JP2017537624A

JP2017537624A - 不死化ニワトリ胚線維芽細胞

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Abstract

本発明は、不死化ニワトリ胚線維芽細胞、このような不死化細胞を含む細胞培養物、このような細胞を含むワクチン、このような細胞における鳥ウイルスの増殖方法、ならびにこのような細胞およびこのようなワクチンの調製方法に関する。

Description

本発明は、不死化ニワトリ胚線維芽細胞、このような不死化細胞を含む細胞培養物、このような細胞を含むワクチン、このような細胞における鳥ウイルスの複製方法、ならびにこのような細胞およびこのようなワクチンの調製方法に関する。

ワクチン製造の目的でウイルスを増殖させるには、感受性の高い宿主細胞が利用できることが必要である。通常、ウイルス種および使用する宿主細胞のタイプに依存して、これらの宿主細胞は細胞培養で増殖させる。多くの鳥ウイルス種の増殖のために、さらに胚発育卵において増殖の可能性がある。しかし、実際には、多くの鳥ウイルス種が、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞において増殖される。（動物から直接培養された細胞は初代細胞として知られている）。このような初代ＣＥＦ細胞は、多くの異なるウイルス種に感受性であり、このようなウイルスは、多くの場合、これらの細胞において高力価まで増殖することができる。ＣＥＦ細胞において頻繁に増殖するウイルスの例は、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、レオウイルス（ＲＶ）および七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）が挙げられる。

しかし、ＣＥＦ細胞の使用にはいくつかの欠点がある。それらは、ｉｎｖｉｔｒｏでの寿命が比較的短く、胚含有の特定の病原体のない卵から得られるので、継続的な需要のための生産は非常に面倒であり、非常に高価である。したがって、初代ＣＥＦ細胞の使用に取って代わる鳥類起源の細胞系を確立することが望ましいであろう。

本発明の目的のために、不死化細胞系は、通常は無期限に増殖しないが、突然変異により正常な細胞老化を回避し、代わりに細胞分裂を受け続ける、多細胞生物に由来する細胞集団（この場合はＣＥＦ）である。このような細胞は、限られた数の分裂周期の間だけ正常な成長制限を免れた。

ＣＥＦ細胞（ＣＥＦ細胞系）の不死化形態は原理的には上記の問題を解決することができるが、このような細胞はほとんど入手できない。このような細胞を得る１つの方法は、初代ＣＥＦ細胞を単離および増殖させ、自発的な不死化事象が起こるのを待つことである。しかしながら、鳥類細胞では、自発的不死化は非常にまれである。結果として、わずか３つの自発的不死化ニワトリ細胞系しか報告されていない；ＤＦ−１（米国特許第５６７２４８５号）、ＳＣ−１およびＳＣ−２（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔｓＩｎｔ．６５：４４１４（２００４）（ＩＳＢＮ０−４９６−０６８８２−２））に記載されている。自発的に不死化したＣＥＦ細胞の発見および単離が非常に時間がかかるという事実は別として、このような不死化ＣＥＦ細胞は、それらの継代数に依存して、経時的に可変な成長速度およびｐ５３レベルなどの全く異なる特性を示し得ることが判明している（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ５７９：６７０５−６７１５（２００５））。しかし、特にワクチン製造目的のためには、継代数にかかわらず、特性が経時的に同じままである細胞系が必要である。ＦＤＡは、未知の機序によって形質転換された腫瘍細胞において、最小限に精製された生弱毒化ウイルスワクチンの開発が望ましくないことを示している（ＦＤＡ；２０００年５月１２日の細胞基質に関するＣＢＥＲ討議）。したがって、自発的に不死化したＣＥＦ細胞は、ワクチン目的のためのウイルス増殖のための細胞供給源としてはあまり望ましくない。

細胞の意図的な不死化のための当該技術分野で公知の方法もある。このような方法の利点は、自発的に不死化した細胞を狙う際に重大な障害であることが知られている併発因子が排除されることである。非鳥類細胞、特に哺乳動物細胞の場合、不死化細胞を得るために頻繁に使用される方法は、レトロウイルスもしくはレトロウイルスベクターへの初代細胞の感染、またはレトロウイルスもしくは少なくともレトロウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列ならびにシミアンウイルスＳＶ４０ＴおよびｔのようなＤＮＡ腫瘍ウイルス腫瘍性タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子の、初代細胞へのトランスフェクションに頼っている。

ＳＶ４０Ｔおよびｔは、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびｐ５３タンパク質の不活性化において役割を果たす。ラージＴおよびｔをコードするＳＶ４０ＴについてのＤｅｅｐｉｋａＡｈｕｊａらの概説論文は、これらのタンパク質の作用機序の洞察を提供する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４：７７２９−７７４５（２００５））。基本的に、ＳＶ４０Ｔ遺伝子産物のＴおよびｔは腫瘍抑制因子のｐ５３およびＲｂファミリーを阻害する。

ＬＴＲは、レトロウイルス遺伝子発現に必要なすべてのシグナル：エンハンサー、プロモーター、転写開始、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナル、を含むレトロウイルスエレメントである。

しかしながら、これらのＬＴＲは腫瘍形成効果を有すると疑われている。このことは、ＬＴＲは他の細胞遺伝子をシス活性化することが知られているという事実およびそれらが細胞ゲノム中の他のレトロウイルス配列との組換えを引き起こし得るという事実に起因する（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓａｆｅｔｙ９：６８−７５（２００４））。したがって、ＬＴＲを含むレトロウイルスＤＮＡまたは少なくとも細胞をトランスフェクトするための長鎖レトロウイルス配列の使用の重大な欠点は、このような場合、ＬＴＲ配列が不死化細胞のＤＮＡに導入されることである。

鳥類細胞については、ＬＴＲを含み、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現するＤＮＡ分子による不死化の成功は一例のみが知られており、このような不死化ＣＥＦ細胞は、ＰＣＴ出願国際公開第９７／４４４４３号に記載されている。

このような方法は明らかにあまり成功していない。Ｓｏｏ−ＨｙｕｎＫｉｍは、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびｐ５３腫瘍抑制因子の不活性化を介してＣＥＦ細胞を不死化する試みにおいて、ＳＶ４０Ｔ抗原をコードするレトロウイルスのＣＥＦ細胞へのトランスフェクションを記載している（Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１９：２４３５−２４４３（２００６））。しかしこれは、ＣＥＦ細胞の寿命のわずかな延長をもたらしただけであり、不死化には至らなかった。

当時のＫｉｍ氏は、限られた寿命の延長についての有力な説明は、テロメアの継続的な侵食である可能性を示唆した。しかし、状況は、ニワトリ細胞が異なるサイズクラスのテロメア反復配列を有する大染色体および小染色体の両方を含み、そのいくつかは内在性であるという事実によって複雑になる。したがって、現段階において、テロメアの侵食および修復の動態およびそれらのニワトリ細胞の不死化への影響は依然として不明である。

これは、ＣＥＦの不死化における重要な役割がｐ５３およびＲｂの喪失またはテロメラーゼの活性化に関連するかどうかの基本的な未解決問題とつながる（Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３６：６０７−６１８（２００１）およびＳｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ１０２：４０７−４１０（２０００））。

最近の実験から、Ｋｉｍ氏の示唆に反して、ＣＥＦ細胞の不死化におけるテロメラーゼの役割は重大ではないように思われる。第１に、自発的に不死化したＣＥＦ細胞系ＳＣ−１（上記参照）において、テロメラーゼの発現は検出されないことが注目されている（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ５７９：６７０５−６７１５（２００５））。

第２に、ニワトリ細胞にｃＴＲ、ｃＴＥＲＴまたはｃＴＲおよびｃＴＥＲＴの両方を形質導入またはトランスフェクトしたいくつかの直接的な実験において、不死化ニワトリ細胞は得られなかった（Ｓｗａｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４５：６４７−６５４（２０１０））。

すべての予想に反して、現在、安定にトランスフェクトされたＣＥＦ細胞系は、ＬＴＲ配列を使用せずに、細胞ゲノムへＤＮＡ分子を組み込むためのトランスポゾン逆位反復配列ならびに適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔおよびｔ抗原または少なくともＴをコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼ（ｃＴＥＲＴ）をコードする遺伝子との両方の組み合わせを含むＤＮＡ分子の、ＣＥＦ細胞へのトランスフェクションによって得られることが発見されている。

トランスポゾン逆位反復配列は、本発明による安定にトランスフェクトされた不死化ＣＥＦを得るための前提条件である、ＳＶ４０Ｔおよびｔ抗原または少なくともＴをコードする遺伝子ならびに（ｃＴＥＲＴ）をコードする遺伝子の、ＣＥＦのゲノムへの安定な組み込みにおいて役割を果たす。

米国特許第５６７２４８５号国際公開第９７／４４４４３号

Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔｓＩｎｔ．６５：４４１４（２００４）（ＩＳＢＮ０−４９６−０６８８２−２）Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ５７９：６７０５−６７１５（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４：７７２９−７７４５（２００５）Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓａｆｅｔｙ９：６８−７５（２００４）Ｓｏｏ−ＨｙｕｎＫｉｍ，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１９：２４３５−２４４３（２００６）Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３６：６０７−６１８（２００１）Ｓｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ１０２：４０７−４１０（２０００）Ｓｗａｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４５：６４７−６５４（２０１０）

したがって、本発明の第１の実施形態は、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現し、ニワトリテロメラーゼ（ｃＴＥＲＴ）を発現し、外因性レトロウイルス長鎖末端反復ＤＮＡを含まないことを特徴とする、安定にトランスフェクトされた不死化ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に関する。

ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇ（Ａ）およびｐＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴ（Ｂ）のベクターマップである。ｃＴＥＲＴのアミノ酸配列である。＊は終止コドンを示す。ＣＥＦＳＴ−１細胞系の増殖曲線である。ｐＰＢ−ＥＶ（×印）、ｐＰＢ−ＳＶ（菱形）またはｐＰＢ−ＳＶおよびｐＰＢ−ｃＴＥＲＴ（ＣＥＦＳＴ−１）（四角）をトランスフェクトした細胞を継代した。各継代の細胞数を決定して、集団倍加／継代を計算した。ＣＥＦＳＴ−１の形態は継代中も一定のままであることを示す。ＣＥＦＳＴ−１細胞を、第２５継代（ｘ１００）（Ａ）および第４４継代（ｘ１００）（Ｂ）において撮影した。ＣＥＦＳＴ−２細胞系の増殖曲線である。ｐＰＢ−ＳＶ（菱形）またはｐＰＢ−ＳＶおよびｐＰＢ−ｃＴＥＲＴ（ＣＥＦＳＴ−２）（四角形）をトランスフェクトした細胞を継代させた。各継代の細胞数を決定して、集団倍加／継代を計算した。ＣＥＦＳＴ−２の形態は継代中も一定のままであることを示す。ＣＥＦＳＴ−２細胞を、第１９継代（ｘ１００）（Ａ）および第２６継代（ｘ４０）（Ｂ）において撮影した。ＣＥＦＳＴ−２細胞におけるＨＶＴの複製を示す。ＣＥＦＳＴ−２細胞を、Ｔ＝０においてＭＯＩ０．０５でＨＶＴに感染させた。示した時点で細胞を回収し、滴定によりＨＶＴ力価を測定した。ＣＥＦＳＴ−２細胞を、Ｔ＝０においてＭＯＩ０．０５でＨＶＴに感染させた。細胞をトリプシン処理し、９６時間後に回収し、新鮮なＣＥＦＳＴ−２単層に再播種した。この手順を４回繰り返した。各継代において、ＨＶＴ力価を決定するために試料を回収した。ＣＥＦＳＴ−２細胞を、Ｔ＝０においてＭＯＩ０．０５で、ＨＶＴまたは組換えＨＶＴウイルスに感染させた。細胞をトリプシン処理し、９６時間後に回収した。ＨＶＴ力価を滴定により決定した。

外因性レトロウイルスＬＴＲＤＮＡは、上記の不死化プロセス中にニワトリ胚線維芽細胞に導入されるＤＮＡであると考えられる。

このような不死化ＣＥＦならびにこのようなＣＥＦの調製方法の詳細および特性は、以下に広範囲にわたって記載する。

本発明の第２の実施形態は、このような不死化ＣＥＦ細胞系の調製方法に関する。

本発明による不死化ＣＥＦ細胞系の調製方法は、基本的に以下のステップを含む：
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ。このステップは当該技術分野において周知であり、特に、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ＲおよびＢｒｏｗｎ，Ｄ．Ｔ．によりＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１７：Ａ．４ｉ．１−Ａ．４ｉ．８（２０１０）などに記載されている。それは未だＣＥＦを取得するための好ましい方法である。

ｂ）前記ＣＥＦに、１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、２）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼ；ｃＴＥＲＴをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、および３）適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、をトランスフェクトするステップ。

適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子は、このＤＮＡ分子自体がトランスポゾン配列を含まず、したがって宿主のゲノムに組み込まれる可能性が低いので、ＬＴＲ配列を含んでいてもよい。それにもかかわらず、意図しない偶然の組み込みを避けるために、適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子は、ＬＴＲ配列を含まないことが好ましい。

効率の理由から、実際には、トランスフェクションは、好ましくは、ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含み、適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む単一のＤＮＡ分子を用いて行われる。

トランスポザーゼ活性は、ＣＥＦゲノム中にＤＮＡを組み込むための不死化プロセスの第１ステップの間のみに必要である。いったん（１または複数の）ＤＮＡが組み込まれれば、トランスポザーゼはもはや必要ない。その後、トランスポザーゼは細胞の安定性に有害になることさえある。

したがって、さらにより好ましくは、前記ＣＥＦにトランスフェクトするステップは、１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含む単一のＤＮＡ分子、および２）好ましくはＬＴＲ配列を含まず、適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼ遺伝子だけを含み、トランスポゾン配列を含まないＤＮＡ分子を用いて行われる。

トランスフェクションは、当該技術分野で公知の多くの方法で行うことができる。トランスフェクションのための市販のキットは、現在、特に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、ＰｒｏｃｅｓｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ）、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ、２０００ＡｌｆｒｅｄＮｏｂｅｌＤｒｉｖｅ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１７５ＳｔａｌｅｙＲｏａｄ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ１４０７２、ＵＳＡ）から利用可能である。一般に使用される試薬ベースのトランスフェクション法は、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ−デキストラン、活性化デンドリマーおよび磁気ビーズの使用を含む。機器に基づく方法は、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションおよびマイクロインジェクションを含む。

ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子およびトランスポゾン逆位反復配列および／または適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子は、例えばプラスミドである。このプラスミドは、トランスフェクションステップのために使用する場合、環状または直鎖であってよい。

このようなトランスポゾンの使用は、当該技術分野において周知である。Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．およびＩｚｓｖａｋＺ．による論文は、トランスポゾンおよびそれらの使用を広く検討し、トランスポゾンの作用機序についての洞察を提供している（ＭｏｂｉｌｅＤＮＡ１：２５−３９（２０１０））。トランスポゾンは、組み込みウイルスと同様に、トランスポザーゼによって媒介される効率的なゲノム挿入が可能な天然のＤＮＡ転移ビヒクルと見ることができる。

原則として、トランスポゾンは、ゲノムへの組み込み後に、細胞ゲノム中に依然として安定に存在している。したがって、好ましくは、本発明による不死化ＣＥＦは、トランスポゾン逆位反復配列などのトランスポゾン配列を含む。

ＳＶ４０Ｔ抗原およびｃＴＥＲＴの発現のための非常に多数の適切なプロモーターが当該技術分野において公知であり、これらは、それらの効率的な発現レベルについて認識されている。哺乳動物細胞において転写的に活性なプロモーターが鳥類細胞においても良好に機能することが知られている。このようなプロモーターとしては、（ヒト）サイトメガロウイルス前初期プロモーター（Ｓｕｎ−ＹｏｕｎｇＬｅｅｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ６：８−１７（１９９９），Ｓｅｅｄ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ヒト・サイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーター（ＤｏｎｏｆｒｉｏＧ．，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３：１２４６−１２５４，（２００６））、マウス・サイトメガロウイルス前初期（ＭＣＭＶｉｅ１）プロモーター、マウス・サイトメガロウイルス初期（ＭＣＭＶｅ１）プロモーター、ＳＶ４０前初期プロモーター（ＳｐｒａｇｕｅＪ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９６，３９−４２，１９８２）、ヒートショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主な後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５６，１５２−１５４，１９９２）などの伝統的なプロモーターが挙げられる。

好ましいプロモーターはＣＡＧプロモーターである。（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ；Ｔａｋａｋｉ，Ｓ；Ａｒａｋｉ，Ｋ；Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｆ；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ；Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｇｅｎｅ７９（２）：２６９−２７７（１９８９）およびＮｉｗａ，Ｈ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ；Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ，．Ｇｅｎｅ１０８（２）：１９３−１９９（１９９１））。

ｃ）持続的増殖が可能な細胞を選択するステップ。

持続的増殖が可能なＣＥＦ細胞は、少なくとも４５回の集団倍加で増殖し続ける細胞である。細胞周期または細胞分裂周期は、分裂および複製（細胞複製）につながる細胞内で起こる一連の事象である。持続的増殖が可能な細胞の選択は、以下の理由から非常に単純なプロセスである：初代ＣＥＦは、最適な状況であっても、それらの自然環境の外側では鳥類の胚を４５回を超えて分裂させることができない。増殖の初期段階の後、単離後の初代ＣＥＦ生細胞の増殖速度は経時的に低下し、最終的にすべての初代ＣＥＦ細胞は非増殖期に入る。結果として、それらは最大約４５回の集団倍加後に死亡する。

このことは、特に４５回の集団倍加後に細胞数の増加がある場合、それが、１または複数の細胞が首尾よくトランスフェクトされた事実、およびＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子およびｃＴＥＲＴをコードする遺伝子が細胞ゲノムに挿入された事実によることを意味する。したがって、基本的にこのプロセスは自己選択的であり：トランスフェクションが成功したいくつかのＣＥＦを適切な細胞増殖培地において維持することにより、これらのトランスフェクトされた細胞の複製に自動的につながるが、非不死化細胞は分裂を停止して死亡する。適切な細胞増殖培地は、当該技術分野において公知であり（上記Ｋｉｍ、２００６およびＨｅｒｎａｎｄｅｚ、２０１０を参照されたい）、特に、実施例の項に記載してある。

細胞培養条件についてのさらなる指針は、実施例に見出すことができる。

通常、少なくとも４５細胞周期の間培養された細胞が選択される。このような細胞ついて、通常、初代ＣＥＦはニワトリ胚から単離した後、ｉｎｖｉｔｒｏで約４５回を超えて複製しないので、それらが不死化が成功したＣＥＦであることを合理的に推測することができる。

したがって、本発明の一実施形態は、本発明による不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記ＣＥＦに、１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、２）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼ；ｃＴＥＲＴをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、および３）ＬＴＲ配列を含まず、適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、
をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含む方法に関する。

この実施形態の好ましい形態は、本発明による不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記初代ＣＥＦ細胞に、ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含み、ならびに適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む、単一ＤＮＡ分子をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含むことを特徴とする方法に関する。

この実施形態のより好ましい形態は、本発明による不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記初代ＣＥＦ細胞に、
１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含むＤＮＡ分子、ならびに
２）ＬＴＲ配列を含まず、適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、
をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含むことを特徴とする方法に関する。

例外的なケースでは、例えば、トランスポゾンが細胞ゲノムの非常に重要な部位に組み込まれているという事実が原因で、またはＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子またはｃＴＥＲＴをコードする遺伝子の不安定な組み込みが原因で、ほぼ４５細胞周期を経過した細胞が、依然として不安定な挙動を示すことがある。したがって、実際には、優先順位として、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０またはさらに１６０細胞周期の間培養された細胞を選択することが好ましい。任意の不安定性が現れる可能性は、選択された不死化ＣＥＦの細胞周期の量とともに減少する。

したがって、優先順位として、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０またはさらに１６０細胞周期の間培養された細胞を選択することが好ましい。

本発明の第３の実施形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターの複製方法であって、
ａ）本発明による不死化ＣＥＦを培養するステップ、
ｂ）該不死化ＣＥＦを鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターと接触させるステップ
ｃ）鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを複製させるステップ、ならびに
ｄ）子孫ウイルスを単離するステップ、
を含む方法に関する。

特に目的の鳥ウイルスは以下の鳥ウイルスである：七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、レオウイルス（ＲＶ）および七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）が挙げられる。これらすべてのウイルス対して、生弱毒化ウイルス、不活化ウイルスまたは組換えウイルス；これらのウイルスのいずれかの免疫原性成分を発現するウイルスベクターのいずれかに基づくワクチンが当該技術分野において公知である。

ウイルスベクターは、ウイルスの野生型には存在しない追加の遺伝子を担持するウイルスである。ウイルスベクターは当該技術分野において周知である。ウイルスベクターを使用して、例えば、外来細菌遺伝子または外来ウイルス遺伝子を運ぶことができる。通常、追加の遺伝子は適切なプロモーターの制御下に置かれる。このようなウイルスベクターの例は、例えば、ＩＢＤＶＶＰ２遺伝子、ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子、鳥インフルエンザＨＡ遺伝子、ＩＬＴｇＤ／ｇＩタンパク質遺伝子またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターである。

したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明による鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを複製する方法であって、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターが、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、レオウイルス（ＲＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）からなる鳥ウイルスならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子、ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子、鳥インフルエンザＨＡ遺伝子、ＩＬＴｇＤ／ｇＩタンパク質遺伝子またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターの群から選択される方法に関する。

マレック病ウイルス（ＭＤＶ）は、ヘルペスウイルスであり、３つの血清型：高度に毒性の血清型１、中程度に毒性の血清型２および血清型３（ニワトリに毒性がない七面鳥ウイルス；マレック病に関連するウイルスである七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ））が存在することが知られている。

本発明による不死化ＣＥＦ細胞は、３つのＭＤＶ血清型の増殖に非常に適切である。

したがって、この実施形態のより好ましい形態は、鳥ウイルスがＭＤＶおよびＭＤＶベクターウイルスからなる鳥ウイルスの群から選択される、本発明による鳥ウイルスの複製方法に関する。

本発明の第４の実施形態は、本発明による不死化ＣＥＦを含む細胞培養物に関する。

この実施形態の好ましい形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染した細胞培養物に関する。

この実施形態のより好ましい形態は、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、レオウイルス（ＲＶ）ならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子、ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子、鳥インフルエンザＨＡ遺伝子、ＩＬＴｇＤ／ｇＩタンパク質遺伝子またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターからなる群から選択される鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染している細胞培養物に関する。

この実施形態のさらに好ましい形態は、ＭＤＶまたはＭＤＶウイルスベクターに感染している細胞培養物に関する。

本発明の第５の実施形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを含むワクチンの調製方法であって、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染している本発明による細胞培養物を、医薬として許容される担体とを混合するステップを含む方法に関する。

この実施形態の好ましい形態において、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターは、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、レオウイルス（ＲＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）ならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子および／またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターからなる群から選択される。

一部のＭＤＶ関連ウイルスは、増殖した細胞に結合した場合にのみ生存可能である。血清型１は、細胞に結合することなく生存可能である。血清型２は細胞に結合することなく生存する可能性は低い。血清型３（ＨＶＴ）は、増殖する細胞から分離された場合に生存しない。本発明による不死化ＣＥＦは、これらのＭＤＶ血清型の増殖に非常に適切である。したがってＭＤＶ、特にＭＤＶ血清型２および３について、これらのＭＤＶ血清型に感染した本発明による不死化ＣＥＦは、細胞結合ＭＤＶを含むワクチンへの使用に非常に適切である。このようなワクチンは、このようなＭＤＶ感染不死化ＣＥＦと、医薬として許容される担体とを混合することによって、細胞結合ＭＤＶワクチンの調製のための当該技術分野において公知の標準的な技術により作製することができる。

したがって、この実施形態のより好ましい形態において、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターはＭＤＶである。

この実施形態のさらにより好ましい形態において、ＭＤＶまたはＭＤＶウイルスベクターは生弱毒化形態である。

本発明の第６の実施形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを含むワクチンの調製方法であって、
ａ）本発明によるＣＥＦの細胞培養物を鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染させるステップ、
ｂ）前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを複製するステップ、
ｃ）前記子孫ウイルスを単離するステップ、
ｄ）前記子孫ウイルスを医薬として許容される担体と混合するステップ、
を含む方法に関する。

この実施形態の好ましい形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターが、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、レオウイルス（ＲＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）ならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子および／またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターからなる群から選択されるワクチンに関する。

この実施形態のより好ましい形態は、鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターがＭＤＶまたはＭＤＶベクターであるワクチンに関する。

上記のように、一部のＭＤＶ関連ウイルスは、増殖した細胞に結合した場合にのみ生存可能である。したがってＭＤＶ、特にＭＤＶ血清型２および３について、これらのＭＤＶ血清型に感染した本発明による不死化ＣＥＦは、細胞結合ＭＤＶを含むワクチンへの使用に非常に適切である。このようなワクチンは、このようなＭＤＶ感染不死化ＣＥＦと、医薬として許容される担体とを混合することによって、細胞結合ＭＤＶワクチンの調製のための当該技術分野において公知の標準的な技術により作製することができる。

したがって、本発明の第７の実施形態は、ＭＤＶに感染している本発明の不死化ＣＥＦ細胞培養物および医薬として許容される担体を含むワクチンに関する。

［実施例］
［実施例１］
ニワトリ胚線維芽細胞の不死化
プラスミド。

ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇを構築するために、プライマーＳＶ４０Ｔａｇ５’−ＢＩＩ（５’−ＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧ−３’）およびＳＶ４０Ｔａｇ３’−ＸＩ（５’−ＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧ−３’）を使用して、ＰＣＲにより、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位をＳＶ４０ＴＡｇに付加した。ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼを、製造業者のプロトコール（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）に従ってＰＣＲに使用した。この断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングし、配列決定によって検証した。次に、ＳＶ４０ＴＡｇをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔから切り出し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位を使用してｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮにクローニングして（Ｙｕｓａｅｔａｌ．，２００９）、ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇを作製した（図１Ａ）。最終構築物を配列決定により検証した。

ｃＴＥＲＴをコードする配列に続いてネコヘルペスウイルスポリＡシグナル配列（ＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＴＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＧＡＣ）（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｅｔａｌ．，１９９５）を合成し、配列決定し、ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位を使用してｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮ（Ｙｕｓａｅｔａｌ．，２００９）にクローニングして、ｐＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴを作製した（図１Ｂおよび図２）。ＣＥＦへのトランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。

ＣＥＦの単離および増殖。

１０個のＳＰＦ卵を３７℃において１０日間インキュベートし、初代胚線維芽細胞の単離に使用した。胚を滅菌条件下で卵から回収した。頭部、脚および翼を除去した後、胚を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて解離させた。解離後、ウシ胎児血清を加えてトリプシンを不活性化した。単離した細胞を４００ｘｇで１５分間遠心分離した。ペレット化細胞を、５％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ）、１％ニワトリ血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭに再懸濁し、生存率について染色し、計数した。２×１０^５細胞／ｃｍ２を培養フラスコにプレーティングし、４０℃および５％ＣＯ_２においてインキュベートした。

トランスフェクション
培養３日後、ＣＥＦを回収し、トランスフェクション前に生存細胞を計数した。トランスフェクション毎に、１×１０^６の生存細胞を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４Ｄ装置（ＬｏｎｚａＣｏｌｏｇｎｅＡＧ）のプログラムＣＡ−１３７を使用して、１００μｌの初代細胞バッファーＰ３＋補助剤（ＬｏｎｚａＣｏｌｏｇｎｅＡＧ）中でトランスフェクトした。細胞に、１．６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇおよび０．４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅをトランスフェクトし（Ｙｕｓａｅｔａｌ．，２０１１）、または対照として、１．６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮおよび０．４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅをトランスフェクトした。パルス投与後、細胞をＲＴにおいて５分間放置した。次に、４００μｌのＲＰＭＩ１６４０（３７℃）を細胞にゆっくり加え、細胞を３７℃において５分間インキュベートした。次いで、細胞を慎重に再懸濁し、Ｔ２５フラスコ中の増殖培地に播種し、４０℃および５％ＣＯ_２においてインキュベートした。ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇ細胞へのｐＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴのトランスフェクションを、同じプロトコールを使用して実施した。ここで、ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇを安定にトランスフェクトされたＣＥＦに１．６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴおよび０．４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅをトランスフェクトし（Ｙｕｓａｅｔａｌ．，２０１１）、または対照として１．６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮおよび０．４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅ、または２μｇの標準的なＧＦＰ発現ベクター（ｐｍａｘＧＦＰ、Ｌｏｎｚａ）を一緒にトランスフェクトした。

組織培養
トランスフェクション後、培養物を増殖培地（５％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ）、１％ニワトリ血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ）中で増殖させ、８０〜９０％の集密度で日常的に継代させた。培地を除去した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用してトリプシン処理した。細胞を増殖培地に再懸濁し、ペレット化した。ペレット化した細胞を増殖培地に再懸濁し、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ計数チャンバーを使用して計数した。細胞をＣｅｌｌｂｉｎｄ組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の新鮮な培地にプレーティングし、４０℃および５％ＣＯ_２においてインキュベートした。ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０細胞を、４２．５％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有する標準培地中で異なる継代において液体窒素保存用に凍結した。ｐ−ＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴまたは対照プラスミドをトランスフェクトしたＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇ細胞を、表面をＩ型コラーゲンでコーティング（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）した、通常の増殖培地または動物成分非含有培地＋１％のウシ新生仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にプレーティングした。集団倍加の数を、以下の方程式を使用して計算した：

（式中、Ｎｔは増殖期の終わりの生存細胞の数であり、Ｎはプレーティングされた細胞の数である（ＶｅｎｋａｔｅｓａｎａｎｄＰｒｉｃｅ，１９９８）。オリンパスＣＫＸ４１顕微鏡に連結したオリンパスＤＰ２１カメラを用いて細胞を撮影した。

感染
感染の２４時間前に、細胞を、０．２５％のウシ新生仔血清を添加した、または添加しない、動物成分非含有培地に１×１０^５細胞／ｃｍ２の密度で播種し、４０℃および５％ＣＯ２においてインキュベートした。ＭＯＩ０．０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）で細胞を感染させた。使用したウイルスは、ＨＶＴ（ＦＣ１２６）、ＮＤＶＦおよびＩＢＤＶＶＰ２抗原の両方を発現する組換えＨＶＴ（ＨＶＴ−ＮＤＶ−ＩＢＤＶ）ならびにＩＬＴｇＤ／ｇＩ抗原を発現する組換えＨＶＴ（ＨＶＴ−ＩＬＴ）であった。感染後、細胞を３８．５℃および５％ＣＯ_２においてインキュベートした。細胞を７２時間以上インキュベートした場合、７２時間後に培地を完全に補充した。実験に応じて、滴定用試料を感染の７２、９６、１２０または１４４時間後に回収し、液体窒素保存のために凍結させた。培地を除去した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いてトリプシン処理した。細胞を増殖培地に再懸濁し、ペレット化した。上清を除去した後、細胞を新鮮な増殖培地に再懸濁し、計数した。次に、最終濃度１０％ＤＭＳＯおよび２０％ウシ胎児血清を含有する増殖培地中で１×１０^７／ｍｌの細胞を凍結し、液体窒素中で保存した。

滴定
凍結したＨＶＴ感染細胞のアンプルを解凍し、ＣＥＦのＨＶＴ感染細胞を滴定することによって、ＰＦＵ数／ｍｌを決定した。プラークを、ＨＶＴを認識するモノクローナル抗体またはポリクローナルニワトリ血清を用いた免疫蛍光アッセイで可視化した。ヤギ抗ニワトリＡｌｅｘａ４８８抗体またはヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８抗体をそれぞれ二次抗体として使用した。すべての滴定は二重に行った。

結果
ＳＶ４０Ｔ抗原の発現は、初代ＣＥＦの寿命を延ばす。

初代ＣＥＦに、第１継代においてｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０ＴＡｇ（ｐＰＢ−ＳＶ）およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクターをトランスフェクトして、ＳＶ４０ＴＡｇのゲノム組み込みおよび安定発現を得た。対照として、ＣＥＦにも空のｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮ（ｐＰＢ−ＥＶ）ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を８０〜９０％の集密度で日常的に継代し、計数して、生存細胞の数を決定した。継代時の生存細胞の数を使用して、播種後の集団の倍加回数を計算した（集団倍加（ＰＤ））。ＳＶ４０ＴＡｇ発現細胞は対照と比較して寿命の延長を示したが（それぞれ３５回の集団倍加対２６回の集団倍加）、すべての培養物は最終的に第１７継代付近で増殖を停止した（図３）。第１７継代の後、培養物中に増殖細胞は依然として存在した。しかし、培養物中の多くの細胞が死亡したため、総細胞数の増加は見られず、最終的にはすべての細胞が死亡した。

ＳＶ４０ＴＡｇに特異的なモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光アッセイを用いて、異なる継代におけるＳＶ４０ＴＡｇの発現についてＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞を試験した。第２継代（トランスフェクション後１継代）において、少数の細胞がＳＶ４０ＴＡｇ陽性であった。ほとんどすべての細胞は、第７継代の後にＳＶ４０ＴＡｇを発現した（データ非掲載）。

ＳＶ４０ＴＡｇ発現細胞におけるｃＴＥＲＴの発現は不死化を誘導する。

ＣＥＦＳＴ−１細胞系
不死化ＣＥＦを得るために、本発明者らは、ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞にｐＰＢ−ＣＡＧ−ｃＴＥＲＴ（ｐＰＢ−ｃＴＥＲＴ）発現ベクターをトランスフェクトした。ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶの第１３継代のアンプルを解凍し、細胞を培養液に入れ、継代させ、第１８継代においてｐＰＢ−ｃＴＥＲＴおよびトランスポザーゼ発現ベクターをトランスフェクトした。第１８継代におけるＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞の総数は低かった。したがって、本発明者らは、標準的なＧＦＰ発現ベクター（ＥＶ）をトランスフェクトしたＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞を使用して、継代中の対照としての空ベクターのトランスフェクション効率も決定した。トランスフェクション後、細胞を播種し、コロニーの増殖および成長について毎日検査した。ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ＋ＥＶ培養物に増殖は観察されず、最終的にすべての細胞は死亡した（データ非掲載）。しかし、ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ＋ｐＰＢ−ｃＴＥＲＴ培養物では、１０日後に急速に増殖するコロニーをはっきりと見ることができた。これらのコロニーをトリプシン処理し、細胞を計数し、組織培養フラスコに播種した。これらの細胞は、本発明者らの標準的な増殖培地よりも動物成分非含有培地（ＡＣＦ）においてより増殖することが見出され（データ非掲載）、したがって、ＡＣＦ培地においてこれらの細胞の増殖を続けた。これらのＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ＋ｐＰＢ−ｃＴＥＲＴ細胞は激しく増殖し続け、１００回以上の集団倍加（ＰＤ）を行うまで継代した（図３）。

この時点で、細胞は依然として健康であり、激しく増殖していた。したがって、本発明者らは、不死化ＣＥＦ細胞系を確立したと結論づけ、それをＣＥＦＳＴ−１（ＣＥＦ＋ＳＶ４０ＴＡｇ＋ｃＴＥＲＴ−ｎｒ．１）と命名した。細胞は、継代中に依然として一定な線維芽細胞形態を有する（図４）。

異なる継代のＣＥＦＳＴ−１細胞を、液体窒素保存のためにアンプル中で凍結した。これらの細胞は、液体窒素保存後に容易に再増殖させることができる。

ＣＥＦＳＴ−２細胞系
ＣＥＦＳＴ−１は、第１８継代のＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞にｃＴＥＲＴ発現ベクターをトランスフェクトすることによって作製した。この時点では、限られた数の細胞が依然として増殖しており、培養中の多くの細胞は既に死亡していた。ｃＴＥＲＴのトランスフェクション後に少数の不死化コロニーのみが増殖し、ＣＥＦＳＴ−１細胞系を生じたので、本発明者らはＣＥＦＳＴ−１がオリゴクローナル細胞系であると結論づけた。

ポリクローナル細胞系、すなわち多くの異なる不死化ＣＥＦ細胞に由来する細胞系を確立するために、本発明者らは、早期継代のＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞にもｃＴＥＲＴをトランスフェクトした。第９継代において液体窒素中に保存したＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ細胞を培養に取り込み、ＡＣＦ培地中で継代させ、ｐＰＢ−ｃＴＥＲＴまたはｐＰＢ−ＥＶをトランスポザーゼ発現ベクターと組み合わせて第１１継代において細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を播種し、継代させた。ＣＥＦ＋ｐＰＢ−ＳＶ＋ｐＰＢ−ＥＶ細胞は、第１６継代後に増殖を停止し、死亡した（データ非掲載）。ｐＰＢ−ＳＶおよびｐＰＢ−ｃＴＥＲＴの両方をトランスフェクトした細胞は、激しく増殖し続け、７０回のＰＤを超えるまで継代した（３３継代、図５）。

この時点で、細胞は依然として健康であり、良好に増殖していた。したがって、我々は別の不死化ＣＥＦ細胞系を確立したと結論づけた。この細胞系を、ＣＥＦＳＴ−２（ＣＥＦ＋ＳＶ４０ＴＡｇ＋ｃＴＥＲＴ−ｎｒ．２）と命名した。ＣＥＦＳＴ−２細胞は、継代中に依然として一定な線維芽細胞形態を有する（図６）。異なる継代のＣＥＦＳＴ−２細胞を、液体窒素保存のためにアンプル中で凍結した。これらの細胞は、液体窒素保存後に容易に再増殖させることができる。

ＣＥＦＳＴ−１およびＣＥＦＳＴ−２におけるＨＶＴの複製。

本発明者らは、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の複製を支援する能力について、ＣＥＦＳＴ−１およびＣＥＦＳＴ−２細胞系の両方を試験した。まず、免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）を使用して、ＣＥＦＳＴ−１がＨＶＴに感染し、ＨＶＴの複製を支援することを実証した。ＣＥＦＳＴ−１細胞をＨＶＴに感染させ、７２、９６および１２０時間後にＩＦのために固定した。ＨＶＴ陽性病巣は、ＨＶＴ感染ＣＥＦＳＴ−１細胞において、すべての時点で見ることができ、ＣＥＦＳＴ−１細胞がＨＶＴに感染し、ＨＶＴの細胞間拡散を支援し得ることを示した（データ非掲載）。

第２の実験において、ＣＥＦＳＴ−１細胞とＣＥＦＳＴ−２細胞との間のＨＶＴ感染および細胞間拡散の効率を比較した。ＣＥＦＳＴ−１およびＣＥＦＳＴ−２の両方をＨＶＴに感染させ、異なる時点において固定して、これらの細胞系におけるＨＶＴ複製の動態を研究した。ＨＶＴ陽性病巣は、２４、４８および７２時間後の両方の細胞系に存在し、病巣の数および大きさは経時的に増加した（データ非掲載）。これらの実験から、ＣＥＦＳＴ−１と比較してより多数のＨＶＴ病巣およびより大きな病巣がＣＥＦＳＴ−２において見られることは明らかであった。したがって、本発明者らは、ＣＥＦＳＴ−２細胞がＣＥＦＳＴ−１よりもＨＶＴ複製のためのより優れた基質であると結論づけた。

次に、本発明者らは、ＣＥＦＳＴ−２系におけるＨＶＴ複製の動態をより詳細に調べた。ＣＥＦＳＴ−２細胞をＨＶＴに感染させ、感染の７２、９６、１２０および１４４時間後に試料を採取して、プラーク形成単位（ＰＦＵ）数／ｍｌを決定した（図７）。これらの結果は、ＨＶＴはＣＥＦＳＴ−２細胞において複製し、回収時間の違いによる力価の差は小さいが、ウイルス力価は感染後約９６時間でピークになると思われることを示している（図７）。

ＨＶＴはＣＥＦＳＴ−２細胞において継代することができる。

ＣＥＦＳＴ−２がＨＶＴ感染および複製の基質であることを確立した後、本発明者らは、ＨＶＴ感染ＣＥＦＳＴ−２細胞が新鮮なＣＥＦＳＴ−２細胞の単層に感染できるかどうかを調べた。ＣＥＦＳＴ−２細胞をＨＶＴに感染させ、９６時間後に回収し、新鮮なＣＥＦＳＴ−２細胞の単層上に播種した。この手順を４回繰り返し、継代毎に細胞をＩＦ染色のために固定し、試料を採取してＰＦＵ数／ｍｌを決定した。ＩＦ染色により、ＨＶＴ陽性病巣が各継代後に存在し、第４継代後に多数の明瞭なＨＶＴ病巣が見られたことが実証された（データ非掲載）。滴定により、第２継代においてＨＶＴ力価が第１継代の力価と比較してわずかに低いことが示された（図８）。しかし、その後のＣＥＦＳＴ−２細胞における継代は、継代毎にＨＶＴ力価の増加をもたらし、第５継代においてＨＶＴ力価は１０^５．７ＰＦＵ／ｍｌであった。これは、ＣＥＦＳＴ−２細胞系がＨＶＴ複製に適切な基質であることを明確に示している。

ＣＥＦＳＴ−２は、組換えＨＶＴ構築物の複製のための基質である。

ＨＶＴはまた、例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）または感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）などの他の鳥ウイルスの抗原発現のためのウイルスベクターとしても使用することができる（Ｉｑｂａｌ、２０１２）。ＣＥＦＳＴ−２細胞も組換えＨＶＴ構築物の複製を可能にするかどうかを試験するために、ＣＥＦＳＴ−２細胞を、野生型ＨＶＴ、ＮＤＶＦおよびＩＢＤＶＶＰ２抗原の両方を発現する組換えＨＶＴ（ＨＶＴ−ＮＤＶ−ＩＢＤＶ）またはＩＬＴｇＤ／ｇＩ抗原を発現する組換えＨＶＴ（ＨＶＴ−ＩＬＴ）のいずれかに感染させた。感染の９６時間後に、細胞をＩＦ染色のために固定するか、または細胞を、滴定のための試料作製のために回収した。ＩＦ染色により、野生型ＨＶＴおよび組換えＨＶＴ構築物の両方について、ＣＥＦＳＴ−２細胞内に病巣が明瞭に示された（データ非掲載）。試料の滴定により、ＣＥＦＳＴ−２細胞はＨＶＴ組換え体の複製を支持するが（図９）、使用した条件下では組換えＨＶＴの複製が、野生型ＨＶＴの複製よりも効率的ではないことも実証された。

参考文献リスト
Ｉｑｂａｌ，Ｍ．（２０１２）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｏｌｙｖａｌｅｎｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｇａｉｎｓｔｍｕｌｔｉｐｌｅｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｕｓｉｎｇｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｏｆｔｕｒｋｅｙｓａｓｖｅｃｔｏｒ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ．３，２２２−２２６．
Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄＰｒｉｃｅ，Ｃ．（１９９８）．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ：ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｍａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ９５，１４７６３−１４７６８．
Ｗｉｌｌｅｍｓｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｔｒｉｊｄｖｅｅｎ，Ｉ．Ｇ．，ｖａｎＳｃｈｏｏｎｅｖｅｌｄ，Ｓ．Ｈ．，ｖａｎｄｅｎＢｅｒｇ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄＳｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．（１９９５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｈｏｒｔｓｅｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅｆｅｌｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１ｇｅｎｏｍｅａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆａｕｎｉｑｕｅｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０８，７０４−７１１．
Ｙｕｓａ，Ｋ．，Ｒａｄ，Ｒ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．，ａｎｄＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．（２００９）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｍｏｕｓｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｔｈｅｐｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６，３６３−３６９．
Ｙｕｓａ，Ｋ．，Ｚｈｏｕ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，ａｎｄＣｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．（２０１１）．ＡｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅｐｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｆｏｒｍａｍｍａｌｉａｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ１０８，１５３１−１５３６．

Claims

ＳＶ４０Ｔ抗原を発現し、異種プロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼ（ｃＴＥＲＴ）を発現し、外因性レトロウイルス長鎖末端反復ＤＮＡを含まないことを特徴とする、安定にトランスフェクトされた不死化ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）。
請求項１に記載の不死化ＣＥＦを含む細胞培養物。
鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染していることを特徴とする、請求項２に記載の細胞培養物。
前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターが、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、レオウイルス（ＲＶ）ならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子、ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子、鳥インフルエンザＨＡ遺伝子、ＩＬＴｇＤ／ｇＩタンパク質遺伝子またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の細胞培養物。
請求項１に記載の不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記初代ＣＥＦに、１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下で前記ＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、２）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼ；ｃＴＥＲＴをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、および３）適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、
をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記初代ＣＥＦ細胞に、ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下で前記ＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含み、ならびに適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む、単一ＤＮＡ分子をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の不死化ＣＥＦの調製方法であって、
ａ）初代ＣＥＦ細胞を得るステップ、
ｂ）前記初代ＣＥＦ細胞に、１）ＬＴＲ配列を含まず、トランスポゾン逆位反復配列を含み、適切なプロモーターの制御下で前記ＳＶ４０Ｔ抗原をコードする遺伝子と、適切なプロモーターの制御下でニワトリテロメラーゼをコードする遺伝子との両方を含むＤＮＡ分子、ならびに２）適切なプロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、をトランスフェクトするステップ、
ｃ）少なくとも４５細胞周期の間培養されたＣＥＦ細胞を選択するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
ステップｃ）において、少なくとも１００細胞周期の間培養された細胞が選択されることを特徴とする、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターの複製方法であって、
ａ）請求項１に記載の不死化ＣＥＦを培養するステップ、
ｂ）前記不死化ＣＥＦを前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターと接触させるステップ
ｃ）前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを複製させるステップ、ならびに
ｄ）子孫ウイルスを単離するステップ、
を含む方法。
前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターが、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ＭＤＶ関連七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳＶ）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、レオウイルス（ＲＶ）からなる鳥ウイルスならびにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子、ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子、鳥インフルエンザＨＡ遺伝子、ＩＬＴｇＤ／ｇＩタンパク質遺伝子またはＮＤＶＦ遺伝子を含むＨＶＴベクターの群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターが、ＭＤＶおよびＭＤＶベクターウイルスからなる鳥ウイルスの群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを含むワクチンの調製方法であって、請求項３または４に記載の細胞培養物を医薬として許容される担体と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターがＭＤＶであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記ワクチン中の前記ＭＤＶまたはＭＤＶウイルスベクターが生の弱毒化形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
請求項３または４に記載の細胞培養物および医薬として許容される担体を含むワクチン。
鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを含むワクチンの調製方法であって、
ａ）請求項２に記載の細胞培養物を鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターに感染させるステップ、
ｂ）前記鳥ウイルスまたは鳥ウイルスベクターを複製するステップ、
ｃ）前記子孫ウイルスを単離するステップ、
ｄ）前記子孫ウイルスを医薬として許容される担体と混合するステップ、
を含むことを特徴とする方法。