KR101337377B1 - 조류 텔로머라아제 역전사효소 - Google Patents
조류 텔로머라아제 역전사효소 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101337377B1 KR101337377B1 KR1020087018929A KR20087018929A KR101337377B1 KR 101337377 B1 KR101337377 B1 KR 101337377B1 KR 1020087018929 A KR1020087018929 A KR 1020087018929A KR 20087018929 A KR20087018929 A KR 20087018929A KR 101337377 B1 KR101337377 B1 KR 101337377B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- nucleic acid
- cells
- virus
- vector
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 신규한 재조합 텔로머라아제 역전사효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 세포 및 상기 세포의 관심 물질 생산을 위한 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 재조합 텔로머라아제 역전사효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 세포 및 관심 물질 생산을 위한 상기 세포의 용도에 관한 것이다.
1965년에 헤이플릭(Hayflick)은 세포의 죽음의 시기가 프로그램되어 있다는 사실을 발견하였다. 노화에 대한 한가지 설명으로써, 그는 인간 세포가 분화될 수 있는 횟수가 제한되어 있다고 제안하였다(Exp Cell Res. 1965 Mar; 37:614-36). 이는 세포를 분화하게 하는 텔로미어의 길이가 짧아짐으로 유발되는 것으로 현재 알려져 있다. 염색체는 보존되고, 나란히 반복되며, 비코딩된 헥사머 DNA 서열로 구성되는 텔로미어에 의해 캡핑되며, 이 헥사머 DNA 서열은 단일- 및 이중-가닥 결합 단백질과 결합된다. 텔로미어는 게놈-안정성 작용을 위해 필수적이며, 특히 염색체 말단의 복제에 필수적이다. 성공적인 염색체 말단 복제는 독특한 텔로미어 구조와 특징화된 효소인 텔로머라아제 역전사효소를 필요로 하며, 이 역전사효소는 역전사 효소의 효소적 활성을 가진 핵단백질이다. 텔로머라아제 역전사 효소는 상보적인 자손 가닥의 복제 연장을 가능하게 하는, 텔로미어 반복 어레이를 연장할 수 있다. 텔로머라아제 역전사 효소가 결핍된 세포에서는, DNA-합성 효소로서 성공적인 분열 동안 짧아진 텔로미어 DNA는 일단 RNA 프라이머가 제거되기 시작하면 염색체의 말단을 완벽하게 복제하는 것을 불가능하게한다. 많은 연구에서는 소위 "텔로미어 시계"라고 일컫어지는 것이 인간 세포의 수명의 중요한 특징이 된다는 증거를 보고하였다. 세포 노화의 텔로미어 이론은 텔로미어 길이가 짧아지는 것이 텔로머라아제 역전사효소 활성의 결핍과 관련이 있고, 염색체 불안정성을 유발하며, 노화와 세포자멸을 유발함을 제시한다. 텔로머라아제 역전사효소 활성은 생체내에서의 발생 동안의 생식세포 혈통과, 시험관내에서의 텔로미어 짧아짐과 관련이 있는 일차 세포에서 하향-조절된다. 반대로, 텔로머라아제 역전사 효소 활성의 상향조절 또는 조절이상은 형질전환된 세포 및 종양에서 발생한다. 여러 포유동물 및 한종의 양서류로부터의 텔로머라아제 역전사효소(TERT) cDNA가 클로닝되고 연구되었다(Nakamura et al., 1997. Science 277, 955-959; Greenberg et al., 1998. Oncogene 16, 1723-1730).
세포에서의 TERT 과발현이 상기 세포의 불멸화를 유도함에 따라, 세포주 생산을 위한 TERT의 용도가 제안되었다(McSharry et al., 2001 J Gen Virol. 82, 855-63). 그러나, TERT 활성은 종에 따라 제한이 된다. 예를 들어, 인간 TERT는 조류 텔로미어 조절 수단과는 부적합하다(Michailidis et al., 2005. Biochem Biophys Res Commun. 335 (1), 240-6). 따라서, 조류, 더욱 구체적으로는 아나티대(Anatidae) 세포주를 개발하기 위해, 이들 특정 세포에서 작용하는 TERT가 필요하다.
진핵 세포주는 바이러스 백신 및 많은 생명공학 생산물의 제조를 위해 필수적이다. 세포 배양에서 생산된 생물학적 제제는 효소, 호르몬, 면역 생물학적 제제(단일클론 항체, 인터루킨, 림포카인), 및 항암제를 포함한다. 비록 많은 간단한 단백질들이 박테리아 세포를 이용해 생산되지만, 글리코실화된 더 복잡한 단백질은 진핵세포에서 생산되어야 한다.
조류 세포주는 이들에서 복제할 수 있는 약제학적 조성물에 사용된 많은 유용한 바이러스이다. 더욱 구체적으로는, 다양한 바이러스는 오직 조류 세포에서만 성장할 수 있다. 예를 들어 변형된 바이러스 안카라(MVA, Modified Virus Ankara)는 대부분의 포유동물 세포에서는 성장할 수 없다. CEF 상에서 500회 이상의 계대에 의해 백시니아 바이러스로부터 유도된 폭스 바이러스는 두창(Variola)에 대해 면역결핍된 사람들을 백신화시키기 위해 17세기 초기에 사용되었다. 현재, MVA는 유전자 치료 및 면역치료 목적의 벡터로서 주로 사용된다. 예를 들어, MVA는 이 항원을 발현하는 종양에 대항하여 환자를 백신화시키기 위한 MUCI 유전자용 벡터로서 사용된다(Scholl et al. 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201). HPV 항원을 코딩하는 유전자를 갖는 MVA는 높은 수준의 자궁경부 병변의 치료를 위한 벡터로서 사용된다. 더욱 최근에, MVA는 새롭게 생겨나는 질병 또는 웨스트나일(west nile) 바이러스 및 탄저병과 같은 생물학적 무기에 대항하여 예방적 치료제를 제조하기 위해 선택한 벡터가 되었다.
따라서, 조류 세포, 특히 아나티대 세포를 불멸화시킬 수 있는 신규한 텔로머라아제 역전사효소가 필요하다.
명세서 전체에 걸쳐 사용된 용어 "하나(a, an)"는 다르게 표시되지 않는 한, 언급된 성분 또는 단계의 "최소한 하나", "최소한 첫번째", "하나 이상" 또는 "다수의"를 의미한다. 예를 들어, 용어 "한 세포(a cell)"는 혼합물을 포함하는 다수의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 연결된 성분의 모든 또는 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 및 "포함"은 언급된 성분 또는 단계를 포함하지만 다른 것은 포함하지 않는 생산물, 조성물 및 방법을 의미하는 것으로 간주된다. 생산물, 조성물 및 방법을 설명하기 위해 "~로 필수적으로 구성된"이 사용될 때에는, 어떠한 필수적으로 중요한 다른 조성물 또는 단계를 배제하는 것으로 의미된다. 따라서, 열거된 조성물로 필수적으로 구성되는 조성물은 미량의 불순물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 제외하지 않는다. "~로 구성되는"은 다른 성분 또는 단계의 미량의 물질 이상을 제외하는 것을 의미한다.
본 발명은 서열번호 1에 대해 최소 60%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된, 및/또는 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1에 대해 최소 70%, 바람직하게는 최소 80%, 더욱 바람직하게는 최소 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 TERT 활성을 가지며, 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현은 아나티대 과에 속하는 세포의 불멸화를 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 "분리된" 및/또는 "재조합"은 사람의 손에 의해 생산되도록 디자인되고, 생체내에서 원래의 세포 환경으로부터 분리된 핵산 분자, DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 인간의 개입의 결과로, 본 발명의 재조합 DNAs, RNAs, 폴리펩타이드 및 단백질은 본원의 자연적으로 발생하지 않는 DNAs, RNAs, 폴리펩타이드 또는 단백질을 설명하는데 유용하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 것과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 바람직한 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 바와 같은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열"은 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 충분한 동일성을 가져, 보통 정도의 혼성화 조건하에서 참조 뉴크레오타이드에 혼성화하는 핵산 분자를 일컫는다. 일 구현예에서, 참조 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 인코딩한다. 다른 구현예에서, 참조 뉴클레오타이드 서열가 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 70%, 더 바람직하게는 최소 90%, 가장 바람직하게는 최소 95%의 동일성을갖는다.
혼성화는 염색체 DNA에서 자연적으로 발생하는 결합과 유사한, 수소 결합을 통해 핵산의 상보적 가닥(즉, 센스:안티센스 가닥 또는 프로브:표적-DNA)이 서로간에 결합하는 것을 일컫는다. 제시된 프로브를 표적 DNA와 혼성화하는데 사용되는 가혹(stringency) 레벨은 당업자에 의해 다양하게 이해될 수 있다.
본원에 사용된 문구 "가혹 혼성화"는 폴리핵산 혼성물이 안정한 조건을 일컫는다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 혼성물의 안정화는 혼성물의 녹는점(Tm)에 반영된다. 일반적으로, 혼성물의 안정화는 소듐 이온 농도와 온도의 작용이다. 전형적으로, 혼성화 반응은 낮은 가혹 조건하에서 수행되고, 그리고 난 뒤 다양한, 그렇지만 더 높은 가혹 환경에서 세척된다. 가혹 혼성화와 관련된 언급은 이러한 세척 조건과 관계있다.
본원에 사용된 문구 "보통의 가혹 혼성화"는 표적-DNA에 대해 약 60% 상동성, 바람직하게는 약 75%의 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85%의 상동성; 특히 바람직하게는 표적-DNA에 대해 약 90% 이상의 상동성을 갖는 상보적 핵산에 표적-DNA가 결합하도록 허락하는 조건을 일컫는다. 바람직하게는, 보통의 가혹 조건은 50% 포르마니드, 5X Denhart's 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS에 넣어 42℃로 혼성화 한 뒤 0.2X SSPE, 0.2% SDS에 넣어 65℃에서 세척하는 혼성화 조건이다.
본 발명의 핵산 분자는 RNA, cDNA 또는 게노믹 서열 또는 이러한 타입의 혼합이 될 수 있다. 이는 적절하게는 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 원래, 교잡(예를 들어 토끼-글로빈 유전자의 인트론 등) 또는 합성적 기원을 가진 하나 이상의 인트론을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 지니는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터를 의미하는 것으로 이해되며, 선택적으로 이러한 벡터는 형질전환 효율 및/또는 이 벡터의 안정성을 향상시키고/또는 이 벡터가 숙주기관의 면역 시스템에 대해 생체내애서 저항하게 하는 하나 이상의 물질과 결합되어 있다. 이들 물질은 당업자가 접근하기 쉬운 문헌에 광범위하게 문서화되어 있다(참조예 Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). 일례로서, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 폴리머, 지질이 될 수 있고, 특히 양이온성 지질, 리포좀, 핵 또는 바이러스 단백질 또는 중성 지질이 될 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 예는 특히 특허문헌 WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 또는 WO 99/05183에서 이용가능하다. 예상되는 조합은 야이온성 지질(DOGS, DC-CHOL, 스퍼민-chol, 스퍼미딘-chol 등) 및 중성 지질(DOPE)과 결합한 플라스미드 재조합 벡터이다.
본 발명의 문맥에 사용될 수 있는 플라스미드의 선택은 방대하다. 이는 클로닝 벡터 및/또는 발현 벡터가 될 수 있다. 일반적으로, 이들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 이들 중의 많은 것들이 상업적으로 이용가능하지만, 유전 공학 기술에 의해 이를 컨스트럭트하거나 변형하는 것도 가능하다. 예를 들어 언급하자면, pBR322(Gibco BRL), pUC(Gibco BRL), pBlustript(Stratagene), pREP4, pCEP4(Invitrogene) or pPoly(Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)로 부터 유도된 플라스미드가 있다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥에 사용된 플라스미드는 생산 세포 및/또는 숙주 세포에서 복제의 시작을 가능하게 하는 복제 기원을 포함한다(예를 들어, ColE1 기원은 E.coli에서 생산될 목적인 플라스미드에 대해 선별될 수 있으며 oriP/EBNA1시스템은 포유동물 숙주 세포에서 자가-복제하기 위해 요구될 경우 선별될 수 있다, Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815).
바이러스 벡터로 간주되는 것으로서, 폭스 바이러스(백시니아 바이러스, 특히 MVA, 카나리폭스 등), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허피스바이러스, 알파바이러스, 포미(foamy) 바이러스 또는 아데노-연관 바이러스로부터 유래된 벡터를 고려하는 것이 가능하다. 바람직하게는 비복제성 벡터가 사용될 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명을 수행하기에 가장 적합한 것이 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 분자의 발현에 필수적인 물질을 추가로 포함한다.
발현에 필수적인 물질은 뉴클레오타이드 서열이 RNA로 전사할 수 있게 하고, mRNA가 폴리펩타이드로 번역될 수 있게 하는 물질의 세트로 구성되며, 구체적으로 이 물질은 상기 세포에서 효과적인 프로모터 서열 및/또는 조절 서열, 그리고 선택적으로는 상기 폴리펩타이드에 대해 표적 세포의 표면에서 분비 또는 발현 가능하도록 요구되는 서열이다. 이러한 물질들은 조절가능하거나 가공가능하다. 물론, 프로모터는 선별된 벡터와 숙주 세포에 적합하다. 예를 들면, 유전자 PGK(Phospho Glycerate Kinase), MT(metallothionein; McIvor et al., 1987, Mol. Cel Biol. 7, 838-848), α-1 안티트립신, CFTR의 진핵세포 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제, 액틴 허파 계면활성제, 면역글로불린 또는 β-액틴을 코딩하는 유전자의 프로모터(Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRα(Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), SV40 바이러스 (Simian Virus) 초기 프로모터, RSV(Rous Sarcoma Virus) LTR, MPSV 프로모터, TK-HSV-1프로모터, CMV 바이러스(Cytomegalovirus) 초기 프로모터, 백시니아 바이러스프로모터 p7.5K pH5R, pK1L, p28, p21 및 아데노바이러스 프로모터 E1A 및 MLP 또는 이들 프로모터의 조합이 언급될 수 있다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터가 가장 바람직하다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 세포 게놈의 원래 게놈에 대한 표적 DNA 서열의 부위 내에 포함된 서열 부분과 상동성을 갖는 2개의 서열을 추가로 포함한다. 이 상동 서열의 존재는 본 발명의 핵산 서열이 상동성 재조합에 의해 표적 DNA 서열에 위치 특이적으로 삽입되는 것을 가능하게 한다.
용어 "상동 재조합"은 본질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열 위치에서 2개의 DNA 분자 사이에서 DNA 단편이 교환되는 것을 일컫는다. 바람직하게는, 벡터에 들어있는 상동 서열은 표적 서열의 부위에 대해 100% 상동성을 갖는다. 그러나, 낮은 서열 상동성도 사용될 수 있다. 따라서, 서열 상동성은 약 80% 정도로 낮은 것도 사용될 수 있다.
벡터에 들어있는 상동 서열은 최소 25 bp, 바람직하게는 이보다 좀더 긴 최소 500 bp , 더욱 바람직하게는 최소 5000 bp를 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 핵산 분자는 벡터에 들어 있는 상동 서열에 의해 둘러싸인다.
본원에 사용된 용어 "둘러싸인"은 상동 서열 중의 하나가 본 발명의 핵산 분자의 상류에 위치하고, 상동 서열 중의 하나가 본 발명의 핵산 분자의 하류에 위치하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "둘러싸인"은 2개의 상동 서열이 본 발명의 핵산 분자의 3' 또는 5' 말단에 직접 연결된 것을 의미하는 것은 아니며, 본 발명의 핵산 분자와 상동 서열은 제한된 수의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
본원에 사용된 "표적 DNA 서열"은 벡터와의 상동 재조합에 의해, 변형을 위해 표적화된 세포의 게놈 내에 있는 부위이다. 표적 DNA 서열은 구조적 유전자(즉, 진핵세포의 경우 인트론과 엑손을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열), 인핸서 서열, 프로모터 등과 같은 조절 서열 및 관심 게놈 내의 다른 부위를 포함한다. 표적 DNA 서열은 숙주 게놈의 기능에 대해 영향을 주지 않는 벡터에 의해 표적화되는 서열이 될 수 있다.
본원에 사용된 "표적 DNA 서열로 삽입된"은 광범위하게는 본 발명의 핵산 분자의 삽입을 유발하여 표적화된 DNA 서열 내로 제거(deletion) 또는 파괴(disruption)를 도입하는 상동 재조합 과정을 의미한다.
당업자라면 세포의 게놈 내로 특정 DNA 서열을 표적화하기 위해 적절한 상동성 서열을 선택할 수 있다. 예를 들어, 한개의 상동성 서열은 표적 DNA 서열의 일부분에 대해 상동성일 수 있으며, 다른 상동성 서열은 표적 서열의 상류 또는 하류에 위치한 DNA 서열에 대해 상동성이다. 다른 실시예에 따르면, 한개의 상동성 서열은 표적 DNA 서열의 상류에 위치한 DNA 서열에 대해 상동성일 수 있고, 다른 상동성 서열은 표적 DNA 서열의 하류에 위치한 DNA 서열에 대해 상동성이다. 다른 실시예에서는, 이 상동성 서열 모두는 표적 DNA 서열에 위치한 서열에 대해 상동성이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표적 DNA 서열은 HPRT(하이폭산틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제) 유전자이다.
HPRT 프로모터 및 캐리나 모스카타의 HPRT 유전자를 포함하는 게노믹 서열은 서열번호 3으로 표시된다. HPRT를 코딩하는 서열은 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 8695번째 위치에 있는 ATG 코돈에서 시작하고, 이 ATG 코돈의 상류에 있는 서열이 HPRT 프로모터 서열이다.
당업자라면 본 발명의 핵산 서열을 HPRT 유전자로 도입하기 위해 필요한 상동성 서열을 선택할 수 있다. 다수의 과(family) 중에서, HPRT를 코딩하는 게노믹 서열은 조류 내에서 가장 상동성이 높으며, 따라서 당업자라면 다른 조류 세포의 HPRT 유전자를 표적으로 하기에 필요한 상동성 서열을 디자인할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상동성 서열은 본 발명의 핵산 분자를 HPRT 프로모터의 하류에 삽입하기 위해 상업화되어 있다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포의 내인성 HPRT 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. 본 발명의 문맥에서, "기능적으로 연결된"은 핵산 분자가 세포 내에서 발현하도록 허락하는 방법 내에서 프로모터에 연결된 것을 의미한다.
이런 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 서열의 상류에 있는 상동성 서열은 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 위치 1에 있는 뉴클레오타이드로부터 시작하고 위치 8694에 있는 뉴클레오타이드에서 끝나는 핵산 서열의 최소 500개의 인접 bp, 더욱 바람직하게는 최소 5000개의 인접 bp에 대해 상동성을 갖는 핵산 서열을 가지는데, 상기 상동성 서열은 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 위치 8695에 있는 뉴클레오타이드로 시작하고 위치 26916에 있는 뉴클레오타이드로 끝나는 핵산 서열과 상동성을 띄지 않는 것을 조건부로 한다. 게다가, 상류 상동성 서열은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자의 시작 코돈에 직접적으로 연결된다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자의 상류에 대해 상동성을 갖는 서열은 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 위치 1383에 있는 뉴클레오타이드로부터 시작하고 위치 8694에 있는 뉴클레오타이드에서 끝나는 핵산 서열로 구성된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열의 위치 1에 있는 뉴클레오타이드로부터 시작하고 위치 11227에 있는 뉴클레오타이드에서 끝나는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자의 하류에 대해 상동성을 갖는 서열은 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 위치 10581에 있는 뉴클레오타이드로부터 시작하고 위치 17800에 있는 뉴클레오타이드에서 끝나는 핵산 서열의 최소 500개의 인접 bp, 더욱 바람직하게는 최소 5000개의 인접 bp에 대해 상동성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 상동성 서열은 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열의 위치 10581에 있는 뉴클레오타이드로 시작하고 위치 17800에 있는 뉴클레오타이드로 끝나는 핵산 서열로 구성된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 제1 선별 마커를 포함하는데, 여기서 상기 제1 선별 마커는 양성 선별 마커이고, 상기 제1 선별 마커와 본 발명의 핵산 분자는 벡터의 동일한 세션에 위치해 있고, 상기 섹션은 상동성 서열에 의해 경계지어 진다.
본원에 사용된 용어 "양성 선별 마커"은 특정 조건하에서 유전자를 가진 세포가 생존 및/또는 성장하게 하는 산물을 인코딩하는 유전자를 일컫는다. 일반적인 선별 마커는 항생제 또는 다른 톡신, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린, 영양 결핍 보체에 대해 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하거나, 또는 복합 배지로부터 얻을 수 없는 필수 영양성분을 제공한다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 제1 선별 마커는 항생제에 대해 내성을 주는 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 벡터 내에 있는 제 1 선별 마커는 이를 억제 가능하게 하는 서열에 의해 둘러싸인다. 제 1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 상기 서열은 본 발명의 핵산 분자는 둘러싸지 않는다. 벡터가 원형일 경우, 상기 서열은 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하고, 제 1 선별 마커와 본 발명의 핵산 분자는 전달 벡터의 동일 섹션에 위치하고, 상기 섹션은 상동성 서열에 의해 경계지어 진다.
핵산 절편의 억제를 가능하게 하는 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다(Nunes-Duby, S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406). 이들 서열들은 상기 서열 사이에 포함된 핵산의 억제를 유발하는 하나 이상의 특정 효소에 의해 인식될 수 있는데, 이러한 효소들은 "리콤비나아제(recombinase)"라고 불린다. 예를 들어, 핵산 절편의 억제를 가능하게 하는 3개의 공지된 리콤비나아제는 FLP, ISCEI 및 Cre 리콤비나아제이다.
전형적인 위치-특이적 리콤비나아제는 Cre 리콤비나아제이다. Cre는 박테리오파지 P1의 cre(cyclization recombination) 유전자의 38-kDa 산물이며, Int 패밀리의 위치-특이적 DNA 리콤비나아제이다(Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212). Cre는 loxP(locus of X-over of P1)라고 불리는 P1 게놈 상에 있는 34-bp 위치를 인식하며, loxP 위치 쌍 사이에서 상호간 보존적 DNA 재조합을 효율적으로 촉매한다. loxP 위치는 8-bp의 비팔린드로믹(nonpalindromic) 중심 부위를 플랭킹하는 2개의 13-bp 역전 반복으로 구성된다. 2개의 직접적으로 반복된 loxP 위치 사이에서의 Cre-유도된 재조합은 공유적으로 닫혀져 있는 원으로서 이들 사이에서 DNA의 절단을 유발한다. 방향이 역전되어 있는 것에서의 loxP 위치 쌍 사이에서의 Cre-유도된 재조합은 제거 보다는 끼어들어간 DNA의 역전을 유발할 것이다. DNA를 절단하고 연결하는 것은 중심 부위 내에서 위치를 분리시키는 것으로 제한되며, 효소를 이용한 일시적 포스포티로신 DNA-단백질 연결 방법에 의해 일시적으로 가닥 상에서 이루어진다.
다른 위치-특이적 리콤비나아제는 I-SceI이다. 다른 인트론-호밍(homing) 엔도뉴클레아제, 예를 들어 I-TliI, I-CeuI, I-CreI, I-PpoI 및PI-PspI는 I-SceI를 대체할 수 있다. 많은 것들이 벨포트와 로버트에 의해 나열되었다((997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388). 이러한 많은 엔도뉴클레아제는 코돈 사용이 일반적인 핵 코돈 사용과는 다른 세포기관으로부터 유도된다. 이들 엔도뉴클레아제의 핵 발현을 위해 이러한 유전자를 사용하기 위해, 핵 유전자와 매치하는 코딩 서열을 변형할 필요가 있을 수 있다. I-SceI는 이의 인식 위치 내에서 DNA를 절단하는 이중가닥의 엔도뉴클레아제이다. I-SceI은 3'OH 오버행으로 4bp의 엇갈린 절단물을 형성한다.
효소 I-SceI의 인식 위치로서 알려져 있다. I-SceI의 인식 위치는 18 bp 이상 연장하는 비-대칭적 서열이다.
5'TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3'ATCCCTATTGTCCCATTA5'
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열은 I-SceI의 인식 위치를 포함한다.
다른 위치-특이저 리콤비나아제는 FLP 리콤비나아제이다. Flp 리콤비나아제는 이의 인식서열의 제한된 퇴화(degeneracy)만을 견디는 다른 34bp 최소 위치를 인식한다(Jayaram, 1985; Sencoff et al., 1988). Flp 리콤비나아제와 FRT 유전자간의 상호작용이 실험되었다(Pangrahi et al., 1992). 다양한 FRT 서열의 예는 Jayaram(1985) 및 Senecoff 등(1988)에 의해 제시되었고, 다른 물질 상에서의 Flp-매개된 재조합의 분석은 Snaith 등(1996)에 의해 기술되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열을 포함하며, 상기 벡터는 바람직하게는 제1 상동 서열 A 및 제2 상동 서열 B를 포함할 수 있으며 여기서 상기 상동 서열 A 및 B는 이들간에 상동성 재조하블 가능하게 하기에 충분한 길이 및 상동성을 가진다. 상동 서열 A 및 B를 언급하는데 있어서, "충분한 상동성"은 최소 20 염기쌍, 바람직하게는 최소 50 염기쌍, 특히 바람직하게는 최소 100 염기쌍, 특히 더 바람직하게는 최소 250 염기쌍, 가장 바람직하게는 최소 500 염기쌍 길이 이상의 상동성 서열 내에서, 최소 70%, 바람직하게는 최소 80%, 더욱 바람직하게는 최소 90%, 특히 바람직하게는 최소 95%, 더욱 바람직하게는 최소 99%, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가진 서열을 일컫는 것이 바람직하다. 이 구현예에서, 본 발명의 벡터는 5'- 에서 3'의 방향으로 다음의 것들을 순서대로 포함한다; 본 발명의 핵산 분자, 제1 상동 서열 A, 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열, 제 1 선별 마커, 제 1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열 및 상동 서열 B.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 상기 상동 서열들에 의해 둘러싸이지 않는 제2 선별 마커를 포함하며, 상기 제2 선별 마커는 음성 선별 마커이다. 상기 제2 선별 마커는 본 발명의 벡터가 원형일 때 특히 유용하다. 벡터가 원형일 경우, 제2 선별 마커가 상기 상동 서열들에 의해 둘러싸이지 않는다는 사실은 제2 선별 마커와 본 발명의 핵산 서열이 전달 벡터의 동일한 섹션에 위치하지 않는다는 것을 의미하고, 상기 섹션은 상동 서열에 의해 경계지어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 제3 선별 마커를 포함하는데, 여기서 상기 제3 선별 마커는 음성 선별 마커이고, 상기 제3 선별마커는 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서여들 사이에 위치한다. 벡터가 원형일 경우, 제3 선별 마커가 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열들에 의해 둘러싸인다는 사실은 제3 선별 마커와 제1 선별 마커가 전달 벡터의 동일한 섹션에 위치한다는 것을 의미하고, 상기 섹션은 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열에 의해 경계지어진다.
본원에 사용된 용어 "음성 선별 마커"는 특정 조건 하에서 유전자를 전달하는 세포를 죽이는 산물을 인코딩하는 유전자를 일컫는다. 이들 유전자들은 "자살 유전자"를 포함한다. 이들 유전자에 의해 인코딩된 산물은 세포 독성 화합물에서 전구약물을 전환시킬 수 있다. 수많은 자살 유전자/전구 약물 쌍은 최근에 이용가능하다. 더욱 구체적으로는 다음의 쌍이 언급된다:
- 허피스 심플렉스 바이러스 타입 I 티미딘 키나아제(HSV-1 TK) 및 아시클로버 또는 간시클로버(GCB)(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Rams et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361);
- 사이토크롬 p450 및 사이클로포스포파미드(Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
- 대장균(E.coli)으로부터의 퓨린 뉴클레오사이드 포스로릴라아제 및 6-메틸퓨린 데옥시리보뉴클레오사이드(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238);
- 대장균(E.coli)으로부터의 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 및 6-티오잔틴(Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) 및
- 사이토신 디아미나아제(CDase) 및 5-플루오로시토신(5FC).
- FCU1 및 5-플루오로-시토신(5FC)(WO9954481).
- FCU1-8 및 5-플루오로-시토신(5FC)(WO2005007857).
첫번째로, 제2 및 제3 선별 마커는 개별적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 제1 및 제3 선별 마커를 포함하지만 제2 선별 마커 단독은 포함할 수 없고, 제2 및 제3 선별 마커를 포함하지만 제1 선별 마커 단독은 포함할 수 없다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1, 제2 및/또는 제3 선별 마커는 숙주 세포에서 이들의 발현을 위해 필요한 구성물의 조절하에 위치한다.
발현을 위해 필수적인 구성물은 뉴클레오타이드 서열을 RNA로 전사시키고, mRNA를 폴리펩타이드로 번역시킬수 있는 구성물의 세트로 구성되는데, 구체적으로는 상기 세포에서 유효한 프로모터 서열 및/또는 조절 서열이 있고, 선택적으로는 상기 폴리펩타이드에 대해 숙주 세포의 표면에서 배출 또는 발현 가능하게 하는데 필요한 서열이 있다. 이들 구성물은 조절가능하거나 구조적이다. 물론, 프로모터는 선별된 벡터와 숙주 세포에 적용된다. 예를 들면 다음의 것들이 언급될 수 있다, 유전자 PGK(Phospho Glycerate Kinase)의 진핵세포 프로모터, MT(메탈로티오네인; McIvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 안티트립신, CFTR, 근육 크레아틴 키나아제를 인코딩하는 유전자, 액틴 폐 계면활성제, 면역글로불린 또는 β-액틴(Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 41-436), SRα(Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), SV40바이러스(Simian Virus) 초기 프로모터, RSV(Rous Sarcoma Virus) LTR, MPSV 프로모터, TK-HSV-1 프로모터, CMV 바이러스(사이토메갈로바이러스) 초기 프로모터, 백시니아 바이러스 프로모터 p7.5K pH5R, pK1L, p28, p11 및 아데노바이러스 프로모터 E1A 및 MLP 또는 상기 프로모터들의 조합. 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터가 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "유도된"은 세포로부터 발생하거나 분화된 것 또는 본 발명의 핵산 분자에 의해 형질전환된 세포를 조상으로 갖는 세포를 일컫는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 벡터의, 세포 불멸화를 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산 분자는 세포의 내인성 HPRT 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. "기능적으로 연결된" 이란 핵산 분자가 세포에서 이의 발현을 가능하게 하는 방법으로 프로모터에 연결된 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 세포내로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 세포의 불멸화 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 불멸화된 세포는 35 계대 이상 동안 배양하여 자랄 수 있는 세포를 일컫는다.
용어 계대 수는 추가적 성장을 촉진시키기에 충분히 낮은 농도에서 세포를 유지시키기 위해, 배양 용기로부터 세포 군락이 제거된 뒤 2차 배양(계대) 과정을 거치는 횟수를 일컫는다.
본원에 사용된 용어 "형질전환된"은 본 발명의 세포의 안정 형질전환 또는 일시적 형질전환을 일컫는다.
용어 "안정 형질전환" 또는 "안정하게 형질전환된"은 형질전환된 세포의 게놈 내로 외래 DNA가 삽입되고 융합되는 것을 일컫는다.
용어 "일시적 형질전환" 또는 "일시적으로 형질전환된"은 외래 DNA가 세포내로 삽입되지만, 형질전환된 세포의 게놈 내로 외래 DNA가 융합되는 것은 실패한 것을 일컫는다. 외래 DNA는 수일 동안 형질전환된 세포의 핵 내에 존재한다. 용어 "일시적 형질전환"은 세포가 외래 DNA를 갖고 있긴 하지만 이 DNA가 융합되는데에는 실패한 것을 일컫는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 조류 세포로부터 유래되며, 더욱 바람직하게는 아나티대 과 또는 파시아니대(Phasianidae) 과의 세포로부터 유래된다. 아나티대 중에서, 캐리나(Cairina) 또는 아나스(Anas) 종에 속하는 세포가 특히 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 캐리나 모스카타 또는 아나스 플라티린코스 종에 속한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 배아 생물체로부터 유래된다. 살아있는 생물체로부터 세포를 분리 가능하게 하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 일차 세포는 0 내지 20일령, 더욱 바람직하게는 5 내지 15일령, 더욱 더 바람직하게는 11 내지 14일령의 아나티대 과에 속하는 배아로부터 분리된다.
벡터가 본 발명의 방법에 사용될 경우 제1 선별 마커를 포함한다. 제1 선별 마커의 삽입은 본 발명의 핵산 분자가 삽입된 세포의 선별을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 제1 선별 마커가 삽입된 세포만의 성장을 가능하게 하는 배지에서 세포가 배양되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 배지에는 항생제가 포함된다.
벡터가 본 발명의 방법에 사용될 경우 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열을 포함하며, 본 발명에 따른 방법은 상기 일차 세포의 게놈으로부터 제1 선별 마커를 억제하는 것으로 구성되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 선별 마커를 억제시키기 위해, 세포는 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열에 대해 특이적인 리콤비나아제를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된다. 유전자를 세포로 전달할 수 있는 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 본 발명의 실시예 4에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
벡터가 본 발명의 방법에 사용될 경우 제2 선별 마커를 포함하며, 본 발명에 따른 방법은 제2 선별 마커가 삽입되지 않는 세포만의 성장을 가능하게 하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 제1 선별 마커가 삽입된 세포만의 성장을 가능하게 하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계와 동시에 또는 별도로 사용될 수 있다.
상기 제2 선별 마커는 본 발명의 방법에 사용된 벡터가 원형일 때 특히 유용하다. 상기 제2 선별 마커의 존재는 세포의 파괴를 가능하게 하는데, 여기서 상동 재조합 과정은 본 발명의 핵산 분자를 포함하지 않는 전달 벡터의 섹션의 도입을 유도한다.
벡터가 본 발명의 방법에 사용될 경우 제3 선별 마커를 포함하며, 본 발명에 따른 방법은 제3 선별 마커를 포함하는 세포의 성장을 가능하지 않게 하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 배지는 제3 선별 마커로서 FCU1, 5-플루오로사이토신을 포함하는 세포의 성장을 가능하지 않게 한다.
이 단계는 제1 선별 마커의 억제가 일어난 세포를 선별 가능하게 한다. 이는 제1 선별 마커를 억제하는 것으로 구성되는 단계가 제3 선별 마커의 억제를 유도할 수 도 있다는 것을 의미한다. 제3 선별 마커의 존재는 제1 선별 마커가 존재하는 세포의 파괴를 가능하게 한다.
특히 본 발명은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 하기 단계를 포함하는 세포 불멸화 방법에 관한 것이다:
- 다음을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환시키는 단계:
ㆍ상동 서열에 의해 둘러싸인 본 발명에 따른 핵산 분자.
ㆍ제 1 선별 마커, 상기 제1 선별 마커는 양성 선별 마커이고, 상기 상동 서열에 의해 둘러싸임.
ㆍ제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열.
ㆍ상기 상동 서열에 의해 둘러싸이지 않는 제2 선별 마커, 상기 선별 마커는 음성 선별 마커임.
ㆍ제3 선별 마커, 상기 제3 선별 마커는 음성 선별 마커이고, 제1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열 사이에 위치함.
- 제1 선별 마커가 삽입된 세포만의 성장을 가능하게 하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계.
- 제2 선별 마커가 삽입된 세포의 성장을 가능하지 않게 하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계.
- 상기 세포의 게놈으로부터 제1 선별 마커를 제거하는 단계.
- 제3 선별 마커를 포함하는 세포의 성장을 가능하지 않게 하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 캐리나 모스카타 텔로머라아제 역전사 효소를 포함하고 캐리나 모스카타 HPRT 프로모터의 조절하에 있으며 HPRT 유전자 내로 삽입된 것을 특징으로 하는 캐리나 모스카타 종에 속하는 동물의 세포로부터 유래된 불멸화된 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포는 결핍성 바이러스의 증식을 가능하게 하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. "결핍성(Defective) 바이러스"는 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자가 결실되거나 기능을 하지 않는 바이러스를 일컫는다. 용어 "결핍성 바이러스의 증식을 가능하게 하는 핵산 서열"은 결핍성 바이러스의 복제를 가능하게 하는 기능(들)을 제공하는 핵산 서열을 일컫는다. 다르게 말하자면, 상기 핵산 서열(들)은 상기 결핍성 바이러스의 복제 및 캡슐화에 필수적인 단백질(들)을 코딩한다. 예를 들면, E1 부위의 대부분이 부족한 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위해, 본 발명에 따른 세포는 E1 부위를 코딩하는 핵산 서열로 일시적 또는 영구적으로 형질전환될 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 관심 물질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 관심 물질은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 다음의 것들을 포함할 수 있다, 면역화 또는 백신화를 위해 유용한 약제학적 활성 단백질, 예를 들어 성장 인자, 성장 조절자, 항체, 항원, 및 이의 유도체 등, 인터루킨, 인슐린, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF 또는 이의 조합, 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론- , 혈액 응고 인자 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX, 또는 셰A 또는 이의 조합. 또한 "관심 물질"은 산업적 효소, 예를 들어 펄프 및 종이, 섬유 변형, 또는 에탄올 생산에 사용되는 산업 효소를 일컫을 수 있다. 마지막으로, "관심 물질"은 단백질 보충제 또는 동물 사료용 부가가치 상품을 일컫는다.
본 발명에 의해 얻어진 세포, 본 발명의 세포 및 이로부터 유도된 세포는 바이러스의 복제에 유용하다. 상기 바이러스는 살아있거나, 약독화되거나, 재조합 또는 그렇지 않은 것도 될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 세포는 폭스바이러스(백시니아 바이러스, 특히 MVA, 카나리폭스바이러스 등), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허피스바이러스, 알파바이러스, 포미 바이러스 또는 아데노바이러스-관련 바이러스의 복제에 유용하다.
레트로바이러스는 감염 특성을 가지며, 대부분의 경우는 세포내로 삽입하고 세포를 분리시키며, 특히 암과 관련된 용도에 적합하다. 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스는 LTR 서열, 단백질막싸기(encapsidation) 부위 및 레트로바이러스 LTR 또는 하기에 기재된 바와 같은 내부 프로모터의 조절하에 있는 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 변형을 포함할 수 있는데 특히 LTRs(진핵세포와 프로모터 부위를 치환) 또는 단백질막싸기 부위(이종 단백질막싸기 부위와 치환, 예를 들어 VL30 타입)에서의 변형을 포함할 수 있다(프랑스 특허 94 08300 및 97 05203).
아데노바이러스 벡터는 복제를 위해 필수적인 최소한 한개의 부위 모두 또는 일부가 결핍될 수 있으며, 상기 부위는 E1, E2, E4 및 L1 L5 부위이다. E1 부위의 결실이 바람직하다. 그러나, 다른 변형(들)/결실(들)과 조합될 수 있는데, 특히 E2, E4 및/또는 L1 L5 부위 모두 또는 일부일 수 있다. 예를 들어 E1 부위 및 E4 전사 단위의 중요한 부분의 결실이 특히 바람직하다. 클로닝 효율을 증가시키기 위한 목적으로, 아데노바이러스 벡터는 비-필수적인 E3 부위의 일부 또는 전부가 추가로 결핍될 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 단백질막싸기에 필수적인, 5' 및 3' ITRs(Inverted Terminal Repeat)라고 불리는 서열 및 단백질막싸기 부위를 보존할 수 있다. 다양한 아데노바이러스 벡터 및 이를 제조하기 위한 기술은 공지되어 있다(참조예, Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc).
폭스바이러스 과는 코도폭스바이러스(Chordopoxvirus) 및 엔토모폭스바이러스(Entomopoxvirus) 아과(subfamily)의 바이러스를 포함한다. 이들 중에서, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 오쏘폭스바이러스(Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), 아비폭스바이러스(Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus), 쉬폭스바이러스(Suipoxvirus), 몰루시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 오쏘폭스바이러스이다.
오쏘폭스바이러스는 바람직하게는 백시니아 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA), 특히 MVA 575(ECACC V0012007) 및 MVA-BN(ECACC V00083008)이다.
용어 "재조합 바이러스"는 그의 게놈 내에 외래 서열이 삽입된 것을 포함하는 바이러스를 일컫는다. 본원에 사용된 바와 같이, 외래 서열은 부모 바이러스에는 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 일컫는다.
일 구현예에서, 외래 서열은 직접적 또는 간접적으로 세포독성 기능을 갖는 분자를 인코딩한다. "직접적 또는 간접적으로" 세포독성이란, 외래 서열에 의해 인코딩된 분자가 그 자체로서 독성일 수 있는(예를 들어 리신(ricin), 종양 괴사 인자, 인터루킨-2, 인터페론-감마, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 슈도모나스 엑소톡신 A), 또는 독성 물질을 형성하도록 물질대사할 수 있고, 또는 독성 물질을 형성하도록 작용하는 것을 의미한다. 리신 cDNA 서열은 Lamb 등의 문헌에 기재되어 있으며 참조문헌으로서 본원에 삽입된다(Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-70).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 외래 서열은 자살 유전자이다. 자살 유전자는 상대적으로 비-독성인 전구약물을 독성 약물로 전환시킬 수 있는 단백지를 인코딩한다. 예를 들어, 효소 사이토신 디아미나아제는 5-플루오로시토신(5FC)를 5-플루오로우라실(5FU)로 전환시키고(Mullen et al(1922) PNAS 89,33); 허피스 심플렉스 효소 티미딘 키나아제는 항바이러스제인 간시클로버(GCV) 또는 아시클로버로 처리한 세포를 감작화시킨다(Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). 모든 생물체 예를 들어 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시애의 사이토신 디아미나아제가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서는, 유전자가 사이토신 디아미나아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하며, 더욱 바람직하게는 특허문헌 WO2005007857 및 WO9954481에 기재된 바와 같은 단백질을 인코딩한다.
다른 구현예에서, 외래 유전자는 표적 DNA 또는 RNA를 절단할 수 있는 라이보자임을 인코딩한다. 절단되는 표적 DNA 또는 RNA는 세포의 기능에 필수적이며, 이의 절단이 세포의 죽음을 유발하는 RNA 또는 DNA이거나, 절단되는 RNA 또는 DNA는 필요없는 단백질, 예를 들어 종양유전자 산물을 인코딩할 수 있으며, 이 RNA 또는 DNA의 절단은 세포가 암으로 발전하는 것을 억제시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 외래 유전자는 안티센스 RNA를 인코딩한다.
"안티센스 RNA"는 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자 또는 pre-mRNA 또는 tRNA 또는 rRNA와 같이 세포내에 있는 다른 RNA 분자와 혼성화하고, mRNA로부터의 발현을 방해하거나, 유전자와 혼성화하거나 유전자의 발현을 방해한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 외래 유전자는 표적 세포에 들어있는 결핍성 유전자의 기능을 대체한다. 인간을 포함하는 포유동물에는 수천가지의 유전된 유전 질병이 있으며, 이는 결핍성 유전자에 의해 유발된다. 이러한 유전 질병의 예로는 CFTR 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 알려진 섬유성 낭종; 디스트로핀(dystrophin) 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 알려진 듀켄(Duchenne) 근육 장애;HbA 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 알려진 겸상 적혈구병이 있다. 많은 종류의 암은 결핍성 유전자, 특히 원발암유전자(protooncogene), 및 돌연변이가 진행되는 종양-억제 유전자에 의해 유발된다.
원발암유전자의 예로는 ras, src, bcl 등이 있다; 종양 성장 억제 인자의 예로는 p53 및 Rb가 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 외래 유전자는 종양 연관 항원(TAA)을 인코딩한다. TAA는 동일한 조직의 비-종양 세포 보다 종양 세포에 더 높은 밀도 및 빈도로 검출되는 분자를 일컫는다. TAA의 예로는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다, CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, 점돌연변이된 ras 종양유전자, 정상 또는 점돌연변이된 p53, 과발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, surviving 및 LRP. 더욱 바람직한 구현예에 따르면, TAA는 MUC1이다.
재조합 바이러스는 하나 이상의 외래 유전자를 포함할 수 있으며, 외래 유전자 각각은 하나 이상의 분자를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 이는 동일한 재조합 폭스바이러스에서 결합하는데 유용하데, TAA를 코딩하는 외래 서열과 사이토카인을 코딩하는 외래 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 외래 서열은 항원을 인코딩한다. 본원에 사용된 "항원"은 항워에 의해 결합될 수 있는 리간드를 일컫으며; 항원은 그 자체로는 면역원성일 필요가 없다.
바람직하게는 항원은 바이러스로부터 유래되며, 예를 들면 다음과 같은 바이러스로부터 유래된다, HIV-1(gp 120 또는 gp 160과 같음), 펠린(Feline) 면역결핍성 바이러스 모두, gD 또는 이의 유도체와 같은 인간 또는 동물 허피스 바이러스 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27과 같은 이미디어트(Immediate) 초기 단백질, 사이토메갈로바이러스(gB 또는 이의 유도체와 같음), 바리셀라 조스터(Varicella Zoster) 바이러스(gpI, II 또는 III와 같음), 헤파티티스 B 표면 항원 또는 이의 유도체와 같은 헤파티티스 B 바이러스, 헤파티티스 A 바이러스, 헤파티티스 C 바이러스(바람직하게는 유전형 1b 스트레인 ja로부터의 비구조적 단백질) 및 헤파티티스 E 바이러스와 같은 헤파티티스 바이러스, 또는 호흡기성 신시티알(Syncytial) 바이러스, 인간 유두종 바이러스(바람직하게는 HPV16 스트레인으로부터의 E6 및 E7 단백질), 또는 살모넬라, 네세리아(Nesseria), 보렐리아(Borrelia)와 같은 박테라아파지(예를 들어 OspA 또는 OspB 또는 이의 유도체), 또는 클라미디아(Chlamydia) 또는 예를 들어 P.69, PT 및 FHA인 보데텔라(Bordetella), 또는 플라스모디움 또는 톡소플라즈마와 같은 해충.
도 1: 텔로머라아제 역전사 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
도 2: 텔로머라아제 역전사 효소를 코딩하는 유전자를 HPRT 유전자 내로 위치 특이적으로 삽입하는 것을 보여주는 모식도.
도 3: 본 발명의 방법에 의해 얻어진 불멸화된 세포의 게놈으로부터 제1 및 제3 선별 마커를 제거하는 것을 보여주는 모식도.
실시예
1:
텔로머라아제
발현 시스템
무작위 삽입
오리 게놈과 상동의 특이 서열을 갖지 않는 플라스미드를 사용하였다(도 1).
표적 삽입
캐리나 모스카타(cairina moschata) 텔로머라아제 역전사 효소 유전자를 둘러싸는 캐리나 모스카타 HPRT 유전자에 대해 상동인 2개의 5kb 단편과 2개의 선별 마커를 포함하는 플라스미드를 컨스트럭트하였다. 하이폭산틴 구아닌 포스포릴 트랜스퍼라아제를 인코딩하는 HPRT 유전자는 캐리나 모스카타 텔로머라아제의 구조적 발현에 적합한 부위로서 선택하였다.
이 2개의 선별 마커는 CMV 프로모터(Thomsen et al., P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-63)의 조절하에 있는 FCU1 유전자(Erbs et al., Cancer Res. 2000. 15. 60:3813-22)와 SV40 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신 저항 유전자이다. 네오마이신 저항성 및 FCU-1 발현 카세트는 최종 세포주로부터 선별 카세트의 제거를 가능하게 하는 Sce1 절단 위치에 의해 둘러싸여 있다. HPRT 유전자 팔의 바깥은 RSV 프로모터에 의해 유도된 HSVTK를 코딩하는 선별 마커가 삽입되어 있다(도 2).
실시예
2: 12일령
캐리나
모스카타
알 및 부차 집단으로부터
CEC
배치(
batch
)의 제조
25개의 SPF 수정란을 37.5℃에서 배양하였다. 12일 동안 배양하고 난 뒤 알을 개방한뒤 다음의 적당한 프로토콜을 수행하였다.
3개의 배아를 분쇄하고 포스페이트 버퍼 살린-듈베코(PBS)로 한번 헹군 뒤 실온에서 5시간 동안 TrypLE Select(Invitrogen)에 넣어 분리시켰다.
저속으로 원심분리하고 난 뒤, 10% 우태아 혈청(FCS), 젠타마이신 0.04 g/L가 포함된 기본 이글 배지(Basal Medium Eagle, MBE)에 현탁하여, 500 ㎠ 트리플 플라스크에 접종하여 37℃ 5% CO2에서 배양하였다.
24시간 뒤에 TrypLE Select(5ml/트리플 플라스크)를 이용하여 플라스크로부터 빽빽하게 자란 세포를 제거하고, 이 세포의 일부르 175 ㎠ 플라스크에 재접종하 여 2회 계대하였다. 남은 세포는 적당한 배지(60% BME, 30% FCS 및 10% DMSO)에 107 세포/ml 농도로 농축하여, 이소프로필 알코올 조절 용기(NALGENE.®. "Mr. Frosty" 1℃ 동결. 용기)에 넣어 -80℃에서 동결시키고, 그리고 난 뒤 장시간 보관하기 위해 액체 질소에 옮겨 맨 처음의 세포 은행(50x1,5.107 세포/바이알, 44x1.107 세포/바이알)을 구성하였다.
배양액에 남아있는 세포는 연속적으로 18 계대까지 유지시키고, 3번의 첫번째 계대 동안 부착하지 않은 세포는 조절된 배지에서 저속으로 원심분리하여 수득한 뒤 재접종하여 동일한 방법으로 맨처음 배양하듯이 추가로 계대배양시켰다.
특징적으로 다른 형태학적 특징을 나타내는 부차집단은 배양 기간 동안 재생 분리하였다.
실시예
3: 형질전환 방법
관심 뉴클레오타이드 서열의 직접 발현하는 벡터를 도입하기 위한 수많은 형질전환 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법을 제한 없이 나열하면 다음과 같다: CaPO4 침전, 전기충격, 리포펙션 형질전환 방법. 이 실시예는 CaPO4침전 방법을 기초로 한다.
세포는 80-50%의 밀집도가 되어야 한다. CaPO4/DNA를 첨가하기 2시간 전에 배지를 교환하였다. 30 ㎍의 DNA를 31 ㎕의 2M CaCl2-161.3 mM Tris pH7.6에 재현 탁하였다. 물을 첨가하여 최종 부피가 0.5ml가 되게 하였다.
각 형질전환 마다, 0.5 ml의 2X HEBS를 15 ml의 멸균된 팔콘 튜브에 분배해 놓고, 부드럽게 섞어주면서 DNA 용액을 한방울씩 떨어뜨리거나 DNA 용액을 버블링시켜 넣었다. 이 용액은 우유와 같은 상태가 되어야 한다. 이 혼합액을 실온에 10-30분 동안 놓아 두었다. 그리고 난 뒤 조직 배양 캐비넷에서 멸균된 피펫으로 피펫팅을 넣었다 뺐다하여 세포를 떨어뜨리고 분산시켰다. 그리고 난 뒤, 세포를 37℃에서 밤새 6시간 동안 배양하였다. 미세한 침전물이 세포 표면을 덮어야 한다. 형질전환 과정을 끝내기 위해 글리세롤 쇼크 용액을 37℃로 데웠다. 배지를 흡입으로 빼낸 뒤, 5 ml BME를 넣어 세포막을 세척하고, 이 배지를 다시 흡입으로 빼낸 뒤 1 ml 글리세롤 쇼크 용액을 2분 미만 동안 첨가하였다. 그 다음에 10 ml BME를 부드럽게 첨가하여 글리세롤을 희석하고, BME-글리세롤을 완전히 제거하였다. 그리고 난 뒤 10 ml의 희망 배지를 첨가하여 플레이트를 적절한 온도에서 배양하였다.
실시예
4: 선별 방법
무작위 삽입:
형질전환 후 48시간에 선별 방법을 적용하였다: TrypLE select로 세포를 분리시키고, 저속으로 원심분리한 뒤 FCS 10% 및 G418 800 ㎍/ml로 재접종하였다.
개별적으로 자라나는 클론이 분리될 수 있을때까지 세포를 연속적으로 계대배양하였다. 복합 포커스 들을 분리하고 증폭시키고 난 뒤, TRAPeze® XL 텔로머 라아제 검출 킷트(S7707, Chemicn)를 이용해 텔로머라아제 활성을 정량화하고 표적의 특이 로커스에 삽입되었는지 확인하기 위해 서던 블랏 분석을 수행하였다.
표적 삽입:
형질전환 후 48시간에 선별 방법을 적용하였다: TrypLE select로 세포를 분리시키고, 저속으로 원심분리한 뒤 FCS 10%, 간시클로버(Ganciclovir) 25 ㎍/ml 및 G418 800 ㎍/ml로 재접종하였다.
개별적으로 자라나는 클론이 분리될 수 있을때까지 세포를 연속적으로 계대배양하였다. 복합 포커스 들을 분리하고 증폭시키고 난 뒤, TRAPeze® XL 텔로머라아제 검출 킷트(S7707, Chemicn)를 이용해 텔로머라아제 활성을 정량화하고 표적의 특이 로커스에 삽입되었는지 확인하기 위해 서던 블랏 분석을 수행하였다.
텔로머라아제 활성이 회복되고 표적의 HPRT 로커스가 삽입이 된 것으로 검출된 세포 클론을 하기에 제시하는 방법에 따라 메가뉴클레아제 I-SceI 발현 플라스미들 형질전환시켰다.
선별 마커 5-플루오로시토신(5-FC)의 제거를 선별하는 것은 형질감염 후 48시간에 적용하였다: 세포를 TrypLE select로 분리하고, 저속으로 원심분리한 뒤 10-3 내지 10-7 M 범위의 5-FC가 포함되어 있는 배지에 재접종하고 G418 선별(FCS 10%, 5-FC 및 G418 800 ㎍/ml이 포함된 BME)을 유지하였다.
<110> TRANSGENE SA
ERBS Philippe
BALLOUL Jean-Marc
KAPFER Marina
SILVESTRE Nathalie
<120> Avian telomerase reverse transcriptase
<130> TG167PCT
<140> PCT/EP2007/050120
<141> 2007-01-05
<150> EP 06360001.9
<151> 2006-01-05
<150> EP 06360047.2
<151> 2006-10-13
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1304
<212> PRT
<213> Cairina moschata
<400> 1
Met Ala Gly Ala Glu Pro Phe Gly Ala Val Leu Gly Ala Leu Arg Asp
1 5 10 15
Cys Tyr Ala Gln Ala Ala Pro Leu Glu Thr Phe Leu Arg Gly Leu Gly
20 25 30
Glu Ser Gly Ala Glu Glu Ala Glu Val Val Arg Asp Asp Asp Ala Ala
35 40 45
Cys Tyr Arg Thr Phe Val Ser Gln Cys Val Val Cys Val Pro His Gly
50 55 60
Ala Arg Asp Ile Pro Arg Pro Phe Ser Leu Glu Gln Leu Ser Ser Gln
65 70 75 80
Ser Glu Val Ile Ser Arg Val Met Gln Arg Leu Cys Gly Lys Lys Lys
85 90 95
Lys Asn Ile Leu Thr Tyr Gly Tyr Ser Leu Leu Asp Glu Asn Ser Ser
100 105 110
His Phe Gln Ile Met Pro Leu Ser Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Pro Asn
115 120 125
Thr Ala Thr Glu Thr Met Arg Ile Ser Gly Leu Trp Glu Thr Leu Leu
130 135 140
Ser Arg Ile Gly Asp Asp Val Met Met Tyr Leu Leu Glu His Cys Ala
145 150 155 160
Ile Phe Met Leu Val Pro Pro Ser Asn Cys Tyr Gln Val Cys Gly Gln
165 170 175
Pro Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Gln Asn Val Glu Ser Ala Pro Ala Phe
180 185 190
Val Lys Gln Arg Leu Ser Lys His Lys Arg Ser Ser Leu Leu Lys Tyr
195 200 205
Thr Gln Lys Arg Leu Thr Phe His Arg Gln Tyr Leu Ser Lys Ser Arg
210 215 220
Gln Ser Lys Arg Arg Gln Arg Leu Glu Ala Asn Val Ser Ser Met Arg
225 230 235 240
Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ile Gln Ser Leu Gly Ser Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Gln Ser Ser Ser Asn Ala Gly Leu Ser Ala Thr Ala Pro Ser Leu
260 265 270
Lys Arg Lys Leu Ala Arg Glu Gln Leu Glu Val Thr Ala Lys Arg Ala
275 280 285
Arg Leu Glu Glu Lys Glu Arg Glu Glu Gln Ala Cys Asn Thr Ala Pro
290 295 300
Asn Val Asn Gln Ser Ile Pro Lys Arg Tyr Gly Thr Ser Cys Val Ala
305 310 315 320
Ser Arg Ser Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Gln Arg Ser
325 330 335
Asn Ser Asp Met Ser Arg Pro Ser Leu Val His Asn Ser His His Gly
340 345 350
Lys Lys Ser Val Ala Asp Lys Ser Ser Phe Leu Gln Gly Ala Glu Ser
355 360 365
Asn Arg His Leu Lys Pro Ser Ile Glu Met Gln Ala Gly Ser Ser Arg
370 375 380
Lys Arg Val Glu Ile His Arg Pro Ile Pro Arg Leu Asp Trp Ile Pro
385 390 395 400
Ile Glu Pro Ala Glu Ser Ser Ser Ser Gly His Lys Lys Gln Glu Ser
405 410 415
Pro Leu Ala His Leu Ala Glu Glu Leu Pro Asn Arg Val Leu Pro Ser
420 425 430
Thr Ile Tyr Ile Asp Arg Lys Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Arg Tyr Trp
435 440 445
Gly Glu Arg Phe Pro Lys Ser Phe Leu Leu Asn Arg Leu Lys Gly Ser
450 455 460
Glu Ala Gly Val Lys Arg Leu Ile Glu Thr Ile Phe Leu Ser Gln Asn
465 470 475 480
Pro Phe Gly Gln Lys Arg Asn Gln Gly Leu Pro Gln Lys Lys Trp Arg
485 490 495
Lys Lys Lys Leu Pro Lys Arg Phe Trp Arg Met Arg Ser Thr Phe Gln
500 505 510
Lys Leu Leu Lys Asn His Gly Lys Phe Pro Tyr Val Ala Phe Leu Arg
515 520 525
Gln Asn Cys Pro Leu Arg Ile Ser Glu Thr Ile Leu Gly Lys Ala Lys
530 535 540
Leu Leu Ser Arg Ala Pro Leu Pro Gly Gln Ala Glu Ala His Lys Gln
545 550 555 560
Ala Glu Gln Leu Gly Lys Glu Pro Ala Lys Arg Val Ala Ser Ser Arg
565 570 575
Cys Glu Ser Gly His Thr Asn Val Pro Ser Ser Val Arg Ala Pro Leu
580 585 590
Ala Ala Ser Ala Cys Val Glu Pro Gly Gly Glu Glu Gln Ile Pro Ala
595 600 605
Glu Ala Ser Asp Ser Val Leu Arg Glu Leu Leu Lys Glu His Cys Ser
610 615 620
His Phe Gln Val Tyr Leu Phe Val Arg Glu Cys Val Glu Arg Val Ile
625 630 635 640
Pro Ala Glu Leu Trp Gly Ser Asn His Asn Lys Arg Arg Phe Phe Lys
645 650 655
Asn Val Lys Ala Phe Ile Ser Met Gly Lys Tyr Ala Lys Leu Ser Leu
660 665 670
Gln Val Leu Met Trp Lys Met Arg Val Asn Asp Cys Met Trp Leu Arg
675 680 685
Leu Ala Lys Gly Asn His Phe Val Pro Ala Ser Glu His Arg Tyr Arg
690 695 700
Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu Tyr Trp Leu Met Asp Thr Tyr Val
705 710 715 720
Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Ile Thr Glu Thr Met Phe Gln
725 730 735
Lys Asn Met Leu Phe Tyr Tyr Arg Lys Cys Ile Trp Ala Lys Leu Gln
740 745 750
Asp Ile Gly Ile Arg Lys His Phe Ala Lys Val Gln Leu Arg Pro Leu
755 760 765
Thr Ala Glu Glu Met Glu Ala Ile His Gln Lys Lys Tyr Leu Pro Met
770 775 780
Ala Ser Lys Leu Arg Phe Ile Pro Lys Val Ser Gly Leu Arg Pro Ile
785 790 795 800
Val Arg Met Ser Gly Val Val Glu Ala Gln Thr Leu Ser Lys Glu Ser
805 810 815
Arg Ala Lys Lys Met Asn His Tyr Asn Met Gln Leu Lys Asn Leu Phe
820 825 830
Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Thr Ile Asn Thr Ser Tyr Ile Gly Ser
835 840 845
Ser Val Phe Gly Arg Asp Asp Ile Tyr Lys Lys Trp Lys Thr Phe Val
850 855 860
Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Gly Glu Ile Pro His Phe Tyr Tyr Val
865 870 875 880
Lys Ala Asp Val Ser Arg Ala Phe Asp Ser Ile Pro His Asp Lys Leu
885 890 895
Val Glu Val Ile Ser Gln Val Leu Lys Pro Glu Lys Lys Thr Val Tyr
900 905 910
Cys Ile Arg Arg Tyr Ala Val Val Met Ile Thr Gly Ser Gly Lys Thr
915 920 925
Arg Lys Leu Tyr Arg Arg His Val Ser Thr Phe Lys Asp Phe Met Pro
930 935 940
Asp Met Lys Gln Phe Val Ser Arg Leu His Glu Ser Thr Ser Leu Arg
945 950 955 960
Asp Ala Ile Ile Val Glu Gln Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ser Ala
965 970 975
Ser Leu Phe Asn Phe Phe Leu Gln Met Leu Asn Asn Asn Ile Leu Glu
980 985 990
Ile Glu Arg Ser Tyr Tyr Leu Gln Cys Ser Gly Ile Pro Gln Gly Ser
995 1000 1005
Leu Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn
1010 1015 1020
Lys Leu Phe Ser Gly Val Gln Lys Asp Gly Val Leu Ile Arg Leu Ile
1025 1030 1035 1040
Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Arg Thr Phe
1045 1050 1055
Leu Arg Thr Leu Ala Met Gly Ile Pro Glu Tyr Gly Phe Leu Ile Asn
1060 1065 1070
Pro Lys Lys Thr Val Val Asn Phe Ser Val Asp Asp Ile Pro Glu Cys
1075 1080 1085
Ser Glu Phe Lys Gln Leu Pro Asn Cys Arg Leu Ile Pro Trp Cys Gly
1090 1095 1100
Leu Leu Leu Asp Thr Gln Thr Leu Glu Val Tyr Cys Asp Tyr Ser Ser
1105 1110 1115 1120
Tyr Ser Cys Thr Ser Ile Arg Ser Ser Leu Ser Phe Asn Ser Asn Arg
1125 1130 1135
Thr Ala Gly Lys Asn Met Lys His Lys Leu Val Ala Val Leu Lys Leu
1140 1145 1150
Lys Cys His Gly Leu Phe Leu Asp Leu Gln Ile Asn Ser Val Lys Thr
1155 1160 1165
Val Phe Ile Asn Val Tyr Lys Ile Phe Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe
1170 1175 1180
His Ala Cys Val Ile Gln Leu Pro Phe Asn Gln Lys Val Arg Asn Asn
1185 1190 1195 1200
Pro Asp Phe Phe Leu Arg Val Ile Ala Glu Asn Ala Ser Cys Cys Tyr
1205 1210 1215
Ser Met Leu Lys Ala Lys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Gly Asn Arg Gly
1220 1225 1230
Ala Ser Gly Met Phe Pro Ser Glu Ala Ala Glu Trp Leu Cys Tyr His
1235 1240 1245
Ala Phe Thr Val Lys Leu Ser Asn His Lys Val Val Tyr Lys Cys Leu
1250 1255 1260
Leu Lys Pro Leu Lys Phe Cys Met Thr Gln Leu Phe Arg Lys Ile Pro
1265 1270 1275 1280
Lys Asp Thr Lys Ala Leu Leu Lys Thr Val Thr Glu Pro Ser Ile Cys
1285 1290 1295
Gln Asp Phe Lys Ala Ile Leu Asp
1300
<210> 2
<211> 3915
<212> DNA
<213> Cairina moschata
<400> 2
atggcgggcg cggagccctt cggcgccgtg ctgggcgccc tgcgggactg ctacgcgcag 60
gcggccccgc tggagacctt cctccggggg ctgggggaga gcggcgccga ggaagccgag 120
gtggtgcggg acgacgacgc cgcctgctac cgcaccttcg tgtcccagtg cgtggtgtgt 180
gtcccccacg gcgcccgcga catcccccgg cccttcagct tggagcagtt atctagtcag 240
agcgaagtca tctcaagagt catgcagagg ctgtgtggga aaaagaagaa gaacatcctc 300
acatatggat actccttgct ggatgaaaac agttctcact tccaaatcat gccgctctca 360
aacgtgtaca gctacctgcc caacaccgca acagaaacca tgcgtatcag tggcctctgg 420
gaaacgctgc tgagcaggat aggggatgac gtgatgatgt atttattgga gcactgtgca 480
atctttatgc tggttccccc tagtaactgt taccaagtct gtgggcaacc aatttatgaa 540
cttatttcgc aaaatgtaga atcagcccca gcgtttgtta aacaacggct ttcaaagcac 600
aaacgtagta gcttgcttaa gtatacgcag aaaaggctaa cgtttcacag acagtatctt 660
tcaaagtcac gtcagtcgaa acgcaggcaa agacttgaag ctaatgtctc cagcatgaga 720
aataaaacca gcaataatat acaaagccta gggtccgctg ctctggaaaa acagagtagc 780
tccaatgcag gtttgtcagc tacagcacca tccttaaaaa ggaagcttgc tagggaacaa 840
ctggaagtca cggctaagag agcaagatta gaagagaaag agagggagga acaggcttgt 900
aatactgctc ctaatgtaaa ccagagtatt cccaagaggt atggaaccag ctgtgtagca 960
tcacgttctg taagtcttat taaagaaaaa tacatttctc aaagaagtaa cagtgatatg 1020
tctcgtcctt ctttagttca caattctcat catgggaaga agtctgtggc agacaaaagc 1080
tctttcctgc aaggagctga gagtaacaga catttaaagc ccagcattga aatgcaagca 1140
ggatccagca ggaagagagt agagatacac aggcctatac ctcggttgga ttggatacca 1200
atcgaaccgg cggaaagtag ttcttcagga cacaaaaagc aggaaagtcc cctagctcat 1260
ctggcagagg agttaccaaa tagggttttg ccatctacaa tatacattga caggaagttt 1320
cttctgtatt ctcgcaggta ctggggggaa cgtttcccaa aatccttcct attgaatcgc 1380
ctgaagggta gtgaggcagg tgtaaagcga ctaatagaaa cgatattctt aagccaaaat 1440
ccgtttgggc aaaagcgcaa ccaaggtctg ccacagaaaa aatggagaaa gaagaagctt 1500
cccaaacgct tctggagaat gagaagtacg tttcaaaaac tcttaaagaa tcatggaaag 1560
ttcccttacg tagctttctt gagacaaaat tgccctcttc ggatatctga aaccattttg 1620
ggaaaagcca agctgctcag tcgggcacct ttgcctgggc aagcagaggc tcacaagcaa 1680
gcagaacagc ttgggaagga gcctgctaag cgtgtggcaa gcagcagatg cgaatctggt 1740
cacaccaacg tgcccagcag cgtacgcgct cctctcgcag catctgcgtg cgtggagcca 1800
gggggggagg agcagatccc tgcagaggcg tctgattcag tcctcaggga gcttctcaag 1860
gagcactgca gccacttcca ggtgtacctc tttgtgaggg agtgcgtgga gcgggtgatc 1920
cccgccgagc tctggggttc aaaccataac aagcgccggt tcttcaagaa cgtgaaagca 1980
ttcatttcca tggggaagta cgctaagctt tccttgcagg tgttgatgtg gaagatgaga 2040
gtaaatgact gcatgtggct tcgtctggcc aaaggtaatc actttgttcc tgcctctgaa 2100
caccgttacc gtgaagaaat tttggctaaa ttcctatact ggctgatgga tacgtatgtt 2160
gttgagttgc tcagatcatt tttctatatc accgagacca tgttccagaa aaatatgctt 2220
ttctactacc gaaagtgtat ttgggccaag ttacaggaca ttggaattag aaagcatttt 2280
gccaaagtac agctacgtcc tttaactgca gaggagatgg aagcgatcca tcagaaaaaa 2340
taccttccta tggcatcaaa gctccgtttc attcccaaag tcagtggact aagacccatc 2400
gtcagaatga gcggtgttgt tgaagcacaa acgttgagca aggaaagcag agcaaagaag 2460
atgaatcact acaacatgca actgaaaaat ctatttagtg tgttaaatta tgaacgaact 2520
ataaacacca gttacatcgg ctcttcagtg tttgggagag atgatatcta caagaagtgg 2580
aagacatttg ttaaaaaggt tcttaaatca gatggtgaaa ttcctcattt ctactatgta 2640
aaggccgatg tgtccagggc ttttgatagc attcctcacg ataaacttgt ggaagtgatt 2700
tcacaggtct taaaacctga gaaaaaaact gtctactgca tacggcgcta tgcagtggtt 2760
atgatcactg gaagtggaaa aaccaggaag ttatacagga gacatgtttc tactttcaag 2820
gattttatgc cagacatgaa gcagtttgtg tcccggcttc atgagagtac ctcattgcga 2880
gatgcaataa tagttgaaca gagcttaact ttcaatgaga caagtgccag tctatttaat 2940
ttttttcttc aaatgctaaa taataacatc ctggaaattg agcgcagcta ctacttacag 3000
tgctctggaa ttccacaggg ctcccttttg tcaaccttgc tttgcagctt gtgctatgga 3060
gacatggaaa acaaattatt cagtggggta cagaaggatg gagtcctgat ccgtctcatt 3120
gatgactttt tgcttgttac accacactta acgcatgcaa gaactttcct aaggactcta 3180
gcaatgggca ttcctgagta tggctttttg ataaacccca aaaagacggt ggtgaatttt 3240
tctgttgacg atatcccaga gtgttccgaa tttaaacagc tgccaaactg tcgtttgatc 3300
ccatggtgtg gcttattatt ggatacacag acacttgagg tttactgtga ttactccagc 3360
tattcctgta cttctatcag atcaagtctt tccttcaatt caaacagaac agctgggaaa 3420
aacatgaaac acaaattggt tgcagtcctt aaactgaaat gccatggctt gtttcttgat 3480
ttacagatca atagcgttaa aacagttttc attaatgtct acaagatatt tttacttcag 3540
gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattca accagaaagt taggaacaat 3600
cctgatttct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctattc tatgctgaaa 3660
gctaaaaatc cagggtttac tttaggtaac agaggtgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720
gcagcagagt ggctctgcta tcatgccttc actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780
tacaaatgct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840
aaggatacta aggcactact gaagacagtg acagaaccat ctatttgtca agatttcaaa 3900
gctatcctgg actga 3915
<210> 3
<211> 26916
<212> DNA
<213> Cairina moschata
<400> 3
gctatcactc catttcaagg aagggcaaaa ggccggttca ataccaacat ctgtgtagct 60
aagtaggatg aaatagatta ggtgaccaaa atatctgctt attcagcagg tgttgatcca 120
caggaggttc tacgataaag ctccagtagg agttgtacca gcgtaattcc tggagggcag 180
caataagtcc accatctaca ctccacaaag tctgatcttt aggtacaaag agctgtgctg 240
atctagaatg atgtggttag actgaatctg gctctaaatt tctgttatta gagtattatg 300
tattattaag taagaggcct tgcttcttac tgctgcctaa atgaagatta actttacagt 360
gaagcagagt gagagatgaa ggggtgataa tgtgtttgaa atatcagact taatctggca 420
ggtgataatc agttcattcc aaaaacgtta atgtgctgaa tcagattgac aagaaaatga 480
atcctaatta gttgaaatta atctgaagag aactgaaagt acatcatagc aaatagtaac 540
tcttcttcca catcacaagg aacagattcc actgtgttag tgatggaggt ttatacaaaa 600
aaaaaaaaaa aagaaaaacc agaacagctc ttaatttata tacttattga agcagattct 660
atatatgcat atgtatgcac attcattaat cagcagtaca tctcaaccct taaaagatcc 720
tggagaactg ttgcttgtca aaaagcactc aggttaggct aacatttgca gcttttgctc 780
tagcatacat ttacattagg tgtaaagaca aggaatgtgt aaaagagggt aaatgcattc 840
ctatctacaa tgttatgtat attttgttcc tgttatattg gctttacttc caaagttgta 900
gtttgcagta ttagtttctt tttattggta tccttgcata tatatatatt caataaatga 960
gttatgaatt tcatatttgc atatctgtcc tttttctgaa agtagaactt taaaactgac 1020
acttcagtgc ataaaagcag tgttccctat tgatgttaaa gtacctcgaa agttttacca 1080
gaagacaagt gagtgcatac ttaaagtatg ctacttactt ggtggtaact gcgtatttgt 1140
gcattgttcc tgactttgtg taatgggtaa gttgctttgt atttaccact tgctaataat 1200
gtgaagtggc tggctcacta aaggttgcca ttctcacctt tcaaggactt cttgaaggct 1260
gtgtcataat aatttagagt aagacagata ctgagagcgc agagtgtaat atagttatgt 1320
tgcagaagag cggatagaca caggatgcat gttagaacca tataaatgtg gtgtaaaaga 1380
tcagcaaaac gaagaattgc ttggaagatg cttggttttg tccaaataaa tagctgctga 1440
gagtgagaga gtgagtgagt aatattcagt atttttaaag tgtcgagaaa tgtaatgggg 1500
aaaaatttaa aataaatgtt ttttgtttgt tttaaaagga gctgtgtgct tttatgttga 1560
catgttgatt taattactgc ggtaggtatt tactgtgccc tgggaaacgg tatccccagt 1620
caacacagac ttatttgtca ggaaaaaaat tgtcatagat catcttcaaa taagagttga 1680
caaataatca aatcttgatg gagtataatt attaatactg tgattacata tccatctttg 1740
caagggtttc ctgaaaaggt cagttttaag tcttctattg tcaaatctga tgtttggagt 1800
agttcgctac atggtgtttg atgccatgta aatagttacc agatagacgt tttattttat 1860
gtgctgtatg tttttgtttt tcattcagtc agctggaatc attgaaacag agaaggtttc 1920
tcaagaaata tcctgaacct gttttgtgga tgtcttcatt gcaatagctg gtcactgaaa 1980
tcttggaata acgacagagg aatccatagg cacaggacca aacacctttc attgtcctca 2040
tatagcgtga tgttagggca gagtggtgag tacttcagtg gctcctgtgt ccatgcttta 2100
atgaactcta cttaatctac catatgtaag agacttgcag cacaggcaaa acaagggaag 2160
ttatctttgt gcctagataa tgtaccacat atggtaaaca attttcaagc ctcagagaca 2220
aaagaaggat gctgtaaagt ctcaagtctc agcttgtgtc tctgtttcca cctttctgtt 2280
ctttctgttc agacctctgg gccagtaatt taaactggaa aattaatgga acagagaaac 2340
tgtttgtgag cctatagaaa gatcaaattg tgtcagagta atgttgctcc ttctacaccc 2400
agataaactt tttgagcaga ggagaagcag tgaacagagc tttactttca tgactttgca 2460
taagaaaaca tgggaatgtg gtccgagacc aatttaaaaa tagaggtttt gaaaacttgt 2520
ttggaaaaca aaacttgctt ggaaaaccct attcagagct gtgaatcatt cacagacaac 2580
ctcttagggt tgtagccact catcagctga atatgattca acgatatgct gaaaaaaaaa 2640
aacacaaaca ttgttgtgga atgtatgaac aggaatgtag tctgtaagat gcgtgtcttg 2700
gtccttcttc tttaggtaat agtagaacac ctttctggga aaatggtatc cagctgttgt 2760
aggcactgca ctccatggaa aatgtgaaga aagtggaaat aatccagaga aaagcaatga 2820
gagggatgac aggataaaaa atgagccttg ctttaaggtg atgagagaaa agtgtttttc 2880
aaatctgtaa gagagccaca gagaagaaag aaagaaacag ttctcatcat tgcaggtagg 2940
acaagaaaaa taggtttaag ttgctgcagg aagcctttag cttagacatc agaatgggta 3000
attgtccttg acagtaggaa gaattaagct gtagcatgca cttcctggag aggtcgtgga 3060
atctcaggaa ttaggtttta aagggaatat ttgtaggcat cttttggggc tggtgcaatt 3120
gtaggttgga ggtgctgggg ataaggctaa tggaaatccc taccagccac tctaaggcct 3180
tctgcaagga gtcagaacca cttttcggaa gtaaaactct gtactggcag aggtcctgtg 3240
cttgacctta aggctcagag ccatgcattt ccgttttcat cttttcactt aaaatagcac 3300
ttgtggtagt aataacatgc tcttgcggag tggcacaggt ctgcatggtt atgaactttc 3360
tgtcaccacc cagcaaatgg cattttccac tcttctgttt cagattttcg ggagtacttc 3420
cttactccca aattcctgat tgaatacgac tgaaaacttc aacacgtttt tagtgcacga 3480
agtgtacttt atacaaatgt gtgggactat tgcacacaac ttactgattt tcttcactgt 3540
gtgcacatgt gctctgtgat gatacagagt ttggggtgac tgaactgtta cccagtcttt 3600
accgaattag ggcagcgatc ttaaaccttc atctgaactt ttgctagaga tgatcttcta 3660
ttttgtttag acagggttct ctgcttgctt gcatttgttc taaaacgaca gtctggatga 3720
gaagaaacca accagggctg gcactgccct accttttatt ccctggatac tttacttggc 3780
acatcacttg gcacacatgc aatacccttt tttcaccccg gtacccaaag aaaagacgtg 3840
ctcctgcaca gactcagcca aattcctgcc tgccagtgga gggcgttaca gaggcttggg 3900
gcagagggag gaaactcact cccaaagcat atactaaaaa taggccaatg cattgcaaac 3960
agctttgctg tgagagcttc cttctggcat gtagccatgc agctgcctta tagttttgag 4020
cctagatacc tccaaaacaa aacaaaaagt cgctaaagtt aaatgcagcc agcagtgctt 4080
atagtcttga taatccctac agtgtatcaa ttttagtttc ttccagagtg caggtagttt 4140
actcaattta acttcaaatg tctgagttac accattgaca ccattgtcaa gactagtgct 4200
ggcaatccct gaagtctgcc aagttcaaag cagggaggag gcctttaaag ttgaaatact 4260
cgggtgacgt gtccaaaaag ttttcctgtg gctttcctgt ggagtaggaa ctgcagtagc 4320
taggttgcaa aaagttttta aactctccaa attgctgcta actaaacatc cttaaatcct 4380
gacatgagag tatgaaatga gaaagtcagt tccttgattt agactagctt gaaaagaata 4440
aactttttgc acaggactcc ctggacagtt gggctggata atagaagtga ttcattcagg 4500
tcttgatgcc tacaagtttc ttgggttttg ccatattttc cagtgatttg tgacatcatt 4560
tttgccctaa aataaatcgc atcatgtcct gccgtatgtt ttgactatga aaatggaggt 4620
ttcggtttga ataccaaact tcgttgttac ttctttcaga ggctgttgat aaaggaaaac 4680
gtgaagcttt tatgtaaatg atcatgattt ctcatttgca tcaagaatat tttccaaaat 4740
agtagttaaa tccctccaat gattttcagc tatgtcacat aaatcaccga aaacacggta 4800
attttgcacg ggtgtttttt ctcccttttt ttattgtcta atactcagct tatatttgag 4860
tcttctgtat ccaattacct gatttgtgtg gcaattaaac agaagatcag cgtcattgta 4920
cttcacattc tttttaaact catcagtagt atgaccacac tagttggtct tgtaagtttg 4980
taatttaaga tgtgcctgga aggggttcaa agagacagga gcagtagtgt gtctcacttc 5040
cctttggaaa gcctttctga tactgtcaag caatatttac atcaaaaggg aactgaattc 5100
tggtaaactt ttccagactc caagtaaacc gaacaacctg agatttagat aaaccttggt 5160
ggatttaaaa acttgatggt atcactgtct aagacttgtg ttagcccatc agatattgca 5220
gacgtatatt ttgaggaaag gctttcagtt aattgataaa attaagagca gagttttggc 5280
aaaaaaaacc gccatctctg ctcagtactt catggcatct tgaatttctg cagttagagg 5340
tacaggtgct ctgttctgca attaacccgt gctgttaatt aaaatgtact gtttgctaaa 5400
tatgattagt gtctggagcc aggtagcttg aaaaagcttc aagattattt ctttttacca 5460
ggaccatcaa gtttttagcc ctccctttag aggaaggttc agaggaggtc ctatttaatc 5520
tgtcccagaa gaaaggctat ttctcccctt agaatggggc ttggcagtcc ttttcagagc 5580
acttttcatc cttgtctcat agggattttt aaggacagat ttctgaaagg attttccacc 5640
gggtaaagcg ggatcctgaa tgggtgacag ataatacgta ggaattctgg cttcctactg 5700
ccaggttgtt tatcttgaga tcttaaaaat ggacttattt ccctttttaa gtgtaaactg 5760
agttcttgag gcaccttttc cactgaagta tctgactttg cccttactgc ccatctcagt 5820
cttgcacatt taacccaaat tcagatccag ggtgtggtgt tactcctaga acagctctta 5880
ctgtttgagg atctgaatga ctattttgcc agcttgtgcc atacaactcg agaggacctg 5940
caaaggggag gggagtcctg atgggcagtt ccctcccagc ctggcatgcg cttcgtgtct 6000
ccgcttccct tataatctgc ccagaaaaga tttctgaaat acttgagcag ctgccacaat 6060
ctgcatggga ggcagcagcc ttggcatgtg agctctgcca cctgatgccc ggtctgtact 6120
gaggcagtgc cagctggatc tgcaagcctc agcgaataca gccttcgtca gcgagttctc 6180
tgatcagatt gctgccttgg agccttttgc tggtcttcct cagctcttct cctgttactc 6240
agatagcctt accacctcct ctcatcatct tttgagtttc tatcctcacg ttacagccag 6300
gtaagcccat ttacccatgc tgatatcaac aggttccaga ttttttaaaa aacaatcctg 6360
tctggctcac agctagggag cctctagtga cacagctaag tcccctgcag ccatttagaa 6420
atgtttctgg agggatgcag gtacgtcttg cactcaggtg cctaatgaaa gcagattgac 6480
ctgttcattc cttcgaaagc aactaagcaa agtggggaat cccatgtctc tgccccactt 6540
ctgtgttcct gacggcaaga cctcctgcca gcaccaaccg cctgtgtttg gagtcagcca 6600
gccttccgtt ctgactgaag ttgaaggtac agtacaaact gctggctaaa agaagctgct 6660
tgacttgctt ttttaggagg cttgtcttgt ggggaaaaaa aaaaaaagta cagataaatt 6720
ctgctgattc cttctgagtc acccagcagc gatggcaaag ctaggagaaa aaatgggatc 6780
acagagggat tgatgaatgg acagtgagtg acctgaagat ctaactcaaa ggacgttact 6840
tcaagtgcaa gtgtcaacat ataaatgctg agttgttgtc tccaagtacc ccactgttgg 6900
ggtatcctgg ttaccaagca aggttttagt aagtctgttc gaaaagttac atacagctga 6960
cattcatgca ggccatgatt tgccaggcct gagctctgag gtattcctgg acggttagag 7020
aggataaaat aatttagaag tcaggaaacc actcagagac aaaccattat ttataaaatt 7080
attttgcctt ctaaaagatg tgcgttccag agaaatcaca acgttggctc caaccttttt 7140
gcatcatcta gctagaaaat gtgcagcttc cagataccgc cagatcacct cccttgaccc 7200
tgccctggaa acatcaatgg ctcccatacc agtaagaaca aaactggtca tctactaaat 7260
ccgttgctga tctcagctaa ccaacttcct gtaatatcag caaatatttc tgcttttgta 7320
aatctgttct tccttccata atggggtgcc agcaggaatg cttgggatcc agaaatgcgc 7380
tggttggcag gaagaacaaa gaaattgttc acccagaagg gcaaaaaagg actaatgctt 7440
tcgtccgctt gggagaagtt gcacagaact tatgccaaca acttttgcac gcaatcagaa 7500
agatgccgct ggatgttact tttaatagca gacgttaata tcagttatta attagaaatg 7560
tcttcagtaa ccagactaaa agcagatcct gaaacactcc tgtggttgaa cagtctcttg 7620
acagacactg cccactgtcc agtaatgtca ggcgctctct gaacttgaca gggcagctgc 7680
tgtttttccc agccttctgg aaataggcca gctctgacat gtttctgata ttagctgggt 7740
gtatttcatt ctgctgccct aggcagtttg ataaaggctc cttcctcctg ctccagagct 7800
aacccaccca aactgtagcc gagcacctcg ctgcaacaaa actgcactcg ctagggttct 7860
gcctgtttgc ttcattaaga tctgcttaaa ttgtttcgta caaaggaaca ctcaaactga 7920
tttctgagcc caaagtagca gtgctaggtg tacatcagga gttgtttggc atgaagaaac 7980
attgccatgg cactgtatga ataaagttat ttttaagaat cattatccct tccttgatac 8040
caagtcttta tgcggcagaa aatcaaactt ggtctccacc cttacagaaa gcagaggaat 8100
gctttcagct gatagttgct taagctagaa tataagaaac catgaatttc tgtgtgcact 8160
gcggcattgc ccttcattcc agacctacag aaaaaaacga cacttttgtt actatttttt 8220
tccttcccat atgagaccag gggagctacc caggcatttc cattcttata attttacctc 8280
aagatcaaat tttctccagg cagttaaagg cagctgcacc cggagacctc gctcagcctc 8340
cccttgcatc ccacggagct gcgtttagtg agaaacctcc cccgaggtga cgggctgcag 8400
gggacccctt cccacacgcg tccccgtccc ttttctcagt gcaaacgcag ccaccgcccc 8460
ttgaaccctc ctccgggctc tctcggttcg gcggaggcag gagggggccg tgcccgccgc 8520
ccgggagctc ctcacagggc ccgggccccg gggcggagcg gccgcggcca tgttgagggc 8580
ggggagcgcg gaaggcggcg ccggggccgc tgcggggcgc ggcgcctccc cgctccccgc 8640
cgctcctcgc cgcccgcagc cgcaacaccg gccccggccc cggcgggccg cgccatggcg 8700
acccccagcc cctgcatcgt ggtgagtgcg ggcccggcgc tgcctcctcg gcctcccgct 8760
gggcccggcg tgcggtgaac ggggaggggg gaggcggctg cggggagccg gcgggggccg 8820
cccgtccccg tggggcgccc cgcgtggcgt ggagtcacct tgaggggctc gggctcccgc 8880
tgccctgcac ggccccgccc ggcccccagc gcccctcctc ggctgccggc tcggtctcgc 8940
ctcctgcccg gtgtcctgcc atggggccgg cggggtgttg gcaatttcgg ggcgctgctt 9000
gggcggctcg cggttgggag agccgcgggt gctgcctcag aaggcgccca gaaataactt 9060
ccaccagaaa taacttccac caggcaccga cccggcgtgg cacaacttcc tattcctgtt 9120
gctcctcaca gcgcgctcgg gaggtcgtgc tccgtgtacc aaaacctgcg agctcagcac 9180
ccgaactggg atgccttttg gaggaagacc ccgctgaggg tgtatttttc atcatcagtg 9240
tgctctgcta agaatccttt tttttttaat tattattttt tttaaaccca gccccgggtg 9300
ccgtgagcgg tagcgtgaca cgcatgtggc gcctcgcggc ccacggccat gcctgccgtc 9360
aggctgtgcc cgcgcgcctg cctgtacttt ctcgctaaaa atccatctgt aaaacccacc 9420
gaacagcccg ctcagtacca aacgtagcct gcaaggctta gtggatgtgc tagatgtagt 9480
tatggggctg aaccgtagga aatttccgta gctgctgaga gggacccagc tcctgacacg 9540
cagcaggtca cgggctcggt gcctggcctg ctgcgagcag gggttgtgca ggggctgctg 9600
tggctgggag ggcaggcctg gctcccggcc aaaatcctca ttaccgcttg cgcaaccaaa 9660
aaacatgtaa acagctggct gatcacaggc aaggtaagtg cttccttggg cactgaaatg 9720
gaagcgtgat ctgcaccggc agcggagctg aggtggatgc ttaccatgcc tgccccgctg 9780
cattgccagc agcaggcttc agtgttcccc acaaacttct ttttacactg agcagccttc 9840
agctgcgtaa ccaacaagtg aagcgattca aaatatattg tcattttcaa gtggcagcgg 9900
ggctaaggtt caggggaagt tttttcttgg tgcttttgga acaatatgcc ctgaaccaca 9960
gcagtggttg tataattacg tacataggca aaccccttgt cctaattaat acactcctgc 10020
taatgttgca agctgtttca tgtggaaaat ctgcccgtgc ggaacaggtt gctgaaacag 10080
ggctttaatt tctgattcta aagatcttga acctccactg tttccagatg gtggtcagag 10140
aaggcttgtt tcataggcac ataacttgtc ccgttaatat agctgtcttg tcttgtattg 10200
acagctggct tgtatgtttt gttgtgattc ggtgttgtgg agatttggaa gatgtccctg 10260
ttacaaggtc tgcttactta gttgcaaagg caggttttgc attacactgc tgaaatcaga 10320
gatgttgaaa agctgaaagc tgcttgatcc ttgtttattt atttattttt aaatgaaata 10380
agattatttg aggtgtagta atttcatttt ccccgctctc caatgggggg aaatgttgtt 10440
agggcttgaa atcatttccc ctccacatcg tgctgagcga cagctcatgt agcatttcag 10500
acaactcttg tgaactgtgg gttgtgcaag cttccacttt gtgctctgtt cagaaggaaa 10560
ataaggtgat cccaactagt gtaatggatt tggtagttta ttgagtaaag caaaggattg 10620
gcagtttctc actacaggct ttctataaga ctttgtagaa atctcacctt atttcctttt 10680
cagattgacg atgatgaaca aggttacgac ctggacttgt tctgcatacc taaacattat 10740
gcagatgatt tggaaaaagt ctatattcct catgggctca tcatggacag gtttgtttga 10800
cttcagacag tacactgctc cagctgattc catgacactg gaaaaaacaa tcttccagtg 10860
atagttttgc tgcctagtga ctgtctaaac agattacatt taattagaga ctaagaaata 10920
cacatgttaa ttaactctct cttgtttggc ttcaaagagt ttgtacattt gcagttacgc 10980
tattgtttgg aaatttgtca attctcaaag aaatttgtgg tacgtagcag tctgtgactt 11040
tctttacagt gtttctttga tgttttactt aaagtaatta gaacacatta cttgttgtgc 11100
tagttcaatc taaaaacagt tatagtctct caaacatctt taggatatta ataagagtag 11160
attattaatc acattatgat aagacttttt catgttcatg tggtagataa ctaacaccca 11220
attttcccct actgtctgcg aaagacatta gcctttgcaa ataccaatct gtcacttgtg 11280
gttgctgaaa tgtatgattt tctctggaag ttttatctcg tgatgagaaa tgggtacatg 11340
aacctataag gtgtttttgt tttactttgt gtaagtaaag tggaggagtt gctggagaca 11400
cagaaccact gaagagcggt tctgagtaga tcttgtgaat aggaatgctt ctagattttg 11460
catggtgctg tttgatcaga ttattacagt atttataata aaatgttttt taactttaca 11520
ctgaaagacc ctatatagga aagcattgga caaagtacag gtcattaagt agctgatgta 11580
aagtttgtaa tggcaggcat tctctgagaa acctgctgtc agctgctata ctgtaaatac 11640
ataccatgct ttctgaatta aattgcaaga taaatttaga aacaatgatc actgaaaaac 11700
tgttcagtgt tctcttgctc tgctttattg gcattatatt ttgcagtcag gacaaattta 11760
ttcagcaaaa cataacgcta tagttgataa tttgagagtt ttcttgctcc tcagttagtg 11820
agagctgttg tctttttggt tgtgctgatt tattttgctc tctgcatgga agctgaacct 11880
atctttggaa gaagaaaaca cccttatgtc tcttatctga cagtaaaaca attcagggtg 11940
ttcagatttg ctttggctga gtatgatgta tgaaaacaaa gaagtttggc agtgttactg 12000
ttagattaac cttggaacgc aaaactttgt tgaccaatag tgggttaaag tgactgaagc 12060
attaggcaaa tatttctgag caaaatatgc ttccgagttt gcatgtgttt gctgttgttg 12120
tttgcaatac aaaatactgc tgccatagta agcaaactaa atgtgttaca acagctaact 12180
ctcttttttt tttttttgta taggacagag agactggcac gagaaattat gaagggcatg 12240
ggaggacatc acattgtagc tctctgtgta ctcaagggtg gctataaatt ttttgctgat 12300
ttattagact acatcaaagc actgaacaga aacagtgaca aatcaatccc catgactgta 12360
gacttcatta ggttgaagag ttactgtgta agtatctctg caataccatg caatttttct 12420
gtaaatttga ctaacttcaa attaacaaca gggatgattg agaattgcca acaaatgttg 12480
caaaagcttt gcctaagtac tgcctaaatt gtgctaattt tatacaaata gttaagacaa 12540
ttaaggggaa aaaagcagtc acaagctaac ttgttctttg tctatcttat atgatctggt 12600
ttctttcaga ctttatctcc tcggcccagt aaaatccaga gcaaagagac cctttccatg 12660
tcctttactt cttaaacaat ttcctctctg ccccctgtcc cacctctaaa actgtggttc 12720
tagaataata cagaggatag tcctacaaat cttattacaa aaacttaact ctaggaattt 12780
tcatgtggct tagacatcac tcaccagata ggaaaacttg aaaactgtga gcatggttat 12840
atttgggttc cctacctcat cttttgtttg gctcaactga acaatgaatg gaatgaattg 12900
catttggcca tgaggaaata ctagattcat aaaaacagat ttatggttag cggccactga 12960
atatggtgct accttttaaa gcctaggtct aggttgcctt ggctttatgc ttttggaaaa 13020
gaatttattt tcattttgca cacaagtatt taactttaca gggaaatgga gcatgaggta 13080
gtatgtaaga tttttataag ggaagcatta gattacattg tgcaggtcaa aggaggaagc 13140
agatgtatgt tagtactgta tgcttcctga ctcagcaaca gcctagtcta gtgttttcaa 13200
gacagtattt gtgggtaatt tagatttttt ccataagatc acctgtagtg tggaaataat 13260
taagtttttt gatttcaatt tacggtgtca aaataaattg cttcttaagg tcatgctgtt 13320
agttctgtgt ctcgatgact gtgttttcca gtcagtagta taagctactt gtcatggttg 13380
tggagtagtg cctgctgcag tagaaaaaaa tagattacta agttggaaac tcaactgcat 13440
tgttcattta attaaaccag agataggggt acttgcagat ttaggttgga ctgtagaaga 13500
gcttcaaaaa tgcgctgctg ctgttgagcg atctgtaaaa atttcacctc gttgagtggc 13560
aaagctcaga ccagtcagag tttggccagg cctgtttgca gaaaagctgt gccagctccc 13620
aaggtgtgtg tgcagtgatg tcctggggct acctggaaac caccgtcatg tctgcagagc 13680
gtgctgcagt gactcagctg cactctttaa agagaaggca aggccaggca gaaagggaca 13740
tgccagcctt tcgttacatc ttgcaagggg agagctgctt gacacacttt gtttctgctc 13800
cccacaaaag attcaggctc cctctaccag tccattcaac cacaaagcca ctacgtgccc 13860
acatacgctg tctgtaaaag ccacaacaga aaggtgaatg tctctattag aggataatat 13920
ttgaaagaat aggaaataac tcccaccttt tttggcgagg aaatttgtat tttctgcttt 13980
cttcaaggaa cacatccaat aactttggtt tatttaaaat ataaggacta cacccttctg 14040
ctctctccac cttccgagta acttggaaca agctatggga taagtgttgt gaaacacctg 14100
gaaaaaatac tacattgcaa agcaaggctt attgtacagc atgtttttat tgttcatctt 14160
tatgcattag gcatgtattg gttctgctgc ttttattttt tacaccgccc ccccaaacta 14220
tagtgctttt atattaatag gaaactgaac agcaaaataa ttacggaagt tttaattctc 14280
tttttgtagt aagaaggagt aaacaaagag aaaagcagag aaatttacac agaaaggagt 14340
gtaagcagaa tgttttccat gaggtgttgg cttcagggtt ttggttttgt cagccaattc 14400
tgtaaaggaa tgttttcttg ttctatatga ccgaggagct ccagttactt gatggcccca 14460
ctagcagatt attacgagca tttcatttct gtcaactctc taaggtagtt attaatatcc 14520
agacttacgt tctttagatt gcataacttg atagactggg taagactgtc ctaacacaaa 14580
catgcgtgta attgattcac ttagttttcc attattaatg gtgctggaat gttaaatctg 14640
ctctgtagtt ttcattcgtg ctttactaaa cggaggagtc agcattctta atgatgggaa 14700
aaccatcaca aaccgtaatg gacagttgaa agtagagcta gctctcttgt gattgttgtt 14760
ggatgcaatt actagatcac gctgcctgcc tttacagact gggtgaaaga tgttaaaaat 14820
accgtcgttg cataaacaaa gcagctgaac tcgtataatg gttctaaaat tgatgcgatt 14880
gatgttctat tcctatttga aattgatcat ttaatatttt caagcttatg ggttatttgt 14940
ttcataatgc aaagttcata ctatgattgc acccaaaaat aattctctaa gaatactgag 15000
atgatgaagc tgtgattaaa tgttgcttat aattcctgct ttcggagtcc ttacaaatga 15060
gttttaatga tctggcaagc tgttaagaaa ttgaaagata gtgtttgtga acagaaccag 15120
atctctgtat tcttgacaaa tagtttattt ttcttgtgct agaagaatgg cttttcacca 15180
gtttcctgca tgtaaagtta gagttaagca aaagttgctt atgtagtcac aaagggcagc 15240
caaaacacaa tggacgtgtt gcattgtcac tcagggaaat agggcttttc ggaggagtac 15300
tgcagcttta aggcaaaatc tagttaggct ggttgagaca gtattctgaa agatctcatg 15360
ttaactgagc cttatagcaa ataccatgag gaacttaaaa tgccttgtca ggggttacga 15420
tcttgcagca tgttattatt ttccagcaat gacaatgagg cagtgaaaac agatctaaac 15480
agtaaatctc taatgtgtta aatcacaaag cattaaagtc ttaccagtac tgaaatcaga 15540
aataatgctc ctgaagataa ttaaagtgtt gcttaattat taaacaaagt tctttccaat 15600
ggaaatctgg ttaaaaccag tgttggaaat ttgttaacca tttttgatcc tttaattgct 15660
cagaaactca gtacctgcat aggcgtgtag gtttatatgc cagcgaaggt ttatgttttg 15720
tgttaaaaaa tgtagcaatt tgcagggtgc ttggtgggaa gaagaagggc agattttgtt 15780
ggttagattg tttttctctg ctgatcagtg tacttgagta tgcataaccc acagggttct 15840
gtagtgatct gtagttctgt gttgttattg tttgattata gtgtgttgct ttgtagccag 15900
agagatcacc aggaaactga tctgcatgca tgtactgaga ggactggtct atcatctgtg 15960
catggtgttt taatggaaca aatatctgta acatctttct ccatcttcct tctgtaagaa 16020
atggtgcttt ttacatcctt ccatggaaaa aggacgaaat tcttattagt gtaggaatag 16080
ataagagaga atcctgcaac ataaacaggg aaaagcttaa agctgtcatt taagataatt 16140
ttaagatatg atgaacgcag gaaatgcccc tcagcattac aaacacggtg cttaactgaa 16200
tcccattttc gtgattaatc taaccagtat ctctggcatt cagtagcagt ctgctgttta 16260
ctgggtcaag cagcagacat tttggacatc ctatttttgg actttttcaa cacagtggta 16320
ttggttctgt tcactatagt tttctttaaa acatggggta aaactgtaaa ggcgcttttt 16380
ctaatgtgtt gtgcttgcct tttttttaat gttttgtcat gggaatctaa aatagaaagt 16440
atctgttagt ctcgttatct gcttttacat acctagagct gtcagcactt ctttatccta 16500
gagcattgac gtcactgtcc aagggatttt aatacatttt ctctttactg taatcccagt 16560
gtcacttatg gtgtgctcag tgtgtgtttc tctctaaacc atttacccct tttttgcatg 16620
tgataacact tctacttttt gtctgcaact ggtacagtat gaatatgtgt gtcagtgaaa 16680
acaggaagct gtatgtggcc gtctgttccc ctgtggtctc ctctctattg tatctgccat 16740
tttggggcgt ggggaaggaa ctgctctttt gctgcttgtc tgcatggtca tgcagtaagg 16800
ttgggcttca gactgaagcg gcaaaataat aaaggttttc taaagggaag atatgaagtg 16860
aagagctgtg agaatgaagt ttgaaaagtg gtatgaccct tcaaataaat gattaaattg 16920
taggataatg acatcatctg taagtagcac agtaatgagt atagcacaat taataagaac 16980
taggagacaa tgtcaaggtt taaagtcagc tgaatgactt taaataaact gcagagatct 17040
ggaggtaccc caggagttgt ttttaacttt cttatataac aaacagttca ctgatgctta 17100
catcaaagcc tagttttact aaagcaaaat gctgtacttc agtgatagga ttgtgtagct 17160
gtgtcgctgt ttaattacca caatgagtaa tttatcacta tttgtaaaat aggcaaaccc 17220
aagcttttct ggctattctt gtagcttata tttcttgttc ttaatctgtg ccttgtttgc 17280
tggctatttc attgttgtta tgattgctta tttttattca gagtaaggct ttctaaggca 17340
tcaaagttta aaatgtaaat taccagctat atagcagcgt acagcttgga aacttttttt 17400
ttttcctgtt ttccatacct ttaatgaata tgtaggaaat aatatttttt taatatacat 17460
gtgtgtatat ataatggtga cagatgagaa gtggtgcctg tatttatgta aatatttttt 17520
caaacaatct tttatctgaa ataccatctt tcagtttgat tacttgtaat ttcttagtta 17580
atagatgttg ctggtgcaat gcttctgaaa gctttggtat ttgtgggtta tgtactttgc 17640
agttttgata tttattagaa gaaaaattac tttaattctg gtaatactaa tgcttaccct 17700
gctctttctt gctagaatga tcagtcaact ggagatataa aagtcattgg tggggatgac 17760
ctttcaacct tgactggaaa ggtatggcat gtcatatgtt taaagcaacc ccctcccccg 17820
cagaaaaaaa aatcctaaaa aatcctaaaa aaaaacaaaa caaaaccaaa aaaaacaaaa 17880
caaaacaaaa ccaaaaaaaa aaaaaacacc aaagaaccaa ataattagag ttttagaaag 17940
gaaaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaactgta gtgtttcatt taaaatttag gttagaggtt 18000
ggacttgatg atcttgaggt ctcttccaac ctagaaattc tgtgattctg tgattctgta 18060
aaatattcac cattgtagag tggtggggtg cataagcccc accagagcca tcagtttagt 18120
ttgaacttca taacatatgt atgtatattc actgtcttca gtatcaggaa gtgttagagt 18180
tgtttttctg cattgcctaa gaatagtctt gtcttggttg ttgttaacaa agtaccttta 18240
aaagagagta gcgttactta ttactgtgtt ggtgtttcat tgcaatagtg aacagagttg 18300
gtactgtcta gacatataac ttgcaggtta gggaataagg gtcctgttac aggcaatgaa 18360
gagacagaaa tgcagagaat gtaaattggg aatctgcttt tcttcagtgg ctgtgtagag 18420
atcattgagc tagatatctg tgggtaaaac atggatgcct cctgttctgt cagaacacat 18480
ggctttcccc ttctgattac acataaacag tctctgtccc atttcagtgt aagtgatgta 18540
ggtgtgacaa gacagtacat aactttatag tatgacattc tctgcattat aagaatttaa 18600
aggccacttt gtactcagca tgagatgttg aggcaagtct cattgtcaac taattgtcat 18660
tagagcatca gaaatgttaa ctaaatagaa ttcactgtta tgtgtcctaa catacataaa 18720
ccatggtaca aatatttaac tgcattgaaa aataaattat taagttatag gagacaatat 18780
atgtaagaaa tgctgtattc tttaaatgct aatggattct tctttttttt tttttctttc 18840
caccagaatg ttttaattgt agaagtaagt attatgtttc actttgaagt tctaacgtgt 18900
gactggcaaa agaccttaaa cagaagttgg ttttaagtca gaaatcctac agtttctggt 18960
ttcaaggttt ttagtttctg actctaggcc tgaattatgc aagtggtctc tgaatttgaa 19020
attacctgtg ttttgaattc tcacatagca ttcaactata ccaaatttaa caaggaaaat 19080
atctgtgtaa aattgcttgc tgtttgcatt tgatttcagt tttctgtgat tctgtcaatt 19140
cttaaatgtc tttttttttt ttttaataat tcttattaag aagtagcctg agcaaagtgg 19200
tactaagtgt gttattgttc tgagtttata acagcaaact aggaaattaa actggagggg 19260
tagaaagaag ttcctagtag gaatatccta aaatacatgg gaaaacagag ctaaggccaa 19320
catctctgtg tacagtttct ttacaggcat ggagaatgtt gattcctaat ttgcattttg 19380
ataatgctta attcccattt ctctatcttg tcgtggttct ttgatactag gtacaataca 19440
cttcagtctg atttcctagt agctactgtt gcttaaatct tgcttccata cctctttgat 19500
gaacgatgtt gcttacattc agtaagtatg acttttacaa aggatgatct agaataagat 19560
cgctaacttg aggttggcaa agcagaagta ctaaacagga aaaatgaatg tatagaagta 19620
ataatgtctt cagactccaa atagtggaaa tggctttgtc cataagctat ggcaactgat 19680
tcagacacca aatgaaagga tgtttccttc tgtcattaaa tgtgtttttt ttatgtacgt 19740
ctttttttaa tttgagaagg ttatattatt ccataggaaa cacttttgac ctaaactgtt 19800
ttagttcagt tctaaaactc ctaccaaact agtatgtata cagcagtcat ctgtgtgacc 19860
ggtggcgtcc tttgaagtgt atttgcttca gataggcaga tgcatttaat tacgtatctg 19920
ctccatttca gatgaatgta tgtcttcaaa gtcccaggca gctaagtagg ttagtttctc 19980
atctgttcag tgaatcatct ctccagtgcc ttatatataa ttatacattg tcaaatatga 20040
accctttgac cagtcaccgt tttaactgtc aaacaatggg ggaaaacaaa caaacaaaac 20100
caaaaaacat tattataggc accagagcac ttaggttttc catacagaat ccctttgatg 20160
tataaaaaca aacaaacgaa aaagaagaaa agaatcccat ccctttctgt gcaggggatg 20220
ggattaagat ggtgtgtcaa acatcatttt agtgtatata aatagaaact ttagaactgc 20280
acccagatat tgccagtgca gcttctttgt ctttggattt ttttgggtct gtaatgtaag 20340
ttgcacttct ttttccttta attgcattga tgggttgttc tgaatgtttt cccgtcttat 20400
tttctttctg ttgtatacat ctctctctga gttcaactgc aagactaatg ttccatttat 20460
aatactggaa ttaaacaatg tttgtcaaat agctacaagg aacacaagcc ataaactctt 20520
cagagggagc ctagaaggtc atagttcagt aactgctttc aaagtagtag ttatctacag 20580
ttttgactgt tgtgatcact ttactgagca taattgctta agcacaatat agcgttatgt 20640
atcacctgta tttgattatg aacattattt tgtcatattt ttgtgctatt acggatgagc 20700
aatttctgca gtaaaaactt gaaaatgcta ctctgaaaat tttaatattc tcacttacat 20760
gacactttta ttttcaggat ataattgata ctggtaaaac aatgaaaaca ttgctgtctc 20820
tactcaagca gtacaatcca aagatggtga aagtagccag gtaaacttct aaatgtgatt 20880
atttgtgctg tatttcaact tcagaatgac acacagtgga ataaaaatat aatatagaat 20940
atattcccat agaagagaaa caggaaggaa catttctgca ggaatcatac atgatggagt 21000
tagagttcag tatttgttta aactcaactt ctgcttgttg tgggagcata tgttcattaa 21060
ggctaacaga aatgctcttc tttccagtcc tattgcttga aaaatatcag tgccttatat 21120
tctagtaata tttgtggggt tttaccactg atctttaact taggtttaaa agcatatgga 21180
agaatttaaa tattttgggc ataaaaaaac acaacaacct ctcaaggtgg caggggtatt 21240
ttcaacacaa atttagttca taaatataaa ctttataaat ataaagttta actagagatt 21300
gggattaaaa aaaaaagtca gtggttgacg tctatggaca tacagtatct gaacatgttt 21360
cagtttgcaa cttcattttt tttcagtggt gtatctgcaa tggagacctt tggtctgcca 21420
gctttacttg tagaattaaa ttagtttgca ctaaacatta ccgtttatat agagtatata 21480
gtgtagctga gcctcagagg tcattctgtg agtcacccag ccatatgctc ttttaggctt 21540
ttctacttag ttgcatcttt aatcagttag ttatgaaacg ttttctaatt aaataactta 21600
cagttagtaa gaaatgttga gggtaatatt aaccaatatc aacattcctc ctacttcttt 21660
ttaaattgca tcttttatgc tcctatgctg tgattgtgta ttttacaata aaagcataat 21720
gattgctggg gattagagat aaaccagaac tgtgtgtaaa atctaatcag ttgtgttgcc 21780
ataacaatgt caaggcagtt gttagatgta ctagagcagc tcttcttgat gataatgtgg 21840
ggatgacctg ctgaaggtga ggtttttgtt ttttttttct ccgtggcctg cttaaatgta 21900
ccagatttta aatatttgtc actgaatagt accttaacgc tacagtgtac atcacaagta 21960
gaatgcagca tgaacaaagc ctagcttccg attgtttaaa cctgttgcag tttgggtctg 22020
ccgaagacct gagcaagtaa gcgtgatcgt gctggatagc tttaagtgtc atgctcttag 22080
ttcacttgcc tttcttttct taattttgtt ttctttctct ctgacaatta agcagttgta 22140
gcagggagat gtgaattaat gctaatgtga ttttgggttg gtttgatcaa gttttatgcc 22200
actactcaaa ttaagactct caactagaag tttcagaaac tgaatgtcta aagacagaca 22260
aatgtcagga tgatggggtc atcttctgaa agtgtgcaac tgaataatga gtgagtcaaa 22320
ttaaactaga aaggtatttc attctgctac agtaccccca actctgcatg tctatgcttt 22380
ttacacctct gactattaat tctgtgaaag tggagctggt ttatatcagc ttatgatcat 22440
caaaaccaat tacattttct gtatgggggt aattagtact accagtggaa aaacagctga 22500
ggacatgttg cacaagtgca attgaggtta catttaacca gctgaacttt tgcttcataa 22560
cactaacgct tttgaaaaga cctcagctgg tctggctaga tcccaagttg tcacctcttt 22620
acctgcgagc taaactgatt gcacctgagg tttctaaaaa cacataaaac ctaattaagt 22680
cacttctggc aatgaaaatc cttccagtaa agtatctcac agcctctttg ctgcaaacat 22740
tttgtttatc ccttaggctg taaaccattc atgattctag gaagttttga gtttgtctat 22800
atgatcagct gcacctgcaa atgaataata tgtttaaaat gtatatagtt atgctgtcaa 22860
ttatacacat gtagtctcac tgaagtggaa ttcagctaat cttcgtgttt catataagtg 22920
aacctggtgt ttttccacgt ttcagtttta cattgttttt atttgacagt ttgttggtaa 22980
aaagaactcc tcgaagcgtg ggatatcggc cagactgtaa gtgacttttt gacacccatt 23040
atcagttttt aaaaatatgt tgtatatatg ttgatgtatt gtgtactctt tggtcaaagt 23100
ccaagggtgt tccaagtaag ttttcatgaa tggtttttga tttattttgc tcttatttgg 23160
gaagtttaaa tatttggaat gtattttgac agagttaata cagatttggt ctagtccttt 23220
ttttcttaac tttttgtggc attttattat acaaaaagga aactttgata ttttagtcca 23280
agttaatccc tcttcatatg gaaattctcc tagcttgcac gttaatcaaa tggtttggtc 23340
agcagaagtg tcatctttga cacttttggg agtgttccag gtgcctaaac atagccaccc 23400
agtgccactc ggatgtcccc agaaatgtaa tgggaccaca cagggtaaca gatctgatca 23460
aagtttacag tggtaagatg ttcaaagtag cacaaacccc atcttgttta agcatctgga 23520
ttactcctgt catgtcttct tgtctgtccc aagaccataa aggaaggaag agcatccaaa 23580
gcacacgggg gtgtcagtga tagcccctct tggcttggaa agggctacgt gtgctatccc 23640
tgtgccagag gttatttcct gttcatgtgg actgtgcgct ttcacaatgg aagtttaaca 23700
gaattgcatc ttctttcccc tcctttccaa gtttgcacag tattcttaaa ttgaaatttc 23760
tcagtgcctt gaaagcttaa ttcaggtgtt tccctcactc gaggatgcct ctctttcctg 23820
agatcttatt atgggtttag ctgggttaac agtctgcctt tctgagcatc ttgcagcaga 23880
tgacttgttt tgccatctgt ccagagacga cctgttcagt gcagaacccg tgagctctga 23940
aggcaagaga caacgcagca gcagagcttg ggcctgcctt ctgtccttgt atcatgaggc 24000
caagtagact ctaaacattg ccttattttt tccagaagcg tacacagtct ttcactggaa 24060
ttgtgtgatt tatctccgtt tttttcatta ctgagcctcg ctgtaaccag ggagagagaa 24120
acagcacagc tcgggagtct ttcatgttta gcataagggg agaaagcctt ctggaaacgt 24180
ccttaggttg tcttacagtg tgtgtggatg gcttggactg atacttcttg actatccaag 24240
gactgttctg ctagagccat gtccacttgg actatctgtg gaacagctga tgtgtttttt 24300
ttaggcagct tctatgggaa aaaaaaaaaa cgaaacaaaa cacaacaaaa aacccgccgg 24360
tttctgaaaa gtgcaagtga caccgtaaat aagagagcgc cttttaccct gtggtcttca 24420
ctattctcta taccaagggc ttggcactta cagcgtgttg ctctgcagag ctgtcccgca 24480
gtcagagtat gtcctggtac accaggttgt tgtccacgag cagccagagg ggagtgaatt 24540
ttgtttggca ctgcctcaaa gacaaaggac tggttcccct gcggtaactc tggttcctcc 24600
tggtgttgac gtgttccatg cttactctcc cagctcttca caaagagccc agttgggctt 24660
gcacacctgt agttttgagg gagctgagag ctgaacctat ctgctcgtta tcccagaggt 24720
gaccttactt atagctgtgc ccaaggcgag ggcacactca cacaggtgcc accttttgaa 24780
taatactgtg agggtgacaa ctaaaacaaa ataaaatgct actgcttggg aaccagtaag 24840
taaatctatt tcattttgtt ttagttgaat taaatcaaca aatagagtta gaccattaac 24900
tagcttgaat attaatctcg ggatacttga atggaagaaa tgaaatgtta tgcttatatg 24960
tctataaaat tctagattct ctctgtaaaa aggtctagtg aactctagga agttcttttc 25020
taacatactg atgacttatg ttctttttca gttgttggat ttgaagtgcc agacaaattt 25080
gttgtgggat acgccctaga ttacaatgaa tacttcagag atttgaatgt aagtaacttt 25140
tcccgtatgt ttttgtccat ttaaaactag ggaggaggaa ggaagggaag tctcctcgca 25200
tcactctttc tcttctgtgt aaatcacagc tcatgtgcaa gcctgttcca ttagtgatgc 25260
aacgacgaga gcaaaggcta gaccagcaca acagtgtttt ggagctcata tgaaactaac 25320
ttttgttttg cttcatgcag aatggaggta ttctgcatga agctgtcagc tttgaaatac 25380
tgtggcagtc tgtatgaagt ttcttatctt accagacata tctgcaagaa acaagtgcat 25440
ttccttagtt acatcaaaat tagagaggag agaccttgga tgttgagatg tttgcatttt 25500
atgctaggtc attattaatt tttcatctgg gtctcactaa ccttataaca gacatagggt 25560
aggagagaga gagaaagtcc agtgttgaga tctgtagaca aaaaaaaaaa gaagctaaag 25620
tttttctgca taaacaatat cacaaggctc ttcggtactg aaatgtgtat agcatgcttt 25680
tatttttttc agaagtgcat tattgaatac atctgtaaac atcatcctac attactttct 25740
aacaggagct ttttattttg ttttgttaca gcatatctgt gtgatcagtg agacggggaa 25800
gcagaaatac aaagcatgaa agcatagttc aagtgctctg atagcagagc tttgaaatgt 25860
tttgtttact gagtcctatc tttcacaggc ttcaactctg gtacaccagc taaaattgta 25920
gaattatcca ccccccttgt catatgctta ctataactta ttgcatgtac aatatacaaa 25980
tcttgtcttg ttcatttata ttttagaaat gtaaacaatt agtgcaattc tgcactcctt 26040
attttgattt gcactatgac tctaccgact attgctgccc ctggttgggt tgtgctgttt 26100
gtgagctccg gagtctaact cttgcagtgg taaattgctt aaacctcatc aacccagaac 26160
tgaaatagtt caagtactgt aaatgtaaaa cactttatga tagggaagtc tattagtaat 26220
atttttaaaa tctgtaattt aagttttata ttttcatgaa caagtgtgat tgtgattaat 26280
ggatagttgc acctttgggt gttataaaac atgaggagca gccagttaca gtatctgtaa 26340
tcaccaagga gctgattcaa gcctcctgga gttgccttat cgctgtaaaa gtccgggtaa 26400
aaaaaatctt ttttttttta atttttttta ttttttgagc taaaaggaga tggaatgaca 26460
aagcagaatg tttaaaatct agtttaagtt gagctattca tttcttttgg attttttctt 26520
taaaaatacc catcagacag tgaaattgcc ttttaaattt aaacaatttt aatatatttt 26580
tgaagaagta ttgtaatgtt tactttataa gatctaaaaa acaaaaagta ctttaaataa 26640
aggctgtctc tttaaaataa gccccataca tctatgccac tcattctgta tattaaagtg 26700
ctcttgaaat tttcttagta atatttttca taagtgtttc tgacagtgaa ggcagactct 26760
acgtttgtta tctttgtaga gcctttagtc agtattgtgc catctacaag agatgataaa 26820
ggcctgaggg aaagctatcg aaatacttgc gtattctata accaaactgg atttcagaga 26880
aaatgcacta agtagtgtcc cgtattctgt tttggc 26916
<210> 4
<211> 18700
<212> DNA
<213> Cairina moschata
<400> 4
agcaaaacga agaattgctt ggaagatgct tggttttgtc caaataaata gctgctgaga 60
gtgagagagt gagtgagtaa tattcagtat ttttaaagtg tcgagaaatg taatggggaa 120
aaatttaaaa taaatgtttt ttgtttgttt taaaaggagc tgtgtgcttt tatgttgaca 180
tgttgattta attactgcgg taggtattta ctgtgccctg ggaaacggta tccccagtca 240
acacagactt atttgtcagg aaaaaaattg tcatagatca tcttcaaata agagttgaca 300
aataatcaaa tcttgatgga gtataattat taatactgtg attacatatc catctttgca 360
agggtttcct gaaaaggtca gttttaagtc ttctattgtc aaatctgatg tttggagtag 420
ttcgctacat ggtgtttgat gccatgtaaa tagttaccag atagacgttt tattttatgt 480
gctgtatgtt tttgtttttc attcagtcag ctggaatcat tgaaacagag aaggtttctc 540
aagaaatatc ctgaacctgt tttgtggatg tcttcattgc aatagctggt cactgaaatc 600
ttggaataac gacagaggaa tccataggca caggaccaaa cacctttcat tgtcctcata 660
tagcgtgatg ttagggcaga gtggtgagta cttcagtggc tcctgtgtcc atgctttaat 720
gaactctact taatctacca tatgtaagag acttgcagca caggcaaaac aagggaagtt 780
atctttgtgc ctagataatg taccacatat ggtaaacaat tttcaagcct cagagacaaa 840
agaaggatgc tgtaaagtct caagtctcag cttgtgtctc tgtttccacc tttctgttct 900
ttctgttcag acctctgggc cagtaattta aactggaaaa ttaatggaac agagaaactg 960
tttgtgagcc tatagaaaga tcaaattgtg tcagagtaat gttgctcctt ctacacccag 1020
ataaactttt tgagcagagg agaagcagtg aacagagctt tactttcatg actttgcata 1080
agaaaacatg ggaatgtggt ccgagaccaa tttaaaaata gaggttttga aaacttgttt 1140
ggaaaacaaa acttgcttgg aaaaccctat tcagagctgt gaatcattca cagacaacct 1200
cttagggttg tagccactca tcagctgaat atgattcaac gatatgctga aaaaaaaaaa 1260
cacaaacatt gttgtggaat gtatgaacag gaatgtagtc tgtaagatgc gtgtcttggt 1320
ccttcttctt taggtaatag tagaacacct ttctgggaaa atggtatcca gctgttgtag 1380
gcactgcact ccatggaaaa tgtgaagaaa gtggaaataa tccagagaaa agcaatgaga 1440
gggatgacag gataaaaaat gagccttgct ttaaggtgat gagagaaaag tgtttttcaa 1500
atctgtaaga gagccacaga gaagaaagaa agaaacagtt ctcatcattg caggtaggac 1560
aagaaaaata ggtttaagtt gctgcaggaa gcctttagct tagacatcag aatgggtaat 1620
tgtccttgac agtaggaaga attaagctgt agcatgcact tcctggagag gtcgtggaat 1680
ctcaggaatt aggttttaaa gggaatattt gtaggcatct tttggggctg gtgcaattgt 1740
aggttggagg tgctggggat aaggctaatg gaaatcccta ccagccactc taaggccttc 1800
tgcaaggagt cagaaccact tttcggaagt aaaactctgt actggcagag gtcctgtgct 1860
tgaccttaag gctcagagcc atgcatttcc gttttcatct tttcacttaa aatagcactt 1920
gtggtagtaa taacatgctc ttgcggagtg gcacaggtct gcatggttat gaactttctg 1980
tcaccaccca gcaaatggca ttttccactc ttctgtttca gattttcggg agtacttcct 2040
tactcccaaa ttcctgattg aatacgactg aaaacttcaa cacgttttta gtgcacgaag 2100
tgtactttat acaaatgtgt gggactattg cacacaactt actgattttc ttcactgtgt 2160
gcacatgtgc tctgtgatga tacagagttt ggggtgactg aactgttacc cagtctttac 2220
cgaattaggg cagcgatctt aaaccttcat ctgaactttt gctagagatg atcttctatt 2280
ttgtttagac agggttctct gcttgcttgc atttgttcta aaacgacagt ctggatgaga 2340
agaaaccaac cagggctggc actgccctac cttttattcc ctggatactt tacttggcac 2400
atcacttggc acacatgcaa tacccttttt tcaccccggt acccaaagaa aagacgtgct 2460
cctgcacaga ctcagccaaa ttcctgcctg ccagtggagg gcgttacaga ggcttggggc 2520
agagggagga aactcactcc caaagcatat actaaaaata ggccaatgca ttgcaaacag 2580
ctttgctgtg agagcttcct tctggcatgt agccatgcag ctgccttata gttttgagcc 2640
tagatacctc caaaacaaaa caaaaagtcg ctaaagttaa atgcagccag cagtgcttat 2700
agtcttgata atccctacag tgtatcaatt ttagtttctt ccagagtgca ggtagtttac 2760
tcaatttaac ttcaaatgtc tgagttacac cattgacacc attgtcaaga ctagtgctgg 2820
caatccctga agtctgccaa gttcaaagca gggaggaggc ctttaaagtt gaaatactcg 2880
ggtgacgtgt ccaaaaagtt ttcctgtggc tttcctgtgg agtaggaact gcagtagcta 2940
ggttgcaaaa agtttttaaa ctctccaaat tgctgctaac taaacatcct taaatcctga 3000
catgagagta tgaaatgaga aagtcagttc cttgatttag actagcttga aaagaataaa 3060
ctttttgcac aggactccct ggacagttgg gctggataat agaagtgatt cattcaggtc 3120
ttgatgccta caagtttctt gggttttgcc atattttcca gtgatttgtg acatcatttt 3180
tgccctaaaa taaatcgcat catgtcctgc cgtatgtttt gactatgaaa atggaggttt 3240
cggtttgaat accaaacttc gttgttactt ctttcagagg ctgttgataa aggaaaacgt 3300
gaagctttta tgtaaatgat catgatttct catttgcatc aagaatattt tccaaaatag 3360
tagttaaatc cctccaatga ttttcagcta tgtcacataa atcaccgaaa acacggtaat 3420
tttgcacggg tgttttttct cccttttttt attgtctaat actcagctta tatttgagtc 3480
ttctgtatcc aattacctga tttgtgtggc aattaaacag aagatcagcg tcattgtact 3540
tcacattctt tttaaactca tcagtagtat gaccacacta gttggtcttg taagtttgta 3600
atttaagatg tgcctggaag gggttcaaag agacaggagc agtagtgtgt ctcacttccc 3660
tttggaaagc ctttctgata ctgtcaagca atatttacat caaaagggaa ctgaattctg 3720
gtaaactttt ccagactcca agtaaaccga acaacctgag atttagataa accttggtgg 3780
atttaaaaac ttgatggtat cactgtctaa gacttgtgtt agcccatcag atattgcaga 3840
cgtatatttt gaggaaaggc tttcagttaa ttgataaaat taagagcaga gttttggcaa 3900
aaaaaaccgc catctctgct cagtacttca tggcatcttg aatttctgca gttagaggta 3960
caggtgctct gttctgcaat taacccgtgc tgttaattaa aatgtactgt ttgctaaata 4020
tgattagtgt ctggagccag gtagcttgaa aaagcttcaa gattatttct ttttaccagg 4080
accatcaagt ttttagccct ccctttagag gaaggttcag aggaggtcct atttaatctg 4140
tcccagaaga aaggctattt ctccccttag aatggggctt ggcagtcctt ttcagagcac 4200
ttttcatcct tgtctcatag ggatttttaa ggacagattt ctgaaaggat tttccaccgg 4260
gtaaagcggg atcctgaatg ggtgacagat aatacgtagg aattctggct tcctactgcc 4320
aggttgttta tcttgagatc ttaaaaatgg acttatttcc ctttttaagt gtaaactgag 4380
ttcttgaggc accttttcca ctgaagtatc tgactttgcc cttactgccc atctcagtct 4440
tgcacattta acccaaattc agatccaggg tgtggtgtta ctcctagaac agctcttact 4500
gtttgaggat ctgaatgact attttgccag cttgtgccat acaactcgag aggacctgca 4560
aaggggaggg gagtcctgat gggcagttcc ctcccagcct ggcatgcgct tcgtgtctcc 4620
gcttccctta taatctgccc agaaaagatt tctgaaatac ttgagcagct gccacaatct 4680
gcatgggagg cagcagcctt ggcatgtgag ctctgccacc tgatgcccgg tctgtactga 4740
ggcagtgcca gctggatctg caagcctcag cgaatacagc cttcgtcagc gagttctctg 4800
atcagattgc tgccttggag ccttttgctg gtcttcctca gctcttctcc tgttactcag 4860
atagccttac cacctcctct catcatcttt tgagtttcta tcctcacgtt acagccaggt 4920
aagcccattt acccatgctg atatcaacag gttccagatt ttttaaaaaa caatcctgtc 4980
tggctcacag ctagggagcc tctagtgaca cagctaagtc ccctgcagcc atttagaaat 5040
gtttctggag ggatgcaggt acgtcttgca ctcaggtgcc taatgaaagc agattgacct 5100
gttcattcct tcgaaagcaa ctaagcaaag tggggaatcc catgtctctg ccccacttct 5160
gtgttcctga cggcaagacc tcctgccagc accaaccgcc tgtgtttgga gtcagccagc 5220
cttccgttct gactgaagtt gaaggtacag tacaaactgc tggctaaaag aagctgcttg 5280
acttgctttt ttaggaggct tgtcttgtgg ggaaaaaaaa aaaaagtaca gataaattct 5340
gctgattcct tctgagtcac ccagcagcga tggcaaagct aggagaaaaa atgggatcac 5400
agagggattg atgaatggac agtgagtgac ctgaagatct aactcaaagg acgttacttc 5460
aagtgcaagt gtcaacatat aaatgctgag ttgttgtctc caagtacccc actgttgggg 5520
tatcctggtt accaagcaag gttttagtaa gtctgttcga aaagttacat acagctgaca 5580
ttcatgcagg ccatgatttg ccaggcctga gctctgaggt attcctggac ggttagagag 5640
gataaaataa tttagaagtc aggaaaccac tcagagacaa accattattt ataaaattat 5700
tttgccttct aaaagatgtg cgttccagag aaatcacaac gttggctcca acctttttgc 5760
atcatctagc tagaaaatgt gcagcttcca gataccgcca gatcacctcc cttgaccctg 5820
ccctggaaac atcaatggct cccataccag taagaacaaa actggtcatc tactaaatcc 5880
gttgctgatc tcagctaacc aacttcctgt aatatcagca aatatttctg cttttgtaaa 5940
tctgttcttc cttccataat ggggtgccag caggaatgct tgggatccag aaatgcgctg 6000
gttggcagga agaacaaaga aattgttcac ccagaagggc aaaaaaggac taatgctttc 6060
gtccgcttgg gagaagttgc acagaactta tgccaacaac ttttgcacgc aatcagaaag 6120
atgccgctgg atgttacttt taatagcaga cgttaatatc agttattaat tagaaatgtc 6180
ttcagtaacc agactaaaag cagatcctga aacactcctg tggttgaaca gtctcttgac 6240
agacactgcc cactgtccag taatgtcagg cgctctctga acttgacagg gcagctgctg 6300
tttttcccag ccttctggaa ataggccagc tctgacatgt ttctgatatt agctgggtgt 6360
atttcattct gctgccctag gcagtttgat aaaggctcct tcctcctgct ccagagctaa 6420
cccacccaaa ctgtagccga gcacctcgct gcaacaaaac tgcactcgct agggttctgc 6480
ctgtttgctt cattaagatc tgcttaaatt gtttcgtaca aaggaacact caaactgatt 6540
tctgagccca aagtagcagt gctaggtgta catcaggagt tgtttggcat gaagaaacat 6600
tgccatggca ctgtatgaat aaagttattt ttaagaatca ttatcccttc cttgatacca 6660
agtctttatg cggcagaaaa tcaaacttgg tctccaccct tacagaaagc agaggaatgc 6720
tttcagctga tagttgctta agctagaata taagaaacca tgaatttctg tgtgcactgc 6780
ggcattgccc ttcattccag acctacagaa aaaaacgaca cttttgttac tatttttttc 6840
cttcccatat gagaccaggg gagctaccca ggcatttcca ttcttataat tttacctcaa 6900
gatcaaattt tctccaggca gttaaaggca gctgcacccg gagacctcgc tcagcctccc 6960
cttgcatccc acggagctgc gtttagtgag aaacctcccc cgaggtgacg ggctgcaggg 7020
gaccccttcc cacacgcgtc cccgtccctt ttctcagtgc aaacgcagcc accgcccctt 7080
gaaccctcct ccgggctctc tcggttcggc ggaggcagga gggggccgtg cccgccgccc 7140
gggagctcct cacagggccc gggccccggg gcggagcggc cgcggccatg ttgagggcgg 7200
ggagcgcgga aggcggcgcc ggggccgctg cggggcgcgg cgcctccccg ctccccgccg 7260
ctcctcgccg cccgcagccg caacaccggc cccggccccg gcgggccgcg ccatggcggg 7320
cgcggagccc ttcggcgccg tgctgggcgc cctgcgggac tgctacgcgc aggcggcccc 7380
gctggagacc ttcctccggg ggctggggga gagcggcgcc gaggaagccg aggtggtgcg 7440
ggacgacgac gccgcctgct accgcacctt cgtgtcccag tgcgtggtgt gtgtccccca 7500
cggcgcccgc gacatccccc ggcccttcag cttggagcag ttatctagtc agagcgaagt 7560
catctcaaga gtcatgcaga ggctgtgtgg gaaaaagaag aagaacatcc tcacatatgg 7620
atactccttg ctggatgaaa acagttctca cttccaaatc atgccgctct caaacgtgta 7680
cagctacctg cccaacaccg caacagaaac catgcgtatc agtggcctct gggaaacgct 7740
gctgagcagg ataggggatg acgtgatgat gtatttattg gagcactgtg caatctttat 7800
gctggttccc cctagtaact gttaccaagt ctgtgggcaa ccaatttatg aacttatttc 7860
gcaaaatgta gaatcagccc cagcgtttgt taaacaacgg ctttcaaagc acaaacgtag 7920
tagcttgctt aagtatacgc agaaaaggct aacgtttcac agacagtatc tttcaaagtc 7980
acgtcagtcg aaacgcaggc aaagacttga agctaatgtc tccagcatga gaaataaaac 8040
cagcaataat atacaaagcc tagggtccgc tgctctggaa aaacagagta gctccaatgc 8100
aggtttgtca gctacagcac catccttaaa aaggaagctt gctagggaac aactggaagt 8160
cacggctaag agagcaagat tagaagagaa agagagggag gaacaggctt gtaatactgc 8220
tcctaatgta aaccagagta ttcccaagag gtatggaacc agctgtgtag catcacgttc 8280
tgtaagtctt attaaagaaa aatacatttc tcaaagaagt aacagtgata tgtctcgtcc 8340
ttctttagtt cacaattctc atcatgggaa gaagtctgtg gcagacaaaa gctctttcct 8400
gcaaggagct gagagtaaca gacatttaaa gcccagcatt gaaatgcaag caggatccag 8460
caggaagaga gtagagatac acaggcctat acctcggttg gattggatac caatcgaacc 8520
ggcggaaagt agttcttcag gacacaaaaa gcaggaaagt cccctagctc atctggcaga 8580
ggagttacca aatagggttt tgccatctac aatatacatt gacaggaagt ttcttctgta 8640
ttctcgcagg tactgggggg aacgtttccc aaaatccttc ctattgaatc gcctgaaggg 8700
tagtgaggca ggtgtaaagc gactaataga aacgatattc ttaagccaaa atccgtttgg 8760
gcaaaagcgc aaccaaggtc tgccacagaa aaaatggaga aagaagaagc ttcccaaacg 8820
cttctggaga atgagaagta cgtttcaaaa actcttaaag aatcatggaa agttccctta 8880
cgtagctttc ttgagacaaa attgccctct tcggatatct gaaaccattt tgggaaaagc 8940
caagctgctc agtcgggcac ctttgcctgg gcaagcagag gctcacaagc aagcagaaca 9000
gcttgggaag gagcctgcta agcgtgtggc aagcagcaga tgcgaatctg gtcacaccaa 9060
cgtgcccagc agcgtacgcg ctcctctcgc agcatctgcg tgcgtggagc caggggggga 9120
ggagcagatc cctgcagagg cgtctgattc agtcctcagg gagcttctca aggagcactg 9180
cagccacttc caggtgtacc tctttgtgag ggagtgcgtg gagcgggtga tccccgccga 9240
gctctggggt tcaaaccata acaagcgccg gttcttcaag aacgtgaaag cattcatttc 9300
catggggaag tacgctaagc tttccttgca ggtgttgatg tggaagatga gagtaaatga 9360
ctgcatgtgg cttcgtctgg ccaaaggtaa tcactttgtt cctgcctctg aacaccgtta 9420
ccgtgaagaa attttggcta aattcctata ctggctgatg gatacgtatg ttgttgagtt 9480
gctcagatca tttttctata tcaccgagac catgttccag aaaaatatgc ttttctacta 9540
ccgaaagtgt atttgggcca agttacagga cattggaatt agaaagcatt ttgccaaagt 9600
acagctacgt cctttaactg cagaggagat ggaagcgatc catcagaaaa aataccttcc 9660
tatggcatca aagctccgtt tcattcccaa agtcagtgga ctaagaccca tcgtcagaat 9720
gagcggtgtt gttgaagcac aaacgttgag caaggaaagc agagcaaaga agatgaatca 9780
ctacaacatg caactgaaaa atctatttag tgtgttaaat tatgaacgaa ctataaacac 9840
cagttacatc ggctcttcag tgtttgggag agatgatatc tacaagaagt ggaagacatt 9900
tgttaaaaag gttcttaaat cagatggtga aattcctcat ttctactatg taaaggccga 9960
tgtgtccagg gcttttgata gcattcctca cgataaactt gtggaagtga tttcacaggt 10020
cttaaaacct gagaaaaaaa ctgtctactg catacggcgc tatgcagtgg ttatgatcac 10080
tggaagtgga aaaaccagga agttatacag gagacatgtt tctactttca aggattttat 10140
gccagacatg aagcagtttg tgtcccggct tcatgagagt acctcattgc gagatgcaat 10200
aatagttgaa cagagcttaa ctttcaatga gacaagtgcc agtctattta atttttttct 10260
tcaaatgcta aataataaca tcctggaaat tgagcgcagc tactacttac agtgctctgg 10320
aattccacag ggctcccttt tgtcaacctt gctttgcagc ttgtgctatg gagacatgga 10380
aaacaaatta ttcagtgggg tacagaagga tggagtcctg atccgtctca ttgatgactt 10440
tttgcttgtt acaccacact taacgcatgc aagaactttc ctaaggactc tagcaatggg 10500
cattcctgag tatggctttt tgataaaccc caaaaagacg gtggtgaatt tttctgttga 10560
cgatatccca gagtgttccg aatttaaaca gctgccaaac tgtcgtttga tcccatggtg 10620
tggcttatta ttggatacac agacacttga ggtttactgt gattactcca gctattcctg 10680
tacttctatc agatcaagtc tttccttcaa ttcaaacaga acagctggga aaaacatgaa 10740
acacaaattg gttgcagtcc ttaaactgaa atgccatggc ttgtttcttg atttacagat 10800
caatagcgtt aaaacagttt tcattaatgt ctacaagata tttttacttc aggcttacag 10860
gttccatgcc tgtgttattc aacttccatt caaccagaaa gttaggaaca atcctgattt 10920
cttcctcaga gtcatcgctg agaatgcatc gtgctgctat tctatgctga aagctaaaaa 10980
tccagggttt actttaggta acagaggtgc atctggcatg ttcccttctg aggcagcaga 11040
gtggctctgc tatcatgcct tcactgtcaa actgtcaaac cacaaagttg tttacaaatg 11100
cttgcttaag cccctgaagt tctgtatgac acagctattc cggaagatcc caaaggatac 11160
taaggcacta ctgaagacag tgacagaacc atctatttgt caagatttca aagctatcct 11220
ggactgatct agagttccta gtctagacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt 11280
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 11340
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 11400
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 11460
atagcaggca tgctggggag gtaatggatt tggtagttta ttgagtaaag caaaggattg 11520
gcagtttctc actacaggct ttctataaga ctttgtagaa atctcacctt atttcctttt 11580
cagattgacg atgatgaaca aggttacgac ctggacttgt tctgcatacc taaacattat 11640
gcagatgatt tggaaaaagt ctatattcct catgggctca tcatggacag gtttgtttga 11700
cttcagacag tacactgctc cagctgattc catgacactg gaaaaaacaa tcttccagtg 11760
atagttttgc tgcctagtga ctgtctaaac agattacatt taattagaga ctaagaaata 11820
cacatgttaa ttaactctct cttgtttggc ttcaaagagt ttgtacattt gcagttacgc 11880
tattgtttgg aaatttgtca attctcaaag aaatttgtgg tacgtagcag tctgtgactt 11940
tctttacagt gtttctttga tgttttactt aaagtaatta gaacacatta cttgttgtgc 12000
tagttcaatc taaaaacagt tatagtctct caaacatctt taggatatta ataagagtag 12060
attattaatc acattatgat aagacttttt catgttcatg tggtagataa ctaacaccca 12120
attttcccct actgtctgcg aaagacatta gcctttgcaa ataccaatct gtcacttgtg 12180
gttgctgaaa tgtatgattt tctctggaag ttttatctcg tgatgagaaa tgggtacatg 12240
aacctataag gtgtttttgt tttactttgt gtaagtaaag tggaggagtt gctggagaca 12300
cagaaccact gaagagcggt tctgagtaga tcttgtgaat aggaatgctt ctagattttg 12360
catggtgctg tttgatcaga ttattacagt atttataata aaatgttttt taactttaca 12420
ctgaaagacc ctatatagga aagcattgga caaagtacag gtcattaagt agctgatgta 12480
aagtttgtaa tggcaggcat tctctgagaa acctgctgtc agctgctata ctgtaaatac 12540
ataccatgct ttctgaatta aattgcaaga taaatttaga aacaatgatc actgaaaaac 12600
tgttcagtgt tctcttgctc tgctttattg gcattatatt ttgcagtcag gacaaattta 12660
ttcagcaaaa cataacgcta tagttgataa tttgagagtt ttcttgctcc tcagttagtg 12720
agagctgttg tctttttggt tgtgctgatt tattttgctc tctgcatgga agctgaacct 12780
atctttggaa gaagaaaaca cccttatgtc tcttatctga cagtaaaaca attcagggtg 12840
ttcagatttg ctttggctga gtatgatgta tgaaaacaaa gaagtttggc agtgttactg 12900
ttagattaac cttggaacgc aaaactttgt tgaccaatag tgggttaaag tgactgaagc 12960
attaggcaaa tatttctgag caaaatatgc ttccgagttt gcatgtgttt gctgttgttg 13020
tttgcaatac aaaatactgc tgccatagta agcaaactaa atgtgttaca acagctaact 13080
ctcttttttt tttttttgta taggacagag agactggcac gagaaattat gaagggcatg 13140
ggaggacatc acattgtagc tctctgtgta ctcaagggtg gctataaatt ttttgctgat 13200
ttattagact acatcaaagc actgaacaga aacagtgaca aatcaatccc catgactgta 13260
gacttcatta ggttgaagag ttactgtgta agtatctctg caataccatg caatttttct 13320
gtaaatttga ctaacttcaa attaacaaca gggatgattg agaattgcca acaaatgttg 13380
caaaagcttt gcctaagtac tgcctaaatt gtgctaattt tatacaaata gttaagacaa 13440
ttaaggggaa aaaagcagtc acaagctaac ttgttctttg tctatcttat atgatctggt 13500
ttctttcaga ctttatctcc tcggcccagt aaaatccaga gcaaagagac cctttccatg 13560
tcctttactt cttaaacaat ttcctctctg ccccctgtcc cacctctaaa actgtggttc 13620
tagaataata cagaggatag tcctacaaat cttattacaa aaacttaact ctaggaattt 13680
tcatgtggct tagacatcac tcaccagata ggaaaacttg aaaactgtga gcatggttat 13740
atttgggttc cctacctcat cttttgtttg gctcaactga acaatgaatg gaatgaattg 13800
catttggcca tgaggaaata ctagattcat aaaaacagat ttatggttag cggccactga 13860
atatggtgct accttttaaa gcctaggtct aggttgcctt ggctttatgc ttttggaaaa 13920
gaatttattt tcattttgca cacaagtatt taactttaca gggaaatgga gcatgaggta 13980
gtatgtaaga tttttataag ggaagcatta gattacattg tgcaggtcaa aggaggaagc 14040
agatgtatgt tagtactgta tgcttcctga ctcagcaaca gcctagtcta gtgttttcaa 14100
gacagtattt gtgggtaatt tagatttttt ccataagatc acctgtagtg tggaaataat 14160
taagtttttt gatttcaatt tacggtgtca aaataaattg cttcttaagg tcatgctgtt 14220
agttctgtgt ctcgatgact gtgttttcca gtcagtagta taagctactt gtcatggttg 14280
tggagtagtg cctgctgcag tagaaaaaaa tagattacta agttggaaac tcaactgcat 14340
tgttcattta attaaaccag agataggggt acttgcagat ttaggttgga ctgtagaaga 14400
gcttcaaaaa tgcgctgctg ctgttgagcg atctgtaaaa atttcacctc gttgagtggc 14460
aaagctcaga ccagtcagag tttggccagg cctgtttgca gaaaagctgt gccagctccc 14520
aaggtgtgtg tgcagtgatg tcctggggct acctggaaac caccgtcatg tctgcagagc 14580
gtgctgcagt gactcagctg cactctttaa agagaaggca aggccaggca gaaagggaca 14640
tgccagcctt tcgttacatc ttgcaagggg agagctgctt gacacacttt gtttctgctc 14700
cccacaaaag attcaggctc cctctaccag tccattcaac cacaaagcca ctacgtgccc 14760
acatacgctg tctgtaaaag ccacaacaga aaggtgaatg tctctattag aggataatat 14820
ttgaaagaat aggaaataac tcccaccttt tttggcgagg aaatttgtat tttctgcttt 14880
cttcaaggaa cacatccaat aactttggtt tatttaaaat ataaggacta cacccttctg 14940
ctctctccac cttccgagta acttggaaca agctatggga taagtgttgt gaaacacctg 15000
gaaaaaatac tacattgcaa agcaaggctt attgtacagc atgtttttat tgttcatctt 15060
tatgcattag gcatgtattg gttctgctgc ttttattttt tacaccgccc ccccaaacta 15120
tagtgctttt atattaatag gaaactgaac agcaaaataa ttacggaagt tttaattctc 15180
tttttgtagt aagaaggagt aaacaaagag aaaagcagag aaatttacac agaaaggagt 15240
gtaagcagaa tgttttccat gaggtgttgg cttcagggtt ttggttttgt cagccaattc 15300
tgtaaaggaa tgttttcttg ttctatatga ccgaggagct ccagttactt gatggcccca 15360
ctagcagatt attacgagca tttcatttct gtcaactctc taaggtagtt attaatatcc 15420
agacttacgt tctttagatt gcataacttg atagactggg taagactgtc ctaacacaaa 15480
catgcgtgta attgattcac ttagttttcc attattaatg gtgctggaat gttaaatctg 15540
ctctgtagtt ttcattcgtg ctttactaaa cggaggagtc agcattctta atgatgggaa 15600
aaccatcaca aaccgtaatg gacagttgaa agtagagcta gctctcttgt gattgttgtt 15660
ggatgcaatt actagatcac gctgcctgcc tttacagact gggtgaaaga tgttaaaaat 15720
accgtcgttg cataaacaaa gcagctgaac tcgtataatg gttctaaaat tgatgcgatt 15780
gatgttctat tcctatttga aattgatcat ttaatatttt caagcttatg ggttatttgt 15840
ttcataatgc aaagttcata ctatgattgc acccaaaaat aattctctaa gaatactgag 15900
atgatgaagc tgtgattaaa tgttgcttat aattcctgct ttcggagtcc ttacaaatga 15960
gttttaatga tctggcaagc tgttaagaaa ttgaaagata gtgtttgtga acagaaccag 16020
atctctgtat tcttgacaaa tagtttattt ttcttgtgct agaagaatgg cttttcacca 16080
gtttcctgca tgtaaagtta gagttaagca aaagttgctt atgtagtcac aaagggcagc 16140
caaaacacaa tggacgtgtt gcattgtcac tcagggaaat agggcttttc ggaggagtac 16200
tgcagcttta aggcaaaatc tagttaggct ggttgagaca gtattctgaa agatctcatg 16260
ttaactgagc cttatagcaa ataccatgag gaacttaaaa tgccttgtca ggggttacga 16320
tcttgcagca tgttattatt ttccagcaat gacaatgagg cagtgaaaac agatctaaac 16380
agtaaatctc taatgtgtta aatcacaaag cattaaagtc ttaccagtac tgaaatcaga 16440
aataatgctc ctgaagataa ttaaagtgtt gcttaattat taaacaaagt tctttccaat 16500
ggaaatctgg ttaaaaccag tgttggaaat ttgttaacca tttttgatcc tttaattgct 16560
cagaaactca gtacctgcat aggcgtgtag gtttatatgc cagcgaaggt ttatgttttg 16620
tgttaaaaaa tgtagcaatt tgcagggtgc ttggtgggaa gaagaagggc agattttgtt 16680
ggttagattg tttttctctg ctgatcagtg tacttgagta tgcataaccc acagggttct 16740
gtagtgatct gtagttctgt gttgttattg tttgattata gtgtgttgct ttgtagccag 16800
agagatcacc aggaaactga tctgcatgca tgtactgaga ggactggtct atcatctgtg 16860
catggtgttt taatggaaca aatatctgta acatctttct ccatcttcct tctgtaagaa 16920
atggtgcttt ttacatcctt ccatggaaaa aggacgaaat tcttattagt gtaggaatag 16980
ataagagaga atcctgcaac ataaacaggg aaaagcttaa agctgtcatt taagataatt 17040
ttaagatatg atgaacgcag gaaatgcccc tcagcattac aaacacggtg cttaactgaa 17100
tcccattttc gtgattaatc taaccagtat ctctggcatt cagtagcagt ctgctgttta 17160
ctgggtcaag cagcagacat tttggacatc ctatttttgg actttttcaa cacagtggta 17220
ttggttctgt tcactatagt tttctttaaa acatggggta aaactgtaaa ggcgcttttt 17280
ctaatgtgtt gtgcttgcct tttttttaat gttttgtcat gggaatctaa aatagaaagt 17340
atctgttagt ctcgttatct gcttttacat acctagagct gtcagcactt ctttatccta 17400
gagcattgac gtcactgtcc aagggatttt aatacatttt ctctttactg taatcccagt 17460
gtcacttatg gtgtgctcag tgtgtgtttc tctctaaacc atttacccct tttttgcatg 17520
tgataacact tctacttttt gtctgcaact ggtacagtat gaatatgtgt gtcagtgaaa 17580
acaggaagct gtatgtggcc gtctgttccc ctgtggtctc ctctctattg tatctgccat 17640
tttggggcgt ggggaaggaa ctgctctttt gctgcttgtc tgcatggtca tgcagtaagg 17700
ttgggcttca gactgaagcg gcaaaataat aaaggttttc taaagggaag atatgaagtg 17760
aagagctgtg agaatgaagt ttgaaaagtg gtatgaccct tcaaataaat gattaaattg 17820
taggataatg acatcatctg taagtagcac agtaatgagt atagcacaat taataagaac 17880
taggagacaa tgtcaaggtt taaagtcagc tgaatgactt taaataaact gcagagatct 17940
ggaggtaccc caggagttgt ttttaacttt cttatataac aaacagttca ctgatgctta 18000
catcaaagcc tagttttact aaagcaaaat gctgtacttc agtgatagga ttgtgtagct 18060
gtgtcgctgt ttaattacca caatgagtaa tttatcacta tttgtaaaat aggcaaaccc 18120
aagcttttct ggctattctt gtagcttata tttcttgttc ttaatctgtg ccttgtttgc 18180
tggctatttc attgttgtta tgattgctta tttttattca gagtaaggct ttctaaggca 18240
tcaaagttta aaatgtaaat taccagctat atagcagcgt acagcttgga aacttttttt 18300
ttttcctgtt ttccatacct ttaatgaata tgtaggaaat aatatttttt taatatacat 18360
gtgtgtatat ataatggtga cagatgagaa gtggtgcctg tatttatgta aatatttttt 18420
caaacaatct tttatctgaa ataccatctt tcagtttgat tacttgtaat ttcttagtta 18480
atagatgttg ctggtgcaat gcttctgaaa gctttggtat ttgtgggtta tgtactttgc 18540
agttttgata tttattagaa gaaaaattac tttaattctg gtaatactaa tgcttaccct 18600
gctctttctt gctagaatga tcagtcaact ggagatataa aagtcattgg tggggatgac 18660
ctttcaacct tgactggaaa ggtatggcat gtcatatgtt 18700
Claims (38)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩타이드.
- 제 1 항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 또는 재조합 핵산 분자.
- 제 2 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 또는 재조합 핵산 분자.
- 제 2 항에 따른 핵산 분자를 갖는 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 상기 벡터는 표적 DNA 서열에 대해 상동성을 갖는 2개의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 5 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 상동성 서열에 의해 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 6 항에 있어서, 상기 벡터는 제 1 선별 마커를 추가로 포함하며, 이 제 1 선별 마커는 양성 선별 마커이고, 상기 상동성 서열에 의해 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 7 항에 있어서, 상기 제 1 선별 마커는 이의 억제를 가능하게 하는 서열에 의해 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 7 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 상동성 서열에 의해 둘러싸이지 않는 제 2 선별 마커를 포함하고, 이 선별 마커는 음성 선별 마커인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 상기 벡터는 제 3 선별 마커를 포함하고, 이 제 3 선별 마커는 음성 선별 마커이고, 제 1 선별 마커의 억제를 가능하게 하는 서열 사이에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 2 항에 따른 핵산 분자에 의해 형질전환되고, 아나티대(Anatidae) 과에 속하는 동물로부터 유래되는 세포.
- 제 11 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 HPRT 유전자에 삽입된 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 12 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 내인성 HPRT 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 11 항에 있어서, 상기 동물은 캐리나 모스카타(cairina moschata) 종에 속하는 동물 또는 아나스 플라티린코스(Anas platyrhynchos) 종에 속하는 동물인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 11 항에 있어서, 상기 세포는 관심 물질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 11 항에 있어서, 상기 세포는 결손(defective) 바이러스의 증식을 가능하게 하는 상보 카세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제2항에 있어서, 아나티대(Anatidae) 과에 속하는 동물로부터 유래되는 세포의 불멸화(immortalization)를 위한, 핵산 분자.
- 제4항에 있어서, 아나티대(Anatidae) 과에 속하는 동물로부터 유래되는 세포의 불멸화(immortalization)를 위한, 벡터.
- 제 11 항에 있어서, 바이러스 복제를 위한, 세포.
- 제 19 항에 있어서, 상기 바이러스는 카우폭스(Cowpox) 바이러스, 엑트로멜리아(Ectromelia) 바이러스, 몽키폭스(Monkeypox) 바이러스, 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스 및 MVA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포.
- 제 15 항에 있어서, 관심 물질 생산을 위한, 세포.
- 제 11 항에 있어서, 바이러스 생산을 위한, 세포.
- 제 22 항에 있어서, 상기 바이러스는 폭스 바이러스인 것을 특징으로 하는, 세포.
- 제 23 항에 있어서, 상기 바이러스는 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는, 세포.
- 제 24 항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 MVA인 것을 특징으로 하는, 세포.
- 제 11 항에 있어서, 재조합 바이러스 생산을 위한, 세포.
- 제 4 항에 따른 벡터를 아나티대(Anatidae) 과에 속하는 동물로부터 유래되는 세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 세포 불멸화 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 방법은 제 1 선별 마커가 삽입된 세포 만 성장 가능하게 하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 방법은 제 2 선별 마커가 삽입된 세포의 성장을 가능하지 않게 하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 게놈으로부터 제 1 선별 마커를 제거시키는(excluding) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 게놈으로부터 제 1 선별 마커를 제거시키는 단계 이후에 수득된 세포를, 제 3 선별 마커를 포함하는 세포의 성장을 가능하지 않게 하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 동물은 캐리나 모스카타 종에 속하는 동물 또는 아나스 플라티린코스(Anas platyrhynchos) 종에 속하는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 표적 DNA 서열에 삽입된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33 항에 있어서, 상기 표적 DNA 서열은 HPRT 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06360001 | 2006-01-05 | ||
EP06360001.9 | 2006-01-05 | ||
EP06360047.2 | 2006-10-13 | ||
EP06360047 | 2006-10-13 | ||
PCT/EP2007/050120 WO2007077256A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-01-05 | Avian telomerase reverse transcriptase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20080085074A KR20080085074A (ko) | 2008-09-22 |
KR101337377B1 true KR101337377B1 (ko) | 2013-12-09 |
Family
ID=38016619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020087018929A KR101337377B1 (ko) | 2006-01-05 | 2007-01-05 | 조류 텔로머라아제 역전사효소 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9024003B2 (ko) |
EP (1) | EP1979474B1 (ko) |
JP (2) | JP5661243B2 (ko) |
KR (1) | KR101337377B1 (ko) |
CN (1) | CN102268413A (ko) |
AT (1) | ATE477321T1 (ko) |
AU (1) | AU2007204024B2 (ko) |
BR (1) | BRPI0706836B1 (ko) |
CA (1) | CA2636329C (ko) |
CY (1) | CY1110860T1 (ko) |
DE (1) | DE602007008360D1 (ko) |
DK (1) | DK1979474T3 (ko) |
HK (1) | HK1122069A1 (ko) |
HR (1) | HRP20100484T1 (ko) |
PL (1) | PL1979474T3 (ko) |
PT (1) | PT1979474E (ko) |
RS (1) | RS51525B (ko) |
RU (1) | RU2415867C2 (ko) |
SI (1) | SI1979474T1 (ko) |
WO (1) | WO2007077256A1 (ko) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101337377B1 (ko) * | 2006-01-05 | 2013-12-09 | 트랜스진 에스.에이. | 조류 텔로머라아제 역전사효소 |
EP1985305A1 (en) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
US8357531B2 (en) * | 2007-07-03 | 2013-01-22 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines |
KR101014030B1 (ko) | 2008-08-29 | 2011-02-14 | 현대자동차주식회사 | 와이어링 취부용 플랜지 및 제조공정 |
AU2010247374A1 (en) * | 2009-05-12 | 2011-12-15 | Transgene Sa | Immortalized avian cell lines and use thereof |
US20120309056A1 (en) | 2010-02-04 | 2012-12-06 | Leon Arnaud | Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells |
WO2012095514A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Vivalis | Recombinant protein production system |
EP2724157B1 (en) | 2011-06-27 | 2017-03-08 | Valneva | Method for screening cells |
TW201318637A (zh) | 2011-09-29 | 2013-05-16 | Transgene Sa | 免疫療法組成物及用於治療c型肝炎病毒感染之療程(一) |
TW201321016A (zh) | 2011-09-29 | 2013-06-01 | Transgene Sa | 免疫療法組成物及用於治療c型肝炎病毒感染之療程(二) |
MX2017007178A (es) | 2014-12-01 | 2017-08-28 | Transgene Sa | Formulaciones liquidas estables de virus de vacuna. |
CN107002044B (zh) | 2014-12-04 | 2020-10-30 | 英特维特国际股份有限公司 | 永生化鸡胚成纤维细胞 |
WO2017191147A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
US20190328869A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-10-31 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
CN110769850A (zh) | 2017-05-15 | 2020-02-07 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定的含病毒组合物 |
US11306292B2 (en) | 2017-05-15 | 2022-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
KR102684237B1 (ko) | 2017-06-21 | 2024-07-11 | 트랜스진 | 개인 맞춤형 백신 |
EP3638777A4 (en) * | 2017-07-13 | 2021-05-12 | Memphis Meats, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE EFFICIENCY OF CELL CULTURES FOR FOOD MANUFACTURING |
CA3111273C (en) | 2018-09-06 | 2024-03-26 | Bavarian Nordic A/S | Storage improved poxvirus compositions |
FR3089789B1 (fr) | 2018-12-14 | 2022-05-27 | Univ Claude Bernard Lyon | Production de vaccins viraux sur une lignee cellulaire aviaire |
EP3842065A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
MX2022011071A (es) | 2020-03-12 | 2022-09-23 | Bavarian Nordic As | Composiciones que mejoran la estabilidad del poxvirus. |
JP2023533584A (ja) | 2020-07-13 | 2023-08-03 | トランジェーヌ | 免疫低下の処置 |
WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002300900A (ja) | 2001-04-05 | 2002-10-15 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 腫瘍悪性化因子および腫瘍悪性化を抑制する化合物のスクリーニング方法 |
JPWO2003038076A1 (ja) | 2001-10-31 | 2005-02-24 | 株式会社レノメディクス研究所 | 不死化間葉系細胞及びその利用 |
JP3897717B2 (ja) * | 2002-04-23 | 2007-03-28 | オリンパス株式会社 | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
KR101337377B1 (ko) * | 2006-01-05 | 2013-12-09 | 트랜스진 에스.에이. | 조류 텔로머라아제 역전사효소 |
-
2007
- 2007-01-05 KR KR1020087018929A patent/KR101337377B1/ko active IP Right Grant
- 2007-01-05 PL PL07703676T patent/PL1979474T3/pl unknown
- 2007-01-05 BR BRPI0706836-0A patent/BRPI0706836B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-01-05 CA CA2636329A patent/CA2636329C/en active Active
- 2007-01-05 AT AT07703676T patent/ATE477321T1/de active
- 2007-01-05 EP EP07703676A patent/EP1979474B1/en active Active
- 2007-01-05 PT PT07703676T patent/PT1979474E/pt unknown
- 2007-01-05 JP JP2008549016A patent/JP5661243B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-01-05 DK DK07703676.2T patent/DK1979474T3/da active
- 2007-01-05 AU AU2007204024A patent/AU2007204024B2/en not_active Ceased
- 2007-01-05 RS RSP-2010/0470A patent/RS51525B/en unknown
- 2007-01-05 RU RU2008125815/10A patent/RU2415867C2/ru active
- 2007-01-05 US US12/159,930 patent/US9024003B2/en active Active
- 2007-01-05 WO PCT/EP2007/050120 patent/WO2007077256A1/en active Application Filing
- 2007-01-05 DE DE602007008360T patent/DE602007008360D1/de active Active
- 2007-01-05 SI SI200730331T patent/SI1979474T1/sl unknown
- 2007-01-05 CN CN201110186565XA patent/CN102268413A/zh active Pending
-
2009
- 2009-03-17 HK HK09102511.7A patent/HK1122069A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-09-03 HR HR20100484T patent/HRP20100484T1/hr unknown
- 2010-10-27 CY CY20101100971T patent/CY1110860T1/el unknown
-
2012
- 2012-09-10 JP JP2012198723A patent/JP2013027397A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Biochem Biophys Res Commun, Vol. 335, No. 1, pp 240-246 (2005.) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE477321T1 (de) | 2010-08-15 |
JP5661243B2 (ja) | 2015-01-28 |
DE602007008360D1 (de) | 2010-09-23 |
WO2007077256B1 (en) | 2007-10-25 |
US20100173378A1 (en) | 2010-07-08 |
AU2007204024A1 (en) | 2007-07-12 |
PL1979474T3 (pl) | 2011-01-31 |
CA2636329A1 (en) | 2007-07-12 |
BRPI0706836B1 (pt) | 2021-05-25 |
RS51525B (en) | 2011-06-30 |
RU2415867C2 (ru) | 2011-04-10 |
EP1979474A1 (en) | 2008-10-15 |
HRP20100484T1 (hr) | 2010-10-31 |
EP1979474B1 (en) | 2010-08-11 |
WO2007077256A1 (en) | 2007-07-12 |
RU2008125815A (ru) | 2010-02-10 |
JP2013027397A (ja) | 2013-02-07 |
CY1110860T1 (el) | 2015-06-10 |
JP2009521945A (ja) | 2009-06-11 |
HK1122069A1 (en) | 2009-05-08 |
AU2007204024B2 (en) | 2012-01-19 |
KR20080085074A (ko) | 2008-09-22 |
SI1979474T1 (sl) | 2010-10-29 |
US9024003B2 (en) | 2015-05-05 |
CN102268413A (zh) | 2011-12-07 |
DK1979474T3 (da) | 2010-09-20 |
PT1979474E (pt) | 2010-10-22 |
BRPI0706836A2 (pt) | 2011-04-05 |
CA2636329C (en) | 2016-12-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101337377B1 (ko) | 조류 텔로머라아제 역전사효소 | |
KR101528379B1 (ko) | 불멸화된 조류 세포주들 | |
KR20130030298A (ko) | 불멸화 조류 세포주들 | |
ES2349483T3 (es) | Transcriptasa inversa de la telomerasa aviar. | |
RU2678003C1 (ru) | Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoQ, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке яичников | |
CN114395585B (zh) | 用于碱基编辑的组合物 | |
RU2678056C1 (ru) | Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoB, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке молочной железы | |
RU2678060C1 (ru) | Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoM, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при меланоме | |
CN115873850A (zh) | 腺嘌呤碱基编辑系统及其应用 | |
KR20220149476A (ko) | 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물 및 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
J201 | Request for trial against refusal decision | ||
B701 | Decision to grant | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181129 Year of fee payment: 6 |