KR20100035650A - 불멸화된 조류 세포주들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 불멸화된 조류 세포 (immortalized avian cells)들 및 이들 세포들을 바이러스들의 생산에 사용하는 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명에 따른 세포는 동물들, 특히 인간들의 치료를 위한 치료적 및/또는 예방적 조성물들의 제조에 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터들을 생산하는 데 유용하다.

Description

불멸화된 조류 세포주들 {Immortalized avian cell lines}
본 발명은 불멸화된 조류 세포 (immortalized avian cells)들 및 이들 세포들을 바이러스들의 생산에 사용하는 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명에 따른 세포는 동물들, 특히 인간들의 치료를 위한 치료적 및/또는 예방적 조성물들의 제조에 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터들을 생산하는 데 유용하다.
진핵 세포주 (eukaryotic cell line)들은 바이러스 백신들 및 바이오테크놀로지의 많은 생산물들을 제조하는 데 기초가 될 수 있다. 세포 배양에 생산되는 생물학적 산물 (biological)들은 효소들, 호르몬들, 면역생물학적 산물 (immunobiological)들 [단일클론 항체 (monoclonal antibody)들 , 인터루킨 (interleukin)들, 림포카인 (lymphokine)들], 및 항암제들을 포함한다. 많은 더 단순한 단백질들은 박테리아 세포들을 사용하여 생산될 수 있지만, 당화되어 있는 (glycosylated) 더 복잡한 단백질들은 현재 진핵세포들에서 만들어져야 한다.
조류 세포 (avian cell)들는 수년 간 바이러스 벡터들을 생산하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들어, 천연두 (Variola)의 치료를 위한 예방적 조성물 (prophylactic composition)을 제조하는 데 사용되는 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus)는 닭 배아 섬유아세포 (chicken embryonic fibroblast) (CEF)에서 배양되었다. 조류 세포들은 약학적 조성물에 사용되는 많은 바이러스가 이들 세포에서 복제 가능하기 때문에 특히 유용하다. 더 주목할만하게도, 다양한 바이러스들이 조류 세포들에서만 성장할 수 있다. 그 예로는 포유류 세포 (mammalian cell)들에서 성장할 수 없는 포유류 바이러스 앙카라 (mammalian virus Ankara) (MVA)를 들 수 있다. 이 폭스바이러스는 CEF 에서 500 이상 계대한 백시니아 바이러스로부터 유래하여 70년대 초반에 천연두에 대해 면역 결핍된 사람들을 백신 주입하는 (vaccinating) 데 사용되었다. 현재, MVA는 유전자 치료 목적들을 위한 벡터 (vector)로서 주로 사용된다. 예를 들어, MVA는 MUC1 유전자를 위한 벡터로서 이 항원을 발현하는 종양에 대항하여 환자들을 백신 치료하는 데 사용된다 (Scholl et al., 2003, J. Biomed. Biotechnol., 3, 194-201). HPV 항원들을 코딩하는 유전자를 운반하는 MVA도 역시 난소 암 (ovarian carcinoma)을 치료하기 위한 벡터로서 사용된다. 더욱 최근에는, MVA가 새로이 출현하는 질병 또는 웨스트 나일 바이러스 (west nile virus) 및 탄저균 (anthrax)과 같은 잠재적인 생물학적 무기에 대항하여 예방적 치료제 (prophylactic treatment)를 제조하기 위한 벡터로 선택되어 왔다.
이러한 관점에서, 바이러스 생산을 위한 필요가 절실해지고 있다. 현재, 가장 많이 사용되는 MVA 생산 방법은 CEF 상에서 바이러스를 복제하는 단계로 이루어진다. 그러나 CEF의 사용은 다양한 문제점을 유발한다. 먼저, CEF의 제조 과정은 반드시 수동으로 시행되어야 하는 많은 단계들로 이루어졌다.
또한, 이 바이러스의 생산 방법은 번식 상의 오염의 경우에 전체가 버려질 수 있는 달걀의 이용 가능성 (availability)에 의존한다. 이는 조류 인플루엔자 (avian flu)에 전파와 함께 점점 더 중대한 문제가 된다.
부수적으로, 많은 CEFs는 역전사효소 (reverse transcriptase) 활성 (RT)을 보유한다. RT는 레트로바이러스들이 복제하는 데 필요한 효소이다. 레트로바이러스는 많은 서로 다른 종들에서 발견된다. RT는 인간들 또는 동물들에서 감염성이 없고, 사람에서 건강상 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되어 왔다. 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 기초한 매우 민감한 분석법을 사용하여, RT 활성이 닭 배아 섬유아세포에서 생산되는 백신들에서 극소량으로 탐지되었다. 이 효소의 근본은 아마도 수백 또는 수천 년 전에 닭 세포에 삽입된 것으로 여겨지는, RT를 코딩하는 부분적인 바이러스 게놈이다. 이 RT를 생산하는 조류 레트로바이러스들은 인간들에게 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV, AIDS를 유발하는 바이러스)는 레트로바이러스인 한편, 백신들에서 탐지되는 이 RT 활성은 명백히 HIV로부터 유래하지는 않는다. 더 나아가, RT의 존재가 레트로바이러스의 존재를 입증하지는 못한다. 그럼에도 불구하고, 내재적 RT 활성이 없는 세포주는 흥미로울 수 있다.
CEF를 사용한 바이러스 생산 방법을 개발하기 위하여, 바이러스의 복제와 생산을 가능하게 하는 조류 세포주에 대한 필요성이 증가하고 있다. 불멸화된 세포주들은 생산 장소에서 각 배치로 유지되거나 냉동될 수 있고 항상 새로운 생산 방법에 이용될 수 있다. 게다가 이 세포들은 생산 공장 (production plant)에 구속되ㄱ기 때문에, 외래성 오염물질 (exogenous contaminant)에 의한 오염도 쉽지 않다. 이들의 사용은 이 생산 방법에 필요한 수동적 조작 (manual manipulation)을 극적으로 감소시킨다. 이 모든 특성은 잠재적인 오염을 감소시킬 뿐만 아니라 비용을 감소시키고 이 생산 방법이 지속되도록 한다.
마지막으로, 세포주들은 모든 특성이 밝혀질 수 있고 따라서 실험실 관행 및 여러 의료기관의 요구사항들을 전적으로 따를 수 있다.
서로 다른 조류 세포주들이 앞서 기재되어 왔다. 예를 들어, DF1 (US5,879,924)은 10일 된 이스트 랜싱 주 (East Lansing line) (ELL-0) 달걀들로부터 유래한 자발적으로 불멸화된 닭 세포주이다. 이 세포들은 바이러스 증식, 재조합 단백질 발현 및 재조합 바이러스 생산을 위한 기질로 유용하다. 그러나, 이 세포주는 멜리아그리드 허피스바이러스 1 (Meleagrid herpesvirus 1) (터키의 허피스 바이러스), 조류 폭스 (fowlpox) 바이러스, 레오바이러스 (reovirus), 조류 사코마 백혈병 바이러스 (avian sarcoma leukemia virus) 및 라루 사코마 바이러스 (Rous sarcoma virus)와 같은 다양한 바이러스에 대해 취약하다.
또한 불멸하는 조류 세포들은 성장인자들 및 피더층을 점진적으로 단절시키고 미분화된 줄기에 특유한 성장 특성 및 무한한 수명을 유지시켜 배아 줄기세포로부터 유래될 수 있다. 이 방법에 의해 유래되는 유일한 조류 세포주는 쥐 기원의 피더층과 접촉하여 닭 세포들에서 쥐 바이러스 오염 및 내재성 레트로바이러스 서열의 존재와 같은 부가되는 조절 의문점 (regulatory questions)을 불러일으키는 Ebx 닭 세포주 (WO2005007840)이다. 더우기 이 세포주들은 일정 조건들에서 불안정하고 분화되기 쉬운 것으로 기술되어 왔다.
내재성 조류 레트로바이러스들이 없는 영구적인 (permanent) 오리 배아 세포주도 역시 확립되었다. 이 세포주는 DEC96 (Ivanov et al. Experimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences)으로 명명되고 140 연속 계대를 통해 배양되었으며, 새들에서는 종양을 유발하지 않는다. 이 DEC 99 세포주는 연구에 사용되어 왔던 표준 세포 배양 시스템이고 또한 바이오테크놀로지의 필요들에 적용될 수 있다. 이 세포주는 세포 생물학 (cell biology), 바이러스학 (virology), 면역학 (immunology), 독성학 (toxicology)의 분야에서의 연구들 그리고 진단제들 (diagnostics) 및 백신들의 생산을 위한 적합한 모델이다. 영구적인 오리 배아 세포주 (CL) DEC 99가 배아-적응된 (embryo-adapted) 조류 폭스바이러스 (APV) 백신 균주의 감염에 대해 취약한 점이 연구되어 왔다 (Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences). 닭과 비둘기 기원의 FK 및 데사우 (Dessau) 백신 균주들이 각각 사용되었다. 이 바이러스 균주들은 일차 오리 배아 세포 배양 (CCs)에서 연속적으로 계대되었다 (13 계대들). 이 적응된 바이러스 균주들은 이 DEC99 세포주의 CCs 에서 좀 더 계대되었고 (12 계대들), 여기서 전형적인 세포 변성 (cytopathic) 효과 (CPE)가 관찰되었다. 감염성 비리온 (infectious virion)들의 생산이 11일 된 화이트 레그혼 (White Leghorn) 배아들을 접종하여 조사되었고, 여기서 전형적인 폭스 증식이 융모요막 (chorioalantoic membrane) (CAMs) 상에서 형성되었다. 이 DEC 99 세포에서 FK 균주가 데사우 균주와 비교되는 초기 CPE 를 유발하고 106,25 CCID50/ml의 역가에 이르렀다. 이 DEC 99-적응된 바이러스 균주들은 2개월 된 닭의 백신 주입 (vaccination) 이후에 전형적인 표피 “흔적 (takes)”을 유도하였다. 따라서, 이 DEC 99는, 표준 CC 시스템으로서, 닭 폭스에 대항하는 백신을 생산하는 데 적합한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고 이 특정 세포주는 40 계대 이후에 느리게 성장하고 현탁 배양되지 못한다.
인간 아데노바이러스 5의 초기 부위 (early region)로부터 나온 핵산 서열들은 몇몇 특이 인간 세포들을 생체 외 (in vitro) 형질전환하는 데 이전에도 사용되었다 (293 및 PER. C6 세포주; Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene. Ther. 9: 1909-17 (1998); Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)).
일반적으로, 이 아데노바이러스 게놈은 30개 이상의 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하여 길이가 대략 36 kb가 되는 이중-가닥의 선형 DNA 분자로 구성된다. 각 말단에는, ITR (inverted terminal repeat)라고 명명되는, 혈청 타입 (serotype)에 의존하는 100 내지 150 뉴클레오타이드들의 짧은 역배열 서열 (inverted sequence)이 존재한다. ITRs는 아데노바이러스 게놈의 복제에 관여한다. 대략 300 뉴클레오타이드들의 캡시드 형성 (encapsidation) 부위는 게놈의 5‘ 말단에 5’ITR 바로 뒤에 위치한다.
이 초기 유전자들은 E1 내지 E4 (E는 초기를 의미)로 명명되어, 아데노바이러스 게놈 상에 분산된 4개 부위들에 분포한다. 이 초기 부위들은 자신의 프로모터들을 가지는 적어도 6개의 전사 유닛 (transcription unit)들로 이루어진다. 이 초기 유전자들의 발현은 스스로 조절되고, 몇몇 유전자들은 다른 유전자들에 앞서서 발현된다. 3개 부위들 E1, E2 및 E4는 각각 바이러스 복제에 필수적이다. 따라서, 아데노바이러스가 이들 기능들 중에 하나에 결함이 생기는 경우, 즉 이들 부위 중 하나에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질을 생산할 수 없는 경우, 이 단백질은 외부에서 (in trans) 공급되어야 한다.
이 E1 초기 부위는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하고 2개의 바이러스 전사 유닛들, E1A 및 E1B를 각각 포함한다. 이 부위는 바이러스 주기 (viral cycle)에 매우 초기에 관여하는 단백질들을 코딩하고 아데노바이러스의 나머지 거의 모든 단백질들의 발현에 필수적이다. 상세하게는, 이 E1A 전사 유닛은 나머지 바이러스 유전자들의 전사를 트랜스-활성화 (trans-activate)하는 단백질을 코딩하여, E1B, E1A, E2B 및 E4 부위들의 프로모터로부터의 전사를 유도한다.
길로트 등 (Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993))은 Ad5 로부터 나온 E1A의 12S 단백질을 레트로바이러스 형질감염 (retroviral transduction)하여 메추라기 세포의 불멸화 (immortalization)가 유도되는 것을 보여주었다. 그러나, WO2005042728는 이 E1A 유전자가 레트로바이러스 감염 대신에 DNA 그대로 형질전환되어 도입될 때 조류 세포들을 불멸화하는 것이 불가능하다고 기재하였다. 또한, WO2005042728에서는: "레트로바이러스 감염을 통한 극도로 효율적이고 안정한 형질감염 (transduction)은 정상적으로 망막아세포종 불활성화 (retinoblastoma inactivation)에서 유도되는 세포사멸 (apoptosis)을 억제하였던 자발적인 게놈 변화에 의해 개별 세포들가 포함될 정도로 충분히 큰 세포 풀 (cell pool)을 만든다고 기술하고 있다. (10페이지)".
길로트 등이 개발한 세포들에서 레트로바이러스 서열들의 존재는 생물학적 산물의 생산을 위한 또한 보다 상세하게는 치료적인 화합물 (therapeutic compounds)을 위한 이러한 세포의 용도를 방해한다.
US5,878,924 WO2005007840 WO98/08489 WO98/17693 WO98/34910 WO98/37916 WO98/53853 EP890362 WO99/05183 WO9954481 WO2005007857 EP06360047.2 FR2722208및FR2762615번호로각각발행된프랑스특허출원들9408300및9705203
Scholl et al., 2003, J. Biomed. Biotechnol., 2003, 3: 194-201 Ivanov et al., Experimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences Ivanov et al., Experimental Pathology And Parasitology, 4/6 2001 Bulgarian Academy of Sciences Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1909-17 (1998) Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977) Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993) Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201 Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 2533-2542 Yates et al., Nature 313, 812-815 Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103 Nunes-Duby, S. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 391-406 Sterberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212 Belfort and Roberts (1997) Nucleic Acids Research 25: 3379-3388 Jayaram, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985 Sep; 82(17): 5875-9 Senecoff et al., J. Mol. Biol. 1988 May 20; 201(2): 405-21 Panigrahi et al., Nucleic Acids Res. 1992 Nov 25; 20(22): 5927-35 Snaith et al. Gene, 1996 Nov 21; 180(1-2): 225-7 Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028 Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552 Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361 Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978 Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238 Mzoz and Moolton, 1993, Human gene Therapy 4, 589-595 Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848 Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436 Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472 Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc Lam et al., Eur J. Biochem., 1985, 148, 265-270 Mullen et al., 91922) PNAS 89, 33 Moolton (1986) Cancer Res. 46, 5276 Ezzedine et al. (1991) New Biol. 3, 608 Erbs et al. Cancer Res. 2000, 15.60.: 3813-22 Thomsen et al., P.N.A.S. 1984. 3: 659-63
본 발명자들은 조류 세포들, 보다 상세하게는 카이리나 모스카타 (cairina moschata) 세포들이 비-바이러스 벡터를 사용한 E1A 형질전환에 의해 효율적으로 불멸화될 수 있다는 점을 놀랍게도 발견하였다.
CEF의 사용 및/또는 앞서의 사용 가능한 세포주들의 사용과 연관된 서로 다른 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명은 조류 세포가 E1B 핵산 서열로 이루어지지 않고, 상기 조류 세포가 E1A 핵산 서열로 이루어진 비 바이러스 벡터로 세포를 형질전환하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 E1A 핵산 서열로 이루어진 불멸화된 조류 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 세포를 E1A 핵산 서열로 이루어진 비-바이러스 (non-viral) 벡터로 형질전환하는 단계로 이루어지고, 상기 조류 세포를 E1B 핵산 서열로 형질전환하는 단계로 이루어지지 않은 방법인 것을 특징으로 하는 불멸화된 조류 세포 (immortalized avian cell)의 제조방법을 제공한다.
여기서 사용되는 바, 불멸화된 세포는 35 계대 이상 배양하여 성장할 수 있는 세포를 말한다.
계대 수 (passage number)라는 용어는 세포를 충분히 낮은 밀도로 유지시켜 성장을 더 촉진하기 위해 세포 집단이 배양 용기로부터 떨어져 나와 계대 배양 (subculture (passage)) 과정을 거치는 횟수를 말한다.
본 명세서 전체를 통해 사용되는 바, "하나 (a)" 및 "하나 (an)"이라는 용어는 내용 상에서 명백히 다른 언급이 없다면 언급된 구성성분들 또는 단계들의 "적어도 하나 (at least one)", "적어도 첫 번째 (at least a first)", "하나 이상 (one or more)" 또는 "다수 (a plurality)"를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "세포 (a cell)"라는 용어는 그의 혼합물을 포함하여 다수의 세포들을 포함한다.
"및/또는 (and/or)"이라는 용어는 여기서 사용될 때 "및", "또는" 그리고 "모두 또는 상기 용어와 연결된 요소들의 기타 조합"의 의미를 포함한다.
여기서 사용되는 바, "이루어진 (comprising)"이라는 용어는 산물들, 조성물들 및 방법들이 다른 것들을 배제하는 것은 아니지만, 언급된 구성성분들 또는 단계들을 포함하는 것을 의미하고자 한다. "필수적으로 구성된 (consisting essentially)"는 산물들, 조성물들 및 방법들을 정의하려고 사용될 때, 필수적으로 중요한 다른 구성성분들 또는 단계들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 재인용된 (recited) 구성성분들로 필수적으로 구성된 조성물은 소량의 오염물질 (trace contaminant)들 및 약학적으로 허용 가능한 담체들을 제외하려는 것은 아니다. "구성된 (consisting of)"은 다른 구성성분들 또는 단계들의 소량 요소 (trace element)들 이상을 배제하는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 바, "E1A 핵산 서열 (E1A nucleic acid sequence)"이라는 용어는 아데노바이러스 E1A 부위의 모든 유전자 산물들의 핵산 서열을 2개 주요 RNAs: 13S 및 12S 를 코딩하는 핵산 서열을 포함하여 언급한 것이다.
바람직하게는 상기 "E1A 핵산 서열"이라는 용어는 서열번호 1과 적어도 60%의 아미노산 서열 일치도 (identity)를 가지는 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현 예에서, E1A는 서열번호 1과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%의 핵산 서열 일치도를 가지는 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열을 말한다. 더욱 바람직한 구현예에서, E1A는 서열번호 1에 표시된 핵산 서열을 말한다.
여기서 사용하는 바, "E1B 핵산 서열"이라는 용어는 19kd 및 55kd의 3개 주요 폴리펩티드 (major polypeptide)들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 E1B 부위의 핵산 서열 모두를 말한다.
여기서 채택하는 바, "실질적으로 동일한 (substantially the same) 핵산 서열"은 기준 폴리펩티드 (reference polypeptide)와 충분한 일치도를 가지고 이 기준 뉴클레오타이드 (reference nucleotide)와 적당히 엄격한 (moderately stringent) 하이브리디제이션 조건 하에서 융합할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 한 가지 구현예로는, 서열번호 1에 표시된 기준 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자를 들 수 있다.
하이브리디제이션 (hybridization)은 핵산의 상보적인 가닥들 [예로, 센스 (sense):안티센스 (antisense) 가닥들 또는 프로브 (probe):표적 (target) DNA]이 염색체 DNA에서 자연적으로 일어나는 결합 (bond)들과 유사한 수소 결합들을 통해 서로 결합하는 것 (bonding)을 말한다. 표적 DNA와 주어진 프로브가 융합하는 데 사용되는 엄격도 (stringency) 수준은 당업자에 의해 다양하게 변화될 수 있다.
"엄격한 하이브리디제이션 (stringent hybridization)"이라는 구절은 폴리핵산 하이브리드 (polynucelic acid hybrid)들이 안정하게 유지되는 조건을 말하는 것으로 여기서 사용된다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 하이브리드들의 안정성이 하이브리드들의 녹는점 (Tm)에 반영되어 있다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 소듐 이온의 농도와 온도의 함수이다. 전형적으로, 하이브리디제이션 반응은 더 낮은 엄격도 하에서 수행되고, 이어서 다양하게 변화되는 더 높은 엄격도 하에서 세척된다. 하이브리디제이션 엄격도의 기준은 이러한 세척 조건과 관련이 있다.
여기서 사용되는 바, "적당히 엄격한 하이브리디제이션"이라는 구절은 표적--DNA 가 이 표적-DNA와 약 60%의 일치도, 바람직하게는 약 75% 일치도, 더욱 바람직하게는 약 85%의 일치도를 가지는; 특히 바람직하게는 표적-DNA와 약 90% 보다 더 큰 일치도로, 상보적인 핵산과 결합이 가능한 조건들을 말한다. 바람직하게는, 적당히 엄격한 조건들은 42℃에서 50% 포름아마이드, 5* 덴하르트 용액, 5* SSPE, 0.2% SDS 를 사용한 융합에 이은 65℃에서 0.2* SSPE, 0.2% SDS 를 사용한 세척에 의한 하이브리디제이션과 동등한 조건들이다.
여기서 사용되는 바, 발현 "비-바이러스 벡터 (non-viral vector)"는 명백히 플라스미드 기원의 벡터이고, 선택 사항으로 (optionally) 상기 벡터의 형질전환 효율성 (transfectional efficiency) 및/또는 안정성 (stability) 및/또는 상기 벡터의 숙주 생물체의 면역 시스템에 대한 생체 내 (in vivo) 보호를 향상시키는 하나 이상의 물질들과 결합된 이러한 벡터를 말한다. 이들 물질들은 당업자들이 쉽게 입수할 수 있는 문헌에 널리 기재되어 있다 (예를 들어, Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654 참조). 이에 제한되지 않지만 기재에 의하면, 이들은 폴리머 (polymer)들, 지질 (lipid)들, 상세하게는 양이온성 지질 (cationic lipid)들, 리포좀 (liposome)들, 핵 단백질 (nuclear protein)들 또는 중성 지질 (neutral lipid)들일 수 있다. 이들 물질들은 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 화합물들의 예들은 특히 특허 출원서들 WO98/08489, WO98/17693, WO 98/34910, WO98/37916, WO98/53853, EP 890362 또는 WO99/05183 에서 입수 가능하다. 예상할 수 있는 조합은 양이온성 지질들 (DOGS, DC-CHOL, 스퍼민-chol (spermine-chol), 스퍼미딘-chol (spermidine-chol) 등) 및 중성 지질들 (DOPE)과 조합된 플라스미드 재조합 벡터이다.
본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 플라스미드들의 선택은 매우 다양하다. 그들은 클로닝 및/또는 발현 벡터들일 수 있다. 일반적으로, 이 벡터들은 당업자에게 잘 알려져 있고 많은 벡터들이 상업적으로 입수 (commercially available) 가능하지만, 또한 유전적 조작 기술 (genetic engineering technique)에 의해 이들을 작제 (construct)하거나 변형하는 것도 가능하다. 그 예들로는, pBR322 (집코 BRL), pUC (집코 BRL), pBluescript (스트라타젠), pREP4, pCEP4 (인비트로겐) 또는 pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)로부터 유래한 플라스미드들이 언급될 수 있다. 본 발명의 내용에서 사용되는 플라스미드는 세포 및/또는 숙주 세포를 생산하는 과정에서 복제의 개시를 유도하는 복제 원점 (replication origin)을 포함하는 것이 바람직하다 (예를 들어, ColE1 원점은 대장균에서 생산되고자 하는 플라스미드를 위해 선택될 수 있고 oriP/EBNA1 시스템은 포유류 숙주세포에서 자가-복제하는 (self-replicating) 플라스미드가 요구되는 경우 선택될 수 있다. (Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). 이 플라스미드는 주어진 세포에서 유지 (maintenance) 및/또는 안정성을 향상시키는 부가적인 요소 (플라스미드의 모노머 유지를 증진시키는 cer 서열)로 이루어질 수 있다 (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequences for integration into the cell genome).
"비-바이러스 벡터 (non-viral vector)"라는 용어는, 예를 들어 폭스바이러스 (백시니아 바이러스, 특히 MVA, 카나리폭스 (canarypox) 등)로부터, 아데노바이러스로부터, 레트로바이러스로부터, 허피스바이러스로부터, 알파바이러스 (alphavirus)로부터, 포미 바이러스 (foamy virus)로부터 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래한 벡터와 같은 바이러스 벡터들을 배제한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포로부터 유래하는 세포들에 관한 것이다. 여기서 사용되는 바, "유래한 (derived)"이라는 용어는 본 발명에 따른 세포를 발생시키거나 이로부터 분화하거나 이를 조상 (ancestor)으로 가지는 세포들을 말한다.
계대 수라는 용어는 세포를 충분히 낮은 밀도로 유지시켜 성장을 더 촉진하기 위해, 세포 집단이 배양 용기로부터 떨어져 나와 계대 배양 과정을 거치는 횟수를 말한다.
여기서 사용되는 바, "형질전환된 (transfected)"이라는 용어는 본 발명의 세포의 안정적 형질전환 (stable transfection) 또는 일시적 형질전환 (transient transfection)을 말한다.
"안정적 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된 (stably transfected)"이라는 용어는 외래의 (foreign) 핵산 서열을 형질전환된 세포의 게놈 내로 도입 (introduction) 및 삽입 (integration)하는 것을 말한다. "안정적 형질전환체 (stable transfectant)"는 외래의 DNA를 게놈 DNA 내로 안정적으로 삽입한 세포를 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 조류 세포는 아나티대 과 (Anatidae family) 또는 파시아니대 과 (Pharsianidae family)의 세포로부터 유래한다. 아나티대 중에서, 카이리나 (Cairina) 또는 아나스 (Anas) 속 (genus)에 속하는 세포들이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 세포들은 카이리나 모스카타 또는 아나스 플래티린코스 종에 속하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
본 발명에 따른 세포는 배아 (embryonic) 생물체로부터 채취하는 것이 바람직하다. 살아있는 생물체로부터 세포들을 분리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 실시예 2 에 기재된 방법들이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 일차 세포 (primary cell)는 아나티대 과에 속하는 10 내지 20일 사이, 더욱 바람직하게는 5 내지 15일 사이, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 11 내지 14일 사이에 있는 배아로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따라, E1A 핵산 서열은 본 발명에 다른 세포의 표적 DNA 서열 내에 삽입된다.
여기서 사용되는 바, "표적 DNA 서열 (target DNA sequence)"은 벡터와 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의한 변형이 되도록 표적되어진 세포의 게놈 내에 미리 정해진 부위이다. 표적 DNA 서열들은 구조 유전자 (structural gene)들 (예로, 진핵세포의 경우 폴리펩티드들을 인코딩하는 인트론들 및 엑손들을 포함하는 DNA 서열들), 인핸서 서열들, 프로모터들 등과 같은 조절 서열들 그리고 관심 게놈 (genome of interest) 내에 기타 부위들을 포함한다. 또한, 표적 DNA 서열은 벡터에 의해 표적이 될 때, 숙주 게놈의 기능에 영향을 미치지 않는 서열일 수 있다.
여기서 사용되는 바, "표적 DNA 서열 내에 삽입되는 (inserted into ㅁ target DNA sequence)"은 널리 불멸화하는 유전자 (immortalizing gene)의 삽입을 유도하는 상동성 재조합 과정이 표적된 DNA 서열 내에 결실 (deletion) 또는 파괴 (disruption)를 도입하는 것을 의미한다.
E1A 핵산 서열이 표적 DNA 서열 내에 삽입되는 불멸화된 조류 세포를 생산하기 위하여, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 상기에 더하여 상기 세포 게놈에 원래 존재하던 (native) 표적 DNA 서열 부위와 상동성 재조합을 할 수 있는 2개의 상동한 서열들로 이루어질 수 있다.
상기 상동 서열의 존재는 상동성 재조합에 의해 표적 DNA 서열을 본 발명의 핵산 분자의 부위 특이한 (site specific) 삽입을 가능하게 한다.
"상동성 재조합 (homologous recombination)"이라는 용어는 필수적으로 일치하는 (essentially identical) 뉴클레오타이드 서열들의 부위에서 2개의 DNA 분자들간 DNA 단편들의 상호 교환을 말한다. 본 발명의 상세한 구현예에 따라, 표적 DNA 서열 내에 포함되는 서열 부분들과 상동한 서열들이 벡터 내에 존재한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전달 벡터 (transfer vector)의 상동한 서열들은 표적 서열의 해당 부위와 100% 상동하다. 그러나, 더 낮은 상동성 (homology)도 사용될 수 있다. 따라서, 약 80% 정도로 낮은 서열 상동성도 사용될 수 있다.
전달 벡터에서 상동한 서열들은 적어도 25 bp로 이루어지고, 더 긴 부위들로는 적어도 500 bp가 바람직하며 적어도 5000 bp는 더욱 바람직하다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따라, 이 벡터에서 핵산 분자는 상동한 서열에 의해 둘러싸인다.
여기서 사용되는 바, "둘러싸인 (surrounded)"은 상동한 서열들의 하나가 본 발명의 핵산 분자의 상류 (upstream)에 위치하고 상동한 서열들의 다른 하나는 본 발명의 핵산 분자의 하류 (downstream)에 위치하는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 바, "둘러싸인"은 2개의 상동한 서열들이 불멸화하는 유전자의 3' 또는 5' 말단에 직접적으로 연결되는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 불멸화하는 유전자 및 상동한 서열들은 무제한적 많은 수의 뉴클레오타이드들에 의해 서로 분리되어 존재할 수 있다.
당업자라면 특이 DNA 서열 (specific DNA sequence)을 불멸화되는 세포의 게놈 내로 표적시키기 위해 적절히 상동한 서열들을 선택할 수 있다. 예를 들어, 하나의 상동한 서열은 표적되는 서열의 일부분과 상동하고, 나머지 상동한 서열은 표적되는 서열의 상류 또는 하류에 위치하는 DNA 서열과 상동할 수 있다. 또 다른 실시예에 따라, 상동한 서열들의 하나는 표적되는 DNA 서열의 상류에 위치하는 DNA 서열과 상동하고, 나머지 상동한 서열은 표적 DNA 서열의 하류에 위치하는 DNA 서열과 상동할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상동한 서열들 양쪽 모두는 표적 DNA 서열 내에 위치하는 서열들과 상동하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 표적 DNA 서열은 HPRT (hypoxanthine phosphoribosyl transferase) 유전자이다.
HPRT 프로모터 및 카이리나 모스카타의 HPRT 유전자로 이루어진 게놈 서열은 서열번호 2 에 표시된다. HPRT를 코딩하는 서열은 서열번호 2 에 표시된 핵산 서열의 8695번 위치 (position)의 ATG 코돈에서 시작한다. 이 ATG 코돈의 상류 서열은 HPRT 프로모터 서열이다.
당업자는 HPRT 유전자 내 E1A 핵산 서열의 삽입에 필요한 상동한 서열을 선택할 수 있다. 해당 과의 여러 구성원들 간과 같이, HPRT 를 코딩하는 게놈 서열들은 매우 상동하다. 또한, 당업자는 모든 조류 세포들의 HPRT 유전자를 표적하는 데 필요한 상동한 서열을 디자인할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따라, 상동한 서열들은 세포의 HPRT 프로모터의 하류에 E1A 핵산 서열을 삽입하기 위해 맞추어진다 (customized). 본 발명의 상세한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포의 내재적 HPRT 프로모터와 연결되어 작동한다. "연결되어 작동하는 (operably linked)"은 이 E1A 핵산 서열이 세포에서 그 발현을 가능하게 하는 방식으로 프로모터와 연결된 것을 말하고자 한다.
본 발명의 상세한 구현예에 따라, 본 발명의 핵산 분자의 상류에 상동한 서열은 적어도 500 연속 (contiguous) bp와 상동한 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 상기 상동한 서열이 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 8695번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 26916번 위치에서 마치는 핵산 서열과 상동하지 않은 것을 조건으로 하여, 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 1번 위치로부터 시작하여 핵산 서열의 뉴클레오타이드 8694번 위치에서 마치는 적어도 5000 연속 bp의 핵산 서열을 가지는 것은 더욱 바람직하다. 게다가, 이 상류의 상동한 서열은 E1A 핵산 서열의 개시 코돈에 직접 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명의 훨씬 더 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 핵산 분자의 상류에 상동한 서열은 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 1번 위치에서 시작하여 핵산 서열의 8694번 위치에서 마치는 핵산 서열로 구성된다. E1A 핵산 서열의 하류에 상동한 서열은 상기 상동한 서열이 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 10580번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 18009번 위치에서 마치는 적어도 500 연속 (contiguous) bp와 상동한 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 적어도 5000 연속 bp의 핵산 서열을 가지는 것은 더욱 바람직하다. 또한, E1A 핵산 서열의 하류에 상기 상동한 서열은 서열번호 2에 표시된 핵산 서열의 뉴클레오타이드 10580번 위치에서 시작하여 뉴클레오타이드 18009번 위치에서 마치는 핵산 서열로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 조류 세포가 E1B 핵산 서열로 이루어지지 않고 상기 E1A 핵산 서열은 세포의 내재성 HPRT 프로모터와 연결되어 작동하며, 상기-조류 세포가 E1A 핵산 서열로 이루어진 비-바이러스 (non-viral) 벡터로 세포를 형질전환하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 E1A 핵산 서열로 이루어진 조류 세포 (avian cell)에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 첫 번째 선별 마커 (selective marker)로 이루어지고, 상기 선별 마커는 양성 (positive) 선별 마커이며, 상기 첫 번째 선별 마커는 벡터 내에 존재하는 상기 상동한 서열들에 의해 둘러싸인다. 이 관점에서, 벡터와 세포 게놈 간에 일어나는 상동한 재조합 과정은 E1A 핵산 서열 및 첫 번째 선별 마커의 삽입을 유도한다. 전달 벡터가 원형 (circular)일 때, "둘러싸인 (surrounded)"은 첫 번째 선별 마커 및 E1A 핵산 서열이 벡터의 동일한 영역 (section)에 위치하고, 상기 영역은 상동한 서열들에 의해 한계가 정해지는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 바, 양성 선별 마커 (positive selection marker)라는 용어는 명백히 이 유전자를 가지는 세포들에서만 일정한 조건들 하에서 생존 및/또는 성장하게 하는 산물을 인코딩하는 유전자를 말한다. 전형적인 선별 마커들은 앰피실린 (ampicillin), 네오마이신 (neomycin), 메토트렉세이트 (methotrexate) 또는 테트라사이클린 (tetracyclin)과 같은 항생제 또는 다른 독성물질 (toxin)들에 대한 저항성, 보완적인 영양요구성 결함 (complement auxotrophic deficiency)들 또는 복합 배지로부터 이용 가능하지 않은 공급 결정적인 영양분 (supply citical nutrient)들을 부여하는 단백질들을 인코드한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 첫 번째 선별 마커는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 인코딩한다.
이 첫 번째 선별 마커의 삽입은 E1A 핵산 서열을 삽입한 세포들의 선별을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 상기 세포들이 첫 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계로 이루어진다. 예를 들어, 항생제로 이루어진 배지에서이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따라, 상기 벡터에서 첫 번째 선별 마커는 그의 억제 (suppression)를 가능하게 하는 서열들로 둘러싸인다. 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 상기 서열들은 E1A 핵산 서열을 둘러싸지 않는다. 벡터가 원형일 때, 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들, 첫 번째 선별 마커 및 E1A 핵산 서열은 전달 벡터의 동일한 영역 (the same section)에 위치하고 상기 영역은 상동한 서열들에 의해 한계가 정해진다.
핵산 단편의 억제를 가능하게 하는 서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Nunes-Duby, S. et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26: 391-406). 이들 서열들은 상기 서열들 간을 구성하는 핵산의 억제를 유발하는 하나 이상의 특이 효소 (specific enzyme)들에 의해 인지될 수 있다. 이들 효소들은 "재조합효소 (recombinase)"라고 불린다. 예를 들어, 핵산 단편의 억제를 가능하게 하는 3가지 잘 알려진 재조합효소는 FLP, ISCE1 및 Cre 재조합효소이다.
전형적인 부위-특이 재조합효소 (site-specific recombinase)는 Cre 재조합효소이다. Cre는 박테리오파지 P1의 cre (cyclization recombination) 유전자의 38 kDa 산물이고 Int 패밀리의 부위-특이 DNA 재조합효소이다 (Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212). Cre는 loxP 라고 불리는 P1 게놈 (P1의 X-오버의 유전자좌) 위에 34-bp 부위를 인지하고 loxP 부위들 쌍들 간 상호 보존적인 DNA 재조합 (reciprocal conservative DNA recombination)을 효율적으로 촉매한다. 이 loxP 부위는 8-bp 비-반복 (nonpalindromic) 코아 부위가 끼어있는 2개의 13-bp 역배열 반복서열 (inverted repeat)들로 구성된다. 2개의 나란한 반복서열 (directly repeated) loxP 부위들 간 Cre-관여 재조합은 공유결합으로 닫힌 원형 (covalently closed circle)으로서 그들 간의 DNA 절단 (excision)을 초래한다. 역배열 방향에서 loxP 부위들 쌍들 간의 Cre-관여 재조합은 절단 보다는 중간이 낀 (intervening) DNA의 역전 (inversion)을 초래한다. DNA의 깨짐 (breaking)과 결합 (joining)이 제한적으로 일어나 코아 부위 내에 위치들을 구분시키고, 가닥 (strand) 위에서 한 번에 일시적인 포스포타이로신 DNA-단백질 연결 (phosphotyrosine DNA-protein linkage)이 생겨서 진행된다.
또 다른 부위-특이 재조합효소는 I-Scel이다. 본 발명에 따른 제조방법에서 다른 인트론-호밍 엔도뉴클레아제 (intron-homing endonuclease), 예를 들어 I-Till, I-Ceul, I-Crel, I-Ppol 및 PI-PspI도 또한 I-Scel을 대체할 수 있다. 벨포트 및 로버트에 의해 많은 것들이 리스트화되어 있다 (Belfort and Roberts (1997) Nucleic Acid Research 25: 3379-3388). 많은 이들 엔도뉴클레아제들이 코돈 사용 (codon usage)이 표준 핵내 코돈 사용과 구별되는 세포기관 게놈 (organelle genome)들로부터 나온다. 이러한 유전자들을 이들 엔도뉴클레아제들의 핵 발현 (nuclear expression)에 사용하기 위해서, 핵 유전자들의 코돈 사용을 맞추기 위해 코딩 서열을 변화시키는 것이 필요할 수 있다. I-Scel은 이 인지 부위 내에 DNA를 절단하는 이중-가닥 (double-stranded) 엔도뉴클레아제이다. I-Scel은 3'OH 끝자락 (overhangs)들을 가지는 4bp의 엇갈린 절단 (staggered cut)을 생성한다.
I-Scel 효소는 알려져 있는 인지 부위 (recognition site)를 가진다. I-Scel의 인지 부위는 18 bp 이상 연장되는 비-대칭적인 (non-symmetrical) 서열이다.
5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'
3'-ATCCCTATTGTCCCATTA-3'
또 다른 부위-특이 재조합효소는 FLP 재조합효소이다. Flp 재조합은 이들 인지 서열의 제한된 반복 (degeneracy)만을 견뎌내는 구분되는 34-bp 최소한 부위를 인지한다 (Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). Flp 재조합효소 및 FRT 서열 간의 상호작용이 연구되어 왔다 (Panigrahi et al., 1992). 다양한 FRT 서열들의 예들이 자야람 [Jayaram (1985)] 및 세네코프 등 [Senecoff et al. (1988)]에 의해 기재되었고, 서로 다른 기질들 상에서 Flp-매개 재조합이 스네이스 등 [Snaith et al. (1996)]에 의해 기술되어 있다.
따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 상기 일차 세포의 게놈으로부터 첫 번째 선별 마커를 억제하는 단계로 이루어진다. 상기 첫 번째 선별 마커를 억제하기 위해서, 세포는 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들에 특이한 재조합효소를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된다. 상기 유전자를 세포 내로 전달할 수 있는 방법들 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예 4에 기재된 제조방법이 사용될 수 있다. 앞서 기술된 벡터들도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 제조방법에 사용되는 벡터는 상기 상동한 서열들로 둘러싸이지 않은 두 번째 선별 마커로 이루어지고 상기 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커이다. 상기 두 번째 선별 마커는 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 이 벡터가 원형일 때 특히 유용하다. 상기 두 번째 선별 마커의 존재가 상동한 재조합 과정이 E1A 핵산 서열로 이루어지지 않은 전달 벡터의 영역을 도입 유도하는 세포들의 파괴를 가능하게 한다. 이 벡터가 원형일 때, 두 번째 선별 마커가 상기 상동한 서열에 의해 둘러싸이지 않는 점은 두 번째 선별 마커와 E1A 핵산 서열이 이 전달 벡터의 동일한 영역에 위치하지 않고 상기 영역은 상동한 서열들에 의해 한계가 정해지는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 세포들이 두 번째 선별 마커를 삽입하지 않은 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계로 이루어진다. 상기 단계는 상기 일차 세포가 첫 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계와 동시 또는 별도로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 이 벡터는 세 번째 선별 마커로 이루어지고, 상기 세 번째 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커이며, 상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들 사이에 위치한다. 이것은 첫 번째 선별 마커를 억제하는 단계도 역시 세 번째 선별 마커의 억제를 유도할 수 있는 점을 의미한다. 세 번째 선별 마커의 존재는 첫 번째 선별 마커가 존재하는 세포들이 파괴되게 한다. 이 벡터가 원형일 때, 세 번째 선별 마커가 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들 사이에 위치하는 점은 세 번째 선별 마커와 첫 번째 선별 마커가 전달 벡터의 동일한 영역에 위치하고 상기 영역은 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들에 의해 한계가 정해지는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 바, 음성 선별 마커라는 용어는 명백히 일정한 조건들 하에서 유전자를 보유하는 세포를 죽이는 산물을 인코딩하는 유전자를 말한다. 이들 유전자들은 명백히 "자살 유전자 (suicide gene)"로 이루어진다. 이들 유전자에 의해 인코드되는 산물들은 세포 독성 (cytotoxic) 화합물에서 프로드럭 (prodrug)을 변환시킬 수 있다. 다수의 자살 유전자/프로드럭 쌍들은 현재 사용 가능하다. 이들은 쌍들로 더욱 상세히 언급될 수 있다.
- 허피스 심플렉스 바이러스 타입 1 티미딘 키나제 (HSV-1 TK) 및 어사이클로비르 (acyclovir) 또는 갱시클로비르 (ganciclovir; CGV)(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-2028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361);
- 사이토크롬 (cytochrome) p450 및 사이클로포스포아미드 (cyclophosphoamide)(Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
- 대장균 (E. coli)으로부터 나온 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 (purine nucleoside phosphorylase) 및 메틸퓨린 데옥시리보뉴클레오사이드 (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238)
- 대장균으로 나온 구아닌 포스포리보실 전이효소 (guanine phosphoribosyl transferase) 및 6-티오산틴 (6-thioxanthine)(Mzoz and Moolten, 1993, Huamn Gene Therapy 4, 589-595) 및
- 사이토신 디아미나제 (CDase) 및 5-플루오로사이토신 (5FC).
- FCU1 및 5-플루오로-사이토신 (5FC)(WO9954481).
- FCU1-8 및 5-플루오로-사이토신 (5FC) (WO2005007857).
상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제가 일어나는 세포들에서 선별을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 상기에 더하여 상기 세포가 세 번째 선별 마커로 이루어진 세포의 성장을 허용하지 않는 배지에서 배양되는 단계로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세 번째 선별 마커로서 FCU1으로 이루어진 세포의 성장을 허용하지 않는 배지는 5-플루오로사이토신으로 이루어진다.
첫 번째, 두 번째 및 세 번째 선별 마커는 별도로 분리되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 벡터는 두 번째 마커를 제외한 첫 번째 및 세 번째 선별 마커로 또는 첫 번째 마커를 제외한 두 번째 및 세 번째 선별 마커로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, E1A 핵산 서열, 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 선별 마커는 불멸화되는 세포에서 그들의 발현에 필요한 요소들의 조절 하에 놓일 수 있다.
발현에 필요한 요소들은 뉴클레오타이드 서열이 RNA로의 전사 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독을 가능하게 하는 요소들의 세트, 상세하게는 상기 세포에서 효과적인 프로모터 서열들 및/또는 조절 서열들 그리고 선택 사항으로 표적 세포들의 표면에 상기 폴리펩타이드의 분비 (excretion) 또는 발현하는 데 필요한 서열들로 이루어진다. 이들 요소들은 조절 (regulatable)될 수 있거나 전신 발현 (constitutive)될 수 있다. 당연히, 이 프로모터는 선택되는 벡터 및 숙주 세포에 적응된다. 실시예를 통해서, PGK (phospho glycerate kinase), MT (metallothionein; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 안티트립신, CFTR 유전자들의 진핵세포 프로모터들, 근육 크레아틴 키나제, 액틴 호흡기 계면활성제 (pulmonary surfactant), 면역글로불린 또는 β-액틴 (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472)을 인코딩하는 유전자의 프로모터들, SV40 바이러스 (simian virus) 초기 프로모터, RSV (Rous sarcoma virus) LTR, MPSV 프로모터, TK-HSV-1 프로모터, CMV 바이러스 (cytomegalovirus) 초기 프로모터가 언급될 수 있다. 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 프로모터가 특히 가장 바람직하다.
본 발명은 보다 상세하게 이에 제한되지는 않지만, 다음 단계들로 이루어진 세포를 불멸화하는 제조방법에 관한 것이다:
- 조류 세포 내로
■ 상동한 서열들로 둘러싸인 E1A 핵산 서열.
■ 첫 번째 선별 마커는 양성 선별 마커이고, 상기 첫 번째 선별 마커는 상기 상동한 서열들로 둘러싸인 첫 번째 선별 마커.
■ 첫 번째 선별 마커의 억제 (suppression)를 가능하게 하는 서열들.
■ 두 번째 선별 마커는 음성 선별 마커이고 상동한 서열들로 둘러싸이지 않은 두 번째 선별 마커.
■ 세 번째 선별 마커는 음성 선별 마커이고, 상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들 사이에 위치하는 세 번째 선별 마커.
로 이루어진 벡터를 전달하는 단계
- 상기 세포들이 첫 번째 선별 마커를 삽입한 (incorporate) 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계
- 상기 세포들이 두 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장이 가능하지 않은 배지에서 배양되는 단계
- 첫 번째 선별 마커를 상기 세포의 게놈으로부터 제외시키는 단계
- 상기 세포가 세 번째 선별 마커로 이루어진 세포들의 성장이 가능하지 않은 배지에서 배양되는 단계
본 발명에 따른 세포는 상기에 더하여 결함 있는 바이러스의 증식을 가능하게 하는 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진다. "결함 있는 바이러스 (defective virus)"는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자가 결실되거나 기능이 없어진 (nonfunctional) 바이러스를 말한다. "결함 있는 바이러스의 증식을 가능하게 하는 핵산 서열"이라는 용어는 결함 있는 바이러스의 복제를 가능하게 하는 기능(들)을 외부에서 (in trans) 공급하는 핵산 서열을 말한다. 다시 말하면, 상기 핵산 서열(들)은 상기 결함 있는 바이러스의 복제 및 캡시드 형성에 필요한 단백질(들)을 코딩한다.
본 발명에 따른 세포는 또한 관심 물질을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진다. 여기서 사용하는 바, 관심 물질은 이에 제한되지는 않지만, 약학적으로 활성이 있는 단백질, 예를 들어 성장인자들, 성장 조절인자들, 항체들, 항원들, 면역화 또는 백신화에 유용한 그들의 유도체들 등, 인터루킨들, 인슐린, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF 또는 그들의 조합들, 예를 들어 인터페론- α, 인터페론-β, 인터페론-γ과 같은 인터페론들, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX 또는 tPA와 같은 혈액 응고인자들 또는 그들의 조합들을 포함할 수 있다. 또한 "관심 물질 (substance of interest)"은 산업적인 효소들, 예를 들어 펄프 또는 종이 내의 용도, 텍스타일 변형 또는 에탄올 생산을 위한 효소들을 말한다. 마지막으로, "관심 물질"은 또한 동물 사료를 위한 단백질 보충물 (supplement) 또는 부가 가치가 있는 산물을 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 본 발명에 따른 세포는 재조합 텔로머라제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase), 더욱 바람직하게는 EP 06 36 0047.2.에 기재된 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열로 이루어진다. EP 06 36 0047.2.에 기재된 본 발명의 바람직한 구현예에서는, 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열이 EP 06 36 0047.2.의 서열번호 2에 표시된핵산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%의 핵산 서열 일치도를 가진다. 바람직한 EP 06 36 0047.2.에 기재된 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 EP 06 36 0047.2.의 서열번호 2에 표시된 바와 같다. EP 06 36 0047.2.에 기재된 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열 서열번호 2는 본 발명에서 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열 서열번호 3과 일치한다. 결론적으로, 본 발명의 바람직한 구현에에 따라 본 발명에 따른 세포도 또한 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호3과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%의 핵산 서열 일치도를 가지는 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열로 이루어진다. 더욱 바람직하게는 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3 (dTERT)에 표시된 바와 같다.
본 발명에 따른 제조방법, 본 발명의 세포 및 이들로부터 유래한 세포들에 의해 얻어진 세포들은 바이러스의 복제에 명백히 유용하다. 상기 바이러스들은 살아있 (live)거나 약하게 지속되거나 (attanuated) 또는 재조합될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포들은 폭스바이러스 (백시니아 바이러스, 특히 MVA, 카나리폭스 바이러스 등), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허피스바이러스, 알파바이러스, 포미바이러스 또는 아데노바이러스-관련 바이러스로부터 나온 바이러스의 복제에 특히 유용하다.
레트로바이러스들는 분열하는 세포들을 감염시키고 대부분의 경우들에서 이에 삽입되는 특성을 가지고, 이러한 측면에서 암과 관련되어 사용하는 것은 특히 적절하다. 일반적으로, 재조합 레트로바이러스는 LTR 서열들, 캡시드 형성 부위 (encapsidation region) 및 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이것은 레트로바이러스 LTR 또는 하기에 기술되는 프로모터들과 같은 내부 프로모터의 조절 하에 놓여진다. 레트로바이러스 벡터는 특히 LTRs (프로모터 부위가 진핵세포 프로모터로 대체) 또는 캡시드 형성 부위 (상이한 (heterologous) 캡시드 형성 부위로 대체, 예를 들어 VL30 타입)에서의 변형들을 포함한다 (프랑스 특허 출원서들 94 08300 및 97 05203 참조).
아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 적어도 하나의 부위가 모두 또는 일부분 부족 (lack)할 수 있고, 이는 E1, E2, E4 및 L1 L5 부위들로부터 선택된다. E1 부위의 결실이 바람직하다. 그러나, 특히 E2, E4 및/또는 L1 L5 부위들의 모두 또는 일부분에 영향을 미치는 다른 변형(들)/결실(들)과 조합될 수 있다. 기재들 통해서, E1 부위 및 E4 전사 유닛의 주요 부분의 결실은 더욱 특별히 유익하다. 클로닝 능력들을 증가시키기 위한 목적으로, 아데노바이러스 벡터는 부가적으로 비-필수적인 E3 부위의 모두 또는 일부분이 부족할 수 있다. 또 다른 대안에 따라, 캡시드 형성에 필수적인 서열들, 즉 5'- 및 3' ITRs (inverted terminal repeat) 및캡시드 형성 부위를 보유하는 최소한의 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 다양한 아데노바이러스 벡터들 및 이들의 제조 기술들은 잘 알려져 있다 (예를 들어, Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc 참조).
폭스바이러스 과 (poxvirus family)는 코르도폭스 바이러스 (chordopoxvirus) 및 엔토모폭스바이러스 (entomopoxvirus) 아과 (subfamily)의 바이러스들이다. 이들 중에서, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 오소폭스 바이러스 (orthopoxvirus)들, 파라폭스 바이러스 (parapoxvirus)들, 조류폭스 바이러스 (avipoxvirus)들, 카프리폭스 바이러스 (capripoxvirus)들, 레포리폭스 바이러스 (leporipoxvirus)들, 수이폭스 바이러스 (suipoxvirus)들, 몰루스키폭스 바이러스 (molluscipoxvirus)들, 야타폭스 바이러스 (yatapoxvirus)들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 폭스바이러스는 오소폭스바이러스이다.
오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스인 것이 바람직하고 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 특히 MVA 575 (ECACC V00120707) 및 MVA-BN (ECACC V00083008)인 것은 더욱 바람직하다.
"재조합 바이러스 (recombinant virus)"라는 용어는 게놈 내에 삽입된 외재성 서열 (exogenous sequence)로 이루어진 바이러스를 말한다. 여기서 사용되는 바, 외재성 서열은 자연적으로 부모 바이러스에 존재하지 않는 핵산을 말한다.
한 가지 구현예에서, 외재성 서열은 직접적 또는 간접적으로 세포독성 기능을 나타내는 분자를 인코드한다. "직접적 또는 간접적으로 (directly or indirectly)" 세포독성이라는 용어에 의해, 우리는 외재성 서열에 의해 인코딩되는 분자는 스스로 독성 (예를 들어, 라이신 (ricin), 종양괴사인자, 인터루킨-2, 인터페론-감마, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 슈도모나스 엑소톡신 A)을 가질 수 있거나 대사되어 독성 산물을 형성할 수 있거나 또는 그 밖의 어떤 작용을 하여 독성 산물을 형성할 수 있다. 라이신 cDNA의 서열은 여기서 참고문헌으로 삽입한 램 등의 논문에 기재되어 있다 (Lamb et al., Eur J. Biochem., 1985, 148, 265-270).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 외재성 서열은 자살 유전자 (suicide gene)이다. 자살 유전자는 비교적 비-독성인 프로드러그 (prodrug)을 독성 약물로 변화시킬 수 있는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 효소 사이토신 디아미나제 (cytosine deaminase)는 5-플루오로사이토신 (5FC)를 5-플루오로우라실 (5FU)로 변화시킨다 (Mullen et al. (1922) PNAS 89, 33); 허피스 심플렉스 효소 티미딘 키나제는 세포들을 항바이러스제 갱시클로비르 (GCV) 또는 아시클로비르로의 처리에 대해 민감하게 한다 (Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al. (1991) New Biol. 3, 608). 모든 생물체, 예를 들어 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)의 사이토신 디아미나제라도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 유전자는 사이토신 디아미나제 활성을 가지는 단백질을 인코드하고, 훨씬 더 바람직하게는 특허 출원서들 WO2005007857 및 WO9954481에 기재된 단백질을 인코딩한다.
또한 다른 구현예에서, 외래성 유전자는 표적된 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임 (ribozyme)을 인코드한다. 절단되는 표적된 RNA 또는 DNA는 세포의 기능에 필수적인 RNA 또는 DNA 일 수 있고, 그의 절단은 세포사 (cell death)를 초래하거나 또는 절단되는 RNA 또는 DNA는 원하지 않는 단백질, 예를 들어 온코유전자 산물을 인코드하는 RNA 또는 DNA가 될 수 있다. 또한 이 RNA 또는 DNA의 절단은 세포가 암세포가 되는 것을 막을 수 있다.
또한 보다 다른 구현예에서, 외래성 유전자는 안티센스 RNA 를 인코드한다.
"안티센스 RNA (antisense RNA)"에 의해, 우리는 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자와 융합하고 이로부터의 발현을 간섭하거나 또는 프리-mRNA 또는 tRNA 또는 rRNA와 같이 세포 내에서 또 다른 RNA 분자와 융합하거나 또는 유전자와 융합하고 이로부터의 발현을 간섭하는 RNA 분자를 의미한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 외래성 서열은 표적 세포에서 결함 있는 유전자의 기능을 대체한다. 인간들을 포함하여 포유류들의 몇천 가지의 유전되는 유전자 질환들이 있고, 이들은 결함 있는 유전자들에 의해 유발된다. 이러한 유전적 질환들의 예들은 CFTR 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 낭포성 섬유종 (cystic fibrosis); 디스트로핀 (dystrophin)유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 듀첸 근육 위축증 (Duchenne muscular dystrophy); HbA 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 빈혈 (sickle cell disease)을 포함한다. 많은 타입들의 암은 결함 있는 유전자들, 특히 프로토온코 유전자 (protooncogene)들 및 돌연변이를 겪은 종양-억제 유전자 (tumor-suppressor gene)들에 의해 유발된다.
프로토온코 유전자들의 예들로는 ras, src, bcl 등을 들 수 있고; 종양-억제 유전자들로는 p53 및 Rb를 들 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 외래성 서열은 종양 관련 항원 (tumor associated antigen)(TAA)을 인코드한다. TAA는 동일한 조직 타입의 비-종양 세포들에서보다 더 높은 빈도 또는 밀도로 종양 세포들에서 관찰되는 분자를 말한다. TAA의 예들은 이에 제한되지는 않지만 CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, 점 돌연변이된 (point mutated) ras 온코유전자, 정상 또는 점 돌연변이된 p53, 과발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나제 (tyrosinase), TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 서바이빙 (surviving) 및 LRP를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에 따라, TAA는 MUC1 이다.
재조합 바이러스는 하나 이상 (more than one)의 외래성 서열로 이루어질 수 있고, 각 외래성 서열은 하나 이상의 분자를 인코드할 수 있다. 예를 들어, 이것은 동일한 재조합 폭스바이러스에서 TAA 를 코딩하는 외래성 서열을 사이토카인을 코딩하는 외래성 서열을 연결하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 외래성 유전자는 항원을 인코드한다. 여기서 사용되는 바, "항원"은 항체에 의해 결합할 수 있는 리간드를 말하고; 항원은 스스로 면역원성을 가질 (immunogenic) 필요는 없다.
바람직하게, 항원은 예를 들어 HIV-1, (gp 120 또는 gp160 등), 고양이 면역결핍 바이러스 모두 (gD 또는 그의 유도체들) 또는 인간 또는 동물 허피스바이러스 (HSV1 또는 HSV2로부터 나온 ICP27와 같은 초기 단백질 (immediate early protein) 등)들, 사이토메갈로바이러스 (gB 또는 그의 유도체들 등), 배리셀라 조스터 바이러스 (Varicella zoster virus)(gpI, II 또는 III 등)와 같은 바이러스로부터, 또는 B형 간염 표면 항원 또는 그의 유도체와 같은 B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 (바람직하게는 유전자형 1b ja 균주로부터 나온 비-구조 단백질) 및 간염 E형 바이러스와 같은 간염 바이러스로부터, 또는 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytium virus), 인간 파필로마 바이러스 (바람직하게 HPV16 균주로부터 나온 E6 및 E7 단백질) 또는 인플루엔자 바이러스와 같은 다른 바이러스 병원균들로부터 유래하거나, 또는 살모넬라 (Salmonella), 나이세리아 (Neisseria), 보렐리아 (Borellia) (예를 들어 OspA 또는 OSPG 또는 그들의 유도체들) 또는 클라미디아 (Chlamydia)와 같은 박테리아 병원균들, 또는 보르드텔라 (Bordetella) (예를 들어 P.69, PT 및 FHA)로부터 유래하거나, 플라스모듐 (Plasmodium) 또는 톡소플라스마 (Toxoplasma)와 같은 기생충들로부터 유래한다.
도 1은 E1A 핵산 서열을 코딩하는 유전자로 이루어진 벡터이다.
도 2은 HPRT 유전자 내로 E1A 핵산 서열의 부위 특이 삽입을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 의해 얻은 불멸화된 세포의 게놈으로부터 나온 첫 번째 및 세 번째 선별 마커의 제거를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 카이리나 모스카타 텔로머라제 역전사효소 유전자 및 E1A 핵산 서열을 코딩하는 유전자로 이루어진 벡터이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예들 :
실시예 1: E1A 핵산 서열로 이루어진 불멸화된 조류 세포주의 확립
A. 플라스미드 작제들
A-1. 무작위 삽입을 위한 플라스미드 작제들
카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 게놈과 상동성을 가지는 특이 서열을 공유하지 않는 플라스미드 (플라스미드 E1A)는 이 목적을 위해 사용되었다 (도 1).
A-2. 표적된 삽입을 위한 플라스미드 작제들
E1A 핵산 서열 (서열번호 1)을 둘러싸는 카이리나 모스카타 HPRT 유전자와 상동한 2개의 5kb 단편들 그리고 2개의 선별 마커로 이루어진 플라스미드가 제작되었다. 하이폭산틴 구아닌 포스포릴 전이효소 (hypoxanthine guanine phosphoryl transferase)를 인코딩하는 HPRT 유전자는 E1A 핵산 서열의 전신 발현 (constititive expression)에 적당한 부위로 선택되었다.
이들 2가지 선별 마커는 CMV 프로모터 (Thomsen et al. PNAS, 1884, 81. 3:659-63)의 조절 하에 FCU1 유전자 (Erbs et al. Cancer Res. 2000, 15.60.:3813-22) 및 SV40 프로모터의 조절 하에 놓인 네오마이신 (또는 퓨로마이신) 저항성 유전자이다. 네오마이신 (또는 퓨로마이신) 저항성 및 FCU-1 발현 카세트는 최종 세포주로부터 선별 카세트의 제거를 가능하게 하는 Sce1 절단 부위들에 의해 둘러싸여 있다. HPRT 유전자 팔들 (arms)의 외부에 RSV 프로모터에 의해 유도되는 HSVTK 를 코딩하는 선별 마커가 삽입되어 있다 (도 2).
B. 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 배치의 제조 및 소집단들 기재 (subpopulations description ).
B.1 12일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 배치의 제조 및 소집단들 기재.
25개의 SPF 수정란들이 37.5℃에서 배양된다. 달걀들은 12일 배양 후에 입수 가능한 프로토콜에 따라 개봉된다.
23개 배아들은 갈아지고 (mince), 포스페이트 완충 식염수-둘베코 (PBS)로 한 번 세척된 다음 TrypLE 셀렉트 (인비트로겐)로 상온에서 5시간 풀어준다.
낮은 속도로 원심분리한 다음 세포들은 10% 우태아 혈청 (FBS), 0.04 g/L의 젠타마이신을 첨가한 기본 이글 배지 (basal medium Eagle, MBE)에 재현탁하고, 500 cm2 삼중 플라스크들에 접종하여 37℃ 5% CO2 에서 배양하였다.
24시간 후, 충분히 자란 (confluent) 세포들은 TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 떼어내고, 세포 일부분은 2번째 계대를 위해 175 cm2 플라스크들에 재접종하였다. 남아있는 세포들은 적절한 배지 (60% BME, 30% FCS 및10% DMSO)에서 107 세포/mL 농도로 농축시켰고, 장기간 보관을 위해 초기 세포 뱅크 (initial cell bank) (50x1, 5.107 세포들/바이알, 44X1.107 세포들/바이알)로 구성하는 액체 아조트 (liquid azote)로 이동시키기 전에 이소프로필 알코올 조절된 컨테이너 (NALGENE
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"미스터 프로스티" 1℃ 프리징 컨테이너) 내 -80℃에서 얼렸다.
배양액에 남아있는 세포들은 고전적으로 80 계대들까지 계대시키고, 처음 3 계대 동안은 부착되지 않은 세포들을 조정된 배지 (conditioned)를 낮게 원심분리하여 수확하고 재접종하여 다시 초기 배양과 같은 동일한 방식으로 계대한다.
서로 다른 형태학적 특성을 나타내는 소집단 (subpopulation)들은 배양 기간 (lifespan) 동안 계속 (reproducibly) 분리되었다.
B.2 19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 배치의 제조 및 소집단들 기재.
AFFSSA 플루프라간 (Floufragan)으로부터 얻은 29개의 SPF AFFSSA 플루프라간 (Floufragan)으로부터 얻은 29개의 SPF 수정란들이 37.5℃에서 습기 환경하에서 배양된다.
달걀들은 19일 후에 개봉되고 배아들은 무균적으로 적출된다. 20개의 배아들은 목을 떼어내고 다른 세포의 제조에 사용되는 간뿐만 아니라 다리들을 제거한다. 배아 반시체들 (torsi)은 갈아지고 PBS 둘베코 용액 (시그마, Ref. D8537, Lot 46K2428)으로 한 번 세척한 다음 500 mL TrypLE 셀렉트 (집코, Ref 12563, Lots 1319986 및 1339844)로 37℃에서 2시간 풀어준다.
5분간 2000 rpm으로 원심분리한 다음, 세포들은 10% 우태아 혈청 (JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, 코드 TG P4001Q), 0.04 g/L의 젠타마이신 및 4 mM L-글루타민을 첨가한 기본 이글 배지 (basal medium Eagle, 집코, Ref. 41010, Lot 8270)에 재현탁한다. 최종 부피 1.5 L (1.9.106 세포/mL) 현탁액은 10개의 삼중 플라스크 (500 cm2)들에 접종하여 37℃ 5% CO2 에서 배양되었다.
24시간 후 충분히 자란 세포들은 PBS로 세척되고, TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 떼어낸다. 세포들은 계수되고 2000 rpm에서 4-5분 원심분리된다. 세포 펠렛은 적절한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 5.106 또는 107 세포/mL 농도로 농축시킨다. 세포 현탁액은 냉동바이알 (cryovial)(Nunc)들에 채우고, 장기간 보관을 위해 액체 질소로 이동시키기 전에, CETC19p1 (오리 반시체 배아 세포들, 19일 된 배아들, 계대 1)의 일차 세포 뱅크 (primary cell bank) (110개 냉동 바이알들, 107 세포들/바이알)를 구성하면서, -20℃에서 중간 2시간 단계를 거쳐 -80℃에서 얼린다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 카이리나 모스카나 달걀들로부터 얻은 CEC 배치의 제조는 대안의 B.2 (19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터)에 따라 수행된다.
수정란들이 37.5℃에서 습기 환경하에서 배양된다.
달걀들은 19일 후에 개봉되고 배아들은 무균적으로 적출된다. 20개의 배아들은 목을 떼어내고 다른 세포의 제조에 사용되는 간뿐만 아니라 다리들을 제거한다. 배아 시체 (torsi)들은 갈아지고 PBS 둘베코 용액 (시그마, Ref. D8537, Lot 46K2428)으로 한 번 세척한 다음 500 mL의 TrypLE 셀렉트 (집코, Ref 12563, Lots 1319986 및 1339844)로 37℃에서 2시간 풀어준다.
5분간 2000 rpm으로 원심분리한 다음, 세포들은 10% 우태아 혈청 (JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, 코드 TG P4001Q), 0.04 g/L의 젠타마이신 및 4 mM L-글루타민을 첨가한 기본 이글 배지 (basal medium Eagle, 집코, Ref. 41010, Lot 8270)에 재현탁한다. 최종 부피 1.5 L (1.9.106 세포/mL) 현탁액은 10개의 삼중 플라스크 (500 cm2)들에 접종하여 37℃ 5% CO2 에서 배양되었다.
24시간 후 충분히 자란 세포들은 PBS로 세척되고, TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 떼어낸다. 세포들은 계수되고 2000 rpm에서 4-5분 원심분리된다. 세포 펠렛은 적절한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 5.106 또는 107 세포/mL 농도로 농축시킨다. 세포 현탁액은 냉동바이알 (cryovial)(Nunc)들에 채우고, 장기간 보관을 위해 액체 질소로 이동시키기 전에, CETC19p1 (오리 반시체 배아 세포들, 19일 된 배아들, 계대 1)의 일차 세포 뱅크 (primary cell bank) (110개 냉동 바이알들, 107 세포들/바이알)를 구성하면서, -20℃에서 중간 2시간 단계를 거쳐 -80℃에서 얼린다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 카이리나 모스카나 달걀들로부터 얻은 CEC 배치의 제조는 대안의 B.2 (19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터)에 따라 수행된다.
C. 형질전환 방법
당해 분야에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 도입하기 위해 많은 수의 형질전환 방법들이 알려져 있다. 이들 방법들의 수많은 리스트가 하기에 나열되어 있다: CaPO4 침전법 (CaPO4 precipitation), 전기천공법 (electroporation), 리포펙틴 형질전환 방법 (lipofectin transfection method). 주어진 실시예는 CaPO4 침전법에 기초하고 있다.
세포들은 약 80-50% 정도의 충만도 (confluency)를 유지해야 한다. 배지는 CaPO4 /DNA 첨가 2시간 전에 교환된다. 30μg DNA는 31μl의 2M CaCl2 - 161.3 mM 트리스 pH 7.6 에서 재현탁된다. H2O가 최종 부피 0.5 ml로 첨가된다.
그 다음, 2가지 대안으로:
a) 형질전환 시마다, 0.5 ml의 2X HEBS 를 15 ml 무균 팔콘 튜브에 넣고 DNA 용액이 DNA 용액을 약하게 볼텍싱 (gently voltexing)하거나 거품을 내면서 (bubbing) 방울방울 첨가된다. 이 용액은 우유빛이 되어야 한다. 이 혼합물은 상온에서 10-30분 동안 세워둔다. 그 다음 무균 피펫으로 조직 배양 캐비넷을 한 번 안팎으로 피펫팅하여 세포막 (flake)들을 깨고 세포 내에 한 방울씩 떨어뜨린다. 그 다음 세포들은 6시간 내지 하룻밤 동안 37℃에서 배양된다. 고운 침전물 (fine precipitate)이 세포 표면을 덮어야 한다. 형질전환 과정을 완성하기 위해서, 글리세롤 충격 용액 (glycerol shock solution)을 37℃까지 데운다. 배지는 아스피레이션으로 제거하고 5 ml의 BME를 첨가하여 세포층을 세척한 다음 배지는 아스피레이션으로 제거되고 1 ml의 글리세롤 충격 용액이 2분 이하 동안 첨가된다. 연속해서 10 ml의 BME 를 조심스럽게 첨가하여 글리세롤을 희석시키고 BME-글리세롤은 완전히 제거된다. 그 다음 원하는 배지 10 ml이 첨가되고 플레이트들이 적절한 온도에서 배양된다.
또는
b) 형질전환 시마다, 0.5 ml의 2X HEBS 를 15 ml 무균 팔콘 튜브에 넣고 DNA 용액이 DNA 용액을 약하게 볼텍싱 (gently voltexing)하거나 거품을 내면서 (bubbing) 방울방울 첨가된다. 이 용액은 우유빛이 되어야 한다. 이 혼합물은 상온에서 10-30분 동안 세워둔다. 그 다음 무균 피펫으로 조직 배양 캐비넷을 한 번 안팎으로 피펫팅하여 세포막들을 깨고 세포 내에 한 방울씩 떨어뜨린다. 고운 침전물이 세포 표면을 덮어야 한다. 그 다음 세포들은 6시간 내지 하룻밤 동안 37℃에서 배양한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 형질전환법 (CaPO4 침전법)은 대안 b)에 따라 수행된다.
D. 선별 방법
D-1. 무작위 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력은 형질전환 후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고 낮은 속도로 원심분리되며 10% FCS 및 800μg/mL 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또한 선택 사항으로 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르)을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 각 개체 성장 클론들이 분리될 때까지 연속적으로 계대된다 (serially passaged).
D-2. 표적된 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력은 형질전환 후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고, 낮은 속도로 원심분리되며 10% FCS; 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르; 및 800μg/mL, 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또는 0.5μg/mL의 퓨로마이신)을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 각 개체 성장 클론들이 분리될 때까지 연속적으로 계대된다 (serially passaged).
세포 클론들은 이후 계속하여 메가뉴클레아제 (meganuclease) I-Scel 발현 플라스미드로 하기 기술한 방법에 따라 형질전환된다.
선별 마커들의 제거를 선택하기 위하여, 5-플루오로사이토신 (5-FC)가 형질전환 후 48시간 동안 처리된다: 세포들은 TrypLE 셀렉트를 사용하여 풀어지고, 낮은 속도로 원심분리되며 10-3 내지 10-7 M 농도 범위의 5-FC를 가진 배지에 재접종되고 G418 (또는 퓨로마이신/갱시클로비르) 선별 (10% FCS; 5-FC, 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 800μg/mL, 바람직하게는 500μg/mL의 G418 (또는 0.5μg/mL의 퓨로마이신)을 첨가한 BME 배지)에 의해 유지된다 (도 3).
실시예 2: E1A 핵산 서열 및 재조합 텔로머라제 역전사효소 핵산 서열로 이루어진 불멸화된 조류 세포주의 확립
A. 플라스미드 작제들
A-1. 무작위 삽입을 위한 플라스미드 작제들
카이리나 모스카타 게놈과 상동성을 가지는 특이 서열을 공유하지 않는 플라스미드는 이 목적을 위해 사용되었다.
A-2. 표적된 삽입을 위한 플라스미드 작제들
카이리나 모스카타 텔로머라제 역전사효소 유전자 (서열번호 3)를 둘러싸는 카이리나 모스카타 HPRT 유전자와 상동한 2개의 5kb 단편들, E1A 핵산 서열 (서열번호 1) 및 그리고 2개의 선별 마커로 이루어진 플라스미드가 제작되었다. 하이폭산틴 구아닌 포스포릴 전이효소를 인코딩하는 HPRT 유전자는 E1A 핵산 서열의 전신 발현에 적당한 부위로 선택되었다.
이들 2가지 선별 마커는 CMV 프로모터 (Thomsen et al. PNAS, 1884, 81. 3:659-63)의 조절 하에 FCU1 유전자 (Erbs et al. Cancer Res. 2000, 15.60.:3813-22) 및 SV40 프로모터의 조절 하에 놓인 퓨로마이신 저항성 유전자이다. 퓨로마이신 저항성 및 FCU-1 발현 카세트는 최종 세포주로부터 선별 카세트의 제거를 가능하게 하는 Sce1 절단 부위들에 의해 둘러싸여 있다. HPRT 유전자 팔들의 외부에 RSV 프로모터에 의해 유도되는 HSVTK 를 코딩하는 선별 마커가 삽입되어 있다 (도 4).
B. 19일 된 카이리나 모스카타 달걀들로부터 CEC 배치의 제조 및 소집단들 기재.
AFFSSA 플루프라간 (Floufragan)으로부터 얻은 29개의 SPF 카이리나 모스카 타 수정란들이 37.5℃에서 습기 환경하에서 배양된다.
달걀들은 19일 후에 개봉되고 배아들은 무균적으로 적출된다. 20개의 배아들은 목을 떼어내고 다른 세포의 제조에 사용되는 간뿐만 아니라 다리들을 제거한다. 배아 시체 (torsi)들은 갈아지고 PBS 둘베코 용액 (시그마, Ref. D8537, Lot 46K2428)으로 한 번 세척한 다음 500 mL의 TrypLE 셀렉트 (집코, Ref 12563, Lots 1319986 및 1339844)로 37℃에서 2시간 풀어준다.
5분간 2000 rpm으로 원심분리한 다음, 세포들은 10% 우태아 혈청 (JRH, Ref. 12003-1000M, Lot. 5A0102, 코드 TG P4001Q), 0.04 g/L의 젠타마이신 및 4 mM L-글루타민을 첨가한 BME (basal medium Eagle, 집코, Ref. 41010, Lot 8270)에 재현탁한다. 최종 부피 1.5 L (1.9.106 세포/mL) 현탁액은 10개의 삼중 플라스크 (500 cm2)들에 접종하여 37℃ 5% CO2 에서 배양되었다.
24시간 후 충분히 자란 세포들은 PBS로 세척되고, TrypLE 셀렉트 (5 mL/삼중 플라스크)를 사용하여 플라스크들로부터 떼어낸다. 세포들은 계수되고 2000 rpm에서 4-5분 원심분리된다. 세포 펠렛은 적절한 배지 (60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에서 5.106 또는 107 세포/mL 농도로 농축시킨다. 세포 현탁액은 냉동바이알 (cryovial)(Nunc)들에 채우고, 장기간 보관을 위해 액체 질소로 이동시키기 전에, CETC19p1 (오리 반시체 배아 세포들, 19일 된 배아들, 계대 1)의 일차 세포 뱅크 (primary cell bank) (110개 냉동 바이알들, 107 세포들/바이알)를 구성하면서, -20℃에서 중간 2시간 단계를 거쳐 -80℃에서 얼린다.
C. 형질전환 방법
당해 분야에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 도입하기 위해 많은 수의 형질전환 방법들이 알려져 있다. 이들 방법들의 수많은 리스트가 하기에 나열되어 있다: CaPO4 침전법, 전기천공법, 리포펙틴 형질전환 방법. 주어진 실시예는 전기천공법에 기초하고 있다.
형질전환은 아마사의 뉴클레오펙터 (Amaxa's Nucleofector) 장치 및 기본 섬유아세포 키트 (basic fibroblast kit, Amaxa, Cat NO. VPI-1002)를 사용하여 수행된다. 세포들은 700 rpm (100g)에서 10분 원심분리되고 기본 뉴클레오펙터 용액 (basic Nucleofector solution, 106 세포들 당 100μl)에 재현탁된다. 100μL 현탁액은 3 내지 6μg DNA와 혼합되고 뉴클레오펙터 (U-12 프로그램) 내에 놓인 큐벳으로 옮겨진다. 전기천공 후에 시료는 6 cm 배양 디쉬로 옮겨지고 37℃/5% CO2 배양기에서 미리 평형유지된 (preequilibrated) 5 ml의 배양 배지로 채운다. 하룻밤 37℃ 5% CO2 에서 배양한 후 배양 배지를 새로 교환해주고 계속 배양된다.
D. 선별 방법
D-1. 무작위 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력은 형질전환 후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고 낮은 속도로 원심분리되며 10% FCS, 25μg/mL 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 800μg/mL 바람직하게는 500μg/mL의 G418을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 각 개체 성장 클론들이 분리될 때까지 연속적으로 계대된다.
D-2. 표적된 삽입을 위한 선별 방법
선별 압력은 형질전환 후 48 내지 72시간 동안 가해진다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고 낮은 속도로 원심분리되며 10% FCS, 25μg/mL 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 0.5μg/mL의 퓨로마이신을 첨가한 BME 배지에 재접종된다.
세포들은 각 개체 성장 클론들이 분리될 때까지 연속적으로 계대된다.
세포 클론들은 이후 계속하여 메가뉴클레아제 I-Scel 발현 플라스미드로 하기 기술한 방법에 따라 형질전환된다.
선별 마커들의 제거를 선택하기 위하여, 5-플루오로사이토신 (5-FC)가 형질전환 후 48시간 동안 처리된다: 세포들은 TrypLE셀렉트를 사용하여 풀어지고, 낮은 속도로 원심분리되며 10-3 내지 10-7 M 농도 범위의 5-FC를 가진 배지에 재접종되고 퓨로마이신/갱시클로비르 선별 (10% FCS; 5-FC, 25μg/mL, 바람직하게는 10μg/mL의 갱시클로비르 및 10μg/mL, 바람직하게는 0.5μg/mL의 퓨로마이신을 첨가한 BME 배지)에 의해 유지된다.
SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE SA <120> Immortalized avian cell lines <130> D26692 <140> PCT/EP2008/058472 <141> 2008-07-02 <150> EP07360030.6 <151> 2007-07-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1027 <212> DNA <213> adenovirus <400> 1 ccgggactga aaatgagaca tattatctgc cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc 60 gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg ataatcttcc acctcctagc 120 cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 180 cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 240 gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 300 cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 360 ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat 420 gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 480 tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 540 aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 600 gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt 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aacagttttc attaatgtct acaagatatt tttacttcag 3540 gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattca accagaaagt taggaacaat 3600 cctgatttct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctattc tatgctgaaa 3660 gctaaaaatc cagggtttac tttaggtaac agaggtgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720 gcagcagagt ggctctgcta tcatgccttc actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780 tacaaatgct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840 aaggatacta aggcactact gaagacagtg acagaaccat ctatttgtca agatttcaaa 3900 gctatcctgg actga 3915

Claims (41)

  1. 조류 세포가 E1B 핵산 서열로 이루어지지 않고, 상기-조류 세포가 E1A 핵산 서열로 이루어진 비-바이러스 (non-viral) 벡터로 세포를 형질전환하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 E1A 핵산 서열로 이루어진 불멸화된 조류 세포 (immortalized avian cell).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 상기 조류 세포의 HPRT 유전자 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 상기 세포의 내재성 HPRT 프로모터(endogenous HPRT promoter)와 연결되어 작동하는 (operably linked) 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 동물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 동물은 카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 동물은 아나스 플래티린코스 (Anas platyrhynchos) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 60%의 핵산 서열 일치도 (identity)를 가지는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 70%의 핵산 서열 일치도를 가지는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 80%의 핵산 서열 일치도를 가지는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 90%의 핵산 서열 일치도를 가지는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 상기에 더하여 재조합 텔로머라제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase)을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90% 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 핵산 서열 일치도를 가지는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3로 표시되는 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 상기에 더하여 관심 물질 (substance of interest)을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 상기에 더하여 결함 바이러스 (defective virus)의 증식을 가능하게 하는 보완 카세트 (complementation cassette)로 이루어진 것을 특징으로 하는 불멸화된 세포.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 불멸화된 세포를 바이러스 복제에 사용하는 용도.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 바이러스는 우두 바이러스 (cowpox virus), 결지증 바이러스 (ectromelia virus), 원숭이 폭스 바이러스 (monkey pox virus), 백시니아 바이러스 (Vaccina virus), 천연두 바이러스 (Variola virus) 및 MVA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 불멸화된 세포를 관심 물질 (substance of interest)의 생산에 사용하는 용도.
  20. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 불멸화된 세포를 바이러스 생산에 사용하는 용도.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 바이러스는 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 용도.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 바이러스는 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 용도.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 MVA인 것을 특징으로 하는 용도.
  24. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 불멸화된 세포를 재조합 바이러스의 생산에 사용하는 용도.
  25. 조류 세포를 E1A 핵산 서열로 이루어진 비-바이러스 (non-viral) 벡터로 형질전환하는 단계로 이루어지고, 상기 조류 세포를 E1B 핵산 서열로 형질전환하는 단계로 이루어지지 않은 방법인 것을 특징으로 하는 불멸화된 조류 세포 (immortalized avian cell)의 제조방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 벡터는 상기 세포 게놈에 존재하는 서열들에 상동한 (homologous) 2개의 서열들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 상기 상동한 서열들 (homologous sequences)로 둘러싸인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 벡터는 상기에 더하여 첫 번째 선별 마커 (selective marker)로 이루어지고, 상기 선별 마커는 양성 (positive) 선별 마커이며, 상기 첫 번째 선별 마커는 상기 상동한 서열들로 둘러싸인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 첫 번째 선별 마커는 그의 억제 (suppression)를 가능하게 하는 서열들로 둘러싸인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 상동한 서열들로 둘러싸이지 않은 두 번째 선별 마커로 이루어지고, 상기 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 상기 벡터는 세 번째 선별 마커로 이루어지고, 상기 세 번째 선별 마커는 음성 (negative) 선별 마커이며, 상기 세 번째 선별 마커는 첫 번째 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조방법은 상기에 더하여 상기 세포들이 첫 번째 선별 마커를 삽입한 (incorporate) 세포들의 성장만을 가능하게 하는 배지에서 배양되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조방법은 상기에 더하여 상기 세포들이 두 번째 선별 마커를 삽입한 세포들의 성장이 가능하지 않은 배지에서 배양되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  34. 제 31항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조방법은 상기에 더하여 첫 번째 선별 마커를 상기 세포의 게놈으로부터 배제시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  35. 제 34항에 있어서, 첫 번째 선별 마커를 상기 세포의 게놈으로부터 배제시키는 상기 단계 이후에 얻어진 세포들이 세 번째 선별 마커로 이루어진 세포들의 성장이 가능하지 않은 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  36. 제 25항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 생물체로부터 채취된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 생물체는 카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 생물체는 아나스 플래티린코스 (Anas platyrhynchos) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  39. 제 25항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1A 핵산 서열은 상기 세포의 표적 DNA 서열 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 표적 DNA 서열은 HPRT 유전자인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  41. 제 25항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기에 더하여 재조합 텔로머라제 역전사효소를 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
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