BRPI0706836B1 - Vetor, uso de um vetor, uso de uma célula aviária e processo de imortalização de uma célula aviária - Google Patents

Abstract

polipeptídeo recombinante ou isolado, molécula de ácido nucléico recombinante ou isolada, vetor, célula, linhagem celular, uso de um polipeptídeo, uso de uma célula e processo de imortalização de uma célula a presente invenção refere-se em particular a novas transcriptases reversas telomerases recombinantes, a moléculas de ácido nucléico que as contêm, células que compreendem a mencionada molécula de ácido nucléico e ao uso destas células para a produção da substância de interesse.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se particularmente às novas transcriptases reversas das telomerases recombinantes, às moléculas de ácido nucléico que as codificam, às células que compreendem a mencionada molécula de ácido nucléico e ao uso destas células para a produção da substância de interesse.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Em 1965, L. Hayflick descobriu que as células possuem um momento de morte programado. Como uma explicação para o envelhecimento, ele sugeriu que o número de vezes que uma célula humana se divide é limitado (Exp Cell Res. 1965 Mar; 37: 614-36). Sabe-se agora que isto é causado pelo encurtamento dos telômeros na divisão celular. Os cromossomos são encapsulados por telômeros que consistem de uma sequência de DNA conservada, repetida em tandem, não codificante e hexamérica, associada a proteínas de ligação de fita dupla ou simples. Os telômeros são responsáveis pelas funções de estabilidade do genoma e, em particular, a replicação dos terminais dos cromossomos. Uma replicação da extremidade do cromossomo bem sucedida requer a estrutura única de telômero e a enzima transcriptase reversa da telomerase especializada, que é uma nucleoproteína que possui uma atividade enzimática de transcriptase reversa. A transcriptase reversa da telomerase é capaz de alongar o conjunto de repetição do telômero, permitindo uma replicação estendida da fita resultante complementar. Em células que não possuem transcriptase reversa da telomerase, o encurtamento do DNA dos telômeros mediante divisões sucessivas, como as enzimas de síntese de DNA, são incapazes de replicar de forma completa os terminais dos cromossomos, uma vez que o primer de RNA de início é removido. Inúmeros trabalhos reportaram a evidência que o denominado “relógio do telômero” é uma característica importante do período de tempo de uma célula humana. A hipótese do telômero de envelhecimento celular propõe que o encurtamento do telômero está relacionado à perda da atividade da transcriptase reversa da telomerase, e prejudica a instabilidade cromossomal, levando à senescência, apoptose. A atividade da transcriptase reversa da telomerase é regulada de forma negativa (down-regulated) em linhagens de células somáticas durante o desenvolvimento in vivo e em células primárias in vitro, estando relacionada com o encurtamento do telômero. Em contraste, a regulação positiva (upregulation) ou desregulação da atividade da transcriptase reversa da telomerase ocorre em células transformadas e tumores. Os cDNAs da transcriptase reversa da telomerase (TERT) de diversos mamíferos e um anfíbio foram clonados e estudados (Nakamura et al. 1997. Science 277, 955- 959; Greenberg et al. 1998. Oncogene 16, 1723-1730).

[003] Como a sobreexpressão de TERT nas células leva à imortalização das mencionadas células, o uso de TERT para a produção de linhagens celulares foi proposto (McSharry et al, 2001 J Gen Virol. 82, 855-63). Entretanto, a atividade de TERT é restrita a espécies. Por exemplo, TERT humana é incompatível com o aparelho de manutenção do telômero de aves (Michailidis et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun. 335 (1), 240-6). Desta forma, para o desenvolvimento de linhagens celulares de aves e, mais particularmente da família Anatidae, há uma necessidade de TERT que funcione nestas células específicas.

[004] Linhagens de células eucarióticas são fundamentais para a produção de vacinas virais e muitos outros produtos da biotecnologia. Produtos biológicos produzidos em culturas celulares incluem enzimas, hormônios, produtos imuno biológicos (anticorpos monoclonais, interleucinas, linfócitos), e agentes anti-câncer. Embora muitas proteínas simples possam ser produzidas a partir do uso de células bacterianas, proteínas mais complexas, que são glicosiladas, geralmente precisam ser produzidas em células eucarióticas.

[005] As linhagens celulares de ave são particularmente úteis uma vez que diversos vírus utilizados em composições farmacêuticas são capazes de se replicar nas mesmas. Mais particularmente, diversos vírus são apenas capazes de se desenvolver em células de aves. Este é, por exemplo, o caso do vírus Ankara modificado (MVA) que é incapaz de se desenvolver na maioria das células de mamíferos. Este poxvírus, que é derivado do vírus Vaccinia através de mais de 500 passagens no CEF, foi utilizado anteriormente nos anos 70 para a vacinação de pessoas imunodeficientes contra varíola. Agora, o MVA é particularmente utilizado como um vetor para terapia gênica e fins de imunoterapia. Por exemplo, o MVA é utilizado como um vetor para o gene MUC1 para a vacinação de pacientes contra tumores que expressam este antígeno (Scholl et al., 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201). O MVA que contém o gene que codifica antígenos de HPV é também utilizado como um vetor para o tratamento terapêutico de lesões cervicais de alta escala. Mais recentemente, o MVA foi o vetor de escolha para a preparação de tratamento profilático contra novas doenças emergentes ou possíveis armas biológicas, tais como vírus west nile e anthrax.

[006] Portanto, há uma necessidade de uma nova transcriptase reversa da telomerase capaz de imortalizar células de aves e, mais particularmente, células da família Anatidae.

[007] Da forma utilizada em todo o presente pedido, os termos “um” e “uma” são utilizados representando “pelo menos um”, “pelo menos um primeiro”, “um ou mais”, ou “uma série” dos componentes ou etapas referidas, a menos que o contexto defina claramente de outra forma. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma série de células, incluindo uma mistura delas.

[008] O termo “e/ou”, da forma utilizada no presente, inclui o significado de “e”, “ou” e “todas ou qualquer outra combinação dos elementos relacionados pelo mencionado termo”.

[009] Da forma utilizada no presente, os termos “que compreende” e “compreendendo” indicam que os produtos, composições e métodos incluem os componentes referenciados ou etapas, mas não excluem outros. “Consistindo essencialmente de”, quando utilizado para definir produtos, composições e métodos, deve indicar que exclui qualquer outro componente ou etapa de qualquer significado essencial. Desta forma, uma composição que consiste essencialmente dos componentes citados não excluiria contaminantes de traço e veículos farmaceuticamente aceitáveis. “Consistindo de” deve indicar excluindo mais de elementos de traço de outros componentes ou etapas.

[010] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo recombinante e/ou isolado, que compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 60 % de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID N°: 1. Em uma realização preferida da presente invenção, o polipeptídeo da invenção compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70 %, preferencialmente pelo menos 80 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID N°: 1. Em uma realização de maior preferência, o polipeptídeo da presente invenção compreende a sequência de aminoácido ilustrada pela SEQ ID N°: 1.

[011] Em uma realização preferida, o polipeptídeo da presente invenção possui uma atividade TERT e, em uma realização preferencial, da presente invenção, a expressão do polipeptídeo da presente invenção permite a imortalização de uma célula que pertence à família Anatidae.

[012] Da forma utilizada no presente, o termo “isolado” e/ou “recombinante” indica que a molécula de ácido nucléico, DNA, RNA, polipeptídeos ou proteínas, desta forma designadas, foram produzidas, desta forma, por intervenção humana, e, assim, são separadas de seu ambiente celular nativo in vivo. Como resultado desta intervenção humana, os DNAs, RNAS, polipeptídeos e proteínas recombinantes da presente invenção são úteis de formas descritas no presente, em que os mencionados DNAs, RNAs, polipeptídeos ou proteínas, na sua forma natural, não são.

[013] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica o polipeptídeo da presente invenção.

[014] Em uma realização preferida da presente invenção, a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo da presente invenção compreende substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos da sequência ilustrada na SEQ ID N°: 2. Moléculas de ácido nucléicos preferidas que codificam o polipeptídeo da presente invenção compreendem a mesma sequência de nucleotídeos ilustrada na SEQ ID N°: 2.

[015] Da forma empregada no presente, o termo “substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos” refere-se a uma molécula de ácido nucléico que possui identidade suficiente ao polipeptídeo de referência, de forma que irá hibridizar ao nucleotídeo de referência sob condições de hibridização de estringência moderada. Em uma realização, a molécula de ácido nucléico que possui substancialmente a mesma sequência de nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de referência, codifica substancialmente a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 1. Em outra realização, a molécula de ácido nucléico que possui substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência possui pelo menos 70 %, preferencialmente, pelo menos 90 %, e ainda de maior preferência, pelo menos 95 %, de identidade à sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 2.

[016] Hibridização refere-se à ligação da fita complementar de ácido nucléico (ou seja, fitas senso:anti-senso ou sonda:DNA alvo) entre si, através de pontes de hidrogênio, similares à ligação que ocorrem naturalmente no DNA cromossomal. Os níveis de estringência utilizados para hibridizar uma dada sonda com o DNA alvo pode ser facilmente variada pelo técnico no assunto.

[017] O termo “hibridização estringente”, da forma utilizada no presente, refere-se a condições em que os híbridos de ácido polinucléico são estáveis. Conforme conhecido pelos técnicos no assunto, a estabilidade dos híbridos é refletida na temperatura de fusão (Tm) dos híbridos. No geral, a estabilidade de um híbrido é uma função da temperatura e concentração de íon de sódio. Tipicamente, a reação de hibridização é realizada sob condições de baixa estringência, seguida por lavagens de estringência variada, mas sempre alta. A referência à estringência da hibridização refere-se a tais condições de lavagem.

[018] Da forma utilizada no presente, o termo “hibridização de estringência moderada” refere-se a condições que permitam que o DNA alvo se ligue a um ácido nucléico complementar que possui cerca de 60 % de identidade, de preferência, cerca de 75 % de identidade, mais particularmente, cerca de 85 % de identidade ao DNA alvo; sendo especialmente preferido com mais do que cerca de 90 % de identidade ao DNA alvo. Preferencialmente, condições de estringência moderada são condições equivalentes para hibridização em 50 % de formamida, 5* de solução de Denhart, 5* de SSPE, 0,2% de SDS a 42° C, seguido por lavagem em 0.2* de SSPE, 0,2% de SDS, a 65° C.

[019] A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser uma sequência de RNA, cDNA ou DNA genômico ou ser de um tipo misturado. A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode, quando apropriado, conter um ou mais íntrons, sendo estes de origem nativa, heteróloga (por exemplo, o íntron de genes globina de coelhos, etc) ou sintética, para aumentar a expressão em células hospedeiras.

[020] A presente invenção refere-se ainda a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção.

[021] Da forma utilizada no presente, o termo “vetor” é entendido como um vetor de origem plasmidial ou viral, e opcionalmente um vetor combinado com uma ou mais substâncias, que aumentam a eficácia de transfecção e/ou a estabilidade do mencionado vetor, e/ou a proteção do mencionado vetor in vivo contra o sistema imune do organismo hospedeiro. Estas substâncias são amplamente documentadas na literatura, que é acessível aos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Feigner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al, 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647654). De forma ilustrativa, mas não limitativa, elas podem ser polímeros, lipídeos, em particular lipídeos catiônicos, lipossomos, proteínas nucleares ou virais ou lipídeos neutros. Estas substâncias podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. Exemplos destes compostos são, em particular, disponíveis nos pedidos de patentes WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 ou WO 99/05183. Uma combinação que pode ser esperada é um vetor recombinante de plasmídeo combinado com lipídeos catiônicos (DOGS, DC-CHOL, espermina-colesterol (spermine-chol), espermidina-colesterol (spermidine-chol) e similares) e lipídeos neutros (DOPE).

[022] A escolha dos plasmídeos que podem ser utilizados no contexto da presente invenção é vasta. Eles podem ser vetores de clonagem e/ou expressão. No geral, eles são conhecidos do técnico no assunto e uma série deles é comercialmente disponível, mas é também possível construí-los ou modificá-los a partir de técnicas de engenharia genética. Pode-se mencionar, como exemplo, os plasmídeos derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). Preferencialmente, o plasmídeo utilizado no contexto da presente invenção contém uma origem de replicação para assegurar o início da replicação em uma célula produtora e/ou célula hospedeira (por exemplo, a origem ColEl pode ser selecionada para um plasmídeo destinado a ser produzido em E. coli, e o sistema oriP/EBNAl pode ser selecionado quando desejado que ele seja auto-replicante em uma célula hospedeira de mamífero, Lupton e Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al, Nature 313, 812-815). Eles podem compreender elementos adicionais que melhoram sua manutenção e/ou sua estabilidade em uma dada célula (sequência cer que promove a manutenção monomérica de um plasmídeo - Summers e Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequences for integration into the cell genome).

[023] Com relação a um vetor viral, é possível imaginar um vetor derivado de um poxvírus (vírus Vaccinia, em particular MVA, vírus canarypox e similares), de um adenovírus, de um retrovírus, de um vírus da herpes, de um alfavírus, de um vírus espumoso (foamy virus) ou de um vírus adeno-associado. Um vetor que não seja de replicação será preferencialmente utilizado. Neste sentido, os vetores adenovirais são particularmente apropriados para a realização da presente invenção.

[024] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente os elementos necessários para a expressão da molécula de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira.

[025] Os elementos necessários para a expressão consistem do conjunto de elementos que permitem a transcrição da sequência de nucleotídeo em RNA, e a tradução do mRNA em um polipeptídeo, em particular, as sequências promotoras e/ou sequências reguladoras que são eficazes na mencionada célula, e opcionalmente as sequências necessárias para permitir a excreção ou a expressão do mencionado polipeptídeo na superfície de células alvo. Estes elementos podem ser reguláveis ou constitutivos. É claro que o promotor é adaptado ao vetor selecionado e à célula hospedeira. Pode-se mencionar, a título de exemplo, que os promotores eucarióticos dos genes PGK (fosfo glicerato quinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codifica creatina quinase do músculo, tensoativo pulmonar de actina, imunoglobulina ou (β-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRa (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor do vírus SV40 (vírus de símios), o RSV (Rous Sarcoma Virus) LTR, o promotor MPSV, o promotor TK-HSV-1, o promotor do vírus CMV (Citomegalovírus), promotores p7.5K pH5R de vírus Vaccinia, pKIL, p28, p11 e promotores E1A e MLP adenovirais, ou uma combinação destes. Os promotores de citomegalovírus (CMV) é o promotor mais particularmente preferido da invenção.

[026] De acordo com uma realização preferida, o vetor da presente invenção compreende adicionalmente duas sequências que são homólogas a porções de sequências contidas na região de uma sequência nativa de DNA alvo ao genoma de um genoma celular. A presença das mencionadas sequências homólogas permite a inserção do sítio específico de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção na sequência de DNA alvo através de recombinação homóloga.

[027] O termo “recombinação homóloga” refere-se à troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA nos sítios que apresentam sequências de nucleotídeos essencialmente idênticas. Preferencialmente, as sequências homólogas no vetor são 100 % homólogas à região da sequência alvo. Entretanto, uma baixa homologia de sequência pode ser utilizada. Desta forma, uma homologia de sequência tão baixa quanto 80 %, pode ser utilizada.

[028] As sequências homólogas no vetor compreendem pelo menos 25bp, regiões mais longas são preferidas, pelo menos 500 bp e, mais particularmente, pelo menos 5000 bp.

[029] De acordo com uma realização de maior preferência da presente invenção, a molécula de ácido nucléico é circundada pelas sequências homólogas no vetor.

[030] Da forma utilizada no presente, “circundada” indica que uma das sequências homólogas está localizada a montante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, e uma das sequências homólogas está localizada a jusante da molécula de ácido nucléico da presente invenção. Da forma utilizada no presente, “circundada” não necessariamente indica que as duas sequências homólogas estão diretamente ligadas à extremidade 3' ou 5' da molécula de ácido nucléico, da presente invenção, a molécula de ácido nucléico da presente invenção e as sequências homólogas podem ser separadas por um número ilimitado de nucleotídeos.

[031] Da forma utilizada no presente, uma “sequência de DNA alvo” é uma região no genoma de uma célula que é alvo para modificações por recombinação homóloga com o vetor. Sequências de DNA alvos incluem genes estruturais (tal como, sequências de DNA que codificam polipeptídeos, incluindo, no caso de eucariotos, íntrons e éxons), sequências reguladoras tais como sequências amplificadoras, promotoras, e similares, e outras regiões no genoma de interesse. Uma sequência de DNA alvo pode também ser uma sequência que, quando alvo de um vetor, não possui qualquer efeito na funcionalidade do genoma hospedeiro.

[032] Da forma utilizada no presente, “inserido em uma sequência de DNA alvo” significa de forma ampla, que o processo de recombinação homólogo que leva à inserção da molécula de ácido nucléico da presente invenção, introduz uma deleção ou uma disrupção na sequência de DNA alvo.

[033] Um técnico no assunto é capaz de selecionar as sequências homólogas apropriadas a fim de que a sequência de DNA específica seja inserida no genoma de uma célula. Por exemplo, uma sequência homóloga pode ser homóloga à parte da sequência de DNA alvo, em que a outra sequência homóloga é homóloga a uma sequência de DNA localizada a montante ou a jusante da sequência alvo. De acordo com outro exemplo, uma das sequências homólogas pode ser homóloga a uma sequência de DNA localizada a montante da sequência de DNA alvo, em que a outra sequência homóloga é homóloga a uma sequência de DNA localizada a jusante da sequência de DNA alvo. Em outro exemplo, ambas as sequências homólogas são homólogas às sequências localizadas na sequência de DNA alvo.

[034] De acordo com uma realização preferencial da presente invenção, a sequência de DNA alvo é o gene HPRT (Hipoxantina fosforibosil transferase).

[035] A sequência genômica que compreende o promotor HPRT e o gene HPRT de cairina moschata é ilustrado na SEQ ID N°: 3. A sequência que codifica o HPRT inicia no códon ATG na posição 8695 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3, a sequência a montante a este códon ATG é a sequência promotora de HPRT.

[036] O técnico no assunto é capaz de selecionar as sequências homólogas necessárias para a integração da molécula de ácido nucléico da presente invenção no gene HPRT. Como entre os diversos membros da família, as sequências genômicas que codificam HPRT são altamente homólogas entre as aves, os técnicos no assunto são então capazes de desenhar as sequências homólogas necessárias para direcionar o gene HPRT de outras células de aves.

[037] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, as sequências homólogas são customizadas a fim de inserir a molécula de ácido nucléico da presente invenção a jusante do promotor HPRT. Neta realização particular, a molécula de ácido nucléico da presente invenção é operacionalmente ligada ao promotor HPRT endógeno das células. No contexto da presente invenção, “operacionalmente ligado” indica que a molécula de ácido nucléico está ligada ao promotor de forma que permita sua expressão na célula.

[038] De acordo com esta realização particular, a sequência homóloga, a montante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, possui preferencialmente uma sequência de ácido nucléico que é homóloga a pelo menos 500 bp contíguo, e mais particularmente, pelo menos 5000 bp contíguo da sequência de ácido nucléico, começando no nucleotídeo na posição 1 e terminando com o nucleotídeo na posição 8694 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3, com a ressalva de que a mencionada sequência homóloga não é homóloga à sequência de ácido nucléico que inicia no nucleotídeo na posição 8695 e termina com o nucleotídeo na posição 26916 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3. Adicionalmente, esta sequência homóloga a montante está preferencialmente diretamente ligada ao códon de início da molécula de ácido nucléico da presente invenção. De acordo com uma realização da presente invenção ainda mais preferida, a sequência homóloga que está à montante da molécula de ácido nucléico da presente invenção consiste na sequência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo na posição 1383 e termina com o nucleotídeo na posição 8694 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3. Por exemplo, o vetor de acordo com a presente invenção compreende a sequência de ácido nucléico que começa no nucleotídeo da posição 1 e termina com o nucleotídeo da posição 11227 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 4. A sequência homóloga, a jusante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, preferencialmente possui uma sequência de ácido nucléico que é homóloga com pelo menos 500 bp contíguos e, mais particularmente, pelo menos 5000 bp contíguos da sequência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo da posição 10581 e termina com o nucleotídeo da posição17800 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3. Mais particularmente, a mencionada sequência homóloga, a jusante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, consiste na sequência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo da posição 10581 e termina com o nucleotídeo da posição 17800 da sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 3.

[039] De acordo com uma realização preferida, o vetor da presente invenção compreende um primeiro marcador de seleção, em que este primeiro marcador de seleção é um marcador de seleção positivo, e em que este primeiro marcador de seleção e a molécula de ácido nucléico da presente invenção estão posicionados na mesma seção do vetor, sendo que a mencionada seção é delimitada pelas sequências homólogas.

[040] Da forma utilizada no presente, o termo “marcador de seleção positive” refere-se particularmente a um gene que codifica um produto que permite apenas as células que carregue o gene de sobreviver e/ou crescer sob determinadas condições. Marcadores de seleção típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, deficiências auxotróficas complementares, ou fornecem nutrientes essenciais que não são disponíveis a partir do meio complexo. Em uma realização preferida de acordo com a presente invenção, o primeiro marcador de seleção codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos.

[041] De acordo com uma realização preferencial da presente invenção, o primeiro marcador de seleção, no vetor, está circundado por sequências que permitem sua supressão. As mencionadas sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção não circundam a molécula de ácido nucléico da presente invenção. Quando o vetor é circular, as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção e a molécula de ácido nucléico da presente invenção são posicionadas na mesma seção do vetor de transferência, sendo que a mencionada seção do vetor é delimitada pelas sequências homólogas.

[042] As sequências que permitem a supressão de um fragmento de ácido nucléico são bem conhecidas por um técnico no assunto (Nunes-Duby, S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391- 406). Estas sequências podem ser reconhecidas por uma ou mais enzimas específicas que induzem a supressão do ácido nucléico compreendido entre as mencionadas sequências, sendo que estas enzimas são denominadas “recombinase”. Por exemplo, três recombinases bem conhecidas que permitem a supressão de um fragmento de ácido nucléico são as recombinases FLP, ISCEI e Cre.

[043] Uma recombinase sítio-específica típica é a recombinase Cre. Cre é um produto de 38-kDa do gene cre (recombinação por ciclização) de bacteriófago PI e é uma DNA recombinase sítio-específica da família Int. Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212. Cre reconhece um sítio de 34-bp no genoma PI denominado loxP (locus de X-sobre de PI) e catalisa de forma eficiente a recombinação de DNA conservativa recíproca entre pares de sítios loxP. O sítio loxP consiste de duas repetições invertidas de 13-bp que flanqueiam uma região de núcleo não-palindrômica de 8-bp. A recombinação mediada por Cre entre dois sítios loxP diretamente repetidos resulta na excisão do DNA entre elas como um círculo covalentemente fechado. A recombinação mediada por Cre entre pares de sítios loxP na orientação invertida resultará na inversão do DNA de intervenção ao invés de excisão. A quebra e ligação do DNA é confinada a pequenas posições na região do núcleo e procede na fita em um momento por meio da ligação provisória da proteína de DNA da fototirosina com a enzima.

[044] Outra recombinase sítio-específica é a I-Scel. Outra endonuclease de íntron, por exemplo, I-Tlil, I-Ceul, I-Crel, I-Ppol e PI-PspI, pode ainda ser substituída por I-Scel. Muitas estão listadas em Belfort e Roberts ((1997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388). Muitas destas endonucleases derivam de genomas de organelas em que o uso do códon difere do uso de códon nuclear padrão. Para o uso destes genes na expressão nuclear destas endonucleases, pode ser necessário alterar a sequência codificadora para combinar com a sequência dos genes nucleares. I-Scel é uma endonuclease de fita dupla que cliva o DNA no seu sítio de reconhecimento. I-Scel gera um corte coesivo (ou corte assimétrico) de 4 pb com o 3'OH se sobressaindo.

[045] A enzima I-Scel possui um sítio de reconhecimento conhecido. O sítio de reconhecimento de I-Scel é uma sequência não-simétrica de mais de 18 bp. 5’ TAGGGATAACAGGGTAAT 3’ 3’ ATCCCTATTGTCCCATTA 5’

[046] Desta forma, em uma realização preferida da presente invenção, as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção compreendem o sítio de reconhecimento de I-Scel.

[047] Outra recombinase sítio-específica é a recombinase FLP. A recombinase Flp reconhece um sítio mínimo de 34-bp distinto que tolera apenas a degeneração limitada de sua sequência de reconhecimento (Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). A interação entre a recombinase Flp e uma sequência FRT foi examinada (Panigrahi et al, 1992). Exemplos de sequências FRT variantes são dados por Jayaram (1985) e Senecoff et al. (1988), e um ensaio para a recombinação mediada por Flp em diferentes substratos é descrito por Snaith et al. (1996).

[048] Em uma realização particular, onde o vetor da presente invenção compreende sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção, o mencionado vetor pode compreender vantajosamente, uma primeira sequência homóloga A e uma segunda sequência homóloga B, em que as sequências de homologia A e B possuem um comprimento suficiente e uma homologia suficiente que permitem a recombinação homóloga entre elas. Com relação às sequências homólogas A e B, o termo “homologia suficiente” refere-se, preferencialmente, a sequências com pelo menos 70 %, de preferência 80 %, mais preferencialmente 90 %, de preferência superior pelo menos 95 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% e, de maior preferência, 100 %, de homologia nestas sequências homólogas em um comprimento de mais de pelo menos 20 pares de bases, preferencialmente, pelo menos 50 pares de base, especialmente, pelo menos 100 pares de bases, mais preferencialmente, pelo menos 250 pares de bases, e mais preferencialmente ainda, pelo menos 500 pares de base. Nesta realização, o vetor de acordo com a presente invenção compreende, no sentido 5’-3’, como segue, a molécula de ácido nucléico da presente invenção, a primeira sequência homóloga A, uma sequência que permite a supressão do primeiro marcador de seleção, o primeiro marcador de seleção, uma sequência que permite a supressão do primeiro marcador de seleção e a sequência homóloga B.

[049] De acordo com uma realização preferida, o vetor da presente invenção compreende um segundo marcador de seleção, que não é circundado pelas mencionadas sequências homólogas, e em que o mencionado segundo marcador de seleção é um marcador de seleção negativo. O mencionado segundo marcador de seleção é particularmente útil quando o vetor da presente invenção é circular. Quando o vetor é circular, o fato do segundo marcador de seleção não ser circundado pelas mencionadas sequências homólogas significa que o segundo marcador de seleção e a molécula de ácido nucléico da presente invenção não estão posicionados na mesma seção do vetor de transferência, sendo que a mencionada seção é delimitada pelas sequências homólogas.

[050] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o vetor da presente invenção compreende um terceiro marcador de seleção, em que o mencionado terceiro marcador de seleção é um marcador de seleção negativo e, em que o mencionado terceiro marcador de seleção está localizado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção. Quando o vetor é circular, o fato do terceiro marcador de seleção estar localizado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção significa que o terceiro marcador de seleção e o primeiro marcador de seleção estão posicionados na mesma seção do vetor de transferência, em que a mencionada seção é delimitada pelas sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção.

[051] Da forma utilizada no presente, o termo “marcador de seleção negativo” refere-se em particular a um gene que codifica um produto que mata as células que carregam o gene sob determinadas condições. Estes genes compreendem, em particular, “gene suicida”. Os produtos codificados por estes genes são capazes de transformar uma pró-droga em um composto citotóxico. Diversos pares de gene suicida/pró-droga estão disponíveis comercialmente. Podem-se mencionar, mais particularmente, os pares: - vírus herpes simplex tipo I timidina quinase (HSV-1 TK) e aciclovir ou ganciclovir (GCV) (Caruso et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 70247028; Culver et al, 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al, 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361); - citocromo p450 e ciclofosfofamida (Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978); - nucleosídeo purina fosforilase de Escherichia coli (E. coli) e 6- metilpurina desoxirribonucleosídeo (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1,233238); - guanina fosforibosil transferase de E. coli e 6-tioxantina (Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) e - citosina deaminase (CDase) e 5-fluorocitosina (5FC); - FCU1 e 5-fluoro-citosina (5FC) (WO 9954481); - FCU1-8 e 5-fluoro-citosina (5FC) (WO 2005007857).

[052] O primeiro, segundo e terceiro marcadores de seleção podem ser utilizados separadamente. Por exemplo, o vetor de acordo com a presente invenção pode compreender o primeiro e o terceiro marcadores de seleção, mas não o segundo, ou pode compreender o segundo e o terceiro marcadores de seleção, mas não o primeiro.

[053] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o primeiro, segundo e/ou o terceiro marcadores de seleção são colocados sob o controle de elementos necessários para sua expressão na célula hospedeira.

[054] Estes elementos necessários para a expressão consistem no conjunto de elementos que permitem a transcrição da sequência de nucleotídeo em RNA e a tradução do mRNA em um polipeptídeo, em particular, as sequências promotoras e/ou sequências reguladoras, que são eficazes na mencionada célula, e opcionalmente as sequências necessárias para permitir a excreção ou a expressão do mencionado polipeptídeo na superfície das células hospedeiras. Estes elementos podem ser reguláveis ou constitutivos. Claramente, o promotor é adaptado ao vetor selecionado e à célula hospedeira. Podem-se citar, a título de exemplo, os promotores eucarióticos dos genes PGK (fosfo glicerato quinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codifica creatina quinase de músculo, tensoativo pulmonar de actina, imunoglobulina ou (β-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRcc (Takebe et al, 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor do vírus SV40 (vírus símios), RSV (Rous Sarcoma Virus) LTR, o promotor de MPSV, o promotor de TK-HSV-1, o promotor do vírus CMV (citomegalovírus), os promotores do vírus vaccinia p7.5K pH5R, pKIL, p28, p11 e promotores adenovirais E1A e MLP ou uma combinação destes promotores. O promotor do citomegalovírus (CMV) é mais particularmente preferido.

[055] A presente invenção também se refere a uma célula transfectada com a molécula de ácido nucléico ou um vetor de acordo com a presente invenção e células derivadas destas. Da forma utilizada no presente, a expressão “derivada” refere-se a células que se diferenciaram ou desenvolveram, ou possuem um ancestral, a partir de uma célula transfectada com a molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[056] A presente invenção também se refere ao uso de polipeptídeos, moléculas de ácidos nucléicos e vetores de acordo com a presente invenção para a imortalização de uma célula.

[057] A presente invenção também se refere a uma célula que compreende a molécula de ácido nucléico da presente invenção, em que a mencionada molécula de ácido nucléico é operacionalmente ligada ao promotor HPRT endógeno de célula. “Operacionalmente ligado” indica que a molécula de ácido nucléico é ligada ao promotor de uma maneira que permite sua expressão na célula. Em uma realização preferida, a célula de acordo com a presente invenção compreende a sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 4.

[058] A presente invenção também se refere a um processo de imortalização de uma célula, que compreende a etapa de transfecção de um vetor de acordo com a presente invenção na mencionada célula.

[059] Uma célula imortalizada, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de crescer em meio de cultura por mais de 35 passagens.

[060] O termo “número de passagens” refere-se ao número de vezes que uma população celular foi removida do recipiente de cultura e colocada em um processo de subcultura (passagem), a fim de manter as células a uma densidade suficientemente baixa para estimular o crescimento adicional.

[061] Da forma utilizada no presente, o termo “transfectada” refere-se à transfecção estável ou a transfecção transitória da célula da presente invenção.

[062] O termo “transfecção estável” ou “transfectada de forma estável” refere-se a introdução e integração do DNA exógeno no genoma da célula transfectada. O termo “transfectante estável” refere-se a uma célula que possui um DNA exógeno integrado de forma estável no DNA genômico.

[063] O termo “transfecção transitória” ou “transitoriamente transfectada” refere-se a introdução do DNA exógeno em uma célula, onde o DNA exógeno é falho na integração no genoma da célula transfectada. O DNA exógeno permanece no núcleo da célula transfectada durante vários dias. O termo “transfectante transitório” refere-se a células que possuem o DNA exógeno, mas falharam na integração deste DNA.

[064] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a célula da presente invenção é derivada de uma célula de aves e, mais particularmente, de uma célula da família Anatidae ou da família Phasianidae. Entre a família Anatidae, as células pertencentes ao gênero Cairina ou Anas são particularmente preferidas. Ainda mais preferencialmente, as células de acordo com a presente invenção pertencem às espécies Cairina moschata ou Anas platyrhynchos.

[065] Preferencialmente, a célula de acordo com a presente invenção é derivada de um organismo embriônico. Métodos de isolamento de células a partir de um organismo vivo são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os métodos descritos no exemplo 2 podem ser utilizados. De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a célula primária é isolada a partir de um embrião que pertence à família Anatidae, que está entre os 0 e 20 dias de idade, mais preferencialmente, entre 5 e 15 dias de idade, e mais particularmente, entre 11 e 14 dias de idade.

[066] Quando o vetor utilizado no processo da presente invenção compreende um primeiro marcador de seleção, a integração do primeiro marcador de seleção permite a seleção de células que possuem incorporada a molécula de ácido nucléico da presente invenção. Assim, o processo de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender uma etapa em que as mencionadas células são cultivadas em um meio que permite apenas o crescimento de células que incorporaram o primeiro marcador de seleção. Por exemplo, em um meio que compreende um antibiótico.

[067] Quando o vetor utilizado no processo da presente invenção compreende sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção, o processo de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente uma etapa que consiste na supressão do primeiro marcador de seleção do genoma da mencionada célula primária. Para a supressão do mencionado primeiro marcador de seleção, a célula é transfectada pelo gene que codifica a recombinase específica para as sequências, permitindo a supressão do primeiro marcador de seleção. Métodos e vetores capazes de transferir o mencionado gene na célula são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, o método descrito no exemplo 4 da presente invenção pode ser utilizado.

[068] Quando o vetor utilizado no processo da presente invenção compreende um segundo marcador de seleção, o processo de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente uma etapa em que as células são cultivadas em um meio que permite apenas o crescimento de células que não possuem incorporado o segundo marcador de seleção. A mencionada etapa pode ser realizada simultaneamente ou separadamente da etapa em que as mencionadas células são cultivadas em um meio que permite apenas o crescimento das células que possuem incorporado o primeiro marcador de seleção.

[069] O mencionado segundo marcador de seleção é particularmente útil quando o vetor, utilizado no processo de acordo com a presente invenção é circular. A presença do mencionado segundo marcador de seleção permite a destruição das células em que o processo de recombinação homóloga levou à introdução da seção do vetor de transferência que não compreende a molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[070] Quando o vetor utilizado no processo da presente invenção compreende um terceiro marcador de seleção, o processo de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender uma etapa em que a mencionada célula é cultivada em um meio que não permite o crescimento das células que compreendem o terceiro marcador de seleção. Por exemplo, um meio que não permite o crescimento de células que compreendem FCU1 como um terceiro marcador de seleção, que compreende 5-fluorocitosina.

[071] Esta etapa permite a seleção das células nas quais a supressão do primeiro marcador de seleção ocorreu. Isto significa que a etapa que consiste na supressão do primeiro marcador de seleção levará também à supressão do terceiro marcador de seleção. A presença do terceiro marcador de seleção permite a destruição das células nas quais o primeiro marcador de seleção está presente.

[072] A presente invenção refere-se, mais particularmente, mas sem se limitar, a um processo de imortalização de uma célula, que compreende as etapas de: * transfecção em uma célula de um vetor que compreende: * uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, circundada por sequências homólogas, * Um primeiro marcador de seleção em que o mencionado primeiro marcador de seleção é um marcador de seleção positivo, e em que o mencionado primeiro marcador de seleção é circundado pelas mencionadas sequências homólogas, * sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção, * um segundo marcador de seleção que não é circundado pelas mencionadas sequências homólogas, e em que o mencionado segundo marcador de seleção é um marcador de seleção negativo, * um terceiro marcador de seleção, em que o mencionado terceiro marcador de seleção é um marcador de seleção negativo, e em que o mencionado terceiro marcador de seleção está localizado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção, * cultivo das mencionadas células em um meio que permite apenas o crescimento das células que possuem incorporado o primeiro marcador de seleção; * cultivo das mencionadas células em um meio que não permite o crescimento das células que possuem incorporado o segundo marcador de seleção; * exclusão do primeiro marcador de seleção do genoma da mencionada célula; - cultivo da mencionada célula em um meio que não permite o crescimento de células que compreendem o terceiro marcador de seleção.

[073] Em uma realização particularmente preferida, a presente invenção refere-se a uma célula imortalizada que deriva de uma célula de um animal pertencente à espécie Cairina moschata e que compreende a transcriptase reversa da telomerase de Cairina moschata, sob o controle do promotor HPRT de Cairina moschata, inserido no gene HPRT da célula.

[074] A célula de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender uma ou mais sequências de ácido nucléico que permitem a propagação de um vírus de defesa. “Vírus de defesa” refere-se a um vírus que em que um ou mais genes virais necessários para sua replicação são deletados ou tornados não-funcionais. O termo “sequência de ácido nucléico que permite a propagação de um vírus de defesa” refere-se a uma sequência de ácido nucléico que fornece em trans a(s) função(ões) que permite a replicação do vírus de defesa. Em outras palavras, a mencionada sequência de ácido nucléico codifica as proteínas necessárias para a replicação e a encapsidação do mencionado vírus de defesa. A título ilustrativo, para a produção de um vetor adenoviral, que não possui a maior parte da região E1, a célula de acordo com a presente invenção pode ser transfectada de forma transitória ou permanente com uma sequência de ácido nucléico que codifica a região E1.

[075] A célula de acordo com a presente invenção pode ainda compreender uma sequência de ácido nucléico que codifica uma substância de interesse. Da forma utilizada no presente, a substância de interesse pode incluir, mas sem se limitar, uma proteína farmaceuticamente ativa, por exemplo, fatores de crescimento, reguladores do crescimento, anticorpos, antígenos, seus derivados úteis para a imunização ou vacinação e similares, interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF ou combinações destes, interferons, por exemple, interferon-α, interferon-β, interferon-y, fatores de coagulação sanguínea, por exemplo, Fator VIII, Fator IX, ou tPA, ou uma combinação destes. “Substância de interesse” também se refere a enzimas industriais, por exemplo, para uso na produção de papel e celulose, modificação têxtil, ou etanol. Finalmente, “substância de interesse” também se refere suplemento protéico ou um produto de valor agregado para a alimentação animal.

[076] As células obtidas pelo processo da presente invenção, a célula da presente invenção e as células derivadas destas, são particularmente úteis para a replicação de um vírus. O mencionado vírus pode ser vivo, atenuado, recombinante ou não. Mais particularmente, as mencionadas células são particularmente úteis para a replicação de poxvírus (vírus Vaccinia, em particular MVA, canarypoxvírus, etc.), um adenovírus, um retrovírus, vírus da herpes, um alfavírus, um vírus espumoso ou de um vírus associado a adenovírus.

[077] Os retrovírus possuem a propriedade de infectar, e na maioria dos casos integrar em, dividindo as células e, neste sentido, são particularmente apropriados para uso com relação ao câncer. Um retrovírus recombinante de acordo com a presente invenção contém geralmente as sequências LTR, uma região de encapsidação e a sequência de nucleotídeo de acordo com a presente invenção, que é colocada sob o controle do LTR retroviral ou de um promotor interno, tal como os descritos abaixo. Um vetor retroviral pode conter modificações, em particular, nas LTRs (substituição da região promotora com um promotor eucariótico) ou na região de encapsidação (substituição com uma região de encapsidação heteróloga, por exemplo, o tipo VL30) (vide os pedidos franceses 94 08300 e 97 05203).

[078] O vetor adenoviral pode não apresentar todo ou parte de pelo menos uma região que é essencial para a replicação, e que é selecionada a partir das regiões E1, E2, E4 e L1 L5. A deleção da região E1 é preferida. Entretanto, ela pode ser combinada com outra modificação / deleção que afeta, em particular, todo ou parte das regiões E2, E4 e/ou L1 L5. A título ilustrativo, a deleção da maior parte da região E1 e da unidade de transcrição E4 é muito particularmente vantajosa. Para aumentar a capacidade de clonagem, o vetor adenoviral pode adicionalmente não apresentar todo ou parte da região E3 não- essencial. De acordo com outra alternativa, é possível fazer uso de um vetor adenoviral mínimo que retém as sequências que são essenciais para a encapsidação, denominadas ITRs 5’ e 3’ (repetição terminal invertida), e a região de encapsidação. Os diversos vetores adenovirais, e as técnicas para prepará- los são conhecidas (vide, por exemplo, Graham and Prevect, 1991, em Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc).

[079] A família do poxvírus compreende vírus das subfamílias Cordopoxvírus e Entomopoxvírus. Entre estes, o poxvírus de acordo com a presente invenção é preferencialmente selecionado do grupo que consiste de Ortopoxvírus, Parapoxvírus, Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus, Suipoxvírus, Molluscipoxvírus, Yatapoxvírus. De acordo com uma realização particular, o poxvírus da presente invenção é um ortopoxvírus.

[080] O ortopoxvírus é preferencialmente um vírus Vaccinia e, em particular, um vírus Vaccinia modificado Ankara (MVA), em particular, MVA 575 (ECACC V00120707) e MVA-BN (ECACC V00083008).

[081] O termo “vírus recombinante” refere-se a um vírus que compreende uma sequência exógena inserida no seu genoma. Da forma utilizada no presente, uma sequência exógena refere-se a um ácido nucléico que não está naturalmente presente no vírus parental.

[082] Em uma realização, a sequência exógena codifica uma molécula que possui, direta ou indiretamente, uma função citotóxica. Por “direta ou indiretamente” citotóxica, entende-se que a molécula codificada pela sequência exógena pode ser tóxica (por exemplo, rícino, fator de necrose tumoral, interleucina-2, interferon-y, ribonuclease, desoxirribonuclease, exotoxina A de Pseudomonas) ou pode ser metabolizada para formar um produto tóxico, ou pode atuar em alguma outra coisa para formar um produto tóxico. A sequência de cDNA de rícino é descrita em Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270) aqui incorporada como referência.

[083] Em uma realização preferida da presente invenção, a sequência exógena pode ser um gene suicida. Um gene suicida codifica uma proteína capaz de converter uma pró-droga relativamente não tóxica em uma droga tóxica. Por exemplo, a enzima citosina deaminase converte 5- fluorocitosina (5FC) em 5-fluorouracila (5FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89, 33); a enzima timidina quinase de herpes simplex sensibiliza células para o tratamento com o agente adenoviral ganciclovir (GCV) ou aciclovir (Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). A citosina deaminase de qualquer organismo, por exemplo, E. coli ou Saccharomyces cerevisiae, pode ser utilizada.

[084] Desta forma, em uma realização preferida da presente invenção, o gene codifica uma proteína que possui uma atividade citosina deaminase, e mais particularmente uma proteína conforme descrita nos pedidos de patente WO 2005007857 e WO 9954481.

[085] Em uma realização particular, o gene exógeno codifica uma ribozima capaz de clivar RNA ou DNA alvo. O RNA ou DNA alvo a ser clivado pode ser RNA ou DNA que é essencial no funcionamento da célula, e sua clivagem resulta na morte celular, ou o RNA ou DNA a ser clivado pode ser um RNA o DNA que codifica uma proteína indesejada, por exemplo, um produto de oncogene, e a clivagem deste RNA ou DNA poderá prevenir a célula de tornar- se cancerosa.

[086] Ainda, em uma realização adicional da presente invenção, o gene exógeno codifica um RNA anti-seno.

[087] Por “RNA anti-senso” indica-se uma molécula de RNA que se hibridiza a, e interfere na expressão de, uma molécula de mRNA que codifica uma proteína, ou a outra molécula de RNA na célula, tal como pré-mRNA ou tRNA ou rRNA, ou hibridiza a, e interfere com a expressão de, um gene.

[088] Em outra realização da presente invenção, a sequência exógena substitui a função de um gene defeituoso em uma célula alvo. Existem centenas de doenças genéticas herdadas de mamíferos, incluindo humanos, que são causadas por genes defeituosos. Exemplos destas doenças genéticas inclui fibrose cística, que se sabe ser uma mutação no gene CFTR; distrofia muscular de Duchenne, em que se sabe que é uma mutação no gene distrofina; doença falciforme, que se sabe ser uma mutação no gene da HbA. Muitos tipos de cânceres são causados por genes defeituosos, especialmente proto-oncogenes, e genes supressores de tumor que passaram por uma mutação.

[089] Exemplos de proto-oncogenes são ras, src, bcl e outros; exemplos de genes supressores de tumor são p53 e Rb.

[090] Em uma realização adicional da presente invenção, a sequência exógena codifica um antígeno associado a tumor (TAA). TAA refere- se a uma molécula que é detectada em uma freqüência ou densidade mais alta em células tumorais do que em células não-tumorais, do mesmo tipo de tecido. Exemplos de TAA incluem, mas sem se limitar, CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE- 3, GP-100, MUC-1, MUC-2, oncogene ras com mutação pontual, p53 normal ou com mutação pontual, p53 sobre expresso, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinase, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, sobreviventes e LRP. De acordo com uma realização preferida, o TAA é MUC1.

[091] O vírus recombinante pode compreender mais de uma sequência exógena, e cada sequência exógena pode codificar mais de uma molécula. Por exemplo, pode ser útil para associar em um mesmo poxvírus recombinante, uma sequência exógena que codifica TAA com uma sequência exógena que codifica uma citosina.

[092] Em outra realização da presente invenção, o gene exógeno codifica um antígeno. Da forma utilizada no presente, “antígeno” refere-se a um ligante que pode ser ligado por um anticorpo; um antígeno precisa ser não- imunogênico.

[093] De preferência, o antígeno é derivado de um vírus tal como, por exemplo, HIV-1, (tal como gp 120 ou gp 160), qualquer vírus de imunodeficiência de felino, vírus da herpes animal ou humano, tal como gD ou seus derivados, ou proteína de expressão precoce, tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus (tal como gB ou seus derivados), vírus Varicella-Zoster (tal como gpI, II ou III), ou de um vírus de hepatite, tal como vírus da hepatite B, por exemplo, antígeno de superfície de hepatite B ou um derivado do mesmo, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C (preferencialmente proteína não- estrutural do genótipo 1b linhagem ja) e vírus da hepatite E, ou de outros patógenos virais, tal como vírus de sincício respiratório, vírus de papiloma humano (preferencialmente as proteínas E6 e E7 da linhagem HPV16) ou vírus Influenza, ou derivado de patógenos bacterianos tais como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por exemplo OspA ou OspB ou derivados dos mesmos), ou Clamídia, ou Bordetella por exemplo P.69, PT e FHA, ou derivado de parasitas, tal como Plasmodium ou Toxoplasma.

[094] Figura 1: vetor que compreende um gene que codifica a transcriptase reversa da telomerase.

[095] Figura 2: representação esquemática de uma inserção em sítio específico do gene que codifica a transcriptase reversa da telomerase no gene HPRT.

[096] Figura 3: representação esquemática da eliminação do primeiro e do terceiro marcador de seleção do genoma da célula imortalizada obtida pelo processo da presente invenção. EXEMPLOS EXEMPLO 1: SISTEMA DE EXPRESSÃO DE TELOMERASE INSERÇÃO RANDÔMICA

[097] Um plasmídeo que não compartilha qualquer sequência específica de homologia com o genoma de pato foi utilizado para este propósito (Figura 1). INSERÇÃO ALVO

[098] Um plasmídeo que compreende dois fragmentos homólogos de 5 kb ao gene HPRT de Cairina moschata circundando o gene da transcriptase reversa da telomerase de cairina moschata e dois marcadores de seleção foram construídos. O gene HPRT que codifica a hipoxantina guanina fosforil transferase foi selecionado como um sítio adequado para a expressão constitutiva da telomerase de cairina moschata.

[099] Estes dois marcadores de seleção são o gene FCU1 (Erbs et al. Cancer Res. 2000. 15. 60. :3813-22) sob o controle de um promotor CMV (Thomsen et al. P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-63) e o gene de resistência a neomicina colocado sob o controle de um promotor SV40. O cassete de expressão de resistência a neomicina e FCU-1 são circundados por sítios de clivagem Sce 1 que permite a eliminação dos cassetes de seleção da linhagem celular final. Além de braços do gene HPRT, é inserido um marcador de seleção que codifica HSVTK dirigido por um promotor RSV (Figura 2). EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE BATELADA CEC BATCH DE OVOS DE CAIRINA MOSCHATA DE 12 ANOS E SUBPOPULAÇÕES DESCRITAS

[0100] 25 ovos SPF fertilizados são incubados a 37,5°C. Os ovos são abertos após 12 dias de incubação, seguindo um protocolo disponível.

[0101] 23 embriões são moídos, lavados uma vez em solução salina tamponada com fosfato - Dulbecco (PBS) e dissociados em meio TrypLE Select (Invitrogen) durante 5 horas a temperatura ambiente.

[0102] Após uma centrifugação em baixa velocidade, as células são novamente suspensas em meio basal Eagle (MBE) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal (FCS), gentamicina 0,04 g/L, semeadas em frascos triplos de 500cm2 e incubadas a 37°C a 5 % de CO2.

[0103] Após 24 horas, as células confluentes são removidas dos frascos utilizando meio TrypLE Select (5 mL/frasco triplo), parte das células são novamente semeadas em frascos de 175 cm2 para segunda passagem. As células restantes foram concentradas a 107célula/mL em meio apropriado (60 % de BME, 30 % de FCS e 10 % de DMSO), e congeladas em um recipiente regulado de álcool isopropílico (NALGENE. ®. "Mr. Frosty" 1°C frezing. Container) a -80°C antes da transferência para nitrogênio líquido, para armazenagem de longo período, constituindo o banco de células inicial (50 x l,5.107células/frasco, 44 x l.l07células/frasco).

[0104] As células permanecidas em cultura são classicamente passadas por 18 passagens, durante as 3 primeiras passagens, as células não ligadas são coletadas por centrifugação baixa do meio condicionado, novamente semeadas e adicionalmente passadas da mesma forma da cultura inicial.

[0105] Subpopulações, exibindo características morfológicas diferentes, foram isoladas de forma reprodutível durante o tempo de cultura EXEMPLO 3: MÉTODOS DE TRANSFECÇÃO

[0106] Um grande número de métodos de transfecção são conhecidos na técnica para introduzir um vetor capaz de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeo de interesse. Uma lista não-limitativa destes métodos é listada a seguir: precipitação em CaPO4, eletroporação, método de transfecção por lipofectina. Um dado exemplo é baseado no procedimento de precipitação em CaPO4.

[0107] As células devem apresentar uma confluência de cerca de 80 a 50 %. O meio é alterado 2 horas antes a adição de CaPO4/DNA. 30 μg de DNA é novamente suspenso em 31 μl2M de CaCl2 -161,3 mM Tris pH 7,6. H2O é adicionado a um volume final de 0,5 ml.

[0108] Por transfecção, 0,5 ml de 2X HEBS é distribuído em 15 ml de tubo Falcon estéril e a solução de DNA é adicionada em gotas, enquanto a solução de DNA é delicadamente passada no vortex ou borbulhada (bubbling). A solução deve se tornar leitosa. A mistura é deixada repousar a temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. A seguir, a solução é pipetada repetidas vezes, com uma pipeta estéril, no frasco de cultura, para quebrar flocos e as células são aplicadas em gotas. As células são então incubadas entre 6 horas por uma noite a 37°C. Um precipitado fino deve cobrir a superfície celular. Para completar o procedimento de transfecção, aquecer a 37°C a solução de choque de glicerol (glycerol shock solution). O meio é então aspirado, 5 ml de BME é adicionado para lavar a camada de células, o meio é então aspirado e 1 ml de solução de choque de glicerol é adicionado por 2 minutos ou menos. Subsequentemente, 10 ml de BME são adicionados calmamente para diluir o glicerol e BME-glicerol é completamente removido. 10 ml do meio desejado é então adicionado e as placas são incubadas a uma temperatura apropriada. EXEMPLO 4: MÉTODOS DE SELEÇÃO INSERÇÃO RANDÔMICA

[0109] Pressão de seleção é aplicada 48 horas após a transfecção: as células são dissociadas com TrypLE selecionado, centrifugadas a baixa velocidade e novamente semeadas em BME com FCS 10 %, e G418 800 μg/mL.

[0110] As células são passadas de forma serial até que clones de crescimento individual possam ser isolados. Os focos de multiplicação são isolados e amplificados antes da quantificação da atividade da telomerase com o kit de detecção de telomerase TRAPeze® XL (S7707, Chemicon) e a análise por southern blot para estabelecer a integração no locus específico alvo. INSERÇÃO ALVO

[0111] Pressão de seleção é aplicada 48 horas após a transfecção: as células são dissociadas com TrypLE seletivo, centrifugadas com baixa velocidade e novamente semeadas em BME com FCS 10 %, Ganciclovir 25 μg/mL, e G418 800 μg/mL.

[0112] As células são passadas de forma serial até que clones de crescimento individual possam ser isolados. Os focos de multiplicação são isolados e amplificados antes da quantificação da atividade da telomerase com o kit de detecção de telomerase TRAPeze® XL (S7707, Chemicon) e a análise de oligos por southern blot para estabelecer a integração no locus específico alvo.

[0113] Clones de células com atividade telomerase restaurada detectados e integração de locus HPRT alvo são subsequentemente transfectadas com um plasmídeo de expressão meganuclease I-Scel seguindo o método descrito abaixo.

[0114] Para selecionar a eliminação dos marcadores de seleção, 5- fluorocitosina (5-FC) é aplicado 48 horas após a transfecção: as células são dissociadas com TrypLE seletivo, centrifugadas a baixa velocidade, e novamente semeadas em meio com concentração de 5-FC variando de 10-3 a 10-7 M e manutenção da seleção por G418 (BME com FCS 10 %, 5-FC, e G418 800 μg/mL).

Claims (17)

1. VETOR, caracterizado por compreender a sequência de ácido nucléico definida na SEQ ID N°: 2, operacionalmente ligada a sequências promotoras e terminadoras heterólogas.

2. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender duas sequências homólogas a uma sequência de DNA alvo.

3. VETOR, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela mencionada sequência de ácido nucléico ser circundada pelas mencionadas sequências homólogas.

4. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender adicionalmente um primeiro marcador de seleção, em que o mencionado primeiro marcador de seleção é um marcador de seleção positivo, e em que o mencionado primeiro marcador de seleção é circundado pelas mencionadas sequências homólogas.

5. VETOR, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo mencionado primeiro marcador de seleção ser circundado por sequências que permitem sua supressão.

6. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo mencionado vetor compreender um segundo marcador de seleção que não é circundado pelas mencionadas sequências homólogas, e onde o mencionado marcador de seleção é um marcador de seleção negativo.

7. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo mencionado vetor compreender um terceiro marcador de seleção, em que o mencionado terceiro marcador de seleção é um marcador de seleção negativo e em que o mencionado terceiro marcador de seleção está localizado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleção.

8. USO DE UM VETOR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para a imortalização de uma célula aviária.

9. USO DE UMA CÉLULA AVIÁRIA imortalizada transfectada com um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para a replicação de um vírus vivo, atenuado ou recombinante, preferencialmente escolhido do grupo que consiste em poxvírus, adenovírus, retrovírus, herpesvírus, alfavírus, vírus sincicial e vírus associado a adenovírus.

10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo poxvírus ser um vírus vaccinia, em particular um vírus vaccinia Ankara modificado (MVA).

11. PROCESSO DE IMORTALIZAÇÃO DE UMA CÉLULA AVIÁRIA, caracterizado por compreender a etapa de transfecção na mencionada célula, de um vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa em que as mencionadas células aviárias são cultivadas em um meio que permite apenas o crescimento das células que possuem incorporado o primeiro marcador de seleção.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa em que as mencionadas células aviárias são cultivadas em um meio que não permite o crescimento das células que possuem incorporado o segundo marcador de seleção.

14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo mencionado processo compreender adicionalmente uma etapa que consiste em excluir o primeiro marcador de seleção do genoma da mencionada célula aviária.

15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelas células viárias, obtidas após a mencionada etapa que consiste em excluir o primeiro marcador de seleção do genoma das mencionadas células, serem cultivadas em um meio que não permite o crescimento de células que compreendam o terceiro marcador de seleção.

16. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pela mencionada célula aviária ser obtida de um organismo que pertence à família Anatidae, preferencialmente às espécies cairina moschata e Anas platyrhynchos.

17. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pela mencionada molécula de ácido nucléico ser inserida em uma sequência de DNA alvo da mencionada célula, preferencialmente no gene HPRT.

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