SRα(Takebe等人，1988，Mol.Cell.8，466-472)、SV40病毒(猿猴病毒)早期启动子，RSV(劳斯肉瘤病毒)LTR，MPSV启动子，TK-HSV-1启动子，CMV病毒(细胞巨化病毒)早期启动子，痘苗病毒启动子p7.5K pH5R、pK1L、p28、p11和腺病毒启动子E1A和MLP或所述的启动子的组合。细胞巨化病毒(CMV)早期启动子是最特别优选的。

根据优选的实施方案，本发明中的载体进一步包含两个与包含在细胞基因组中基因组的天然目标DNA序列区域内的序列部分同源的序列。所述的同源序列的存在允许本发明的核酸分子通过同源重组位点特异性插入到目标DNA序列中。

术语“同源重组”指两个DNA分子在基本上相同的核苷序列位点之间交换DNA片段。优选地，载体中的同源序列与目标序列的区域是100％同源的。但是，可以使用较低的序列同源性。因此，可以使用的序列同源性低至约80％。

载体中的同源序列包括至少25bp的载体，较长的区域是优选的，至少500bp，更优选至少5000bp。

根据本发明的一个更优选的实施方案，所述的核酸分子在载体中被同源序列包围。

本文使用的“包围”指所述的同源序列之一位于本发明的核酸分子的上游，所述的同源序列之一位于本发明的核酸序列的下游。本文使用的“包围”不一定指两个同源序列直接连接至本发明的核苷酸序列的3′或5′端，本发明的核酸分子和同源序列可以被不限定数目的核苷酸隔开。

本文使用的“目标DNA序列”是用于通过与载体同源重组修饰的细胞基因组内的目标区域。目标DNA序列包括结构基因(即，编码多肽的DNA序列，在真核生物的情况下包括内含子和外显子)，调节序列比如增强序列，启动子等及感兴趣的基因组内的其他区域。目标DNA序列还可以是一个当被载体作为目标时对宿主基因组功能没有影响的序列。

本文使用的“插入到目标DNA序列”广泛地指导致本发明的核酸分子的插入的同源重组过程在目标DNA序列中引入缺失或破坏。

本领域的技术人员能选择合适的同源序列以将特定的DNA序列插入到一个细胞的基因组中。例如，一个同源序列可以与目标DNA序列的一部分同源，另一个同源序列与位于所述的目标序列的上游或下游的DNA序列同源。根据另一个实施例，一个同源序列可以与位于所述的目标DNA序列上游的DNA序列同源，另一个同源序列与位于所述的目标DNA序列下游的DNA序列同源。在另一个实施例中，两个同源序列都与位于所述的目标DNA序列中的序列同源。

根据本发明的一个优选的实施方案，目标DNA序列是HPRT(Hypoxanthine phosphorybosyl transferase，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)基因。

包括疣鼻栖鸭的HPRT启动子和HPRT基因的基因组序列列在SEQ ID NO：3中。编码HPRT的序列起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的8695位点的ATG密码子，该ATG密码子上游的序列就是HPRT启动子序列。

本领域的技术人员能选择将本发明的核酸分子整合到HPRT基因所需的同源序列。如在家族中不同成员之间，编码HPRT的基因序列在鸟类间是高度同源的，因此，本领域技术人员能设计靶向其他鸟类细胞的HPRT基因所需的同源序列。

根据本发明一个更优选的实施方案，为了将本发明的核酸分子插入HPRT启动子下游，对同源序列进行人为改造(customized)。在该特定的实施方案中，将本发明的核酸分子可操作地连接至细胞的内源性HPRT启动子。在本发明的内容中，“可操作地连接”指核酸分子以允许其在细胞中表达的方式连接至启动子。

根据该特定的实施方案，本发明的核酸分子上游的同源序列优选地具有与如下核酸序列有至少500个连续的碱基对(bp)，更优选地至少5000个连续碱基对的核酸序列同源：其起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的位置1的核苷酸，结束于该核酸序列的位置8694的核苷酸，条件是所述的同源序列与起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的位置8695的核苷酸，结束于所述的核酸序列的位置26916的核苷酸的核酸序列不同源。而且，该上游同源序列优选地直接连接根据本发明的核酸分子的起始密码子。根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的核酸分子上游的同源序列包括如下核酸序列：起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的位置1383的核苷酸，结束于所述的核酸序列的位置8694的核苷酸。例如，根据本发明的载体包括包括如下核酸序列：起始于在SEQ ID NO：4中列出的核酸序列的位置1的核苷酸，结束于所述的核酸序列的位置11227的核苷酸。本发明的核酸分子下游的同源序列优选地具有与如下核酸序列有至少500个连续的碱基对，更优选地至少5000个连续碱基对的核酸序列同源：其起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的位置10581的核苷酸，结束于所述的核酸序列的位置17800的核苷酸。而且，更优选地，本发明的核酸分子下游的所述的同源序列包括如下核酸序列：起始于在SEQ ID NO：3中列出的核酸序列的位置10581的核苷酸，结束于所述的核酸序列的位置17800的核苷酸。

根据一个优选的实施方案，本发明的载体包括第一选择标记，其中该第一选择标记为阳性选择标记，且其中所述的第一选择标记和本发明的核酸分子位于所述的载体中相同区段，所述的区段由同源序列分界(delimited)。

本文使用的术语“阳性选择标记”特别地指编码只有含该基因的细胞才能在一定条件下存活和/或生长的产物的基因。典型的选择标记编码对抗生素或其它毒素有抗性的蛋白质，所述的抗生素或其它毒素例如例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，互补营养缺陷型或提供不能从复合培养基中获得的重要营养素。在根据本发明的一个优选的实施方案中，第一选择标记编码对抗生素有抗性的蛋白质。

根据本发明的一个更优选的实施方案，载体中的第一选择标记被抑制该标记的序列包围。所述的抑制第一选择标记的序列不包围本发明的核酸分子。当载体为环状时，抑制第一选择标记的序列、第一选择标记和本发明的核酸分子位于转移载体的相同区段中，所述的区段由同源序列分界。

抑制核酸片段的序列是本领域技术人员熟知的(Nunes-Duby，S等人(1998)Nucleic Acids Res.26：391-406)。这些序列可以被一个或多个特异性的酶识别，所述的酶诱导包含在所述的序列之间的核酸的抑制，这些酶被称为“重组酶”。例如，三种熟知的抑制核酸片段的重组酶为FLP、ISCEI和Cre重组酶。

典型的位点特异性重组酶是Cre重组酶。Cre是噬菌体P1的cre(环化重组)基因的38-kDa产物，并且是Int家族的位点特异性DNA重组酶。Sternberg，N.等人，(1986)J.Mol.Biol.187：197-212。Cre识别P1基因组中被称为loxP(P1的X-over基因座)的34bp位点，并有效地催化成对loxP位点间的交互(reciprocal)保守的DNA重组。loxP位点由8bp的非回文核心区域(nonpalindromic core region)两侧的两个13bp反向重复序列组成。在两个直接重复的loxP位点之间的Cre-介导的重组导致它们之间的DNA以共价闭合环的形式被切除。反向成对的loxP位点之间的Cre介导的重组将导致其间的DNA倒位而非切除。DNA的断裂和连接限制在核心区域中不连续的位置，并且每次在链上与所述的酶以瞬时磷酸酪氨酸DNA-蛋白连接方式进行。

另一个位点特异性重组酶是I-SceI。其它的内含子归巢核酸内切酶，例如I-TliI、I-CeuI、I-CreI、I-PpoI和PI-PspI也可以被I-SceI代替。许多被Belfort和Roberts列出((1997)Nucleic Acids Research25：3379-3388)。许多这些核酸内切酶源自细胞器基因组，其中所用密码子与标准的核密码子不同。为了使用这样的基因用于它们的核酸内切酶的核表达，可能需要改变编码序列以匹配核基因。I-SceI是一个切割其识别位点内的DNA的双链核酸内切酶。I-SceI产生一个含有3′OH悬突的4bp交错切口。

所述的酶I-SceI具有一个已知的识别位点。I-SceI的识别位点是一个超过18bp的不对称序列。

5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′

3′ATCCCTATTGTCCCATTA5′

因此，在本发明的一个优选的实施方案中，抑制第一选择标记的序列包括I-SceI的识别位点。

另一个位点特异性重组酶是FLP重组酶。Flp重组酶识别一个特殊的34-bp最小位点，该位点只容许其识别序列有限的简并(Jayaram，1985；Senecoff等人，1988)。已经研究了Flp重组酶和FRT序列之间的相互作用(Panigrahi等人，1992)。Jayaram(1985)和Senecoff等人(1988)给出了不同FRT序列的实例，Snaith等人描述了用于在不同底物上的Flp-介导重组的测定(1996)。

在一个特别的实施方案中，当本发明的载体包括抑制第一选择标记的序列时，所述的载体可以有利地包含第一同源序列A和第二同源序列B，其中同源序列A和B具有便于在它们之间进行同源重组的足够的长度和足够的同源性。关于同源序列A和B，“足够的同源性”优选地指这些同源序列中在至少20个碱基对，优选至少50个碱基对，尤其优选至少100个碱基对，特别尤其优选250个碱基对，最优选至少500个碱基对的长度上，具有至少70％，优选80％，优选至少90％，尤其优选至少95％，非常尤其优选至少99％，最优选至少100％的同源性。在该实施方案中，本发明中的载体在5′-至3′-方向在本发明的核酸分子后包括如下部分：第一同源序列A、抑制第一选择标记的序列、第一选择标记、抑制第一选择标记的序列和同源序列B。

根据一个优选的实施方案，本发明的载体包含没有被所述的同源序列包围的第二选择标记，其中所述的第二选择标记为阴性选择标记。当本发明的载体是环状时，所述的第二选择标记特别有用。当所述的载体为环状时，第二选择标记不被所述的同源序列包围的情形指第二选择标记和本发明的核酸分子没有位于转移载体的相同区段，所述的区段由同源序列分界。

根据本发明的一个优选的实施方案，其中本发明的载体包括第三选择标记，其中所述的第三选择标记为阴性选择标记，并且其中所述的第三选择标记位于抑制第一选择标记的序列之间。当所述的载体为环状时，第三选择标记位于抑制第一选择标记的序列之间的情形指第三选择标记和第一选择标记位于转移载体的相同区段，所述的区段由抑制第一选择标记的序列分界。

本文使用的术语“阴性选择标记”特别地指编码在一定条件下杀死载有该基因的细胞的产物的基因。这些基因特别地包括“自杀基因”。由这些基因编码的产物能转化细胞毒素化合物中的药物前体。许多自杀基因/药物前体对是目前可获得的。可以更特别地提及以下自杀基因/药物前体对：

-I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-I TK)和阿昔洛韦或更昔洛韦(GCV)(Caruso等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7024-7028；Culver等人，1992，Science 256，1550-1552；Ram等人，1997，Nat.Med.3，  1354-1361)；

-细胞色素p450和环磷酰胺(Wei等人，1994，Human Gene Therapy5，969-978)；

-来自大肠杆菌(E.coli)的嘌呤核苷磷酸化酶和6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷(Sorscher等人，1994，Gene Therapy 1，233-238)；

-来自大肠杆菌(E.coli)的鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和6-硫代黄嘌呤(Mzoz和Moolten，1993，Human Gene Therapy 4，589-595)和

-胞嘧啶脱氨酶(CDase)及5-氟胞嘧啶(5FC)。

-FCU1和5-氟-胞嘧啶  (5FC)(WO9954481)。

-FCU1-8和5-氟-胞嘧啶(5FC)(WO2005007857)。

第一、第二、第三选择标记可以单独使用。例如，本发明的载体可包含第一和第三选择标记但不包含第二选择标记，或者包含第二和第三选择标记但不包含第一选择标记。

根据本发明的一个优选的实施方案，将第一、第二和/或第三选择标记置于其在宿主细胞中表达所需元件的调控下。

表达所需元件由一组允许核苷酸序列转录为RNA和将mRNA翻译成多肽的元件组成，特别是在所述的细胞中有效的启动子序列和/或调节序列，和任选的对于所述的多肽在宿主细胞表面分泌或表达所需的序列。这些元件可能是可调型的或组成型的。当然，所述的启动子适于选择的载体及宿主细胞。可以提及，例如PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金属硫蛋白；McIvor等人，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、α-1-抗胰蛋白酶、CFTR基因的真核启动子，编码肌肉肌酸激酶、肌动蛋白肺表面活性物质、免疫球蛋白或β-肌动蛋白基因的启动子(Tabin等人，1982，Mol.Cell Biol.2，416-436)，SRα(Takebe等人，1988，Mol.Cell.8，466-472)、SV40病毒(猿猴病毒)早期启动子，RSV(劳斯肉瘤病毒)LTR，MPSV启动子，TK-HSV-1启动子，CMV病毒(细胞巨化病毒)早期启动子，痘苗病毒启动子p7.5K pH5R、pK1L、p28、p11和腺病毒启动子ElA和MLP或所述的启动子的组合。细胞巨化病毒(CMV)早期启动子是最特别优选的。

本发明还涉及一种被根据本发明的核酸分子或载体转染的细胞，以及来源于此的细胞。本文使用的术语“来源于”指从根据本发明的核酸分子转染的细胞中发育或分化的细胞或将其作为祖先的细胞。

本发明还涉及根据本发明的多肽、核苷酸分子和载体用于细胞无限增殖的用途。

本发明还涉及一种包括本发明的核酸分子的细胞，其中所述的核酸分子可操作地连接到该细胞的内源HPRT启动子。“可操作地连接”指核酸分子以允许其在细胞中表达的方式连接至启动子。在一个优选的实施方案中，本发明的细胞包括在SEQ ID NO：4中列出的核酸序列。

本发明还涉及一种用于细胞无限增殖的方法，包括将根据本发明的载体转入所述的细胞的步骤。

本文使用的无限增殖的细胞指一种能在培养中超过35次传代生长的细胞。

术语传代次数指为了保持细胞以足够低的密度来刺激进一步生长，将细胞群从培养瓶中迁移并进行继代培养(传代)过程的次数。

本文使用的术语“转染”指本发明的细胞的稳定的转染或瞬时转染。

术语“稳定的转染”或“稳定转染的”指将外源DNA引入和整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定的转染子”指具有将外源DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。

术语“瞬时的转染”或“瞬时转染的”指将外源DNA引入到细胞中，其中所述的外源DNA未能整合到转染细胞的基因组中。所述的外源DNA在转染细胞的核中维持几天。术语“瞬时转染子”指具有引入外源DNA但未能整合该DNA的细胞。

根据本发明中的一个优选的实施方案，本发明的细胞源自鸟类细胞，更优选地源自鸭科(Anatidae)或雉科(Phasianidae)的细胞。在鸭科中，属于栖鸭属(Cairina genus)或鸭属(Anas genus)的细胞是特别优选的。更加优选属于疣鼻栖鸭种(Cairina moschata)或属于绿头鸭种(Anas platyrhynchos)的本发明的细胞。

优选地，本发明的细胞源自胚胎生物。从活生物中分离细胞的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用实施例2中公开的方法。根据本发明的一个优选的实施方案，所述的原代细胞是从属于0至20天，更优选5至15天，甚至更优选的11到至14天的鸭科的胚胎中分离的。

当在本发明的方法中所用的载体包含第一选择标记时，第一选择标记的整合允许对包含本发明的核酸分子的细胞进行选择。因此，根据本发明的方法可以进一步包括下述步骤：将所述的细胞在仅允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养。例如，在包括抗生素的培养基中。

当在本发明的方法中所用的载体包括抑制第一选择标记的序列时，根据本发明的方法可以进一步包括以下步骤：抑制来自所述的原代细胞的基因组的第一选择标记。为了抑制所述的第一选择标记，用编码特异性抑制第一选择标记的重组酶的基因转染所述的细胞。将所述的基因转入细胞的方法和载体是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用在本申请的实施例4中公开的方法。

当在本发明的方法中使用的载体包括第二选择标记时，根据本发明的方法可以其进一步包括下述步骤：将所述的细胞仅允许不包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养。所述的步骤可以与将所述的细胞在只允许加入第一选择标记的细胞生长的培养基中培养的步骤同时进行或分别进行。

当在根据本发明的方法中使用的载体是环状时，所述的第二选择标记特别有用。所述的第二选择标记的存在可以使同源重组过程中引入了不包括本发明的核酸分子的转移载体区段的细胞不能存活。

当在本发明的方法中使用的载体包括第三选择标记时，根据本发明的方法可以进一步包括将所述的细胞在不允许包括第三选择标记的细胞生长的培养基中培养的步骤。例如，不允许包含作为第三选择标记的FCU1的细胞生长的培养基，其包含5-氟胞嘧啶。

该步骤允许选择存在抑制第一选择标记的细胞。这意味着包括抑制第一选择标记的步骤也将导致抑制第三选择标记。第三选择标记的存在可以使存在第一选择标记的细胞不能存活。

本发明更特别地涉及，但不限于细胞无限增殖的方法，其包括下述步骤：

-将包括下述组分的载体转入细胞：

·被同源序列包围的根据本发明的核酸分子。

·第一选择标记，其中所述的第一选择标记是一个阳性选择标记，且其中所述的第一选择标记被所述的同源序列包围。

·能抑制第一选择标记的序列。

·第二选择标记，其不被所述的同源序列包围，其中所述的选择标记为阴性选择标记。

·第三选择标记，其中所述的第三选择标记为阴性选择标记，并且其中所述的第三选择标记位于抑制第一选择标记的序列之间。

-将所述的细胞在只允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养。

-将所述的细胞在不允许包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养。

-从所述的细胞的基因组中除去第一选择标记。

-将所述的细胞在不允许包括第三选择标记的细胞生长的培养基中培养。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种无限增殖的细胞，其来源于属于疣鼻栖鸭种的动物细胞，并且其包括疣鼻栖鸭端粒酶反转录酶，该反转录酶插入到该细胞的HPRT基因中，并受疣鼻栖鸭HPRT启动子调控。

本发明的细胞还可以进一步包括一个或多个允许缺损病毒繁殖的核酸序列。“缺损病毒”指其中其复制所需一个或多个病毒基因被删除或丧失功能的病毒。术语“允许缺损病毒繁殖的核酸序列”指以反式方式提供缺陷病毒生长复制功能的核酸序列。换言之，所述的核酸序列编码所述的缺损病毒复制和壳体化所需的蛋白质。作为例证，为了产生缺少大部分E1区域的腺病毒载体，可以用一个编码E1区域的核酸序列瞬时或永久转染本发明的细胞。

本发明的细胞也可以包括编码所需的物质的核酸序列。本文使用的所需的物质可以包括，但不限于药学活性蛋白质，例如生长因子、生长调节剂、抗体、抗原、用于免疫或疫苗接种等的其衍生物、白介素、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或其组合，干扰素例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-，凝血因子例如因子VIII、因子IX或tPA或其组合。“所需的物质”还指工业酶，例如用于纸浆和纸中、纺织品改良或酒精生产中的酶。最后，“所需的物质”还指用于动物饲养的蛋白质补充物或增值产物。

通过根据本发明的方法得到的细胞，本发明的细胞和由其获得的细胞对病毒复制特别有用。所述的病毒可以是活的、减毒的、重组的或非重组的。更优选地，所述的细胞对痘病毒(痘苗病毒，特别是MVA、金丝雀痘病毒等)、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、α病毒、泡沫病毒或腺病毒相关病毒的复制特别有用。

逆转录病毒具有感染的性质，并且在大多数情况下整合到分裂细胞中，在这方面，其特别适合于癌症相关的应用。根据本发明的重组逆转录病毒通常包含LTR序列、壳体化区域和根据本发明所述的核苷酸序列，所述的核苷酸序列受逆转录病毒LTR或体内启动子比如如下所述的那些启动子的调控。逆转录病毒载体可包含修饰，特别是LTR(用真核启动子替换启动子区域)或壳体化区域(用异源壳体化域比如VL30型替换)(参见法国申请94 08300和97 05203)。

腺病毒载体可能缺少用于复制所必需的区域的全部或至少一部分，所述的区域选自E1、E2、E4和L1 L5区域。E1区域的缺失是优选的。然而，其可以与特别地影响E2、E4和/或L1 L5区域的全部或部分的(一个)其它的修饰/缺失组合。作为例证，E1区域的主要部分和E4转录单元的缺失是特别有利的。为了增加克隆量，腺病毒载体还可以缺少非必需的E3区域的全部或一部分。根据另一个替代实例，有可能使用最小的保留壳体化必需序列的腺病毒载体，即，5′和3′ITRs(Inverted Terminal Repeat，末端反向重复)和壳体化区域。多种腺病毒载体和用于制备它们的技术是已知的(参见，例如，Graham和Prevect，1991，in Methods in Molecular Biology，Vol 7，p 109 128；Ed：E.J.Murey，The Human Press Inc)。

痘病毒家族包括脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxvirus)和昆虫痘病毒亚科的病毒。在这些中，根据本发明的痘病毒优选自正痘病毒属、副痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒、软疣痘病毒属、亚塔痘病毒。根据一个更优选的实施方案，本发明的痘病毒为正痘病毒属。

所述的正痘病毒属优选地为痘苗病毒，更优选修饰的痘苗病毒安卡拉(vaccinia virus Ankara，MVA)，特别是MVA 575(ECACCV00120707)和MVA-BN(ECACC V00083008)。

术语“重组体病毒”指包括插入其基因组中的外源序列的病毒。本文使用的外源序列指不是天然存在于母体病毒中的核酸。

在一个实施方案中，所述的外源序列编码具有直接的或间接的细胞毒素功能的分子。“直接的或间接的”细胞毒素指由外源序列编码的分子本身可能是有毒性的(例如蓖麻毒、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2、干扰素-γ、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、假单胞菌外毒素A)，或者其可以被代谢形成有毒的产物，或者其可以作用于其他物质形成有毒的产物。蓖麻毒cDNA的序列公开在Lamb等人的(Eur.J.Biochem.，1985，148，265-270)中，将其引入作为参考。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述的外源序列为自杀基因。自杀基因编码能将相对无毒的药物前体转化成有毒的药品的蛋白质。例如，酶胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5FC)转化成5-氟尿嘧啶(5FU)(Mullen等人，(1922)PNAS 89，33)；单纯性疱疹酶胸苷激酶致敏要用抗病毒药更昔洛韦(GCV)或阿昔洛韦处理的细胞(Moolten(1986)Cancer Res.46，5276；Ezzedine等人(1991)New Biol 3，608)。可以使用任一种生物的胞嘧啶脱氨酶，例如大肠杆菌或酿酒酵母。

因此，在本发明的一个更优选的实施方案中，所述的基因编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质，甚至更优选如在专利申请WO2005007857和WO9954481中描述的蛋白质。

在一个进一步的实施方案中，所述的外源基因编码能切割目标RNA或DNA的核酶。要切割的目标RNA或DNA可以是细胞功能所必需的且其切割引起细胞死亡的RNA或DNA，或者要切割的RNA或DNA可以是编码不想要的蛋白质例如致癌基因产物且该RNA或DNA的切割可预防细胞癌变的RNA或DNA。

在一个更进一步的实施方案中，所述的外源基因编码反义RNA。

“反义RNA”指如下的RNA分子：其杂交至编码蛋白质的mRNA分子和干扰其表达，或者杂交至细胞内的另一个RNA分子，比如pre-mRNA或tRNA或rRNA，或者杂交至基因和干扰其表达。

在本发明的另一个实施方案中，所述的外源序列代替目标细胞中有缺陷的基因的功能。存在数千个包括人类的哺乳动物由缺陷基因引起的遗传疾病。这样的遗传性疾病的实例包括囊性纤维化，其中已知存在CFTR基因突变；迪谢内肌营养不良，其中已知存在肌营养不良蛋白基因突变；镰状红细胞病，其中已知存在HbA基因突变。许多类型的癌症由有缺陷的基因引起，尤其是原癌基因和已经进行突变的肿瘤抑制基因。

原癌基因的实例为ras、src、bcl等；肿瘤抑制基因的实例为p53和Rb。

在本发明的一个进一步的实施方案中，所述的外源序列编码肿瘤相关抗原(TAA)。TAA指在肿瘤细胞中比在相同组织类型的非肿瘤细胞中以较高频率或密度检测到的分子。TAA的实例包括，但不限于CEA、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、MUC-1、MUC-2、点突变的ras致癌基因、正常或点突变的p53、过表达的p53、CA-125、PSA、C-erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、存活的(surviving)和LRP。根据更优选的实施方案，所述的TAA为MUCl。

所述的重组体病毒可以包括多于一种外源序列，并且各个外源序列可以编码多于一个分子。例如，在同一个重组体痘病毒中，将编码TAA的外源序列和编码细胞因子的外源序列联合起来是有用的。

在本发明的另一个实施方案中，所述的外源基因编码抗原。本文使用的“抗原”指可以通过抗体结合的配体；抗原本身不必是免疫原性的。

优选地，所述的抗原来源于病毒，例如HIV-1、(比如gp 120或gp160)、猫科免疫缺陷病毒的任何一种、人类或动物疱疹病毒比如gD或其衍生物或即刻早期蛋白(Immediate Early protein)比如来自HSVl或HSV2的ICP27、细胞巨化病毒(比如gB或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(比如gpI、II或III)、或者来自肝炎病毒比如乙型肝炎病毒例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(优选地来自基因型1b菌株ja的非结构蛋白)和戊型肝炎病毒、或者来自其它病毒病原体比如呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒(优选来自HPV 16菌株的E6和E7蛋白质)或流感病毒，或来源于细菌性病原体比如沙门氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋体(例如OspA或OspB或其衍生物)、或衣原体、或博德特氏菌例如P.69、PT和FHA、或来源于寄生物比如变形体或弓形体。

图1：包括编码端粒酶反转录酶的基因的载体。

图2：编码端粒酶反转录酶的基因位点特异性插入HPRT基因的图示。

图3：从通过本发明的方法获得的无限增殖细胞的基因组中除去第一和第三选择标记的图示。

实施例：

实施例1：端粒酶表达系统

随机插入

为达到此目的，使用与鸭基因组无特异性序列同源性的质粒(图1)。

目标插入

构建包括与包围疣鼻栖鸭端粒酶反转录酶基因的疣鼻栖鸭HPRT基因同源的两个5kb片段和两种选择标记的质粒。选择编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酰基转移酶的HPRT基因作为用于组成型表达疣鼻栖鸭端粒酶的合适位点(adequate site)。

这两个选择标记为在CMV启动子(Thomsen等人，P.N.A.S.1984，81，3：659-63)调控下的FCU1基因(Erbs等人，Cancer Res.2000，15，60，：3813-22)和在SV40启动子调控下的新霉素抗性基因。新霉素耐药性和FCU-1表达盒(expression cassette)被Sce 1切割位点包围，以允许从最终细胞系中除去的选择盒(cassettes)。将由RSV启动子驱动的编码HSVTK的选择标记插入HPRT基因臂之外(图2)。

实施例2：从12只老的疣鼻栖鸭卵中制备批量CEC以及对亚群的描述。

将25只受精的SPF卵在37.5℃培养。在按照可获得的实验方案培养12天后，卵张开。

剁碎23只胚胎，在磷酸盐缓冲盐水-Dulbecco(PBS)中洗涤一次，并在室温下，在TrypLE Select(Invitrogen)中分离5小时。

在低速离心后，将细胞再悬浮在补充有10％的胎牛血清(FCS)、庆大霉素0.04g/L的Eagle基础培养基(MBE)中，接种在500cm²的培养瓶(triple flask)中，并在37℃，5％ CO₂下培养。

在24小时后，使用TrypLE Select(5mL/培养瓶)从烧瓶中除去融合细胞，将部分该细胞再接种在175cm²的烧瓶中用于第二次传代。将剩余细胞以10⁷细胞/mL浓缩在适当的培养基(60％ BME、30％FCS和10％ DMSO)中，并在用液氮中转移之前在-80℃冷冻于异丙醇(isopropyl alcool)调节的容器(NALGENE.

.“Mr.Frosty”1℃frezing.Container)中，用于长期储存，构成原始细胞储存库(50×l，5.10⁷细胞/小瓶，44×1.10⁷细胞/小瓶)。

保留在培养基中细胞按传统传代至多达18代，在3个第一次传代期间，通过低离心条件培养基收集非附着细胞，再接种和按照与初始培养相同的方法进一步传代。

在培养物的生存期中，可重复地分离表现出不同的形态特征的亚群。

实施例3：转染的方法

本领域已知大量将表达所需的核苷酸序列的载体引入的转染的方法。下面非限制性的列出这些方法：CaPO₄沉淀法、电穿孔、脂质体转染法(lipofectin)。给出的实施例是基于CaPO₄沉淀过程。

细胞应当约80-50％融合。在CaPO₄/DNA加入前两小时更换培养基。将30μg的DNA再悬浮在31μl的2M CaCl₂ 161.3mM Tris pH 7.6中。加水至最终体积为0.5ml。

每次转染，将0.5ml的2×HEBS分配在15ml无菌Falcon管中，滴加DNA溶液，同时轻轻地震荡所述的DNA溶液或向其中通气。该溶液将变成乳状。在室温下静置该混合物10-30分钟。然后，在组织培养箱中用无菌吸量管使吸量管进出一次以打碎薄片(flakes)，并滴加于细胞。然后，在37℃，培养细胞6小时至过夜。良好的沉淀物将覆盖细胞表面。为了完成转染过程，将甘油休克溶液加热至37℃。抽吸出培养基，加入5ml BME以洗涤细胞层，然后，抽吸出培养基，用2分钟或更短时间加入1ml甘油休克溶液。接着，缓慢地加入10ml BME以稀释甘油，并完全除去BME-甘油。然后，加入10ml所需的培养基(desired medium)，在适当的温度下保温平皿。

实施例4：选择方法

随机插入：

在转染后48小时施加选择压：  用TrypLE Select分离细胞，低速离心并再接种在具有FCS 10％和G418 800μg/mL的BME中。

连续传代细胞直至可以分离单个生长克隆。分离和扩增繁殖源(multiplying foci)，然后用

XL端粒酶检测试剂盒(S7707，Chemicon)定量端粒酶活性以及用Southern印迹分析确定在目标特异性基因座中的整合。

目标插入：

在转染后48小时施加选择压：用TrypLE Select分离细胞，低速离心并再接种在具有FCS 10％、更昔洛韦25μg/mL和G418 800μg/mL的BME中。

连续传代细胞直至可以分离单个生长克隆。分离和扩增繁殖源，然后用

XL端粒酶检测试剂盒(S7707，Chemicon)定量端粒酶活性以及用Southern印迹寡核苷酸分析确定在目标特异性基因座中的整合。

接着，按如下所述的方法，用大范围核酸酶(meganuclease)I-SceI表达质粒转染具有检测到恢复的端粒酶活性并且目标HPRT基因座有整合的细胞克隆。

为选择去除选择标记的细胞，在转染后48小时应用5-氟胞嘧啶(5-FC)：用TrypLE Select分离细胞，低速离心并再接种在培养基中，所述的培养基含有浓度范围为10^-3至10^-7M的5-FC，并维持G418选择(具有FCS 10％、5-FC和G418 800μg/mL的BME)。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

卷    号：580591CP

国际申请号：PCT／EP2007／050120

国际申请日：2007年1月5日

根据PCT第19条修改部分的译文

权利要求书：

修改的权利要求书1—38项替换原权利要求书1—41项。

1.一种分离的或重组多肽，其包括具有与SEQ ID NO：1至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

2.一种分离的多肽，其包括如在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。

3.一种分离的或重组核酸分子，其编码如权利要求1至2中任一项所述的多肽。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸序列包括基本上如在SEQ ID NO：2中列出的核酸序列。

5.载有如权利要求3或4中任一项所述的核酸分子的载体。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述的载体包括两个与目标DNA序列同源的序列。

7.根据权利要求6所述的载体，其中所述的核酸分子被所述的同源序列包围。

8.根据权利要求6至7中任一项所述的载体，其中所述的载体进一步包括第一选择标记，其中所述的第一选择标记为阳性选择标记，并且所述的第一选择标记被所述的同源序列包围。

9.根据权利要求8所述的载体，其中所述的第一选择标记被抑制该标记的序列包围。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的载体，其中所述的载体包括不被所述的同源序列包围的第二选择标记，并且其中所述的选择标记为阴性选择标记。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的载体，其中所述的载体包括第三选择标记，其中所述的第三选择标记为阴性选择标记，并且其中所述的第三选择标记位于抑制第一选择标记的序列之间。

12.用如权利要求3或4中任一项所述的核酸分子转染的细胞。

13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述的核酸分子插入到原代细胞的HPRT基因之中。

14.包括可操作地连接到细胞的内源性HPRT启动子的如权利要求3或4中任一项所述的核酸分子的细胞。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的细胞，其中所述的细胞取自属于鸭科的动物。

16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述的动物属于疣鼻栖鸭种cairina moschata。

17.根据权利要求15所述的细胞，其中所述的动物属于绿头鸭种Anas platyrhynchos。

18.根据权利要求12至17中任一项的细胞系，其中其进一步包括编码所需物质的核酸序列。

19.根据权利要求12至18中任一项所述的细胞，其中其进一步包括允许缺损病毒繁殖的互补盒。

20.如权利要求1或2中任一项所述的多肽、如权利要求3或4中任一项所述的核苷酸分子或如权利要求5至11中任一项所述的载体用于使细胞无限增殖的用途。

21.如权利要求12至18中任一项所述的细胞用于病毒复制的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述的病毒选自牛痘病毒、小鼠痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒或MVA。

23.如权利要求18所述的细胞用于产生所需物质的用途。

24.如权利要求12至19中任一项所述的细胞用于产生病毒的用途。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述的病毒为痘病毒。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述的病毒为痘苗病毒。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述的痘苗病毒为MVA。

28.如权利要求12至18中任一项所述的细胞用于产生重组病毒的用途。

29.使细胞无限增殖的方法，其包括将如权利要求5至11中任一项所述的载体转染到所述的细胞中的步骤。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于其进一步包括下述步骤：将所述的细胞在仅允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养。

31.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其特征在于其进一步包括下述步骤：将所述的细胞在不允许包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括下述步骤：从所述细胞的基因组中除去第一选择标记。

33.根据权利要求32所述的方法，其中将从所述细胞的基因组中除去第一选择标记的所述步骤后获得的细胞在不允许包括第三选择标记的细胞生长的培养基中培养。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述的细胞取自属于鸭科的生物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的生物属于疣鼻栖鸭种cairina moschata。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述的生物属于绿头鸭种Anas platyrhynchos。

37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中将所述的核酸分子插入到所述细胞的目标DNA序列中。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的目标DNA序列为HPRT基因。

Claims (41)

1.一种分离的或重组多肽，其包括具有与SEQ ID NO：1至少60％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

2.一种分离的或重组多肽，其包括具有与SEQ ID NO：1至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

3.一种分离的或重组多肽，其包括具有与SEQ ID NO：1至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

4.一种分离的或重组多肽，其包括具有与SEQ ID NO：1至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

5.一种分离的多肽，其包括如在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。

6.一种分离的或重组核酸分子，其编码如权利要求1至5中任一项所述的多肽。

7.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸序列包括基本上如在SEQ ID NO：2中列出的核酸序列。

8.载有如权利要求6或7中任一项所述的核酸分子的载体。

9.根据权利要求8所述的载体，其中所述的载体包括两个与目标DNA序列同源的序列。

10.根据权利要求9所述的载体，其中所述的核酸分子被所述的同源序列包围。

11.根据权利要求9至10中任一项所述的载体，其中所述的载体进一步包括第一选择标记，其中所述的第一选择标记为阳性选择标记，并且所述的第一选择标记被所述的同源序列包围。

12.根据权利要求11所述的载体，其中所述的第一选择标记被抑制该标记的序列包围。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的载体，其中所述的载体包括不被所述的同源序列包围的第二选择标记，并且其中所述的选择标记为阴性选择标记。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的载体，其中所述的载体包括第三选择标记，其中所述的第三选择标记为阴性选择标记，并且其中所述的第三选择标记位于抑制第一选择标记的序列之间。

15.用如权利要求6或7中任一项所述的核酸分子转染的细胞。

16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述的核酸分子插入到原代细胞的HPRT基因之中。

17.包括可操作地连接到细胞的内源性HPRT启动子的如权利要求6或7中任一项所述的核酸分子的细胞。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的细胞，其中所述的细胞取自属于鸭科的动物。

19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述的动物属于疣鼻栖鸭种cairina moschata。

20.根据权利要求18所述的细胞，其中所述的动物属于绿头鸭种Anas platyrhynchos。

21.根据权利要求15至20中任一项的细胞系，其中其进一步包括编码所需物质的核酸序列。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的细胞，其中其进一步包括允许缺损病毒繁殖的互补盒。

23.如权利要求1至5中任一项所述的多肽、如权利要求6或7中任一项所述的核苷酸分子或如权利要求8至14中任一项所述的载体用于使细胞无限增殖的用途。

24.如权利要求15至21中任一项所述的细胞用于病毒复制的用途。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述的病毒选自牛痘病毒、小鼠痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒或MVA。

26.如权利要求21所述的细胞用于产生所需物质的用途。

27.如权利要求15至22中任一项所述的细胞用于产生病毒的用途。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述的病毒为痘病毒。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述的病毒为痘苗病毒。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述的痘苗病毒为MVA。

31.如权利要求15至21中任一项所述的细胞用于产生重组病毒的用途。

32.使细胞无限增殖的方法，其包括将如权利要求8至14中任一项所述的载体转染到所述的细胞中的步骤。

33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于其进一步包括下述步骤：将所述的细胞在仅允许包含第一选择标记的细胞生长的培养基中培养。

34.根据权利要求32至33中任一项所述的方法，其特征在于其进一步包括下述步骤：将所述的细胞在不允许包含第二选择标记的细胞生长的培养基中培养。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括下述步骤：从所述细胞的基因组中除去第一选择标记。

36.根据权利要求35所述的方法，其中将从所述细胞的基因组中除去第一选择标记的所述步骤后获得的细胞在不允许包括第三选择标记的细胞生长的培养基中培养。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述的细胞取自属于鸭科的生物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的生物属于疣鼻栖鸭种cairina moschata。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述的生物属于绿头鸭种Anas platyrhynchos。

40.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中将所述的核酸分子插入到所述细胞的目标DNA序列中。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述的目标DNA序列为HPRT基因。

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