TWI614342B - 禽類永生化細胞系 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於禽類永生化細胞系，並關於此等細胞於製造病毒方面之用途。本發明之細胞對於製造重組病毒載體尤為有用，製成之重組病毒載體可用於製備針對以動物，尤其是人類為主的疾病之治療及/或預防性組成物。
Description
本發明係關禽類永生化細胞系，並關於此等細胞於製造病毒方面之用途。本發明之細胞對於製造重組病毒載體尤為有效，其所製成之重組病毒載體可用於製備針對以人類為主的動物疾病之治療及/或預防性組成物。
病毒疫苗與其他許多生物科技產物之製造係以真核細胞系為基礎。透過細胞培養製成之生物製品包括酵素、荷爾蒙、生物免疫製品(單株抗體、白細胞介素、淋巴介質)與抗癌劑等。雖然部分較簡單的蛋白質可利用細菌細胞加以製造，但目前較為複雜的醣化蛋白質之製造仍必須仰賴真核細胞。
利用禽類細胞製作病毒載體之技術已行之有年。例如，用以製備天花預防組成物之牛痘病毒即為利用雞胚纖維母細胞(Chicken Embryonic Fibroblast，CEF)培養而得者。許多用於製藥組成物的病毒皆能於禽類細胞中培養而得，因此禽類細胞之用途備受肯定。更有甚者，許多病毒僅能透過禽類細胞加以培養。例如哺乳動物安卡拉病毒(Mammalian Virus Ankara，MVA)即無法於哺乳動物細胞中成長。此種痘病毒係令牛痘病毒於CEF中傳殖逾500代而得，在七零年代早期作為對免疫系統不良者接種之疫苗，用以預防天花。現今MVA主要用作基因治療所需之載體。例如，MVA可作為MUCl基因之載體，爲患者接種以對抗具抗原之腫瘤(Scholl等人，2003年，J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201)。載有爲HPV抗原提供編碼之基因的MVA亦用為卵巢癌治療之載體。近年來，MVA已成為製備用以對抗如西尼羅病毒等新興疾病或如炭疽熱等潛在生物武器之預防療法的最佳載體。
就此觀點，現今世界對於病毒生產的需求乃與日俱增。目前，最
廣為採用的MVA製造法係以CEF進行病毒之複製。然而，CEF的使用卻存有若干困難。首先，CEF之製備包含多項須以人工執行之步驟。
其次，病毒製作程序端賴蛋體之可用性，一旦蛋體於培養過程中受到污染便完全無法使用。此一問題隨著禽流感的蔓延而廣受關注。
同時，許多CEF具有反轉錄酶(RT)活性。RT為繁殖反轉錄病毒所必需之酵素。反轉錄病毒於許多物種中皆可發現。RT對人類或動物並無傳染性，且目前亦未發現其對人類健康造成任何危害之證據。使用高靈敏度聚合酶鏈鎖反應(PCR)試驗，可從以雞胚纖維母細胞製得之疫苗中發現極少量的反轉錄酶活性。該酵素的來源可能是部分為RT提供編碼的病毒基因組，其據信是千百年前即已併合於雞隻細胞中的。產生此種RT的禽類反轉錄病毒就目前已知之領域而言對人類並無影響。雖然人類免疫不全病毒(HIV，亦即導致AIDS的病毒)亦為一種反轉錄病毒，但疫苗中測得的反轉錄酶活性卻絕非來自HIV。此外，RT的存在並不代表反轉錄病毒的存在。即便如此，不具內生反轉錄酶活性的細胞系仍相當受到矚目。
爲使病毒生產程序不再需要使用CEF，一種可供複製與生產病毒之禽類細胞系乃當務之需。永生化細胞系可於生產場所批次保存或冷凍，俾便下一生產程序使用。同時，因其保存於生產場所之中，可相對免於外來污染物的污染威脅。使用此等永生化細胞系將有助於大量降低生產過程仰賴人工操作的比例，從而降低製造程序所需成本與時間，亦使人工操作可能造成之污染風險大幅降低。
並且，此種細胞系可完全特性化，因此可充分符合良好實驗室規範與不同醫療機構之標準。
多種禽類細胞系已為吾人所知。例如，DF1(美國專利第5, 879, 924號)為一種取自10天大東蘭辛系(East Lansing Line)(ELL-0)雞蛋之自發性永生化細胞系。該細胞可用作繁殖病毒、表達重組蛋白質與製造重組病毒之基質。然而，諸如火雞皰疹病毒1(Meleagrid herpesvirus 1)、雞痘病毒(Fowlpox Virus)、里奧病毒(reovirus)、禽類肉瘤白血
病病毒(Avian Sarcoma Leukemia Virus)與勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)等多種病毒皆會對該細胞系造成影響。
永生性禽類細胞亦可產自胚胎幹細胞，作法係令胚胎幹細胞逐步與生長因子與飼養層解離，因而保有未分化幹細胞之生長特徵與無限壽命特性。由此程序可得之唯一禽類細胞系是Ebx雞細胞系(Ebx chicken cell line)(世界專利組織申請案WO2005007840號)，其與鼠類細胞飼養層有關，因此在調控方面較難以掌握，例如可能面臨鼠類病毒污染與雞細胞中的內生反轉錄病毒序列等問題。此外，該細胞系在某些條件下具有變異傾向，難以保持穩定。
相關技術中對於不含內生禽類反轉錄病毒的鴨胚永久細胞系亦有所揭露。此種定名為DEC 99的細胞系(Ivanov等人，Experimental Pathology And Parasitology，4/2000，保加利亞科學院(Bulgarian Academy of Sciences))已培養超過連續140代，且對禽類並無致癌性。DEC 99細胞係為一已用於研究且可滿足生物技術所需之標準細胞培養系統。該細胞係為研究細胞生物學、病毒學、免疫學、毒物學之理想模型，亦為提供診斷及製造疫苗之理想模型。永久鴨胚細胞系(CL)DEC 99感染多種胚適應禽類痘病毒(APV)疫苗之可能性亦可見於相關研究(Ivanov等人，Experimental Pathology And Parasitology，4/62001，保加利亞科學院)。此外尚有FK與Dessau公司分別源自雞與鴿子的疫苗品種。病毒株於初代鴨胚細胞培養(CCs)中連續傳殖(13代)。已適應之病毒株在DEC 99細胞系的細胞培養中持續傳殖(12代)，可觀測到典型的細胞病變效應(CPE)。為11天大的白色來亨雞胚胎進行預防接種後，便不再生成傳染性病毒粒子，而胚胎的絨毛尿囊膜(CAMs)上則出現典型的痘增生現象。FK品種在DEC 99細胞中較Dessau品種更早產生細胞病變效應(CPE)，且到達106, 25 CCID50/ml之滴定濃度。DEC 99適應病毒株在接種兩個月大的雞隻後誘發典型皮膚「反應量」。因此，DEC 99作為一標準CC系統，似可用於製造抗雞痘之疫苗。唯此特定細胞系在40代後成長緩慢，因而不適合於懸浮液中培養。
來自人類腺病毒5早期區的核酸序列已用於體外轉化特定人類細胞(293與PER. C6細胞系；Fallaux, F. J.等人，Hum. Cene Ther. 9: 1909-17 (1998);Craham, F. L.等人，J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977))。
一般型態下，腺病毒基因組係一長度約36 kb的直線型雙股DNA分子，其包含可爲30種以上蛋白質編碼的序列。在其每一端具有一包含100至150個核苷酸(視其血清型而定)的短反向序列，名為反向末端重複序列(inverted terminal repeat，ITR)。反向末端重複序列與腺病毒基因組的複製有關。具有約300個核苷酸的包被區位於基因組的5'端，緊接於5' ITR之後。
早期基因分布於腺病毒基因組中的四個區域，即E1至E4(其中E代表「早期」)。早期區至少包含六個轉錄單位，各有其啟動子。早期基因之表達，本身即受到調控，致使各基因之表達自有先後。E1、E2與E4此三區為病毒複製所必要者。因此，若一腺病毒於此功能中之任一者有所缺陷，亦即假若其無法製造至少一種由該等區域其中之一所編碼之蛋白質，則必須於轉錄時將此蛋白質反式供予該腺病毒。
E1早期區位於腺病毒基因組的5'端，並包含E1A與E1B等兩個病毒轉錄單位。E1早期區可為出現於病毒週期極早階段、且為腺病毒中幾乎所有其他基因之表達所必需的蛋白質提供編碼。尤其，E1A轉錄單位提供編碼之對象包括一可反式激活其他病毒基因之轉錄(包括從E1B、E2A、E2B與E4區域之啟動子轉錄)的蛋白質。
Guilhot等人(Guilhot, C.等人，Oncogene 8:619-24(1993))研究顯示，E1A之12S蛋白質從Ad5進行反轉錄病毒轉導可能導致鵪鶉細胞的永生化。然而，WO2005042728專利申請案揭示當E1A基因係由裸露DNAA之轉染而非由反轉錄病毒之感染而導入時，則無法使禽類細胞永生化。WO2005042728案並進一步指出：「經由反轉錄病毒感染的穩定有效轉導，可產生一細胞池，該細胞池足以收納具有自發基因組變化的個別細胞，其中該等自發基因組變化已阻滯通常由視網膜母細
胞瘤抑制所誘發的凋亡現象。」(第10頁)。
由Guilhot等人研究取得之細胞因出現反轉錄病毒序列，妨礙此等細胞於製造生物製品方面之用途，特別是於製造治療性組成物之用途。
然本案發明人發現禽類細胞，尤其是番鴨(cairina moschata)細胞可透過一非病毒載體經E1A轉染而有效永生化。
為解決各種與使用CEF及/或現有細胞系有關的問題，本發明提供一種含有E1A核酸序列的禽類永生化細胞，而取得該細胞之程序包括以一含有該E1A核酸序列的非病毒載體轉染該細胞之步驟，其中該細胞並不包含E1B核酸序列。
本發明亦關於一種永生化禽類細胞之程序，該程序包括：以一含有一E1A核酸序列的非病毒載體轉染該細胞之步驟，其中該程序並不包含以一E1B核酸序列轉染該細胞。
在此所謂之「永生化細胞」意指一種可於培養中生長35代以上的細胞。
「代數」一詞意指為使細胞維持在一足以刺激進一步生長的低密度而將細胞族群從培養瓶取出並經繼代培養(subculture或passage)的次數。
除非上下文另有明確指出者，否則本文中關於元素或步驟之敘述中所稱「一個」代表「至少一個」、「至少其中第一個」、「一個以上」或「複數個」之概念。例如，「一細胞」之意涵包含複數細胞，並包含該複數細胞之混合。
本文中「及/或」一詞包含「以及」、「或者」與「由該詞所連接之元素的所有或任何其他組合」。
本文中「包含」一語表示該產物、組成物與方法含有所述之元素或步驟，但不排除未敘及之元素或步驟。當「主要由...組成」一語用以定義產物、組成物以及方法時，表示排除其他具有重要性之元素或步驟。以此概念，一主要由所述元素構成之組成物應不排除包含微量污染物與在藥學上可接受之載體。而「由...組成」則表示排除其他成分或步驟之微量元素以外者。
在此所述之「E1A核酸序列」意指腺病毒E1A區所有基因產物之核酸序列，包括可為13S與12S等二主要RNA提供編碼的核酸序列。
較佳地，「E1A核酸序列」包含與SEQ ID NO：1至少具有60%氨基酸序列同源性之核酸序列。於本發明一較佳實施例中，E1A係指一核酸序列其與SEQ ID NO：1之氨基酸同源性至少為70%，最好至少為80%，若至少為90%則更佳。於本發明一較佳實施例中，E1A即為SEQ ID NO：1之核酸序列。
於此所述，「E1B核酸序列」意指腺病毒E1B區所有核酸序列，包含為三種主要多胜肽提供編碼之核酸序列，即19kd與55kd。
於此所述，「大致相同之核酸序列」一語意指與參考多核苷酸具有足量同源性之核酸分子，該核酸分子在適度嚴格雜交條件下會與參考核苷酸產生雜交。於一較佳實施例中，核酸分子具有與SEQ ID NO：1之參考核苷酸序列大致相同之核苷酸序列。
雜交意指核酸之互補股(亦即正義：股或探針反義：標的DNA)經由氫鍵而相互銜接，與染色體DNA中自然產生之鍵結相似。精於此技藝人士應可輕易變化雜交已知探針與標的DNA所雜交條件的嚴格度。
在此所述之「嚴格雜交」一語意指在此條件下多核酸合成物(hybrids)可保持穩定。如所屬技術領域人士所知，合成物之穩定性係反映於合成物之熔融溫度(Tm)。一般而言，合成物穩定性取決於鈉離子濃度與溫度。通常，雜交反應係先於低嚴格度之條件下執行，而後於嚴格度可變，但較高之條件下進行洗滌。因此，論及雜交嚴格度，其係取決於上述之
洗滌條件。
在此所述「適度嚴格雜交」一語意指一雜交條件，其允許標的DNA與一互補核酸鍵結，其中該互補核酸與該目標DNA具有約60%同源性，較佳為約75%同源性，若具有約85%同源性則更佳，若與該標的DNA具有約90%以上同源性則最佳。較佳地，適度嚴格條件為在50%甲醯胺、5*Denhart's溶液、5*SSPE、0.2% SDS於42℃進行雜交，並接著以0.2*SSPE、0.2% SDS於65℃進行雜交後洗滌。
在此所述「非病毒載體」尤其指一源自質體之載體，且該載體可選擇性地與一或多個增進物質結合，此等增進物質之作用在於當以該載體投注於一宿主有機體之免疫系統進行體內處理時，可增進該載體之轉染效能及/或穩定性及/或保護該載體。此等物質已廣泛揭露於習知此技藝者可取得之文獻中(例如請見Felgner等人，1987年，Proc.West.Pharmacol.Soc.32,115-121；Hodgson與Solaiman，1996年，Nature Biotechnology 14,339-342；Remy等人，1994年，Bioconjugate Chemistry 5,647-654)。此等物質可為，但不限於，聚合物、脂質，尤其為陽離子脂質、脂質體、核蛋白質或中性脂質。且此等物質可單獨使用或混合使用。此等化合物之範例尤可見於WO 98/08489、WO 98/17693、WO 98/34910、WO 98/37916、WO 98/53853、EP 890362或WO 99/05183等專利申請案。可能的結合範例之一為一結合有陽離子脂質(DOGS、DC-CHOL、精胺-膽固醇、精三胺-膽固醇等等)與中性脂質(DOPE)的質體重組載體。
可用於本發明的質體選擇範圍相當廣泛。其可為純系複製及/或表達載體。一般而言，此等質體為所屬技術領域者熟知，且部分已可從市面購得；但其亦可為以遺傳工程技術加以建構或改造者。例如，此等質體可能取自pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4 (Invitrogene)或p Poly(Lathe等人，1987年，Gene 57,193-201)。本發明採用之質體最好包含一複製起點，以確保在一製造細胞及/或宿主細胞中開始複製(例如，若欲於大腸桿菌中製造一
質體，可為該質體選擇ColE1起點；若欲於哺乳動物宿主細胞中自我複製，則可選擇oriP/EBNA1系統。Lupton與Levine，1985年，Mol.Cell.Biol.5,2533-2542；Yates等人，Nature 313，812-815)。其可包含其他元素，用以加強其維持性及/或於一已知細胞中的穩定性(促進一質體單體維持的cer序列(Summers與Sherrat，1984年，Cell 36，1097-1103，sequences for integration into the cell genome)。
「非病毒載體」不包含病毒載體，例如由痘病毒(牛痘病毒，尤其是MVA、金絲雀痘病毒等)、腺病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、阿爾法病毒、泡沫病毒或腺相關病毒取得之載體。
本發明亦關於由本發明之細胞取得之複數細胞。在此所述之「取得」意指自本發明之細胞發展或分化而出之細胞、或以本發明之細胞為祖先的細胞。
代數意指為使細胞維持在一足以刺激進一部生長的低密度而將細胞族群從培養瓶取出並經繼代培養(subculture或passage)的次數。
在此所述，「轉染」意指本發明細胞之穩定轉染或過渡性轉染。
「穩定轉染」或「穩定地轉染」意指將外來核酸序列引入或整合於受轉染細胞之基因組。「穩定轉染體」意指一細胞已將外來DNA穩定整合至其基因DNA中者。
根據本發明之一較佳實施例，本發明之禽類細胞係取自一雁鴨科(Anatidae family)或雉科(Phasianidae family)之細胞。在雁鴨科中，又以番鴨屬(Cairina genus)或綠頭鴨屬(Anas genus)之細胞較為理想。更理想之條件下，本發明之細胞屬於番鴨種(Cairina moschata)或綠頭鴨種(Anas platyrhynchos)。
較理想地，本發明之細胞係取自一胚胎有機體。將細胞由一有機活體取下的方法已為所屬技術領域人士所熟知。例如，可利用範例2所揭示之方法。根據本發明之一較佳實施例，係從一0至20天大的雁鴨科胚胎取得初代細胞，更理想者是從一5至15天大的雁鴨科胚胎取得初代細
胞，而最理想之來源為11至14天大的雁鴨科胚胎。
根據本發明之一較佳實施例，係將E1A核酸序列插入本發明細胞之一標的DNA序列中。
在此所述，「標的DNA序列」係指一欲以載體進行同源重組改造的細胞，其基因組中之一預定區域。標的DNA序列包含結構基因(亦即可為多胜肽編碼的DNA序列，在此案例中所謂多胜肽包括真核生物、內含子與外顯子)、諸如增強子序列等調控序列、啟動子等，以及相關基因組中之其他區域。標的DNA序列亦可為一序列，當其做為一載體之標的時，對宿主基因組之機能不產生影響。
在此所述，「插入一標的DNA序列中」廣泛指稱同源重組程序，該程序中將永生化基因插入於被標定的DNA序列中，造成該序列產生刪除或錯位之情形。
根據本發明，在將E1A核酸序列插入一標的DNA序列，以製造禽類永生化細胞之程序中採用的載體可進一步包含兩個同源序列，此二同源序列能夠與該細胞基因組內一原生之標的DNA序列中之一區域進行同源重組。
該等同源序列之存在，允許本發明之核酸分子藉由同源重組而對該標的DNA序列實現位點特異性插入。
「同源重組」意指兩個DNA分子間實質相同之核苷酸序列位點之DNA片段相互交換。根據本發明之實施例，載體內存之序列係同源於標的DNA序列之序列片段。根據本發明之一較佳實施例，轉移載體內的同源序列與標的序列之區域為百分之百同源。然而，較低度的序列同源性亦為可行，序列同源性可低至約80%。
轉移載體內的同源序列長度至少為25bp。其涵蓋區域越長越好，較佳地為至少500bp，更佳地為至少5000bp。
根據本發明之一更佳實施例，該核酸分子受載體內的同源序列所包
圍。
在此所述，所謂「包圍」意指該等同源序列之一位於本發明核酸分子之上游，且該等同源序列之一位於本發明核酸分子之下游。在此所述，「包圍」之概念並不限於兩個同源序列直接連接於該永生化基因之3’端或5’端。永生化基因與同源序列可以不限數量之核苷酸之間隔，間接相連。
習知此技藝人士可選用適當的同源序列，以於欲接受永生化處理的細胞基因組中標定一特定DNA序列。例如，一同源序列可與該被標定的特定序列為部份同源，而另一同源序列則與一位於該被標定的特定序列上游或下游的DNA序列同源。根據另一範例，該同源序列之一可與位於該被標定的DNA序列上游的DNA序列同源，而另一同源序列則與位於該被標定的DNA序列下游的DNA序列同源。在另一範例中，兩個同源序列皆與位於該標的DNA序列中的序列同源。
根據本發明之一較佳實施例，該標的DNA序列為一HPRT(次黃嘌呤磷酸核醣基轉移酶，Hypoxanthine phosphorybosyl transferase)基因。
包含番鴨(cairina moschata)HPRT啟動子與HPRT基因的基因組序列可見於SEQ ID NO：2。為HPRT編碼的序列啟始於SEQ ID NO：2核酸序列中8695位點的ATG密碼子，在此ATG密碼子上游的序列為HPRT啟動子序列。
為將E1A核酸序列整合入HPRT基因，精於此技藝人士可選擇所需之同源序列。在一家族的多個成員中，為HPRT編碼的基因組序列為高度同源。精於此技藝人士亦可設計出標定每種禽類細胞HPRT基因所需的同源序列。
根據本發明之一更佳實施例，同源序列係根據將E1A核酸序列插入該細胞HPRT啟動子下游之目的而設計。在此實施例中，本發明之核酸分子可作用地連結於細胞之內生HPRT啟動子。「可作用地連結」意指E1A核酸序列連接於啟動子之方式允許其於該細胞中之表達。
根據此實施例，位於本發明核酸分子上游之同源序列較佳地具有一核酸序列，該核酸序列係與至少500個鄰近之bp同源，較佳地則與該核酸序列的至少5000個鄰近bp同源，其中該核酸序列始於SEQ ID NO：2位置1的核苷酸，且止於位置8694的核苷酸，但同時該同源序列不與SEQ ID NO：2中以位置8695之核苷酸起始並以位置26916之核苷酸終結的核酸序列同源。此外，該上游同源序列較佳地為直接連結於E1A核酸序列的起始密碼子。根據本發明之一更佳實施例，本發明核酸分子上游的同源序列係存在於該始自SEQ ID NO：2中位置1之核苷酸且止於位置8694之核苷酸的核酸序列。E1A核酸序列下游的同源序列較佳地具有一核酸序列，其係與至少500個鄰近之bp同源，較佳地則與該核酸序列的至少5000個鄰近bp同源，其中該核酸序列為始於SEQ ID NO：2核酸序列位置10580的核苷酸並止於位置18009的核苷酸。更理想的是，E1A核酸序列下游的同源序列係存在於該始自SEQ ID NO：2中位置10580之核苷酸並止於位置18009之核苷酸的核酸序列。
據此，本發明亦關於一禽類細胞，其包含一E1A核酸序列，且其特徵在於取得該細胞之程序包含：以一包含該E1A核酸序列的非病毒載體轉染該細胞之步驟，其中該細胞並不包含一E1B核酸序列，且其中該E1A核酸序列可作用地連結於該細胞之內生HPRT啟動子。
根據本發明之一較佳實施例，本發明程序所採用的該載體包含一第一選擇標記，其中此第一選擇標記為一正選擇標記，且其中該第一選擇標記係受包含於該載體中的同源序列包圍。以此概念，發生於該載體與該細胞基因組間的同源重組程序導致E1A核酸序列的整合與第一選擇標記的整合。當轉化載體為環形時，「被包圍」意指第一選擇標記與E1A核酸序列係位於該載體中由該等同源序列所界定的同一段落中。
在此所述，正選擇標記尤指一可為一產物編碼之基因，其僅使載有該基因之細胞在特定條件下存活及/或成長。典型的選擇標記係為蛋白質提供編碼，該等蛋白質或為可賦予抗生素或其他毒素(例如氨比西林
(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲氨喋昤(methotrexate)或四環素(tetracycline))抗性者，或為營養不足之補充物，或可供應無法自複合培養基取得的重要營養素。在本發明之一較佳實施例中，該第一選擇標記係編碼一蛋白質，而該蛋白質則可賦予抗生素抗性。
第一選擇標記之整合有助於篩選已合併有E1A核酸序列的細胞。據此，本發明之程序可進一步包含一步驟，其中係在一培養基中培養該等細胞，然此培養基僅允許結合有該第一選擇標記的細胞於其中成長。例如在一包含抗生素之培養基中進行培養。
根據本發明之一更佳實施例，該載體中的第一選擇標記係受序列包圍，其中該等序列對該第一選擇標記發揮抑制效果。對該第一選擇標記發揮抑制效果的該等序列並不包圍該E1A核酸序列。當載體為環形時，對該第一選擇標記發揮抑制效果的該等序列、該第一選擇標記與該E1A核酸序列均位於該轉化載體中由該等同源序列所界定的同一段落中。
可對一核酸片段發揮抑制效果的序列已為精於此技藝人士所習知(Nunes-Duby,S.等人(1998)Nucleic Acids Res.26：391-406)。此等序列可由一或多種特定酵素加以鑑別，該等酵素稱為「重組酶」，可引發包含於該等序列間之核酸的抑制作用。例如，可對一核酸片段發揮抑制效果的三種已知重組酶為FLP、ISCE1與Cre重組酶。
Cre重組酶是典型的位點特異性重組酶。Cre為噬菌體P1其cre(環化重組，cyclization recombination)基因的一種38-kDa產物，且為一種屬於可結合家族(Int family)的位點特異性DNA重組酶(Sternberg,N.等人(1986)J.Mol.Biol.187：197-212)。Cre可辨識出P1基因組上一稱為loxP(P1的X染色體交換位置)的34bp位點，並有效催化loxP位點對之間的交互保留DNA重組。該loxP位點係由兩個位於一8bp非迴文核心區域兩側的13bp反向重複序列組成。發生於兩個直接重複loxP位點之間的Cre介導重組造成其間DNA的切除，因而形成一共價封閉環。而發生於數對loxP位點間的反向Cre介導重組則將造成中間DNA的反轉而非切除。DNA的斷裂與
接合僅限核心區內的不連續位置，且藉由與酵素的暫時性磷酸化酪胺酸DNA-蛋白質連結，一次進行於一股。
另一位點特異性重組酶為I-SceI。其他內含子歸巢內切酶，例如I-TliI、I-CeuI、I-CreI、I-PpoI與PI-PspI，亦可用於本發明之程序中取代I-SceI。Belfort與Roberts((1997)Nucleic Acids Research 25：3379-3388)已提出許多可用之選擇。許多此等內切酶係取自細胞器基因組，其中密碼子之用法不同於標準細胞核密碼子的用法。將此等基因用於其內切酶之細胞核表達時，可能必須修改編碼序列以配合細胞核基因的編碼序列。I-SceI為一種雙股內切酶，可在其辨識位點內切割DNA。I-SceI產生一具有3'OH懸端的4bp交錯切割。
酵素I-SceI具有已知辨識位點，該辨識位點為一超過18bp的非對稱序列。
5'TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3'ATCCCTATTGTCCCATTA5'
另一位點特異性重組酶為FLP重組酶，其可辨識一獨特的34bp最小位點，該位點僅可容受其辨識序列出現有限退化(Jayaram，1985年；Senecoff等人，1988年)。FLP重組酶與FRT序列的交互影響已經檢驗(Panigrahi等人，1992年)。不同FRT序列的範例已見於Jayaram(1985年)與Senecoff等人(1988年)之研究，而在不同基質上進行Flp介導重組之實驗則可見於Snaith等人(1996年)之專文。
據此，本發明之程序可進一步包含一步驟，其在於抑制來自該初代細胞基因組的該第一選擇標記。為抑制該第一選擇標記，在此係利用可為一重組酶提供編碼之基因轉染該細胞，其中該重組酶係專門用於可對該第一選擇標記發揮抑制效果的序列。用以將該基因轉化入該細胞的方法與載體皆為此技藝中所習知，例如可使用本發明範例4所述之方法。亦可使用上述之載體。
根據一較佳實施例，本發明程序中之該載體包含一不為該等同源序列所包圍的第二選擇標記，其中該第二選擇標記為一負選擇標記。當用於本發明程序之載體為環形時，該第二選擇標記尤為有用。該第二選擇標記之存在有助於破壞已歷經同源重組程序並已插入不含該E1A核酸序列之轉化載體片段的細胞。當載體為環形時，該第二選擇標記並不被該等同源序列所包圍，意謂該第二選擇標記與該E1A核酸序列並非位於該轉化載體中由該等同源序列所界定的相同段落中。
據此，本發明之程序可進一步包含一步驟，其中係將該等細胞於一培養基中進行培養，然此培養基僅允許尚未合併有該第二選擇標記的細胞於其中生長。此步驟可與前文所述之將初代細胞培養於僅容許含有該第一選擇標記的細胞於其中生長的培養基中培養的步驟同時進行或分別進行。
根據本發明之一較佳實施例，該載體包含一第三選擇標記，其中該第三選擇標記為一負選擇標記，且其中該第三選擇標記位於可對該第一選擇標記進行抑制作用的序列之間。這表示抑制該第一選擇標記之步驟亦將導致第三選擇標記受到抑制。第三選擇標記有助於破壞已存在有第一選擇標記之細胞。當載體為環形時，該第三選擇標記係位於可對該第一選擇標記發揮抑制作用的序列之間，意謂該第三選擇標記與該第一選擇標記係位於該轉化載體內由該等可對該第一選擇標記發揮抑制作用的序列所界定之同一段落中。
在此所述，負選擇標記尤指一基因，其可在特定條件下為可殺死帶有該基因之細胞的產物編碼。此等基因尤其包含「自殺基因」。由此等基因所編碼之產物可轉化一細胞毒素化合物中的前驅藥。目前已有許多為人熟知的自殺基因/前驅藥配對，例如：-單純皰疹病毒第一型胸腺嘧啶激酶(HSV-1 TK)與環孢子素或更昔洛韋(GCV)(Caruso等人，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7024-7028；Culver等人，1992年，Science 256,1550-1552；Ram等人，
1997年，Nat.Med.3,1354-1361)；-細胞色素p450與環磷醯胺(cyclophosphophamide)(Wei等人，1994年，Human Gene Therapy 5,969-978)；-取自大腸桿菌(E.coli)的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase)與6-甲基嘌呤去氧核苷(6-methylpurine deoxyribonucleoside)(Sorscher等人，1994年，Gene Therapy 1,233-238)；-取自大腸桿菌的鳥糞嘌呤磷酸核醣基轉化酶(guanine phosphoribosyl transferase)與6-硫黃嘌呤(6-thioxanthine)(Mzoz與Moolten，1993年，Human Gene Therapy 4,589-595)；-胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CDase)與5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5FC)；-FCU1與5-fluoro-cytosine(5FC)(WO9954481)；以及-FCU1-8與5-fluoro-cytosine(5FC)(WO2005007857)。
上述第三選擇標記協助選擇出其中已發生該第一選擇標記抑制作用的細胞。據此，本發明之程序可進一步包含一步驟，其中係在一培養基中培養該等細胞，然此培養基不允許包含該第三選擇標記的細胞於其中成長。例如，包含5-Fluorocytosine之培養基即不允許包含FCU1作為第三選擇標記的細胞生長。
該第一、第二與第三選擇標記可分別使用。例如，用於本發明程序中的載體可包含第一與第三選擇標記，但不包含第二選擇標記；或者，該載體包含第二與第三選擇標記，但不包含第一選擇標記。
根據本發明之一較佳實施例，該E1A核酸序列、第一、第二及/或第三選擇標記之設置係受到其在欲永生化細胞中進行表達所需元素的控制。
表達所必需的元素係由一組允許將核苷酸序列轉錄至DNA及允許將mRNA轉譯為多胜肽之元素所組成，尤其是對該細胞有效的啟動子序
列及/或調控序列，且選擇性地為允許標的細胞表面對該多胜肽產生分泌或表達的序列。此等元素係為可調控或可建構的。當然，啟動子應適用於所選用的載體與宿主細胞。例如，磷酸甘油酸酯激酶(Phospho Glycerate Kinase，PGK)、金屬硫蛋白(metallothionein，MT；Mclvor等人，1987年，Mol.Cell Biol.7,838-848)、a-1抗胰蛋白酶(a-1 antitrypsin)、CFTR等基因的啟動子，可為肌肉肌酸激酶、肌動蛋白肺表面活性物質、免疫血球素或β-肌動蛋白等編碼之基因的啟動子(Tabin等人，1982年，Mol.Cell Biol.2,416-436)、SRa？(Takebe等人，1988，Mol.Cell.8,466-472)、SV40病毒(Simian Virus)早期啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)LTR、MPSV啟動子、TK-HSV-1啟動子、細胞巨大病毒(Cytomegalovirus，CMV)早期啟動子等。其中以細胞巨大病毒(CMV)早期啟動子尤其理想。
本發明更關於，但不限於，一種將一細胞永生化之程序，該程序包含以下步驟：
-將一載體轉入一禽類細胞，該載體包括：
■一E1A核酸序列，其為同源序列包圍。
■一第一選擇標記，其中該第一選擇標記為一正選擇標記，且其中該第一選擇標記受該等同源序列包圍。
■複數序列，其可對該第一選擇標記發揮抑制作用。
■一第二選擇標記，其不受該等同源序列包圍，其中該第二選擇標記為一負選擇標記。
■一第三選擇標記，其中該第三選擇標記為一負選擇標記，且其中該第三選擇標記係位於可對該第一選擇標記發揮抑制作用的該等序列之間。
-在一培養基中培養該等細胞，該培養基僅允許結合有該第一選擇標記之細胞於其中成長。
-在一培養基中培養該等細胞，該培養基不允許已結合有該第二選擇標記之細胞於其中成長。
-將該第一選擇標記從該細胞之基因組中排除。
-在一培養基中培養該細胞，該培養基不允許含有該第三選擇標記之細胞成長。
本發明之細胞可進一步包含一或多個允許缺陷病毒繁殖的核酸序列。所謂「缺陷病毒」意指該病毒中之一或多個複製所需的基因遭到去除或變為無效。「允許缺陷病毒繁殖的核酸序列」意指一核酸序列反式供應允許缺陷病毒繁殖的功能。換言之，該核酸序列可為複製與包被該缺陷病毒所需之蛋白質提供編碼。
本發明之細胞亦可包含一可為一特定所需物質提供編碼之核酸序列。在此所述，特定所需物質可能包含，但不限於，在藥學上具活性之蛋白質，如生長因子、生長調控子、抗體、抗原、其可用於免疫或接種等用途的衍生物、白細胞介素、胰島素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或其組合、干擾素，如干擾素-a、干擾素-β、干擾素-？，凝血因子，例如Factor VIII、Factor IX或tPA或其組合。「特定所需物質」亦可為工業酵素，例如用於紙漿與紙、紡織原料改性或乙醇生產之酵素。最後，「特定所需物質」亦可為蛋白質補充品或供動物食用的營養加值產物。
根據本發明之一較佳實施例，本發明之細胞亦包含一核酸序列，其可為一重組端粒酶反轉錄酶編碼，且尤其是為EP 06 36 0047.2所述之重組端粒酶反轉錄酶編碼。在EP 06 36 0047.2所述發明之一較佳實施例中，可為該重組端粒酶反轉錄酶編碼之核酸序列與EP 06 36 0047.2中SEQ ID NO：2之核酸序列具有至少70%之同源性，若至少具有90%之同源性則更佳，若至少具有95%之同源性尤佳。EP 06 36 0047.2中所述可為該重組端粒酶反轉錄酶編碼之較佳核酸序列為該案SEQ ID NO：2所定義者。EP 06 36 0047.2中所述端粒酶反轉錄酶核酸序列SEQ ID NO：2與本發明之端粒酶反轉錄酶核酸序列SEQ ID NO：3相對應。因此，根據本發明
之一較佳實施例，本發明之細胞亦包含一可為一重組端粒酶反轉錄酶編碼之核酸序列，且該重組端粒酶反轉錄酶與SEQ ID NO：3最好具有至少70%之同源性，若至少具有90%之同源性則更佳，若至少具有95%之同源性尤佳。更理想的，可為該重組端粒酶反轉錄酶編碼之核酸序列為SEQ ID NO：3(dTERT)所定義者。
經由本發明程序取得之細胞、本發明之細胞、與由其所取得之細胞對於病毒之複製尤有功效。該等病毒可為活性、減毒、重組或非重組病毒。更詳而言之，該等細胞對於痘病毒(牛痘病毒，特別是MVA、金絲雀痘病毒等等)、腺病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、甲型病毒、泡沫病毒或腺病毒相關病毒之複製尤為有效。
反轉錄病毒具有可感染細胞之特性，且通常可與細胞結合並使其分裂，因此尤適於與癌症相關之應用。一重組反轉錄病毒通常包含LTR序列、一包被區以及本發明之核苷酸序列，其中該核苷酸序列係置於反轉錄病毒的LTR或如上所述內部啟動子的控制之下。反轉錄病毒的載體可包含變型，尤其是在LTR中(以真核細胞啟動子取代啟動子區域)、或在包被區域中(以異源包被區域取代，例如VL30型)(請見法國專利申請案94 08300與97 05203兩案)。
腺病毒載體可缺乏至少一複製所必需區域的部份或全部，該區域係選自E1、E2、E4與L1 L5區域。最好刪除該E1區域。然而，刪除該E1區域之動作可與其他影響E2、E4及/或L1 L5等區全部或部份的改造/刪除動作結合。例如，若能刪除E1區域主要部分與E4轉錄單元則尤為理想。為增強複製能力，腺病毒載體可同時缺乏非必要E3區域之部份或全部。在另一替選實施例中可使用一最小腺病毒載體，其保留包被所必需之序列(亦即5'端與3'端ITR(反向末端重複序列))與包被區域。不同的腺病毒載體與其製備之技術係為已知(例如可參見Graham與Prevect，1991年，Methods in Molecular Biology，Vol.7,p.109-128；E.J.Murey主編，The Human Press Inc)。
痘病毒家族包含索帶痘病毒與昆蟲痘病毒兩個子家族。在其中，本發明之痘病毒較佳地係選自包含以下病毒之群組：正痘病毒(Orthopoxviruses)、副痘病毒(Parapoxviruses)、禽痘病毒(Avipoxviruses)、羊痘病毒(Capripoxviruses)、野兔痘病毒(Leporipoxviruses)、豬痘病毒(Suipoxviruses)、軟體動物痘病毒(Molluscipoxviruses)以及亞塔痘病毒(Yatapoxviruses)。根據一更佳實施例，本發明之痘病毒為正痘病毒。
正痘病毒較佳地為牛痘病毒，更佳地為經改造之牛痘病毒安卡拉(MVA)，尤其是MVA 575(ECACC V00120707)與MVA-BN(ECACC V00083008)。
「重組病毒」一詞意指包含一外成序列插入其基因組中之病毒。在此所述，外成序列意指非天然出現於該病毒內之核酸。
在一實施例中，外成序列可為一具有直接或間接細胞毒化作用之分子編碼。所謂「直接或間接」細胞毒化，意指由該外成序列編碼之該分子其自身具有毒性(例如蓖麻毒蛋白、腫瘤壞死因子、白細胞介素-2、干擾素-？、核醣核酸酶、去氧核醣核酸酶、綠膿桿菌外毒素A)，或經變形以形成一有毒產物，或其可作用於他物以形成一有毒產物。揭示於Lamb等人所做研究(Eur.J.Biochem.，1985年，148,265-270)的蓖麻毒蛋白cDNA序列在此以引用的方式併入本文。
在本發明之一較佳實施例中，該外成序列為一自殺基因。一自殺基因可為一可將相對無毒之前驅藥轉換為毒性藥物之蛋白質編碼。例如，胞嘧啶脫氨酶將5-fluorocytosine(5FC)轉換為5-fluorouracil(5FU)(Mullen等人(1922)PNAS 89,33)，而單純皰疹酵素胸腺嘧啶核苷酵素則可提高細胞對抗病毒劑更昔洛韋(GCV)或阿昔洛韋之治療的敏感度(Moolten (1986)Cancer Res.46,5276；Ezzedine等人(1991)New Biol 3,608)。或者亦可使用如大腸桿菌或酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等任一有機體的胞嘧啶脫氨酶。
因此，在本發明之一更佳實施例中，該基因可為一具有胞嘧啶脫氨
酶活性的蛋白質編碼，若能為WO2005007857與WO9954481等專利申請案所述之蛋白質編碼則更佳。
在另一實施例中，該外成基因可為一核酸酵素編碼，其中該核酸酵素可切割被標定之RNA或DNA。該待切割的標定RNA或DNA為該細胞功能所必需且其切割將造成細胞死亡。抑或該待切割的標定RNA或DNA係可為一致癌基因產物等不良蛋白質編碼的RNA或DNA，且其切割可防止細胞罹癌。
在另一實施例中，該外成基因可為一反義RNA編碼。
「反義RNA」意指一RNA分子，其與來自一可為一蛋白質編碼的mRNA分子的表達雜交並干擾之，或與該細胞中另一RNA分子，如pre-mRNA或tRNA或rRNA雜交，或與來自一基因的表達雜交並干擾之。
在本發明另一實施例中，該外成序列取代一標的細胞中一缺陷基因的功能。包含人類在內的哺乳類動物有數千種遺傳性基因疾病均肇因於缺陷基因。此等基因疾病之範例包括囊狀纖維化症(其已知係源自CFTR基因之質變)、裘馨氏肌肉萎縮症(其已知係源自抗肌萎縮蛋白基因之質變)、鎌刀狀細胞病(其已知係源自HbA基因之質變)。許多型態之癌症皆因缺陷基因而產生，尤其是經質變的原癌基因與腫瘤抑制基因。
原癌基因包括ras、src、bcl等等，而腫瘤抑制基因包括p53與Rb。
在本發明之另一實施例中，該外成序列可為一腫瘤相關抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)編碼。相較於同型組織的非腫瘤細胞，TAA分子更常或更密集出現於腫瘤細胞。TAA之範例包括但不限於CEA、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、MUC-1、MUC-2、點突變ras致癌基因、一般或點突變p53、過表達p53、CA-125、PSA、C-erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、存活蛋白與LRP。根據本發明之一較佳實施例，TAA為MUC1。
該重組病毒可包含一種以上之外程序列，且每一外成序列可為一種以上分子編碼。例如，可為TAA編碼的外成序列與可為細胞激素編碼的外成序列可用於同一種重組痘病毒。
在本發明另一實施例中，該外成基因可為一抗原編碼。在此所述「抗原」係指一種可為一抗體結合的配體，配體本身並不需具免疫產生性。
該抗原較佳地係取自一病毒，例如HIV-1(如gp 120或gp 160)、任一種貓免疫缺陷病毒、人類或動物皰疹病毒，例如gD或其衍生物或立即早期蛋白，如來自HSV1或HSV2的ICP27、細胞巨大型病毒(如gB或其衍生物)、水痘帶狀皰疹病毒(如gpI、II或III)或取自一肝炎病毒，例如B型肝炎病毒，像是B型肝炎表面抗原或其衍生物、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒(較佳地為來自基因型1b strain ja的非結構蛋白質)與E型肝炎病毒，或取自其他病毒的病原體，例如呼吸融合病毒、人類乳突病毒(較佳地為來自HPV16 strain的E6與E7蛋白質)或流感病毒，或取自細菌病原體，例如沙門氏菌、奈瑟氏菌、疏螺旋體(例如OspA或OspB或其衍生物)、或衣原體或博德氏菌，如P.69、PT與FHA、或取自寄生蟲，如瘧原蟲或弓形蟲。
範例：：
範例1：包含一E1A核酸序列的禽類永生化細胞之建立。
A.質體構成
A-1.供隨機插入之質體構成
使用之質體與番鴨基因組(質體E1A)無任何特定之同源序列(第一圖)。
A-2.供標的插入之質體構成
建構一質體，其包含兩個與番鴨HPRT基因同源並包圍該E1A核酸序列(SEQ ID NO：1)的5kb片段以及兩個篩選標的。將為次黃嘌呤磷酸核醣
基轉移酶編碼的HPRT基因選為該E1A核酸序列組成型表達的適當位點。
二選用的選擇標記為CMV啟動子(Thomsen等人，P.N.A.S.，1984年，81.3：659-63)控制下的FCU1基因(Erbs等人，Cancer Res.，2000.15.60.：3813-22)與SV40啟動子控制下的抗新徽素(嘌呤黴素)基因。抗新徽素(或嘌呤黴素)抗力與FCU-1表達盒受Sce1切割位點包圍，允許篩選盒從最終細胞系的去除。
HPRT基因之外插有一可為HSVTK編碼並受RSV啟動子驅動的選擇標記(第二圖)。
B.由番鴨蛋與子族群敘述製備CEC。
B.1由12天大番鴨蛋與子族群敘述製備CEC。
25個無特殊病原菌(SPF)受精卵於37.5℃孵育。於12天後依可得實驗方法將蛋打開。
絞碎23個胚胎，以杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌一次並於室溫下之TrypLE Select細胞解離劑(Invitrogen)中進行分解5小時。
以離心機低速離心後之細胞於補充10%胎牛血清(FCS)與0.04g/L健大黴素(gentamycine)的基礎培養基(MBE)中回溶，播種於500cm2細胞培養角瓶並於37℃、5% CO2中孵育。
24小時後將融合細胞從培養瓶中取出，使用TrypLE Select細胞解離劑(5mL/細胞培養角瓶)加以解離，部分細胞再次播種於175cm2培養瓶，因而取得第二代。剩下的細胞於適當的培養基(60%BME、30%FCS與10%DMSO)中濃縮至107cell/mL濃度並於異丙醇調節容器(NALGENE.R.“Mr.Frosty”1℃ Container)中冷凍至-80℃，而後移入液化氮以供長期保存，因此構成初始細胞庫(50x1，5.107cells/vial，44x1.107cells/vial)。
繼續培養的細胞傳殖達18代，將條件培養基以低速離心處理，收集前三代中非貼壁細胞，重新播種並以與初代培養相同之方式繼續培養。
將培養生命週期中顯示不同型態學特徵的子族群以可複製的方式抽提。
B.2.從19天大番鴨蛋與子族群敘述製備CEC。
將29個取自AFFSSA Ploufragan的無特殊病原菌(SPF)番鴨蛋於37.5°C潮濕大氣中孵育。
於19天後將蛋打開，以無菌方式提取胚胎。取下20個胚胎的頭、肢與肝臟以供其他細胞製備之用。將胚胎軀幹絞碎，以杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水洗滌一次(Sigma，Ref.D8537，Lot 46K2428)並於37℃，500mL的TrypLE Select細胞解離劑(Gibco,Ref.12563,Lots 1319986 and 1339844)中分解2小時。
以離心機速度2000rpm離心5分鐘後之細胞於補充10%胎牛血清(JRH,Ref.12003-1000M,Lot.5A0102,Code TG P4001Q)、0.04g/L健大黴素(gentamycine)與4mM L-谷氨醯胺(L-Glutamine)的BME(Basal Medium Eagle,Gibco,Ref.41010,Lot 8270)中回溶。將最終量為1.5L(1.9.106cell/mL)之懸浮液播種於10個500cm2細胞培養角瓶並於37℃，5% CO2中進行孵育。
24小時後將融合細胞以PBS洗滌並從培養瓶中取出，使用TrypLE Select細胞解離劑解離。計算細胞並將其於2000rpm下離心4-5分鐘。沉澱物以適當培養基(60%BME、30%FCS與10% DMSO)之濃縮至5.106或107cell/mL。將懸浮液裝填入冷凍小管cryovials(Nunc)冷凍於-80℃，並以-20℃冷凍2小時，而後移入液化氮以供長期保存，因此構成CETC19p1(鴨驅幹胚胎細胞(Duck Torso Embryonic Cells)，19天大胚胎，代數1)初代細胞庫(110cryovials，107cells/vial)。
在本發明一較佳實施例中，番鴨蛋的CEC製備依照上述B.2.之方法(採用19天大番鴨蛋進行培養)。
C.轉染方法
習知技術中已有多種轉染方法，用以導入能夠引領相關核苷酸序列之表現的載體。此等方法例如為CaPO4沉澱法、電撃法、脂質體轉染法等等。本發明提供的範例之一係基於CaPO4沉澱法程序。
細胞應為約80-50%滿。於CaPO4/DNA加入前兩小時更換培養基。將30μg DNA回溶於31μl2M CaCl2-161.3mM Tris pH 7.6之中。加入水將最終量為調整0.5ml。
以下提供兩種選擇：
a)經由轉染，0.5ml的2X HEBS分解於15ml無菌Falcon試管，且將之滴加入邊輕攪或鼓泡的DNA溶液。溶液應成乳狀。混合物靜置室溫中10-30分鐘。而後以無菌移液管在組織培養櫃中將培養瓶中混合物取出滴加入細胞。接著將細胞於37℃下孵育或6小時至隔夜。待細緻沉澱物覆蓋細胞表面。繼而將之置於甘油溶液加溫至37℃完成轉染程序。吸出培養基，加入5ml BME洗滌細胞層，而後將培養基吸出並加入1ml甘油溶液2分鐘以下。接著將10ml BME輕加入以稀釋甘油，並將BME-甘油混合物完全取出。而後加入10ml理想的培養基並將培養皿於適當溫度孵育。
或
b)經由轉染，0.5ml的2X HEBS分解於15ml無菌Falcon試管，且將之滴加入邊輕攪或鼓泡的DNA溶液。溶液應成乳狀。混合物靜置室溫中10-30分鐘。而後以無菌移液管在組織培養櫃中將培養瓶中混合物取出滴加入細胞。待細緻沉澱物覆蓋細胞表面。接著將細胞於37℃下孵育或6小時至隔夜。
於本發明脂較佳實施例中，該轉染(CaPO4沉澱法)較佳地係根據b)所述的方法進行。
D.篩選方法
D-1.隨機插入之篩選方法：
轉染後48-72小時施以選擇壓力：以TrypLE select分解細胞，低速離心並以FCS 10%及G418 800μg/mL，較佳地為500μg/mL(且可選擇地為Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/mL)，重新播種於BME。
細胞連傳直到可分離出單獨生長複製體。
D-2.標的插入之篩選方法：
轉染後48-72小時施以選擇壓力：以TrypLE select分解細胞，低速離心並以FCS 10%及Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/Ml，以及G418800μg/mL，較佳地為500μg/mL(或Puromycin 0.5μg/mL)，重新播種於BME。
細胞連傳直到可分離出單獨生長複製體。
繼上述方法之後，以大範圍核酸酶I-SceI表達質體轉化該細胞複製體。
轉染後48小時施以選擇標記5-Fluorocytosine(5-FC)去除之選擇：以TrypLE select分解細胞，低速離心並重新播種於培養基，培養基中5-FC的濃度介於10-3至10-7M，且含有G418(或Puromycin)/Ganciclovir篩選(BME具有FCS 10%；5-FC Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/mL；以及G418 800μg/mL，較佳地為500μg/mL(或Puromycin 0.5μg/mL)(第三圖)。
範例2：包含一E1A核酸序列與一重組端粒酶反轉錄酶核酸序列的禽類永生化細胞系之建立。
A.質體構成
A-1.供隨機插入之質體構成
使用之質體與番鴨基因組(質體E1A)無任何特定之同源序列。
A-2.供標的插入之質體構成
建構一質體(質體dTERT-E1A)，其包含與番鴨HPRT基因同源並包圍番鴨端粒酶反轉錄酶基因(SEQ ID NO：3)與該E1A核酸序列(SEQ ID NO：1)的兩個5kb片段以及兩個篩選標。將為亞黃嘌呤鳥糞嘌呤磷酸核醣基轉基酶編碼的HPRT基因選為該E1A核酸序列組成型表達的適當位點。
二選用的選擇標記為CMV啟動子(Thomsen et al.P.N.A.S.1984.81.3：659-63)控制下的FCU1基因(Erbs等人Cancer Res.2000.15.60.：3813-22)與SV40啟動子控制下的抗嘌呤黴素基因。抗嘌呤黴素抗力與FCU-1表達盒受Sce1切割位點包圍，允許篩選盒從最終細胞系的去除。HPRT基因之外插有一可為HSVTK編碼並受RSV啟動子驅動的選擇標記(第四圖)。
B.由19天大的番鴨蛋與子族群敘述製備CEC。
將29個取自AFFSSA Ploufragan的無特殊病原菌(SPF)番鴨蛋於37.5°C潮濕大氣中孵育。
於19天後將蛋打開，以無菌方式提取胚胎。取下20個胚胎的頭、肢與肝臟以供其他細胞製備之用。將胚胎軀幹絞碎，以杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水洗滌一次(Sigma，Ref.D8537，Lot 46K2428)並於37℃，500mL的TrypLE Select細胞解離劑(Gibco,Ref.12563,Lots 1319986 and 1339844)中分解2小時。
以離心機速度2000rpm離心5分鐘後之細胞於補充10%胎牛血清(JRH,Ref.12003-1000M,Lot.5A0102,Code TG P4001Q)、0.04g/L健大黴素(gentamycine)與4mM L-谷氨醯胺(L-Glutamine)的BME(Basal Medium Eagle,Gibco,Ref.41010,Lot 8270)中回溶。將最終量為1.5L(1.9.106cell/mL)之懸浮液播種於10個500cm2細胞培養角瓶並於37℃，5% CO2中孵育。
24小時後將融合細胞以PBS洗滌並從培養瓶中取出，使用TrypLE Select細胞解離劑解離。計算細胞並將之於2000rpm下離心4-5分鐘。沉澱物以適當培養基(60% BME、30% FCS與10% DMSO)濃縮至5.106或
107cell/mL。將懸浮液裝填入冷凍小管cryovials(Nunc)冷凍於-80℃，並以-20℃冷凍2小時，而後移入液化氮以供長期保存，因此構成CETC19p1(鴨軀幹胚胎細胞(Duck Torso Embryonic Cells)，19天大胚胎，代數1)初代細胞庫(110cryovials，107cells/vial)。
C.轉染方法
習知技術中已有多種轉染方法，用以導入能夠引領相關核苷酸序列之表現的載體。此等方法例如為CaPO4沉澱法、電撃法、脂質體轉染法等等。本發明在此提供之一範例係基於電撃法。
轉染之進行使用Amaxa公司的核轉染儀與基礎纖維母細胞組(Amaxa,Cat NO VPI-1002)。細胞於700rpm(100g)下離心10分鐘，並回溶於基礎核轉染溶液(Basic Nucleofector Solution)(每106細胞100μL)；100μL的懸浮液與3-6μg DNA混合，並轉入玻璃管置入核轉染儀(U-12程式)。電撃後將樣本轉入6公分培養皿，加入5mL培養基，以37℃/5% CO2孵卵器加以預平衡。於37℃/5% CO2培養基孵育隔夜，換新培養基，取得孵育體。
D.篩選方法
D-1.隨機插入之篩選方法：
轉染後48-72小時施以選擇壓力：以TrypLE select分解細胞，低速離心並以FCS 10%及Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/mL，以及G418 800μg/mL，較佳地為500μg/mL，重新播種於BME。
細胞連傳直到可分離出單獨生長複製體。
D-2.標的插入之篩選方法：
轉染後48-72小時施以選擇壓力：以TrypLE select分解細胞，低速離心並以FCS 10%及Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/mL 1，以及Puromycin 0.5μg/mL，重新播種於BME。
細胞連傳直到可分離出單獨生長複製體。
繼上述方法之後，以大範圍核酸酶I-SceI表達質體轉化該細胞複製體。
轉染後48小時施以選擇標記5-Fluorocytosine(5-FC)去除之選擇：以TrypLE select分解細胞，低速離心並重新播種於培養基，培養基中5-FC的濃度介於10-3至10-7M，且保持Puromycin/Ganciclovir篩選(BME具有FCS 10%；5-FC Ganciclovir 25μg/mL，較佳地為10μg/mL；以及Puromycin 0.5μg/mL)。
Scholl et al., 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201 US5,879,924 WO2005007840
Ivanov et al. Expetimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences Ivanov et al. Experimental Pathology And Parasitology, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences Fallaux,F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998); Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977) Guilhot, C. et al., Oncogene 8:619-24(1993) WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 WO 99/05183 Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201 Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815 Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103 Nunes-Duby, S. et al (1998)Nucleic Acids Res. 26:391-406 Sternberg, N. et al. (1986)J. Mol. Biol. 187: 197-212 Belfort and Roberts ((1997)Nucleic Acids Research 25:3379-3388 Jayaram, Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Sep;82(17):5875-9; Senecoff et al., J Mol Biol. 1988 May 20;201(2):405-21 Panigrahi et al., Nucleic Acids Res. 1992 Nov 25;20(22):5927-35 Snaith et al. Gene. 1996 Nov 21;180(1-2):225-7 Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361; Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978 Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238
Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595 WO9954481 WO2005007857 McIvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848 Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436 Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472 EP 06 36 0047.2 French applications 94 08300 and 97 05203, published under n∘ FR2722208 and FR2762615 respectively Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc Lamb et al, Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270 Mullen et al (1922)PNAS 89, 33 Moolten (1986)Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991)New Biol 3, 608 Erbs et al. Cancer Res. 2000. 15. 60.:3813-22 Thomsen et al. P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-63
第一圖為一載體，其包含一可為E1A核酸序列編碼的基因。
第二圖為E1A核酸序列中以位特異性方式插入HPRT基因的概要圖。
第三圖為第一與第三選擇標記從本發明程序所取得之永生化細胞基因組中去除的概要圖。
第四圖為一載體，其包含一可為番鴨端粒酶反轉錄酶基因與E1A核酸序列編碼的基因。
<110> TRANSGENE SA
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<212> DNA
<213> Cairina moschata
<400> 3
(無元件符號說明)
Claims (32)
- 一種禽類永生化細胞系，係包含一E1A核酸序列，其特徵在於該細胞係經由一方法取得，該方法包括以一含有該E1A核酸序列的非病毒載體轉染該細胞之步驟，該E1A核酸序列係插入該禽類細胞的HPRT基因中，並可作用地與該細胞之內生HPRT啟動子連結，該E1A核酸序列係屬於SEQ ID NO：1，其中該細胞並不包含一E1B核酸序列，該細胞進一步包括一核酸序列，其對一重組端粒酶反轉錄酶編碼，該核酸序列係屬於SEQ ID NO：3。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，其中該細胞取自一屬於雁鴨科(Anatidae family)之動物。
- 如申請專利範圍第2項所述之禽類永生化細胞系，其中該動物屬於番鴨(Cairina moschata)種。
- 如申請專利範圍第2項所述之禽類永生化細胞系，其中該動物屬於綠頭鴨(Anas platyrhynchos)種。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，其中該核酸序列可為一特定所需物質編碼。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，其中進一步包括一輔助盒，該輔助盒允許一缺陷病毒進行繁殖。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，其中該非病毒載體係為一源自質體之載體。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，係為病毒複製之用途。
- 如申請專利範圍第8項所述之禽類永生化細胞系，其中該病毒係選自一群組，該群組係由牛痘病毒(Cowpox virus)、鼠痘病毒(Ectromelia virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、天花 病毒(Variola virus)與哺乳動物安卡拉病毒(Mammalian Virus Ankara，MVA)所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，係為製造一特定所需物質之用途。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，係為製造一病毒之用途。
- 如申請專利範圍第11項所述之禽類永生化細胞系，其中該病毒為一痘病毒。
- 如申請專利範圍第12項所述之禽類永生化細胞系，其中該病毒為一牛痘病毒。
- 如申請專利範圍第13項所述之禽類永生化細胞系，其中該病毒為一MVA。
- 如申請專利範圍第1項所述之禽類永生化細胞系，係為製造一重組病毒之用途。
- 一種使一禽類細胞永生化之方法，該方法包括以一含有一E1A核酸序列的非病毒載體轉染該細胞之步驟，該E1A核酸序列係屬於SEQ ID NO：1，及一對重組端粒酶反轉錄酶編碼之核酸序列，該核酸序列係屬於SEQ ID NO：3，其中該E1A核酸序列係插入該禽類細胞的HPRT基因中並可作用地與該細胞之內生HPRT啟動子連結，且該方法不包含以一含有E1B核酸序列轉染該細胞之步驟。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該載體包含兩個序列，此二序列與該E1A細胞基因組中之序列同源。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該E1A核酸序列受該同源序列包圍。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該載體進一步包含一第 一選擇標記，且該第一選擇標記為一正選擇標記，係受該同源序列包圍。
- 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該第一選擇標記受允許抑制作用的序列包圍。
- 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該第一選擇標記係編碼一蛋白質，而該蛋白質則可賦予抗生素抗性。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該載體進一步包含一第二選擇標記，該第二選擇標記不受該同源序列包圍，其中該選擇標記為一負選擇標記。
- 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該載體進一步包含一第三選擇標記，其中該第三選擇標記為一負選擇標記，且其中該第三選擇標記位於允許該第一選擇標記抑制作用的序列之間。
- 如申請專利範圍第22項所述之方法，其中該負選擇標記為一自殺基因，係選自一群組，該群組由單純皰疹病毒第一型胸腺嘧啶激酶、細胞色素p450、取自大腸桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶、取自大腸桿菌的鳥糞嘌呤磷酸核醣基轉化酶、胞嘧啶脫氨酶及FCU1和FCU1-8的基因所組成。
- 如申請專利範圍第20項所述之方法，其特徵在於進一步包含一步驟，其中該細胞係培養於一培養基中，此培養基僅允許已結合有該第一選擇標記的細胞於其中生長。
- 如申請專利範圍第22項所述之方法，其特徵在於進一步包含一步驟，其中該細胞係培養於一培養基中，此培養基不允許已結合有該第二選擇標記的細胞於其中生長。
- 如申請專利範圍第23項所述之方法，其特徵在於進一步包含一步驟，該步驟在於將該第一選擇標記自該細胞之基因組中排除。
- 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中取得自將該第一選擇標記自該細胞之基因組中排除之步驟之該細胞培養於一培養基中，此培養基不允許包含有該第三選擇標記的細胞於其中生長。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該細胞係取自一屬於雁鴨(Anatidae)科之有機體。
- 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該有機體屬於番鴨(Cairina moschata)種。
- 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該有機體屬於綠頭鴨(Anas platyrhynchos)種。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該細胞係指一種可於培養中生長35代以上的細胞。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005042728A2 (en) * | 2003-11-03 | 2005-05-12 | Probiogen Ag | Immortalized avian cell lines for virus production |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
| FR2749021B1 (fr) * | 1996-05-23 | 2001-10-26 | Agronomique Inst Nat Rech | Lignees de cellules aviaires immortalisees |
| US5672485A (en) * | 1996-08-13 | 1997-09-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Immortalized cell lines for virus growth |
| FR2777570A1 (fr) * | 1998-04-17 | 1999-10-22 | Transgene Sa | Mutant ayant une activite phosphoribosyl transferase |
| EP1103610A1 (en) * | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Introgene B.V. | Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines |
| FR2836924B1 (fr) * | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Rubaiyat Rahman et al., "hTERT antagonizes p53-induced apoptosis independently of telomerase activity", Oncogene, Vol. 24, pp. 1320–1327, 2005 * |
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| CA2636329C (en) | Avian telomerase reverse transcriptase | |
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