JP2009521945A - トリテロメラーゼ逆転写酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に新規な組換えテロメラーゼ逆転写酵素、それらをコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる細胞、および目的とする物質の製造のためのこれら細胞の使用に関する。
1965年に、L. Hayflickは、細胞がプログラミングされた死の瞬間を有することを見出した。老化の一つの説明として、彼は、ヒト細胞が分裂することができる回数は限定されていることを示唆した(Exp Cell Res. 1965 Mar; 37: 614-36)。これは、現在では細胞が分裂するときにテロメアが短縮することによって引き起こされることが知られている。染色体は、一本鎖および二本鎖の結合タンパク質に会合した、保存され、縦列反復した非コード六量体性DNA配列からなるテロメアによってキャップされている。テロメアは、ゲノム安定性機能および特に染色体末端の複製に関与している。染色体末端を良好に複製するには、ユニークテロメア構造と、逆転写酵素の酵素活性を有する核タンパク質である特殊化した酵素テロメラーゼ逆転写酵素の両方を必要とする。テロメラーゼ逆転写酵素はテロメア反復配列を長くすることができ、これにより相補的娘鎖の延長複製を可能とする。テロメラーゼ逆転写酵素を欠いている細胞では、開始RNAプライマーが除去されると、DNA合成酵素は染色体の末端を完全に複製することができないので、テロメアDNAは連続分裂により短くなる。多くの研究により、いわゆる「テロメア時計」がヒト細胞寿命の重要な特徴であることの証拠が報告されている。細胞老化のテロメア仮説では、テロメアの短縮がテロメラーゼ逆転写酵素活性の全般的な欠如に関係しており、染色体を不安定にし、老化、アポトーシスを招くことが提案されている。テロメラーゼ逆転写酵素活性は、イン・ビボでの発生の際の体細胞系統およびイン・ビトロでテロメア短縮と相関している一次細胞でダウンレギュレーションされる。反対に、テロメラーゼ逆転写酵素活性のアップレギュレーションまたは制御不全は、形質転換細胞や腫瘍で見られる。数種類の哺乳類および1種類の両生類由来のテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)cDNAがクローニングされ、研究されてきた(Nakamura et al. 1997. Science 277, 955- 959; Greenberg et al. 1998. Oncogene 16, 1723-1730)。
5' TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA5'
単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV−I TK)とアシクロビールまたはガンシクロビール(GCV)(Caruso et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354- 1361);
シトクロムp450とシクロホスファミド(Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
Escherichia coli(E. coli)由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼと6−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238);
E. coli由来のグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと6−チオキサンチン(Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595);および
シトシンデアミナーゼ(CDアーゼ)と5−フルオロシトシン(5FC);
FCU1と5−フルオロ−シトシン(5FC)(WO9954481);
FCU1−8と5−フルオロ−シトシン(5FC)(WO2005007857)。
細胞に、
相同配列によって囲まれている本発明による核酸分子、
第一の選択マーカー(この第一の選択マーカーは正の選択マーカーであり、かつ上記相同配列によって囲まれている)、
第一の選択マーカーを抑制することができる配列、
第二の選択マーカー(この第二の選択マーカーは上記相同配列によって囲まれておらず、かつ負の選択マーカーである)、
第三の選択マーカー(この第三の選択マーカーは負の選択マーカーであり、かつ第一の選択マーカーを抑制することができる配列の間に配置されている)
を含んでなるベクターを導入し、
前記細胞を、第一の選択マーカーが組み込まれた細胞の増殖のみを可能にする培地で培養し、
前記細胞を、第二の選択マーカーが組み込まれた細胞の増殖を可能にしない培地で培養し、
第一の選択マーカーを前記細胞のゲノムから排除し、
前記細胞を、第三の選択マーカーを含んでなる細胞の増殖を可能にしない培地で培養する
工程を含んでなる、細胞を不死化する方法に関するが、これらに限定されない。
ランダム挿入
カモ(duck)ゲノムと相同な特異配列を共有しないプラスミドを、この目的に用いた(図1)。
ノバリケンテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を囲んでいるノバリケン(Cairina moschata)HPRT遺伝子に相同な2つの5kb断片と2つの選択マーカーを含んでなるプラスミドを構築した。ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼをコードするHPRT遺伝子を、ノバリケンテロメラーゼの構成的発現に適当な部位として選択した。
25個のSPF受精卵を37.5℃でインキュベーションする。12日間のインキュベーションの後に、これらの卵を、利用可能なプロトコルに従って切開する。
目的とするヌクレオチド配列の発現を指示することができるベクターを導入するための多数のトランスフェクションの方法が、当技術分野で知られている。これらの方法としては次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない:CaPO4沈澱、エレクトロポレーション、リポフェクチントランスフェクション法。本実施例は、CaPO4沈澱の手順に基づいている。
ランダム挿入:
トランスフェクションの48時間後に選択圧を加え、細胞をTrypLE Selectで解離させ、低速遠心分離し、10%FCSと800μg/mLのG418を含むBMEに再播種する。
トランスフェクションの48時間後に選択圧を加え、細胞をTrypLE Selectで解離させ、低速遠心分離し、10%FCS、25μg/mLのガンシクロビールおよび800μg/mLのG418を含むBMEに再播種する。
Claims (41)
- 配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたまたは組換えポリペプチド。
- 配列番号1に対して少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたまたは組換えポリペプチド。
- 配列番号1に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたまたは組換えポリペプチド。
- 配列番号1に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたまたは組換えポリペプチド。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたまたは組換え核酸分子。
- 配列番号2に実質的に示される核酸配列を含んでなる、請求項6に記載の単離された核酸分子。
- 請求項6または7に記載の核酸分子を有する、ベクター。
- ターゲットDNA配列に相同な2つの配列を含んでなる、請求項8に記載のベクター。
- 前記核酸分子が前記相同配列によって囲まれている、請求項9に記載のベクター。
- 前記ベクターが第一の選択マーカーをさらに含んでなり、該第一の選択マーカーが正の選択マーカーであり、前記相同配列によって囲まれている、請求項9または10に記載のベクター。
- 前記第一の選択マーカーがそれを抑制することができる配列によって囲まれている、請求項11に記載のベクター。
- 前記ベクターが前記相同配列によって囲まれていない第二の選択マーカーを含んでなり、該選択マーカーが負の選択マーカーである、請求項9〜12のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターが第三の選択マーカーを含んでなり、該第三の選択マーカーが負の選択マーカーであり、第一の選択マーカーを抑制することができる配列の間に配置されている、請求項11〜13のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項6または7に記載の核酸分子によってトランスフェクトされた、細胞。
- 前記核酸分子が前記一次細胞のHPRT遺伝子中に挿入されている、請求項15に記載の細胞。
- 細胞の内在性HPRTプロモーターに作動可能に連結された請求項6または7に記載の核酸分子を含んでなる、細胞。
- 前記細胞がカモ科(Anatidae)に属する動物に由来するものである、請求項15〜17のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記動物がノバリケン(Cairina moschata)種に属するものである、請求項18に記載の細胞。
- 前記動物がマガモ(Anas platyrhynchos)種に属するものである、請求項18に記載の細胞。
- 目的とする物質をコードする核酸配列をさらに含んでなる、請求項15〜20のいずれか一項に記載の細胞系。
- 欠損ウイルスの増殖を可能にする相補性カセットをさらに含んでなる、請求項15〜21のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞の不死化のための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項6または7に記載の核酸分子、または請求項8〜14のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- ウイルスの複製のための、請求項15〜21のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 前記ウイルスが、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルスおよびMVAからなる群から選択される、請求項24に記載の使用。
- 目的とする物質の製造のための、請求項21に記載の細胞の使用。
- ウイルスの製造のための、請求項15〜22のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項27に記載の使用。
- 前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項28に記載の使用。
- 前記ワクシニアウイルスがMVAである、請求項29に記載の使用。
- 組換えウイルスの製造のための、請求項15〜21のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 細胞を請求項8〜14のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトする工程を含んでなる、細胞を不死化する方法。
- 前記細胞を、第一の選択マーカーが組み込まれた細胞の増殖のみを可能にする培地で培養する工程をさらに含んでなる、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞を、第二の選択マーカーが組み込まれた細胞の増殖を可能にしない培地で培養する工程をさらに含んでなる、請求項32または33に記載の方法。
- 前記細胞のゲノムから第一の選択マーカーを排除することからなる工程をさらに含んでなる、請求項32〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞のゲノムから第一の選択マーカーを排除することからなる前記工程の後に得られる細胞を、第三の選択マーカーを含んでなる細胞の増殖を可能にしない培地で培養する、請求項35に記載の方法。
- 前記細胞がカモ科(Anatidae)に属する生物から採取されたものである、請求項32〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物がノバリケン(Cairina moschata)種に属するものである、請求項37に記載の方法。
- 前記生物がマガモ(Anas platyrhynchos)種に属するものである、請求項37に記載の方法。
- 前記核酸分子が前記細胞のターゲットDNA配列中に挿入される、請求項32〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲットDNA配列がHPRT遺伝子である、請求項40に記載の方法。
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